JP2021510153A - 膵臓ベータ細胞の増殖を増加させる方法、治療方法、および組成物 - Google Patents

Abstract

膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法を本明細書において開示する。不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法も開示する。DYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬とを含む組成物も開示する。本開示は、移植患者における膵臓ベータ細胞を再生させる方法をさらに記載する。

Description

本願は2018年1月5日に出願の米国仮特許出願第62/614,136号の恩典を主張し、該出願はその全体において参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は国立衛生研究所により授与された助成金番号T32 GM062754、DK105015、DK105015-01A1S1、P30 DK 020541、およびUC4 DK 104211の下で政府の支援によって行われた。政府は発明において一定の権利を有する。

分野
膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法、および二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体作動薬とを含む組成物を記載する。

背景
糖尿病は世界中で4億2200万人に影響を及ぼし、罹患率が増加しており(World Health Organization Global Report on Diabetes, 2016(非特許文献1))、最終的には、機能しているインスリン産生ベータ細胞の数が不十分であるために生じる(Butler et al., "Beta Cell Deficit and Increased Beta Cell Apoptosis in Humans with Diabetes," Diabetes 52(1):102-110 (2003)(非特許文献2)およびCampbell-Thompson et al., "Insulitis and Beta Cell Mass in the Natural History of Type 1 Diabetes," Diabetes 65(3):719-731 (2016)(非特許文献3))。

1型および2型糖尿病はいずれも、最終的には、機能しているインスリン分泌膵臓ベータ細胞の数が不十分なために生じる。したがって、ヒトベータ細胞の量および機能を置き換えるかまたは再生することが糖尿病研究の主な目的である。残念ながら、複製するように成人ベータ細胞を誘導することは困難であることが証明されている：幼児期後、ヒトベータ細胞は治療上意味のある速度で複製することができず、それらは薬物、成長因子、栄養素、または他のアプローチに応答してそれらの拡大を誘導しようとする試みに不応であることが証明されている(Gregg et al., "Formation of a Human Beta Cell Population within Pancreatic Islets is Set Early in Life," J. Clin. Endocrinol Metab. 97(9):3197-3206 (2012)(非特許文献4)およびWang et al., "Advances and Challenges in Human Beta Cell Proliferation for Diabetes," Nat. Rev. Endocrinol. 11(4):201-212 (2015)(非特許文献5))。

世界中で現在最も広く処方されている糖尿病薬物には、グルカゴン様ペプチド-1受容体(「GLP1R」)を活性化するために直接的にまたは間接的に作用する薬物がある。GLP1R作動薬ファミリーは、GLP1(7-36)自体、より安定した爬虫類ホモログであるエキセナチドや、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチドなどの修飾エキセナチド類似体などを含む(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018)(非特許文献6)およびGuo X-H, "The Value of Short- and Long-Acting Glucagon-Like Peptide Agonists in the Management of Type 2 Diabetes Mellitus: Experience with Exenatide," Curr. Med. Res. Opin. 32(1):1, 67-76 (2016)(非特許文献7))。これらのGLP1R作動薬、および酵素ジペプチジルペプチダーゼIV(「DPP4」)による内因性GLP1の分解を防止する追加の薬剤(例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチンなど)(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018)(非特許文献6)およびDeacon et al., "Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes: Comparison, Efficacy and Safety," Expert Opin. Pharmacother. 14(15):2047-2058 (2013)(非特許文献8))は、げっ歯類のベータ細胞において増殖を誘導するが、成人のヒト膵島におけるベータ細胞複製の活性化には繰り返し失敗してきた(Parnaud et al., "Proliferation of Sorted Human and Rat Beta Cells," Diabetologia 51(1):91-100 (2008)(非特許文献9)およびDai et al., "Age-Dependent Human Beta Cell Proliferation Induced by Glucagon-Like Peptide-1 and Calcineurin Signaling," J. Clin. Invest. 127(10):3835-3844 (2017)(非特許文献10))。しかしながら、それらは有益な「インクレチン」効果を有し、血中グルコースが上昇するとインスリン分泌を強めるようにベータ細胞を誘導する(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018)(非特許文献6))。現状では、GLP1R作動薬はヒトベータ細胞の増殖を誘導できないが、GLP1Rは組織分布が限定的でありベータ細胞において特に高度に発現している(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018)(非特許文献6); Pyke et al., "GLP1 Receptor Localization in Monkey and Human Tissue: Novel Distribution Revealed With Extensively Validated Monoclonal Antibody," Endocrinology 155(4):1280-90 (2014)(非特許文献11);およびAmisten et al., "An Atlas and Functional Analysis of G-Protein Coupled Receptors in Human Islets of Langerhans," Pharmacol. Ther. 139(3):359-391 (2013)(非特許文献12))。よって、それは現在では特有のベータ細胞特異性をもたらす。

二重特異性チロシン調節キナーゼ1A(「DYRK1A」)は、次のシナリオに従ってヒトおよびげっ歯類のベータ細胞増殖を誘導することができるシグナル伝達カスケードの下流コンポーネントである(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13); Gallo et al., "Lymphocyte Calcium Signaling from Membrane to Nucleus," Nat. Immunol. 7(1):25-32 (2006)(非特許文献14); Heit et al., "Calcineurin/NFAT Signaling Regulates Pancreatic β-cell Growth and Function," Nature 443(7109):345-349 (2006)(非特許文献15);およびGoodyer et al., "Neonatal Beta Cell Development in Mice and Humans is Regulated by Calcineurin/NFaT," Dev. Cell 23:21-34 (2012)(非特許文献16))。細胞内カルシウムの増加(例えば、グルコース、薬物などによって誘導される)はカルモジュリンおよびカルシニューリンの逐次的な活性化につながり、後者は活性化T細胞核内因子(「NFaT」)と名付けられた転写因子の細胞質プールを脱リン酸化する。これによりNFaTが核に移行することが可能になり、ここではそれらが細胞周期活性化遺伝子をトランス活性化しかつ細胞周期阻害遺伝子を抑制して、ベータ細胞の増殖をもたらす。核キナーゼDYRK1Aはこのプロセスに対する「ブレーキ」として機能し、核NFaTを再リン酸化し、それらを強制的に核から退出させ、これによってそれらの細胞分裂シグナルを停止させる。ハルミン類似体ファミリー(「ハルマログ」)はDYRK1Aを阻害して、ベータ細胞における増殖に対する「ブレーキ」を取り除き、これによって細胞周期へのエントリーを可能にする。

DYRK1A阻害剤クラスの薬剤はハルミン(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13))、INDY(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13))、ロイセチン(Tahtouh et al., "Selectivity, Co-Crystal Structures and Neuroprotective Properties of Leucettines, a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived from the Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B," J. Med. Chem. 55(21):9312-9330 (2012)(非特許文献17), GNF4877 (Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015)(非特許文献18))、5-ヨードツベルシジン("5-IT")(Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016)(非特許文献19))；CC-401(Abdolazimi et al., "CC-401 Promotes Beta Cell Replication via Pleiotropic Consequences of DYRK1A/B Inhibition," Endocrinology 159(9):3143-3157 (2018)(非特許文献20))、およびその他(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13); Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015)(非特許文献18); Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016)(非特許文献19); Abdolazimi et al., "CC-401 Promotes Beta Cell Replication via Pleiotropic Consequences of DYRK1A/B Inhibition," Endocrinology 159(9):3143-3157 (2018)(非特許文献20); Aamodt et al., "Development of a Reliable Automated Screening System to Identify Small Molecules and Biologics that Promote Human Beta Cell Regeneration," AJP Endo. Metab. 311:E859-68 (2016)(非特許文献21);およびWang et al., "Single Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas," Cell Metab. 24(4):616-626 (2016)(非特許文献22))を含む。これらの薬物は、細胞周期活性化遺伝子をトランス活性化し細胞周期阻害遺伝子を抑制する転写因子である活性化T細胞核内因子(「NFaT」)の核転座を誘導するそれらの能力を介して、ヒトベータ細胞における増殖を誘導する(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13); Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015)(非特許文献18);およびDirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016)(非特許文献19))。

ハルマログファミリーの分裂促進能は有望であるが、依然として問題が2つある。第一に、Ki67またはBrdU/EdUベータ細胞標識指標によって評価される、ハルミンファミリーに応答して観察される増殖速度が1〜3％/日の範囲である(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13); Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015)(非特許文献18); Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016)(非特許文献19); Aamodt et al., "Development of a Reliable Automated Screening System to Identify Small Molecules and Biologics That Promote Human Beta Cell Regeneration," AJP Endo. Metab. 311:E859-68 (2016)(非特許文献21);およびWang et al., "Singe Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas," Cell Metab. 24(4):616-626 (2016)(非特許文献22))。これは生後1年以内の正常な若年の膵臓において記載される生理学的な増殖速度と似ているが(Gregg et al., "Formation of a Human Beta Cell Population within Pancreatic Islets is Set Early in Life," J. Clin. Endocrinol Metab. 97(9):3197-3206 (2012)(非特許文献4)およびWang et al., "Advances and Challenges in Human Beta Cell Proliferation for Diabetes," Nat. Rev. Endocrinol. 11(4):201-212 (2015)(非特許文献5))、この速度は、ベータ細胞量が80〜99％減少している1型糖尿病の人々におけるベータ細胞量の急速な増加につながる可能性は低い(Meier et al., "Sustained Beta Cell Apoptosis in Patients with Longstanding Type 1 Diabetes: Indirect Evidence for Islet Regeneration?," Diabetologia 48:2221-2228 (2005)(非特許文献23)およびKeenan et al., "Residual Insulin Production and Beta Cell Turnover after 50 Years of Diabetes: Joslin Medalist Study," Diabetes 59:2853 (2010)(非特許文献24))。よって、より高い増殖速度が望ましい。第二に、ハルミンファミリーの生物学的効果はベータ細胞の増殖に限定されない：このクラスの薬物は他の膵島細胞タイプ(アルファ細胞など)の増殖につながり(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)(非特許文献13); Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016)(非特許文献19);およびWang et al., "Single Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas," Cell Metab. 24(4):616-626 (2016)(非特許文献22))、カルシウム-カルモジュリン-カルシニューリン-NFaT経路が遍在するのでおそらく他の細胞型も同様である。さらに、ハルミンは精神活性および幻覚特性が周知のCNS活性薬である(Brierley et al., "Developments in Harmine Pharmacology - Implications for Ayahuasca Use and Drug Dependence Treatment," Prog. Neuro-Psychopharmacol Biol. Psych. 39:263-272 (2012)(非特許文献25)およびHeise et al., "Ayahuasca Exposure: Descriptive Analysis of Call to US Poison Control Centers from 2005-2015," J. Med. Toxicol. 13:245-8 (2017)(非特許文献26))。よって、ハルミンクラスの細胞分裂活性をヒトベータ細胞に対してターゲティングさせるかまたは限定し、標的外への副作用を制限する方法を特定する必要性がある。

GLP1R作動薬を用いた併用療法がハルミンクラスの薬物の細胞分裂促進効果をさらに向上させ得るかどうかは調査されていない。

本明細書において提供される開示は、当技術分野における課題を解決することに向けられている。

World Health Organization Global Report on Diabetes, 2016 Butler et al., "Beta Cell Deficit and Increased Beta Cell Apoptosis in Humans with Diabetes," Diabetes 52(1):102-110 (2003) Campbell-Thompson et al., "Insulitis and Beta Cell Mass in the Natural History of Type 1 Diabetes," Diabetes 65(3):719-731 (2016) Gregg et al., "Formation of a Human Beta Cell Population within Pancreatic Islets is Set Early in Life," J. Clin. Endocrinol Metab. 97(9):3197-3206 (2012) Wang et al., "Advances and Challenges in Human Beta Cell Proliferation for Diabetes," Nat. Rev. Endocrinol. 11(4):201-212 (2015) Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018) Guo X-H, "The Value of Short- and Long-Acting Glucagon-Like Peptide Agonists in the Management of Type 2 Diabetes Mellitus: Experience with Exenatide," Curr. Med. Res. Opin. 32(1):1, 67-76 (2016) Deacon et al., "Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes: Comparison, Efficacy and Safety," Expert Opin. Pharmacother. 14(15):2047-2058 (2013) Parnaud et al., "Proliferation of Sorted Human and Rat Beta Cells," Diabetologia 51(1):91-100 (2008) Dai et al., "Age-Dependent Human Beta Cell Proliferation Induced by Glucagon-Like Peptide-1 and Calcineurin Signaling," J. Clin. Invest. 127(10):3835-3844 (2017) Pyke et al., "GLP1 Receptor Localization in Monkey and Human Tissue: Novel Distribution Revealed With Extensively Validated Monoclonal Antibody," Endocrinology 155(4):1280-90 (2014) Amisten et al., "An Atlas and Functional Analysis of G-Protein Coupled Receptors in Human Islets of Langerhans," Pharmacol. Ther. 139(3):359-391 (2013) Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015) Gallo et al., "Lymphocyte Calcium Signaling from Membrane to Nucleus," Nat. Immunol. 7(1):25-32 (2006) Heit et al., "Calcineurin/NFAT Signaling Regulates Pancreatic β-cell Growth and Function," Nature 443(7109):345-349 (2006) Goodyer et al., "Neonatal Beta Cell Development in Mice and Humans is Regulated by Calcineurin/NFaT," Dev. Cell 23:21-34 (2012) Tahtouh et al., "Selectivity, Co-Crystal Structures and Neuroprotective Properties of Leucettines, a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived from the Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B," J. Med. Chem. 55(21):9312-9330 (2012) Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015) Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016) Abdolazimi et al., "CC-401 Promotes Beta Cell Replication via Pleiotropic Consequences of DYRK1A/B Inhibition," Endocrinology 159(9):3143-3157 (2018) Aamodt et al., "Development of a Reliable Automated Screening System to Identify Small Molecules and Biologics that Promote Human Beta Cell Regeneration," AJP Endo. Metab. 311:E859-68 (2016) Wang et al., "Single Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas," Cell Metab. 24(4):616-626 (2016) Meier et al., "Sustained Beta Cell Apoptosis in Patients with Longstanding Type 1 Diabetes: Indirect Evidence for Islet Regeneration?," Diabetologia 48:2221-2228 (2005) Keenan et al., "Residual Insulin Production and Beta Cell Turnover after 50 Years of Diabetes: Joslin Medalist Study," Diabetes 59:2853 (2010) Brierley et al., "Developments in Harmine Pharmacology - Implications for Ayahuasca Use and Drug Dependence Treatment," Prog. Neuro-Psychopharmacol Biol. Psych. 39:263-272 (2012) Heise et al., "Ayahuasca Exposure: Descriptive Analysis of Call to US Poison Control Centers from 2005-2015," J. Med. Toxicol. 13:245-8 (2017)

概要
開示の一局面は、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。本発明は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程であって、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

開示の別の局面は、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法に関する。本方法は、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

開示のさらなる局面は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを含む組成物に関する。

開示のさらに別の局面は、移植患者における膵臓ベータ細胞を再生させる方法に関する。本方法は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを移植患者に投与する工程であって、患者における膵臓ベータ細胞を再生させるために移植患者における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

開示の別の局面は、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法に関する。本方法は、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)阻害剤とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

GLP1R作動薬およびDPP4阻害剤は2型糖尿病薬のうちで最も広く処方されるものである。それらはベータ細胞からのインスリン分泌を増加させるが(Reimann et al., "G Protein-Coupled Receptors as New Therapeutic Targets for Type 2 Diabetes," Diabetologia 59(2):229-233 (2016)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、それらはヒトベータ細胞の増殖を増加させることはできない(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018); Parnaud et al., "Proliferation of Sorted Human and Rat Beta Cells," Diabetologia 51(1):91-100 (2008); およびDai et al., "Age-Dependent Human Beta Cell Proliferation Induced by Glucagon-Like Peptide-1 and Calcineurin Signaling," J. Clin. Invest. 127(10):3835-3844 (2017)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。DYRK1Aの小分子阻害剤は成人ヒトベータ細胞の増殖を誘導できる最初のクラスの薬剤を代表しているが、速度はわずか(約2％/日)である(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015); Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015); Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016); Abdolazimi et al., "CC-401 Promotes Beta Cell Replication via Pleiotropic Consequences of DYRK1A/B Inhibition," Endocrinology 159(9):3143-3157 (2018); Aamodt et al., "Development of a Reliable Automated Screening System to Identify Small Molecules and Biologics that Promote Human Beta Cell Regeneration," AJP Endo. Metab. 311:E859-68 (2016);およびWang et al., "Single Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas," Cell Metab. 24(4):616-626 (2016)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

任意のGLP1R作動薬を任意のDYRK1A阻害剤と組み合わせると驚くべきことにヒトベータ細胞複製の相乗的速度(5〜6％/日)および実際のヒトベータ細胞数の増加を誘導するという実証を以下に記載する。相乗効果はDYRK1Aの阻害とcAMPの増加との組み合わせを必要とする。治療はベータ細胞の脱分化にはつながらず、これまでには達成されたことのない程度のヒトベータ細胞特異性を提供する。これらの有益な効果は正常なヒトベータ細胞から2型糖尿病の人々に由来するものにまで及ぶ。本開示は、これらの効果が正常なヒトベータ細胞だけでなく、2型糖尿病のヒトからのベータ細胞にも当てはまることを実証する。

本明細書において意外にも開示されているように、直接的にGLP1Rを活性化する現在広く用いられている糖尿病薬(GLP1類似体)または間接的にGLP1Rを活性化する現在広く用いられている糖尿病薬(DPP4阻害剤)の大きなグループのうちのいずれか1つを、経口的に活性な小分子DYRK1A阻害剤(ハルミン、INDY、ロイセチン、5-IT、またはGNF4877など)と組み合わせることによって、ヒトベータ細胞複製の「速度」または「標識指数」を誘導することができる。これらの速度はDYRK1A阻害剤単独の速度を上回っており、2型糖尿病およびおそらくは1型糖尿病の人々における正常なベータ細胞量の回復に必要であると想定され得る範囲である。ヒトベータ細胞増殖マーカーの増加は成人ヒトベータ細胞数の実際の増加を伴う。増殖の増加は厳密な薬理学的意味で相乗的であり、それら自体では増殖効果がないハルミンおよびGLP1用量にまで及ぶ。

図1A〜1GはDYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬との組み合わせがヒトベータ細胞の増殖において相乗的増加をもたらすことを実証する。図1Aは96時間処理されかつKi67およびインスリンについて免疫標識された分散ヒト膵島細胞に対する表示の薬物処理の効果を示すグラフである。「DMSO」は0.1％の対照ベヒクルを表す。棒は平均±SEMを表し、棒内の数字は各用量で試験したヒト膵島標本の数を示す。各棒毎に最低で1000個のベータ細胞がカウントされた。ハルミン単独に対して^*はp<0.05を表し、^**はp<0.001を表す。図1Bは、図1Aで用いたKi67およびインスリン免疫標識の例を示す。図1Cは、ヒト膵島数の漸進的な低下に応答したFACS定量ヒトベータ細胞の定量を実証する陰性対照を示すグラフである。図1Dは、サイトカイン(1000IU/mlの各TNFα、IL1βおよびIFNγ)による処理に応答したヒトベータ細胞数の減少を実証する第二の陰性対照を示すグラフである。図1Eは、ベヒクル(0.1％DMSO)またはハルミン(10μM)とGLP1(5nM)との組み合わせで処理した8つのヒト膵島標本のうちの7つにおける処理96時間以内のヒトベータ細胞数の増加を示すグラフである。図1C〜1Eにおいて、^*はp<0.0.05、^**はp<0.001、および^***はp<0.02を表す。図1Fは、示されるように、GLP1を伴うかまたは伴わない様々なDYRK1A阻害剤による分散させたヒト膵島の処理の結果を示すグラフである。棒は平均±SEMを表し、棒内の数字は各用量で試験したヒト膵島標本の数を表す。各棒毎に最低で1000個のベータ細胞がカウントされた。図1F〜1Gでは、DYRK1A阻害剤単独に対して^#はp<0.025を表し、^**はp<0.01を表す。図4に詳細に記載のように、各DYRK1A阻害剤を用いた増殖は1の値に正規化され、GLP1の組み合わせはDYRK1A阻害剤の増殖効果の関数として表されることに留意されたい。実際のKi67％値は、ハルミンが2.1％、INDYが1.7％、ロイセチンが2.8％、5-ITが2.6％、およびGNF4788が2.9％であった。5nMのGLP1が投与されるとこれらの値はほぼ2倍になった。図1Gは、示されたGLP1R作動薬を伴うかまたは伴わないハルミンによる分散させたヒト膵島の処理の結果を示すグラフである。データは図1Fと同様に表され、ハルミンについては実際のKi67％値は2.2％であったので、各GLP1R作動薬からの生のKi67値はハルミンの値のほぼ2倍であった。棒は平均±SEMを表し、棒内の数字は各用量で試験したヒト膵島標本の数を表す。各棒毎に最低で1000個のベータ細胞がカウントされた。ハルミン単独に対して^*はp<0.05を示し、^**はp<0.03を示す。 図1-1の説明を参照のこと。 図2は図1Aおよび3Aに係る個々のドナーのKi67-インスリン免疫標識データを示す。図2の表示形式は、図1Aおよび3Aに示されたヒト膵島ドナー20人におけるDMSO(0.1％)、ハルミン(10μM)、GLP1(5nM)またはGLP1-ハルミンの組み合わせに対する増殖反応を示す。濃い黒色の棒は各処理条件毎の平均値を示す。標準誤差および統計的有意性は図1Aに示す。この図は、異なるヒト膵島ドナー間で応答性のばらつきがよく認められることを浮き彫りにしている。これはすべてのヒト膵島ドナーがハルミン-GLP1の組み合わせに応答して向上した増殖を示したことも実証する。 図3A〜3Eはハルミン-GLP1の組み合わせによる増殖の相乗的活性化についてのさらなる証拠を提供する。図3Aは、Ki67⁺/インスリン⁺細胞/総インスリン⁺免疫標識細胞の割合がすべて、「1」として定義されたハルミン群における値に対して正規化されるように調整された、図1Aおよび図2に示したのと同じ実験の結果を示すグラフである。すべてのヒト膵島標本がすべての薬物のすべての用量で分析できるわけではないので、これは同じヒト膵島ドナーにおいて実施されたすべての実験に対して各データセットの調整を許容するものである。この調整はKi67免疫標識が示される各後続のパネル毎に用いられる。棒は平均±SEMを表す。^*はp<0.02を表し、^**はp<0.001を表す。各実験で用いた膵島ドナー数は図1Aと同じである。図3Bは、示された条件に応答した、分散させた膵島におけるベータ細胞へのBrdUの取り込みを示すグラフである。固定の18時間前にBrdUを培養物に加えた。棒は平均±SEMを表す。棒内またはその上の数字は各条件毎に用いられたヒト膵島ドナーの数を示す。図3Cは対照ベヒクルまたは10μMハルミン-5nM GLP1の組み合わせで処理したヒト膵島におけるBrdU取り込みの例を示す画像である。図3D〜3Eはより低い用量である3μM(図3D)および1μM(図3E)のハルミンを用いた以外は図1Aおよび3Aに示されるのと同じタイプの実験を示すグラフである。ここでも、特にハルミンおよびGLP1はほとんどまたは全く増殖を誘導しないが組み合わせが10μMのハルミン用量(2.7％)と同程度の増殖を誘導する図3Eでは、明確な相乗効果がはっきりと分かることに留意されたい。棒は平均±SEMを表す。棒内またはその上の数字は各条件毎に用いられたヒト膵島ドナーの数を示す。^*はp<0.05を表し、^**はp<0.01を表す。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図3Aの説明を参照のこと。 図4は単独でまたはGLP1と組み合わせて用いられるDYRK1A阻害剤ファミリーの小分子についての未調整データを示すグラフである。これらは図1Cに示すものと同じデータであり、各DYRK1A阻害剤単独、または5nMのGLP1との組み合わせでの効果を視覚化し得るように示されている。 図5A〜5Hはハルミン-GLP1の相乗効果がDYRK1Aの阻害およびベータ細胞cAMPの増加を必要とすることを実証する。図5A〜5CはcAMP(フォルスコリン、ジブチリルcAMP、ならびにホスホジエステラーゼ阻害剤であるイソブチルメチルキサンチン(IBMX)およびジピリダモール(DPD)を増加させる薬剤が単独で投与された場合には増殖には影響しないが、ハルミンと共に投与されるとGLP1と置き換え得るという実験結果を示すグラフである。図5Dは、PKA阻害剤H89がそれ自体では効果を有さないが、ハルミンおよびGLP1によって誘導される相乗的な増殖を阻止するという実験結果を示すグラフである。よって、相乗効果は部分的にはPKAによって媒介される。PKAおよびEPACが相乗効果を仲介するさらなる証拠は図5F〜5Hを参照されたい。図5Eはハルミン誘導ヒトベータ細胞増殖に対するPKAアクチベータ6-bnz-cAMPの効果を示すグラフである。図5Fはハルミン誘導増殖に対するEPAC2アクチベータ8-CPT-cAMPの効果を示すグラフである。図5Gは、EPAC2がFACS選別ヒトベータ細胞においておよび他の膵島細胞タイプにおいても最も豊富なEPACであることを実証するグラフである(その全体において参照により本明細書に組み入れられるWang et al., "Insights into Human Beta Cell Regeneration for Diabetes via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas. Nat. Comm. 8(1):767 (2017)からのRNA配列データを参照されたい)。対照的に、EPAC1はわずかしか検出できない。図5Hはハルミンの組み合わせに対するEPAC2阻害剤ESI-05の効果を示すグラフである。図5E、5F、および5Hにおいて、棒は平均±SEMを表す。棒内またはその上の数字は各条件毎に用いられたヒト膵島ドナーの数を示す。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図5Aの説明を参照のこと。 図6A〜6FはDYRK1A-GLP1の相乗作用メカニズムに関する追加の情報を示す。図6Aは分散させたヒト膵島が示されるように処理された実験の結果を示すグラフである。以前に記載されているように(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)ならびに図5E〜5Gおよび6D〜6F(下記)において、「GLP1」は5nMのGLP1を表し、「Har」はハルミン10μMを表し、「Con.sh」は、ベータガラクトシダーゼに対するshRNAを発現する対照アデノウイルスを表し、「DYRK1A-sh」はDYRK1Aに対するshRNAを発現するアデノウイルスを表す。DYRK1Aをサイレンシングすると、GLP1およびハルミンで観察されるのと同じGLP1相乗効果がアデノウイルス的に達成されることに留意されたい。図6Bは図6Aと逆の実験を示すグラフである。ここでは、DYRK1A cDNAまたは対象(Cre)のいずれかがヒト膵島においてアデノウイルス(CMVプロモーター)的に過剰発現した。DYRK1Aの過剰発現はハルミンのおよびハルミン-GLP1の組み合わせの両方の効果を阻止することに留意されたい。図6Cは図6A〜6BにおけるインスリンおよびKi67の免疫標識の例を示す。図6Dは分散させたヒト膵島の4つのセットにおけるDYRK1Aのアデノウイルス過剰発現の定量的PCRディスプレイの結果を示すグラフである。DYRK1AサイレンシングはDYRK1A mRNA発現を約25倍増加させる。図6EはAd.DYRK1Aに応答したベータ細胞におけるタンパク質レベルでのDYRK1Aの過剰発現を実証する免疫組織化学を示す。図6Fはヒト膵島におけるDYRK1Aのアデノウイルスサイレンシングがヒト膵島におけるDYRK1A発現を約80％減少させることを示すグラフである。棒は平均±SEMを表す。棒内またはその上の数字は各条件毎に用いられたヒト膵島ドナーの数を示す。^*はp<0.01を示す。すべてのパネルにおいて、棒は平均±SEMを表し、別々のヒト膵島数を棒内に示す。p値は示されている通りである。先の図面と同じく、ハルミンの値は1.0に正規化され、他の値はその値の関数として表される。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図6Aの説明を参照のこと。 図7A〜7Bは、qPCRによって確認された、細胞周期分子に対するベヒクル、5nM GLP1、10μMハルミン、ハルミン-GLP1の組み合わせの効果を示す。図7Aは4つの条件に曝露した72時間後の細胞周期アクチベータに対する効果を示すグラフである。図7Bは同じ試料について細胞周期阻害剤に対する効果を示すグラフである。細胞周期阻害剤の遺伝子名は、p15^INK4、p16 ^INK4、p18^INK4、p19^INK4、p21^CIP、p27^CIP、およびp57^KIPについては、それぞれ、CDKN2B、CDKN2A、CDKN2C、CDKN2D、CDKN1A、CDKN1B、およびCDKN1Cである。棒は平均±SEMを示す。棒内またはその上の数字は各条件毎に用いられたヒト膵島ドナーの数を示す。ハルミン単独に対して、^*はp<0.05を表し、^**はp<0.005を表す。 図8A〜8Cはハルミン-GLP1処理がヒトベータ細胞分化を維持するかまたは増強することを示す。図8Aは、qPCRを用いて評価した、ベータ細胞分化のマーカーに対する対照ベヒクル(DMSO、0.1％)、GLP1 5nM、ハルミン10μM、または組み合わせの効果を示すグラフである。棒は平均±SEMを表し、棒内または棒の上方の数字は各条件下で試験したヒト膵島標本の数を表す。対照ベヒクル処理に対して、^*はp<0.05を表す、^**はp<0.008を表す。図8Bは図8Aに示す実験からのPDX1、MAFA、およびNKX6.1についてのベータ細胞の免疫標識の画像を示す。それぞれハルミンまたはその組み合わせとではベータ細胞核を増加させることに留意されたい。4つのヒト膵島標本における実験を表している。図8Cはベヒクル、GLP1(5nM)、ハルミン(10μM)、または組み合わせで72時間処理した後の低グルコース(2.8mM、灰色の棒)および高グルコース(16.8mM、黒色の棒)に応答した4つの異なるドナーからのヒト膵島のインスリン分泌を示すグラフである。データは高グルコース刺激後にインスリンが何倍増加したかを表す。2.8mMグルコース対照(DMSO)ウェルにおけるインスリン濃度(平均±SEM)は19.9±9.1pmol/膵島であり、16.7mMグルコースでは33.3±12.6pmol/膵島であった。 図8Aの説明を参照のこと。 図8Aの説明を参照のこと。 図9A〜9Eは2型糖尿病(「T2D」)の人々からのベータ細胞に対するハルミン-GLP1の組み合わせの効果を示す。図9Aは図8Aに示す同じ分化マーカーに対するGLP1を伴うかまたは伴わないハルミンの効果を示すグラフである。ハルミンまたはハルミン-GLP1の組み合わせは分化に対して悪影響がなかった。むしろ、それはT2Dの人々からの膵島においてはPDX1、MAFB、NKX6.1、GLUT2、GLP1R、およびPCSK1を増加させるようである。棒は平均±SEMを表し、棒内または棒の上方の数字は各条件で試験したヒト膵島標本の数を表す。対照ベヒクル処理に対して、^*はp<0.05を表し、^**はp<0.008を表す。図9Bは、示された処理後の分散させたヒトT2D膵島のPDX1、MAFA、およびNKX6.1免疫標識の例を示す画像を提示する。3つすべてがベータ細胞内のタンパク質レベルで増加することに留意されたい。増加は、図9AにおけるmRNAレベルでの増加がない場合でもMAFAについては明らかである。図9Cはベヒクル、GLP1、ハルミン、または組み合わせで72時間前処理した3つの異なるT2D膵島標本における低グルコース(2.8mM、灰色の棒)および高グルコース(16.8mM、黒色の棒)に応答したインスリン分泌を示すグラフである。データは高グルコース刺激後にインスリンが何倍増加したかを表す。2.8mMグルコース対照(DMSO)ウェルでの平均インスリン濃度は18.1±3.2pmol/膵島であり、16.7mMグルコースでの平均インスリンでは32.2±4.6pmol/膵島であった。誤差棒は平均±SEMを表す。低グルコースに対して^*はp<0.01を表し、ベヒクル処理、高グルコース応答に対して^**はp<0.02を表す。図9Dはベヒクル、GLP1、ハルミン、または組み合わせに応答したヒトT2Dベータ細胞増殖を示すグラフである。棒は平均±SEMを表し、棒内のまたは棒の上方の数字は各条件下で試験したヒト膵島標本の数を表す。対照ベヒクル処理に対しておよびハルミン単独に対して、^*はp<0.01を表し、^**はp=0.02を表す。図9EはT2Dのドナーに由来するベータ細胞におけるインスリンおよびKi67免疫標識の例を示す。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図9Aの説明を参照のこと。 図10A〜10Dは非ベータ細胞における増殖に対するならびにベータ細胞死およびDNA損傷に対するハルミン-GLP1組み合わせの効果を示す。図10Aはインサートに示した処理に応答したベータ(INS⁺)、アルファ細胞(GCG⁺)、デルタ細胞(SST⁺)、および腺管細胞(CK19⁺)におけるBrdU標識を用いて評価した増殖を示すグラフである。ハルミンはこれまでに報告されているように(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、4つの細胞すべてにおいて増殖を活性化し、GLP1はGLP1受容体を含有するベータおよび腺管細胞に対してこれを増強することに留意されたい。棒は平均±SEMを表す。棒の下方の数字は各条件毎に用いたヒト膵島ドナーの数を表す。図10Bは示された薬剤に応答するヒト膵島細胞サブタイプにおけるBrdU免疫標識の例を示すグラフである。図10Cは、TUNELアッセイによって評価された、細胞死に対するハルミン-GLP1の組み合わせの効果を示すグラフである。2つ目の棒におけるサイトカインカクテルは陽性対照であり、実施例(下)に記載されているように、IFNγ、TNFα、およびIL1βを含有する。棒は平均±SEMを表す。棒内の数字は各条件毎に用いたヒト膵島ドナーの数を表す。図10Dは図10Cに示す条件に対するTUNEL応答の例を示す。 図10Aの説明を参照のこと。 図10Aの説明を参照のこと。 図10Aの説明を参照のこと。

詳細な説明
膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法、ならびに二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体活性を増加させる薬剤とを含む組成物が開示される。

一つの局面は膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。本方法は二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)活性を増加させる薬剤を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程を伴い、該接触工程は膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される。GLP1R活性を増加させる好適な薬剤は下に記載しており、GLP1R作動薬およびDPP4阻害剤を非限定的に含む。

本明細書において記載される本方法および他の方法を実施する際には、膵臓ベータ細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、例えば、マウス、ハムスター、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、サル、イヌ(例えば、カニス・ファミリアリス(Canis familiaris))、ネコ、ウサギ、モルモット、およびヒトを含む霊長類からの細胞を含む。例えば、細胞はヒト膵臓ベータ細胞であってもよい。

1つの態様によれば、「膵臓ベータ細胞」は初代ヒト膵臓ベータ細胞である。

1つの態様では、本明細書において記載される方法および他の方法はエクスビボまたはインビボで実施される。エクスビボで実施される場合、膵臓から細胞を取得し、哺乳類細胞、特にヒト細胞のインビトロまたはエクスビボ培養に適した液体培地中で細胞を培養することによって細胞集団が提供されてもよい。例えば、非限定的には、好適かつ非限定的な培地はインビトロジェンからのRPMI1640などの市販の培地に基づくものであってもよい。

細胞が膵臓ベータ細胞表現型を有するかどうかを決定するための方法は当技術分野で公知であり、細胞をグルコースとインキュベートすること、および細胞におけるインスリン発現が増加するかまたは誘導されるかどうかを試験することを非限定的に含む。他の方法は、ベータ細胞特異的転写因子が発現しているかどうかを試験すること、RNA定量PCRを利用したベータ細胞特異的遺伝子産物の検出、糖尿病マウスにおける候補細胞の移植およびそれに続く移植後の生理的反応を検査すること、ならびに電子顕微鏡を用いて細胞を分析することを含む。

天然源や低分子創薬プログラムからのいくつかのDYRK1A阻害剤が同定されかつ特性決定されている。好適なDYRK1A阻害剤はハルミン、INDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、ハルミン類似体、CC-401、チアジアジンキナーゼ阻害剤などを非限定的に含む。追加の好適なDYRK1A阻害剤はGNF7156およびGNF6324を非限定的に含む(Shen et al., "Inhibition of DYRK1A and GSK3B Induces Human Beta Cell Proliferation," Nat. Commun. 6:8372 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。本発明の方法を実施する際または本発明の組成物を形成する際には、DYRK1A阻害剤の組み合わせを用いてもよい。すべてのDYRK1A阻害剤のうちで、ハルミンおよびその類似体(β-カルボリン)が最もよく研究されており、依然としてこれまでに扱われてきた中で最も強力かつ経口的に生体利用可能なクラスの阻害剤である(Becker et al., "Activation, Regulation, and Inhibition of DYRK1A," FEBS J. 278(2):246-256 (2011)およびSmith et al., "Recent Advances in the Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Selective DYRK1A Inhibitors: A New Avenue for a Disease Modifying Treatment of Alzheimer's?," ACS Chem. Neurosci. 3(11):857-872 (2012)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

ハルミン以外にも、EGCgおよび他のフラバン-3-オール(Guedj et al., "Green Tea Polyphenols Rescue of Brain Defects Induced by Overexpression of DYRK1A," PLoS One 4(2):e4606 (2009)およびBain et al., "The Specificities of Protein Kinase Inhibitors: An Update," Biochem. J. 371(1):199-204 (2003)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、ロイセチン(Tahtouh et al., "Selectivity, Cocrystal Structures, and Neuroprotective Properties of Leucettines, a Family of Protein Kinase Inhibitors Derived from the Marine Sponge Alkaloid Leucettamine B," J. Med. Chem. 55(21):9312-9330 (2012)およびNaert et al., "Leucettine L41, a DYRK1A-preferential DYRKs/CLKs Inhibitor, Prevents Memory Impairments and Neurotoxicity Induced by Oligomeric Aβ25-35 Peptide Administration in Mice," Eur. Neuropsychopharmacol. 25(11):2170-2182 (2015)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、キナリザリン(Cozza et al., "Quinalizarin as a Potent, Selective and Cell-permeable Inhibitor of Protein Kinase CK2," Biochem. J. 421(3):387-395 (2009)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、ペルトギノイドアカニロールAおよびB(Ahmadu et al, "Two New Peltogynoids from Acacia nilotica Delile with Kinase Inhibitory Activity," Planta Med. 76(5):458-460 (2010)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、ベンゾクマリン(dNBC)(Sarno et al., "Structural Features Underlying the Selectivity of the Kinase Inhibitors NBC and dNBC: Role of a Nitro Group that Discriminates Between CK2 and DYRK1A," Cell. Mol. Life Sci. 69(3):449-460 (2012)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、ならびにインドロカルバゾール(スタロスポリン、レベッカマイシンおよびそれらの類似体)(Sanchez et al., "Generation of Potent and Selective Kinase Inhibitors by Combinatorial Biosynthesis of Glycosylated Indolocarbazoles," Chem. Commun. 27:4118-4120 (2009)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)がDYRK1Aおよび他のキナーゼを阻害することが示されている他の天然物である。

小分子創薬の試みから特定された他のスキャフォールドのうち、INDY(Ogawa et al., "Development of a Novel Selective Inhibitor of the Down Syndrome-Related Kinase Dyrk1A," Nat. Commun. 1: Article Number 86 (2010)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、DANDY(Gourdain et al., "Development of DANDYs, New 3,5-Diaryl-7-Azaindoles Demonstrating Potent DYRK1A Kinase Inhibitory Activity," J. Med. Chem. 56(23):9569-9585 (2013)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、およびFINDY(Kii et al., "Selective Inhibition of the Kinase DYRK1A by Targeting its Folding Process," Nat. Commun. 7:11391 (2016)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、ピラゾリジン-ジオン(Koo et al., "QSAR Analysis of Pyrazolidine-3,5-Diones Derivatives as Dyrk1A Inhibitors," Bioorg. Med. Chem. Lett. 19(8):2324-2328 (2009); Kim et al., "Putative Therapeutic Agents for the Learning and Memory Deficits of People with Down Syndrome," Bioorg. Med. Chem. Lett. 16(14):3772-3776 (2006)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、アミノ-キナゾリン(Rosenthal et al., "Potent and Selective Small Molecule Inhibitors of Specific Isoforms of Cdc2-Like Kinases (Clk) and Dual Specificity Tyrosine-Phosphorylation-Regulated Kinases (Dyrk)," Bioorg. Med. Chem. Lett. 21(10):3152-3158 (2011)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、メリオリン(Giraud et al., "Synthesis, Protein Kinase Inhibitory Potencies, and In Vitro Antiproliferative Activities of Meridianin Derivatives," J. Med. Chem. 54(13):4474-4489 (2011); Echalier et al., "Meriolins (3-(Pyrimidin-4-yl)-7-Azaindoles): Synthesis, Kinase Inhibitory Activity, Cellular Effects, and Structure of a CDK2/Cyclin A/Meriolin Complex," J. Med. Chem. 51(4):737-751 (2008);およびAkue-Gedu et al., "Synthesis and Biological Activities of Aminopyrimidyl-Indoles Structurally Related to Meridianins," Bioorg. Med. Chem. 17(13):4420-4424 (2009)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、ピリジンおよびピラジン(Kassis et al., "Synthesis and Biological Evaluation of New 3-(6-hydroxyindol-2-yl)-5-(Phenyl) Pyridine or Pyrazine V-Shaped Molecules as Kinase Inhibitors and Cytotoxic Agents," Eur. J. Med. Chem. 46(11):5416-5434 (2011)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、クロメノイドール(Neagoie et al., "Synthesis of Chromeno[3,4-b]indoles as Lamellarin D Analogues: A Novel DYRK1A Inhibitor Class," Eur. J. Med. Chem. 49:379-396 (2012)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、11H-インドロ[3,2-c]キノリン-6-カルボン酸，チアゾロ[5,4-f]キナゾリン(EHT 5372)(Foucourt et al., "Design and Synthesis of Thiazolo[5,4-f]quinazolines as DYRK1A Inhibitors, Part I. ," Molecules 19(10):15546-15571 (2014)およびCoutadeur et al., "A Novel DYRK1A (Dual Specificity Tyrosine Phosphorylation-Regulated Kinase 1A) Inhibitor for the Treatment of Alzheimer's Disease: Effect on Tau and Amyloid Pathologies In Vitro," J. Neurochem. 133(3):440-451 (2015)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、および5-ヨードツベルシジン(Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016)およびAnnes et al., "Adenosine Kinase Inhibition Selectively Promotes Rodent and Porcine Islet β-cell Replication," Proc. Natl. Acad. Sci. 109(10):3915-3920 (2012)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)がキナーゼ選択性の度合が異なる強力なDYRK1A活性を示す。

好適なチアジアジンキナーゼ阻害剤は、例えば、その全体において参照により本明細書に組み入れられる2018年11月20日に出願のPCT Application No. PCT/US2018/062023に記載のものを非限定的に含む。具体例は表1および2に示すものを含む。

（表１）チアジアジンキナーゼ阻害剤

（表２）追加のチアジアジンキナーゼ阻害剤

上に記載のように、グルカゴン様ペプチド-1受容体作動薬は、食物摂取に応答して腸から放出されるインクレチンホルモンGLP-1の効果を模倣する。それらの効果は、インスリン分泌を増加させること、グルカゴン放出を減少させること、満腹感を増加させること、および胃排出を遅延させることを含む。

開示の方法を実施するための好適なGLP1R作動薬は、エキセナチド、リラグルチド、エキセナチドLAR、タスポグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、およびセマグルチドを非限定的に含む。エキセナチドおよびエキセナチドLARはアメリカドクトカゲ(Heloderma suspectum)(トカゲ)の唾液から得られる合成エキセンディン-4類似体である。リラグルチドは、皮下注射部位からの吸収を遅らせる7量体構造へと自己会合する、GLP-1のアシル化類似体である。タスポグルチドは未変性のGLP-1と3％の相同性を有し、DPP-4の分解に対して完全な耐性がある。リキシセナチドはヒトGLP1R作動薬である。アルビグルチドは長時間作用性のGLP-1模倣薬であり、DPP-4の分解に対して耐性がある。デュラグルチドは長時間作用性GLP1類似体である。セマグルチドはT2Dでの使用に承認されているGLP1R作動薬である。臨床的に利用可能なGLP1R作動薬は、例えば、エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド、デュラグルチド、リキシセナチド、セマグルチドを含む。

いくつかの態様では、GLP1R作動薬は、GLP1(7-36)、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

追加の好適なGLP1作動薬は、二置換-7-アリール-5,5-ビス(トリフルオロメチル)-5,8-ジヒドロピリミド[4,5-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン化合物およびそれらの誘導体、例えば、7-(4-クロロフェニル)-1,3-ジメチル-5,5-ビス(トリフルオロメチル)-5,8-ジヒドロピリミド[4,5-d]ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(例えば、その全体において参照により本明細書に組み入れられるNance et al., "Discovery of a Novel Series of Orally Bioavailable and CNS Penetrant Glucagon-like Peptide-1 Receptor (GLP-1R) Noncompetitive Antagonists Based on a 1,3-Disubstituted-7-aryl-5,5-bis(trifluoromethyl)-5,8-dihydropyrimido[4,5-d]pyrimidine-2,4(1H,3H)-dione Core," J. Med. Chem. 60:1611-1616 (2017)を参照されたい)を非限定的に含む。

さらなる好適なGLP1作動薬は、GLP1Rのポジティブアロステリックモジュレータ(「PAMS」)、例えば、(S)-2-シクロペンチル-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド;(R)-2-シクロペンチル-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；2-シクロペンチル-N-(((S)-1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピラジノ[1,2-a]インドール-4-カルボキサミド；N-(((S)-1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-2-((S)-テトラヒドロフラン-3-イル)-l,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；N-(((R)-1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-2-((S)-テトラヒドロフラン-3-イル)-l,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-2-シクロペンチル-8-フルオロ-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-2-シクロペンチル-8-フルオロ-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-2-シクロペンチル-N-(((S)-1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピラジノ[1,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-2-シクロペンチル-N-(((S)-1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2,3,4-テトラヒドロピラジノ[1,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-10-クロロ-2-シクロペンチル-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-10-クロロ-2-シクロペンチル-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-10-ブロモ-2-シクロペンチル-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-10-ブロモ-2-シクロペンチル-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-2-フェニル-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-10-シアノ-2-シクロペンチル-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-2-シクロペンチル-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-1-オキソ-10-ビニル-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-N-((1-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-2-(l-メチル-lH-ピラゾール-4-イル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[1,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-2-(1-メチル-lH-ピラゾール-4-イル)-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[1,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(S)-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-l-オキソ-2-(ピリジン-3-イル)-l,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；(R)-N-((l-イソプロピルピロリジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-2-(ピリジン-3-イル)-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；N-(アゼチジン-2-イルメチル)-2-シクロペンチル-10-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[1,2-a]インドール-4-カルボキサミド；および2-シクロペンチル-N-((1-イソプロピルアゼチジン-2-イル)メチル)-10-メチル-1-オキソ-1,2-ジヒドロピラジノ[l,2-a]インドール-4-カルボキサミド；またはそれらの薬学的に許容される塩(その全体において参照により本明細書に組み入れられるPCT Publication No. WO 2017/117556を参照されたい)を含む。

本明細書において記載される方法を実施する際には、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、ハルミンおよびGLP1(7-36)を用いて実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、ハルミンおよびN-(4-フルオロベンジル)-5-(ベンゾ[d]イミダゾール-2(3H)-オン)-6H-1,3,4-チアジアジン-2-アミンを用いて実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、DYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬とを両方含む単一組成物を用いて実施してもよい。あるいは、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は逐次的に実施してもよい。例えば、膵臓ベータ細胞の集団をまず二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤(または二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤を含む組成物)、次いでグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬(またはグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を含む組成物)と接触させてもよいし、またはまずグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬(またはその組成物)、次いで二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤(またはその組成物)と接触させてもよい。

本明細書において記載される方法を実施する際には、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、1日に複数回、1日1回、週1回、週2回、月1回、隔月1回、1年1回、半年1回、またはその間の任意の期間に行ってもよい。DYRK1A阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬は異なる投与頻度で投与してもよい。DYRK1A阻害剤およびGLP1R作動薬と膵臓ベータ細胞の集団を接触させる工程は短期的にまたは長期的に行われてもよい。例えば、接触させる工程は1年、2年、3年、4年、またはそれ以上の期間にわたって長期的に行われてもよい。いくつかの態様では、投与が行われる頻度は低い。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、集団における増殖性膵臓ベータ細胞の数を少なくとも約4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％またはそれ以上増加させるために実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、集団における増殖性膵臓ベータ細胞の数を1日あたり約4〜10％、または1日あたり約4〜6％、1日あたり5〜7％、1日あたり6〜9％、または1日あたり7〜10％増加させるために実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、集団における増殖性膵臓ベータ細胞の数を1日あたり約6〜10％増加し得る。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる方法は、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施されてもよく、これは、とりわけ、細胞がDYRK1A阻害剤もしくはGLP1R作動薬のみと接触される場合または細胞がDYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬のどちらとも接触されない場合と比較して、集団における増殖性膵臓ベータ細胞数の増加を意味する。

本方法および他の方法を実施する際には、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程は、細胞集団においてベータ細胞死またはDNA損傷を誘導しなくてもよい。さらに、接触させる工程は、ベータ細胞の分化を誘導しかつグルコース刺激インスリン分泌を増加させてもよい。

方法は細胞寿命を向上させるために実施してもよい。例えば、方法は、未処理の膵臓ベータ細胞の集団と比較して、処理された膵臓ベータ細胞の集団の細胞寿命を向上させるために実施してもよい。あるいは、方法は、未接触の膵臓ベータ細胞の集団と比較して、接触させた膵臓ベータ細胞の集団の細胞死またはアポトーシスを減少させるために実施してもよい。

別の局面は、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法に関する。本方法は、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

開示の別の局面は、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法に関する。本方法は、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)阻害剤とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

本明細書において用いられるように、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態とは、対象が血中の正常なグルコースレベルを維持するのに必要とされるよりも低いインスリンの血漿レベルを生じ、不十分なインスリン分泌に関連する状態の対象が高血糖になる状態を意味する。そのような状態では、罹患した対象の膵臓ベータ細胞は、血中グルコースの正常な濃度(すなわち、正常血糖)の存在を維持するには不十分なレベルのインスリンを分泌する。

不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態の1つはインスリン抵抗性である。インスリン抵抗性は対象の細胞がインスリンのグルコース低下作用に対して感受性がより低くなる状態である。筋肉および脂肪細胞におけるインスリン抵抗性はグルコースの取り込み(ひいては、グリコーゲンおよびトリグリセリドとしてのグルコースの局所貯蔵)を減少させるのに対し、肝細胞におけるインスリン抵抗性はグリコーゲンの合成および貯蔵の減少ならびにグルコースの産生および血中への放出の抑制不全をもたらす。インスリン抵抗性とは通常インスリンのグルコース低下作用の減少を指す。しかしながら、インスリンの他の機能も影響を受ける場合がある。例えば、脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、脂質に対するインスリンの正常な効果を減少させ、循環する脂質の取り込みの減少および貯蔵されたトリグリセリドの加水分解の増加をもたらす。これらの細胞における貯蔵された脂質の動員が増加すると血漿中の遊離脂肪酸が上昇する。血中脂肪酸濃度の上昇、筋肉のグルコース取り込みの減少、および肝臓のグルコース産生の増加はすべて血中グルコースレベルの上昇に寄与する。インスリン抵抗性がある場合、より多くのインスリンが膵臓から分泌される必要がある。この代償的な増加が起こらない場合、血糖濃度が増加し、II型糖尿病が起きる。

不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態の1つは糖尿病である。糖尿病はI型(「T1D」)およびII型(「T2D」)という大きく2つのタイプの糖尿病に分類できる。「糖尿病」という用語は、本明細書においては、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成人発症型糖尿病(「MODY」)、嚢胞性線維症関連糖尿病、ヘモクロマトーシス関連糖尿病、薬物性糖尿病(例えば、ステロイド糖尿病)、およびいくつかの形態の単一遺伝子糖尿病を含む、患者が高血糖値を有する代謝性疾患群も指す。

特定の態様では、対象はI型糖尿病(T1D)、II型糖尿病(T2D)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成人発症型糖尿病(MODY)、嚢胞性線維症関連糖尿病、ヘモクロマトーシス関連糖尿病、薬物性糖尿病、または単一遺伝子糖尿病のうちの1つもしくは複数を有するか、またはそれらのうちの1つもしくは複数について治療を受けている。例えば、対象はI型糖尿病を有するかまたはI型糖尿病について治療を受けている。あるいは、対象はII型糖尿病を有するかまたはII型糖尿病について治療を受けている。

不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態はメタボリックシンドロームである。メタボリックシンドロームは、概して、II型糖尿病およびアテローム性動脈硬化性血管疾患の発症リスクの増加に関連する異常群を規定するために用いられる。関連した状態および症状は、空腹時高血糖症(II型糖尿病もしくは空腹時血糖異常、耐糖能異常、またはインスリン抵抗性)；高血圧；主に腰周りに脂肪が沈着する体重過多を意味する中心性肥満(内臓、男性型またはリンゴ型脂肪症としても公知である)；HDLコレステロールの低下；およびトリグリセリドの上昇を非限定的に含む。

不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態はメタボリックシンドロームまたはインスリン抵抗性であってもよい。よって、本発明の方法は、メタボリックシンドロームまたはインスリン抵抗性を有するかまたはそれについて治療されている対象を治療するために実施してもよい。

不十分なインスリン分泌レベルに関連しうる他の状態は、高尿酸血症、非アルコール性脂肪肝疾患へと進行する脂肪肝(特に同時に起こる肥満において)、多嚢胞性卵巣症候群(女性において)、および黒色表皮腫を非限定的に含む。

関連障害も、本明細書において開示された治療方法に従って治療されてもよく、高血糖症などの正常範囲外の血液または血漿グルコースレベルに関連する任意の疾患を非限定的に含む。従って、「関連障害」という用語は耐糖能異常(「IGT」)、空腹時血糖異常(「IFG」)、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、食後高血糖、および過体重/肥満を含む。そのような関連障害は異常な血液および/または血漿インスリンレベルも特徴とし得る。

方法は、ベータ細胞の不全または欠乏に関連する状態の対象を治療するために実施してもよい。そのような状態は、I型糖尿病(T1D)、II型糖尿病(T2D)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成人発症型糖尿病(MODY)、嚢胞性線維症関連糖尿病、ヘモクロマトーシス関連糖尿病、薬物性糖尿病、または単一遺伝子糖尿病を非限定的に含む。薬物性糖尿病は、ベータ細胞に対して毒性のある薬物(例えば、ステロイド、抗うつ薬、第二世代抗精神病薬、および免疫抑制薬)の使用を通じて引き起こされる状態に関する。例示的な免疫抑制薬はコルチゾンファミリーのメンバー(例えば、プレドニゾンおよびデキサメタソーム)、ラパマイシン/シロリムス、エベロリムス、およびカルシニューリン阻害剤(例えば、FK-506/タクロリムス)を非限定的に含む。

ベータ細胞欠乏に関連する追加の状態は、無自覚性低血糖、不安定型インスリン依存性糖尿病、膵臓切除、膵臓部分切除、膵臓移植、膵島同種移植、膵島自家移植、および膵島異種移植を非限定的に含む。

本明細書において用いるように、無自覚性低血糖は、血糖値の低下を患者に警告する働きをする高血糖症の特徴的な症状(例えば、動悸、発汗、不安)を生じさせるエピネフリンの分泌を誘発することができないため患者が血糖値の大幅な低下に気づかない、糖尿病の合併症である。

膵臓移植は、単独で、腎移植後に、または腎移植と組み合わせて行ってもよい。例えば、至適な医療管理にもかかわらず持続する無自覚性低血糖および不安定型インスリン依存性糖尿病により、重度の障害および生命を脅かす可能性のある合併症がある患者では単独の膵臓移植が医学的に必要であると考えられることがある。以前の腎臓移植に続く膵臓移植はインスリン依存性糖尿病の患者において行われることがある。尿毒症があるインスリン依存性糖尿病患者では膵臓移植と組み合わせて腎臓移植が行われることがある。膵臓の再移植は先の膵臓移植がうまくいかなかった後に考えられることがある。

本明細書において用いるように、膵島移植とはインスリン産生ベータ細胞およびグルカゴン産生アルファ細胞を含む膵臓の内分泌細胞を含有するランゲルハンス島のみが単離されて患者に移植される手法である。膵島同種移植はランゲルハンス島が1つまたは複数のヒトドナー膵臓から単離される場合に行われる。膵島細胞はまたヒト胚性幹細胞または人工多能性幹細胞に由来してもよい。膵島異種移植はランゲルハンス島が1つまたは複数の非ヒト膵臓(ブタの膵臓または霊長類の膵臓)から単離される場合に行われる。膵島自家移植は、膵切除術(例えば、胆石、薬物、および/または家族性遺伝的原因からの慢性膵炎のため)を受けた患者の膵臓からランゲルハンス島が単離され、門脈への輸液を介して、卵巣への腹腔鏡検査法を介して、胃壁への内視鏡検査法を介して、または小切開を介した皮下的に、同じ患者に戻される場合に行われる。膵臓移植と同様に、膵島移植は単独で、腎臓移植後、または腎臓移植と組み合わせて実施できる。例えば、膵島移植は、低血糖自覚を回復し、血糖コントロールを提供し、かつ/または重度の低血糖事象から患者を保護するために単独で行われてもよい(Hering et al., "Phase 3 Trial of Transplantation of Human Islets in Type 1 Diabetes Complicated by Severe Hypoglycemia," Diabetes Care 39(7):1230-1240 (2016)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

膵島移植は膵全摘術と組み合わせて行ってもよい。例えば、膵島移植は、外科的に誘導される糖尿病をβ細胞機能を維持することによって防止するかまたは改善するために、膵全摘術後に実施してもよい(Johnston et al., "Factors Associated With Islet Yield and Insulin Independence After Total Pancreatectomy and Islet Cell Autotransplantation in Patients With Chronic Pancreatitis Utilizing Off-site Islet Isolation: Cleveland Clinic Experience," J. Chem. Endocrinol. Metab. 100(5):1765-1770 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。よって、膵島移植は持続的な長期のインスリン非依存性を提供し得る。

いくつかの態様では、膵島移植は免疫抑制剤の投与と組み合わせて行ってもよい。好適な免疫抑制剤はダクリズマブ(ゼナパックス；ロシュ)、低用量ラパマイシン(シロリムス)、およびFK506(タクロリムス)を非限定的に含む(Van Belle et al., "Immunosuppression in Islet Transplantation," J. Clin. Invest. 118(5):1625-1628 (2008)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

いくつかの態様では、膵島移植は、移植された膵島細胞にグルコースおよび栄養素が到達することを可能にしつつ、移植された膵島細胞を宿主の自己免疫応答から保護する封止デバイスという観点で行ってもよい。

本明細書において記載される方法は、患者における膵臓β細胞を再生することによって膵臓、膵島同種移植、膵島自家移植、膵島異種移植を向上させるために実施してもよい。例えば、本願の方法は、外科的に誘導される糖尿病をβ細胞機能を維持することによって防止するかもしくは改善し、低血糖自覚を回復し、血糖コントロールを提供し、かつ/または重度の低血糖事象から患者を保護するために用いられてもよい。よって、開示の別の局面は、移植患者における膵臓ベータ細胞を再生させる方法に関する。本方法は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを移植患者に投与する工程であって、移植患者における膵臓ベータ細胞を再生するために患者における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

方法はII型糖尿病を発症するリスクのある対象を治療するために実施してもよい。II型糖尿病を発症するリスクのある対象は前糖尿病/メタボリックシンドロームを有し得る。

II型糖尿病を発症するリスクのある患者は、うつ病、強迫性障害(「OCD」)などのための選択的セロトニン再取り込み阻害薬(「SSRI」)を非限定的に含む向精神薬での治療を受けた可能性がある。

対象は、哺乳類対象、例えば、ヒト対象であってもよい。好適なヒト対象は、ベータ細胞および/またはインスリンが欠乏した小児、成人、および高齢者を非限定的に含む。

対象はまたウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、ウマ、ネズミ、イヌ、ウサギなどの非ヒトであってもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、対象における増殖性膵臓ベータ細胞の数を少なくとも約4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、またはそれ以上増加させ得る。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、対象における増殖性膵臓ベータ細胞の数を1日あたり約4〜10％、または1日あたり約4〜6％、1日あたり5〜7％、1日あたり6〜9％、または1日あたり7〜10％増加させるために実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、対象における増殖性膵臓ベータ細胞の数を1日あたり約6〜10％増加させ得る。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、対象の膵臓ベータ細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌を増加させ得る(例えば、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とが投与されていない対象と比較して)。

DYRK1A阻害剤は、ハルミンINDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、CC-401、チアジアジンキナーゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。例示的なDYRK1A阻害剤は上に詳細に記載している。

GLP1R作動薬は、上に記載のGLP1類似体、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、ハルミンおよびGLP1(7-36)を用いて実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、ハルミンおよびN-(4-フルオロベンジル)-5-(ベンゾ[d]イミダゾール-2(3H)-オン)-6H-1,3,4-チアジアジン-2-アミンを用いて実施してもよい。

二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、DYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬とを両方含む単一組成物を投与することによって実施してもよい。あるいは、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は逐次的に実施してもよい。例えば、対象にまず二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤(または二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤を含む組成物)、次いでグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬(またはグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を含む組成物)を投与してもよいし、またはまずグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬(またはその組成物)、次いで二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤(またはその組成物)を投与してもよい。

投与工程は、1日に複数回、1日1回、週1回、週2回、月1回、隔月1回、1年1回、半年1回、またはその間の任意の期間に行ってもよい。DYRK1A阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬は異なる投与頻度で投与してもよい。いくつかの態様では、投与は短期的にまたは長期的に行われてもよい。例えば、投与工程は1年、2年、3年、4年、またはそれ以上の期間にわたって長期的に実施してもよい。いくつかの態様では、投与が行われる頻度は低い。本明細書において用いるように、「治療する」という用語は予防的または回復的または治癒的治療を意味する。言い換えると、治療方法は、対象が不十分なインスリン分泌に関連する状態になることまたは不十分なインスリン分泌に関連する対象の状態が悪化することを防止するために実施してもよい。代替的には、治療方法は、不十分なインスリン分泌に関連する対象の状態を改善するためにまたは該状態を完全に治癒するために(すなわち、対象が、適格な医療従事者によって、不十分なインスリン分泌に関連する状態をもはや有さないと判断されるように)実施される。

「治療する」という用語は、対象におけるグルコース恒常性異常の、是正、変化率の低下、または減少を意味する。血中グルコースレベルは一日を通して変動する。グルコースレベルは、朝その日の最初の食事の前には通常はより低く、食後は数時間上昇する。その結果、「治療する」という用語は、対象の血中グルコースレベルを増加させるかまたは低下させることによって対象における血中グルコースレベルを制御することを含む。血中グルコースレベルは一日を通して変動するため、これは対象の状態および/または1日のうちの特定の時間を含む多くの要因に応じて異なる場合がある。

「治療する」とは、糖尿病または関連障害を有する対象における血中グルコースレベルの一時的なまたは持続的な低下を調節することを意味する。「治療する」という用語は、対象におけるインスリン放出(例えば、膵臓ベータ細胞による)を改善することも意味する場合がある。

異常なレベル(すなわち、正常なグルコース恒常性を有する対応する対象の公知の基準値、中央値、または平均値を下回るかまたは上回るレベル)を有する対象における血中または血漿グルコースレベルを正常化するかまたは調節するために対象における血中グルコースレベルを調整することが望ましい場合がある。本発明の治療方法は、そのような効果を達成するために実施してもよい。

治療方法を実施する際には、二重特異性チロシンキナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを対象に投与する工程は、二重特異性チロシンキナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤もしくはグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬または両方を含む薬学的組成物を治療有効量で投与することを含んでもよく、これは、対象における記載の状態および/または障害を治療するのに有効なDYRK1A阻害剤およびGLP1R作動薬の量を意味する。そのような量は、概して、当業者の知識の範囲内で多くの要因に応じて異なる。これらは、特定の対象の全身的な健康、年齢、体重、身長、全身的な身体状態、病歴、用いられる特定の化合物や、それが製剤化される担体、およびそのために選択される投与経路、治療の長さまたは期間、ならびに治療されている状態の性質および重症度を非限定的に含む。

投与工程は、典型的には、薬学的に許容される剤形を投与することを伴い、これは、本明細書において記載される化合物の剤形を意味し、例えば、錠剤、糖衣剤、粉末、エリキシル、シロップ、懸濁液を含む液体製剤、スプレー、吸入剤錠剤、トローチ、乳剤、溶液、顆粒、カプセル、および坐剤や、リポソーム製剤を含む注射用液体製剤を含む。技術や製剤化は、概して、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest editionに見出され得、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる。

治療方法を実施する際には、DYRK1A阻害剤およびGLP1R作動薬は、任意の好適な担体物質中、任意の適切な量で含有されてもよい。DYRK1A阻害剤およびGLP1R作動薬は組成物の総重量のうち最大で99重量％の量で存在してもよい。組成物は経口、非経口(例えば、静脈内、筋肉内)、直腸、皮膚、経鼻、経膣、吸入、表皮(パッチ)、または眼球投与経路に好適な剤形で提供されてもよい。よって、組成物は、例えば、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、懸濁液、乳液、溶液、ヒドロゲルを含むゲル、ペースト、軟膏、クリーム、硬膏剤、水薬、浸透圧送達デバイス、坐剤、浣腸、注射剤、インプラント、スプレー、またはエアロゾルの形態であってもよい。

薬学的組成物は、投与時に実質的に直ちにまたは投与後の任意の所定の時間もしくは期間、活性DYRK1A阻害剤およびGLP1R作動薬を放出するように、製剤化してもよい。

制御放出製剤は、(i)長期間にわたり体内に実質的に一定の薬物濃度を作り出す製剤；(ii)所定のラグタイム後に長期間にわたり体内で実質的に一定の薬物濃度を作り出す製剤；(iii)活性薬物成分の血漿レベルの変動に関連する望ましくない副作用を最小限に抑えながら体内で比較的一定の有効な薬物レベルを維持することによって所定の期間にわたり薬物作用を持続する製剤；(iv)例えば患部組織または器官に隣接するかまたはその内部に制御放出組成物を空間的に配置することによって、薬物の作用を局在化させる製剤；および(v)特定の標的細胞型に薬物を送達するために担体または化学誘導体を用いることによって薬物作用を標的に向かわせる製剤を含む。

制御放出製剤の形態でのDYRK1A阻害剤およびGLP1R作動薬の投与は、薬物の(i)治療指数が狭い(すなわち、有害な副作用または毒性反応につながる血漿濃度と治療効果につながる血漿濃度との差が小さい；一般に、治療指数(「TI」)は半数致死量(LD₅₀)の半有効量(ED₅₀)に対する比として規定される)場合；(ii)消化管における吸収窓が狭い場合；または(iii)生物学的半減期が非常に短いため、血漿レベルを治療レベルに維持するためには1日の間に頻繁に投与する必要がある場合に、特に好ましい。

当のDYRK1A阻害剤および/またはGLP1R作動薬の代謝速度よりも放出速度が上回る制御放出を得るために、多数の手法のうちの任意のものを遂行することができる。制御放出は、例えば様々なタイプの制御放出組成物およびコーティングを含む、様々な製剤パラメーターおよび成分の適切な選択によって取得してもよい。よって、薬物は、適切な賦形剤と共に、投与時には制御された様式で薬物を放出する薬学的組成物(単一または複数の単位錠剤またはカプセル組成物、油性溶液、懸濁液、乳液、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、およびリポソーム)へと製剤化される。よって、投与工程は、経鼻的に、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下的に、静脈内的に、筋肉内的に、腹腔内的に、経鼻注入によって、体腔内または膀胱内注入によって、眼内的に、動脈内的に、病巣内的に、または粘膜への塗布によって実施してもよい。化合物は単独でまたは好適な薬学的担体と共に投与してもよく、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、またはエマルジョンなどの固体または液体形態であってもよい。特定の態様では、投与工程は、経鼻、経口、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内的に実施される。

特定の態様では、投与は、例えば、速度制御注入、定期的注入、および/またはボーラス用量注入を提供するために輸液ポンプを用いて実施される。輸液ポンプは据置型または携帯型の輸液ポンプであってもよい。据置型輸液ポンプは主に患者の枕元で用いられる。携帯型輸液ポンプは特定(selected)の対象に薬物および他の注入可能物質(例えば、インスリン)を導入するために用いられる比較的小型で少なくとも実質的に自給式の装置である。一部の携帯型輸液ポンプはベルトに装着したり、衣服のポケットに入れたり、そうでなければ何らかのホルダ内に支持されるように構成される(まとめて「ポケットポンプ」と呼ばれる)。他の輸液ポンプはパッチのように皮膚に貼付するように構成される(「パッチポンプ」と呼ばれる)。輸液ポンプは、例えば、臨床環境の外で継続的またはさらに連続的に薬物を静脈内または皮下に導入する(または「注入する」)ために用いてもよい。輸液ポンプは針を用いた注射などの皮下へのアクセス事象の頻度を大幅に減少させる。特定の態様では、輸液ポンプは皮下または静脈内輸液ポンプである。例えば、輸液ポンプは携帯型皮下インスリン輸液ポンプであってもよい。

さらなる局面は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを含む組成物に関する。

好適なDYRK1A阻害剤は上に記載しており、例えば、ハルミン、INDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、CC-401、キナーゼ阻害剤、およびそれらの誘導体を含む。

好適なGLP1R作動薬は上に記載しており、例えば、エキセンディン-4、リラグルチド、リキセナチド、セマグルチド、およびそれらの誘導体を含む。

組成物は担体をさらに含んでもよい。好適な担体は上に記載している。担体は薬学的に許容される担体であってもよい。好適な薬学的に許容される担体は上に記載している。

別の局面は、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法に関する。本方法は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびcAMPを増加させる化合物と膵臓ベータ細胞の集団を接触させる工程であって、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

開示の別の局面は、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法に関する。本方法は、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とcAMPを増加させる化合物とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

開示のさらなる局面は、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とcAMPを増加させる化合物とを含む組成物に関する。

環状アデノシン一リン酸(cAMP)は、β細胞の複製を調節する細胞内セカンドメッセンジャーである。いくつかの態様では、開示の方法を実施するためのcAMPを増加させる化合物は、ジブチル-cAMPおよび/または8-クロロ-cAMPを含むcAMP類似体を含む。cAMPの増加は、若年のげっ歯類においてベータ細胞の複製を増加させることが示されている(Zhao et al., "Repurposing cAMP-Modulating Medications to Promote β-Cell Replication," Mol. Endocrinol. 28(10):1682-1697 (2014)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。しかしながら、図5A〜5Hに示されているように、cAMPを増加させる薬剤の投与は、投与がDYRK1阻害剤(例えば、ハルミン)と組み合わせて行われない限り、ヒトベータ細胞の増殖に対する効果を有さない。よって、本開示は、DYRK1A阻害剤と組み合わせてcAMPを増加させることがヒトベータ細胞の増殖を相乗的に増加させることを初めて実証する。

cAMPの細胞内レベルは、アデニルシクラーゼ(「AC」)および環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ(PDE)という2つの酵素の活性間のバランスによって調節される。ほとんどのACは、G_sタンパク質のαサブユニット(α_s)との相互作用によってβアドレナリン受容体などのGタンパク質共役受容体(GPCR)の下流で活性化され、このαサブユニットはGPCR(例えば、βアドレナリン受容体の場合はエピネフリン)に作動薬リガンドが結合した後にヘテロ三量体αβγGタンパク質複合体から放出されACに結合してこれを活性化する(Sassone-Corsi, "The Cyclic AMP Pathway," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4(12) (2012)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

βアドレナリン受容体はβ₁、β₂、およびβ₃サブタイプに分類され、それらのそれぞれがG_sタンパク質に結合する。β細胞上のβ₂アドレナリン受容体の活性化は細胞内のcAMPを増加させる。よって、特定の態様では、開示の方法を実施するためのcAMPを増加させる化合物はβ₂アドレナリン受容体作動薬を含む。好適なβ₂アドレナリン受容体作動薬はエピネフリン、アルブテロール(サルブタモール)、メシル酸ビトルテロール、ホルモテロール、イソプレナリン、レバルブテロール、メタプロテレノール、サルメテロール、テルブタリン、および/またはリトドリンを非限定的に含む。

様々なGPCRが、cAMP依存性シグナル伝達経路およびcAMPの細胞内レベルを活性化することによってβ細胞の複製を促進する。特定の態様では、細胞内cAMPレベルを増加させる化合物はGPCRのためのリガンドである。cAMPレベルを増加させるための好適(かつ非限定的)な作動薬を下の表3に列挙する。

（表３）例示的なGPCR、リガンドおよび作動薬

追加のGPCRは、その全体において参照により本明細書に組み入れられ、ヒト膵島に存在する293個のGPCRを同定しているAmisten et al., "An Atlas and Functional Analysis of G-Protein Coupled Receptors in Human Islets of Langerhans," Pharmacol. Ther. 139(3):359-391 (2013)に記載されている。

ノルエピネフリンはβ細胞におけるcAMP合成の生理的抑制剤として機能し、α₂アドレナリン受容体の活性化を介してβ細胞の活性化を阻害する(Zhao et al., "Repurposing cAMP-Modulating Medications to Promote β-Cell Replication," Mol. Endocrinol. 28(10):1682-1697 (2014)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。よって、α₂アドレナリン受容体の阻害は細胞内cAMPレベルを増加させる。特定の態様では、開示の方法を実施するためのcAMPを増加させる化合物は、ミルタザピンを非限定的に含むα₂アドレナリン受容体拮抗薬を含む。

PDEはcAMPの加水分解を触媒する。ヒトでは、11の構造的に関連したファミリー(PDE1-11)を含む21のPDE遺伝子が存在する。B細胞は、PDE1、PDE3、PDE4、PDE7、PDE8、PDE10、およびPDE11を含むいくつかのPDEファミリーメンバーを発現する。

PDE阻害剤はPDEによる細胞内セカンドメッセンジャー(例えば、cAMP)の分解を防止することによって細胞内cAMPレベルを増加させる。よって、開示の方法を実施するためのcAMPを増加させる好適な化合物はホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤を非限定的に含む。特定の態様では、PDE阻害剤は非選択的阻害剤である。例えば、PDE阻害剤は3-イソブチル-1-メチルキサンチン、ザルダベリン、および/またはトレキンシンであってもよい。特定の態様では、PDE阻害剤はPDE1阻害剤、PDE3阻害剤、PDE4阻害剤、PDE7阻害剤、PDE8阻害剤、PDE10阻害剤、および/またはPDE11阻害剤である。好適なPDE3阻害剤はシロスタミドおよび/またはミルリノンを非限定的に含む。好適なPDE4阻害剤はイルソグラジン、グラウシン、エタゾレート、CGH2466、ロリプラム、および/またはベイ19-8004を非限定的に含む。好適なPDE5阻害剤はジピリダモール、バルデナフィル、および/またはタダラフィルを非限定的に含む。好適なPDE10阻害剤はパパベリンを非限定的に含む。特定の態様では、PDE阻害剤はトレキンシン、ザルダベリン、シロスタミドからなる群より選択される。特定の態様では、PDE阻害剤はPDE4/PDE10阻害剤として作用することによってβ細胞の複製を増加させる。したがって、PDE阻害剤はジピリダモールである。

いくつかの態様では、PDE阻害剤はα細胞ではなくβ細胞に特異的である(Zhao et al., "Repurposing cAMP-Modulating Medications to Promote β-Cell Replication," Mol. Endocrinol. 28(10): 1682-1697 (2014)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。よって、ある態様では、PDE阻害剤はジピリダモールである。

上に記載のように、GLP1R作動薬と、酵素ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)による内因性GLP1の分解を防止する追加の薬剤とは、げっ歯類のベータ細胞における増殖を誘導することが示されているが、大人のヒト膵島におけるベータ細胞の複製の活性化を示すことはできなかった(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018)およびDeacon et al., "Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes: Comparison, Efficacy and Safety," Expert Opin. Pharmacother. 14(15):2047-2058 (2013)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。本開示は、GLP1活性を増加させる薬剤と組み合わせてDYRK1Aを阻害することがヒトベータ細胞の増殖を相乗的に増加させることを実証する。

よって、開示の別の局面は、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法に関する。本方法は、不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)阻害剤とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程を伴う。

本明細書において上に記載のように、本明細書において記載される方法はインビボで実施してもよい。いくつかの態様では、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)阻害剤とを投与する工程は、DYRK1A阻害剤とDPP4阻害剤とを両方含む組成物を用いて実施される。

本明細書において上に記載のように、対象はI型糖尿病(「T1D」)、II型糖尿病(「T2D」)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成人発症型糖尿病(「MODY」)、嚢胞性線維症関連糖尿病、ヘモクロマトーシス関連糖尿病、薬物性糖尿病、または単一遺伝子糖尿病のうちの1つまたは複数について治療されてもよい。いくつかの態様では、対象は哺乳類対象である。対象はヒト対象であってもよい。

本明細書において上に記載のように、二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)阻害剤とを投与する工程は、対象の膵臓ベータ細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌を増加し得る。

好適なDYRK1阻害剤は上に詳細に記載している。いくつかの態様では、DYRK1A阻害剤はハルミン、INDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、CC-401、チアジアジンキナーゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。

好適なDPPR阻害剤はシタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン、およびこれらの組み合わせを非限定的に含む(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018)およびDeacon et al., "Dipeptidyl Peptidase-4 Inhibitors for the Treatment of Type 2 Diabetes: Comparison, Efficacy and Safety," Expert Opin. Pharmacother. 14(15):2047-2058 (2013)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

実施例1〜6のための材料および方法
ヒト膵島：NIHが支援するIntegrated Islet Distribution Program (IIDP)、アルバータ大学のAlberta Diabetes Institute Islet Coreの膵島コア、アルバータ大学病院のClinical Islet Laboratoryを通じて81人の正常なドナーからヒト膵島を入手した。インフォームドコンセントおよび膵島単離センターでのIRB承認があり何らの識別情報のない死亡した臓器ドナーの膵臓から膵島を採取した。ドナーの年齢は15〜76歳の範囲(平均±SEM、45.3±12.9)で；女性が26人であり、男性が53人であった。平均BMIは30.3±5.6(17.3〜44.4の範囲)であり、冷阻血時間は604分(270〜969分の範囲)であった。純度は55〜98％の範囲(平均84.9±8.5)であった。加えて、2型糖尿病のドナー11人から膵島を入手した。年齢は26〜71歳の範囲(平均48.2±13.6)であり；女性が3人であり、男性が8人であった。平均BMIは31.7±4.4(27.3〜38.1の範囲)であり、冷阻血時間は582分(155〜1200分の範囲)であった。純度は55％〜85％の範囲であった。HbA1Cは6.6〜14.1の範囲(平均7.9)であった。3人は糖尿病薬を服用していることが公知であった(メトホルミン n=3、DPP4阻害剤 n=1)。到着時に、膵島を膵島培養培地中37℃および5％CO₂で一晩培養した(10％ウシ胎児血清(FBS)、5.5mMグルコース、および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地。膵島分散液：膵島をこれまでに記載されているように(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nature Medicine 21:383-388 (2015); Cozar-Castellano et al., "Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin-Dependent Kinase-4 and Cyclin D₁," Diabetes 53:149-59 (2004);およびFiaschi-Taesch et al., "Induction of Human Beta Cell Proliferation and Engraftment Using a Single G1/S Regulatory Molecule, cdk6," Diabetes 59:1926-36 (2010)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)アキュターゼ(Accutase)を用いて単一の細胞まで分散させた。全膵島を200×Gでの遠心分離によってペレット化し、PBS中で2回洗浄した。次いで、膵島をアキュターゼ中37℃で15〜17分間培養し、ピペットトリチュレーションによって単一の細胞へと完全に分散させた。単一の膵島細胞を700×Gでの遠心分離によってペレット化し、膵島培養液に再懸濁した。

化学物質および化合物：試薬を次のように購入した：アキュターゼ(Mediatech: 25-058-CL)、ハルミン(286044, Sigma)、ロイセチン-41(MR-C0023, Adipogen)、INDY(4997, Tocris Biosciences)、GLP-1(7-36)アミド(H-6795, Bachem)、エキセンディン-4(アセテート)(11940, Cayman)、リラグルチド酢酸塩(H-8148, Bachem)、リキシセナチド酢酸塩(H-7426, Bachem)、セマグルチドアセテート(H-7894, Bachem)、フォルスコリン(11018, Cayman)、ブクラデシン(ducladesine)(ジブチリルcAMP)(14408, Cayman)、IBMX(13347, Cayman)、ジピリダモール(18189, Cayman)、H-89(10010556, Cayman)、N6-ベンゾイル-環状AMP(5255, Tocris)、8-pCPT-2'-O-Me-環状AMP(17143, Cayman)、ESI-05(SML1907, Sigma)、組み換えヒトIL-1β(201-lb-005, R&D Systems)、組み換えヒトTNF-α(210-TA-010, R&D Systems)、Amersham細胞増殖標識試薬(RPN201, GE)。

化合物処理：分散させた膵島を、ポリ-D-リジン-ラミニンでコーティングしたガラスチャンバースライドまたはカバーガラスにプレーティングした。20〜30IEQの分散細胞に由来する細胞を1ウェルあたりに播種し、化合物処理の前に24時間回復させた。細胞をKi67染色、BrdU染色またはTUNEL標識の前に96時間処理した。TUNEL標識には、TNFαおよびIL-1βを含有するサイトカインカクテルをそれぞれ1000単位/mlおよび500単位/ml用いた。

免疫細胞化学：処理後、細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、増殖マーカー(Ki67、またはBrdU)およびインスリンに対する抗体で免疫染色した(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015); Cozar-Castellano et al., "Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin-Dependent Kinase-4 and Cyclin D₁," Diabetes 53(1):149-59 (2004);およびFiaschi-Taesch et al., "Induction of Human Beta Cell Proliferation and Engraftment Using a Single G1/S Regulatory Molecule, cdk6," Diabetes 59(8):1926-1936 (2010)、該文献のそれぞれはその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。抗体をブロッキング緩衝液(5％正常ヤギ血清(NGS)、1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.5％トリトン、PBS中)で希釈した。用いた一次および二次抗血清を下に列挙する。BrdU(細胞増殖標識試薬、Amersham GE Healthcare、GE：RPN201)を固定の18時間前に1:100希釈度で各処理に加えた。BrdU免疫染色のための抗原回収は、固定後一次抗体のインキュベーション前に30分間1N HClを用いて37℃で実施した。細胞を下の表4に従って一次および二次抗体でインキュベートした後、DAPIで対比染色した。TUNEL標識はDeadEnd Fluorometric System(カタログ番号G3250、Promega)を用いて実施した。

（表４）細胞標識試薬

アデノウイルスの生成および使用：アデノウイルスは、これまでに記載されているように(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)、CMVプロモーターの制御下、CreまたはヒトDYRK1AをコードするcDNA、またはU6プロモーターの制御下、LacZまたはヒトDYRK1Aに対するshRNAを用いて調製した。分散させたヒト膵島に無血清培地中で2時間100〜150の感染多重度で実験または対照アデノウイルスをカバーガラス上で形質導入した。10％FCSを含有する完全培地を加えて形質導入を停止させ、図に記載のように96時間細胞を培養した。

グルコース刺激インスリン分泌：インスリン放出は、ベヒクル、ハルミン、GLP1、またはそれらの組み合わせのいずれか(状態毎に20膵島当量)で72時間処理されたインタクトなヒト膵島から測定を2回繰り返した(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015); Cozar-Castellano et al., "Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin-Dependent Kinase-4 and Cyclin D₁," Diabetes 53(1):149-59 (2004);およびFiaschi-Taesch et al., "Induction of Human Beta Cell Proliferation and Engraftment Using a Single G1/S Regulatory Molecule, cdk6," Diabetes 59(8):1926-1936 (2010)、該文献のそれぞれはその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。膵島を10mM HEPES、1％BSA、および2.8mMグルコースを補充した1mlのクレブス・リンゲル重炭酸緩衝液中、5％CO₂のインキュベータにおいて37℃で1時間インキュベートし、次いで0.1％BSAと2.8または16.8mMいずれかのグルコースとを補充した1mlの新たなクレブス・リンゲル重炭酸緩衝液中37℃で30分間インキュベートした。インスリンELISA(10-1113-01、Mercodia)によるインスリン測定のために緩衝液を取り出し、収集し、-20℃で凍結させた。膵島を37℃の0.1N NaOH中で一晩消化し、タンパク質を、HClでの中和後にブラッドフォードアッセイにより測定した。インスリン値はタンパク質含有量に対して正規化する。

RNA抽出およびq-PCR：製造業者の指示書に従ってQiagen RNeasy Mini System(74104、Qiagen)を用いて、分散させた膵島から全RNAを精製した(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。次いでSuperScript IV VILO (11756050、Life Technologies)を用いてcDNAを調製した。分散させた膵島における遺伝子発現はABI 7500 Real Time PCR機器(Life Technologies、Grand Island、NY)上でBio Rad SYBRGreenシステム(1725271、BioRad)を用いて分析した。遺伝子発現の相対的定量化は参照としてシクロフィリンA(CYPA)を用いた比較サイクル閾値法によって分析した。プライマーを表5および6にて下に示す。

（表５）フォワードプライマー配列

（表６）リバースプライマー配列

定量的ヒトベータ細胞フローサイトメトリー：ヒト膵島(250〜300IEQ)または幹細胞由来ベータ細胞(300〜500,000)をアキュターゼ(MT25058CI、Fisher Scientific)(ヒト膵島用)またはトリプシン(hESC由来ベータ細胞用)を用いて分散させ、ラミニン/ポリ-D-リジンでコーティングしたチャンバースライド(BD354688、VWR Scientific)にプレーティングした。ヒト膵島については、これまでに記載されているようにベータ細胞をアデノウイルスで標識した(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015); Cozar-Castellano et al., "Induction of Beta Cell Proliferation and Retinoblastoma Protein Phosphorylation in Rat and Human Islets Using Adenoviral Delivery of Cyclin-Dependent Kinase-4 and Cyclin D₁," Diabetes 53(1):149-59 (2004);およびFiaschi-Taesch et al., "Induction of Human Beta Cell Proliferation and Engraftment Using a Single G1/S Regulatory Molecule, cdk6," Diabetes 59(8):1926-1936 (2010)、該文献のそれぞれはその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。簡単に記載すると、ヒト膵島細胞を8ウェルチャンバーにおいて単一細胞へと分散させ、ラットインスリン-1プロモーター(RIP1)およびミニCMVエンハンサーの制御下で、明るい緑色の蛍光タンパク質であるZsGreen(Clontech、Mountain View CA)を発現するアデノウイルス150moiを含み、ウシ胎児血清(FBS)を含まないRPMI1640培地で2時間形質導入した(Wang et al., "Insights into Human Beta Cell Regeneration for Diabetes via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas. Nat. Comm. 8(1):767 (2017)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。RIP1-ミニCMVプロモーターは、438塩基のRIP1プロモーターに連結した177塩基のhCMV IE-1プロモーターClaI-SpeIフラグメントを含んでいた。ベータ細胞フラクションは、選別された細胞をインスリンで免疫標識することによって、qRT-PCRによって、およびRNAseqによって純度が＞92％であることが確認された(Wang et al., "Insights into Human Beta Cell Regeneration for Diabetes via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas," Nat. Comm. 8(1):767 (2017)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。Ad.RIP-ZsGreenアデノウイルスで2時間形質導入後、10％FBSを含有するRPMI1640培地300μlを加えてアデノウイルス感染を停止させ、細胞に24時間ZsGreenを発現させた。この時点で、DMSOまたはハルミンを10μM、Ly364947を3μMまたはハルミン-LYの組み合わせを含有する新たな培地をさらに4日間加えた。

フローサイトメトリーヒトベータ細胞定量のために、薬物処理(DMSOまたはハルミン+LY364947)の4日(ヒト膵島細胞の場合)または7日(hESC由来ベータ細胞の場合)後、穏やかなアキュターゼ(ヒトベータ細胞の場合)またはトリプシン(hESC由来ベータ細胞の場合)解離によって細胞を採取し、50,000個の蛍光ビーズ(ACURFP-50-10、Spherotech, Inc.)を加え、内部回収標準およびFACS計数基準として機能させた。死/生細胞マーカーとしてDAPI(D3571、Life Technologies)を用いた。分散させた細胞をAria IIセルソーターにロードし、生きているZsGreen⁺(ヒト膵島から)またはGFP⁺(hESCから)細胞を各ベヒクル処理およびハルミン-LY364947処理ウェルから10,000個のビーズがカウントされるまでカウントした。結果はZsGreen⁺またはGFP⁺ベータ細胞の絶対数として表され、50,000個の元の内部ビーズ標準に対して補正した。ベータ細胞フラクションは、選別された細胞をインスリンで免疫標識することによって、qRT-PCRによって、およびRNAseqによって純度が＞92％であることが確認された(Wang et al., "Insights into Human Beta Cell Regeneration for Diabetes via Integration of Molecular Landscapes in Human Insulinomas," Nat. Comm. 8(1):767 (2017)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。

統計：図に示すように、すべての実験を複数のヒト膵島標本において複数回繰り返した。結果は両側スチューデントt検定または一元配置分散分析を用いて決定してp<0.05で有意であると認識した。示された各グラフ毎に、最低5人の異なるドナーからの最低1,000個のベータ細胞をカウントした。

実施例1 - ハルミン-GLP1の組み合わせはヒトベータ細胞増殖の相乗的な増加をもたらす
DYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬との組み合わせがヒトベータ細胞の複製を相乗的に誘導し、GLP1R作動薬のヒトベータ細胞ターゲティング特異性を提供するかどうかを調べるために、成人ヒト膵島をベヒクル、ハルミン、GLP1(7-36)アミド(本明細書においては「GLP1」と呼ぶ)、またはその組み合わせで処理し、ヒト膵島から分散させたインスリン陽性細胞においてKi67免疫標識を評価した(図1A〜1B、2、3A)。これまでに報告されているように(Drucker DJ, "Mechanisms of Action and Therapeutic Application of Glucagon-Like Peptide-1," Cell Metab. 27(4):740-756 (2018); Parnaud et al., "Proliferation of Sorted Human and Rat Beta Cells," Diabetologia 51(1):91-100 (2008);およびDai et al., "Age-Dependent Human Beta Cell Proliferation Induced by Glucagon-Like Peptide-1 and Calcineurin Signaling," J. Clin. Invest. 127(10):3835-3844 (2017)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、GLP1は広範囲の用量にわたってヒトベータ細胞の増殖に対する効果がごくわずかであった。予想通り、ハルミンはヒトベータ細胞の増殖を約2％誘導した(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。しかしながら、驚くべきことに、ハルミンとGLP1の組み合わせによりヒトベータ細胞の増殖が予測外に著しく増加し、より高いGLP1用量では、ハルミン単独で観察されるよりも大幅に高い5〜6％を達成した。確証的なヒトベータ細胞の増殖はヒトベータ細胞数の迅速かつ明確な増加を通じて立証された。これは2つの陰性対照とは対照的であった。第一にヒト膵島数がより少ない場合、第二にサイトカイン処理の場合、ベータ細胞数の明らかな用量関連的な低下が観察された(図1C〜1E)。特に、相乗効果は、より高用量、例えば、10μM(図1A〜1G、2、3A〜3C)のハルミンだけでなく、個別には効果が低いかまたは全くないハルミンとGLP1との用量でさえも観察された(図3D〜3E)。効果のない用量のハルミン(1μM)と任意の用量のGLP1との組み合わせは明らかな相乗効果を生み出し、ハルミン単独の最大有効量(10μM)と同等なヒトベータ細胞増殖の増加(2.7％)をもたらした(図3E)。

実施例2 - DYRK1A-GLP1R作動薬の組み合わせはヒトベータ細胞増殖の相乗的な増加をもたらす
GLP1との組み合わせにおいてハルミンが増殖を駆動する相乗的能力は、INDY、ロイセチン、5-ITおよびGNF4877という試験したすべてのDYRK1A阻害剤にまで及び(図1F、4)、GLP1との相乗効果はDYRK1A阻害剤全般の「クラス効果」であることを示している。逆に、相乗効果は、GLP1、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチドという試験したすべてのGLP1R作動薬と組み合わせたハルミンにも明らかであり(図1G)、DYRK1A阻害剤との細胞分裂促進的な相乗効果はGLP1受容体作動薬全般の「クラス効果」であることも示している。まとめると、知見は、任意のGLP1R作動薬と共に、また拡大解釈すれば、循環するGLP1レベルを増大させる任意のDPP4阻害剤と共に投与された任意のDYRK1A阻害剤がどのクラスの薬物ともこれまでに観察されたことのないヒトベータ細胞の増殖速度を生じさせることが可能であることを示唆している。

実施例3 - ハルミン-GLP1の相乗効果はDYRK1A阻害およびcAMP-PKA-EPACシグナル伝達を必要とする
相乗効果はDYRK1Aキナーゼの阻害を必要とする。ハルミンによって誘導される相乗的な増殖はヒト膵島におけるDYRK1Aのアデノウイルスサイレンシングによって模倣できる。逆に、DYRK1Aを過剰発現させるとハルミン-GLP1の組み合わせの分裂促進効果を圧倒することができる(図6A〜6F)。GLP1の相乗効果は、ハルミン-GLP1ヒトベータ細胞増殖がフォルスコリン、ジブチリル-環状AMP、ならびにホスホジエステラーゼ阻害剤IBMXおよびジピリダモールなどのcAMPを増加させる薬剤と組み合わせたハルミンによって模倣されるという所見からも証明されるように、細胞内cAMPの増加も必要とする(図5A〜5C)。また、相乗効果は、それぞれPKAおよびEPAC2アクチベータである6-BNZ-cAMPおよび8CPT-cAMPの両方によって模倣することができ、それぞれPKAおよびEPAC2の薬理学的阻害剤であるH89およびESI-05によって阻害することができる(図5D〜5H、6F)。まとめると、これらの知見は、ヒトベータ細胞複製を駆動するためのハルミンとGLP1との相乗効果がDYRK1Aの阻害およびcAMP-PKA-EPAC2シグナル伝達の活性化の両方によって模倣することができかつこれらを必要とすることを示している。

実施例4 - ハルミンは細胞周期活性化分子を活性化しかつ細胞周期阻害剤を阻害する
ハルミンは、サイクリンなどの細胞周期活性化分子およびサイクリン依存性キナーゼの両方を活性化し、かつINK4/CIP-KIPファミリーなどの細胞周期阻害剤を阻害することが示されている(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015)、該文献はその全体において参照により本明細書に組み入れられる)。この所見は確認されているが、GLP1をハルミンに加えた場合の細胞周期アクチベータまたは阻害剤への漸進的変化は確認されていない(図7A〜7B)。タンパク質レベルでのさらなる変化が増殖の相乗的活性化の根底にあり得る。

実施例5 - ハルミン-GLP1の組み合わせはベータ細胞の脱分化を誘導しない
ヒトベータ細胞増殖の薬理学的誘導は脱分化につながることがある。意外なことに、ハルミン-GLP1の組み合わせはベータ細胞分化マーカーの発現低下にはつながらなかった。代わりに、これは、全ヒト膵島のqPCRによって評価されるように、ベータ細胞分化の増加と適合するPDX1、NKX6.1、MAFA、MAFB、GLUT2、GLP1RおよびPCSK1の発現を増加させた(図8A)。これは、個々のベータ細胞におけるPDX1、MAFA、およびNKX6.1タンパク質の増加、ならびに正常なグルコース刺激インスリン分泌の維持を伴っていた(図8B〜8C)。これらの所見は、ハルミン-GLP1の組み合わせがベータ細胞の脱分化を誘導せず、かつ分化を維持するかまたは増強する可能性さえあることを示している。

2型糖尿病(T2D)ではベータ細胞の脱分化が観察されてきたので(Talchai et al., "Pancreatic Beta Cell Dedifferentiation as a Mechanism of Diabetic Beta Cell Failure," Cell 150(6):1223-1234 (2012)およびCinti et al., "Evidence of Beta Cell De-Differentiation in Human Type 2 Diabetes," J. Clin. Endocrinol. Metab. 101(3):1044-54 (2016)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)、分化および増殖に対するハルミン-GLP1の組み合わせの効果をT2Dのヒトドナーからの膵島におけるベータ細胞で検討した。ハルミン単独、およびGLP1との組み合わせもPDX1、MAFB、NKX6.1、GLUT2、GLP1R、およびPCSK1の発現を増加させた(図9A)。興味深いことに、MAFAは正常な膵島で起きたようにはmRNAレベルでは劇的に増加しなかったが(図8A)、MAFA、NKX6.1、およびPDX1はすべて免疫組織化学によってタンパク質レベルではT2Dベータ細胞において増加することが観察され、グルコースに対するインスリン分泌応答も正常であり、おそらく増大していた(図9A〜9C)。さらに、これまでに報告されていない所見であるが、ハルミン単独でT2Dベータ細胞におけるベータ細胞増殖を活性化した(図9D〜9E)。最後に、ハルミン-GLP1の組み合わせは、T2Dベータ細胞では、正常なベータ細胞で観察されたのと同じKi67免疫標識の相乗的な増加をもたらした。

実施例6 - ベータ細胞以外のヒト膵島細胞に対するハルミン-GLP1の組み合わせの効果
ハルミンは、図10A〜10Bに示されているように、ベータ細胞以外の膵島細胞の増殖を誘導することが報告されている(Wang et al., "A High-Throughput Chemical Screen Reveals that Harmine-Mediated Inhibition of DYRK1A Increases Human Pancreatic Beta Cell Replication," Nat. Med. 21(4):383-388 (2015); Dirice et al., "Inhibition of DYRK1A Stimulates Human Beta Cell Proliferation," Diabetes 65(6):1660-1671 (2016);およびWang et al., "Singe Cell Mass Cytometry Analysis of Human Endocrine Pancreas," Cell Metab. 24(4):616-626 (2016)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。ハルミンへのGLP1の添加はベータ細胞と同様に腺管細胞における増殖をさらに増加させたが、グルカゴンおよびソマトスタチンをそれぞれ産生するアルファまたはデルタ細胞には追加的な影響を及ぼさず、これはアルファおよびデルタ細胞にGLP1Rが存在しないことを反映している可能性ある(Pyke et al., "GLP1 Receptor Localization in Monkey and Human Tissue: Novel Distribution Revealed With Extensively Validated Monoclonal Antibody," Endocrinology 155(4):1280-90 (2014)およびAmisten et al., "An Atlas and Functional Analysis of G-Protein Coupled Receptors in Human Islets of Langerhans," Pharmacol. Ther. 139(3):359-391 (2013)、該文献はそれらの全体において参照により本明細書に組み入れられる)。ハルミンおよびハルミン-GLP1の組み合わせ処理はいずれもベータ細胞死のマーカー(TUNEL)を誘導しなかった(図10C〜10D)。

実施例1〜6の考察
実施例はいくつかの注目すべき所見を記載している。第一に、直接的にGLP1Rを活性化する現在広く使用されている糖尿病治療薬(GLP1類似体)または間接的にGLP1Rを活性化する現在広く使用されている糖尿病治療薬(DPP4阻害剤)の大きなグループのうちのいずれか一つを経口的に活性な低分子DYRK1A阻害剤(例えば、ハルミン、INDY、ロイセチン、5-IT、GNF4877など)と組み合わせることによって、これまでに達成できなかったヒトベータ細胞複製の「速度」またはより正確には「標識指標」を誘導することが可能になる。これらの速度はDYRK1A阻害剤単独のものを超え、2型糖尿病およびおそらくは1型糖尿病の患者の正常なベータ細胞量の回復のために必要であると想定され得る範囲にある。第二に、ヒトベータ細胞増殖マーカーの増加は成人のヒトベータ細胞数の実際の増加を伴う。第三に、増殖の増加は厳密な薬理学的意味で相乗的であり、それら自体では増殖効果のないハルミンおよびGLP1の用量にまで及ぶ。重要なことは、これは、現在T2Dの人々に広く用いられている標準的な長期的薬物レジメンに、それ自体では全身的な効果のない低用量のハルミン類似体を加えて、ベータ細胞特異的な細胞分裂促進効果を生じさせ得る。第四に、ハルミンのみおよびGLP1R作動薬との組み合わせは、ベータ細胞の不十分な数および脱分化の両方に関連する疾患であるT2Dの人々に由来するベータ細胞の増殖および分化の両方を誘導することが可能である。最後に、本明細書において提供される実施例は、ヒトベータ細胞数をカウントするための迅速でシンプルかつ信頼性の高いFACSに基づくアッセイを拡張しかつ検証している。

実施例はヒトベータ細胞の再生治療には依然としてハードルがあることも明確に示している。一つ目は、1型糖尿病の人々において新たに生じたベータ細胞を継続的な免疫攻撃から保護する必要性である。この課題は現在でも未達成であるが、ベータ細胞の拡大も必要とする2型糖尿病の人々の大きな集団にとって障壁とはならない。二つ目は、直接的な再生薬および造影剤を特異的かつ排他的にヒトベータ細胞に向かわせるためのツールを開発する必要性である。低用量のハルミン(それ自体には効果がない)と任意の用量のGLP1R作動薬との相乗効果は、既にGLP1受容体作動薬を用いている対象において低用量のハルミンを用いることによって、GLP1受容体のベータ細胞特異性がヒトベータ細胞増殖のために活用され得るという興味深い可能性を提起している。

好ましい態様が本明細書において詳細に示されかつ記載されてきたが、発明の精神から逸脱することなく様々な変更、追加、置換などが可能であり、したがって、それらは次の特許請求の範囲において規定される発明の範囲内にあると考えられることは関連技術分野における当業者には明らかであろう。

Claims (39)

1. 以下の工程を含む、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖を増加させる方法：
   二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤およびグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬を膵臓ベータ細胞の集団と接触させる工程であって、膵臓ベータ細胞の集団における細胞増殖の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程。
2. エクスビボで実施される、請求項1記載の方法。
3. インビボで実施される、請求項1記載の方法。
4. 接触工程が、DYRK1A阻害剤とGLP1R作動薬とを両方含む組成物を用いて実施される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
5. 接触工程が、前記集団における増殖性膵臓ベータ細胞数を1日あたり約4〜6％増加させる、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
6. 接触工程が、前記集団における増殖性膵臓ベータ細胞数を1日あたり約6〜10％増加させる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
7. DYRK1A阻害剤が、ハルミン、INDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、CC-401、チアジアジンキナーゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
8. GLP1R作動薬が、GLP1類似体、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、セマグルチド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
9. 接触工程が、ハルミンおよびGLP1(7-36)を用いて実施される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
10. 膵臓ベータ細胞が初代ヒト膵臓ベータ細胞である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
11. 接触工程がベータ細胞死またはDNA損傷を誘導しない、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
12. 接触工程がベータ細胞の分化を誘導する、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
13. 接触工程がグルコース刺激インスリン分泌を増加させる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
14. 以下の工程を含む、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法：
    不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程。
15. 対象がI型糖尿病(「T1D」)、II型糖尿病(「T2D」)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成人発症型糖尿病(「MODY」)、嚢胞性線維症関連糖尿病、ヘモクロマトーシス関連糖尿病、薬物性糖尿病、または単一遺伝子糖尿病のうちの1つまたは複数について治療される、請求項14記載の方法。
16. 対象がI型糖尿病について治療される、請求項15記載の方法。
17. 対象がII型糖尿病について治療される、請求項15記載の方法。
18. 投与工程が経鼻、経口、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内的に実施される、請求項14〜17のいずれか一項記載の方法。
19. 対象が哺乳類対象である、請求項14〜18のいずれか一項記載の方法。
20. 対象がヒト対象である、請求項14〜19のいずれか一項記載の方法。
21. 投与工程が、対象における増殖性膵臓ベータ細胞数を1日あたり約4〜6％増加させる、請求項14〜20のいずれか一項記載の方法。
22. 投与工程が、対象における増殖性膵臓ベータ細胞数を1日あたり約6〜10％増加させる、請求項14〜21のいずれか一項記載の方法。
23. 投与工程が、対象の膵臓ベータ細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌を増加させる、請求項14〜22のいずれか一項記載の方法。
24. DYRK1A阻害剤が、ハルミン、INDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、CC-401、チアジアジンキナーゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14〜23のいずれか一項記載の方法。
25. GLP1R作動薬が、GLP1類似体、エキセンディン-4、リラグルチド、リキシセナチド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項14〜24のいずれか一項記載の方法。
26. 投与工程が、ハルミンおよびGLP1(7-36)を用いて実施される、請求項14〜23のいずれか一項記載の方法。
27. 二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤と、
    グルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬と
    を含む、組成物。
28. 担体をさらに含む、請求項27記載の組成物。
29. 担体が薬学的に許容される担体である、請求項28記載の組成物。
30. 以下の工程を含む、移植患者における膵臓ベータ細胞を再生させる方法：
    二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とグルカゴン様ペプチド-1受容体(GLP1R)作動薬とを移植患者に投与する工程であって、患者における膵臓ベータ細胞を再生させるために移植患者における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程。
31. 移植患者が膵臓移植、膵島同種移植、膵島自家移植、または膵島異種移植を受けたことがある、請求項30記載の方法。
32. 以下の工程を含む、不十分なインスリン分泌に関連する状態について対象を治療する方法：
    不十分なインスリン分泌レベルに関連する状態についての治療を必要とする対象に二重特異性チロシンリン酸化調節キナーゼ1A(DYRK1A)阻害剤とジペプチジルペプチダーゼIV(DPP4)阻害剤とを投与する工程であって、不十分なインスリン分泌レベルについて対象を治療すべく対象における膵臓ベータ細胞量の相乗的な増加を引き起こすのに有効な条件下で実施される工程。
33. 対象がI型糖尿病(「T1D」)、II型糖尿病(「T2D」)、妊娠糖尿病、先天性糖尿病、成人発症型糖尿病(「MODY」)、嚢胞性線維症関連糖尿病、ヘモクロマトーシス関連糖尿病、薬物性糖尿病、または単一遺伝子糖尿病のうちの1つまたは複数について治療される、請求項32記載の方法。
34. 対象が哺乳類対象である、請求項32〜34のいずれか一項記載の方法。
35. 対象がヒト対象である、請求項32〜35のいずれか一項記載の方法。
36. 投与工程が、対象の膵臓ベータ細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌を増加させる、請求項32〜36のいずれか一項記載の方法。
37. 投与工程が、DYRK1A阻害剤とDPP4阻害剤とを両方含む組成物を用いて実施される、請求項32〜37のいずれか一項記載の方法。
38. DYRK1A阻害剤が、ハルミン、INDY、ロイセチン-41、5-ヨードツベルシジン(5-IT)、GNF4877、CC-401、チアジアジンキナーゼ阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項32〜38のいずれか一項記載の方法。
39. DPP4阻害剤が、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項32〜39のいずれか一項記載の方法。

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