MX2012007026A - Compuestos que promueven la replicacion de celula beta y metodos de su uso. - Google Patents

Compuestos que promueven la replicacion de celula beta y metodos de su uso.

Info

Publication number
MX2012007026A
MX2012007026A MX2012007026A MX2012007026A MX2012007026A MX 2012007026 A MX2012007026 A MX 2012007026A MX 2012007026 A MX2012007026 A MX 2012007026A MX 2012007026 A MX2012007026 A MX 2012007026A MX 2012007026 A MX2012007026 A MX 2012007026A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
optionally substituted
amino
pyrido
pyrimidine
cells
Prior art date
Application number
MX2012007026A
Other languages
English (en)
Inventor
Justin P Annes
Douglas A Melton
Lee L Rubin
Gordon Weir
Original Assignee
Joslin Diabetes Center Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Joslin Diabetes Center Inc filed Critical Joslin Diabetes Center Inc
Publication of MX2012007026A publication Critical patent/MX2012007026A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/507—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides or bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/65—MicroRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)

Abstract

En la presente invención se proporciona un método para estimular o incrementar la replicación o crecimiento de célula ß, al poner en contacto una célula ß con un inhibidor de adenosina quinasa (ADK), un inhibidor de S-Adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH) o un activador de proteína quinasa activada con AMP (AMPK).

Description

COMPUESTOS QUE PROMUEVEN LA REPLICACIÓN DE CÉLULA BETA Y MÉTODOS DE SU USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a composiciones y métodos para promover la replicación y/o el crecimiento de célula ß.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Hay dos formas de diabetes mellitus: (1) diabetes dependiente de insulina o Tipo 1 (también conocida como, Diabetes Juvenil, Diabetes Inestable, Diabetes Mellitus Dependiente de Insulina ( IDDM) ) y (2) diabetes no dependiente de insulina o Tipo II (también conocida como, NIDDM) . La diabetes Tipo 1 se desarrolla mucho más frecuentemente en gente joven pero puede aparecer en adultos. La diabetes Tipo 2 se desarrolla mucho más frecuentemente en adultos de mediana edad y avanzada edad, pero puede aparecer en gente joven. La diabetes es una enfermedad derivada de múltiples factores causantes y caracterizada por niveles elevados de glucosa en el plasma (hiperglucemia) en el estado de ayuno o después de la administración de glucosa durante una prueba de tolerancia de glucosa oral. Una disminución en la masa de célula ß ocurre en la diabetes tanto Tipo I como Tipo II.
La diabetes Tipo 1 es una condición de enfermedad autoinmune caracterizada por altos niveles de glucosa en la sangre causados por una carencia total de insulina, es decir, una pérdida de la función y masa de célula ß pancreática. La diabetes Tipo 1 ocurre cuando un sistema inmune de la persona ataca las células ß que producen la insulina en el páncreas y las destruye. Se cree que la familia de citoquinas Interleucina 12 (IL-12) y la activación corriente abajo de los miembros de la familia de Transductores de Señal y Activadores de Transcripción (STAT) , por ejemplo, STAT-4, que se creen que son reguladores de diferenciación de la célula T involucrada en las respuestas inmunes, desempeñan una función mayor en los procesos que conducen a la destrucción de la célula ß autoinmune. El páncreas luego produce poca o nada de insulina. Los síntomas de la diabetes Tipo 1 mucho más comunes experimentados incluyen sed excesiva (polidipsia) , orinar con frecuencia (poliuria), hambre extrema (polifagia), fatiga extrema y pérdida de peso. Estos síntomas son causados por la hiperglucemia y una descomposición de las grasas del cuerpo. Las personas diagnosticadas con diabetes Tipo 1 típicamente exhiben niveles de azúcar en la sangre arriba de 300 mg y cetonas presentes en su orina. La restauración de la masa de la célula ß y la producción de insulina puede completamente revertir el estado diabético. La evidencia sugiere que la gente con diabetes Tipo 1 de largos años tienen células ß que continúan formándose pero son indeseablemente destruidas mediante la destrucción autoinmune continua. Por lo tanto, las composiciones y métodos para incrementar la replicación de célula ß proporcionaría una manera efectiva para restaurar los niveles de masa de célula ß normales y revertir o curar la diabetes Tipo 1.
LADA es un subconjunto recientemente reconocido de la diabetes Tipo 1 y se cree que representa hasta 10%-20% de todos los casos de diabetes. La LADA también se conoce como la diabetes Tipo 1.5. La LADA frecuentemente se presenta en la gente inicialmente diagnosticada con la diabetes Tipo 2. Aunque tiene características similares a la diabetes Tipo 1 de inicio en adultos, la destrucción de la célula ß se considera que es menos agresiva en su progresión.
La diabetes Tipo 2 resulta de una combinación de resistencia a la insulina y secreción de insulina deteriorada pero finalmente mucha gente con diabetes Tipo 2 muestra la masa y función de la célula ß pancreática marcadamente reducida que, a su vez, causa a las personas diabéticas Tipo 2 que tengan una "relativa" deficiencia de insulina debido a que las células ß pancreáticas están produciendo algo de insulina, pero la insulina es muy poca o no está trabajando apropiadamente para permitir adecuadamente que la glucosa en las células produzca energía. Los estudios de autopsia recientes han mostrado clara evidencia de la continúa muerte de la célula ß (apoptosis) en la gente con diabetes Tipo 2. Por lo tanto, los procedimientos terapéuticos para proporcionar más células ß podrían proporcionar un significante tratamiento para revertir o curar la diabetes Tipo 2.
La diabetes Tipo 2 no controlada conduce al exceso de glucosa en la sangre, dando por resultado la hiperglucemia o alto contenido de azúcar en la sangre. Una persona con diabetes Tipo 2 experimenta fatiga, sed incrementada, orinar con frecuencia, piel seca, comezón, visión borrosa, cortes o heridas de curación lenta, más infecciones que las usuales, entumecimientos y hormigueo en los pies. Sin el tratamiento, una persona con diabetes Tipo 2 llegará a ser deshidratada y desarrollará un volumen de sangre peligrosamente bajo. Si la diabetes Tipo 2 permanece sin estar controlada durante un periodo largo de tiempo, pueden resultar síntomas más serios, que incluyen hiperglucemia severa (azúcar en la sangre sobre 600 mg) letargía, confusión, choque y finalmente "coma no cetótico hiperglucémico hiperosmolar" . La hiperglucemia persistente o no controlada está asociada con la morbidez y mortalidad incrementadas y prematuras. Como tal, el control terapéutico de la homeostasis de la glucosa, metabolismo lipídico, obesidad e hipertensión son críticamente importantes en el manejo y tratamiento clínico de la diabetes mellitus .
El objetivo de los tratamientos de diabetes es prevenir la ocurrencia de las complicaciones crónicas mencionadas en lo anterior, lenta progresión de la enfermedad al mejorar el estado hiperglucémico o revertiría/curarla. Los métodos convencionales para tratar la diabetes han incluido la administración de fluidos e insulina en el caso de la diabetes Tipo 1 y administración de varios agentes hipoglucémicos en el caso de la diabetes Tipo 2. Los agentes hipoglucémicos tales como preparaciones de insulina, secretagogos de insulina, sensibilizadores de insulina e inhibidores de a-glucosidasa se han aplicado ampliamente como el método para el tratamiento clínico. Ejemplos incluyen acarbosa (PrecoseJ), glimeprimida (AmarylJ) , metformina (GlucophageV) , nateglinida (StarlixV) , pioglitazona (ActosV) , repaglinida (PrandinJ), rosiglitazona (AvandiaV) , sulfonilureas, Orlistat (XenicalV) , exenatida (Byetta) y los similares. Sin embargo, muchos de los agentes hipoglucémicos conocidos, exhiben efectos secundarios indeseables y son tóxicos en ciertos casos. Por ejemplo, en el caso de los pacientes diabéticos con secreción de insulina pancreática seriamente disminuida, se disminuye la efectividad de los secretagogos de insulina y sensibilizadores de insulina. De manera similar, en el caso de los pacientes diabéticos cuya resistencia a insulina es significantemente alta, se disminuye la efectividad de las preparaciones de insulina y secretagogos de insulina.
En principio, la diabetes mellitus podría ser tratada por un transplante exitoso del tejido que contiene células que secretan o producen insulina, es decir, los islotes de Langerhans. El transplante de las células que producen insulina se ha intentado como un método para revertir o curar la diabetes Tipo 1, pero hay riesgos significantes asociados con la cirugía y con los fármacos de tipo inmunosupresión tóxica que necesitan ser tomados para prevenir o mitigar el rechazo del aloinjerto y la reocurrencia autoinmune. Además, hay más de 1 millón de gentes con diabetes Tipo 1 en los Estados Unidos hoy en día, pero el suministro de tejido pancreático cadavérico por islotes es limitado. Por ejemplo, solamente 6,000 órganos son disponibles por año y 2 o 3 órganos se necesitan para proporcionar bastantes islotes para revertir la diabetes Tipo 1 en una persona. Por lo tanto, la provisión de una nueva fuente de funcionamiento (producción de insulina) de las células ß se necesita urgentemente.
Solamente un ejemplo de un ensayo de clasificación de alto rendimiento para los compuestos que pueden inducir la proliferación de célula ß se describe en la técnica. El método de clasificación utiliza células ß de ratón reversiblemente inmortalizadas, detenidas en crecimiento. La mayor desventaja con este procedimiento es que los compuestos identificados en este ensayo de clasificación no pueden tener el mismo efecto en las células ß primarias, por ejemplo, los compuestos identificados son específicos para inducir la proliferación de células ß reversiblemente inmortalizadas, detenidas en crecimiento solamente. De esta manera, hay una necesidad por métodos para clasificar compuestos que puedan inducir la proliferación de célula ß primaria, por ejemplo, células ß que no se han sometido a la transformación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto la invención proporciona un método para incrementar la replicación de célula ß en una población de células pancreáticas, el método que comprende: poner en contacto una población de células pancreáticas con un inhibidor de adenosina quinasa (ADK) , un inhibidor de S-Adenosilhomocisteina Hidrolasa (SAHH) o un activador de proteina quinasa activada con AMP (AMPK) .
En otro aspecto, la invención proporciona un método para clasificar un compuesto candidato para incrementar la replicación de célula ß, el método que comprende: (a) poner en contacto una población de células pancreáticas con un compuesto de prueba; (b) seleccionar el compuesto que: (i) incrementa el número total de células en el cultivo, (ii) incrementa el número total de células que expresan por lo menos un marcador de célula ß en el cultivo, como es comparado con un control no tratado, (iii) incrementa la relación de células que expresan por lo menos un marcador de célula ß al número total de células en el cultivo, como es comparado con un control no tratado, (iv) incrementa el número de células que expresan por lo menos un marcador de replicación celular, como es comparado con un control no tratado, o (v) incrementa la relación de células que expresan por lo menos un marcador de replicación celular, como es comparado con un control no tratado; y en donde las células pancreáticas son células pancreáticas primarias.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 representa una gráfica de barras que muestra el % de incremento en PH3 sobre PDX1 por AlO y B8.
Las Figs. 2a y 2b representan gráficas de lineas que muestra el efecto de la concentración del compuesto AlO (5-IT) en la célula ß (Fig. 2a) y proliferación de fibroblastos dérmicos de ratón (Fig. 2b) . La EC50 para la célula ß se determinó que es 0.47µ?.
La Fig. 3 representa una gráfica de lineas que muestra el efecto de la concentración del compuesto B8 en la proliferación de célula ß (EC50 = 9.1µ?).
La Fig. 4 representa una gráfica de lineas que muestra el efecto de los compuestos AlO y B8 en la inducción de Ki-67 veces durante un periodo de 4 días después del tratamiento. Los compuestos se adicionaron a las células en el día 0 y el medio se cambió en el día 2.
La Fig. 5 representa una gráfica de barras que muestra el efecto de la concentración de suero en el medio en la inducción de Ki-67 en las células ß por ?µ? de AlO.
La Fig. 6 representa una gráfica de líneas que muestra que la glucosa no efectúa la inducción de Ki-67 y la expresión de PDX+ por AlO en células ß.
La Fig. 7 representa una gráfica de lineas que muestra que la adenosina no conduce a la inducción de PDX+ y Ki-67 en islotes de Rata en una manera dependiente de la concentración.
Las Figs . 8a y 8b representan gráficas de barras que muestran el efecto de los antagonistas del receptor de adenosina en incremento inducido por AlO en Ki-67. La Fig. 9a, se probaron los antagonistas a concentraciones de 2µ?, ?µ?, 0.2µ?, 0.04µ? o ?.?µ? (ningún antagonista). La Fig. 9b, antagonistas probados a concentración de 0.2µ?.
La Fig. 9 representa una gráfica de barras que muestra el efecto del inhibidor de adenosina quinasa AlO y el activador de quinasa activado con monofosfato de adenosina AICAR en la replicación de célula ß.
La Fig. 10 representa una gráfica de barras que muestra el efecto de la inhibición de AMPK en la replicación de célula ß inducida con AlO.
Las Figs. lia y 11b representan estructuras de algunos activadores de inhibidores de adenosina quinasa basados en nucleósido (Fig. lia) y no basados en nucleósido (Fig. 11b) ejemplares.
La Fig. 12 es una gráfica de barras que muestra el incremento en la replicación de célula beta in vivo.
Las Figs . 13a-13d muestran que los inhibidores de adenosina quinasa (ADK-Is) inducen la proliferación de células ß de rata, ratón y porcinas. La Fig. 13a muestra las estructura químicas y nombres de alqunos ADK-Is ejemplares que promueven la replicacion de célula ß. La Fig. 13b muestra las curvas de dosis-respuesta que muestran la relación entre la proliferación de célula ß de murino (parte superior) y porcino (fondo) en respuesta al tratamiento con ABT-702. La Fig. 13c muestra las curvas de dosis-respuesta para los cultivos de islote de rata que muestran la relación entre la proliferación de célula ß y el tratamiento con compuesto con 5-IT (izquierda; EC50=4pM) y ABT-702 (derecha; EC50=7.0 µ ) . La Fig. 13d muestra la cuantificación del número de células ß después del tratamiento con DMSO o 5-IT (2µ?) durante 96h y 144h. Las barras de error representan la desviación estándar, *P < 0.01 comparado con la condición del tratamiento con vehículo .
Las Figs. 14a y 14b muestran que las células ß expresan adenosina quinasa (ADK) nuclear que actúa como un regulador negativo autónomo celular de la proliferación. La Fig. 14a es un manchado de western que muestra el bloqueo de ADK mediado por siRNA evaluado utilizando el lisado H4IIE (línea celular de hepatocitos de rata) de células establemente transducidas con ya sea un siRNA de control negativo (líneas 1,3) o un siRNA dirigido a ADK (líneas 2,4).
La carga fue estandarizada utilizando ?-tubulina. La Fig. 14b es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de la replicación de célula ß después de la infección con virus que contiene ya sea una secuencia siRNA de control (izquierda) o una secuencia siRNA dirigida a ADK (derecha) . La velocidad de replicación de las células no infectadas y células infectadas dentro de la misma cavidad se analizaron separadamente en la base de la expresión de GFP codificada por el virus. Las barras de error representan SEM (n =8 cavidades independientes); *P <0.01.
Las Figs. 15a y 15b muestran que la inducción de la replicación de célula ß por ADK-Is es aditiva a la glucosa y los agonistas del receptor de péptido 1 similar a glucagón (GLP-IR) . La Fig. 15a es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de la velocidad de replicación de célula ß después del cultivo durante 24h, 48h o 96h en la presencia de varias concentraciones de glucosa más DMSO o 5-IT (2µ?) . Los valores son normalizados a la condición del tratamiento de glucosa 5mM más DMSO en cada punto de tiempo. La desviación estándar fue menos de 10% para cada condición de tratamiento, barras de error no mostradas. *P <0.01 cuando las cavidades tratadas con 5-IT son comparadas con las cavidades tratadas con DMSO en la misa concentración de glucosa y punto de tiempo; **P <0.01 cuando las cavidades tratadas con DMSO o 5-IT son comparadas con la condición tratada de glucosa 5mM en el mismo punto de tiempo y con el mismo tratamiento (DMSO o 5-IT) . La Fig. 15b es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de la velocidad de replicación de célula ß después del tratamiento con DMSO, 5-IT, GLP-1, Ex4, 5-IT más GLP-1 o 5-IT más Ex4 durante 24h. La concentración de 5-IT fue 2µ?. Las concentraciones de GLP-1 y Ex-4 fueron 20 nM (barra izquierda) y 4nM (barra derecha) . Valores normalizados a la condición de tratamiento de DMSO. Las barras de error representan la desviación estándar; *P <0.01 y **P <0.03 para las comparaciones indicadas.
Las Figs. 16a - 16e muestran que ADK-Is selectivamente promueven la replicación de célula ß in vitro e in vivo. La Fig. 18a muestra gráficas de barras que representan la cuantificación de las velocidades de replicación in vitro de las células d (somatostatina+; panel izquierdo) , células a (glucagón+; panel central) y fibroblastos ( imentina+; panel derecho) después del tratamiento con DMSO, 5-IT (2µ?) o ABT-702 (15µ?). *P <0.01 y **P <0.05 comparados con la condición tratada de DMSO. La Fig. 16b es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de la velocidad de replicación del crecimiento de hepatocitos de murino aislados en la presencia de EGF (40ng/ml) y HGF (20 ng/ml) más DMSO o ABT-702 (15µ?) . La Fig. 16c es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de las velocidades de replicación in vivo de células ß de islote en ratones 24h después del tratamiento con BRDU y ya sea el vehículo o ABT-702. La Fig. 16d es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de las velocidades de replicación in vivo de células exocrinas en ratones 24h después del tratamiento con BRDU y ya sea el vehículo o ABT-702. La Fig. 16T es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de las velocidades de replicación in vivo de hepatocitos en ratones 24h después del tratamiento con BRDU y ya sea el vehículo o ABT-702. Las barras de error representan la desviación estándar, valores p obtenidos utilizando la prueba t de dos colas.
Las Figs. 17a y 17b son gráficas de barras que muestran que la replicación de célula ß se incrementa por AD -Is. La Fig. 17a muestra la cuantificación de la replicación de célula ß después del tratamiento con DMSO o 5-IT (2µ ) . Las células ß se identificaron por la presencia de PDX-1 y manchado de insulina. *P <0.001. La Fig. 17b muestra la cuantificación de la replicación de célula ß después del tratamiento con DMSO, 7-Yodo-2 , 3-dideoxi-7-desazaadenosina (20µ?, 10 µ?) o Aristeromicina (6µ?, ?µ?) . Las barras de error representan la desviación estándar.
La Fig. 18a es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de la replicación de célula ß utilizando la co-expresión de PDX-1 y fosfohistona-H3. Los cultivos se trataron con DMSO, 5-IT (2µ?) o ABT-702 (15 µ?) . ) . *P <0.001 comparado con la condición tratada con DMSO.
La Fig. 18b es una gráfica de barras que muestra la cuantificación de la replicación de célula ß utilizando un pulso BRDU de dos días en la presencia de DMSO, 5-IT (2µ?) o ABT-702 (15 µ?) seguido por un lapso de dos días sin el tratamiento con compuesto. Los datos se exhiben como el incremento de veces en células BRDU+ PDX-1+ en las cavidades tratadas con compuesto comparadas con las cavidades tratadas con DMSO. *P <0.002 comparado con DMSO.
La Fig. 19 es una gráfica de barras que muestra la cuantificación automatizada del porcentaje de células de islote positivas de ADK después de la infección con un siRNA de control o un siRNA dirigido a ADK. Las barras de error representan la desviación estándar; *P <0.001.
La Fig. 20 es una gráfica de barras que muestra que el tratamiento in vivo de ratones con ABT-702 incrementa la replicación de célula ß pero no células exocrinas. La cuantificación de la velocidad de replicación de célula ß in vivo que utiliza el inmunomanchado de insulina para identificar las células ß e inmunomanchado de BRDU para identificar las células replicantes (izquierda) . La cuantificación de la velocidad de replicación de las células exocrinas de extra-islote se realizó simultáneamente utilizando las mismas secciones de tejido (derecha).
La Fig. 21 representa un perfil esquemático del protocolo de clasificación utilizado para identificar compuestos que promueven la replicación de célula ß.
La Fig. 22 representa una gráfica de barras que muestra el efecto del inhibidor de SAHH vidarabina en la proliferación de célula ß.
La Fig. 23 es una ilustración esquemática que representa una vista general de la ruta de ADK.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto la invención proporciona un método para incrementar la replicación de célula ß en una población de células pancreáticas, el método que comprende: poner en contacto una población, o preparación, de células pancreáticas con un inhibidor de adenosina quinasa (ADK) , un inhibidor de S-Adenosilhomocisteina Hidrolasa (SAHH) , o un activador de proteina quinasa activada con AMP (AMPK) .
Como se utiliza en la presente, "incrementar la replicación de célula ß" significa que las células ß se replican a una velocidad más rápida y/o más frecuentemente. En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, la replicación de célula ß se incrementa por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más alta con relación a un control no tratado. El % o incremento de veces en la replicación de célula ß se puede determinar al medir el número de células ß replicantes mientras se ponen en contacto con un compuesto descrito en la presente con relación a un control donde las células ß no están en contacto con el compuesto. El incremento en la replicación también se puede basar en las relaciones de las células replicantes al número total de células en el control tratado y no tratado respectivo. En algunas modalidades, el número total de células en los controles tratados y no tratados se utilizan para determinar la frecuencia de replicación.
En algunas modalidades, "incrementar la replicación de célula ß" también incluye un incremento en el número de células ß debido a la diferenciación de los progenitores de célula ß en células ß. En una modalidad alternativa, "incrementar la replicación de célula ß" no incluye un incremento en el número de células ß debido a la diferenciación de los progenitores de célula ß en células ß.
Como se utiliza en la presente el término "célula ß" incluye células ß pancreáticas primarias, células similares a ß pancreáticas derivadas de células desdiferenciadas, por ejemplo de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), o células similares a ß pancreáticas que se han reprogramado directamente de una célula de origen endodérmico (por ejemplo una célula del hígado o una célula pancreática exocrina) . En una modalidad, una célula ß no es una linea celular inmortalizada (por ejemplo prolifera indefinidamente en el cultivo) . En una modalidad, la célula ß no es una célula transformada, por ejemplo, una célula que exhibe una propiedad de transformación, tal como crecimiento en agar suave o ausencia de inhibición de contacto.
El término "célula similar a ß pancreática", como se utiliza en la presente, se refiere a una célula que expresa por lo menos 15% de la cantidad de insulina expresada por una célula beta pancreática endógena o por lo menos aproximadamente 20%, o por lo menos aproximadamente 30%, o por lo menos aproximadamente 40%, o por lo menos aproximadamente 50%, o por lo menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 100% o mayor que 100%, tal como por lo menos aproximadamente 1.5 veces, o por lo menos aproximadamente 2 veces, o por lo menos aproximadamente 2.5 veces, o por lo menos aproximadamente 3 veces, o por lo menos aproximadamente 4-veces o por lo menos aproximadamente 5-veces o más que aproximadamente 5-veces la cantidad de la insulina secretada por una célula beta pancreática endógena. En una modalidad, la célula similar a ß pancreática exhibe por lo menos una, o por lo menos dos características de una célula beta pancreática endógena, por ejemplo, pero no limitado a, secreción de insulina en respuesta a la glucosa, y la expresión de marcadores de célula beta, tal como por ejemplo, c-péptido, Pdx-1 y glut-2. La célula similar a ß pancreática es referida algunas veces en la presente como una "célula ß reprogramada", que se utiliza intercambiablemente en la presente con el término "célula similar a ß pancreática". En una modalidad, la célula similar a ß pancreática no es una célula inmortalizada (por ejemplo proliferar indefinidamente en cultivo) . En una modalidad, la célula similar a ß pancreática no es una célula transformada, por ejemplo, una célula que exhibe una propiedad de transformación, tal como crecimiento en agar suave o ausencia de inhibición de contacto.
Como se utiliza en la presente el término "célula des-diferenciada" se refiere a una célula que se ha reprogramado de una célula diferenciada. El término "reprogramada" o "reprogramación" como se utiliza en la presente se refiere al proceso que altera o revierte el estado de diferenciación de una célula somática. La célula puede ser ya sea parcialmente o terminalmente diferenciada antes de la reprogramación. La reprogramación abarca la reversión completa del estado de diferenciación de una célula somática a una célula pluripotente . Tal reversión completa de la diferenciación produce una célula pluripotente inducida (iPS). La reprogramación también abarca la reversión parcial del estado de diferenciación, por ejemplo a un estado multipotente o a una célula somática que no es ni pluripotente o multipotente, pero es una célula que ha perdido una o más características específicas de la célula diferenciada de la cual surge, por ejemplo la reprogramación directa de una célula diferenciada a un tipo de célula somática diferentes. La reprogramación generalmente involucra alteración, por ejemplo, reversión, de por lo menos algunos de los patrones hereditarios de modificación de ácido nucleico (por ejemplo, metilación) , condensación de cromatina, cambios epigenéticos, impresión genómica, etc., que ocurre durante la diferenciación celular conforme un cigoto se desarrolla en un adulto.
Los métodos descritos en la presente, son aplicables a las células similares a ß pancreáticas que se han derivado de células reprogramadas (des-diferenciadas) . Por ejemplo, obtenidas de una célula iPS que se ha diferenciado en una célula similar a beta pancreática utilizando factores y condiciones conocidas por aquellos de habilidad en la técnica. Las células similares a ß pancreáticas también se pueden derivar mediante la reprogramación directa de células somáticas de endodermo/ exocrinas sin reversión al estado de célula madre pluripotente (por ejemplo célula iPS) , por ejemplo como es descrito en Zhou, y colaboradores, Nature, Volumen 455, 2 de Octubre del 2008, páginas 627-633), incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Como se utiliza en la presente los términos "célula iPS" y "célula madre pluripotente inducida" se utilizan intercambiablemente y se refieren a una célula madre pluripotente artificialmente derivada, es decir desdiferenciada (reprogramada) de una célula no pluripotente, típicamente una célula somática adulta, por ejemplo, al inducir una expresión forzada de uno o más genes.
Como se utiliza en la presente el término "célula beta pancreática endógena", alternativamente una "célula beta pancreática primaria" se refiere a una célula que produce insulina del páncreas de un mamífero, o una célula de un fenotipo de célula beta pancreática (célula beta) de un mamífero. El fenotipo de una célula beta pancreática es bien conocido por personas de habilidad ordinaria en la técnica, e incluye, por ejemplo, secreción de insulina en respuesta a un incremento en el nivel de glucosa, expresión de marcadores tal como c-péptido, polipéptido PDX-1 y Glut 2, así como distintas características morfológicas tal como organizadas en islotes en el páncreas in vivo y típicamente tienen pequeñas células similares a husillo de aproximadamente 9-15µ?? de diámetro. Las células beta pancreáticas endógenas se pueden encontrar en los islotes de Langerhans. En métodos de la invención, las célula beta pancreáticas primarias se puede poner en contacto in vitro como parte de los islotes de Langerhans .
Como se utiliza en la presente el término "célula que produce insulina" incluye células beta primarias como aquel término es descrito en la presente, así como células similares a beta pancreáticas como aquel término es descrito en la presente, que sintetiza (es decir, transcribe el gen de insulina, traduce el mRNA de proinsulina y modifica el mRNA de proinsulina en la proteína de insulina) , expresa (es decir, manifiesta el rasgo fenotípico llevado por el gen de insulina), o secreta (liberación de insulina en el espacio extracelular) insulina de una manera constitutiva o inducible .
El término "una célula de origen de endodermo" como se utiliza en la presente se refiere a una célula de origen de endodermo que incluye cualquier célula que se ha desarrollado de una célula de origen de endodermo, que es una célula de una de las tres capas germinales primarias en el embrión muy temprano que se diferencia para dar lugar al intestino embrionario luego a los revestimientos de los tractos respiratorio y digestivo y al hígado y páncreas. Los estudios en diversos organismos modelo y humanos han revelado señales inductivas evolucionariamente conservadas y redes de factor de transcripción que provoca la diferenciación de las células del hígado y páncreas y proporciona una guía de cómo promover la diferenciación de hepatocitos y célula ß de diversos tipos de célula madre y progenitora.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, la actividad de la adenosina quinasa se inhibe o disminuye por al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98%, o 100% (por ejemplo pérdida completa de actividad) con relación a un control no inhibido. Sin desear que sea limitado por alguna teoría, la actividad de la adenosina quinasa se puede medir al medir la fosforilación de adenosina al utilizar métodos conocidos en la técnica para medir tales reacciones de fosforilación.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, el inhibidor de adenosina quinasa tiene una IC50 de menos de o igual a 500nM, de menos de o igual a 250nM, de menos de o igual a ?????, de menos de o igual a 50nM, de menos de o igual a 10n , de menos de o igual a InM, de menos de o igual a 0. InM, de menos de o^igual a O.OlnM o de menos de o igual a O.OOlnM.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, la actividad de la quinasa activada con AMP se incrementa por al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 1-vez, al menos 1.1 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5-veces o más con relación a un control no activado.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, el activador de quinasa activado con AMP tiene una EC50 de menos de o igual a 500nM, de menos de o igual a 250nM, de menos de o igual a ?????, de menos de o igual a 50nM, de menos de o igual a ????, de menos de o igual a InM, de menos de o igual a O.lnM, de menos de o igual a O.OlnM o de menos de o igual a O.OOlnM.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, la actividad de la SAHH se inhibe o disminuye por al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o 100% (por ejemplo pérdida completa de la actividad) con relación a un control no inhibido. La actividad de la SAHH se puede medir utilizando los métodos descritos, por ejemplo en, la Solicitudes de Patentes Norteamericanas Nos. 10/836,953 y 11/389,393, el contenido de ambas de las cuales es incorporado en la presente por referencia.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, el inhibidor de SAHH tiene una IC50 de menos de o igual a 500nM, de menos de o igual a 250nM, de menos de o igual a ?????, de menos de o igual a 50n , de menos de o igual a 10n , de menos de o igual a InM, de menos de o igual a O.llnM, de menos de o igual a O.Oln o de menos de o igual a O.OOln .
Será reconocido que muchos compuestos descritos en la presente pueden ejercer múltiples efectos en una célula. Por ejemplo, los análogos de SAH y tubercidina actúan en varios puntos en las rutas de metilación. De esta manera, la división de los compuestos y moléculas en ciertos grupos, por ejemplo inhibidores de ADK o inhibidores de SAHH, no se propone que sean una división científica exacta y no de sobreposición . Más bien tal información se expone para ayudar a aquellos en la técnica con entendimiento de ciertos datos científicos que se consideraron por los inventores. Por ejemplo, muchos de los inhibidores de ADK descritos en la presente también son disponibles a la invención como inhibidores de SAHH.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, el inhibidor de adenosina quinasa es de la fórmula ( I ) : Fórmula (I) en donde: R1 es H, alquilo de CI~CG opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, OR5, SR5, N(R6)2, (CH2)mR7 o R1 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R2 y R3 son cada uno independientemente H, OR5, SR5, N(R5)2 o R2 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclilo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R4 es H, halógeno, CN, N2, OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquini.lo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R5 es independientemente para cada ocurrencia H, C(0)R7, C(0)OR7, C (0)N(R7)'2, alquilo de C!-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente¦ sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido o los dos R5 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros opcionalmente que comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, 0 o S; R6 es R5, OR5, SR5, N(R5)2, N2, CN, - , halógeno, o s · ·2 R7 es independientemente para cada ocurrencia H, alquilo de Ci~C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; X es O, S, NH o CH2; Y y Z son cada uno independientemente N o CR8; R8 es independientemente para cada ocurrencia H, halógeno, CN, C(0}R C(0)OR7, C(0)N(R7)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Z1 es independientemente para cada ocurrencia O o S; Z2 es independientemente para cada ocurrencia OM, S , OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; M es un catión de metal alcalino; m es 1, 2, 3 o 4; n es 0, 1 o 2; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo.
En algunas modalidades preferidas, es Na+.
En algunas modalidades, R1 es opcionalmente sustituido alquilo de Ci-C6, OR5, N(R5)2 o (CH2)mR6. De preferencia alquilo de Ci~C6 es metilo. Cuando R1 es N(R5)2, por lo menos uno de R5 es H, de preferencia ambos R5 son H. Cuando R1 es OR5, R5 puede ser H o alquilo de Ci-C6, de-preferencia R5 es H.
Cuando R1 es (CH2)mR6, m es 1 o 2, de preferencia m es 1. En algunas modalidades, R6 es OR5 o N(R5)2- Cuando R6 es N(R5)2, por lo menos uno de R5 es H, de preferencia ambos R5 son H. Cuando R6 es OR5, R5 puede ser H o alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, de preferencia R5 es H. Mucho más de preferencia R1 es CH3, CH20H o NH2.
En algunas modalidades, R1 y R2, en los compuestos de la fórmula (I), junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros, en donde la cadena principal del heterociclo en donde Z3 es independientemente para cada ocurrencia y Z4 es H, OM, SM, OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, por lo menos uno de Y o Z es CR8, de preferencia Y es CR8 y más de preferencia Y es CH2. En una modalidad, Y es CR8 y Z es N.
En algunas otras modalidades, ambos de Y y Z son CR8. De preferencia Y es CH2 y Z es CR8, en donde R8 se selecciona del grupo que consiste de CN, halógeno, arilo y hetereoarilo . De preferencia el grupo arilo es un grupo fenil, que puede ser opcionalmente sustituido. Cuando R8 es halógeno, I y Br son preferidos, con I que es más preferido.
En aun algunas otras modalidades, R4 es un halógeno o N(R5)2. Los halógenos incluyen, Br, F, I o CI, de preferencia halógeno es CI. Cuando R4 es N(R5), ambos R5 pueden ser H, o de preferencia uno de R5 es H y el otro R5 se selecciona del grupo que consiste de arilo y heteroarilo. De preferencia el grupo arilo es un grupo fenilo. En algunos casos el grupo fenilo es un grupo fenilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, grupo 4-fluoro-fenilo .
En todavía aun algunos otros modalidades, X se selecciona del grupo que consiste de 0, NH y CH2. En algunas modalidades preferidas, X es 0.
En algunas modalidades, R2 y R3 son ambos OR5. De preferencia R2 y R3 son ambos OH.
En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (I) tiene la configuración estereoquímica mostrada en la fórmula ( la) : En otras modalidades, el compuesto de la fórmula (I) tiene la configuración estereoquímica mostrada en la fórmula (Ib) : Fórmula (Ib).
En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (I) no es 7-deaza-7-yodo-2' -desoxiadenosina, 7-deaza-2'-desoxiadenosina, 7-deaza-2' , 3' -didesoxiadenosina, Sangiva-micina, Tubercidina o adenosina.
En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (I) es aristeromicina, 5' -deoxiadenosina, 5' -aminoadenosina, 5' -deoxi-5-yodotubercidina, 5-yodotubercidina (también referido como A10 o 5-IT en la presente) , 7-deaza-7-yodo-2' , 3' -didesoxiadenosina (también referido como didesoxi-7-yodo-desazaadenosia o d7ldAdo en la presente) , nor-aristeromicina, nor-tubercidina, A-134974, Toyocamicina, GP-515 ( (2R, 3R, S, 5R) -2- ( -amino-3-bromo-lH-pirazolo [3, 4-d] pirimidin-l-il ) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3, 4-diol) , GP-3269 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4- ( 4-fluorofenilamino) -5-fenil-7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimidin-7-il) -tetrahidro-5-metilfuran-3, 4-diol), GP-683 ( (2R, 3S, 4R, 5R) -tetrahidro-2-metil-5- (5-fenil-4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il) furan-3, 4-diol) , GP-947 ( (2S, 3S, 4R, 5R) -tetrahidro-2-metil-5- (5-fenil-4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) furan-3, 4-diol) , compuesto 1 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-amino-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d] irimidin-7-il) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3, 4-diol) , compuesto 2 ( (2R 3R, S, 5R) -2- ( 4-cloro-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d]pirimidin-7-il) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3 , -diol) , compuesto 3 ( ( 1S, 2R, 3S , 5R) -3-amino-5- ( 6-amino-9H-purin-9-il) ciclopentano-1, 2-diol) , compuesto 4 ( (1S, 2R, 3S, 5R) -3-amino-5- (7-amino-3H- [1,2,3] triazolo [4, 5-d] pirimidin-3-11) ciclopentano-1, 2-diol) o compuesto 5 ( (1S, 2R, 3S, 4R) -4- (4-amino-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) ciclopentano- 1,2, 3-triol) .
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, el inhibidor de adenosina quinasa es de la fórmula (II) : Fónnula (II) en donde: cada R9 es independientemente H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, o los dos R9 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que opcionalmente comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O o S; R10, R11 y R12 son cada uno independientemente H, OR14, N(R1 )2, N2, N02, CN, halógeno, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-Ce opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R13 es independientemente para cada ocurrencia halógeno, CN, NH2, o alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido; R14 es H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, o los dos R14 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que opcionalmente comprenden de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O o S; X2 es N o CR15; R15 es NHR16, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R16 es H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Y2 es N o CH; q es O, 1, 2 o 3; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo.
En algunas modalidades, R9 es H o alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido.
En modalidades preferidas, R10 es H.
En algunas modalidades, R11 se selecciona del grupo que consiste de H, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo opcionalmente sustituido. Cuando R11 es arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido. R14 se puede seleccionar del grupo que consiste de fenilo, tiofen-2-ilo, l-metil-2-oxobenzoxazolin-5-ilo, 2-(dimetilamino) -5-pirimidinilo, 2- (N-formil-N-metilamino) -3-pirimidinilo, 2- (N- (2-metoxiethil) -N-metilamino) -5-pirimidinilo, 5-dimetilamino-2-piridinilo, 5- (N- (2-metoxietil) -N-metilamino) -2-piridinilo, 2- (N-metilamino) -5-pirimidinilo, 2- (1-morfolinil) -5-pirimidinilo, 2- ( 1-pirrolidinil ) -5-pirimi-dinilo, 2-dimetilamino-5-pirimidinilo, 2-furanilo, 2-oxobenzoxazolin-5-ilo, 2-piridilo, 3- (dimetilamino) fenilo, 3-amino-4-metoxifenilo, 3-bromo-4- (dimetilamino) fenilo, 3-metoxifenilo, 3-metil-4- (N-acetil-N-metilamino) fenilo, 3-metil-4- (N-formil-N-metilamino) fenilo, 3-metil-4- (N-metil-N- ( trifluoroacetil) amino) fenilo, 3-metil-4- (N-metilamino) -fenilo, 3-metil-4-pirrolidinilfenilo, 3-piridilo, 3,4-diclorofenilo, 3, 4-metilendioxifenilo, 3, 4, 5-trimetoxifenilo, 4- (acetilamino) fenilo, 4- (dimetilamino) -3-fluorofenilo, 4- (dimetilamino) fenilo, 4- (imidazol-l-il) fenilo, 4 - (metiltio) -fenilo 4- (morfolinil) fenilo, 4- (N- (2- (dimetilamino) etil ) -amino) fenilo, 4- (N- (2-metoxietil ) amino) fenilo, 4- (N-acetil-N-metilamino) fenilo, 4- (N-etil-N-formilamino) fenilo, 4-(N-etil-amino) fenilo, 4- (N-formil-N- (2-metoxietil ) amino) fenilo, 4- (N-isopropilamino) fenilo, 4- (N-metil-N- ( (2-dimetilamino) etil) -amino) fenilo, 4- (N-metil-N- (2- (N-ftalimidil ) acetil) amino) -fenilo, 4- (N-metil-N- (2-ciano) etilamino) fenilo, 4- (N-metil-N- ( 2-metoxietil) amino) fenilo, 4- (N-metil-N- ( 3-metoxi ) propionil-amino) fenilo, 4- (N-metil-N-acetilamino) fenilo, 4 (N-metil-N-formilamino) fenilo, 4- (N-metil-N-trifluoroacetilamino) fenilo, 4- (N-morfolinil) fenilo, 4- (tiofen-2-il) fenilo, 4-(ureido)-fenilo, 4- (2- (dimetilamino) acetilamino) fenilo, 4-(2-(2-metoxi) acetilamino) etil) amino) fenilo, 4- (2-metoxi) etoxi-fenilo, 4- ( 2-oxo-l-oxazolidinil ) fenilo, 4- (4-metoxi-2-butil) - fenilo, 4- ( 4-metilpiperidinil ) fenilo, 4- ( 5-pirimidinil ) -fenilo, 4-butoxifenilo, 4-carboxamidofenilo, 4-clorofenilo, 4-cianofenilo, 4-dietilaminofenilo, 4-dietilmalonilalil-fenilo) , 4-dimetilaminofenilo, 4-etoxifenilo, 4-etilfenilo, 4-hidroxifenilo, 4-imidazolilfenilo, 4-yodofenilo, 4-isopropilfenilo, 4-metoxifenilo, 4-metilaminofenilo, 4-metil-sulfonilfenilo, 4-morfolinilfenilo, 4-N- (2- (dimetilamino) -etil) -N-formilamino) fenilo, 4-N- ( 3-metoxipropionil ) -?-5-iso-propil-amino) fenilo, 4-N-etil-N- (2-metoxietil) amino) fenilo, 4-N-formilpiperidinilfenilo, 4-nitrofenilo, 4-piperidinil-fenilo, 4-piridilfenilo, 4-pirrolidinilfenilo, 4-t-butil-acrilfenilo, 5- (dimetilamino) tiofen-2-ilo, 5-amino-2-piridilo, 5-dimetilamino-2-pirazinilo, 3-dimetilamino-piridazin-6-ilo, 5-dimetilamino-2-piridilo, 5-pirimidinil-fenilo, 6- (N-metil-N-formilamino) -3-piridinilo, 6- (N-metil-N- (2-metoxietil ) amino) -3-piridinilo, 6- (2-oxo-oxazolidinil ) 3-piridinilo, 6-dimetilamino-3-piridinilo, 6-imidazolil-3-piridinilo, 6-morfolinil-3-piridinilo, 6-pirrolidinil-3-piridinilo, ( 2-propil ) -3-piridinilo y (4-fomiilamino) fenilo, (tiofen-2-il ) metilo, (tiofen-3-il)metilo, butilo, ciclo-heptilo, pentilo, tiofen-2-ilo, 1- (3-bromofenil) etilo, 2-(N-fenilmetoxicarbonil) aminofenilo, 2- (3-bromofenil) etilo, 2-(3-cianofenil)metilo, 2- (4-bromofenil) etilo, 2- ( 5-cloro-2-(tiofen-3-il) fenilo, 2-bromofenilo, 2-furanilo, 2-metil-propilo, 2-feniletilo, fenilmetilo, 2 , 3-dimetoxifenilo, 2,3-metilendioxifenilo, 3- ( furan-2-il) fenilo, 3- ( tiofen-2-il ) -fenilo, 3- (2-piridil) fenilo, 3- (3-metoxibenzil) fenilo, 3- (amino) propinilo, 3-benciloxifenilo, 3-bromo4-fluorofenilo, 3-bromo-5-yodofenilo, 3-bromo-5-metoxifenilo, 3-bromofenilo, 3-bromofenilmetilo, 3-carboxamidofenilo, 3-clorofenilo, 3-cianofenilo, 3-dietilmalonilalilfenilo, 3-dimetilaminofenilo, 3-etoxifenilo, 3-fluoro-5-trifluorometilfenilo, 3-fluoro-fenilo, 3-hidroxifenilo, 3-yodofenilo, 3-metoxietoxifenilo, 3-metoxifenilo, 3-metilfenilo, 3-metilsulfonilfenilo, 3-metiltiofenilo, 3-t-butilacrilfenilo, 3-triflorometoxifenilo, 3-trifluorometilfenilo, 3-vinilpiridinilfenilo, 3,4-dicloro-fenilo, 3 , 4-dimetoxifenilo, 3, 4-raetilendioxifenilo, 3 , 4 , 5trimetoxifenilo, 3, 5-di (trifluorometil) fenilo, 3,5-dibromofenilo, 3 , 5-diclorofenilo, 3 , 5-dimetoxifenilo, 3,5-dimetilfenilo, 4 (2-propil) fenilo, 4- (2-propil) oxifenilo, 4-benziloxifenilo, 4-bromofenilo, 4-bromotiofen-2-ilo, 4-butoxifenilo, 4-dimetilaminofenilo, 4-fluoro-3-trifluoro-metilfenilo, 4-metoxifenilo, 4-neopentilfenilo, 4-fenoxifenilo, 5-broraotiofen-2-ilo, ciclohexilo, ciclo-propilo, hexilo, metilo, fenilo, (2-bromo-5-clorofenil ) -metilo, (2-bromofenil) metilo, 6-ciclopropilrnetilamino-3-piridinilo y (5-cloro-2- (3-metoxifenil) fenil)metilo. En algunas modalidades, R11 es H.
En algunas modalidades, R12 se selecciona del grupo que consiste- de N(R14)2, OR14, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo opcionalmente sustituido. Cuando R12 es N(R1 )2, uno o ambos R14 puede ser H. De preferencia por lo menos uno de R14 no es H, por ejemplo, uno de R14 es H y el otro R14 es alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, mucho más de preferencia ambos R14 son independientemente alquilo de Ci-C6. En algunas modalidades, R12 se selecciona del grupo que consiste de dialquilamino (por ejemplo dimetilamino) y heterociclilo de 5-8 miembros opcionalmente sustituido, en donde el heterociclilo comprende por lo menos un átomo de nitrógeno (por ejemplo morfolina, piridina) .
En algunas modalidades preferidas, q es 0.
En algunas modalidades, R14 es un alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, por ejemplo, metilo opcionalmente sustituido o etilo opcionalmente sustituido. El alquilo de Ci-C6 puede ser sustituido con alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, arilo o ciclilo, cada uno que también puede ser opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R14 es un metilo sustituido o etilo sustituido, en donde el metilo y etilo es sustituido con un arilo opcionalmente sustituido. En algunas modalidades, R14 es ciclilo, por ejemplo ciclopentano, ciclohexano o cicloheptano . De preferencia ciclilo es ciclohexano. En algunas modalidades, R14 es heterociclilo, de preferencia heterociclilo comprende por lo menos un átomo de 0 o N. En algunas otras modalidades, R14 es arilo opcionalmente sustituido. Por ejemplo, fenilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, un arilo sustituido con por lo menos un halógeno.
En algunas modalidades, X2 es CR15 y R15 se selecciona del grupo que consiste de NHR16, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo opcionalmente sustituido. De preferencia R16 es un alquilo opcionalmente sustituido, por ejemplo, metilo opcionalmente sustituido, etilo opcionalmente sustituido etilo, por ejemplo metilo sustituido con arilo o heteroarilo, por ejemplo, indolilo.
En algunas modalidades, R15 se selecciona del grupo que consiste de fenilo, tiofen-2-ilo, l-metil-2-oxobenzoxa-zolin-5-ilo, 2- (dimetilamino) -5-pirimidinilo, 2- (N-formil-N-metilamino) -3-pirimidinilo, 2- (N- (2-metoxietil) -N- metil-amino) -5-pirimidinilo, 5-dimetilamino-2-piridinilo, 5-(N-(2-metoxietil) -N-metilamino) -2-piridinilo, 2- (N-metilamino) -5-pirimidinilo, 2- ( 1-morfolinil ) -5-pirimidinilo, 2-(l-pirrolidinil) -5-pirimidinilo, 2-dimetilamino-5-pirimidinilo, 2-furanilo, 2-oxobenzoxazolin-5-ilo, 2-piridilo, 3-(dimetil-amino) fenilo, 3-amino-4-metoxifenilo, 3-bromo-4- (dimetil-amino) fenilo, 3-metoxifenilo, 3-metil-4- (N-acetil-N-metil-amino) fenilo, 3-metil-4- (N-formil-N-metilamino) fenilo, 3-metil-4- (N-metil-N- (trifluoroacetil) amino) fenilo, 3-metil-4-(N-metilamino) fenilo, 3-metil-4-pirrolidinilfenilo, 3-piridilo, 3, -diclorofenilo, 3, 4-metilendioxifenilo, 3,4,5-trimetoxifenilo, 4- (acetilamino) fenilo, 4- (dimetilamino) -3-fluorofenilo, 4- (dimetilamino) fenilo, 4- (imidazol-l-il) -fenilo, 4- (metiltio) fenilo, 4- (morfolinil) fenilo, 4-(N-(2-(dimetilamino) etil) amino) fenilo, 4- (N- (2-metoxietil) amino) -fenilo, 4- (N-acetil-N-metilamino) fenilo, 4- (N-etil-N-formil-amino) fenilo, 4- (N-etilamino) fenilo, 4- (N-formil-N- (2-metoxietil) amino) fenilo, 4- (N-isopropilamino) fenilo, 4-(N-metil-N- ( (2-dimetilamino) etil) amino) fenilo, 4- (N-metil-N- (2-(N-ftalimidil) acetil) amino) fenilo, 4- (N-metil-N- (2-ciano) -etilamino) fenilo, 4- (N-metil-N- (2-metoxietil) amino) fenilo, 4-(N-metil-N- ( 3-metoxi) propionilamino) fenilo, 4- (N-metil-N-acetilamino) fenilo, 4 (N-metil-N-formilamino) fenilo, 4-(N-metil-N-trifluoroacetilamino) fenilo, 4- (N-morfolinil ) fenilo, 4- (tiofen-2-il ) fenilo, 4- (ureido) fenilo, 4- (2- (dimetilamino) -acetilamino) fenilo, 4- (2- (2-metoxi) acetilamino) etil) amino) -fenilo, 4- (2-metoxi) etoxifenilo, 4- (2-oxo-l-oxazolidinil ) -fenilo, 4- (4-metoxi-2-butil) fenilo, 4- (4-metilpiperidinil) -fenilo, 4- ( 5-pirimidinil) fenilo, 4-butoxifenilo, 4-carboxa-midofenilo, 4-clorofenilo, 4-cianofenilo, 4- dietilamino-fenilo, 4-dietilmalonilalilfenilo) , 4-dimetilaminofenilo, 4-etoxifenilo, 4-etilfenilo, 4-hidroxifenilo, 4-imidazolil-fenilo, 4-yodofenilo, 4-isopropilfenilo, 4-metoxifenilo, 4-metilaminofenilo, 4-metilsulfonilfenilo, 4-morfolinilfenilo, 4-N- (2- (dimetilamino) etil) -N-formilamino) fenilo, 4-N- (3-metoxipropionil) -N-5isopropil-amino) fenilo, 4-N-etil-N- (2-metoxietil) amino) fenilo, 4-N-formilpiperidinilfenilo, 4-nitrofenilo, 4-piperidinilfenilo, 4-piridilfenilo, 4-pirrolidinilfenilo, 4-t-butilacrilfenilo, 5- (dimetilamino) -tiofen-2-ilo, 5-amino-2-piridilo, 5-dimetilamino-2-pirazinilo, 3-dimetilaminopiridazin-6-ilo, 5-dimetilamino-2-piridilo, 5-pirimidinilfenilo, 6- (N-metil-N-formilamino) -3-piridinilo, 6- (N-metil-N- (2metoxietil) amino) -3-piridinilo, 6-(2-oxo-oxazolidinil) 3-piridinilo, 6-dimetilamino-3-piridi-nilo, 6-imidazolil-3-piridinilo, 6-morfolinil-3-piridinilo, 6-pirrolidinil-3-piridinilo, ( 2-propil ) -3-piridinilo y (4-formilamino) fenilo, (tiofen-2-il ) metilo, (tiofen-3-il)metilo, butilo, cicloheptilo, pentilo, tiofen-2-ilo, l-(3-bromo-fenil) etilo, 2- (N-fenilmetoxicarbonil ) aminofenilo, 2-(3-bromofenil) etilo, 2- ( 3-cianofenil ) metilo, 2- (4-bromofenil) -etilo, 2- (5-cloro-2- (tiofen3-il) fenilo, 2-bromofenilo, 2-furanilo, 2-metilpropilo, 2-feniletilo, fenilmetilo, 2,3-dimetoxifenilo, 2 , 3metilendioxifenilo, 3- (furan-2-il) fenilo, 3- (tiofen-2-il) fenilo, 3- (2-piridil) fenilo, 3-(3-metoxi-benzil) fenilo, 3- (amino) propinilo, 3-benciloxifenilo, 3-bromo-4-fluorofenilo, 3-bromo-5-yodofenilo, 3-bromo-5-metoxi-fenilo, 3-bromofenilo, 3-bromofenilmetilo, 3-carboxamido-fenilo, 3-clorofenilo, 3-cianofenilo, 3-dietilmalonil-alilfenilo, 3-dimetilaminofenilo, 3-etoxifenilo, 3-fluoro-5-trifluorometilfenilo, 3-fluorofenilo, 3-hidroxifenilo, 3-yodofenilo, 3-metoxietoxifenilo, 3-metoxifenilo, 3-metil-fenilo, 3-metilsulfonilfenilo, 3-metiltiofenilo, 3-t-butil-acrilfenilo, 3-triflorometoxifenilo, 3-trifluorometilfenilo, 3-vinilpiridinilfenilo, 3 , 4-diclorofenilo, 3, -dimetoxi-fenilo, 3, -metilendioxifenilo, 3 , 4 , 5-trimetoxifenilo, 3,5-di (trifluorometil) fenilo, 3 , 5-dibromofenilo, 3,5-dicloro-fenilo, 3, 5-dimetoxifenilo, 3, 5-dimetilfenilo, 4(2-propil)-fenilo, 4- (2-propil) oxifenilo, 4-benciloxifenilo, 4-bromo-fenilo, 4-bromotiofen-2-ilo, 4-butoxifenilo, 4-dimetil-aminofenilo, 4-fluoro-3-trifluorometilfenilo, 4-metoxifenilo, 4-neopentilfenilo, 4-fenoxifenilo, 5-bromotiofen-2-ilo, ciclohexilo, ciclopropilo, hexilo, metilo, fenilo, (2-bromo-5-clorofenil)metilo, (2-bromofenil) metilo, 6-ciclopropil-metilamino-3-piridinilo, (5-cloro-2- (3-metoxifenil ) fenil) -metilo, 2-bromofenilo, 3-bromofenilo, 4-bromofenilo, (2-bromofenil) metilo, 2-clorofenilo, 3-clorofenilo, 4-clorofenilo, 2-fluorofenilo, 3-fluorofenilo, 4-fluorofenilo, 2-nitrofenilo, 3-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 2-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 4-metoxifenilo, 3-aminofenilo, 3-aminofenilo, 4-aminofenilo, ciclohexano, tetrahidropirano (por ejemplo, tetrahidropiran-4-ilo) , 1- (2-bromofenil ) etilo, 4-metilpent-l-en-4-ilo y ( indol-2-il-metil) amino .
En algunas modalidades, Y2 es N.
En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (II) es ABT-702 ( 5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina, también referido como B8 en la presente), compuesto 6 (7- (4- (dimetilamino) -fenil) -pteridin-4-amina) , compuesto 7 ( 5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidin-4 -amina) , compuesto 8 ( 5- (2-bromobencil ) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il ) -pirido [2, 3-d]pirimidin-4-amina) , compuesto 9 ( 5-ciclohexil-7- (6-morfolinopiridin-3-il)pirido[2, 3-d]pirimidin-4-amina) , compuesto 10 ( 5- (tetrahidro-2H-piran-4-il ) -7- ( 6-morfolino-piridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 11 (5- (1- (2-bromofenil) etil) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il ) pirido-[2, 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 12 (5- (2-metilpent-4-en-2-il) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4 -amina) o compuesto 13 (N5- ( (lH-indol-3-il)metil) -7- (6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2 , 3-d] pirimidin-4 , 5-diamina) .
En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (II) se selecciona del grupo que consiste de 4-amino-5- (4-chorofenil ) -7- ( -nitrofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (4-metoxifenil) -7- (4-nitrofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-fluorofenil) -7- (4-fluorofenil) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- ( 4-clorofenil) -7- (4-fluorfenil) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-fenil-7- ( -aminofenil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-fenil-7- ( -bromfenil ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (4-metoxifenil) -7- (4-aminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5, 7-difenilpirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-dimetiiilaminofenil) -7- (4-bromofenil) -pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amiho-5- (4-dimetilaminofenil) -7-( 4-dimetilaminofenil] pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-S- (4-metoxifenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-dimetilaminofenil) -7- ( 4 -metoxifenil ) pirido [2 , 3— d] pirimidina; 4-amino-5- (4- (2-propil) fenil) -7- (4-metoxi-fenil)pirido[2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-neopentilfenil ) -7-(4-metoxifenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-butiloxifenil ) -7- ( 4-metoxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-metoxifenil ) -7- ( 4-bromofenil ) pirido [2, 3-d]-pirimidina; 4-amino-5- (4- (2-propil) oxifenil) -7- (4-metoxifenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 4-butoxifenil } -7-(4-N-formilpiperazinilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-benciloxifenil) -7- (4-metoxifenil)pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4 -amino-5- ( 4-fenoxifenil ) -7- (4-metoxifenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4- (2-propil) fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4- (2-propil ) -fenil) -7- ( 4-t-butilacrilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3, 4-dimetoxifenil ) -7- ( -dimetilamino fenil] pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-t-butilacril fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- (3-metoxifenil-7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil-7- (4-dimetilamino fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-dietilmalonil alilofenil) -7- (4-dimetilaminofenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-vinilpiridinilfenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-teifluorometilfenil ) -7 ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-(3 carboxamidofenil) -7- ( -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-cianofenil) -7- ( -dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-benciloxifenil ) -7- (4-dimetil aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-metoxi fenil ) -7- ( 4-metoxifenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5 ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-butoxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- (3- (2-piridil) fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-metilfenil) -7- (4-dimetil aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-clorofenil) 7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3 fluorofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-fluorofenil) -7- (4-metoxifenil) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-metoxifenil) -7- ( 4 -bromofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7 fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4 etilfenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-bromofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- ( 4-cianofenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( -hidroxifenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-yodofenil) -7- (4-dimetilammofenil) pirido [2, 3- d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-etoxifenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 3-triflorometiloxifenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-diclorofenil) -7- ( 4-dimetilaniinofenil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-4-fluorofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- { 3-hidroxi-fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-morfolinilfenil ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-piperidinilfenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- ( imidazol-l-il ) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-clorofenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bfomofenil) -7- (4-isopropilfenil) irido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-S- (3-bromofenil) -7- ( -trilluorofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-dietilaminofenil ) -pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3, , 5-trimetoxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3- (3-metoxibencil ) fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-metoxietoxifenil ) -7- ( 4-dimetilamino-fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3, 4-metilendioxi-fenil) -7- ( 4 -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 4-etoxifenil ) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( tiofen-2-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-fluorofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-dimetilaminofenil) -7 ( 4 -dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5 fenil-7- (4-dimetilaminofenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- (3,4, 5-trimetoxifenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d]pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-nitrofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-yodo fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (3-bromofenil) -7 (3, 4-metilenedioxfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5 (tiofen-2-il) -7- ( 4-morfolinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil ) -7- ( tiofen-2-i1) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-carboxamidofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (2 metoxi) etoxifenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5 dimetoxifenil ) -7- ( 4-morfolinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-trifluoromeetilfenil ) -7- (tiofen-2-il ) irido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-4-fluorofenil) -7 (tiofen-2-il) pirido [2 , 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 3-bromo-4 fluorofenil) -7- (2-furanil) irido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5 (3, 5-dimetoxifenil) -7- (4-yodofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil) -7- ( midazolilfenil ) pirido [2, 3--d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil ) -7- (4- (tiofen-2-il) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxi-fenil) -7- (4- (3-pindil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- ( 4-metilpiperidinil ) fenil) pirido [2,3-d] irimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-pirrolidinil-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( -bromotiofen-7- (4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-bromotiofene-2-il) -7- ( 4-morfolinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-morfolinil-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 5-bromotiofen-2-il ) -7- (4-morfolinilfenil)pirido[2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (4-bromo-fenil) -7- ( 4 -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (acetilamino) fenil)pirido[2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil) -7- (5-pirimidinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- ( 4-fluorofenil) amino) -5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-bromotiofen-2-il) -7- (4-pirrolidinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-bromotiofen-2-il) -7- (tiofen-2-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (5- (dimetilamino) tiofen-2-il) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-yodofenil) -7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3,5-di ( trifluorometil ) fenil) -7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-di (trifluorometil) fenil) -7- (4-morfolinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3,5-dibromofenil) -7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, S-dibromofenil) -7- (4-morfolinilfenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-bromotiofen-2-il ) -7- (4-(4-metilpiperidinil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dibromofenil) -7- ( -dimetilamino) fen) pirido [2, 3d] pirimidina; 4-amino-5- { 3-bromofenil) -7-{3- (dimetilamino) fenil) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( -metil-sulfonilfenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- (3-metoxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (metiltio) fenil) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (3, 4-diclorofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-animo-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (N-metil-N-formil-amino) fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil) -7- (4-metilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- (3-bromo-4 -fluorofenil) -7- ( 4-metilSulfonilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-amino-4-metóxi-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-bromo-4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-metil-4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N-trifluoroacetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (dimetilamino) -3-fluorofenil)pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-etil-N-formilamino) fenil) pirido [ 2 , 3d] pirimidina; 4 , 4-bis (acetil-amino) -5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N-acetilamino) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-acetil-N-metilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 4- (N-etilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (2-metoxi-etil) amino) fenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromo-fenil ) -7- ( 4- ( -isopropilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4-N-etil-N- (2-metoxietil) amino) -fenil) pirido [2, 3-dipirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-N- (3-metiioxipropionil) -N-isopropi1-amino) fenil) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-N- (2- (dimetil-amino) etil) -N-fomilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N- (2- (dimetilamino) etil) amino) -fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (?-2-dimetilamino) etil) amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (3-metoxi) propionil-amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (3-metil-4- (N-formil-N-metilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-metil-4- (N-metilamino) fenil) irido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- ( -metoxi-2-butil ) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (2- (N-ftali-midil) acetil) amino) fenil ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-(3-bromofenil) -7- (3-metil-4- (N-metil-N-(trifluoroacetil) amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 3-metil-4- (N-acetil-N-metilamino) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-dimetilamino-3-piridinil ) pirido[2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-(3-cianofenil) -7- (4-metilsulfonilfenil)pirido[2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- ( 3-cianofenil ) -7- ( 4- (N-metil-N-formilamino) -fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-( -meti1-N-formilamino) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] piridimina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-morfolinil-3-piridinil ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (N-metil-N-metoxietilamino-3-piridinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- (3-bromofenil) -7- ( 6-pirrolidinil-3-piridinil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2- (dimetilamino) -5-pirimidinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2- (N-metoxietil-N-metilamino) -5-pirimidinil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 2- (N-formil-N-metilamino) -5-pirimidinil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2- (N-metilamino) -5-pirimidinil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2- (1-pirrolidinil ) -5-pirimidmil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2- (1-morfolinil) -5-pirimidinil) pirido [2,3 d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (2-oxo-3-oxazo-lidinil) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil ) -7- ( 2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5-(3-bromofenil) -7- (3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3- (tiofen-2-il) fenil) -7- ( -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3- (furan-2-il) fenil) -7- (4-dimetil-aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3- (3-metoxi-fenil) fenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ] ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5-fenil-7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimi-dina; 4-amino-5- (3-clorofenil) -7- (4- (morfolinil) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-4-fluorofenil) -7- (4- (morfolinil) fenil) pirido [2 , 2-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-clorofenil) -7- (4-yodofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- (3-clorofenil) -7- (4- (tiofen-2-il) fenil) pirido [2, 3-d] pirimi-dina; 4-amino-5- (3-clorofenil) -7- (4- ( 5-pirimidinil) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-4-fluorofenil) -7-( 4-yodofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-bromo-tiofen-2-il) -7- (4-metoxifenil) pirido [23-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil)metil-7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2-feniletil) -7- ( 4-dietilamino-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 2-metilpropil ) -7-( 4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-(butil ) -7- ( 4-dietilaminofenil ) pirido [2, 3-d] piridina; 4-amino-5- (2- (4 -bromofenil) etil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (butil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- ( 3-cianofenil ) metil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- (N-fenilmetoxicarbonil) aminoetil) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (cicloheptil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- (5- cloro-2- (tiofen-3-il) fenilmetil) -7- ( 4-dimetilaminofneil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amio-5- (pentil) -7- (4-dietilamino-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-hexil-7- ( -dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- (3-bromo-fenil) etil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( (2-bromofenil)metil) -7- (4-dietilaminofenil)pirido- [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5-ciclopropil-7- ( 4-dimetilamino-fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (4-dimetilaminofenil)pirido[2, 3-d] pirilTudina : 4-amino-5- ( (2-bromo-5-clorofenil) metil) -7- ( 4-dietilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-metil-7- (4-dietilaminofenil) pirido- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2, 3-metilendioxifenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-fluoro-5-trifluorometilfenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2-bromofenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetil-fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, -diclorofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-fluoro-3-trifluorometilfenil) -7- (4-dimetilaminofenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-5-metoxifenil ) -7- (4-morfolinilfenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-metoxifenil) -7- (4-pirro-lidinilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-5-metoxifenil) -7- ( 4-piperidinilfenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-metboxifenil] ) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-metiltiofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-metoxifenil) -7- (tiofene-2-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2, 3-dimetoxifenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-metilsulfonilfenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina : 4 -acetilamino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2 , 3-d]pirimi-dina; 4-formilamino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- (metoxiacetil) amino-5- (3-bromo-fenil) -7- ( 4-dietilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-trifluoroacetilamino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dmietilamino-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-pentanoilamino-5- (3-bromo-fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-benzoilamino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4- (N-BOC-glicil) amino-5- ( 3-bromofenil ) -7-(4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4- (N-ftalimi-dilglicil) amino-5- ( 3-bromofneil ) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido[2, 3-d] pirimidina ; 4- (etilaminocarbonil) -amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- (etilaminocarbonil) amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-alilamino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 - (2-(N, N-dimetilamino) etilamino) -5- ( -bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4- ( - (N, N-dimetilamino) -butilamino) -5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) - pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- (N-alil-N-formilamino) -5- (4 dimetilaminofenil) -7- ( 4-bromofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-diacetilamino-5- (p-dimetilaminofenil ) -7- (4-bromofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (5-amino 2-piridil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) 7- (5-dimetilamino-2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino 5- (3-bromofenil) -7- (5-dimetilamino-2-pirazinil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil] ) -7- (2-oxobenzoxazolin-6 il)pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (1 metil-2-oxobenzoxazolin-6-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( (5-cloro-2- ( 3-metoxifenil ) fenil) metil) -7- ( -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( (tiofen-2 il)metil) -7- (4-amino-5- ( ( tiofene-3-il) metil) -7- (4-dietil-aminofenil)pirido[2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( (2-bromo fenil) memil) -7- (4 -dimetilaminofenil) pirido [ 2 , 3-d] pirido [2 , 3-d]pirimidin; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-formil-N- (2 metoxietil) amno) fenil] ) pirido [2, 3-d]pirimidina; 4-amino-5- (3 bromofenil) -7- (4- (N- (2 -metoxietil) amino) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-araino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- ( (2 dimetilamino) etil) amino) fenili ) pirido [23-d] pirimidina; 4 amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (2-metoxi) acetilamino) etil) -amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromo fenil) -7- ( (4-formilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (2- (dimetilamino) acetilamino) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- (4 (2-oxo-3-oxazolidini) fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -.7- (6- (2-propil) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 3-metil-4-pirroli-dinilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6-imidazolil-3-piridinil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-fenilmetil-7- ( 4-dietilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- (3-aminopropinil) fenilmetil) -7- ( 4-dietilamino-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- ( 3-bromofenil ) -etil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-dimetilaminofenil) -7- ( 4-bromofenil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (2-furanil) -7- (4- (N-morfolinil ) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (2-dimetilamino-5-pirimidinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- (3-bromofenil) -7- (4- (ureido) fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 1-fenilmetil-3-piperidinil ) -7- ( 4-dietilaminoetil ) -pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (6- (3-metil-5-isoxazolil) ) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (6-cloro-3-piridinil)pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-metoxi-3-piri-dinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-(1,2, 4-triazol-4-il) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2-morfolinil-5-pirimdinil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2-tiazolil)-7- ( 4-pirrolidinil-fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7-(6-pirazolil-3-piridinil) ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- ( 1-metil-ureido) fenil) -pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (N-metil-N- (2-pirimidinil ) amino) fenil ] ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina ; -amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-fluoro-4- (N-formil-N-metilamino) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-formilamino-S- (3-bromofenil) -7- (3-fluoro-4- (N-formil-N-metilamino) fenil) -pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N-metil-sulfonilamino) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (N-metil-N-metilSulfonilamino) -3-piridinil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (1-metil-5-indolinil) pirido [2, 3-d] pirimidina: 4-amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- ( l-metil-5-bencimidazolil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-dimetilamino-3-piridazinil ) -pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6-morfolinil-3-piridazinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-(3-bromofenil) -7- ( 6-pirrolidinil-3-piridazinil ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bimofenil) -7- ( 5-morfolinil-2-pirazi-nil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 5-(N- (2-metoxietil) -N-metilamino) -2-pirazinil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (morfolinilmetil ) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (5-(?,?-bis (2-metoxietil) amino) -2-piridinil ) pirido [ 2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (imidazolilmetil) -fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (5-( 1-morfolinil) -2-piridinil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- ( (dimetilamino) metil) -fenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (5- (4-hidroxi-l-piperidinil ) -2-piridinil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (5- (N-formil-N-metilamino) -2-piridinil) -pirodo [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (5- (2-propenil) -2-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (3- (2-metoxietil) -2-oxo-6-benzoxazolil) pirido- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (1- (N-formilamino) -etil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; clorhidrato de 4- (metilamino) -5- (3-bromofenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) -pirido- [2 , 3-d] pirimidina; clorhidrato de 4-(2-metoxi-etilamino) -5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil] ) pirido-[2 , 3-d] pirimidina ; triclorhidrato de 4 -amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- (4- ( l-metil-2-imidazolil ) fenil)pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (aminometil) fenil ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (2-bromo-4- (dimetilamino) fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- ( (dimetilaminoetil ) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (3- (dimetilamino) -propinil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (3-amino-3-metil]butinil) fenil ) pirido [ 2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( -dimetilfosfonato-fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7-(4- (3- (metoxipropinil) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-carboxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 4-metil-3-oxo-2H-4H-pirido [ 3, 2-b] -1, 4-oxazin-7-il) pirido [23-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (2-dimetilamino) etil) -3-oxo-2H-4H-pirido [ 3, 2b] -1 , 4-oxazin-7-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil) -7- ( 2-dihidro-3- (dimetilaminoetil ) -2-oxobenzoxazol-6-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-metil-3-oxo-2H-4H-benzo-l, 4 -oxa zin-7-i 1 ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (2,2, 4-trimetil-3-oxo-2H-4H-benzo-l, 4-oxazin-7-il) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 4- (2-dimetilamino) etil-2H, 4H-benzo-3-oxo-l , 4-oxazin-7-il) pirido [2, 3-d] pi imidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (5- ( 1-metiletil] ) -2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (5-piperidin-l-ilpirid-2-il) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (4-bromofenil) etil) -7- ( 6-morfolinilpirid-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-( 3-bromofenil ) -7- ( 4- ( (N-formilamino) metil ) fenil ) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (1-metil-l- (N-metilamino) etil) fenil) -pirido [2 , 3-d] pirimidina : 4 -amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (1- (dimetilamino) -1-metiletil) fenil ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (N-acetil-5-indolinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-cloro-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 1- (2-bromofenil) etil) -7- ( 6-dietilamino-3-piridil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromofenil) etil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromo- fenil) etil)-7-(4- (N-metil-N-formil ) amino) -fenil) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-morfolinil-3-piridil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( (2-bromofenil ) -metil) -7- (6-morfolinil—3-piridil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-S- ( 4-tetrahidropiranil) -7- (6-morfolinil-3-piridil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-dimetil-amino-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1-etil-propil ) -7- ( 6-dimetilamino-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5-ciclopentil-7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (2-cloro-3-piridil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetilciclohexil) -7-(6-dimetilamino-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-( (N- (benciloxicarbonil ) -4-piperidinil ) metil ) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-bromo-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclo-hexil-7- ( 3-cianofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-S- ( 1-(2-bromofenil ) etil ) -7- ( 6-dimetilamino-3-piridazini1 ) pirido-[2 , 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-imidazolil-3-pi idazinil ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina ; -amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- (6- (azacicloheptanil) -3-piridazinil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (6- (N-metil-N- ( 1-metiletil) amino) -3-piridazinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromofenil) etil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridazi-nil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- ( -acetilpiperazinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- amino-5-ciclohexil-7- (6- ( -acetil-l , 4-diazacicloheptanil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-S-ciclohexil-7- ( 6- ( 4-meti1-1 , 4-diazacicloheptanil ) -3-piridil ) pirido [2, 3-d]-pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (N-metil-N- (2- (2-piridil) etil) amino) -3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6-2-(?-(?',?' -dimetilaminoetil) -N-metilamino) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-azetidinil-3-piridil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (3- (N-metilacetamido) pirrolidinil) -piridil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil.-7- ( 6-( 3- ( fomiamido) pirrolidinil ) piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5-ciclohexil-7- (4-oxo-l-fenil-l, 3, 8-triazaespiro-[ 4 , 5 [decan-8-il) pirido [2 , 3-d] pirimidina; -amino-5-cielo-hexil-7- (6- (2-metoxietil) pirrolidin-l-il) piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (N-metoxietil-N-propilamino) piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (N-metil-N- (2, 2-dimetoxietil) amino) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (4- (dimetilamino) -piperidinil ) piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (4- (aminocarbonil) ) piperidinil ) piridil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (N-metil-N-(3- (dietilamino) propil) aminopirid-3-il) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (N-metil-N- (4-piridil) etil-amino) pirid-3-il) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (N-metil-N- ( 3-piridilmetilamino) pirido [2,3- d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromofenil ) etil) -7- (l-metil-5-indolil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromofenil ) -etil) -7- ( l-metil-2, 3-dioxo-5-indolil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-fluoro-4- (1-morfolinil) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4 -hidroxi-3-nitrofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (6- (4, 4-etilendioxipiperidinil) -3-piridil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (6- (4-oxopiperidinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- ( 4-formilpiperazinil) -3-piridil ) pirido- [2, 3d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (6- (4-metil-piperazinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-oxopiperidinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 6- ( 4 , -dioxotio-morfolinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2-bromofenil) -7- ( 6-morfolinil3-piridil ) pirido [ 2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromo-4-metoxifenil ) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-bromofenil) -7- (6-morfo-linil-3-piridil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-cloro-fenil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 5-cloro-6-morfolinil-3-piridil ) -pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (N-oxidomorfolinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- ( 3-bromofenil ) -7- (6- (N- (2-hidroxietoxietil ) 4 -amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (6- (N- (2-hidroxietoxietil) -N-formilamino) -3- piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6- (N- (2-hidroxietoxietil) -3-piridil-N-óxido) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- ( 3-hidroxi ) morfo-linil) -3-piridil) pirido [2, 3-d]pirimidina; sal de disodio de 1- (5- (4-amino-5- ( 3-bromofenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidin-7-il) -2-piridil) -piperidin-4-fosfato; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-metilenilpiperidinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-hidroxi-4- (hidroximetil ) piperi-dinil) -3-piridil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromófenil) -7- (6- (4, 4-etilendioxipiperidinil) -3-piridil) pirido- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (4-oxo-piperi-dinil)-3-piridil)pirido[2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclo-hexil-7- ( 6- ( 4-metilenilpiperidinil ) -3-piridil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-N- ( iminometil ) amino-5-ciclohexil-7- (6-dimetil-amino-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-dimetilaminofenil) -7- (4-bromofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-dimetilaminofenil) -7- ( 4-metilaminofenil ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-S- (4-metoxifenil) -7- (4-dimetilaminofenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-S- (4-dimetil-aminofenil) -7- (4-metoxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4- (2-propil) fenil) -7- (4-metoxifenil ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( -neopentilfenil) -7- (4-metoxifenil) -pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( -butiloxifenil) -7- (4-metoxifenili) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4 -metoxifenil) -7- (4-bromofenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4- amino-5- (4- (2-propil) oxifenil) -7- ( 4-metoxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( -butoxifenil ) -7- (4-N-formilpipera-zinilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( -benciloxi-fenil] ) -7- ( 4-metoxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-( 4-fenoxifenil) -7- (4-metoxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5- (4- (2-propil) fenil-7- (4-dietilmalonilalilfenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4- (2-propil ) fenil ) -7- ( 4 -t-butilacrilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4-dimetilamino 4-amino-5- (3, 4-dimetoxifenil ) -7- (4-dimetilaminofenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-t-butilacrilfenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2,3-d] pirimidino; 4-amino-5- (3-metoxifenil-7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (3, 5-dimetoxifenil-7 , -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-dietilmalonilalilfenil ) ) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-vinilpiridinilfenil-7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-trifluoro-metrilfenil) -7- ( -dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-carboxamidofenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-cianofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 3-benciloxi-fenil) -7- (4-dimetilaminofenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-metoxifenil ) -7- (4-metoxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-butoxifenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3- (2-piridil) fenil) -7- (4-dimetil-arainofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5- ( 3-metilfenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-clorofenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-S- ( 3-fluorofenilD-7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( -metoxifenil ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-metoxifenil ) -7- ( 4-bromofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7-fenilpirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7-( 4-etilfenil ] fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4-bromofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino- 5- (3-bromofenil) -7- (4-cianofenil) pirido2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-hidroxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-yodofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-etoxifenil) -7- (4-dimetil-aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-trifloro-metioxifenil ) -7- (4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-diclorofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil] )pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-4 -fluorofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-hidroxifenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [23-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-morfolinilfenil ) pirido [2-3-d]-pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-piperidinilfenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- ( imidazol-l-il ) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 4-clorofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-isopropilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-trifiuorofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dietilaminofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3, 4 , 5-trimetoxifenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3- ( 3-metoxibenzil) fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; samino-5- ( 3-metoxietoxifenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 4-metilendioxi-fenil) -7- (4-dimetilaminofenil] pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-etoxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2' -tiofene) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-fIuorofenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-dimetilaminofenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2 , 2-d] pirimidina; 4 -amino-5-fenil-7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3,4, 5-ttrimetoxifeni ) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d]pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-etoxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-yodofenil) pirido [2, 3-d] irimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil) -7-amino-S- (3—bromofenil) -7- (3, 4-metilendioxifenil) -pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (tiofen-2-il ) -7- (4-morfolinilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3, S-dimetoxifenil) -7- (tiofen-2-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-carboxamidofenil) pirido[2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (2-metoxi) etoxi-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil ) -7- (4-morfolinilfenil] ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-trifluorometilfenil ) -7- (tiofen-2-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-aminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-4-fluorofenil) -7- (tiofene-2-il ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-4-fluoro-fenil) -7-(tiofen-2-il)pirido[2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-4-fluorofenil ) -7- (2-furanil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil ) -7- (4—imidazolilfenil ) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil ) -7- (4- (tiofen-2-il) fenil)pirido[2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3 , 5-dimetoxi-fenil) -7- (4- (3-piridil ) fenil] ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- ( 4-metilpiperidinil ) fenil) pirido-[2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil ] ) -7- ( - (4-metil-piperidinil) fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-bromotiofen) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4-bromotiofen-2-il ) -7- (4-morfolinilfenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-morfolinil-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (5-bromotiofen-2-il) -7- (4-morfolinilfenil) irido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- ( 4-bromofenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (acetil-amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3, 5-dimetoxifenil) -7- (5-pinmidinilfenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- (4-fluorofenil) amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil) pirodo [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-bromotiofen-2-il ) -7- ( 4-pirrolidinilfenil ) pirido [2, 3-d]-pirimidina; 4-amino-5- (4-bromotiofen-2-il) -7- ( tiofen-2-il ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 5-dimetilamino) tiofen-2-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-yodofenil) -7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4 -amino-5- (3, 5-di ( trifluorometil) fenil) -7- ( 4-- (dimetilamino) fenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (3,5-di (trifluorometil) fenil) -7- ( 4-morfolinilfenil) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dibromofenil ) -7- ( 4-dimetiiil-araino) fenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 3 , 5-dibromo-fenil ) -7- (4-morfolinil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4 -amino-5- (4-bromotiofen-2-il) -7- (4- ( 4-metilpiperidinil ) fenil ) pirido [2 , 3-b] pirimidina; 4-amino-5- (3, 5-dibromofenil) -7- (4- (dimetil-amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil)-7-(3- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina: 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-me ilsulfonilfenil ) pirifo [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 3-metoxifenil ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( - (metiltio) fenil) pirido [23~d] pirimidine; -amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- (3, 4-diclorofenil ] )pi ido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N-formilamino) fenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-metilamino-fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; samino-5- (3-bromo-4-fluoro- fenil) -7- (4-metilsulfonilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-amino-4-metaoxifenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-bromo-4- (dimetil-amino) plienil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil) - (3-metil-4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N-trifluoro-acetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofeni) -7- (4- (N-etil-N-formilamino) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4, 4-bis (acetilamino) -5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-meti1-N-acetilamino) fenil)pirido[2,3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (N-acetil-N-metilamino) fenil) pirido [2,3-d] pirimidina : 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-etilamino) -fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3-bromofenil ) -7- (4- (N-metil-N- (2-metoxietil) amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-isopropilamino) fenil) pirido-[2, 3-d] irimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-N-etil-N- (2-metoxietil) amino) fenil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-N- (3-metoxipropionil) -N-isopropil-amino) -fenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-N- (2- (dimetilamino) etil) -N^formilamino) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7-(4-(N-(2- (dimetilamino) etil) amino) fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (2-ciano) etilamino) fenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N-(3-metoxi ) propionilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (3-metil-4- (N-formil-N-metilamino) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3 metil-4- (N-metilamino) fenili) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-metoxi-2-butil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (2- (N ftalimidil) acetil) amino) fenil)pirido [2, 3-d] pirmidina; 4 amino-S- (3-bromofenil) -7- (3-metil-4- (N-metil-N- (trifluoro-acetil ) amino) fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 3 bromofenil) -7- (3-metil-4- (N-acetil-N-metilamino) fenil) -pirido [2 , 3-d] pirimidina : 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 6 dimetilamino-3-piridini1 ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina ; 4 -amino-5 (3-cianofenil) -7- ( 4-metilsulfonilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-cianofenil) -7- (4-N-metil-N-fomilamino) fenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6 ( -meti1-N-formilamino) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridinil ) -pirodo [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6- (N-metil-N metoxietilamino) -3-piridinil)pirido[2, 3-d]pirimidina; 4 amino-5- (3-bromofenil) -7- (6-pirrolidinil-3-piridinil)pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (2- (dimetil amino) -5-pirimidinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3 bromofenil) -7- (2- (N-metoxietil-N-metilamino) -5-pirimidinil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-S- (3-bromofenil) -7- (2- (N formil-N-metilamino) -5-pirimidinil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2- (N-metilamino) 5-pirimidinil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (2- (1 pirrolidinil) -5-pirimidinil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino 5- ( 3-bromofenil ) -7- (2- ( 1-pirrodinil ) -5-pirimidinil ) pirido- [ 2 , 3-d] pirimidina : 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (6- (2-oxo-3 oxazolidinil) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5 (3-bromofenil) -7- (2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino 5- ( 3-bromofenil ) -7- (3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- (3- (tiofen-2-il ) fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirodo- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3- (furan-2-il) fenil) -7- (4 dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d]pirimidina; 4-amino-5- ( 3- ( 3 metoxifenil) fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-S-fenil- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [2 , 3 d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-clorofenil ) -7- (4- (morfolinil) fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3-bromo-4-fluoro fenil) -7- (4- (morfolinil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4 amino-S- ( 3-clorofenil ) -7- ( -yodofenil) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-clorofenil) -7- (4- (tiofen-2-il) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 3-clorofenil ) -7- ( - ( 5 pirimidinil) fenil] ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- ( 3 bromo-4-fluorofenil) -7- (4-yodofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 4-bromotiofeni-2-il ) -7- ( -metoxifenil) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) metil-7- (4- (dimetil amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (2-feniletil) 7- ( 4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (2 metilpropil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (butil) -7- ( 4-dietilaminopenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (2- (4-bromofenil) etil) -7- (4-dietil-aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (butil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- ( 3-cianofenil) metil-7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-S- (2- (N-fenilmetoxicarbonil) aminoetil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- (5-cloro-2- (tiofen-3-il) fenilmetil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (pentil) -7- (4-dietil-aminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-hexil-7- ( 4-dietilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2- ( 3-bromofenil) etil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( ( 2-bromofenil ) metil ) -7- ( -dietilamino-fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclopropil-7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 4-dimetilaminofenil] ) pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 2-bromo-5-clorofenil ) metil ) -7- ( 4-dietilamino-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-metil-7- (4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina : 4-amino-5- (2, 3-metilen-dioxifenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-fluoro-5-trifluorometilfenil ) -7- ( 4-dimetil-aminofeni) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-(3, 5-dimetilfenil ) -7- ( 4 -dimetilaminofenil ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3, 4-diclorofenil) -7- ( -dimetilamino-fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (4-fluoro-3-trifluorometilfenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-5-metoxifenil ) -7- (4-morfo-linilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-metoxifenil) -7- (4-pirrolidinilfenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-5-metoxifenil) -7- (4-piperidinilfenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-5-metoxifenil) -7- ( -dimetilaminofenil ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-metiltiofenil) -7- ( -dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromo-5-metoxifenil ) -7- (tiofen-2-il ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (2, 3-dimetoxifenil ) -7- (4-dimetilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-metilsulfonilfenil ) -7- (4-dimetilaminofenil ) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-acetilamino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetil-aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-formilamino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) -4- (metoxiacetil ) amino-5-(3-bromofenil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-trifluoroacetilamino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-dimetilamino-fenil)pirido[2,3-d] pirimidina; -pentanoilamino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d]pirimidina: 4-benzoilamino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4-dimetilaminofenil ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4- (N-BOC-glicil) amino-5- (3-bromofenil ) -7-(4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- (N-ftalimi-dilglicil) amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) -pirido [2, 3-d]pirimidina; 4- (etoxicarbonil) amino-5- ( 3-bromo- fenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 (etilaminocarbonil) amino-S- ( 3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil] ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-alilamino-5- ( 3-bromofenil ) 7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4- (2- (N, N dimetilamino) etilamino) -5- ( -bromofenil ) -7- ( 4-dimetilaminofenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4- (4- (N, N-dimetilamino) butil amino) -5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4- (N-alil-N-formilamino) -5- (4-dimetilaminofenil) 7- (4-bromofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-diacetilamino-5 (p-dimetilaminofenil) -7- (4-bromofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7-5-amino-2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (5-dimetil amino-2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3 bromofenil) -7- ( 5-dimetilamino-2-pirazinil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7-2-oxobenzoxazolin-6 il)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (1 metil-2-oxobenzoxazolin-6-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( (5-cloro-2- ( 3-metoxifenil ) fenil ) metil-7- (4-dimetilaminofenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; -amino-5- ( ( tiofen-2 il)metil) -7- (4-dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( (tiofen-3-il)metil) -7- (4-dimetilaminofenil) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( (2-bromofenil) metil) -7- (4 dimetilaminofenil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3 bromofenil) -7- (4- (N-formil-N- (2-metoxietil ) amino) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N- (2 metoxietil) amino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3 bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (2-dimetilamino) etil) amino) -fenil ) pirido [2 , 3-d] pirmidina; 4-amino-5- ( 3-bromometil ) -7- ( (2-metoxi) acetilamino) etil) amino) fenil) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( ( 4-formilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (2 dimet.ilamino) acetilamino) fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4- ( 2-oxo-3-oxazolidinil ) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (6- (2 propil ) -3-piridinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3 bromofenil) -7- (3-metil-4-pirrolidinilfenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-imidazolil-3 piridinil)pirido[2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-fenilmetil-7- ( 4 dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (2- ( 3 aminopropinil) fenilmetil) -7- ( 4-dietilaminofenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (1- ( 3-bromofenil ) etil ) -7- ( 4-dietil aminofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (4-dimetil aminofenil) -7- (4-bromofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino 5- (2-furanil) -7- (4- (N-morfolinil ) fenil) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (2-dimetilamino-5-pirimi dinil)pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( (ureido) fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidinae; 4-amino-5- ( 1-fenil-metil-3-piperidinil) -7- (4 -dietilaminofenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; -amino-5- (3-bromofenil ) -7- (6- ( 3-metil-5-isoxazolil ) -3-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-cloro-3-piridinil ) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-metoxi-3-piridinil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6- (1, 2, 4-triazol-4-il) -3-piridinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- { 3-bromofenil) -7- { 2-morfolinil-5-pirimidinil) pirido- [2, 3-d] pirimidina: 4-amino-5- (2-tiazolil) -7- (4-pirrolidinil-fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil-7- (6-pirazolil-3-piridinil ) ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- ( 1-metil-ureido) fenil) -pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (N-metil-N- (2-pirimidinil) amino) fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (3-fluoro-4- (N-formil-N-metilamino) fenil) -pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-formilamino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 3-fluoro-4- (N-formil-N-metilamino) fenil) -pirido[2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (-metil-N-metil-sulfonilamino) -fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (N-metil-N-metilsulfonilamino) -3-piridinil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (1-metil-5-indolinil) pirido [2, 3-d] pirimidina: 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( l-metil-5-bencimidazolil ) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-dimetilamino-3-piri-dazinil)pirido[23-d]pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7-( 6-morfolinil-3-piridazinil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-pirrolidinil-3-piridazinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (5-morfolinil-2-pirazini1 ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (5- (N- ( 2-metoxietil) -N-metilamino) -2-pirazinil ) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (morfolinil-metil) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo-fenil)-7-(5-(N, N-bis (2-metoxietil ) amino) -2-piridinil) pirido- [23-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- (4- (morfolinil-metil ) fenil ) pirido [2, 3-d] pirmidina; 4-amino-5- (3-bromofenil ) -7- (5- ( 1-morfolini1 ) -2-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil-7- ( 4- ( (dimetilamino) metil ) fenil ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 5- ( 4 -hidroxi-l-piperidinil ) -2-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; A-amino-5- (3-bromofenil) -7- (5- (N-formil-N-metilamino-2-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 5- (2-propeni1) -2-piridinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3- (2-metoxietil) -2-oxo-6-benzo-xazolil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (1- (N-formilamino) -ettil) fenil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; clorhidrato de 4- (metilamino) -5- (3-bromofenil) -7- (4-dimetil-aminofenil) pirido- [2, 3-d] pirimidina; clorhidrato de 4- (2-metoxietilamino) -5- ( 3-bromofenil-7- (4- (2-metoxietilamino) -5-( 3-bromofenil) -7- ( 4-dimetilaminofenil ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; triclorhidrato de 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- ( 1-metil-2-imidazolil) feniDpirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-( 3-bromofenil) -7- (4- (aminoetil) fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- (2-bromo-4- (dimetilamino) fenil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4 (dimetilaminoetil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5 ( 3-bromofenil ) -7- ( 4- ( 3- (dimetilamino) piropinil ) fenil ) pirido- [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4- (3-amino-3 metilbutinil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-(3 bromofenil) -7- (4-dimetilfosfonatofenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4- ( 3- (metioxipropinil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4 (carboxifenil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromo fenil) -7- (4-metil-3-oxo-2H-4H-pirido[3, 2-b] -1, 4-oxazin-7-il ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (2 (dimetilamino) etil) -3-oxo-2H-4H-pirido [3, 2-b] -1, 4-oxazin-7-il) pirido [2 , 3-dpirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (2 , 3 dihidro-3- (dimetilaminoetil ) -2-oxobenzoxazol-6-il ) pirido-[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 4-metil-3-oxo 2H-4H-benzo-l , 4-oxazin-7-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino 5- (3-bromofenil) -7- (2, 2, 4-trimetil-3-oxo-2H-4H-benzo-l, 4-oxazin-7-il ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7 (4- (2-dimetilamno) etil) -2H-4H-benzo-3-oxo-l , 4-oxazin-7-il) pirido [2 , 3-dpirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 5- ( 1 metiletil) -2-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3 bromofenil) -7- (5-piperidin-l-ilpirid-2-il) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amio-5- (1- (4-bromofenil) etil) -7- ( 6-morfolinil pirid-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) 7- (4- ( (N-formilamino) metil) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (4- (1-raetil-l- (N-metilamino) etil) -fenil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7 (4- (1- (dimetilamino) -1-metiletil) fenil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (N-acetil-5-indo-linil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-cloro-3 piridil)pirido[2, 3-d] pirimidina; -amino-5- ( 1- (2-bromofenil ) etil) -7- ( 6-dietilamino-3-piridil) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4 amino-5- (1- ( 2-bromofenil ) etil ) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromo-fenil) etil) -7 (4- (N-metil-N-formil) amino) -fenil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5-ciclohexil-7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina: 4-amino-5- ( (2-bromofenil) -metil) -7- ( 6-morfolinil 3-piridil ) pirido [ 2 , 3-d] -pirimidina ; 4-amino-5- ( 4-tetrahidro piranil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil ) -pirido [2 , 3-d] pirimidina ; 4 -amino-5-ciclohexil-7- ( 6-dimeti1-amino-3-piridil ) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 1-etil-propil ) -7- ( 6-dimetilamino-3 piridil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclopentil-7- ( 6 morfolinil-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5 ciclohexil-7- (2-cloro-3-piridil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 amino-5- (3, 5-dimetilciclohexil) -7- ( 6-dimetilamino-3-piridil )¦ pirido [2, 3-d] pirmidina; 4-amino-5- ( (N- (benciloxicarbonil ) -4 piperidinil) metil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-bromo-3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclo-hexil-7- ( 3-ciano fenil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 1- (2-bromofenil ) etil) -7- ( 6-dimetilamino-3-piridazinil) pirido- [2, 3d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 6-imidazolil-3-pirida-zinil)pirido[2,3-d] pirimidina : 4-amino-5- ( 3-bromo-fenil ) -7- ( 6- (azacicloheptanil) -3-piridazini] ) pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- (6- (N-metil-N- ( 1-metiletil ) amino) -3-piridazinil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (1- (2-bromo-fenil) etil) -7- (6-morfolinil-3-pirida-zinil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- ( 4-acetilpiperazi-nil ) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (4-acetil-l, -diazacicloheptanil ) -3-piridil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (4-metil-l, 4-diaza-cicloheptanil ) -3-piridil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (N-metil-N- (2- (2-piridil) etil ) amino) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6-2- (N- (?' , N-dimetilaminoetil) -N-metil-amino) -3-piridil) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclo-hexil-7- (6-azetidinil-3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (3- (N-metilacetamido) pirrolidinil) -piridil) pirido [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (3- (formamido) pirro-lidinil)piridil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclo-hexil-7- (4-oxo-l-fenil-l, 3, 8-triazaespiro- [4, 5 [decan-8-il) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (2-metoxi-metil ) pirrolidin-l-il) piridil ) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (N-metoxietil-N-propilamino) piridil ) -pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-cciclohexil-7- (N-metil-N- ( 2 , 2-dimetoxietil) amino) -pirido [2 , 3-d] pirimidina 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (4- (amino-carboni1 ) ) piperidinil ) piridil) -pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- (6- (4- (amino-carbonil) ) piperidinil ) -piridil) pirodo [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5-ciclohexil-7- (N-metil-N- ( 3-dietilamino) propil) amino) -propil) aminopirid-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (N-metil-N- ( -piridil ) etilamino) -pirid-3-il) -pirido [2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- (N-metil-N- (3-piridil-metilamino) pirid-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (1- (2-bromofenil) etil) -7- (1-metil-S-indolil) pirido- [2, 3-d] -pirimidina: 4-amino-5- (1- (2-bromofenil] ) etil) -7- (1-meitil-2, 3-dioxo-S-indoili) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (3-fluoro-4- ( 1-morfolinil ) fenil) pirido- [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (4-hhidroxi-3-nitro-fenil) pirido [2, 3-d] irimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil) -7- ( 6- (4 , -etilendioxipiperidinil) -3-piridil) -pirido- [2, 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (4-oxor piperidinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina ; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (4-formilpiperazinil) -3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6- ( 4-metil-piperazinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4 -amino-5- (3-bromofenil) -7- (6-tiomorfolinil-3-piridil-)pirido[2, 3-d] -pirmidina; 4-amino-5- (3-bromofenil] ) -7- ( 6- (4 , -dioxotio-morfolinil) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; -amino-5- (2-bromofenil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- ( 3-bromo-4-metoxifenil ) -7- ( 6-morfo-linil-3-piridil)pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 4 -bromo-fenil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-clorfenil) -7- ( 6-morfolinil-3-piridil) pirido [2, 3-d]pirimi-dina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 5-cloro-6-morfo-linil-3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromo-fenil) -7- (6- (N-oxidomorfolinil-3-piridil ) pirido [ 2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6- (N- ( 2-hidroxietoxi-etil ) amino) -3-piridil) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (N- (2-hidroxietoxietil) -N-formilamino) -3-piridil) pirido- [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (N- (2-hidroxietoxietil) -3-piridil-N-óxido) pirido [ 2 , 3-d] -pirimidina; 4-amino-5- ( 3-bromofenil-7- (6- (3-hidroxi)morfo-linil) -3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; sal de disodio de 1- (5- (4-amino-5- (3-bromofenil] ) pirido [2, 3-d] pirimidin-7-il ) -2-piridil) -piperidin-4-fosfato; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- ( 4-metilenil-piperidinil) -3-piridil ) pirido [2, 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil] (hidroximetil) iperidinil) -3-piridil ) pirido [2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5- (3-bromofenil) -7- (6- (4, 4-etilendioxi-piperidinil) -3-piridil) pirido [ 2 , 3-d] pirimidina; 4-amino-5-ciclohexil-7- ( 6- ( 4-oxo-piperidinil ) -3-piridil ) pirido [2,3-d] pirimidina; 4-amino-S-ciclohexil-7- (6- (4-metilenilpiperi-dinil) -3-piridil) pirido[2, 3-d] pirimidina; 4-N- ( iminometil ) -amino-5-ciclohexil-7-6-dimetilamino-3-piridil ) pirido [2, 3-d] -pirimidina; y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .
Los compuestos de la fórmula (II) se pueden sintetizar utilizando métodos conocidos en la técnica y fácilmente disponibles para la persona experta. Por ejemplo, la preparación de compuestos de 4-aminopirido [2 , 3-djpirimidina 5, 7-disustituido y 5, 6, 7-trisustituido es descrito en Int. Pat. App. Pub. No. WO98/46605 y Patente Norteamericana No. 6,0303,969, los contenido de cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Victory, P. y colaboradores, Tetrahedron (1995), 51, 10253-10258, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia, describe la síntesis de compuestos 4-amino-5, 7-difenilpirido [2 , 3-d] pirimidina .
Otros inhibidores de adenosina quinasa disponibles a la invención son descritos en las Patentes Norteamericanas Nos: 5,506,347; 5,763,696; 5,763,597; 5,674,998; 5,721,356; 5,726,302; 5,795,977; y 5,864,033, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
La S-adenosilhomocisteína hidrolasa (SAHH) es una enzima celular ubicua que controla los niveles intracelulares de S-adenosilhomocisteína (SAH) . La SAHH también se conoce como AA987153, Adenosilhomocisteinasa, AdoHciasa, AL024110, CuBP, CUBP, proteína de enlace a cobre del Hígado, MGC102079, MGC118063, MGC19228, S-adenosil-L-homocisteína hidrolasa y SAH hidrolasa en la técnica. La SÁHH cataliza la hidrólisis de S-adenosilhomocisteina a adenosina y homocisteina . La SAH es un potente inhibidor de producto de algunas metil-transferasas dependientes de S-adenosilmetionina y la inhibición de SAHH da por resultado la inhibición de las reacciones de metilación dependientes de S-adenosil-L-metionina (SAM) .
Los inhibidores de S-adenosilhomocisteina Hidrolasa. incluyen, pero no están limitados a adenosina y análogos y derivados de los mismos. Los análogos y derivados de adenosina ejemplares incluyen, pero no están limitados a, 9 (S) - (2, 3-dihidroxipropil) adenina [(S)-DHPA]; D-eritadina; ácido (R, S) -3-adenina-9-il-2-hidroxipropanócico [ (R, S ) -AHPA] ; dialdehido de adenosina (Ado) ; 3-deazaadenosina (c3-Ado) ; aristeromicina (Ari) y análogos; neplanocina A (NPA o NpcA) ; dihidroxiciclopenteniladenina (DHCeA) / dihidroxiciclo-pentenil-3-deazaadenina (c3-DHCeA) ; dihidroxiciclopentanil-adenina (DHCaA); dihidroxiciclopentanil-3-deazaadenina (c3-DHCaA) ; 3-deazaneplanocina A (c3-NpcA) ; 3-deazaaristeromicina (c3Ari) ; carbociclico-3-deazaadenosina (C-c3Ado) ; 6' -Cmetilneplanocina A; 2 ' -deoxiadenosina ; tubercidina; ribavirina; piraazofurina; 2 ' -deoxi-2' -cloroadenosina; isopenteniladenosina; metiltioadenosina (MTA) ; 9-ß-arabinofuranosiladenina (Ara-A, vidarabina) ; 2 ' -Deoxiadeno-sina; N-metilaristeromicina, 8-azaaristeromicina y 3- deazaaristeromicina y sus derivados de dialdehido y diol; (±) -5Noraristeromicina y su análogo 2 , 6-diamino . Los análogos y derivados de aristeromicina incluyen, pero no están limitados a, 2'-deoxi-, 3'-deoxi-, 3' -amino-3' -deoxi-, 3'-amino-3' -desoxiarabinofuranosilo, 6'-hidroxi, 6' -mercapto, 8' -bromo, 8-hidroxiaristeromicina, fosfato de aristeromician-3' -cíclico y fosfato de aristeromicina-6' -cíclico .
Ciertos análogos estructurales de S-adenosilhomocisteína (SAH) con modificación en el aminoácido, base o porción de azúcar de la molécula también se pueden utilizar como inhibidores de SAH hidrolasa. Los análogos de SAH ejemplares incluyen, pero no están limitados a, 2-fluoro-S-adenosilhomocisteína (2-FSAH) , sulfóxido de S-Adenosil-L-homocisteína, S-Adenosil-Lhomocisteína sulfona, S-aristero-micinil-L-homocisteína, 5' -S- (3-carboxil-4-nitrofenil ) tio-adenosina y 5' -S (metil) -5' -S- (butil) tioadenosina .
Otros inhibidores de SAHH incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en Yuan y colaboradores, Exp. Opin. Ther. Patents, 1999, 9:1197-1206; Wolfe y Borchardt, Journal of Medicinal Chemistry, 1991, 34:1521-1530); Votruba y Holy, Coll Czech. Chem. Commun. , 1980,. 45:3039; Schanche y colaboradores, Molecular Plarmacology, 1984, 26:553-558; De Clercq E . , Nucleosides Nucleotides, 1998, 17 (1-3) : 625-3 ; y Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/410,879 el contenido de todas de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
La proteina quinasa activada con AMP se puede activar alostéricamente por incrementos en la concentración de AMP o por un compuesto que es análogo a AMP. Por ejemplo el análogo AMP puede ser 5' -tiomonofosf to de adenosina, 5'-fosforamidato de adenosina, 5' -monofosfato de formicina A, o ribonucleósido de 5' -monofosfato-5-aminoimidazol-4-carboxamida (ZMP) .
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, el activador de proteina quinasa activada con AMP es de la fórmula (III) : en donde: R17 es H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, OR22, SR22, N (R22) 2, (CH2) mR23 o R17 y R18 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R18 y R19 son cada uno independientemente H, OR22, SR22, N(R22)2, o R18 y R19 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R20 y R21 son cada uno independientemente halógeno, CN, N2, OR22, SR22, N(R22)2, C(0)R24 C(0)OR24 C(0)N(R24)2, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R22 es independientemente para cada ocurrencia H, C(0)R24 C(0)OR24 C(0)N(R24)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de 2- e opcionalmente sustituido, alquinilo de 2- 5 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R23 es R22, OR22, SR22, N(R22)2, N2, CN, halógeno, o independientemente para cada ocurrencia H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; X es 0, S, NH o CH2; Y y Z son cada uno independientemente N o CR25; R25 es independientemente para cada ocurrencia H, halógeno, CN, C(0)R24, C(0)OR24, C(0)N(R24)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Z1 es independientemente para cada ocurrencia O o S; Z2 es independientemente para cada ocurrencia H, OM, SM, OR22, SR22, N(R22)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; M es un catión de metal alcalino; m es 1, 2, 3 o 4; n es O, 1 o 2; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo .
En algunas modalidades, M es Na+.
En algunas modalidades, R17 es alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, OR22, N(R22)2, o (CH2)mR23. De preferencia alquilo de Ci-C6 es metilo. Cuando R17 es N(R22)2 por lo menos uno de R22 es H, de preferencia ambos R22 son H. Cuando R17 es OR22, R22 puede ser H o alquilo de C1-C6, de preferencia R22 es H.
Cuando R17 es (CH2)mR23, m es 1 o 2, de preferencia m es 1. En algunas modalidades, R23 es OR22 o N(R22)2. Cuando R23 es N(R22)2, por lo menos uno de R22 es H, de preferencia ambos R22 son H. Cuando R23 es OR33, R33 puede ser H o alquilo de Ci~ C6, de preferencia R5 es H. En algunas modalidades, R17 es CH2OH.
En algunas modalidades, R17 y R18, en los compuestos de la fórmula (III), junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros, en donde la cadena principal del heterociclo comprende en donde Z3 es independientemente para cada ocurrencia O o S y Z4 es H, OM, SM, OR22, SR22, N(R22)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido. De preferencia Z3 es 0 y Z4 es O o SM.
En algunas otras modalidades, X se selecciona del grupo que consiste de 0, NH y CH2. De preferencia X es 0.
En todavía algunas otras modalidades, R18 y R19 son ambos OR22. En algunas modalidades preferidas, R18 y R19 son ambos OH.
En algunas modalidades, R20 se selecciona del grupo que consiste de halógeno, CN, OR22, alquilo de Ci-C6 opcionalmente, N(R2)2, C(0)R24, C(0)OR24 y C (O) N (R24) 2, en donde R22 y R24 son como se definen en lo anterior. De preferencia R20 es NHR22 y más de preferencia 20 es NH2.
En algunas modalidades, R21 se selecciona del grupo que consiste de halógeno, CN, OR22, alquilo de Ci-C6, N(R22)2, C(0)R24, C(0)OR24 y C(0)N(R24)2, en donde R22 y R24 son como se definen en lo anterior. De preferencia R21 es C(0)NHR24 y más de preferencia R21 es C(0)NH2.
En algunas modalidades, R20 no es NH2 y R21 no es C (O) NH2.
En algunas modalidades, por lo menos uno de Y o Z es CR25, de preferencia Y es CR25 y más de preferencia Y es CH2. En algunas modalidades, Y es CR25 y Z es N.
En algunas otras modalidades, ambos de Y y Z son CR25. De preferencia Y es CH2 y Z es CR25, en donde R25 se selecciona del grupo que consiste de CN, halógeno, arilo opcionalmente sustituido, hetereoarilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo opcionalmente sustituido. De preferencia el grupo arilo es un grupo fenilo, que es opcionalmente sustituido .
En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (III) tiene la configuración estereoquímica mostrada en la fórmula ( Illa) : Fórmula (Illa) En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula (III) tiene la configuración estereoquímica mostrada en la fórmula (Illb) : Fórmula <IIIb).
En algunas modalidades, el activador de quinasa activado con A P es ribonucleósido de 5-aminoimidazol-4-carboxamida (también referido como AICAR en la presente) .
Los compuestos de la fórmula (III) se pueden preparar, por ejemplo al utilizar métodos descritos en las Patentes Norteamericanas Nos. 3,450,693 y 5,658,889, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Mioyoshi y colaboradores, Chem. Pharm. Bull. (1976), 24:2089-2093; Chambers y colaboradores, Nucleosides & Nucleotides (1988), 7:339-346; y Srivastava y colaboradores, J. Org. Chem. (1975) 40:2920-2924, describen derivados y análogos de ribonucleósido de 5-aminoimidazol-4-carboxamida.
Otros activadores de AMPK disponibles a la invención son descritos en la Patente Norteamericana No. 7,119,205 y las Solicitudes de Patente Norteamericanas Nos. 2006/0287356; 2007/0015665; and 2007/024420, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
Células pancreáticas Como se utiliza en la presente el término "células pancreáticas" se refiere a células, o una población, o preparación de células de tejidos pancreáticos, que pueden incluir tejidos tanto endocrinos como exocrinos, asi como lineas de células derivadas de los mismos. El páncreas endocrino está compuesto de células productoras de hormonas arregladas en agrupaciones conocidas como islotes de Langerhans. De los cuatro principales tipos de células que forman los islotes ("células de islote") , las células alfa producen glucagones, las células beta producen insulina, las células delta producen somatostatina y las células PP producen polipéptido pancreático (PP) . El páncreas exocrino incluye acinos pancreáticos y el ducto pancreático. Las células acinares pancreáticas sintetizan una gama de enzimas digestivas. Las células ductales secretan iones de bicarbonato y agua en respuesta a la hormona secretada del tracto gastrointestinal. Por lo tanto, el término "células pancreáticas" incluye células encontradas en un páncreas, que incluyen células alfa, células beta, células delta, células PP, células acinares, células ductales, células mesenquimales , fibroblastos y otras células presentes en el tejido conectivo pancreático, u otras células (por ejemplo, células endoteliales, células neuronales y células progenitoras que no son diferenciadas o completamente no diferenciadas o todavía que son diferenciadas) , o una mezcla o combinación de las mismas.
Los marcadores característicos de las células pancreáticas incluyen la expresión de proteínas de superficie celular o los genes codificantes, la expresión de proteínas intracelulares o los genes codificantes, características morfológicas de célula y la producción de productos secretorios tal como glucagón, insulina y somatostatina. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los métodos inmunofluorescentes, inmunoquímicos , reacción de cadena de polimerasa, hibridación in situ, análisis de manchado de Northern, químicos o radioquímicos o biológicos conocidos pueden fácilmente comprobar la presencia o ausencia de las características específicas de la célula de islote.
Si es deseado, el (los) tipo(s) de células en una población de células pancreáticas se puede determinar utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el uso de cepas específicas de tipo de célula, tal como, por ejemplo ditizona, que es específica para células de islote. Alternativamente, un experto puede realizar el manchado de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos dirigidos a varias proteínas específicas de la célula pancreática, tal como, por ejemplo, insulina, somatostatina, glucagón, citoqueratinas de polipéptido pancreático, amilasa y lipasa. Además, un tipo de célula se puede determinar por su morfología utilizando técnicas tal como, por ejemplo, microscopía de luz o microscopía electrónica.
En algunas modalidades, las células pancreáticas son de tejidos endocrinos pancreáticos. En algunas modalidades, las células pancreáticas están dentro del islote de Langerhans. El término "islote" o "islotes" como se utiliza en la presente incluyen los tipos de célula constituyente dentro del islote de Langerhans, que incluyen células alfa, beta, delta y épsilon, islotes intactos, fragmentos de islote o combinaciones de los mismos.
Como se utiliza en la presente el término "células pancreáticas" incluye células pancreáticas primarias, células similares a la célula pancreática derivadas de células desdiferenciadas, por ejemplo de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) , o células similares a la célula pancreática que se han reprogramado directamente de una célula de origen endodérmico (por ejemplo una célula del hígado o una célula pancreática exocrina) . En una modalidad, la célula pancreática no es una línea celular inmortalizada (por ejemplo proliferar indefinidamente en cultivo) . En una modalidad, la célula pancreática no es una célula transformada, por ejemplo, una célula que exhibe una propiedad de transformación, tal como crecimiento de agar suave, o ausencia de una inhibición de contacto.
La población de célula pancreática puede estar comprendida de solamente un tipo de célula pancreática o una mezcla de diferentes tipos de célula pancreática. En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención descritos en la presente, la población de célula pancreática está comprendida de un tipo de célula pancreática seleccionado del grupo que consiste de células alfa, células beta, células delta, células épsilon y combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, la población de célula pancreática es la población de células beta. En algunas modalidades, las poblaciones de célula pancreática también incluyen tipos de célula no pancreática.
Va a ser entendido que cuando una población de célula pancreática comprende una mezcla de diferentes tipos de célula pancreática, los diferentes tipos de células pueden estar presentes en cualquier relación entre si. Sin desear que sea limitado por alguna teoría, cada tipo de célula en mezcla puede estar presente entre 1-99% de las células totales. En algunas modalidades, la población de célula pancreática comprende entre 1-99% de células beta a las células totales en la población. En algunas modalidades, la población de célula pancreática comprende entre 1-50% de células beta a las células totales en la población.
En una modalidad, las células pancreáticas son células pancreáticas primarias. En algunas modalidades, las células pancreáticas son células ß pancreáticas primarias. En algunas modalidades, las células pancreáticas no son células pancreáticas transformadas. En algunas modalidades, las células pancreáticas no son células ß pancreáticas transformadas. En algunas modalidades, las células pancreáticas no son células pancreáticas inmortalizadas. En algunas modalidades, las células pancreáticas no son células ß pancreáticas inmortalizadas.
En algunas modalidades, las células pancreáticas son células pancreáticas re-diferenciadas. Como se utiliza en la presente el término "célula pancreática re-diferenciada" se refiere a una célula pancreática que es diferenciada de una célula pancreática re-diferenciada. En algunas modalidades, las células pancreáticas son células ß re-diferenciadas. Como se utiliza en la presente el término "célula ß re-diferenciada" se refiere a una célula ß que es diferenciada de una célula ß diferenciada. Una célula ß re-diferenciada, puede secretar insulina de una manera regulada con glucosa, tiene una morfología de tipo célula ß y es capaz de formar uniones adherentes. Ver por ejemplo, Volk y colaboradores, Arch Pathol. 88(4): 413-22 (1969).
En algunas modalidades, las células pancreáticas son derivadas de células somáticas des-diferenciadas (por ejemplo, células reprogramadas) . Por ejemplo, una célula somática des-diferenciada a una célula madre pluripotente, o a una célula pancreática (por ejemplo mediante reprogramación directa de una célula de origen endodérmico) . Sin desear que sea limitado con alguna teoría, una célula des-diferenciada tiene una morfología que se parece un tipo de célula más primitivo del cual se derivó, por ejemplo, morfología mesenquimal .
Las células pancreáticas también se puede derivar (es decir diferenciar) de células madre embriónicas de un sujeto o de un donador (ESCs) . En algunas modalidades, las células madre pluripotentes inducidas se puede generar de un sujeto o un donador y luego diferenciadas en células pancreáticas o células similares a la célula pancreática. La inducción de diferenciación de la célula ß en células humanas es descrita en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,84,585; 6,911,324; y 7,276,352 y la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2006/02,922,127, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Brolen, G.K. y colaboradores, Diabetes (2005), 54:2867-2874 y Segev, H., Stem Cells (2004), 22:265-274, los contenidos de las cuales son incorporadas .en la presente por referencia, describen métodos para la diferenciación de células madre embriónicas humanas en células similares a la célula ß.
En algunas modalidades, las células pancreáticas están en un estado estabilizado, por ejemplo, las células se tomaron de un sujeto y se trataron de tal manera que les permitieron ser almacenadas por algún periodo de tiempo. Por ejemplo, las células se pueden congelar, por ejemplo, utilizando métodos conocidos en la técnica para congelar células primarias, tal que las células son viables cuando se descongelan. Por ejemplo, los métodos conocidos en la técnica para congelar y descongelas embriones para generar mamíferos vivos se pueden adaptar para el uso en los presentes métodos. Tales métodos pueden incluir el uso de nitrógeno líquido, por ejemplo, con uno o más crioprotectores, por ejemplo, agentes que previenen el daño de congelación-descongelación de la célula.
La población de células pancreáticas obtenida de un sujeto o donador pueden ser sustancialmente puras, por ejemplo,' no más de aproximadamente 40% de células no diferenciadas, es decir, por lo menos aproximadamente 60% de células pancreáticas completamente diferenciadas. En algunas modalidades, la población es por lo menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o más de células pancreáticas completamente diferenciadas. La pureza de la población se puede determinar, y manipular, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar métodos que utilizan distribución de célula activada con fluorescencia. Por ejemplo, las células epiteliales ductales se puede detectar y contar, por ejemplo, al marcar las células con una lectina especifica de ducto marcada con fluorescencia (por ejemplo, aglutinina Dolichos biflorus (DBA) ) , como son descritas en la presente y removidas de la población, por ejemplo, mediante métodos de distribución de célula activada con fluorescencia (por ejemplo, distribución de flujo) o inmunosorción a un sustrato, tal como una columna o cuentas, enlazadas a DBA. Otras células no de ß se puede remover utilizando métodos similares, que incluyen distribución de flujo basada en la autofluorescencia .
La población de células pancreáticas obtenidas de un sujeto puede ser homogénea o heterogénea. En algunas modalidades, las células pancreáticas obtenidas de un sujeto son de solo tipo de célula, por ejemplo, célula alfa, célula beta, célula delta o célula épsilon. En otras modalidades, células pancreáticas obtenidas de un sujeto comprende una mezcla de diferentes tipos de células pancreáticas.
En algunas modalidades, las células pancreáticas son de un mamífero, por ejemplo, un ratón, una rata o un humano. En algunas modalidades, las células pancreáticas son de un sujeto, donde el sujeto se selecciona basado en la necesidad del sujeto de células ß adicionales.
Contacto de las células pancreáticas con los compuestos La población de célula pancreática se puede poner en contacto con los compuestos descritos en la presente en un cultivo celular por ejemplo, in vitro o ex vivo, o el compuesto se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, in vivo. En algunas modalidades de la invención, un compuesto descrito en la presente se puede administrar a un sujeto para tratar y/o prevenir un desorden que es causado por una reducción en la función y/o número de células ß, por ejemplo, hiperglucemia o diabetes.
El término "ex vivo" se refiere a células que se remueven de un organismo vivo y cultivadas fuera del organismo (por ejemplo, en un tubo de ensayo) .
El término "poner en contacto" o "contacto" como se utiliza en la presente en conexión con poner en contacto una población de células pancreáticas incluye someter las células pancreáticas a un medio de cultivo apropiado que comprende el compuesto o agente indicado. Donde la población de célula pancreática es in vivo, "poner en contacto" o "contacto" incluye administrar el compuesto o agente en una composición farmacéutica a un sujeto por la vía de una ruta de administración apropiada tal que el compuesto o agente se pone en contacto con la población de célula pancreática in vi o.
Para los métodos in vivo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto descrito en la presente se puede administrar a un sujeto. Los métodos para administrar los compuestos a un sujeto son conocidos en la técnica y fácilmente disponibles para uno de habilidad en la técnica .
La promoción de la replicación de células ß en un sujeto pude conducir al tratamiento, prevención o mejoramiento de un número de desórdenes que son causados por una reducción en la función y/o número de las células ß, por ejemplo, hiperglucemia o diabetes. Sin desear que sea limitado por alguna teoría, incrementar la replicación de células ß en un sujeto conduce a un incremento en la densidad y/o número de célulass ß, por ejemplo, más de célula ß.
Como se utiliza en la presente, un incremento en la masa de célula ß se refiere a un incremento en número de células ß, por ejemplo un incremento en número de células ß (por ejemplo, células pancreáticas ß) en un sujeto que es tratado con un compuesto descrito en la presente como es comparado al número de células ß en el sujeto antes del inicio del tratamiento. El incremento en la masa de célula ß puede ser por lo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más en el sujeto tratado comparado con la masa de célula ß en el sujeto antes del inicio del tratamiento.
Las células pancreáticas adecuadas para el uso en métodos ex vivo se pueden preparar de un páncreas de acuerdo a los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ej emplo , el páncreas cosechado se puede incubar con una solución de enzima a o aproximadamente 37 °C para digerir el tejido pancreático en agrupaciones pequeñas de tejido y células. Después del tiempo de digestión apropiado el tejido digerido se puede filtrar para remover el tejido grande no digerido. El tejido digerido luego se puede aplicar a un gradiente de densidad tal como Ficoll, polisacarosa, dextrano y los similares. El gradientes de densidad puede ser ya sea continúo o descontinúo. El gradiente de densidad cargado de tejido luego se puede centrifugar y las células contenidas dentro de la digestión migran dentro del gradiente de acuerdo con su densidad. Las células se pueden recuperar del gradiente, lavar y colocar en cultivo. Las células pancreáticas preparadas de esta manera pueden contener múltiples tipos de células.
Para los métodos ex vivo, las células pancreáticas pueden incluir células pancreáticas autólogas, es decir, una célula o células tomadas de un sujeto quien está en necesidad de células ß adicionales (es decir, el donador y receptor son el mismo individuo) . Las células pancreáticas autólogas tienen la ventaja de evitar cualquier rechazo inmunológicamente basado de las células. Alternativamente, las células pueden ser heterólogas, por ejemplo, tomadas de un donador. El segundo sujeto puede ser de la misma o diferentes especie. Típicamente, cuando las células llegan de un donador, serán de un donador quien es de manera suficiente inmunológicamente compatible con el receptor, es decir, no será sometido al rechazo de transplante, para disminuir o remover la necesidad de inmunosupresión . En algunas modalidades, las células se toman de una fuente xenogeneica, es decir, un mamífero no humano que ha sido genéticamente diseñado para ser de manera suficiente inmunológicamente compatible con el receptor, o la especie de receptor. Los métodos para determinar la compatibilidad inmunológica son conocidos en la técnica, e incluyen tipo de tejido para estimar la compatibilidad del receptor donador para las determinantes de HLA y ABO. Ver, por ejemplo, Transplantation Immunology, Bach and Auchincloss, Eds . (Wiley, John & Sons, Incorporated 1994). En algunas modalidades, las células pancreáticas son células ß recombinantes, por ejemplo aquellas descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,114,599; 6,242,254; y 6,448,045, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, el sujeto sufre de diabetes Tipo I, Tipo 1.5 o Tipo 2 o tiene una condición pre-diabética .
Sin desear que sea limitado por alguna teoría cualquier medio de cultivo celular se puede utilizar para los métodos ex vivo de la invención. En algunas modalidades, las células ß son cultivadas en la presencia de una proteina de matriz celular, la proteína que es capaz de promover la formación de hemidesmosoma . Por ejemplo, las proteínas de matriz celular producidas por las líneas celulares de carcinoma de vejiga de rata 804G o NBT-II son conocidas en la técnica para promover la formación de hemidesmosoma. Por consiguiente, la Patente Norteamericana No. 5,510,263, el contenido de la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad, divulga el crecimiento aumentado de las células de islote pancreáticas cultivadas en las matrices 804G y NBT-II.
En algunas modalidades, las células son cultivadas en medios acondicionados de línea celular de carcinoma de vejiga de rata 804G o NBT-II. Las células también se pueden cultivar en medios a los cuales una o más de las proteínas de matriz de los medios acondicionados se han adicionado. Tales proteínas de matriz se pueden purificar de fuentes naturales o producidas utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica.
En algunas otras modalidades, las células se cultivan en medios de cultivo en contacto con laminina 5. De preferencia, la laminina 5 se selecciona del grupo que consiste de Kalinina y epiligrina. La laminina 5 se puede obtener de un número .de fuentes que incluyen, pero no limitados a, de la matriz extracelular obtenida de células MCF 10A.
Después del contacto ex vivo con un compuesto descrito en la presente, cuando las células pancreáticas, por ejemplo, células ß han alcanzado un número o densidad de población deseado, por ejemplo, aproximadamente lxlO6, 2xl06, 3xl06, 4xl06, 5xl06, 6xl06, 7xl06, 8xl06, 9xl06, lxlO7, 2xl07, o más células, las células se pueden transplantar en un sujeto quien está en necesidad de células ß adicionales. Las células se pueden transplantar en un sujeto de quien las células fueron originalmente obtenidas o en diferente sujeto. Los métodos para remover y transplantar quirúrgicamente células pancreáticas adecuadas, por ejemplo, células beta, de un mamífero son conocidas en la técnica; ver, por ejemplo, Shapiro y colaboradores, N. Engl. J. Med. 343(4) :230-8 (2000); Ryan y colaboradores, Diabetes 50(4): 710-9 (2001).
Cuando las células pancreáticas se ponen en contacto con un compuesto, el compuesto puede tener un efecto directo o indirecto en las células beta. Como se utiliza en la presente un "efecto directo" significa que el compuesto está interactuando directamente con las células beta, por ejemplo, enlazar a un receptor de superficie celular en la célula beta, tomada en la células beta. Como se utiliza en la presente un "efecto indirecto" significa que el compuesto no interactúa directamente con la célula beta. Por ejemplo, el compuesto puede interactuar con una célula no beta e indirectamente influenciar la velocidad de replicación o crecimiento de célula beta. Sin desear que sea limitado por alguna teoría, el compuesto puede influenciar indirectamente una célula beta al inducir la expresión y/o secreción de una molécula de una célula no beta y esta molécula luego influencia directamente o indirectamente la velocidad de replicación o crecimiento de célula beta.
Métodos para monitorear el incremento en la replicación de célula ß Para los métodos ex vivo de la invención, la replicación de la célula ß incrementada se puede monitorear por cualquier método conocido en la técnica para medir la replicación celular. Por ejemplo, la replicación de la célula ß se puede determinar al medir la expresión de por lo menos un marcador de replicación celular, por ejemplo, Ki-67 o PH3. Un ejemplo no limitante es el ensayo inmunofluourescente cuantitativo que mide el índice mitótico al monitorear la fosforilación de histona H3 en serina 10 (H3-P) , un evento específico de mitosis (Ajiro y colaboradores, J Biol. Chem. 271:13197-201. 1996; Goto y colaboradores, J Biol Chem. 274:25543-9, 1999). El incremento en la replicación de la célula ß también se puede basar en un incremento en el número total de células ß en el control tratado contra el no tratado. En algunos casos, la replicación de la célula ß se puede basar en la relación de la célula ß a células totales para los controles tratados y no tratados. La replicación de célula B se puede medir al monitorear el número de células que co-expresan Ki-67 y/o PH3 y PDX-1.
Para los métodos in vivo de la invención, la replicación de célula ß incrementada se puede evaluar indirectamente al medir los niveles de insulina en la sangre. Sin desear que sea limitado por alguna teoría, el nivel de insulina en la sangre es una medición indirecta del número de células ß, por ejemplo, masa de célula ß en el sujeto. Por lo tanto, los niveles de insulina en la sangre antes y después del inicio del tratamiento pueden proporcionar indirectamente una medición relativa de número de células ß en el sujeto antes y después del inicio del tratamiento, masa de célula ß en un sujeto también se puede determinar al medir la concentración de glucosa en la sangre en ayunas en el sujeto. Una relación curvilínea entre la masa de célula ß las concentraciones de glucosa en la sangre en ayunas en humanos se divulga en Ritzel, y colaboradores, Diabetes Care (2006) , 29:717-718, el contenido de la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Alternativamente, la captación in vivo del radioligando [11C]DTBZ (dihidrotetra-benazina) , que específicamente enlaza a VMAT2, por células ß se puede medir por la exploración de tomografía de emisión de positrón (P.E.T.). Este radioligando se ha utilizado previamente en sujetos humanos en ensayo clínicos que evalúan la exploración P.E.T del cerebro en pacientes con enfermedad bipolar y esquizofrenia comparada con los sujetos de control sanos. La Publicación de Patente Norteamericana No. 2009/0202428 describe el uso de DTBZ para obtener imágenes de la masa de célula ß del páncreas endocrino en la diabetes tipo 1, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
Los métodos para estimar la masa de célula ß in vivo también son descritos en, por ejemplo, Antkowiak, P.F., y colaboradores, Noninvasive assessment of pancreatic-beta-cell function in vivo with manganese-enhanced magnetic resonance imaging. Am J Physiol Endocrinol Metab (2009), 296:E573-E5788; Bergman, R. N. y colaboradores, Quantitative estimation of insulin sensitivity. Am J Physiol (1979) , 236 : E667-E67 ; Brunzell J.D., y colaboradores, Relationships between fasting plasma glucose levéis and insulin secretion during intravenous glucose tolerance tests. J. Clin. Endocrinol. Metab (1976), 42:222 -229; DeFronzo, R. A., y colaboradores, Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol (1979), 237: E214-E223; Evgenov N.V. y colaboradores, In vivo imaging of islet transplantation. Nat Med (2006), 12:144-148; Kjems, L. L., y colaboradores, Decrease in beta-cell mass leads to impaired pulsatile insulin secretion, reduced postprandial hepatic insulin clearance, and relative hyperglucagónemia in the minipig. Diabetes (2001), 50:2001-2012; Larsen, M. O. y colaboradores, Loss of beta-cell mass leads to a reduction of pulse mass with normal periodicity, regularity and entrainment of pulsatile insulin secretion in Gottingen minipigs . Diabetologia (2003), 46:195-202; Larsen, M. O., y colaboradores, easurements of insulin secretory capacity and glucose tolerance to predict pancreatic beta-cell mass in vivo in the nicotinamide/streptozotocin Gottingen minipig, a model of modérate insulin deficiency and diabetes. Diabetes (2003), 52:118-123; Larsen, M.O. y colaboradores, Measuress of Insulin Responses as Predictive Markers of Pancreatic Beta-Cell Mass in Normal and Bet-Cell Reduced Lean and Obese Gottingen minipigs in vivo. Am J Physiol Endocrinol Metab (2005), 2006, 290 : E670-E677 ; McCulloch, D. K. y colaboradores, Correlations of in vivo beta-cell function tests with beta-cell mass and pancreatic insulin content in streptozocin-administered baboons. Diabetes (1991), 40:673-679; Meier, J.J. y colaboradores, Functional Assessment of Pancreatic {beta}-Cell Area in Humans. Diabetes, (2009), 58:1595-1603; Souza F y colaboradores, Longitudinal noninvasive PET-based beta cell mass estimates in a spontaneous diabetes rat model. J. Clin. Invest. (2006), 116:1506-1513; Tobin B.W. y colaboradores,. Insulin secretory function in relation to transplanted islet mass in STZ-induced diabetic rats. Diabetes (1993), 42:98-105; y ard, W. K. y colaboradores, Diminished B cell secretory capacity in patients with noninsulin dependent diabetes mellitus. J Clin Invest (1984), 74:1318-1328, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
Tratamiento de Diabetes Los métodos descritos en la presente son útiles en tratar desórdenes asociados con una pérdida de células ß, por ejemplo, hiperglucemia o diabetes. Los métodos pueden incluir la administración de un inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH y/o activador de AMPK al sujeto. Los compuestos se pueden administrar sistémicamente o localmente, por ejemplo, mediante inyección o implante de un dispositivo que proporciona una dosis permanente del compuesto a los tejidos pancreáticos, por ejemplo, a los islotes. Tales dispositivos son conocidos en la técnica, e incluyen micro-bombas y matrices de liberación controlada, por ejemplo, las matrices que se rompen a través del tiempo, liberando el modulador en el tejido.
Alternativamente, los métodos incluyen terapias basadas en células. Por ejemplo, los métodos pueden incluir implantar en un sujeto una población de células ß que se han expandido o incrementado por un método descrito en la presente. En algunas modalidades, las células son autólogas, por ejemplo, llegan a ser del mismo sujeto en el cual serán transplantadas . Los métodos quirúrgicos para implantar tales células son conocidos en la técnica e incluyen métodos endoscópicos mínimamente invasivos. Generalmente, para humanos, es deseable implantar por lo menos aproximadamente una masa de islote (±SD) de 10,000 equivalentes de islote por kilogramo de peso corporal, ver, por ejemplo, Shapiro y colaboradores, N. Engl. J. Med. 343(4) :230-8 (2000).
En un aspecto, la invención proporciona un método para incrementar la masa de célula ß o producción de insulina en un sujeto, el método que comprende: (a) poner en contacto una célula ß con un inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH o activador de AMPK, en un cultivo celular; (b) permitir que la célula se replique durante un tiempo suficiente para producir un número deseado o densidad de células; e (c) introducir las células de la etapa (b) en un sujeto.
En algunas modalidades, el método comprende la etapa adicional de obtener células ß de un sujeto.
En algunas modalidades, las células se dejan replicar durante un tiempo suficiente tal que hay aproximadamente lxlO6, 2xl06, 3xl06, 4xl06, 5xl06, 6xl06, 7xl06, 8xl06, 9xl06, lxlO7, 2xl07, o más células, en el cultivo celular .
Los métodos por los cuales tales células se pueden introducir en el sujeto son descritos en la presente. Un método representativo involucra la encapsulación de células en un recubrimiento biocompatible . En este procedimiento, las células son atrapadas en un recubrimiento capsular que protege las células encapsuladas de respuestas inmunológicas y también sirve para prevenir la proliferación no controlada y esparcido de las células. Una técnica de encapsulación ejemplar involucra la encapsulación con alginato-polilisina-alginato. En modalidades particulares, las cápsulas hechas al emplear esta técnica generalmente contienen varios cientos de células y tienen un diámetro de aproximadamente 1 mm.
Las células se pueden implantar utilizando la técnica de encapsulación de alginato-polilisina de O'Shea y Sun (1986), Diabetes 35:943, con modificaciones como es descrito por Fritschy y colaboradores, (1991) Diabetes 40:37. De acuerdo con este método, las células son suspendidas en alginato de sodio al 1.3% y encapsuladas por extrusión de gotas de la suspensión de célula/alginato a través de una jeringa en CaC12. Después de varias etapas de lavado, las gotas se suspenden en polilisina y se re-lavan. El alginato dentro de las cápsulas luego se re-licua mediante suspensión en EGTA 1 mi y luego se re-lava con solución reguladora de sal balanceada de Krebs. Cada cápsula debe contener varios cientos de células y tener un diámetro de aproximadamente uno mm.
El implante de islotes encapsulados en modelos de animal de diabetes por el método anterior se han mostrado que incrementan significantemente el periodo de control glicémico normal, al prolongar la supervivencia del xenoinherto comparado con los islotes no encapsulados (O' Shea y Sun (1986), Diabetes 35:943; Fritschy y colaboradores, (1991) Diabetes 40:37). También, la encapsulacion puede prevenir la proliferación no controlada de las células clónales. Las cápsulas que contienen células se pueden implantar (por ejemplo, de aproximadamente 500, 1,000 o 2,000 células a aproximadamente 5,000, 10,000 o 20,000 células/animal) intraperitonealmente y las muestras de sangre tomadas diariamente para monitoreo de la glucosa y lisina en la sangre .
Un procedimiento alternativo es sembrar fibras Amicon con células. Las células llegan a ser enredadas en las fibras, que son semipermeables y de esta manera son protegidas de una manera similar a los micro-encapsulados (Altman y colaboradores, (1986) Diabetes 35:625).
Después de la encapsulacion exitosa o el sembrado de fibra, las células, generalmente de aproximadamente 1,000-10,000, se pueden implantar intraperitonealmente, usualmente mediante inyección en la cavidad peritoneal a través de una aguja de calibre grande (calibre 23) .
Una variedad de otras tecnologías de encapsulacion se han desarrollado que son aplicables a la práctica de la presente invención (ver, por ejemplo, Lacy y colaboradores, (1991), Science, 254:1782-1784; Sullivan y colaboradores, Science, 252:718-721; publicaciones de PCT WO 91/10470; WO 91/10425; WO 90/15637; WO 90/02580; WO 8901967; Patente Norteamericana No. 5,011,472; Patente Norteamericana No. 4,892,538; los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. La compañía Cyto Therapeutics ha desarrollado tecnologías de encapsulacion que son ahora comercialmente disponibles y son de uso en la aplicación de la presente invención. Un dispositivo vascular también se ha desarrollado por Biohybrid, of Shrewsbury, ass, que tiene aplicación a la tecnología de la presente invención .
Con respecto a los métodos de implante, ventajas particulares se pueden encontrar en los métodos recientemente descritos por Lacy y colaboradores, (1991), Science, 254:1782-1784 y Sullivan y colaboradores, (1991) Science, 252:718-721, cada una incorporada en la presente por referencia en su totalidad para las enseñanzas de los métodos de implante. Esto se refiere, en primer lugar, el xenoinjerto subcutáneo de islotes encapsulados y en segundo lugar, el implante a largo plazo del tejido de islote en un "páncreas artificial" gue se puede conectar al sistema vascular como una derivación arteriovenosa . Estos métodos de implante se pueden adaptar ventajosamente para el uso con la presente invención al emplear las células expandidas, como es divulgado en la presente, en el lugar del "tejido de islote" descrito en estas publicaciones.
Lacy y colaboradores, ((1991), Science, 254:1782-1784) describe la encapsulacion de islotes de rata en fibras acrilicas huecas e inmovilización de estos en hidrogel de alginato. Después del transplante intraperitoneal de los islotes encapsulados en ratones diabéticos, la normoglicemia se restauró reportadamente . Resultados similares también se obtuvieron utilizando implantes subcutáneos que tuvieron una superficie exterior apropiadamente construida en las fibras. Las células expandidas de la presente invención también se pueden "transplantar" de forma directa en un mamífero mediante inyección subcutánea similar.
Un "páncreas artificial" perfusionado biohíbrido, que encapsula el tejido del islote en una membrana selectivamente permeable, también se puede emplear (Sullivan y colaboradores, (1991) Science, 252:718-721) . En esta modalidad, una membrana semi-permeable tubular se enrolla dentro de un alojamiento protector para proporcionar un compartimiento para las células del islote. Cada extremo de la membrana luego se conecta a un injerto de politetrafluoro-etileno (PTFE) arterial que se extiende más allá del alojamiento y une el dispositivo al sistema vascular como una derivación arteriovenosa . El implante de tal dispositivo que contiene aloinjertos del islote en perros pancreatectomizados se reportó que da por resultado el control de niveles de glucosa en ayunas. Los injertos de este tipo que encapsulan las células modificadas descritos en la presente también se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención.
Un procedimiento alternativo para la encapsulación es simplemente inyectar las células en la región escapular o cavidad peritoneal de los ratones o ratas diabéticas, donde estas células se reportan que forman tumores (Sato y colaboradores, (1962) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 48:1184). Composiciones Farmacéuticas Para la administración a un sujeto, los compuestos se pueden proporcionar en composiciones farmacéuticamente aceptables. Estas composiciones farmacéuticamente aceptables comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más inhibidores de ADK y activadores de AMPK descritos en lo anterior, formulados junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables (aditivos) y/o diluyentes. Como es descrito en detalle enseguida, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular especialmente para administración en forma sólida o liquida, que incluyen aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas) , pastillas, grageas, cápsulas, pildoras, tabletas (por ejemplo, aquellas dirigidas para la absorción bucal, sublingual y sistémica) , bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril o formulación de liberación sostenida; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o un parche o rocío de liberación controlada aplicado a la piel; (4) intravaginalmente o intrarectalmente, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; (5) sublingualmente ; (6) ocularmente; (7) trans-dérmicamente; (8) transmucosalmente; o (9) nasalmente. Adicionalmente, los compuestos se pueden implantar en un paciente o inyectar utilizando un sistema de suministro de fármaco. Ver, por ejemplo, Urquhart y colaboradores, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199-236 (1984); Lewis, ed. "Controlled Reléase of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, Nueva York, 1981); Patente Norteamericana No. 3,773,919; y Patente Norteamericana No. 35 3,270,960.
Como se utiliza aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que están, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional con una relación de beneficio/riesgo razonables.
Como se utiliza aqui, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un rellenador líquido o sólido, diluyente, excipiente, auxiliar de manufacturación (por ejemplo, lubricante, talco, magnesio, calcio o estearato de zinc o ácido estérico) , o material de encapsulacion de solvente, involucrado en llevar o transportar el compuesto objetivo de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de que sea compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial al paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa y sus derivados, tal como carboximetil celulosa de sodio, metilcelulosa, etil celulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agente lubricantes, tal como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, manitol y polie ilenglicol (PEG) ; (12) ésteres, tal como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes reguladores, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógeno; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones reguladas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de voluminosidad, tal como polipéptidos y aminoácidos (23) componente de suero, tal como albúmina de suero, HDL y LDL; (22) alcoholes de C2-C12, tal como etanol; y (23) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en las formulaciones farmacéuticas. También pueden estar presentes agentes humectantes, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, agentes saborizantes , agentes perfumantes, conservadores y antioxidantes en la formulación. Los términos tales como "excipiente", "portador", "portador farmacéuticamente aceptable" o los similares se utilizan intercambiable-mente en la presente.
La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente significa aquella cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es efectivo para producir algún efecto terapéutico deseado en por lo menos una sub-población de células en un animal en una relación de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Por ejemplo, una cantidad de un compuesto administrado a un sujeto que es suficiente para producir un cambio medible, estadísticamente significante en por lo menos un síntoma de diabetes Tipo 1, Tipo 1.5 o Tipo 2, tal como nivel de hemoglobina glicosilada, nivel de glucosa en la sangre en ayunas, hipoinsulinemia, etc.. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica. Generalmente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar con el historial, edad, condición, sexo del sujeto así como la severidad y tipo de la condición médica en el sujeto y la administración de otros agentes farmacéuticamente activos.
Como se utiliza en la presente el término "administrar" se refiere a la colocación de una composición en un sujeto por un método o ruta que da por resultado por lo menos la localización parcial de la composición a un sitio deseado tal que se produce el efecto deseado. Un compuesto o composición descrita en la presente se puede administrar por cualquier ruta apropiada conocida en la técnica que incluyen, pero no limitado a, rutas oral o parenteral, que incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, vías respiratorias (aerosol) , pulmonar, nasal, rectal y administración tópica (incluyendo bucal y sublingual) .
Los modos ejemplares de administración incluyen, pero no están limitados a, inyección, infusión, instilación, inhalación o ingestión. "Inyección" incluye, sin limitación, inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, intracerebro espinal e intrasternal . En modalidades preferidas, las composiciones se administran mediante infusión o inyección intravenosa.
Por "tratamiento", "prevención" o "mejoramiento" de una enfermedad o desorden se propone retardar o prevenir el inicio de tal enfermedad o desorden, revertir, aliviar, aminorar, inhibir, desacelerar o detener la progresión, agravación o deterioro de la progresión o severidad de una condición asociada con tal enfermedad o desorden. En una modalidad, los síntomas de una enfermedad o desorden son aliviados por al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50%.
El tratamiento de la Diabetes se determina por métodos médicos estándares. Un objetivo del tratamiento de la Diabetes es llevar los niveles de azúcar hacia abajo tan cercano a lo normal como sea seguramente posible. Comúnmente los objetivos establecidos son 80-120 miligramos por decilitro (mg/dl) antes de las comidas y 100-140 mg/dl a la hora de acostarse. Un médico particular puede establecer diferentes objetivos para el paciente, dependiendo de otros factores, tal como con qué frecuencia el paciente tiene bajas reacciones de azúcar en la sangre. Las pruebas médicas útiles incluyen pruebas en la sangre y orina del paciente para determinar el nivel de azúcar en la sangre, pruebas para el nivel de hemoglobina glicosilada (HbAlc; una medición de niveles de glucosa en la sangre promedio durante los últimos 2-3 meses, intervalo normal que es 4-6%), pruebas para los niveles de colesterol y grasa y pruebas para el nivel de proteína en la orina. Tales pruebas son pruebas estándares conocidas para aquellos de habilidad en la técnica (ver, por ejemplo, American Diabetes Association, 1998). Un programa de tratamiento exitoso también se puede determinar al tener pocos pacientes en el programa con complicaciones relacionadas a la Diabetes, tales como enfermedades de los ojos, enfermedad de riñon o enfermedad de nervios.
Retardar el inicio de la diabetes en un sujeto se refiere al retardo del inicio de por lo menos un síntoma de diabetes, por ejemplo, hiperglucemia, hipoinsulinemia, retinopatía diabética, nefropatía diabética, ceguera, pérdida de memoria, falla renal, enfermedad cardiovascular (que incluye enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad de la arteria periférica, enfermedad cerebrovascular, ateros-clerosis e hipertensión) , neuropatía, disfunción autonómica, coma hiperosmolar hiperglicémico o combinaciones de los mismos, de por lo menos 1 semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos 1 mes, por lo menos 2 meses, por lo menos 6 meses, por lo menos 1 año, por lo menos 2 años, por lo menos 5 años, por lo menos 10 años, por lo menos 20 años, por lo menos 30 años, por lo menos 40 años o más y puede incluir la toda la vía útil del sujeto.
Como se utiliza en la presente un "sujeto" significa un humano o animal. Usualmente el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal de caza. Los primates incluyen chimpancés, monos cynomologous, monos araña y macacos, por ejemplo, Rhesus . Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y de caza incluyen vacas, caballos, cerdos, venados, bisonte, búfalo, especies felinas, por ejemplo, gato doméstico, especies caninas, por ejemplo, perro, zorro, lobo, especies de aves, por ejemplo, gallina, emú, avestruz y peces, por ejemplo, trucha, bagre y salmón. El paciente o sujeto incluye cualquier subconjunto de lo anterior, por ejemplo, todos los anteriores, pero excluyendo uno o más grupos o especies tales como humanos, primates o roedores. En ciertas modalidades, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un primate, por ejemplo, un humano. Los términos, "paciente" y "sujeto" se utilizan intercambiablemente en la presente.
De preferencia, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un humano, primate no humano, ratón, rata, perro, gato, caballo o vaca, pero no están limitados a estos ejemplos. Los mamíferos diferentes a humanos se pueden utilizar ventajosamente como sujetos que representan modelos animales de diabetes Tipo 1, Diabetes Mellitus Tipo 2 o condiciones pre-diabéticas . Además, los métodos descritos en la presente se pueden utilizar para tratar animales y/o mascotas domesticadas. Un sujeto puede ser macho o hembra. Un sujeto puede ser uno a quien se le ha diagnosticado previamente con o identificado como que sufre de o que tiene Diabetes (por ejemplo, Tipo 1 o Tipo 2), una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes, o una condición pre-diabética y opcionalmente, pero no es necesario tener ya el tratamiento sometido para la Diabetes, la una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes, o la condición pre-diabética . Un sujeto también puede ser uno quien no está sufriendo de Diabetes o una condición pre-diabética. Un sujeto también puede ser uno quien se ha diagnosticado con o identificado como que sufre de Diabetes, una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes, o una condición pre-diabética, pero quien muestra mejoramientos en los factores de riesgo de Diabetes conocidos como un resultado de recibir' uno o más tratamientos para la Diabetes, una o más complicaciones relacionada a la Diabetes, o la condición pre-diabética. Alternativamente, un sujeto también puede ser uno quien no se ha diagnos icado previamente como que tiene Diabetes, una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes, o una condición pre-diabética. Por ejemplo, un sujeto puede ser uno quien exhibe uno o más factores de riesgo para la Diabetes, complicaciones relacionadas a la Diabetes, o una condición pre-diabética, o un sujeto quien no exhibe factores de riesgo de Diabetes, o un sujeto quien es asintomático para la Diabetes, una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes, o una condición pre-diabética. Un sujeto también puede ser uno quien está sufriendo de o está en riesgo de desarrollar Diabetes o una condición pre-diabética. Un sujeto también puede ser uno quien se ha diagnosticado con o identificado como que tiene una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes o una condición pre-diabética como se define en la presente, o alternativamente, un sujeto puede ser uno quien no se ha diagnosticado previamente con o identificado como que tiene una o más complicaciones relacionadas a la Diabetes o una condición pre-diabética.
Como se utiliza en la presente, la frase "sujeto en necesidad de células ß adicionales" se refiere a un sujeto quien es diagnosticado con o identificado como que sufre de, tener o está en riesgo de desarrollar diabetes (por ejemplo, Tipo 1, Tipo 1.5 o Tipo 2), una o más complicaciones relacionada a la diabetes, o una condición pre-diabética.
Un sujeto en necesidad de células ß adicionales se puede identificar utilizando cualquier método utilizado para la diagnosis de diabetes. Por ejemplo, la diabetes Tipo 1 se puede diagnosticar utilizando una prueba de hemoglobina glicosilada (AIC) , una prueba de glucosa de sangre aleatoria y/o una prueba de glucosa en la sangre en ayunas. Los parámetros para la diagnosis de la diabetes son conocidos en la técnica y disponibles para un experto en la técnica sin mucho esfuerzo.
En algunas modalidades, los métodos de la invención además comprenden seleccionar un sujeto identificado como que está en necesidad de células ß adicionales. Un sujeto en necesidad de células ß adicionales se puede seleccionar basado en los síntomas presentados, tales como síntomas de diabetes tipo 1, tipo 1.5 o tipo 2. Los síntomas ejemplares de diabetes incluyen, pero no están limitados a, sed excesiva (polidipsia) , orinar con frecuencia (poliuria) , hambre extrema (polifagia) , fatiga extrema, pérdida de peso, hiperglucemia, niveles bajos de insulina, alta azúcar en la sangre (por ejemplo, niveles de azúcar sobre 250 mg, sobre 300 mg) , presencia de cetonas presentes en la orina, fatiga, piel seca y/o comezón, visión borrosa, cortes o heridas de curación lenta, más infecciones que las usuales, entumecimientos y hormigueo en los pies, retinopatía diabética, nefropatía diabética, ceguera, pérdida de memoria, falla renal, enfermedad cardiovascular (que incluyen enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad de la arteria periférica, enfermedad cerebrovascular, aterosclerosis e hipertensión), neuropatía, disfunción autonómica, coma hiperosmolar hiperglicémico y combinaciones de los mismos.
El inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH y/o activador de AMPK se pueden administrar a un sujeto en combinación con un agente farmacéuticamente activo. El compuesto farmacéuticamente activo ejemplar incluye, pero no está limitado a, aquellos encontrado en Harrison' s Principies of Internal Medicine, 13- Edición, Eds . T.R. Harrison y colaboradores, McGraw-Hill N.Y., NY; Physicians Desk Reference, 50- Edición, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics , 8-Edición, Goodman and Gilman, 1990; Farmacopea de los Estados Unidos, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990; edición actual de Goodman y Oilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics; y edición actual de The Merck Index, los contenidos completos de todas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. En algunas modalidades, el agente farmacéuticamente activo incluye aquellos agentes conocidos en la técnica para el tratamiento de diabetes y/o por tener actividades anti-hiperglucémicas, por ejemplo, inhibidores de dipeptidil peptidasa 4 (DPP-4) (por ejemplo, Alogliptina, Linagliptina, Saxagliptina, Sitagliptina, Vildagliptina y Berberina) , biguanidas (por ejemplo, Metformina, Buformina y Fenformina) , moduladores del receptor activados con el proliferador de peroxisoma (PPAR) tal como tiazolidindionas (TZDs) (por ejemplo, Pioglitazona, Rivoglitazona, Rosiglitazona y Troglitazona) , agonistas PPAR dobles (por ejemplo, Aleglitazar, Muraglitazar y Tesaglitazar) , sulfonilureas (por ejemplo, Acetohexamida, Carbutamida, Clorpropamida, Gliclazida, Tolbutamida, Tolazamida, Glibenclamida (Gliburida) , Glipizida, Gliquidona, Gliclopiramida y Glimepirida) , meglitinidas ("glinidas") (por ejemplo, Nateglinida, Repaglinida y Mitiglinida) , péptido 1 similar a glucagón (GLP-1) y análogos (por ejemplo, Exendina-4, Exenatida, Liraglutida, Albiglutida) , insulina y análogos de insulina (por ejemplo, Insulina lispro, Insulina asparto, Insluina glulisina, Insulina glargina, Insulina detemir, Exúbera e insulina NPH) , inhibidores de alfa-glucosidasa (por ejemplo, Acarbosa, iglitol y Voglibosa) , análogos de amilina (por ejemplo Pramlintida ) , inhibidores de cotransportador T2 de glucosa dependientes de sodio (SGLT T2) (por ejemplo, Dapgliflozin, Remogliflozin y Sergliflozin) y otros (por ejemplo Benfluorex y Tolrestat) .
En la diabetes tipo 1, las células ß se destruyen indeseablemente mediante la respuesta autoinmune continua. Esta respuesta autoinmune se puede atenuar por el uso de los compuestos que inhiben o bloquean tal respuesta autoinmune. Esto puede reducir la longitud del régimen de tratamiento necesario para establecer los niveles de masa de célula ß necesarios y/o requeridos. En algunas modalidades, el agente farmacéuticamente activo es un modulador de respuesta inmune. Como se utiliza en la presente el término "modulador de respuesta inmune" se refiere al compuesto (por ejemplo, una molécula pequeña, anticuerpo, péptido, ácido nucleico o reactivo de terapia de genes) que inhiben la respuesta autoinmune en un sujeto. Sin desear que sea limitado por alguna teoría, un modulador de respuesta inmune inhibe la respuesta autoinmune al inhibir la actividad, activación o expresión de citoquinas inflamatorias (por ejemplo, IL-12, IL-23 o IL-27) o STAT-4. Los moduladores de respuesta inmunes incluyen, pero no están limitados a, miembros del grupo que consiste de Lisofilina (LSF) y los análogos de LSF y derivados descritos en la Patente Norteamericana No. 6, 774,130, el contenido de la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
El inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH y/o el activador de AMPK y el agente farmacéuticamente activo se puede administrar al sujeto en la misma composición farmacéutica o en diferentes composiciones farmacéuticas (al mismo tiempo o en diferentes tiempos) . Cuando es administrado en diferentes tiempos, el compuesto de la invención y el agente farmacéuticamente activo se puede administrar dentro de 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 60 minutos, 2 horas, 3 horas, 4, horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas de administración del otro. Cuando el inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH o el activador de AMPK y el agente farmacéuticamente activo se administran en diferentes composiciones farmacéuticas, las rutas de administración pueden ser diferentes. Por ejemplo, un inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH o activador de AMPK se administra por cualquier ruta apropiada conocida en la técnica que incluye, pero no limitada a rutas oral o parenteral, que incluyen la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, vías respiratorias (aerosol) , pulmonar, nasal, rectal y tópica (que incluye bucal y sublingual) y el agente farmacéuticamente activo se administra por una ruta diferentes, por ejemplo una ruta comúnmente utilizada en la técnica para la administración del agente farmacéuticamente activo. En un ejemplo no limitante, un inhibidor de ADK de la fórmula (II) (por ejemplo, B8) se puede administrar oralmente, mientras que un agente farmacéuticamente activo (por ejemplo, inhibidor de DPP-4) se puede administrar subcutáneamente .
La cantidad del compuesto que se puede combinar con un material portador para producir una sola forma de dosificación generalmente será la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente fuera de un cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0.1% a 99% del compuesto, de preferencia de aproximadamente 5% a aproximadamente 70%, mucho más de preferencia de 10% a aproximadamente 30%.
La toxicidad y eficacia terapéutica se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) . La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Las composiciones que exhiben grandes índices terapéuticos, son preferidas.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios de animales se pueden utilizar en la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en humanos. La dosificación de tales compuestos reside de preferencia dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o nada toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada.
La dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en el plasma circulante que incluye la IC50 (es decir, la concentración del terapéutico que logra una inhibición media-máxima de síntomas) como es determinado en cultivo celular. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto desempeño. Los efectos de cualquier dosificación particular se pueden monitorear por un bioensayo adecuado.
La dosificación se puede determinar por un médico y ajustar, como sea necesario, para adaptarse a los efectos observados del tratamiento. Generalmente, las composiciones se administran de modo que el inhibidor de ADK, inhibidor de SAHH y/o el activador de AMPK se da en una dosis de 1 pg/kg a 150 mg/kg, 1 pg/kg a 100 mg/kg, 1 pg/kg a 50 mg/kg, 1 pg/kg a 20 mg/kg, 1 pg/kg a 10 mg/kg, 1 pg/kg a 1 mg/kg, 100 pg/kg a 100 mg/kg, 100 yg/kg a 50 mg/kg, 100 pg/kg a 20 mg/kg, 100 pg/kg a 10 mg/kg, 100 g/kg a 1 mg/kg, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 50 mg/kg, 1 mg/kg a 20 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg, 10 mg/kg a 100 mg/kg, 10 mg/kg a 50 mg/kg o 10 mg/kg a 20 mg/-kg. Se va a entender que los intervalos dados aqui incluyen todos los intervalos intermedios, por ejemplo, el intervalo de 1 mg/kg a 10 mg/kg incluye 1 mg/kg a 2 mg/kg, 1 mg/kg a 3 mg/kg, 1 mg/kg a 4 mg/kg, 1 mg/kg a 5 mg/kg, 1 mg/kg a 6 mg/kg, 1 mg/kg a 7 mg/kg, 1 mg/kg a 8 mg/kg, 1 mg/kg a 9 mg/kg, 2 mg/kg a 10 mg/kg, 3 mg/kg a 10 mg/kg, 4 mg/kg a 10 mg/kg, 5 mg/kg a 110 mg/kg, 6 mg/kg a 10 mg/kg, 7 mg/kg a 10 mg/kg, 8 mg/kg a 10 mg/kg, 9 mg/kg a 10 mg/kg etc. Va a ser entendido adicionalmente que los intervalos intermedios dados en lo anterior también están dentro del alcance de esta invención, por ejemplo, en el intervalo de 1 mg/kg a 10 mg/kg, intervalos de dosis tales como 2 mg/kg a 8 mg/kg, 3 mg/kg a 7 mg/kg, 4 mg/kg a 6 mg/kg etc.
Con respecto a la duración y frecuencia del tratamiento, es típico para los clínicos expertos monitorear sujetos para determinar cuando el tratamiento está proporcionando beneficio terapéutico, y para determinar si se incrementa o disminuye la dosificación, se incrementa o disminuye la frecuencia de administración, descontinuar el tratamiento, reasumir el tratamiento o hacer otra alteración al régimen de tratamiento. El programa de dosificación puede variar de una vez a la semana a diario dependiendo de un número de factores clínicos, tal como la sensibilidad del sujeto a los polipéptidos . La dosis deseada se puede administrar en un tiempo o divida en subdosis, por ejemplo, 2-4 subdosis y administrada durante un período de tiempo, por ejemplo, a intervalos apropiados a través del día y otro programa apropiado. Tales sub-dosis se pueden administrar como formas de dosificación unitaria. En algunas modalidades, la administración es crónica, por ejemplo, una o más dosis diarias durante un período de semanas o meses. Ejemplos de los programas de dosificación son de administración diaria, dos veces al día, tres veces al día o cuatro o más veces al día durante un período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses o más.
Ensayos de clasificación En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para clasificar un compuesto candidato para estimular o incrementar la replicación o crecimiento de una célula ß en una población de células pancreáticas, el método que comprende: (a) poner en contacto una población de células pancreáticas con un compuesto de prueba; (b) estimar la replicación de célula beta; y (c) seleccionar el compuesto que incrementa o aumenta la replicación de célula ß.
La población de células pancreáticas puede comprender diferentes tipos de células pancreáticas, que incluye pero no limitadas a, células oc, células ß, células d y fibroblastos. Por consiguiente, en algunas modalidades, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 95% de las células en la población de células pancreáticas son células ß.
En algunas modalidades, 90% o menos, 80% o menos, 70% o menos, 60% o menos, 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de las células en la población de células pancreáticas son células a.
En algunas modalidades, 90% o menos, 80% o menos, 70% o menos, 60% o menos, 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos o 5% o menos de las células en la población de células pancreáticas son células d.
En algunas modalidades, 90% o menos, 80% o menos, 70% o menos, 60% o menos, 50% o menos, 40% o menos, 30% o menos, 20% o menos, 10% o menos, o 5% o menos de las células en la población de células pancreáticas son fibroblastos.
En algunas modalidades, la población de células pancreáticas comprende 50-90% de células ß, 10-30% de células a, 5-10% de fibroblastos y 5-10% de otros tipos de célula. En una modalidad adicional de esta población de células pancreáticas comprende aproximadamente 75% de células ß, aproximadamente 18% de células a, aproximadamente 3% de fibroblastos y aproximadamente 5% de otros tipos de célula.
Como se utiliza en la presente el término "compuesto de prueba" se refiere a compuestos y/o composiciones que van a ser clasificadas por su capacidad de estimular y/o incrementar la replicación y/o crecimiento de célula ß. Los compuestos de prueba pueden incluir una amplia variedad de diferentes compuestos, que incluyen compuestos químicos y mezclas de compuesto químicos, por ejemplo, moléculas orgánicas o inorgánicas pequeñas; sacarinas; oligosacáridos ; polisacáridos ; macromoléculas biológicas, por ejemplo, péptidos, proteínas y análogos de péptido y derivados; peptidomiméticos ; ácidos nucleicos; análogos de ácido nucleico y derivados; un extracto hecho de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos o células animal; tejidos de animal; que ocurren naturalmente o composiciones sintéticas; y cualquiera de las combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el compuesto de prueba es una molécula' pequeña.
Como se utiliza en la presente el término "molécula pequeña" puede referirse a compuestos que son "similares al producto natural", sin embargo, el término "molécula pequeña" no se limita a compuestos "similares al producto natural".
Más bien, una molécula pequeña es típicamente caracterizada en que contiene varios enlaces de carbono—carbono y tiene un peso molecular de menos de 5000 Daltons (5 kD) , de preferencia menos de 3 kD, aun más de preferencia menos de 2 kD y mucho más de preferencia menos de 1 kD. En algunos casos es preferido que una molécula pequeña tenga un peso molecular igual a o menor que 700 Daltons.
El número de posibles compuestos de prueba se corre en millones. Los métodos para desarrollar las librerías basadas en molécula pequeña, poliméricas y genoma son descritos, por ejemplo, en Ding y colaboradores, J Am. Chem. Soc. 124:1594-1596 (2002) y Lynn y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 123:8155-8156 (2001). Las librerías de compuestos comercialmente disponibles se pueden obtener de, por ejemplo, ArQule, Pharmacopia, graffinity, Panvera, Vitas-M Lab, Biomol International y Oxford. Estas librerías se pueden clasificar utilizando los dispositivos y métodos de clasificación descritos en la presente. También se pueden utilizar librerías de compuestos químicos tales como aquellas de NIH Roadmap, Molecular Libraries Screening Centers Network (MLSCN) . Una lista comprehensiva de librerías de compuestos se puede encontrar en www . broad . harvard . edu/chembio/ platforrn/screening/compuesto libraries/index . htm. Una librería química o librería de compuestos es una colección de químicos almacenados usualmente utilizados finalmente en la clasificación de alto rendimiento o manufactura industrial. La librería química puede consistir en simples términos de una seria de químicos almacenados. Cada químico tiene información asociada almacenada en alguna clase de la base de datos con información tal como la estructura química, pureza, cantidad y características fisicoquímicas del compuesto.
Dependiendo de la modalidad particular que es practicada, los compuestos de prueba se puede proporcionar libres en solución o se pueden unir a un portador, o un soporte sólido, por ejemplo, cuentas. Un número de soportes sólidos adecuados se pueden emplear para la inmovilización de los compuestos de prueba. Ejemplos de portadores sólidos adecuados incluyen agarosa, celulosa, dextrano (comercialmente disponibles como, es decir, Sephadex, Sepharose) carboximetil celulosa, poliestireno, polietilen-glicol (PEG), papel filtro, nitrocelulosa, resinas de intercambio iónico, películas plásticas, copolímero de ácido malico de éter poliaminametilvinílico, cuentas de vidrio, copolímero de aminoácido, copolímero de etileno-ácido maleico, nilón, seda, etc. adicionalmente, para los métodos descritos en la presente, los compuestos de prueba se pueden clasificar individualmente o en grupos. L clasificación de grupo es particularmente útil donde los índices de aciertos para los compuestos de prueba efectivos se esperan que sean bajos tal que un experto no esperaría más de un resultado positivo para un grupo dado.
En algunas modalidades, el compuesto de prueba incrementa la replicación o crecimiento de célula beta por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más alto con relación a un control no tratado.
En algunas modalidades, la etapa de estimar la replicación de célula beta comprende detectar un marcador de célula ß y un marcador de replicación de célula. Un compuesto de prueba seleccionado se puede limitar adicionalmente al compuesto donde el marcador de célula ß y el marcador de replicación de célula se co-localiza en la misma célula.
La replicación de célula ß incrementada o aumentada se puede estimar por: (i) el número total incrementado de células en el cultivo, como es comparado con un control no tratado; (ii) el número total incrementado de células que expresan por lo menos un marcador de célula ß en el cultivo, como es comparado con un control no tratado; (iii) la relación incrementada de células que expresan por lo menos un marcador de célula ß con el número total de células en el cultivo, como es comparado con un control no tratado; (iv) el número incrtementado de células que expresan por lo menos un marcador de replicación de célula, como es comparado con un control no tratado; (v) la relación incrementada de células que expresan por lo menos un marcador de replicación de célula, como es comparado con un control no tratado; o (vi) una combinación de los mismos.
En algunas modalidades, la replicación de célula beta se estima por la vía de la adquisición y análisis de imagen automatizada utilizando un Cellomics ArrayScan VTI. Los umbrales/parámetros de adquisición se establecen tal que las llamadas basadas en computadora de eventos de replicación son consistentes con las llamadas basadas en humanos. Tal adquisición y análisis de imagen automatizada permite la clasificación de alto rendimiento de los compuestos.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, las células pancreáticas se cultivan en la presencia de proteínas de matriz celular capaces de promover la formación de hemidesmosoma, tal como aquellas producidas por las líneas celulares de carcinoma de vejiga de rata 804G o NBT-II. La Patente Norteamericana No. 5,510,263, el contenido de la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad, divulga el crecimiento aumentado de las células del islote pancreático cultivadas en las matrices 804G y NBT-II.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, las células se cultivan en medios acondicionados de línea celular de carcinoma de vejiga de rata 804G o NBT-II. Las células también se pueden cultivar en medios a los cuales una o más de las proteínas de matriz de los medios acondicionados se han adicionado. Tales proteínas de matriz se pueden purificar de fuentes naturales o producidas utilizando métodos recombinantes conocidos en la técnica.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, las células se cultivan en medios de cultivo en contacto con laminina 5. De preferencia, la laminina 5 se selecciona del grupo que consiste de Kalinina y epiligrina. La laminina 5 se puede obtener de un número de fuentes que incluyen, pero no limitadas a, de la matriz extracelular obtenida de células MCF 10A.
Se va a entender que, los medios acondicionados o proteínas de matriz se pueden adicionar a los medios de cultivo. Alternativamente, los medios acondicionados o proteínas de matriz se pueden utilizar para prerrecubrir la superficie del recipiente donde las células pancreáticas van a ser cultivadas. De preferencia, la superficie del recipiente se recubre con medios acondicionados 804G o NBT-II, antes de la colocación en placa de las células pancreáticas.
Generalmente la densidad de colocación en placa puede variar de aproximadamente 10k células/cavidad a aproximadamente 100k células/cavidad. En algunas modalidades, la densidad de colocación en placa celular está en el intervalo de aproximadamente 25k células/cavidad a aproximadamente 75k células/cavidad. En una modalidad, la densidad de colocación en placa celular es aproximadamente 60k células/cavidad. Generalmente, por lo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de las células son viables en el momento de la colocación en placa.
Después de la colocación en placa, las células pancreáticas se pueden dejar adherir a la superficie durante un tiempo suficiente, por ejemplo por lo. menos 1 hora, 2 horas, 3, horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas o más, antes de ponerse en contacto con el compuesto de prueba. En algunas modalidades, las células se dejan adherir durante 48 horas antes del tratamiento del compuesto. Después de que las células se han dejado adherir durante un tiempo suficiente, los medios se pueden cambiar antes del tratamiento con el compuesto de interés .
Generalmente, los compuestos se pueden probar a cualquier concentración que puede aumentar la replicación de células ß con relación a un control durante un periodo de tiempo apropiado. En algunas modalidades, los compuestos se prueban en concentración en el intervalo de aproximadamente 0.1 nM a aproximadamente 1000 mM. De preferencia el compuesto se prueba en el intervalo de aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 20 µ?, aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 10 µ?, o aproximadamente 0.1 µ? a aproximadamente 5 µ?. En una modalidad, los compuestos se prueban a 1 µ?.
La población de células pancreáticas se puede mantener a cualquier temperatura adecuada para los cultivos de células pancreáticas. En una modalidad, las células pancreáticas se mantienen a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 15°C a aproximadamente 55°C. En una modalidad, las células pancreáticas se mantienen a 37°C.
Generalmente, el número de células ß en el cultivo se pueden contar después de que las células pancreáticas han estado en contacto con el compuesto de prueba durante tiempo suficiente, por ejemplo, por lo menos 1 hora, por lo menos 2 horas, por lo menos 3, horas, por lo menos 4 horas, por lo menos 5 horas, por lo menos 6 horas, por lo menos 7 horas, por lo menos 8 horas, por lo menos 9 horas, por lo menos 10 horas, por lo menos 11 horas, por lo menos 12 horas, por lo menos 24 horas, por lo menos 36 horas, por lo menos 48 horas, por lo menos 5 días, por lo menos 1 semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas o más. Las células se pueden contar manualmente o por un sistema automatizado. El uso de un sistema automatizado permite la clasificación de alto rendimiento de los compuestos.
La detección del marcador de célula beta y célula de replicación se puede hacer después de que las células pancreáticas están en contacto con el compuesto de prueba durante un tiempo suficiente, por ejemplo, por lo menos 1 hora, por lo menos 2 horas, por lo menos 3, horas, por lo menos 4 horas, por lo menos 5 horas, por lo menos 6 horas, por lo menos 7 horas, por lo menos 8 horas, por lo menos .9 horas, por lo menos 10 horas, por lo menos 11 horas, por lo menos 12 horas, por lo menos 24 horas, por lo menos 36 horas, por lo menos 48 horas, por lo menos 5 días, por lo menos 1 semana, por lo menos 2 semanas, por lo menos 3 semanas o más. Después de la detección del marcador, el número de células que expresan el marcador de replicación de célula y/o célula ß se pueden contar. La detección del marcador puede incluir las etapas de preparar las células para el ensayo apropiado, por ejemplo, fijado y/o manchado de las células.
En algunas modalidades, el método comprende adicionalmente seleccionar el compuesto que incrementa la relación de las células ß al número total de células como es comparado con un control no tratado.
El término "marcador de célula ß" se refiere a, sin limitación, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polimorfismos de proteínas y ácidos nucleicos, variantes de empalme, fragmentos de proteínas o ácidos nucleicos, elementos y otros analitos que se expresan específicamente o se presentan en células ß. Los marcadores de célula ß ejemplares incluyen, pero no están limitados a, polipéptido homeobox 1 pancreático y duodenal (PDX-1), insulina, péptido c, amilina, E-cadherina, ???3ß, PCI/3, Beta2, Nkx2.2, Nkx6.1, GLUT2, PC2, ZnT-8, MAFA, MAFB y aquellos descritos en Zhang y colaboradores, Diabetes. 50 ( 10 ): 2231-6 (2001). En alguna modalidad, el marcador de célula ß es un marcador de célula ß nuclear. En algunas modalidades, el marcador de célula ß es PDX-1 o PH3.
Sin desear que sea limitado por alguna teoría, la falla de las clasificaciones de replicación de célula ß anteriores es primariamente una consecuencia de utilizar un marcador citoplásmico (Insulina) como el identificador de célula ß . El uso de un marcador citoplásmico previene la atribución precisa de la replicación nuclear en una identidad de célula específica, es decir, en cultivo denso es imposible atribuir un citoplasma a un núcleo específico dada la proximidad a múltiples núcleos. Por lo tanto, en algunas modalidades, el marcador de célula ß no es un marcador de célula ß citoplásmico. En una modalidad, el marcador de célula ß no es insulina.
El término "marcador de replicación de célula" se refiere a, sin limitación, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, polimorfismos de proteínas y ácido nucleicos, variantes de empalme, fragmentos de proteínas o ácidos nucleicos, elementos y otros analitos que están asociados específicamente con la proliferación celular. Adicionalmente, el "marcador de replicación de célula", incluye actividad enzimática cuando cambios, por ejemplo, incremento o disminución, en la actividad enzimática están asociados específicamente con la proliferación celular. Los marcadores de replicación de célula ejemplares incluyen, pero no están limitados a, histona H3 fosforilada (PH3), proteína Ki-67, antígeno PM-2 fosforilado, Antígeno Nuclear de Célula Proliferante (PCNA, una proteína que se expresa en los núcleos de las células durante la fase de síntesis de DNA del ciclo celular) , epítope de fosfo-S780-Rb ( Jacobberger, JW y colaboradores, Cytometry A (2007), 73A:5-15), Cenp-F (mitosina) , ß-Tubulina clase III, spindal checkpint protina hMad2, quinasa de cadena ligera de miosina fosforilada, topoisomerasa II. Quinasa 1 de punto de control (Chkl), Transportador 2 de Monoamina Vesicular (VMAT2), pérdida de actividad de quinasa de la quinasa 1 dependiente de ciclina (Cdkl) . La histona H3 puede ser fosforilada en Ser28 o SerlO.
En algunas modalidades, el marcador de replicación de célula es proteína Ki-67 o PH3.
La proteína Ki-67 (también conocida como MKI67) es un marcador celular para la proliferación. Está estrictamente asociada con la proliferación celular. Durante la interfase, la proteína Ki-67 se puede detectar exclusivamente dentro del núcleo celular, mientras que en la mitosis la mayoría de la proteína se reubica a la superficie de los cromosomas. La proteína Ki-67 está presente durante todas las fases activas del ciclo celular (Gi, S, G2 y mitosis) , pero está ausente de células en reposo (G0) . La Ki-67 es un excelente marcador para determinar la fracción de crecimiento de una población de célula dada.
Los marcadores de replicación de célula y marcadores de célula ß se pueden detectar por métodos conocidos en la técnica y fácilmente disponibles para la persona experta, por ejemplo ensayos de ELISA, inmunofluourescentes o inmunohistoquímicos apropiados se pueden utilizar para la detección. El MIB-1 es un anticuerpo monoclonal comúnmente utilizado que detecta la proteína Ki-67. Se utiliza en aplicaciones clínicas para determinar el índice de marcación de Ki-67. ELISA de Ki-67 son descritos en Klein, CL y colaboradores, J. Mater. Sci. Mater. Med. (2000), 11:125-132; Frahm, SO y colaboradores, J. Immunol. Methods (199*0, 211:43-50; y Key G y colaboradores, J. Immunol. Methods (1994), 177:113-117. Phospho-Histone H3 antibodies for detection of phosphorilated Histone H3 son comercialmente disponibles de Cell Signaling Technology and Millipore. Los anticuerpos contra PCNA son comercialmente disponibles de Sigma Aldrich. Los anticuerpos al antígeno PM-2 son específicos para células en la mitosis, reconocen una familia de proteínas que comparten un epítope fosforilado común.
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, las células pancreáticas son islotes de Langerhans o fragmentos de los mismos. En algunas modalidades, las células pancreáticas son de un mamífero, por ejemplo, un ratón, una rata o un humano. En algunas modalidades, las células pancreáticas son de un sujeto, donde el sujeto se selecciona basado en la necesidad del sujeto de células ß adicionales. En algunas modalidades, las células pancreáticas son células pancreáticas primarias, por ejemplo una célula del islote primario. En algunas modalidades, las células pancreáticas no son células pancreáticas transformadas .
En algunas modalidades de este y otros aspectos de la invención, las células pancreáticas se aislan de un sujeto y se cultivan durante la noche.
En algunas modalidades de este y otro aspecto de la invención, las células pancreáticas se tripsinizan en agrupaciones celulares de 1-10 células. De preferencia, las células pancreáticas se tripsinizan en agrupaciones celulares de 1-7 células, más de preferencia 1-5 y mucho más de preferencia 1-3 células. Las células pancreáticas tripsinizadas se pueden resuspender en medios del islote apropiados antes de la colocación en placa. En algunas modalidades, las células pancreáticas tripsinizadas se dejan recuperar durante la noche antes de la colocación en placa.
En una modalidad, el método de clasificación para un compuesto candidato para estimular o incrementar la replicacion de célula beta comprende: (a) tripsinizar islotes en agrupaciones celulares de 1-3 células; (b) dejar que las células se recuperen durante la noche; (c) colocar en placa las células de la etapa (b) en las cavidades de una placa de 96 cavidades, en donde las cavidades se recubren con medio acondicionado 804G y la densidad de colocación en placa celular es 60k células/cavidad; (d) dejar a las células adherirse a la superficie de las cavidades durante 48 horas; (e) poner en contacto 1 µ? del compuesto de prueba con las células beta durante 24 horas; (f) manchar las células con anticuerpo PDX-1 y anticuerpo Ki-67 y/o PH3; y estimar la replicacion de célula beta.
Como se utiliza en la presente el término "células transformadas" se reconoce en la técnica y se refiere a células que se han convertido a un estado de crecimiento sin restricción, es decir, han adquirido la capacidad de crecer a través de un número indefinido de divisiones en el cultivo. Las células transformadas se pueden caracterizar por tales términos como neoplásticas, anaplásticas y/o hiperplásticas, con respecto a su pérdida de control dé crecimiento. En general, el término "célula ß transformada" se refiere a células ß que exhiben capacidad incrementada para persistir en subcultivos en serie o proporción de crecimiento incrementada in vitro.
En algunas modalidades, el método de clasificación es una clasificación de alto rendimiento. La clasificación de alto rendimiento (HTS) es un método para la experimentación científica que usa procesamiento de datos, robóticos y software de control, dispositivos de manejo de líquido y detectores sensibles. La Clasificación de Alto Rendimiento o HTS permite que un investigador rápidamente conduzca millones de pruebas bioquímicas, genéticas y farmacológicas. Las Clasificaciones de Alto Rendimiento son bien conocidas para un experto en la técnica, por ejemplo, aquellas descritas in las Patentes Norteamericanas Nos. 5,976,813; 6,472,144; 6,692,856; 6,824,982; y 7,091,048 y los contenidos de cada una de las cuales son incorporados en la presente por referencia en su totalidad.
La HTS usa la automatización para correr una clasificación de un ensayo contra una librería de compuestos candidato. Un ensayo es una prueba para la actividad específica: usualmente inhibición o estimulación de un mecanismo bioquímico o biológico. Las librerías de clasificación HTS típicas o "plataformas" pueden contener de 100,000 a más de 2,000,000 compuestos.
El aparato de laboratorio clave o recipiente de prueba de HTS es la placa de microtitulo: un contenedor pequeño, usualmente desechable y hecho de plástico, que dispone de una cuadricula de cavidades pequeñas', llamadas aberturas abiertas. Las microplacas modernas para HTS generalmente tienen ya sea 384, 1536, o 3456 cavidades. Estos son todos múltiples de 96, que reflejan la microplaca de 96 cavidades original con cavidades espaciada de 8 x 12 9mm.
Para preparar un ensayo, el investigador rellena cada cavidad de la placa con los reactivos apropiados que desea para conducir el experimento con, tal como una población de células pancreáticas. Después de que algún tiempo de incubación ha pasado se deja el reactivo absorber, enlazar, o de otra manera reaccionar (o no reaccionar) con los compuestos en las cavidades, las mediciones se toman a través de todas las cavidades de la placa, ya sea manualmente o mediante una máquina. Las mediciones manuales son frecuentemente necesarias cuando el investigador está utilizando microscopía para (por ejemplo) buscar cambios que una computadora no podría fácilmente determinar por sí misma. De otra manera, una máquina de análisis automatizada especializada puede correr un número de experimentos sobre las cavidades tal como mediciones colorimétricas, conteo de radioactividad, etc. En este caso, la máquina envía el resultado de cada experimento como una cuadricula de valores numéricos, con cada número que mapea al valor obtenido de una sola cavidad. Una máquina de análisis de alta capacidad puede medir docenas de placas en el espacio de unos pocos minutos similar a esto, generando miles de puntos de datos experimentales muy rápidamente.
En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto seleccionado por el ensayo de clasificación descrito en la presente. Se va a entender que los análogos, derivados e isómeros de los compuestos seleccionados por los ensayos de clasificación descritos en la presente también son reclamados en la presente.
Diagnosis de diabetes La diabetes Tipo 1 es una enfermedad autoinmune que da por resultado la destrucción de células beta productoras de insulina en el páncreas. La falta de insulina causa un incremento de glucosa en la sangre en ayunas (alrededor de 70-120 mg/dL en gente no diabética) que comienza a aparecer en la orina por encima del umbral renal (aproximadamente 190-200 mg/dl en la mayoría de la gente) . La Organización Mundial de la Salud define el valor de diagnóstico de concentración de glucosa en plasma en ayunas a 7.0 mmol/1 (126 mg/dl) y arriba para Diabetes Mellitus (sangre entera 6.1 mmol/1 o 110 mg/dl), o nivel de glucosa de 2 horas de 11.1 mmol/L o más alto (200 mg/dL o más alto) .
La diabetes Tipo 1 se puede diagnosticar utilizando una variedad de pruebas de diagnóstico que incluyen, pero no están limitadas a, lo siguiente: (1) prueba de homoglobina glicada (AIC) , (2) prueba de glucosa en la sangre aleatoria y/o (3) prueba de glucosa en la sangre en ayunas.
La prueba de hemoglobina glicada (AIC) es una prueba en la sangre que refleja el nivel de glucosa en la sangre promedio de un sujeto durante los últimos dos a tres meses. La prueba mide el porcentaje de glucosa en la sangre unido a hemoglobina, que se correlaciona con los niveles de glucosa en la sangre (por ejemplo, entre más altos los niveles de . glucosa en la sangre, más hemoglobina es glicosilada) . Un nivel AIC de 6.5 por ciento o más alto en dos pruebas separadas es indicativo de diabetes. Un resultado entre 6 y 6.5 por ciento se considera prediabético, que indica un alto riesgo de desarrollar diabetes.
La Prueba de Glucosa en la Sangre Aleatoria comprende obtener una muestra de sangre en un punto de tiempo aleatorio de un sujeto que se sospecha de tener diabetes. Los valores de glucosa en la sangre se pueden expresar en miligramos por decilitro (mg/dL) o milimoles por litro (mmol/L) . Un nivel de glucosa en la sangre aleatorio de 200 mg/dL (11.1 mmol/L) o más alto indica que el sujeto probablemente tiene diabetes, especialmente cuando se acopla con cualquiera de los signos y síntomas de diabetes, tal como orinar con frecuencia y sed extrema.
Para la prueba de glucosa en la sangre en ayunas, una muestra de sangre se obtiene después del ayuno durante la noche. Un nivel de glucosa en la sangre en ayunas de menos de 100 mg/dL (5.6 mmol/L) se considera normal. Un nivel de glucosa en la sangre en ayunas de 100 a 125 mg/dL (5.6 a 6.9 mmol/L) se considera prediabético, mientras que un nivel de 126 mg/dL (7 mmol/L) o más alto en dos pruebas separadas es indicativo de diabetes.
La diabetes Tipo 1 también se puede distinguir de la diabetes tipo 2 utilizando un ensayo de C-péptido, que es una medición de la producción de insulina endógena. La presencia de anticuerpos anti-islote (a Ácido Glutámico Descarboxilasa, Péptido-2 Asociada a Insulinoma o insulina) , o falta de resistencia a insulina, determinada por una prueba de tolerancia a la glucosa, es también indicativo del tipo 1, ya que muchos diabéticos tipo 2 continúan produciendo insulina internamente y todos tienen algún grado de resistencia a insulina.
La prueba para anticuerpos GAD 65 se ha propuesto como una prueba mejorada para diferenciar entre las diabetes tipo 1 y tipo 2 ya que parece que el sistema inmune está involucrado en la etiología de la diabetes Tipo 1.
Definiciones A menos de que sea definido de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente solicitud tendrán los significados que son entendidos comúnmente por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Además, a menos de que sea requerido de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán lo singular.
Los términos "diabetes" y "diabetes mellitus" se utilizan intercambiablemente en la presente. La Organización Mundial de la Salud define el valor de diagnóstico de la concentración de glucosa en la sangre en ayunas a 7.0 mmol/1 (126 mg/dl) y arriba para la Diabetes Mellitus (sangre entera 6.1 mmol/1 o 110 mg/dl) o nivel de glucosa de 2 horas 11.1 mmol/L o más alto (200 mg/dL o más alto) . Otros valores sugestivos de o que indican alto riesgo para la Diabetes Mellitus incluyen presión arterial elevada 140/90 mm Hg o más alta; triglicéridos en plasma elevados (1.7 mmol/L; 150 mg/dL) y/o bajo HDL-colesterol (menos de 0.9 mmol/L, 35 mg/dl para hombres; menos de 1.0 mmol/L, 39 mg/dL para mujeres); obesidad central (varones: relación de cintura a cadera más alta que 0.90; mujeres: relación de cintura a cadera más alta que 0.85) y/o índice de masa corporal que excede 30 kg/m2; microalbuminuria, donde la velocidad de excreción de albúmina urinaria es 20 µg/min o más alta, o relación de albúmina : creatinina 30 mg/g o más alta).
Como se utiliza en la presente el término "que comprende" o "comprende" se utiliza en referencia a composiciones, métodos y componente ( s ) respectivo (s) de los mismos, que son esenciales para la invención, todavía abierto a la inclusión de elementos no especificados, si o no esenciales.
Como se utiliza en la presente el término "que consiste esencialmente de" se refiere a aquellos elementos requeridos para una modalidad dada. El término permite la presencia de elementos adicionales que no afectan materialmente la característica (s) básica y novedosa o funcional de esa modalidad de la invención.
El término "que consiste de" se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos como son descritos en la presente, que son exclusivos de cualquier elemento no citado en esa descripción de la modalidad .
Diferente en los ejemplos operantes, o donde de otra manera sea indicado, todos los números que expresan cantidades de los ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente deben ser entendidos como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente." El término "aproximadamente" cuando se utiliza en conexión con los porcentajes puede significar ±1%.
Los términos singulares "un", "uno" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo indique de otra manera. De manera similar, la palabra "o" se propone para incluir "y" a menos de que el contexto claramente lo indique de otra manera. Va a ser entendido adicionalmente que todos los tamaños de base o tamaños de aminoácido y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para descripción.
Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de esta descripción, los métodos y materiales adecuados son descritos enseguida. El término "comprende" significa "incluye". La abreviación, "e.g." se deriva del Latín exempli gratia y se utiliza en la presente para indicar un ejemplo no limitante. De esta manera, la abreviación "e.g." es sinónimo con el término "por ejemplo" .
Los términos "disminuye", "reducido", "reducción", "disminuye" o "inhibir" todos se utilizan en la presente generalmente para dar a entender una disminución por una cantidad estadísticamente significante. Sin embargo, para evitar dudas, ""reducido", "reducción" o "disminución" o "inhibir" significa una disminución por al menos 10% como es comparado con un nivel de referencia, por ejemplo una disminución por al menos aproximadamente 20%, o al menos aproximadamente 30% o al menos aproximadamente 40%, o al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60%, o al menos aproximadamente 70%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% o hasta y que incluye una disminución al 100% (por ejemplo nivel ausente como es comparado con una muestra de referencia) , o cualquier disminución entre 10-100% como es comparado con un nivel de referencia .
Los términos "incrementado" "incrementar" o "aumentar" o "activar" todos se utilizan en la presente para dar a entender generalmente un incremento por una cantidad estadísticamente significante; para evitar cualquier duda, los términos "incrementado", "incrementar" o "aumentar" o "activar" significan un incremento de por lo menos 10% como es comparado con un nivel de referencia, por ejemplo un incremento de por lo menos aproximadamente 20%, o por lo menos aproximadamente 30%, o por lo menos aproximadamente 40%, o por lo menos aproximadamente 50%, o por lo menos aproximadamente 60%, o por lo menos aproximadamente 70%, o por lo menos aproximadamente 80%, o por lo menos aproximadamente 90% o hasta y que incluye un incremento al 100% o cualquier incremento 10-100% como es comparado con un nivel de referencia, o por lo menos aproximadamente a 2 veces, o por lo menos aproximadamente a 3 veces, o por lo menos aproximadamente a 4 veces, o por lo menos aproximadamente a 5-veces o por lo menos aproximadamente a 10 veces de incremento, o cualquier incremento entre 2 veces y 10 veces o mayor como es comparado con un nivel de referencia.
El término "estadísticamente significante" o "significantemente" se refiere a la significancia estadística y generalmente significa dos desviaciones estándar (2SD) por debajo de lo normal, o más baja, concentración del marcador. El término se refiere a la evidencia estadística de que hay una diferencia. Se define como la probabilidad de hacer una decisión para rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula es realmente verdadera. La decisión se hace frecuentemente utilizando el valor p.
Como se utiliza en la presente, el término "IC50" se refiere a la concentración de un inhibidor que produce 50% de la inhibición máxima de la actividad de ADK medible utilizando el mismo ensayo en la ausencia del inhibidor. La IC50 se puede medir in vitro o in vivo. La IC50 se puede determinar al medir la actividad de adenosina quinasa in vitro utilizando un ensayo de quinasa in vitro convencional. La inhibición de adenosina quinasa se puede realizar, por ejemplo, de acuerdo con procedimientos estándares bien conocidos en la técnica (Yamada y colaboradores, Comp. Biochem, Physiol. 1982, 71B : 367-372 ) . Típicamente, la adenosina quinasa se pone en contacto con el compuesto inhibidor, típicamente al adicionar el compuesto a una solución acuosa que contiene la enzima, adenosina de sustrato radiomarcado, cloruro de magnesio y ATP. La enzima puede existir en células intactas o en fracciones subcelulares aisladas que contienen la enzima. La enzima luego se mantiene en la presencia del inhibidor durante un período de tiempo y bajo condiciones fisiológicas adecuadas. Los medios para determinar los tiempos de mantenimiento son bien conocidos en la técnica y dependen de inter alia en las concentraciones de enzima y las condiciones fisiológicas. Las condiciones fisiológicas adecuadas son aquellas necesarias para mantener la viabilidad de adenosina quinasa e incluyen temperatura, acidez, tonicidad y los similares. A manera de ejemplo, las células que contienen adenosina quinasa, tales como células de neuroblastoma humano IMR-32, se cultivan en la presencia y ausencia de un inhibidor. La inhibición se mide como la capacidad para inhibir la fosforilación de 14C-adenosina endógena o externamente aplicada por estas células. En algunas modalidades, la actividad de ADK se mide por un ensayo descrito en Cowart . y colaboradores, Structure-activity studies of 5-substited piridopyrimidines as adenosine kinasa inhibitors. Bioorg Med Chem Lett 2001, 1:83-86; Davies LP y colaboradores, Halogenated pyrrolopyrimidine analogues of adenosine from marine organisms: Pharmacological activities and potent inhibition of adenosine kinasa. Biochem Pharmacol 1984, 33:347-355; Erion MD y colaboradores, Design, synthesis and anticonvulsant activity of the potent adenosine kinasa inhibitor GP3269. Nucleosides Nucleotides 1997, 16:1013-1021; Hajduk PJ y colaboradores, Design of adenosine kinasa inhibitors from the NMR-based screening of fragments. J Med Chem 2000, 3:4781-4786; Jarvis, MF y colaboradores, ABT-702, a novel orally effective adenosinea kinasa (AK) inhibitor analgesic with antiinflammatory properties: I. In vitro characterization and acute antinociceptive effects in mice. J Pharmacol Exp Ther 2000, 295:1156-1164; Kowaluk EA, Bhagwat SS, Jarvis MF. Adenosine kinase inhibitors. Curr Pharmaceut Des 1998, 4:403-416; Kowaluk EA y colaboradores, Characterization of the effects of adenosine kinasa inhibitors on acute thermal nociception in mice. Pharmacol Biochem Behav 1999, 63:83-91; Miller LP y colaboradores, Pre-and peristroke treatment with el inhibitor de adenosine kinasa, 5' deoxiiodotubercidin, significantly reduces infarct volume after temporary occlusion of the middle cerebral artery in rats. Neurosci Lett 1996, 220:73-76; Miller RL, Adamczyk DL, Miller WH y colaboradores, Adenosine kinase from rabbit liver. II. Substrate and inhibitor specificity. J Biol Chem 1979, 254:2346-2352; Ugarkar BG y colaboradores, Adenosine kinase inhibitors. 2. Synthesis, enzyme inhibition, and antiseizure activity of diariltubercidin analogues, J Med Chem 2000, 43:2984-2905; Ugarkar BG y colaboradores, Adenosine kinase inhibitors. 1. Synthesis, enzyme inhibition, and antiseizure activity of 5-yodotubercidin analogues. J Med Chem 2000, 43:2883-2893; Wiesner JB y colaboradores, Adenosine kinase inhibitors as a novel pproach to anticonvulsant therapy. J Pharmacol Exp Ther 1999, 289:1669-1677, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
Como se utiliza en la presente, el término "EC50", se refiere a la concentración de un activador que produce 50% de activación máxima de la actividad de AMPK medible utilizando el mismo ensayo en la ausencia del activador. Establecido diferentemente, la "EC50" es la concentración del activador que da 50% de activación, cuando 100% de la activación se establece en la cantidad de la actividad que no incrementa con la adición de más activador. La EC50 se puede medir in vitro o in vivo. La EC50 se puede determinar al medir la actividad de AMPK in vitro utilizando un ensayo de quinasa in vitro convencional. En algunas modalidades, la actividad de AMPK es por un ensayo como es descrito en Gorton, JM y colaboradores, 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside : a specific method for activating AMP-activated protein kinase in intact células? Eur. J. Biochem. 1995, 229:558-565, los contenidos de las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
La "tolerancia de glucosa alterada" (IGT) se define como que tiene un nivel de glucosa en la sangre que es más alto que lo normal, pero no bastante alto para ser clasificado como Diabetes Mellitus. Un sujeto con IGT tendrá niveles de glucosa de dos horas de 140 a 199 mg/dL (7.8 a 11.0 mmol) en la prueba de tolerancia de glucosa oral de 75 g. Estos niveles de glucosa están por arriba de lo normal pero por debajo del nivel que es diagnóstico para la Diabetes. Los sujetos con tolerancia a la glucosa alterada o glucosa en ayunas alterada tienen un riesgo significante de desarrollar Diabetes y de esta manera son un grupo objetivo importante para la prevención primaria.
El "nivel de glucosa normal" se utiliza intercambiablemente con el término "normoglucémico" y se refiere a una concentración de glucosa en plasma venosa en ayunas de menos de 6.1 mmol/L (110 mg/dL) . Aunque esta cantidad es arbitraria, tales valores se han observado en sujetos con tolerancia de glucosa normal aprobada, aunque algunos pueden tener IGT como es medido por la prueba de tolerancia de glucosa oral (OGTT) . Un valor de linea de base, valor de índice o valor de referencia en el contexto de la presente invención y como se definen en la presente pueden comprender, por ejemplo, "niveles de glucosa normales".
Una "condición pre-diabética" se refiere a un estado metabólico que está intermedio entre la homeostasis de glucosa normal, metabolismo y estados vistos en Diabetes Mellitus Real. Las condiciones pre-diabéticas incluyen, sin limitación, Síndrome Metabólico ("Síndrome X"), Tolerancia a la Glucosa Alterada (IGT) y Glicemia en Ayunas Alterada (IFG) . La IGT se refiere a anormalidades post-prandiales de regulación de glucosa, mientras que la IFG se refiere a anormalidades que se miden en un estado en ayunas. La Organización Mundial de la Salud define valores para IFG como un concentración de glucosa en plasma en ayunas de 6.1 mmol/L (100 mg/dL) o mayor (sangre entera 5.6 mmol/L; 100 mg/dL) , pero menos de 7.0 mmol/L (126 mg/dL) (sangre entera 6.1 mmol/L; 110 mg/dL) . El Síndrome Metabólico de acuerdo a los criterios del Programa de Educación de Colesterol Nacional (NCEP) se define como que tiene por lo menos tres de los siguientes: presión sanguínea 130/85 mm Hg o más alta; glucosa en plasma en ayunas 6.1 mmol/L o más alta; circunferencia de la cintura >102 cm (hombres) o >88 cm (mujeres); triglicéridos 1.7 mmol/L o más alta; y colesterol HDL <1.0 mmol/L (hombres) o 1.3 mmol/L (mujeres).
Las "complicaciones relacionadas con la Diabetes tipo 2" o "complicaciones relacionadas con una condición pre-diabética" pueden incluir, sin limitación, retinopatía diabética, nefropatía diabética, ceguera, pérdida de memoria, falla renal, enfermedad cardiovascular (que incluye enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad de la arteria periférica, enfermedad cerebrovascular , aterosclerosis e hipertensión) , neuropatía, disfunción autonómica, coma hiperosmolar hiperglicémico o combinaciones de las mismas.
Como se utiliza en la presente, el término "HBAlc" se refiere a hemoglobina glucosilada o hemoglobina glucosilada, y es un indicador de niveles de glucosa en la sangre durante un período de tiempo (por ejemplo, 2-3 meses). El nivel de HBAlc se "reduce" si hay una disminución de por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o más del tratamiento con un compuesto descrito en la presente comparado con el nivel de HBAlc antes del inicio del tratamiento en el sujeto. De manera similar, los cuerpos de cetona se "reducen" si hay una disminución de por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o más en el tratamiento con un compuesto descrito en la presente.
Por simplicidad, las porciones químicas son definidas y referidas por toda esta que pueden ser porciones químicas univalentes (por ejemplo, alquilo, arilo, etc.) o porciones multivalentes bajo las circunstancias estructurales apropiadas claras para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, una porción "alquilo" se puede referir a un radical monovalente (por ejemplo CH3-CH2-) , o en otros casos, una porción de enlace bivalente puede ser "alquilo", caso en el cual aquellos expertos en la técnica entenderán que el alquilo va a ser un radical divalente (por ejemplo, -CH2-CH2-), que es equivalente al término "alquileno". De manera similar, en circunstancias en que las porciones divalentes son requeridas y son establecidas como que son "alcoxi", "alquilamino", "ariloxi", "alquiltio", "arilo", "heteroarilo", "heterociclico", "alquilo", "alquenilo", "alquinilo", "alifático" o "cicloalquilo", aquellos expertos en la técnica entenderán que los términos "alcoxi", "alquilamino", "ariloxi", "alquiltio", "arilo", "heteroarilo", "heterociclico", "alquilo", "alquenilo", "alquinilo", "alifático" o "cicloalquilo" se refieren a la porción divalente correspondiente.
El término "halo" se refiere a cualquier radical de flúor, cloro, bromo o yodo.
El término "acilo" se refiere a un sustituyente alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, arilcarbonilo, hetero-ciclilcarbonilo, o heteroarilcarbonilo, cualquiera de los cuales puede ser sustituido adicionalmente por sustituyentes. Los grupos acilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, alcanoilo de (Ci-C6) (por ejemplo, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, caproilo, t-butilacetilo, etc.), cicloalquilcarbonilo de (C3-C6) (por ejemplo, ciclo-propilcarbonilo, ciclobutilcarbonilo, ciclopentilcarbonilo, ciclohexilcarbonilo, etc.), carbonilo heterocíclico (por ejemplo, pirrolidinilcarbonilo, pirrolid-2-on-5-carbonilo, piperidinilcarbonilo, piperazinilcarbonilo, tetrahidrofura-nilcarbonilo, etc.), aroilo (por ejemplo, benzoilo) y heteroaroilo (por ejemplo, tiofenil-2-carbonilo, tiofenil-3-carbonilo, furanil-2-carbonilo, furanil-3-carbonilo, 1H-pirroil-2-carbonilo, lH-pirroil-3-carbonilo , benzo[b]-tiofenil-2-carbonilo, etc.) . Además, la porción alquilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo y heteroarilo del grupo acilo puede ser cualquiera de los grupos descritos en las definiciones respectivas.
El término "alquilo" se refiere a cadenas de hidrocarburo no aromáticas saturadas que pueden ser una cadena recta o cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono (estos incluyen sin limitación metilo, etilo, propilo, alilo o propargilo) , que pueden ser opcionalmente insertados con N, O, S, SS, S02, C(O), C(0)0, OC(O), C(0)N o NC(O) . Por ejemplo, Ci-C6 indica que el grupo puede tener de 1 a 6 (inclusive) átomos de carbono en éste.
El término "alquenilo" se refiere a un alquilo que comprende por lo menos un enlace doble. Los grupos alquenilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, l-metil-2-buten-l-ilo y los similares.
El término "alquinilo" se refiere a un alquilo que comprende por lo menos un enlace triple.
El término "alcoxi" se refiere a un radical de -0-alquilo.
El término "aminoalquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un amino.
El término "mercapto" se refiere a un radical -SH. El término "tioalcoxi" se refiere a un radical -S-alquilo.
El término "arilo" se refiere al sistema de anillo aromático monociclico, biciclico o triciclico en donde 0, 1, 2, 3, o 4 átomos de cada anillo pueden ser sustituidos por un sustituyente . Los grupos arilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, fenilo, naftilo, antracenilo, azulenilo, fluorenilo, indanilo, indenilo, naftilo, fenilo, tetrahidronaftilo y los similares.
El término "arilalquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un arilo.
El término "ciclilo", "cíclico" o "cicloalquilo" se refiere a grupos de hidrocarburo cíclicos saturados y parcialmente no saturados que tienen de 3 a 12 carbonos, por ejemplo, de 3 a 8 carbonos y, por ejemplo, de 3 a 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo adicionalmente puede ser opcionalmente sustituido. Los grupos cicloalquilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, ciclopropilo, ciclo-butilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexe-nilo, cicloheptilo, ciclooctilo y los similares.
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo monociclico de 5-8 miembros, biciclico de 8-12 miembros o triciclico de 11-14 miembros aromático que tiene de 1-3 heteroátomos si monociclicos, 1-6 heteroátomos si biciclicos, o 1-9 heteroátomos si triciclicos, los heteroátomos seleccionados de 0, N, o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6, o 1-9 heteroátomos de N, 0, o S si monociclicos, biciclicos o triciclicos, respectivamente) , en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo pueden ser sustituido por un sustituyente . Los grupos heteroarilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a, piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimi-dinilo, tiofenilo o tienilo, piridazinilo, pirazinilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo, naftiridinilo y los similares .
El término "heteroarilalquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo.
El término "heterociclilo", "heterociclo" o "heterociclico" se refiere a un sistema de anillo monociclico de 5-8 miembros, biciclico de 8-12 miembros o triciclico de 11-14 miembros no aromático que tiene de 1-3 heteroátomos si monociclicos, 1-6 heteroátomos si biciclicos o 1-9 heteroátomos si triciclicos, los heteroátomos seleccionados de O, N, or S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, 0, o S si monocíclicos , bicíclicos o tricíclicos, respectivamente), en donde 0, 1, 2 o 3 átomos de cada anillo pueden ser sustituidos por un sustituyente . Los grupos heterociclilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo y los similares.
El término "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene uno, dos, tres o más átomos de halógeno unidos al mismo. Los grupos haloalquilo ejemplares incluyen, pero no están limitados a clorometilo, bromoetilo, trifluorometilo y los similares.
El término "opcionalmente sustituido" significa que el grupo o porción especificada, tal como un grupo alquilo, arilo, grupo heteroarilo y los similares, es no sustituido o es sustituido con uno o más (típicamente de 1-4 sustituyentes ) independientemente seleccionados del grupo de sustituyentes listados enseguida en la definición para "sustituyentes" o de otra manera especificados.
El término "sustituyentes" se refiere a un grupo "sustituido" en un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo, heteroarilo, acilo, amino en cualquier átomo de ese grupo. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, halo, hidroxi, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, amino, acilamino, alquil-carbanoilo, arilcarbanoilo, aminoalquilo, alcoxicarbonilo, carboxi, hidroxialquilo, alquiltio, CF3, N-morfilino, feniltio, alcanosulfonilo, arenosulfonilo, alcanosulfonamido, arenosulfonamido, aralquilsulfonamido, alquilcarbonilo, aciloxi, ciano o ureido. En algunas modalidades, el sustituyente puede ser por si mismo opcionalmente sustituido. En algunos casos, dos sustituyentes, junto con los carbonos a los cuales están unidos pueden formar un anillo.
Los compuestos descritos en la presente y sus sales incluyen átomos de carbono asimétricos y por lo tanto pueden existir como estereoisómeros solos, racematos y como mezclas de enantiómeros ' y diastereómeros . Típicamente, tales compuestos serán preparados como una mezcla racémica. Si es deseado, sin embargo, tales compuestos se pueden preparar o aislar como estereoisómeros puros, es decir, como enantiómeros o diastereómeros individuales, o como mezclas enriquecidas de estereoisómero . Como es discutido en más detalle enseguida, los estereoisómeros individuales de los compuestos se preparan mediante síntesis de materiales de partida ópticamente activos que contienen los centros quirales deseados o por la preparación de mezclas de productos enantioméricos seguidos por la separación o resolución, tal como conversión a una mezcla de diastereómeros seguida por la separación o recristalización, técnicas cromatográficas, el uso de agentes de resolución quiral o separación directa de los enantiómeros en columnas cromatográficas quirales. Los compuestos de partida de estereoquímica particular son ya sea comercialmente disponibles o son hechos por los métodos descritos enseguida y resueltos por técnicas bien conocidas en la técnica.
Como se utiliza en la presente, los términos "estereoisómero" o "isómero óptico" significan un isómero estable que tiene por lo menos un átomo quiral o rotación restringida dando lugar a planos disimétricos perpendiculares (por ejemplo, ciertos bifenilos, alenos y compuestos espiro) y pueden girar la luz del plano polarizado. Debido a que los centros asimétricos y otra estructura química existen en los compuestos descritos en la presente como adecuados para el uso en la presente invención que pueden dar lugar al estereoisomerismo, la invención contempla estereoisómeros y mezclas de los mismos. El término "enantiómeros" significa un par de estereoisómeros que no son imágenes de espejo superponibles entre sí. El término "diastereoisómeros" o "diastereómeros" significa isómeros ópticos que no son imágenes de espejo entre sí. El término "mezcla racémica" o "racemato" significa una mezcla que contiene partes iguales de enantiómeros individuales. El término "mezcla no racémica" significa una mezcla que contiene partes desiguales de enantiómeros individuales.
El término "enriquecimiento enantiomérico" como se utiliza en la presente, se refiere al incremento en la cantidad de un enantiómero como es comparado con el otro. Un método conveniente para expresar el enriquecimiento enantiomérico logrado es el concepto de exceso enantiomérico, o "ee", que se encuentra utilizando la siguiente ecuación: ee=100x (E1-E2) / (E1+E2) , en donde E1 es la cantidad del primer enantiómero y E es la cantidad del segundo enantiómero.
En algunas modalidades, el compuesto descrito en la. presente tiene un exceso enantiomérico de por lo menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más. Generalmente, un ee de mayor que 90% es preferido, y un ee de mayor que 95% es mucho más preferido y un ee de mayor que 99% es mucho más especialmente preferido.
El enriquecimiento enantiomérico se determina fácilmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica utilizando técnicas y procedimientos estándares, tal como cromatografía líquida de alto desempeño o de gases con una columna quiral. La elección de la columna quiral apropiada, eluyente y condiciones necesarias para efectuar la separación del par enantiomérico está bien dentro del conocimiento de uno de habilidad ordinaria en la técnica. Además, los enantiómeros de los compuestos se pueden resolver por uno de habilidad ordinaria en la técnica utilizando técnicas estándares bien conocidas en la técnica, tales como aquellas descritas por J. Jacques y colaboradores, "Enantiomers , Racemates, and Resolutions" , John Wiley y Sons, Inc., 1981. Ejemplos de resolcuiones incluyen técnicas de recristalización o cromatografía quiral.
Todas las patentes y otras publicaciones identificadas son incorporadas expresamente en la presente por referencia para el propósito de describir y divulgar, por ejemplo, las metodologías descritas en tales publicaciones que podrían ser utilizadas en conexión con la presente invención. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este sentido debe ser considerado como una admisión de que los inventores no están autorizados a la antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos están basadas en la información disponible a los solicitantes y no constituyen cualquier admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.
La presente invención se puede definir en cualquiera de los siguientes párrafos numerados: 1. Un método para incrementar la replicación de célula ß en una población de células pancreáticas, el método que comprende: poner en contacto una población de células pancreáticas con un inhibidor de adenosina quinasa (ADK) , un inhibidor de S-Adenosilhomocisteina hidrolasa (SAHH) o un activador de proteina quinasa activada con AMP (AMPK) . El método del párrafo 1, en donde el inhibidor de adenosina quinasa es de la fórmula (I): Fórmula (I) en donde: R1 es H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, OR5, SR5, N(R6)2, (CH2)mR7, o R1 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R2 y R3 son cada uno independientemente H, OR5, SR5, N(R5)2 o R2 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclilo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R4 es H, halógeno, CN, N2, OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de Ci- C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente. sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es independientemente para cada ocurrencia H, C(0)R7, C(0)OR7, C(0)N(R7)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2_C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido o los dos R5 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros opcionalmente que comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, es R5, OR5, SR5, N(R5)2, N2, CN, s independientemente para cada ocurrencia H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-Ce opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; X es 0, S, NH o CH2; Y y Z son cada uno independientemente N o CR8; R8 es independientemente para cada ocurrencia H, halógeno, CN, C(0)R7, C(0)0R7, C(0)N(R )2, alquilo de C 1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Z1 es independientemente para cada ocurrencia O o S; Z2 es independientemente para cada ocurrencia OM, SM, OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; M es un catión de metal alcalino; m es 1, 2, 3 o 4 ; n es 0, 1 o 2; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo.
El método del párrafo 1, en donde el inhibidor de adenosina quinasa es de la fórmula (II) : Fórmula (II) en donde: cada R9 es independientemente H, alquilo de Ci~C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, o los R9 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que opcionalmente comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O o S; R10, R11 y R12 son cada uno independientemente H, OR14, N(R14)2, N2, N02, CN, halógeno, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es independientemente para cada ocurrencia halógeno, CN, NH2, o alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido; es H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, o los dos R14 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que opcionalmente comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, 0 o S; es N o CR15; es NHR16, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R16 es H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Y2 es N o CH; q es 0, 1, 2 o 3; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo. El método de cualquiera de los párrafos 1-3, en donde la IC50 del inhibidor de ADK es de menos de o igual a 500nM, 250nM, 200nM, ?????, 75n , 50nM, 25nM, ????, InM, O.llnM, O.OlnM, O.OOlnM.
El método de cualquiera de los párrafos 1-4, en donde la actividad de ADK se inhibe o disminuye por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 100% (por ejemplo pérdida completa de actividad) con relación a un control no inhibido.
El método de cualquiera de los párrafos 1-5, en donde el inhibidor de ADK se selecciona del grupo que consiste de aristeromicina, 5' -deoxiadenosina, 5' -aminoadenosina, 5'-deoxi-5-yodotubercidina, 5-yodotubercidina (A10), 7-deaza-7-yodo-2' , 3' -dideoxiadenosina, nor-risteromicina, nor-tubercidina, A-134974, Toyocamicina, GP-515 ( (2R, 3R, S, 5R) -2- ( 4-amino-3-bromo-lH-pirazolo [ 3 , 4-d] piri-midin-l-il) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3, 4-diol) , GP-3269 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4- (4-fluorofenilamino) -5-fenil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il) -tetrahidro-5-metilfuran-3, 4-diol), GP-683 ( (2R, 3S, 4R, 5R) -tetrahidro-2-metil-5- (5-fenil-4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) -furan-3, 4-diol) , GP-947 ( (2S, 3S, 4R, 5R) -tetrahidro-2-metil-5- ( 5-fenil-4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2 , 3-d] pirimi-din-7-il) furan-3, 4-diol) , ABT-702 ( 5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina, B8), compuesto 1 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-amino-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) -5- (aminometil) -tetrahidro-furan-3, 4-diol) , compuesto 2 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4-cloro-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3, -diol) , compuesto 3 ( ( 1S, 2R, 3S, 5R) -3-amino-5- ( 6-amino-9H-purin-9-il) ciclopentano-1, 2-diol) , compuesto 4 ( (1S, 2R, 3S, 5R) -3-amino-5- (7-amino-3H- [1, 2, 3] -triazolo [4, 5-d] pirimidin-3-il) ciclopentano-1, 2-diol) , compuesto 5 ( (1S, 2R, 3S, 4R) -4- (4-amino-5-yodo-7H-pirrolo- [2, 3-d] pirimidin-7-il) ciclopentano-1, 2, 3-triol) compuesto 6 (7- ( 4- (dimetilamino) fenil) pteridin-4-amina) , compuesto 7 (5- (3-bromofenil) -7- (4- (dimetilamino) fenil) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amine) , compuesto 8 (5- (2-bromobencil) -7- (6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 9 (5-ciclohexil-7- (6-morfolinopiridin-3-il) -pirido[2, 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 10 (5-(tetra-hidro-2H-piran-4-il) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il ) pirido- [2 , 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 11 (5- (1- (2-bromo-fenil) etil) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] piri-midin-4-amine) , compuesto 12 (5- (2-metilpent-4-en-2-il) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il ) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 13 (N5- ( (lH-indol-3-il)metil) -7- (6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin- , 5-diamina) y combinaciones de los mismos.
El método del párrafo 1, en donde el activador de AMPK es de la fórmula en donde : R17 es H, alquilo de Ci~C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, OR22, SR22, N(R22)2, (CH2)mR23 o R17 y R18 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R18 y R19 son cada uno independientemente H, OR22, SR22, N(R22)2, o R18 y R19 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R20 y R21 son cada uno independientemente halógeno, CN, N2, OR22, SR22, N(R22)2, C(0)R24 C(0)OR24 C(0)N(R2 )2, alquilo de Ci-Ce opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R22 es independientemente para cada ocurrencia H, C(0)R24, C(0)OR24, C(0)N(R24)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; R23 es R22, OR22, SR22, N(R22)2, N2, CN, halógeno, o R 524 es independientemente para cada ocurrencia H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; X es O, S, NH o CH2; Y y Z son cada uno independientemente N o CR25; R25 es independientemente para cada ocurrencia H, halógeno, CN, C(0)R24, C(0)OR24, C(0)N(R24)2, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Z1 es independientemente para cada ocurrencia O o S; Z2 es independientemente para cada ocurrencia H, OM, SM, OR22, SR22, N(R22)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; M es un catión de metal alcalino; m es l, 2, 3 o 4 ; n es O, l o 2; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo. El método del párrafo 1 o 7, en donde la actividad de la quinasa activada con AMP se incrementa por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más con relación a un control no activado.
El método de cualquiera de los párrafos 1, 7 o 8, en donde la EC50 del activador de AMPK es de menos de o igual a 500nM, 250nM, ?????, 50nM, ????, InM, O.llnM, . OlnM o O.OOlnM.
El método de cualquiera de los párrafos 1, 7-9, en donde el activador de AMPK es ribonucleósido de 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICAR) .
El método del párrafo 1, en donde la IC50 del inhibidor de SAHH es de menos de o igual a 500nM, 250nM, 200nM, ?????, 75nM, 50nM, 25??, ??? , InM, O.llnM, O.OlnM, 0. OOlnM.
El método del párrafo 1 o 11, en donde la actividad de SAHH se inhibe o disminuye por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 100% (por ejemplo pérdida completa de actividad) con relación a un control no inhibido.
El método de cualquiera de los párrafos 1, 11 o 12, en donde el inhibidor de SAHH se selecciona del grupo que consiste de 9 (S) - (2, 3-dihidroxipropil) adenina [ ( S ) -DH PA ] ; D-eritadina; ácido (R, S) -3-adenina-9-il-2-hidroxipropa-nócico [ (R, S) -AHPA] ; adenosina ( Ado ) dialdehido; 3-deazaadenosina (c3-Ado) ; aristeromicina (Ari) ; neplanocina A ( N PA o NpcA) ; dihidroxiciclopenteniladenina (DHCeA) ; dihidroxiciclopentenil-3-deazaadenina (c3-DHCeA) ; dihidroxiciclopentaniladenina (DHCaA); dihidroxi-ciclopentanil-3-deazaadenina (c3-DHCaA) ; 3-deazano-planocina A (c3-NpcA ) ; 3-deazaaristeromicina (c3Ari) ; 3-deazaadenosina carbociclica (C-c3Ado) ; 6' -Cmetilne-planocina A; 2' -deoxiadenosina; tubercidian; ribavirin; piraazofurina; 2' -deoxi-2' -cloroadenosina; isopentenil-adenosina; metiltioadenosina (MTA) ; 9~ -arabinofurano-siladenina (Ara-A, vidarabina) ; 2' -Deoxiadenosina; N- metilaristeromicina, 8-azaaristeromicina y 3-deazaaris-teromicina y su dialdehido y derivados de diol; (+)-5Noraristeromicina y su 2, 6-diamino-análogo; 2' -deoxi-aristeromicina; 3' -deoxi-aristeromicina; 3 ' -amino-3 ' -deoxi-aristeromicina; 3' -amino-3' -deoxiarabinofuranosil-aristeromicina; 6' -hidroxi-aristeromicina; 6' -mercapto-aristeromicina, 8' -bromo-aristeromicina; 8-hidroxi-aristeromicina, fosfato aristeromicin-3' -cíclico, fosfato aristeromicin-6' -cíclico; 2-fluoro-S-adenosilhomocisteína (2-FSAH) ; sulfóxido de S-Adenosil-L-homocisteína; sulfona de S-Adenosil-Lhomocisteína; S-aristeromicinil-L-homocisteína; 5 ' -S- ( 3-carboxil- -nitrofenil ) tioadeno-sina; 5' -S (metil) -5' -S- (butil) tioadenosina; y cualquiera de las combinaciones de los mismos.
El método de cualquiera de los párrafos 1-13, en donde las células pancreáticas son de un sujeto y en donde el sujeto están en necesidad de células ß adicionales.
El método de cualquiera de los párrafos 1-14, en donde las células pancreáticas son de un sujeto y en donde el sujeto no está en necesidad de células ß adicionales.
El método de cualquiera de los párrafos 1-15, en donde el sujeto es un mamífero.
El método de cualquiera de los párrafos 1-16, en donde el sujeto es un humano.
El método de cualquiera de los párrafos 1-16, en donde el sujeto es un ratón. 19. El método de cualquiera de los párrafos 1-18, en donde las células pancreáticas son células pancreáticas primarias . 20. El método de cualquiera de los párrafos 1-19, en donde las células pancreáticas se derivan de células desdiferenciadas . 21. El método de cualquiera de los párrafos 1-20, en donde el contacto es in vitro. 22. El método de cualquiera de los párrafos 1-20, en donde el contacto es ex vivo. 23. El método de cualquiera de los párrafos 1-20, en donde el contacto es in vivo. 24. El método del párrafo 23, en donde el contacto in vivo es en un mamífero. 25. El método del párrafo 24, en donde el contacto in vivo es en un ratón. 26. El método del párrafo 24, en donde el contacto in vivo es en un humano. 27. El método del párrafo 23, en donde el contacto in vivo es en un sujeto, donde el sujeto está en necesidad de células ß adicionales. 28. El método del párrafo 27, en donde el sujeto sufre de diabetes Tipo 1. 29. El método del párrafo 27, en donde el sujeto sufre de diabetes Tipo 2.
El método del párrafo 27, en donde el sujeto es un mamífero.
El método de cualquiera del párrafo 27-30, en donde el sujeto es un humano.
El método de cualquiera de los párrafos 1-31, en donde la replicación de célula ß se incrementa por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más con relación a un control.
Un ensayo de alto rendimiento para clasificar compuestos que incrementan la replicación de célula ß en una población de células pancreáticas, el ensayo que comprende : (a) poner en contacto una población o preparación de células pancreáticas con un compuesto de prueba, en donde las células pancreáticas son células pancreáticas primarias; (b) estimar la replicación o crecimiento de célula beta; y (c) seleccionar el compuesto que incrementa o aumenta la replicación o crecimiento de célula ß.
El ensayo del párrafo 33, en donde las células pancreáticas se cultivan en un recipiente de cultivo celular, la superficie del cual se recubre con medios acondicionados de linea celular de carcinoma de vejiga de rata 804G.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-34, en donde la etapa de estimar la replicación de célula beta comprende detectar un marcador de célula beta y un marcador de replicación de célula.
El ensayo del párrafo 35, en donde el marcador de replicación de célula es Ki-67 o PH3.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 35-36, en donde el marcador de célula ß se selecciona del grupo que consiste de PDX-1, insulina, c-péptido, amilina, E-cadherina, ???3ß, PCI/3, Beta2, Nkx2.2, Nkx6.1, GLUT2, PC2, ZnT-8, MAFA, MAFB y combinaciones de los mismos.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 35-37, en donde el marcador de célula ß es PDX-1.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 35-38, en donde el marcador de célula ß no es insulina.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-39, en donde el compuesto de prueba tiene una concentración en el intervalo de O.ln a lOOOmM.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-40, en donde el ensayo se realiza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 15°C a aproximadamente 55°C.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-41, en donde el compuesto de prueba se pone en contacto con las células pancreáticas por al menos 1 hora.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 30-42, en donde el compuesto de prueba incrementa la replicación o crecimiento de célula beta por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más alta con relación a un control no tratado .
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-43, en donde las células pancreáticas no son lineas de células pancreáticas .
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-44, en donde la población de células pancreáticas es un islote de Langerhan o un fragmento del mismo.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-45, en donde las células pancreáticas son células pancreáticas ß primarias.
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-46, en donde las células pancreáticas se dejan adherir a la superficie del recipiente de cultivo celular durante aproximadamente 12 a 48 horas antes del contacto con el compuesto de prueba .
El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-47, en donde las células pancreáticas se derivan de células desdiferenciadas . 49. El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-48, en donde las células des-diferenciadas son células madre pluripotentes inducidas. 50. El ensayo de cualquiera de los párrafos 33-49, el ensayo que comprende : (a) tripsinizar islotes de Langerhans en agrupaciones celulares de 1-3 células; (b) dejar que las células se recuperen durante la noche ; (c) colocar en placa las células de la etapa (b) en las cavidades de una placa de 96 cavidades, en donde las cavidades se recubren con medio acondicionado 804G y la densidad de colocación en placa celular es 60k células/cavidad; (d) dejar que las células se adhieran a la superficie de las cavidades durante 48 horas; (e) poner en contacto ?µ? del compuesto de prueba con las células beta durante 24 horas; (f) manchar las células con anticuerpo PDX-1 y anticuerpo i-67 y/o PH3; (g) estimar la replicación de célula beta; y (h) seleccionar el compuesto que incrementa o aumenta la replicación de célula ß.
Al grado que no se ha indicado, será entendido por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que cualquiera de las diversas modalidades descritas en la presente e ilustradas se pueden modificar adicionalmente para incorporar características mostradas en cualquiera de las otras modalidades divulgadas en la presente.
Los siguientes ejemplos ilustran algunas modalidades y aspectos de la invención. Sera evidente para aquellos expertos en la técnica relevante que varias modificaciones, adiciones, sustituciones y los similares se pueden realizar sin alterar el espíritu o alcance de la invención y tales modificaciones y variaciones están abarcadas dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones que siguen. Los siguientes ejemplos de ninguna manera limitan la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Ensayo de clasificación.
Los islotes de rata se aislaron como es descrito previamente en Gotoh M, Maki T, Kiyoizumi T, Satomi S, Monaco ??: An improved methodfor isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation 40:437-438, 1985, los contenidos del cual son incorporados en la presente por referencia en su totalidad. Los islotes aislados se cultivaron durante la noche en una incubadora de cultivo de tejido. En la mañana siguiente, los islotes se tripsinizaron en agrupaciones celulares de 1-3 células, se re-suspendieron en medio de islote (Mediatech 99-786-CV; suero FBS al 10% (Valley Biomedial BS3033) Glucosa 8.3 mM (Sigma G7528); IX Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen 15070-063); IX Glutamax (Invitrogen 35050-079)) y se colocaron en las cavidades de una placa de 96 cavidades (Sigma CLS3904) que se ha recubierto con medio acondicionado 804G (una linea celular de carcinoma de vejiga de rata). La densidad de la colocación en placa celular fue 60k células/cavidad y mayor que 95% de la viabilidad se confirmó en el tiempo de la colocación en placa. Las células del islote se dejaron 48 horas para adherirse, tiempo en el cual el medio se cambió (Mediatech 99-786-CV suero al 2%, glucosa 5mM, IX pen/strep, IX glutamax) y las células se trataron con los compuestos de prueba. Para la clasificación, los compuestos se probaron en concentración luM en duplicado. Después de 24 horas de tratamiento con el compuesto, las células se fijaron con PFA al 4% fresco (Electron Microscopy Services 15710) durante 20 minutos y se lavaron con PBS (VWR 45000-446) . La recuperación de antígeno se realizó al calentar las células a 90 grados Celsius en EDTA 0.1 mM (Ambion AM9260G) en PBS. Las células luego se lavaron y se permeabilizaron con PBS/Triton X-100 al 0.3% (J.T. Baker X198-07) durante 15 minutos. El manchado inmunocitoquímico luego se realizó como sigue. El bloqueo de antigeno se realizó con suero de asno normal al 5% (Jackson ImmunoResearch 017-000-121) en PBS durante una hora. El manchado se realizó mediante incubación durante la noche con anticuerpo primario a 4 grados Celsius. Para la clasificación primaria, el anticuerpo PDX-1 (R&D AF2419) se utilizó para revelar las células beta y anticuerpo ki-67 (BD Bioscience 556003) para visualizar las células proliferantes. Sin desear que sea limitado por alguna teoria, la falla de las clasificaciones de replicación de célula beta anteriores es principalmente una consecuencia de utiliza un marcador citoplásmico (Insulina) como el identificador de célula ß. El uso de un marcador citoplásmico previene la atribución precisa de la replicación nuclear a una identidad celular especifica es decir, en cultivo denso es imposible atribuir un citoplasma a un núcleo especifico dada la proximidad a múltiples núcleos. Los anticuerpos inmunohistoquímicos adicionales incluyen Fosfohistona 3 (Millipore 06-570), Insulina (Dako A0564), Glucagón (Millipore 4031-01F) y Vimentina (Millipore ab5733) . Para los anti-cuerpos de manchado de western incluyeron ADK (Abeam ab38010, ab64825) y RAN (BD Bioscience 610340) como un control de carga.
Una vez que las células del islote tratadas con el compuesto se mancharon, la replicación de célula ß se estimó por la vía de la adquisición y análisis de imagen automatizada utilizando un Cellomics ArrayScanVTI . Los umbrales/ parámetros de adquisición se establecieron tal que las llamadas basadas por computadora de eventos de replicación fueron consistentes con llamadas basadas de humano. Los parámetros utilizados se dirigieron a la identificación de (1) células PDX-1+ y (2) manchado positivo de ki-67 dentro del área positiva de PDX-1. El algoritmo fue un proceso de tres etapas. Primero el área nuclear se predijo por el software basado en el patrón de manchado de PDX-1 esperado. Segundo las células positivas de PDX-1 (objetos seleccionados) se contaron basado en la intensidad de manchado promedio dentro del área nuclear predicha (Nota: la intensidad de señal total fue esencialmente igual en calidad pero no se utilizó típicamente) . Tercero, el número de células positivas de PDX-1 (objetos seleccionados) que simultáneamente fueron posistivos de Ki-67 se determinó al determinar la intensidad de fluorescencia promedio del manchado de ki-67 dentro del área nuclear predicha (nuevamente, la intensidad total también se utilizó ocasionalmente con igual eficacia) . Los umbrales específicos (intensidades de fluorescencia) variaron de experimento a experimento. En general, la velocidad de replicación basal se estableció a aproximadamente 1% es decir, el algoritmo fue variado hasta que 1% de células PDX+ tratadas con DMSO se reportaron que son doble positivo para PDX-1 y ki67. Las librerías de alto contenido que se clasificaron incluyeron una librería de inhibidor de quinasa (aproximadamente 300 compuestos), una librería de canabinoide (80 compuestos), una librería de hormona (80 compuestos) y una librería de inhibidor de fosfodiesterasa (40 compuestos) . En total se probaron aproximadamente 500 compuestos. Los compuestos de acierto se compraron subsecuentemente (A10, 5-yodotubercidina (Calbiochem 407900); ABT-702 (B8, Sigma A2721)) y se confirmaron en curvas de dosis y otros estudios. En el ensayo de clasificación, una inducción de 2.3 veces de replicación de célula ß se observó para el compuesto correspondiente a A10 (datos no mostrados) . Aunque los compuestos D7 y F3 también mostraron más de 2 incrementos de desviación estándar en fluorescencia, estos dos compuestos se observaron que son auto-fluorescentes.
Ejemplo 2: Inducción de PH3 por ?10 y B8.
Utilizando un protocolo similar como es descrito en el Ejemplo 1, las células ß se trataron con A10 (2µ?) , o B8 (15µ?) . El anticuerpo de fosfohistona 3 (Millipore 06-570) se utilizó para visualizar las células proliferantes. Como se puede observar en la Fig. 1, tanto A10 como B8 incrementaron la relación de PH3 sobre PDX-1 con relación a un tratamiento de DMSO de control.
Ejemplo 3 : A10 específicamente incrementa la replicación de células .
Utilizando un protocolo similar como es descrito en el Ejemplo 1, las células ß o fibroblastos dérmicos de ratón se trataron con 10 uM, 5 uM, 2.5 uM, 1.25 uM, 0.625 uM, 0.3125 uM, 0.156 uM, 0.078uM, 0.04 uM o 0.019 uM de A10. Como se observa en la Fig. 2a, el % de células ß positivas de Ki-67 se observaron que se incrementan en una manera dependiente de dosis. Sin embargo, como se observa en la Fig. 2b, el % de fibroblastos dérmicos de ratón de positivos de Ki-67 positivos no cambiaron en el tratamiento con A10. Estos resultados son consistentes con la poca o nada de expresión de ADK en fibroblastos de ratón con relación a islotes de ratón como se observa a partir del análisis de manchado de Western (datos no mostrados) .
Ejemplo 4 : Curva de dosis de B8.
Utilizando un protocolo similar como es descrito en el Ejemplo 1, las células ß se trataron con 30 uM, 15 uM, 7.5 uM, 3.75 uM, 1.875 uM, 0.94 uM, 0.47 uM o 0.23 uM de B8. Como se observa en la Fig. 3, el % de células positivas de PDX-1 y Ki-67 se incrementó de una manera dependiente de dosis en el tratamiento con B8.
Ejemplo 5: Curso de tiempo del tratamiento con A10 y B8.
Utilizando un protocolo similar como es descrito en el Ejemplo 1, las células ß se trataron con A10 (2µ ) o B8 (15µ ) . La inducción de Ki-67 con relación al control de DMSO se midió en diferentes puntos de tiempo. Los compuestos se adicionaron en el dia 0 y el medio se cambió en el dia 2. Los resultados se muestran en la Fig. 4.
Ejemplo 6: Efecto de concentración de suero en el tratamiento con A 0.
Utilizando un protocolo similar como es descrito en el Ejemplo 1, las células ß se trataron con A10 (2µ?) en medio de cultivo que comprende diferente 0.2%, 2.0% o 20% de suero. Como se observa en la Fig. 5, en las muestras tratadas con A10, el % de células positivas de Ki-67 se incrementó con la concentración de suero incrementada. Por otra parte, en las muestras tratadas con DMSO, el % de células positivas de Ki-67 disminuyó con la concentración de suero incrementada. Ejemplo 7: Efecto de glucosa en el tratamiento con A10.
Utilizando un protocolo similar como es descrito en el Ejemplo 1, las células ß se trataron con 2 µ? de A10 o DMSO en el medio de cultivo que comprende 25 mM, 20 inM, 15 mM, 12.5 mM, 10 mM, 8 mM , 6 mM , 4 mM , 1 mM o 0 mM de glucosa. Como se observa en la Fig. 6, la concentración de glucosa tuvo poco efecto en el % de replicación de célula beta en las muestras tratadas con A10 o DMSO.
Ejemplo 8 : Efecto de adenosina en la replicación de célula B .
Para probar si el efecto de A10 en la replicación de célula ß fue debido a un incremento en la concentración de adenosina en las células, los islotes de rata se trataron con lOOOuM, 330uM, llOuM, 37uM, 12uM, 4uM, 1.4uM, 0.46uM, 0.156uM o 0.05uM de adenosina. Como se observa en la Fig. 7, la adenosina tuvo poco efecto en el % de células que expresan PDX-1 y Ki-67.
Ejemplo 9: Efecto de antagonistas del receptor de adenosina en el aumento de la replicación de célula ß con A10.
Para probar si el efecto de AlO fue mediado por el receptor de adenosina las células ß se trataron con 5 uM, luM, 0.2 uM o 0.04 uM de AlO o DMSO en medio de cultivo que comprende diferentes concentraciones de antagonistas del receptor de adenosina Teofilina, CPT, cafina, Allox y MRS . Los resultados se muestran en la Fig. 8a y 8b. Como se observa en la Fig. 8b, los antagonistas de adenosina a 0.2µ? tuvieron poco efecto en el incremento de veces de la replicación de célula beta con el tratamiento de AlO.
Ejemplo 10: Activación de AMPK.
Se postuló que A10 conduce al incremento en la replicación de célula ß al activar indirectamente AMPK. Para probar esto, las células ß se trataron con A10 (2µ?) , activador AICAR de AMPK (3.3µ?). Como se observa en la Fig. 9, la activación de AMPK con AICAR conduce a un incremento en el % de replicación de célula ß.
Ejemplo 11: Efecto de inhibición de AMPK en el aumento de replicación de célula fi con A10.
El efecto de inhibición de AMPK con Cpd C se probó en el aumento de replicación de célula ß con A10. Como se observa en la Fig. 10, la inhibición de AMPK con Cpd C (10µ?) conduce a una disminución en la replicación de célula beta con relación a los controles no inhibidos.
Ejemplo 12: Replicación de célula ß in vivo.
Animales hembra C57/B6 de 12 semanas de edad se inyectaron con BRDU 10ul/g (Sigma B5002) y ya sea con ABT-702 (21 mg/kg) o vehículo de DMSO. 24 horas del post tratamiento, los animales se sacrificaron y el páncreas se fijó, se seccionó y se manchó por PDX-1 y BRDU (Amaersham RPN202) . Cada cuarta sección se incluyó en el análisis y un mínimo de 2000 PDX-1+ por animal se contaron. Los resultados se muestran en la Fig. 12.
Ejemplo 13: La inhibición de adenosina quinasa selectivamente promueve la replicacion de célula ß del islote Aislamiento del islote y protocolo de clasificación primaria: Los islotes de rata y ratón se aislaron como es descrito previamente. (M. Gotoh y colaboradores, Transplantation 43, 725-730 (1987)). Todo el trabajo animal se aprobó y se llevó a cabo de acuerdo con el comité de cuidado y uso de animales institucionales de los inventores. Los islotes porcinos se proporcionaron por VitaCyte ( Indianapolis, ID) . Los islotes se incubaron (37°C, CO2 al 5%) durante la noche en medio del islote ( ediatech 99-786-CV; suero de FBS al 10% (Valley Biomedial BS3033) ; Glucosa 8.3 mM (Sigma G7528); IX Penicilina/Estreptomicina (Invitrogen 15070-063); IX Glutamax (Invitrogen 35050-079)). En la mañana siguiente, los islotes se tripsinizaron en agrupaciones celulares de 1-3 células, se re-suspendieron en medios del islote y se colocaron en placa en las cavidades de una placa de 96 cavidades (Sigma CLS3904) que se han recubierto con medio acondicionado de 804G (una linea celular de carcinoma de vejiga de rata) . La densidad de la colocación en placa celular fue 60k células/cavidad y mayor que 95% de viabilidad se confirmó en el tiempo de la colocación en placa. Las células del islote se dejaron 48 horas para adherirse tiempo en el cual el medio se cambió (como en lo anterior, excepto suero al 2%, glucosa 5mM) y las células se trataron con el compuesto. Para clasificación, los compuestos se probaron a concentraciones de ?µ? y ??µ? en duplicado en una sola ocasión. Después de 24 horas de tratamiento del compuesto, las células se fijaron con PFA al 4% fresco. La recuperación de antigeno se realizó al calentar las células a 90 grados Celsius en EDTA 0.1 M en agua destilada. Las células luego se lavaron y se permeabilizaron con PBS/Triton X-100 al 0.3% (J.T. Baker X198-07) durante 15 minutos. El manchado inmunocitoquimico luego se realizó como sigue. El bloqueo de antigeno se realizó con suero de asno normal al 5% (Jackson ImmunoResearch 017-000-121) en PBS durante una hora. El manchado se realizó mediante incubación durante la noche con anticuerpo primario en PBS a 4 grados Celsius. Para la clasificación primaria, se utilizó anticuerpo PDX-1 (R&D AF2419; 1:300) para revelar células beta y anticuerpo ki-67 (BD Bioscience 556003, 1:300) para visualizar células proliferantes .
La replicación de célula ß se estimó por la via de la adquisición y análisis de imagen automatizada utilizando un Cellomics ArrayScanVTI . Los umbrales/parámetros de adquisición se establecieron tal que las llamadas basadas por computadora de eventos de replicación fueron consistentes con las llamadas basadas de humano. Las librerías de alto contenido que se clasificaron incluyeron una librería de inhibidor de quinasa (aproximadamente 300 compuestos) , una librería de canabinoide (80 compuestos) , una librería de hormona (80 compuestos), una librería de inhibidor de fosfodiesterasa (40 compuestos) y una porción de la Colección Clínica NIH (250 compuestos) . Todos los compuestos orgánicos se suspendieron en DMSO y se utilizaron a una dilución mínima de 1:1000. Subsecuentemente, los compuestos se compraron de una variedad de vendedores: 5-yodotubercidina (Calbiochem 407900); ABT-702 (Sigma A2721; Tocris) ; Aristeromicina (Sigma A0928) y didesoxi-7-yodo-dezaadenosina (chem-ipex 15132) . Los experimentos de replicación de célula ß con Exendina-4 (Sigma E7114) y GLP-1 (AbCam, ab50245) se realizaron como es descrito en lo anterior, los experimentos de replicación de célula ß con glucosa se realizaron como en lo anterior con modificación de la concentración de glucosa y duración de cultivo. En todos los cultivos extendidos, el medio se cambió cada 48h.
Inmunohistoquímica: Una variedad de poblaciones celulares se identificaron mediante marcadores inmunohistoquimicos : célula ß (anti Insulina de Cerdo de Conejillos de Indias; Dako, A0564); células (anti Glucagón de conejillos de Indias; Millipore, 4031-01F) ; células PP (anti Polipéptido Pancreático de Conejo; Pierce, PAI-36141); células d (anti Somatostatina de Conejo; Dako, A0566) y fibroblastos (anti Vimentina de Pollo; Millipore, AB5733) . La Adenosina Qinasa (ADK) con anticuerpo especifico N-terminal (pAB a ADK de Conejo; Abeam, ab38010-100) se utilizó para la inmunoflourescencia de adenosina quinasa. El anticuerpo ADK utilizado para la inmunoflourescencia se validó por la transfección transiente de células Cos-7 (ATCC; CRL-1651) con un cDNA de ADK ( Invitrogen; ) . Los anticuerpos adicionales incluyeron anticuerpo Fosfohistona 3 (Millipore 06-570), BRDU.
Cuantificación del numero de células ß: Para cuantificar el número de células ß a Oh, 96h y 144h de cultivo, las células se colocaron en placas de 96 cavidades como en lo anterior en la presencia de un vehículo solamente o 5-IT y glucosa 15mM; la dilución de DMSO final fue 1:1000 en todas las cavidades. El tiempo Oh fue después de que las células se han dejado 48h para adherirse. Cada condición se representó por 16 cavidades separadas por placa para acomodar fluctuaciones pequeñas en la densidad de la colocación en placa. Los cambios de los medios se realizaron cada 48h. Las células se fijaron en el punto de tiempo apropiado y se almacenaron para ser manchadas simultáneamente por PDX-1. El conteo celular automatizado se realizó utilizando el Cellomics ArrayScanVTI que identificó células PDX-1+.
Ensayo de BRDU: Las células del islote se colocaron en placa como en lo anterior y se dejaron 48h para adherirse. El medio se cambió e incluyó BRDU y DMSO o 5-IT (2µ ) o ABT-702 (15µ?) . Después de 48h, las células se lavaron y se adicionó el medio regular. Los cultivos se dejaron otras 48h de crecimiento antes de ser fijados. La recuperación de antigeno se realizó al calentar a 90°C durante 10 minutos en EDTA 0.1M. El manchado se realizó utilizando inmunofluorescencia de PDX-1 (como en lo anterior) para identificar células ß y un equipo de manchado de BRDU (Amersham, RPN20) para identificar células replicantes. El análisis de imagen cuantitativo se realizó utilizando un Cellomics ArrayScanVTI para contar el porcentaje de células PDX-1+ que también fueron BRDU+.
Bloqueo de ADK: El sistema de expresión Block-iT poIII miR RNAi con EmGFP (Invitrogen, K4938-00) se utilizó para el bloqueo lentiviral de ADK. La concentración viral se realizó utilizando el equipo Fast-Trap (Millipore, FTLV00003) . Varios miRNAs dirigidos con ADK se probaron utilizando transducción lentiviral estable de la linea celular de hepatoma H4IIE de rata (ATCC, CRL-1600) seguido por la evaluación de niveles ADK por manchado de western. La secuencia mucho más efectiva (Superior: 5' -TGCTGAAGAACTGGCTAA TGAACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTTCAAGCCAGTTCTT (SEC ID NO: 1); Fondo: 5 ' -CCTGAAGAACTGGCTTGAACGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCG TTCATTAGCCAGTTCTTC (SEC ID NO: 2)) se seleccionó para el uso en experimentos de célula del islote. La secuencia de control negativa fue (Superior: 5' -TGCTGGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTT GGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT (SEC ID NO: 3); Fondo: 5'-CCTGGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACA TTTC (SEC ID NO: 4)). Los cultivos de célula del islote de rata dispersados (como en lo anterior) fueron transducidos en un formato de 96 cavidades iniciando 48 horas después de la colocación en placa. El virus concentrado se utilizó para infectar serialmente cultivos del islote durante el curso de 48h seguido por un periodo de cultivo de 4 días antes de la fijación celular. El Cellomics ArrayScanVTI se utilizó para cuantificar la intensidad de fluorescencia y determinar una variedad de parámetros: la eficiencia de transducción viral (DAPI+, GFP+) , el porcentaje de células que expresan ADK (DAPI+,ADK+) , la velocidad de replicación de células células ß infectadas (GFP+, PDX-1+, ki-67+) y células ß no infectadas (GFF, PDX-1+, ki-67+) . La expresión de ADK se determinó por manchado de western utilizando un anticuerpo específico C-terminal para detectar tanto la isorforma larga como corta (Abgent, AP7091bf 1:100).
Aislamiento y proliferación de hepatocitos : Los hepatocitos se aislaron utilizando una técnica de perfusión de colagenasa de dos etapas como es descrita previamente y se cultivaron en medio E de William suplementado con FBS al 10%, hEGF (40 ng/ml; R&D Systems 236-EG-200) ) y mHGF (20 ng/ml; R&D Systems 2207-HG-025) . (P. O. Seglen, Methods in cell biology 13, 29-83 (1976)). Los cultivos fueron tratados con compuesto durante la noche como es indicado en lo anterior y luego se fijaron y se mancharon. El número de células total se estimó con DAPI y las células replicantes fueron ki-67+. El Cellomics ArrayScanVTI se utilizó para adquisición y análisis de imagen.
Cuantificación de la replicación in vivo: Animales hembra C57/B6 de 12 semanas de edad se inyectaron con BRDU (Sigma B5002; 10 ul/g) y con ya sea vehículo ABT-702 (21mg/kg) o DIVISO. 24 horas de post tratamiento, los animales se sacrificaron y los órganos pertinentes se recolectaron. Todos los experimentos se realizaron con un mínimo de 4 animales por grupo de tratamiento. Cada cuarta sección de 12 µ se utilizó para el análisis y un mínimo de 2, 000 células ß, células exocrinas y hepatocitos por órgano por animal se contaron. El análisis se realizó por adquisición de foto manual y conteo celular. Las células ß se identificaron por ya sea el manchado de PDX-1 o manchado de insulina con resultados similares. Las células exocrinas fueron aproximadas al contar todos los núcleos fuera de la estructura del islote. Una minoría de estas células no fueron células exocrinas. Los hepatocitos se identificaron como células DAPI+ albúmina* (Betil Laboratories, A90-234A) . Las células de división fueron BRDU+ (Amaersham RPN202) .
Estadística: Los datos se presentan como la media de múltiples replicados (mínimo de 4 cavidades por punto de dato mostrado) realizados simultáneamente. Todos los resultados experimentales presentados se repitieron mayor que dos veces. Las barras de error muestran la desviación estándar a menos de que sea especificado de otra manera. Los resultados se compararon utilizando la prueba t de dos colas. La EC50 se calculó utilizando la regresión no lineal con la velocidad de replicación superior restringida.
Resultados Desarrollo y desempeño de un ensayo de replicación de célula ß primaria de alto rendimiento: Para identificar los compuestos que incrementan la replicación de célula ß la invención proporciona una plataforma de clasificación utilizando células del islote de rata recién aisladas (Fig. 21) . Aunque el uso de células primarias limita el suministro de células ß y podría ser esperado introducir la variabilidad del comportamiento, este procedimiento maximiza la retención de características metabólicas in vivo que son pertinentes para el comportamiento mitótico de células ß. (Y. Zimmer y colaboradores, FEBS letters 457, 65-70 (1999)). Estos cultivos dispersados contuvieron ~75% de células ß (PDX-1+) , ~18% de células (glucagon"1") , ~3% de fibroblastos (vimentina"1") y -5% de otros tipos de células. Las células del islote de rata dispersadas se mancharon inmunofluores-centemente para el factor de transcripción de célula ß PDX-1, glucagon de hormona de célula alfa, marcador de fibroblastos vimentina y DNA en combinación (datos no mostrados) . Los porcentajes se obtuvieron mediante la adquisición y análisis de imagen automatizada (n=80 imágenes de una preparación del islote de rata representativa) . La desviación estándar para todos los valores fue menos de 10%. Las células PDX-1 positivas expresaron ya sea insulina o somatostatina (datos no mostrados) . El análisis de múltiples poblaciones celulares en estos cultivos del islote primarios permite verificar la especificidad de célula ß en el ensayo de replicación.
Los islotes aislados se recuperaron durante la noche en una incubadora de cultivo de tejido antes de ser dispersados y colocados en placa el día siguiente. Para permitir la adhesión celular, las células del islote se incubaron durante 48 horas antes de la adición del . medio fresco y tratamiento del compuesto. Después de 24 horas de tratamiento con compuesto, las células se fijaron, se mancharon y se analizaron. PDX-1 es un factor de transcripción expresado por células ß y células d. (P. Serup y colaboradores, The Biochemical journal 310 (Pt 3), 997-1003 (1995)). Entre la población de PDX-1, >90% de las células son células ß de insulina"1- (datos no motrados) (J. Suckale y colaboradores, Front Biosci 13, 7156-7171 (2008)). El manchado de PDX-1 nuclear se utilizó como el marcador de célula ß primario debido a que las células del islote crecen en agrupaciones irregulares densas que causan una mancha citoplásmica, tal como insulina, que está asociada ambiguamente con múltiples núcleos. Como resultado de esta ambigüedad, los núcleos ki-67+ de células rápidamente replicantes tales como fibroblastos tienen el potencial de ser atribuidos incorrectamente a células de insulina+. La velocidad de replicación de célula ß in vitro basal mostró la variabilidad de inter-experimento moderada (0.4-3.5%) y fue típicamente más alta que la velocidad de replicación de célula ß in vivo (0.8+0.2%) de animales viejos similares como es determinado por el porcentaje de células PDX-1+ que co-expresaron ki-67.
ADK-Is promueven la replicación de célula ß : Aproximadamente 750 compuestos de una librería cuidadosamente seleccionada de compuestos bioactivos permeables a la célula se clasificaron por su capacidad de incrementar la replicación de célula ß. Al utilizar el inmunomanchado de PDX-1 para identificar células ß y el inmunomanchado de ki-67 para identificar células divididas, las células PDX-1+ replicantes se distinguieron fácilmente de las células PDX-1- por la co-localización de PDX-1 y ki-67 (datos no mostrados). Dos compuestos se identificaron; ambos inhibidores (ADK-Is) de adenosina quinasa (ADK) bien caracterizados. 5-yodotubercidina (5-IT; CAS 24386-93-4) y ABT-702 (CAS 214697-26-4), incrementaron el porcentaje de células ß divididas 2-3 veces por arriba de la cadena principal después de 24 horas y tienen un efecto significante en el número de célula ß (ver enseguida) . Independiente de la velocidad de replicación de célula ß de linea de base variable, los ADK-Is consistentemente causaron un incremento de 2 a 3 veces en la velocidad de replicación de célula ß. En el -experimento exhibido, los compuestos de acierto incrementaron la velocidad de replicación de célula ß de ~2.5% a ~6.5%. Para confirmar sus resultados utilizando PDX-1 para identificar células ß, los inventores realizaron experimentos similares utilizando PDX-1 y co-manchado de insulina para identificar células ß (Fig. 17a) .
Los ADK-Is adicionales para su capacidad de promover la replicación de célula ß se probaron enseguida. Dos ADK-Is adicionales demostraron eficacia similar a los compuestos de acierto primarios (Fig. 17b) y se muestran en la Fig. 13a. (E. A. Kowaluk y . F. Jarvis, Expert opinión on investigational drugs 9, 551-564 (2000) ) . También se probó el efecto de ABT-702 en islotes de murino y porcino. Los cultivos sanos de células del islote dispersadas de estas especies se establecieron y los mismos anticuerpos previamente utilizados para los cultivos de células del islote de rata efectivamente identificaron tanto células ß (PDX-1) como células replicantes (ki-67) (datos no mostrados) .
El tratamiento con compuesto de células del islote de ambas de estas especies causó una inducción de replicacion de célula ß similar a aquella observada para células del islote de rata, aunque con un poco de potencias diferentes (Fig. 13b y 13c). Ambos compuestos demostraron eficacia incrementada con dosis incrementada. Aunque 5-IT fue más potente que ABT-702 ambos compuestos tuvieron una inducción máxima de ~2-3 veces. Una observación notable es que el análisis de ABT-702 a concentraciones por arriba de -20 µ? se limitó por la fluorescencia de fondo.
El efecto replicativo de estos compuestos se confirmó al estimar el porcentaje de células ß que expresaron el marcador de fase mitótica fosfohistona-H3 (PH3) en respuesta al tratamiento con compuesto (datos no mostrados) . Utilizando PH3 se observó un incremento de 2 a 3 veces similar en replicacion de célula ß (Fig. 18a) . Además, un experimento de impulso-amplitud se realizó utilizando BRDU para marcar las células de fase S. Las células del islote se cultivaron en la presencia de BRDU y vehículo o compuesto durante dos días seguido por un período de lavado de dos días. Los cultivos del islote tratados con el ADK-Is demostraron un incremento de 2 veces en el porcentaje de células ß que incorporaron células BRDU (Fig. 18b). La habilidad de los ADK-Is para causar una inducción similar de un marcador de amplio ciclo celular (ki-67) y marcador de fase mitótica reducido (PH3) asi como el incremento de incorporación de BRDU, todos sugieren que estos compuestos incrementan la actividad mitótica.
Para probar si los ADK-Is pueden incrementar el número absoluto de células ß, las células del islote se cultivaron en la presencia de 5-IT o DMSO durante varios días y luego el número total de células ß se contó y comparó al número de células ß presentes en el tiempo 0. Solamente una pequeña diferencia en el número de célula ß fue evidente después de 96 horas, pero hubo un incremento considerable en el número de célula ß después de 144 horas (Fig. 13d) . En el día 6, el número de células ß en las cavidades tratadas con 5-IT tuvo incremento al 40% comparado con incremento al 20% en las cavidades de control. El incremento que resultó del tratamiento con ADK-I fue consistente con un incremento 2 veces en la replicación de célula ß y sugiere un cambio de una velocidad de replicación basal de -3% por día a ~6% por día en sus cultivos.
ADK se expresa por células ß y negativamente regula la replicación de célula ß: ADK es un miembro del grupo de enzimas de azúcar quinasa, compuesto de tres familias metabólicas (hexoquinasas, riboquinasas y galactoquinasas ) que desempeñan funciones importantes en el metabolismo celular. (P. Bork, C. Sander y A. Valencia, Protein Sci 2, 31-40 (1993)). ADK es una riboquinasa que regula los niveles de adenosina intracelulares y extracelulares a través de su habilidad para catalizar la fosforilación de adenosina a AMP utilizando ATP como el donador de fosfato. (T. A. Krenitsky, R. L. Miller & J. A. Fyfe, Biochemical pharmacology 23, 70-72 (1974) y J. Park &R. S. Gupta, Cell Mol Life Sci 65, 2875-2896 (2008)). Mientras que esta enzima se expresa ampliamente, es altamente expresada en el hígado y páncreas. (M. Andrés & I. H. Fox, The Journal of biological chemistry 254, 11388-11393 (1979)) ADK tiene dos formas conocidas, una isoforma nuclear larga y una isorforma citoplásmica corta. (X. A. Cui y colaboradores, Biochemical and biophysical research Communications 388, 46-50 (2009) ) La forma citoplásmica participa en la ruta de salvamento de purina, mientras que la forma larga es un 'regulador global de reacciones de metiltransferasa por la vía de la regulación de retroalimentación de adenosina de la actividad de S-adenosilhomocisteína hidrolasa. (N. M. Kredich & D. V. Martin, Jr., Cell 12, 931-938 (1977) y Boison, L. y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 99, 6985-6990 (2002) ) . De esta manera, la inhibición de ADK tiene el doble efecto de incrementar la adenosina extracelular e inhibir las reacciones de metiltransferasa .
El inmunomanchado de ADK reveló expresión nuclear de ADK en células ß (datos no mostrados) . En contraste, el manchado de ADK fue en el citoplasma, no en el núcleo, en fibroblastos y células a (datos no mostrados) . Aunque la localización de ADK en células d (células de somatostatina+- ) fue variable, ADK se presentó generalmente en el núcleo de estas células (datos no mostrados) . Para asegurar que el manchado fue especifico, el anticuerpo utilizado fue validado mediante transfección transiente de células COS con un cDNA de ADK de longitud completa que demostró fuerte patrón de expresión nuclear y confirmó la especificidad de su manchado de célula del islote (datos no mostrados) . La presencia del manchado nuclear en células ß, pero no en células , sugiere que la forma larga de ADK se expresa en células ß y no en células a.
Si el ADK en células ß actúa como un regulador negativo de replicación se probó enseguida. Los inventores utilizaron la infección lentiviral para dirigir la expresión de GFP y ya sea un RNA inhibidor no especifico (siRNA) o uno que fue dirigido a ADK. La capacidad del siRNA dirigido con ADK a niveles de proteina de bloqueo de ADK se confirmó por el manchado de western e inmunomanchado (Figs. 14a y 19). Al infectar aproximadamente la mitad del cultivo celular del islote, como es determinado por la expresión de GFP, la velocidad de replicacion de célula ß de células infectadas y no infectadas dentro de la misma cavidad podría ser separadamente analizada. Se razonó que si ADK actúa como un regulador autónomo de célula de replicacion de célula ß entonces las células ß que reciben el plásmido de control negativo y células ß que permanecieron no infectadas todas tendrían la misma velocidad de replicacion mientras que las células ß infectadas con el virus de siRNA dirigido con ADK tendrían una velocidad de replicacion incrementada. En efecto, los resultados confirmaron esta predicción (Fig. 14b) . Las células ß no infectadas y las células ß infectadas de control todas tuvieron la velocidad de proliferación basal de ~2%. En contraste, las células ß que recibieron el siRNA dirigido con ADK demostraron un incremento 2.5 veces en su velocidad de replicacion. Este resultado indicó que ADK es un regulador negativo autónomo de célula de replicacion de célula ß y puede ser el objetivo molecular del ADK-Is.
ADK-Is y glucosa o agonistas de GLP-1R tienen un efecto aditivo en la replicacion de célula ß : La Hiperglucemia se considera que es el impulsor fisiológico primario de la proliferación de célula ß a pesar de la relativamente poca evidencia in vitro para soportar este principio ampliamente aceptado. (S. Bonner-Weir y colaboradores, Diabetes 38, 49-53 (1989) y L. C. Alonso y colaboradores, Diabetes 56, 1792-1801 (2007)). Tomando ventaja de la plataforma de replicación de célula ß descrita en la presente, se demostró que la glucosa tiene un efecto dependiente de concentración en la proliferación de célula ß (Fig. 15a) . Sin embargo, la cinética de respuesta pareció ser diferente de aquella de los AKD-Is. Los ADK-Is incrementaron el manchado de ki-67 por 24h mientras que un efecto de glucosa no se observó hasta después (48h) . Sin desear que sea limitado por una teoría, un distinto mecanismo de acción para la glucosa y ADK-Is es apoyado por el efecto aditivo de 5-IT en todas las concentración de, glucosa probadas (Fig. 15a). La combinación de alta glucosa y 5-IT causó una inducción 5 veces de la velocidad de replicación por arriba de la velocidad de línea de base. Los resultados de este experimento indicaron que la adición de ADK-Is a un ambiente hiperglucémico puede incrementar significantemente el crecimiento de la célula ß.
Los agonistas de GLP-IR han recibido atención para su capacidad de promover la liberación de insulina, mejorar el control glicémico e incrementar la replicación de célula ß. (J. H. Nielsen y colaboradores, Diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001) y D. J. Drucker & M. A. Nauck, Lancet 368, 1696-1705 (2006) ) . Dado que actúan al aumentar la respuesta de célula ß a glucosa, estos agonistas también aumentan el efecto de replicación de célula ß de las ADK-Is. Por consiguiente, los cultivos de islote de rata se incubaron con agonistas de GLP-IR (péptido 1 similar a Glucagón (GLP-1) o Exenatida-4 (Ex-4)) con y sin 5-IT. Mientras que los agonistas de GLP-IR solamente de manera modesta incrementaron la replicación de célula ß (~1.5 veces) comparado con 5-IT (~2.5 veces), la adición de 5-IT a los agonistas de GLP-IR permitió un efecto de replicación aditivo (~4 veces) (Fig. 15b) . Estos resultados fueron consistentes con ADK-Is que actúan de una manera independiente de GLP-1 y demuestran el potencial para modular estas dos rutas en combinación para incrementar la replicación de célula ß.
ADK-Is selectivamente promueven la replicación de célula ß: La velocidad de replicación de múltiples células se estimó en el cultivo de islote: células PP, células a, células d y fibroblastos (Fig. 16a) . Las células d también pueden mostrar un incremento de replicación en respuesta a ADK-Is debido como las células ß, células d expresan ADK nuclear y comparten la propiedad fisiológica de secretar su hormona en respuesta a glucosa. (M. Braun y colaboradores, Diabetologia 52, 1566-1578 (2009)) En realidad, las células d demuestran un incremento significante en la replicación en respuesta al tratamiento de ADK-I mientras que los fibroblastos, células a y células P no lo hacen (Fig. 16a). La velocidad de replicación de las células PP no se muestra debido a que su división es extraordinariamente rara bajo las condiciones de cultivo utilizadas en la presente.
Además de las células ß, los hepatocitos también expresan altos niveles de ADK y por lo tanto se pueden esperar que proliferen en respuesta a ADK-Is. (Boison, L. y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 99, 6985-6990 (2002)). Para probar esta posibilidad, se aislaron hepatocitos de murino, se colocaron en cultivo y se trataron con ABT-702 (5-IT no fue bien tolerado por los hepatocitos) . La velocidad de replicación de estas células no incrementó en respuesta al tratamiento con fármaco (Fig. 16b) . Por lo tanto, el efecto de replicación de ADK-Is fue selectivo.
Los ADK-Is promueven la replicación de célula ß ln vivo: Favorecido por los resultados in vitro, la capacidad de ABT-702 para promover selectivamente la replicación de célula ß in vivo se probó. ABT-702 se seleccionó debido a su vida media más larga comparado con 5-IT. (G. Z. Zheng y colaboradores, Bioorganic & medicinal, chemistry letters 11, 2071-2074 (2001) ) . En efecto, una sola inyección intraperitoneal de ABT-702 dio por resultado un incremento 2 veces en incorporación de BRDU por las células ß (Fig. 16c). Los resultados se confirmaron en un grupo separado de animales en los cuales las células ß se identificaron por la presencia de insulina antes que de PDX-1 (Fig. 20) .
Notablemente, el tratamiento con ABT-702 no incrementa la velocidad de replicación de las células exocrinas, nuevamente resaltando la selectividad de los ADK-Is (Figs. 16d y 20). Además, la incorporación de BRDU por los hepatocitos en respuesta al tratamiento de ABT-702 en los mismos grupops de animales también se examinó (Fig. 16e) . Los hepatocitos no muestran una velocidad incrementada de la división celular en respuesta al tratamiento con fármaco. Por lo tanto, ABT-702 selectivamente promovió la replicación de célula ß in vitro e in vivo.
Discusión La DM2 es una epidemia global en necesidad de tratamiento mejorado. Mientras que la prevención de la enfermedad a través de la modificación de prácticas dietéticas y comportamiento permanece fundamental, estas estrategias no han sido ampliamente exitosas. Históricamente, las terapias de DM2 han intentado aumentar la secreción de insulina (sulfonilureas) o reducir la demanda de insulina (biguanidas, tiazolidindionas) al disminuir la resistencia periférica. Sin embargo, los pacientes con DM2 parecen tener una capacidad limitada para el crecimiento de célula ß adaptiva y estos procedimientos no se dirigen a esta deficiencia. Consecuentemente, la mayoría de los pacientes diabéticos demuestran falla de célula ß progresiva. Por consiguiente, la invención proporciona una plataforma para identificar agentes farmacológicos que promueven la división de célula ß incrementada. Mientras que el presente estudio se enfocó en una sola clase de agentes, inhibidores de adenosina quinasa, el ensayo de clasificación descrito en la presente se puede utilizar para descubrir compuestos adicionales.
La aplicación de agentes que promueven el crecimiento para aumentar la masa de célula ß se limita principalmente por su especificidad. Un amplio espectro de factores que promueven la replicación de célula ß se han identificado incluyendo reguladores del ciclo celular tal como ciclina2, moléculas de señalización similares a AKT2, factores de crecimiento y hormonas que incluyen factor de crecimiento de hepatocitos, hormona de crecimiento y prolactina y varias moléculas pequeñas (S. Georgia & A. Bhushan, The Journal of clinical investigation 114, 963-968 (2004); S. Fatrai y colaboradores, Diabetes 55, 318-325 (2006) ; J. H. Nielsen y colaboradores, Diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001); R. C. Vasavada y colaboradores, The international journal of biochemistry & cell biology 38, 931-950 ( 2006) ; y W. Wang y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 106, 1427-1432 (2009)). Sin embargo, la mayoría de estas entidades demuestran efectos pleiotrópicos que limitan su utilidad o han fallado en incrementar consistentemente la replicación de célula ß. La invención proporciona ADK-Is como una nueva clase de agentes que son capaces de promover la replicación de célula ß in vitro e in vivo. De importancia critica es que estos compuestos tienen un efecto de proliferación selectiva en las células ß y no en células a, hepatocitos, células exocrinas o fibroblastos.
Adicionalmente, los resultados presentados en la presente muestran que los ADK-Is tienen la cualidad atractiva de aumentar el efecto de replicación de célula ß de los agonistas de GLP-IR e hiperglucemia .
La identificación de ADK como un regulador de la replicación de célula ß fue un descubrimiento inesperado que resalta el valor de utilizar la clasificación química para revelar nueva biología. En casi todos los otros tipos de célula que se han tratado con adenosina o un ADK-Is, se observa la inhibición de crecimiento. En fibroblastos cardíacos, células del músculo liso aórticas, células mesangiales glomerulares, condrocitos, astrocitos, linfocitos, líneas celulares de cáncer de colon, líneas celulares de cáncer de seno, líneas celulares de cáncer gástrico, líneas celulares de hepatoma y líneas celulares de toroide, por nombrar algunos, el efecto de ADK-Is es inhibir, no estimular, la replicación. Ver por ejemplo, R. K. Dubey y colaboradores, Circulation 96, 2656-2666 (1997); R. K. Dubey y colaboradores, Hypertension 31, 516-521 (1998); R. K. Dubey y colaboradores, Hypertension 46, 628-634 (2005) ; Mistry, M.
G. Chambers & R. M. Masón, Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society 14, 486-495 (2006); J. Faller y colaboradores, Metabolism: clinical and experimental 33, 369-374 (1984); M . Saito y colaboradores, Cáncer letters 290, 211-215; Y. Yasuda y colaboradores, Journal of gastroenterology 44, 56-65 (2009) ; M. Hashemi y colaboradores, Cell proliferation 38, 269-285 (2005); K. Sai y colaboradores, Neurotoxicology 27, 458-467 (2006) ; M. Saitoh y colaboradores, Biochemical pharmacology 67, 2005-2011 (2004); L. T. Wen & A. F. Knowles, British journal of pharmacology 140, 1009-1018 (2003); L. F. u y colaboradores, Acta pharmacologica Sínica 27, 477-484 (2006) ; y M. Vainio, P. Saarinen & K. Tornquist, Journal of cellular physiology 171, 336-342 (1997) . Estos resultados previos son consistentes con las observaciones de los inventores de que los hepatocitos, fibroblastos, células exocrinas y células no proliferan en respuesta a los ADK-Is.
Sin desear que sea limitado por una teoría, el efecto que promueve el crecimiento inusual de ADK-Is en células PDX-1+ es poco probable que sea mediado por la señalización de adenosina extracelular por tres razones. Primero, se observó un incremento autónomo celular en la proliferación de célula ß en respuesta al bloqueo de ADK. Si este efecto se medió por adenosina extracelular, un efecto paracrino seria anticipado. Segundo, la adición de antagonistas de adenosina o receptor de adenosina no tuvo efecto en la proliferación de célula ß en el ensayo (datos no mostrados) . Tercero, las células ß expresan principalmente la isoforma nuclear de ADK que se cree que regula principalmente la actividad de transmetilación . Sin desear que sea limitado por una teoría, la inhibición de la actividad de ADK previene reacciones de metilación que actúan para prevenir la replicación de célula ß. Por ejemplo, menina es un importante regulador negativo de replicación de célula ß que funciona como parte de un complejo de histona metiltransferasa . (S. K. Karnik y colaboradores, Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 102, 14659-14664 (2005) ) . Por consiguiente, la actividad de menina se puede inhibir mediante la inhibición de ADK.
Los ADK-Is aparecen para ser bien tolerados por los animales y están en desarrollo como un terapéutico para una variedad de condiciones que incluyen epilepsia, isquemia cerebral, dolor e inflamación. (E. A. Kowaluk & M. F. Jarvis, Expert opinión on investigational drugs 9, 551-564 (2000) ) . La invención proporciona un regulador previamente no reconocido de replicación de célula ß con una actividad selectiva en la replicación de célula ß. De esta manera, ADK puede ser un objetivo terapéutico para ' el tratamiento y prevención de la diabetes. Además, la expansión ex vivo de las células ß permite superar la disponibilidad limitada de islotes cadavéricos utilizados para tratar la diabetes tipo 1.
Referencias 1. R. C. Turner, C. A. Culi, V. Frighi, R. R. Holman, Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes raellitus: progressive requirement for múltiple therapies (UKPDS 49) . UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. Jama 281, 2005-2012 (1999) . 2. S . M. Haffner, S. Lehto, T. Ronnemaa, K. Pyorala, M.
Laakso, Mortality from coronary heart disease in subjects with type 2 diabetes and in nondiabetic subjects with and without prior myocardial infarction. The New England journal of medicine 339, 229-234 (1998). 3. Juutilainen, S. Lehto, T. Ronnemaa, K. Pyorala, M.
Laakso, Type 2 diabetes as a "coronary heart disease equivalent": an 18-year prospective population-based study in Finnish subjects. Diabetes care 28, 2901-2907 (2005) . 4. E. S. Huang, A. Basu, M. O'Grady, J. C. Capretta, Projecting the future diabetes population size and related costs for the U.S. Diabetes care 32, 2225-2229 (2009) . 5. J. P. Boyle, T. J. Thompson, E. W. Gregg, L. E. Barker, D. F. Williamson, Projection of the year 2050 burden of diabetes in the US adult population: dynamic modeling of incidence, mortality, and prediabetes prevalence. Population health metrics 8, 29.
D. M. Muoio, C. B. Newgard, Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 193-205 (2008).
B. L. Wajchenberg, beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment. Endocrine reviews 28, 187-218 (2007).
S. O'Rahilly, Human genetics illuminates the paths to metabolic disease. Nature 462, 307-314 (2009).
S. C. Elbein, S. J. Hasstedt, K. Wegner, S. E. Kahn, Heritability of pancreatic beta-cell function among nondiabetic members of Caucasian familial type 2 diabetic kindreds . The Journal of clinical endocrinology and metabolism 84, 1398-1403 (1999).
E. Butler, J. Janson, S. Bonner-Weir, R. Ritzel, R. A. Rizza, P. C. Butler, Beta-cell déficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes 52, 102-110 (2003).
H. Mokdad, E. S. Ford, B. A. Bowman, W. H. Dietz, F. Vinicor, V. S. Bales, J. S. Marks, Prevalence of obesity, diabetes, and obesity-related health risk factors, 2001. Tama 289, 76-79 (2003) .
R. N. Kulkarni, U. S. Jhala, J. N. Winnay, S. Krajewski, . Montminy, C. R. Kahn, PDX-1 haploinsufficiency limits the compensatory islet hyperplasia that occurs in response to insulin resistance. The Journal of clinical investigation 114, 828-836 (2004) .
R. A. Ritzel, A . E. Butler, R. A . Rizza, J. D. Veldhuis, P. C. Butler, Relationship between beta-cell mass and fasting blood glucose concentration in humans. Diabetes care 29, 717-718 (2006).
Y. Dor, J. Brown, O. I. Martínez, D. A. Melton, Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation . Nature 429, 41-46 (2004) .
K. Brennand, D. Huangfu, D. Melton, All beta Cells Contribute Equally to Islet Growth and Maintenance. PLoS biology 5, el63 (2007) .
S. Georgia, A. Bhushan, Beta cell replication is the primary mechanism for maintaining postnatal beta cell mass. The Journal of clinical investigation 114, 963-968 (2004) .
M. Teta, M. M. Rankin, S. Y. Long, G. M. Stein, J. A. Kushner, Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Developmental cell 12, 817-826 (2007) .
T. Nir, D. A. Melton, Y. Dor, Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation 117, 2553-2561 (2007) .
D. A. Cano, I. C. Rulifson, P. W. Heiser, L. B. Swigart, S. Pelengaris, M. Germán, G. I. Evan, J. A. Bluestone, M. Hebrok, Regulated -cell regeneration in the adult mouse páncreas. Diabetes (2007).
P. Collombat, X. Xu, P. Ravassard, B. Sosa-Pineda, S. Dussaud, N. Billestrup, 0. D. Madsen, P. Serup, H. Heimberg, A. ansouri, The ectopic expression of Pax4 in the mouse páncreas converts progenitor cells into alpha and subsequently beta cells. Cell 138, 449-462 (2009) . Inada, C. Nienaber, H. Katsuta, Y. Fujitani, J. Levine, R. Morita, A. Sharma, S. Bonner-Weir, Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine páncreas after birth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 105, 19915-19919 (2008).
X. Xu, J. D'Hoker, G. Stange, S. Bonne, N. De Leu, X. Xiao, M. Van de Casteele, G. Mellitzer, Z. Ling, D. Pipeleers, L. Bouwens, R. Scharfmann, G. Gradwohl, H. Heimberg, Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse páncreas. Cell 132, 197-207 (2008).
F. Thorel, V. Nepote, I. Avril, K. Kohno, R. Desgraz, S.
Chera, P. L. Herrera, Conversión of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature 464, 1149-1154 (2010) .
F. A. Van Assche, L. Aerts, F. De Prins, A morphological study of the endocrine páncreas in human pregnancy. British journal of obstetrics and gynaecology 85, 818-820 (1978).
G. Xu, D. A. Stoffers, J. F. Habener, S. Bonner-Weir, Exendin-4 stimulates both beta-cell replication and neogenesis, resulting in increased beta-cell mass and improved glucose tolerance in diabetic rats. Diabetes 48, 2270-2276 (1999) .
Y. Li, T. Hansotia, B. Yusta, F. Ris, P. A. Halban, D. J. Drucker, Glucagon-like peptide-1 receptor signaling modulates beta cell apoptosis. The Journal of biological chemistry 278, 471-478 (2003).
D. J. Drucker, . A. Nauck, The incretin system: glucagon-like peptide-1 receptor agonists and dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in type 2 diabetes. Lancet 368, 1696-1705 (2006).
W. Wang, J. R. Walker, X. Wang, M. S. Tremblay, J. W. Lee, X. Wu, P. G. Schultz, Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansión. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 106, 1427-1432 (2009) .
N. Fleischer, C. Chen, M. Surana, . Leiser, L. Rossetti, W. Pralong, S. Efrat, Functional analysis of a conditionally transformed pancreatic beta-cell line. Diabetes 47 , 1419-1425 (1998).
Y. Zimmer, D. Milo-Landesman, A. Svetlanov, S. Efrat, Genes induced by growth arrest in a pancreatic beta cell line: identification by analysis of cDNA arrays. FEBS letters 457, 65-70 (1999).
P. Serup, H. V. Petersen, E. E. Pedersen, H. Edlund, J. Leonard, J. S. Petersen, L. I. Larsson, O. D. adsen, The homeodomain protein IPF-l/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact El helix-loop-helix factor binding site. The Biochemical journal 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
J. Suckale, . Solimena, Páncreas islets in metabolic signaling--focus on the beta-cell. Front Biosci 13, 7156-7171 (2008) .
E. A. Kowaluk, M. F. Jarvis, Therapeutic potential of adenosine kinase inhibitors. Expert opinión on investigatíonal drugs 9, 551-564 (2000) .
P. Bork, C. Sander, A. Valencia, Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. Protein Sci 2, 31-40 (1993) .
T. A. Krenitsky, R. L. Miller, J. A. Fyfe, Levéis of nucleoside and nucleotide kinases in rhesus monkey tissues. Biochemical pharmacology 23, 70-72 (1974).
J. Park, R. S. Gupta, Adenosine kinase and ribokinase-the RK faraily of proteins. Cell Mol Life Sci 65, 2875-2896 (2008).
M. Andrés, I. H. Fox, Purification and properties of human placental adenosine kinase. The Journal of biological chemistry 254, 11388-11393 (1979).
X. A. Cui, B. Singh, J. Park, R. S. Gupta, Subcellular localization of adenosine kinase in mammalian cells: The long isoform of AdK is localized in the nucleus. Biochemical and biophysical research Communications 388, 46-50 (2009) .
N. M. Kredich, D. V. Martin, Jr., Role of S-adenosylhomocysteine in adenosinemediated toxicity in cultured mouse T lymphoma cells. Cell 12, 931-938 (1977) .
Boison, L. Scheurer, V. Zumsteg, T. Rulicke, P. Litynski, B. Fowler, S. Brandner, H. Mohler, Neonatal hepatic steatosis by disruption of the adenosine kinase gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 99, 6985-6990 (2002) .
M. Braun, R. Ramracheya, S. Amisten, M. Bengtsson, Y. Moritoh, Q. Zhang, P. R. Johnson, P. Rorsman, Somatostatin reléase, electrical activity, membrane currents and exocytosis in human pancreatic delta cells. Diabetologia 52, 1566-1578 (2009) .
S. Bonner-Weir, D. Deery, J. L. Leahy, G. C. Weir, Compensatory growth of pancreatic beta-cells in adult rats after short-term glucose infusión. Diabetes 38, 49-53 (1989) .
L. C. Alonso, T. Yokoe, P. Zhang, D. K. Scott, S. K. Kim, C. P. O'Donnell, A. Garcia-Ocana, Glucose infusión in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes 56, 17921801 (2007).
J. H. Nielsen, E. D. Galsgaard, A. Moldrup, B. N. Friedrichsen, N. Billestrup, J. A. Hansen, Y. C. Lee, C. Carlsson, Regulation of beta-cell mass by hormones and growth factors. Diabetes 50 Suppl 1, S25-29 (2001) . G. Z. Zheng, C. Lee, J. K. Pratt, R. J. Perner, M. Q. Jiang, A. Gomtsyan, M. A. Matulenko, Y. Mao, J. R. Koenig, K. H. Kim, S. Muchmore, H. Yu, K. Kohlhaas, K. M. Alexander, S. McGaraughty, . L. Chu, C. T. Wismer, J. Mikusa, M. F. Jarvis, K. Marsh, E. A. Kowaluk, S. S. Bhagwat, A. O. Stewart, Pyridopyrimidine analogues as novel adenosine kina.se inhibitors. Bioorganic & medicinal chemistry letters 11, 2071-2074 (2001) .
S. Fatrai, L. Elghazi, N. Balcazar, C. Cras-Meneur, I. Krits, H. Kiyokawa, E. BernalMizrachi, Akt induces beta-cell proliferation by regulating cyclin DI, cyclin D2, and p21 levéis and cyclin-dependent kinase-4 activity. Diabetes 55, 318-325 (2006) .
R. C. Vasavada, J. A. Gonzalez-Pertusa, Y. Fujinaka, N. Fiaschi-Taesch, I. Cozar-Castellano, A. Garcia-Ocana, Growth factors and beta cell replication. The international journal of biochemistry & cell biology 38, 931-950 (2006) .
R. K. Dubey, D. G. Gillespie, Z. Mi, E. K. Jackson, Exogenous and endogenous adenosine inhibits fetal calf serum-induced growth of rat cardiac fibroblasts: role of A2B receptors. Circulation 96, 2656-2666 (1997).
R. K. Dubey, D. G. Gillespie, Z. Mi, E. K. Jackson, Adenosine inhibits growth of human aortic smooth muscle cells via A2B receptors. Hypertension 31, 516-521 (1998) .
R. K. Dubey, D. G. Gillespie, Z. Mi, E. K. Jackson, Adenosine inhibits PDGF-induced growth of human glomerular mesangial cells via A(2B) receptors. Hypertension 46, 628-634 (2005) .
Mistry, M. G. Chambers, R. M. Masón, The role of adenosine in chondrocyte death in murine osteoarthritis and in a murine chondrocyte cell line. Osteoarthritis and cartilage/OARS, Osteoarthritis Research Society 14, 486-495 (2006) .
J. Faller, T . D. Palella, P. Dean, I. H. Fox, Altered cell cycle distributions of cultured human lymphoblasts during cytotoxicity related to adenosine deaminase inhibition. Metabolism: clinical and experimental 33, 369-374 (1984).
M. Saito, T. Yaguchi, Y . Yasuda, T. Nakano, T. Nishizaki, Adenosine suppresses CW2 human colonic cáncer growth by inducing apoptosis via A(l) adenosine receptors. Cáncer letters 290, 211-215.
Y. Yasuda, M. Saito, T. Yamamura, T. Yaguchi, T. Nishizaki, Extracellular adenosine induces apoptosis in Caco-2 human colonic cáncer cells by activating caspase-9/-3 via A (2a) adenosine receptors. Journal of gastroenterology 44, 56-65 (2009) .
M. Hashemi, F. Karami-Tehrani , S. Ghavami, S. Maddika, M. Los, Adenosine and deoxyadenosine induces apoptosis in oestrogen receptor-positive and -negative human breast cáncer cells via the intrinsic pathway. Cell proliferation 38, 269-285 (2005).
K. Sai, D. Yang, H. Yamamoto, H. Fujikawa, S. Yamamoto, T. Nagata, M. Saito, T. Yamamura, T. Nishizaki, A(l) adenosine receptor signal and AMPK involving caspase-9/-3 activation are responsible for adenosine-induced RCR-1 astrocytoma cell death. Neurotoxicology 27, 458-467 (2006) .
M. Sait.oh, K. Nagai, ?. Nakagawa, ?. Yamamura, S. Yamamoto, T. Nishizaki, Adenosine induces apoptosis in the human gastric cáncer cells via an intrinsic pathway relevant to activation of AMP-activated protein kinase. Biochemical pharmacology 67 , 2005-2011 (2004).
L. T. en, A. F. Knowles, Extracellular ATP and adenosine induce cell apoptosis of human hepatoma Li-7A cells via the A3 adenosine receptor. British journal of pharmacology 140, 1009-1018 (2003) .
L. F. Wu, G. P. Li, J. L. Feng, Z. J. Pu, Molecular mechanisms of adenosine-induced apoptosis in human HepG2 cells. Acta pharmacológica Sínica 27, 477-484 (2006) . M. Vainio, P. Saarinen, K. Tornquist, Adenosine inhibits DNA synthesis stimulated with TSH, insulin, and phorbol 12-myristate 13-acetate in rat thyroid FRTL-5 cells. Journal of cellular physiology 171, 336-342 (1997) .
S. K. Karnik, C M. Hughes, X. Gu, 0. Rozenblatt-Rosen, G. W. McLean, Y. Xiong, M. Meyerson, S. K. Kim, Menin regulates pancreatic islet growth by promoting- histone methylation and expression of genes encoding p27Kipl and pl8IN 4c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Estados Unidos de América 102, 14659-14664 (2005) . M. Gotoh, T. Maki, S. Satomi, J. Porter, S. Bonner- eir, C. J. O'Hara, A. P. Monaco, Reproducible high yield of rat islets by stationary in vitro digestión follo ing pancreatic ductal or portal venous collagenase injection. Transplantation 43, 725-730 (1987). 63. P. 0. Seglen, Preparation of isolated rat liver cells.
Methods in cell biology 13, 29-83 (1976) .
Todas las patentes y otras publicaciones identificadas en la especificación y ejemplos se incorporan expresamente en la presente por referencia para todos los propósitos. Estas publicaciones se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada a este respecto debe ser considerado como una admisión de que los inventores no están autorizados en la antefecha de tal descripción en virtud de la invención previa o por cualquier otra razón. Todas las declaraciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos están basadas en la información disponible para los solicitantes y no constituyen cualquier admisión en cuanto a la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.

Claims (50)

REIVINDICACIONES
1. Un método para incrementar la replicación de célula ß en una población de células pancreáticas, el método caracterizado porque comprende: poner en contacto una población de células pancreáticas con un inhibidor de adenosina quinasa (ADK) , un inhibidor de S-Adenosilhomocisteina hidrolasa (SAHH) o un activador de proteina quinasa activada con MP (AMPK) .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor de adenosina quinasa es de la fórmula (I) : en donde : R1 es H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, OR5, SR5, N (R6) 2, (CH2)mR\ o R1 y R2 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5- 8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; R2 y R3 son cada uno independientemente H, OR5, SR5, N(R5)2, o R2 y R3 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclilo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; es H, halógeno, CN, N2, OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es independientemente para cada ocurrencia H, C(0)R7, C(0)OR7, C(0)N(R7)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-CQ opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido o los dos R5 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros opcionalmente que comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, 0 o S; es R5, OR5, SR5, N(R5)2, N2, CN, ' halógeno, o es independientemente para cada ocurrencia H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2- C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es 0, S, NH o CH2; Z son cada uno independientemente N o CR8; es independientemente para cada ocurrencia H, halógeno, CN, C(0)R7, C(0)0R7, C(0)N(R7)2, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es independientemente para cada ocurrencia 0 o S; es independientemente para cada ocurrencia OM, SM, OR5, SR5, N(R5)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; M es un catión de metal alcalino; m es 1, 2, 3 o 4; n es 0, 1 o 2; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo.
3. El método de conformidad con la reivindicación caracterizado porque el inhibidor de adenosina quinasa es la fórmula ( II ) : Fórmula (II) en donde: cada R9 es independientemente H, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, o los dos R9 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que opcionalmente comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O o S; R11 y R12 son cada uno independientemente H, OR14, N(R14)2, N2, N02, CN, halógeno, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es independientemente para cada ocurrencia halógeno, CN, NH2, o alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido; s H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo opcionalmente sustituido, o los dos R14 tomados junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que opcionalmente comprende de 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, 0 o S; es N o CR15; es NHR16, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; s H, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de 2- e opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es N o CH; q es O, 1, 2 o 3; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la IC50 del inhibidor de ADK es de menos de o igual a 500nM, 250nM, 200??, ?????, 75nM, 50nM, 25nM, ????, InM, O.llnM, O.OlnM, 0. OOlnM.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la actividad de ADK se inhibe o disminuye por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,· 95%, 98% o 100% (por ejemplo pérdida completa de actividad) con relación a un control no inhibido .
6. El método de conformidad con cualquiera de las ' reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el inhibidor de ADK se selecciona del grupo que consiste de aristeromicina, 5' -deoxiadenosina, 5' -aminoadenosina, 5' -desoxi-5-yodotuber- cidina, 5-yodotubercidina (A10) , 7-deaza-7-yodo-2 ' , 3' - dideoxiadenosina, nor-aristeromicina, nor-tubercidina, A- 134974, Toyocamicina, GP-515 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- ( 4-amino-3- bromo-lH-pirazolo [3, -d] pirimidin-l-il) -5- (aminometil) -tetra- hidrofuran-3, -diol) , GP-3269 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- (4- (4- fluorofenilamino) -5->-fenil-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) - tetrahidro-5-metilfuran-3, 4-diol) , GP-583 ( (2R, 3S, R, 5R) - tetrahidro-2-metil-5- (5-fenil-4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2 , 3-d]pirimidin-7-il) furan-3, -diol) , GP-947 ( ( 2S , 3S, R, 5R) -tetrahidro-2-metil-5- (5-fenil-4- (fenilamino) -7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il) furan-3, 4-diol) , ABT-702 ( 5- ( 3-bromofenil ) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina, B8), compuesto 1 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- ( 4-amino-5-yodo-7H-pirrolo-[2, 3-d] pirimidin-7-il) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3, 4-diol), compuesto 2 ( (2R, 3R, 4S, 5R) -2- ( 4-cloro-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) -5- (aminometil) -tetrahidrofuran-3, 4-diol), compuesto 3 ( ( 1S, 2R, 3S, 5R) -3-amino-5- ( 6-amino-9H-purin-9-il) ciclopentano-1, 2-diol) , compuesto 4 ((1S,2R,3S, 5R) -3-amino-5- (7-amino-3H- [1,2,3] triazolo [4, 5-d] pirimidin-3-il) ciclopentano-1, 2-diol) , compuesto 5 ( ( 1S, 2R, 3S, 4R) -4- ( 4-amino-5-yodo-7H-pirrolo [2, 3-d] pirimidin-7-il ) ciclopentano-1, 2, 3-triol) , compuesto 6 (7- (4- (dimetilamino) fenil) pteridin-4-amine) , compuesto 7 (5- (3-bromofenil) -7- (4- (dimetilamino) -fenil) pirido [2 , 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 8 (5-(2-bromobenzil) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il ) pirido [2, 3-d] pirimi-din-4-amine) , compuesto 9 ( 5-ciclohexil-7- ( 6-morfolino-piridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 10 (5- (tetrahidro-2H-piran-4-il) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il ) -pirido [2 , 3-d] pirimidin-4-amina) , compuesto 11 (5-(l-(2-bromofenil) etil) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] -pirimidin-4-amina) , compuesto 12 (5- (2-metilpent-4-en-2-il) -7- ( 6-morfolinopiridin-3-il) pirido [2, 3-d] pirimidin-4-amina ) , compuesto 13 (N5- ( ( lH-indol-3-il ) metil ) -7- ( 6-morfolino-piridin-3-il) pirido [2, 3- d] pirimidin-4 , 5-diamina) y combinaciones de los mismos.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el activador de AMPK es de la fórmula onalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, OR22, SR22, N(R2)2, (CH2)mR23, o R17 y R18 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; y R19 son cada uno independientemente H, OR22, SR22, N(R22)2 o R18 y R19 junto con los átomos a los cuales están unidos forman un heterociclo de 5-8 miembros que puede ser opcionalmente sustituido; y R21 son cada uno independientemente halógeno, CN, N2, OR22, SR22, N(R22)2, C(0)R24 C(0)OR24 C(0)N(R24)2, alquilo de Ci-Ce opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2- C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; es independientemente para cada ocurrencia H, C(0)R24 C(0)OR24 C(0)N(R24)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; , alquilo de Ci~C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2- C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; X es 0, S, NH o CH2; Y y Z son cada uno independientemente N o CR25; R25 es independientemente para cada ocurrencia H, halógeno, CN, C(0)R2\ C(0)OR24, C(0)N(R24)2, alquilo de C1-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2- C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2~C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; Z1 es independientemente para cada ocurrencia 0 o S; Z2 es independientemente para cada ocurrencia H, O , SM, OR22, SR22, N(R22)2, alquilo de Ci-C6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-C6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, ciclilo opcionalmente sustituido, heterociclilo opcionalmente sustituido, arilalquilo opcionalmente sustituido o heteroarilalquilo opcionalmente sustituido; M es un catión de metal alcalino; m es 1, 2, 3 o 4; n es 0, 1 o 2; y sales y amidas farmacéuticamente aceptables del mismo.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 7, caracterizado porque la actividad de la quinasa activada con AMP se incrementa por al menos 5%, 10%,. 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5-veces o más con relación a un control no activado.
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 7 o 8, caracterizado porque la EC50 del activador de AMPK es de menos de o igual a 500nM, 250nM, ?????, 50nM, ????, InM, O.llnM, .OlnM o O.OOlnM.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 7-9, caracterizado porque el activador de AMPK es ribonucleósido de 5-aminoimidazol-4-carboxamida (AICAR) .
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la IC50 del inhibidor de SAHH es de menos de o igual a 500nM, 250nM, 200n , ?????, 75nM, 50nM, 25nM, ????, InM, O.lnM, O.OlnM, O.OOlnM.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 11, caracterizado porque la actividad de SAHH se inhibe o disminuye por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 100% (por ejemplo pérdida completa de actividad) con relación a un control no inhibido.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 11 o 12, caracterizado porque el inhibidor de SAHH se selecciona del grupo que consiste de 9 (S) - (2, 3-dihidroxipropil) adenina [(S)-DHPA]; D-eritadina ; ácido (R, S) -3-adenin-9-il-2-hidroxipropanocico [ (R, S) -AHPA] ; dialdehído de adenosina (Ado) ; 3-deazaadenosina (c3-Ado) ; aristeromicina (Ari); neplanocina A (NPA o NpcA) ; dihidroxi-ciclopenteniladenina (DHCeA) ; dihidroxiciclopentenil-3-deazaadenina (c3-DHCeA) ; dihidroxiciclopentaniladenina (DHCaA); dihidroxiciclopentanil-3-deazaadenina (c3-DHCaA) ; 3-deazaneplanocina A (c3-NpcA) ; 3-deazaaristeromicina (c3Ari) ; carbociclico-3-desazaadenosina (C-c3Ado) ; 6'- Cmetilneplano-cina A; 2' -deoxiadenosina; tubercidina; ribavirina; pira-azofurina; 2' -deoxi-2' -cloroadenosina; isopenteniladenosina; metiltioadenosina (MTA) ; 9-p-arabinofuranosiladenina (Ara-A, vidarabina) ; 2' -Deoxiadenosina; N-metilaristeromicina, 8-azaaristeromicina y 3-deazaaristeromicina y su dialdehido y derivados de diol; (+) -5Noraristeromicina y su 2,6-diamino-análogo; 2' -desoxi-aristeromicina; 3' -desoxi-aristeromicina; 3' -amino-3' -deoxi-aristeromicina; 3' -amino-3' -deoxiarabino-furanosil-aristeromicina; 6' -hidroxi-aristeromicina; 6' -mercapto-aristeromicina; , 8 ' -bromo-aristeromicina; 8-hidroxiaristeromicina, fosfato de aristeromicina-3 ' -cíclico, fosfato de aristeromicin-6' -cíclico; 2-fluoro-S-adenosilhomocisteína (2-FSAH) ; sulfóxido de S-Adenosil-L-homocisteína; sulfona de S-Adenosil-Lhomocisteína; S-aristeromicinil-L-homocisteina; 5' -S- (3-carboxil-4-nitro-fenil) tioadenosina; 5' -S (metil) -5' -S- (butil) tioadenosina; y cualquiera de las combinaciones de los mismos.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque las células pancreáticas son de un sujeto, y en donde el sujeto está en necesidad de células ß adicionales.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque las células pancreáticas son de un sujeto y en donde el sujeto no está en necesidad de células ß adicionales.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque el sujeto es un mamífero .
17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque el sujeto es un humano .
18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque el sujeto es un ratón.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque las células pancreáticas son células pancreáticas primarias.
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque las células pancreáticas son derivadas de células desdiferenciadas.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque el contacto es in vi tro.
22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque el contacto es ex vivo.
23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque el contacto es in vivo.
24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el contacto in vivo es en un mamífero.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el contacto in vivo es en un ratón.
26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el contacto in vivo es en un humano.
27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el contacto in vivo es en un sujeto, donde el sujeto está en necesidad de células ß adicionales .
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el sujeto sufre de diabetes Tipo 1.
29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el sujeto sufre de diabetes Tipo 2.
30. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el sujeto es un mamífero.
31. El método de conformidad con cualquier reivindicación 27-30, caracterizado porque el sujeto es un humano .
32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizado porque la replicación de célula se incrementa por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o más con relación a un control .
33. Un ensayo de alto rendimiento para clasificar compuestos que incrementa la replicación de célula ß en una población de células pancreáticas, el ensayo caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto una población o preparación de células pancreáticas con un compuesto de prueba, en donde las células pancreáticas son células pancreáticas primarias; (b) estimar la replicación o crecimiento de célula beta; y (c) seleccionar el compuesto que incrementa o aumenta la replicación o crecimiento de célula ß.
34. El ensayo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque las células pancreáticas se cultivan en un recipiente de cultivo celular, la superficie del cual se recubre con medios acondicionados de linea celular de carcinoma de vejiga de rata 804G.
35. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-34, caracterizado porque la etapa de estimar la replicación de célula beta comprende detectar un marcador de célula beta y un marcador de replicación de célula .
36. El ensayo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el marcador de replicación de célula es Ki-67 o PH3.
37. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-36, caracterizado porque el marcador de célula ß se selecciona del grupo que consiste de PDX-1, insulina, c-péptido, amilina, E-cadherina, ???3ß, PCI/3, Beta2, Nkx2.2, Nkx6.1, GLUT2, PC2, ZnT-8, MAFA, MAFB y cualquiera de las combinaciones de los mismos.
38. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-37, caracterizado porque el marcador de célula ß es PDX-1.
39. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 35-38, caracterizado porque el marcador de célula ß no es insulina.
40 El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-39, caracterizado porque el compuesto de prueba tiene una concentración en el intervalo de O.lnM a lOOOmM.
41. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-40, caracterizado porque el ensayo se realiza a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 15°C a aproximadamente 55°C.
42. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-41, caracterizado porque el compuesto de prueba se pone en contacto con las células pancreáticas por al menos 1 hora.
43. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-42, caracterizado porque el compuesto de prueba incrementa la replicación o crecimiento de célula beta por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1.1 veces, 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces o más alto con relación a un control no tratado.
44. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-43, caracterizado porque las células pancreáticas no son líneas de células pancreáticas.
45. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-44, caracterizado porque la población de células pancreáticas es un islote de Langerhan o un fragmento del mismo.
46. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-45, caracterizado porque las células pancreáticas son células ß pancreáticas primarias.
47. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-46, caracterizado porque las células pancreáticas se dejan adherir a la superficie del recipiente de cultivo celular durante aproximadamente 12 a 48 horas antes del contacto con el compuesto de prueba.
48. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-47, caracterizado porque las células pancreáticas se derivan de células desdiferenciadas.
49. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-48, caracterizado porque las células desdiferenciadas son células madre pluripotentes inducidas.
50. El ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-49, el ensayo caracterizado porque comprende : (a) tripsinizar islotes de Langerhans en agrupaciones celulares de 1-3 células; (b) dejar que las células se recuperen durante la noche; (c) colocar en placa las células de la etapa (b) en las cavidades de una placa de 96 cavidades, en donde las cavidades se recubren con medio acondicionado 804G y la densidad de colocación en placa celular es 60k células/cavidad; (d) dejar que las células se adhieran a la superficie de las cavidades durante 48 horas; (e) poner en contacto ?µ? del compuesto de prueba con las células beta durante 24 horas; (f) manchar las células con anticuerpo PDX-1 y Ki-67 y/o anticuerpo PH3; (g) estimar la replicacion de células beta; y (h) seleccionar el compuesto que incrementa o aumenta la replicacion de célula ß.
MX2012007026A 2009-12-18 2010-12-17 Compuestos que promueven la replicacion de celula beta y metodos de su uso. MX2012007026A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28800109P 2009-12-18 2009-12-18
PCT/US2010/061075 WO2011075665A2 (en) 2009-12-18 2010-12-17 Beta-cell replication promoting compounds and methods of their use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2012007026A true MX2012007026A (es) 2013-03-18

Family

ID=44167939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2012007026A MX2012007026A (es) 2009-12-18 2010-12-17 Compuestos que promueven la replicacion de celula beta y metodos de su uso.

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20130023491A1 (es)
EP (1) EP2513298A4 (es)
JP (1) JP2013514781A (es)
KR (1) KR20120113228A (es)
CN (1) CN102803474A (es)
AU (1) AU2010330823A1 (es)
BR (1) BR112012014925A2 (es)
CA (1) CA2784596A1 (es)
EA (1) EA201270661A1 (es)
IL (1) IL220401A0 (es)
MX (1) MX2012007026A (es)
SG (1) SG181703A1 (es)
WO (1) WO2011075665A2 (es)
ZA (1) ZA201204521B (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103193781B (zh) * 2013-04-01 2015-12-23 济南大学 一种sahn酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法
JP2016057488A (ja) * 2014-09-10 2016-04-21 株式会社ジャパンディスプレイ 自発光型表示装置
WO2017022793A1 (ja) * 2015-08-06 2017-02-09 日東電工株式会社 免疫誘導促進組成物及びワクチン医薬組成物
TW202321249A (zh) 2015-08-26 2023-06-01 比利時商健生藥品公司 使用作為ｐｒｍｔ５抑制劑之新穎經６－６雙環芳香環取代之核苷類似物
US10898504B2 (en) 2016-03-10 2021-01-26 Janssen Pharmaceutica Nv Substituted nucleoside analogues for use as PRMT5 inhibitors
CN115626935A (zh) 2016-10-03 2023-01-20 詹森药业有限公司 用作prmt5抑制剂的单环和双环系统取代的卡巴核苷类似物
AU2018225312B2 (en) 2017-02-27 2024-02-08 Janssen Pharmaceutica Nv Use of biomarkers in identifying cancer patients that will be responsive to treatment with a PRMT5 inhibitor
WO2018160534A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Joslin Diabetes Center Protection of beta cells from immune attack
AU2018368790A1 (en) 2017-11-20 2020-06-25 Ichan School Of Medicine At Mount Sinai Kinase inhibitor compounds and compositions and methods of use
CN111479817B (zh) 2017-12-08 2023-03-21 詹森药业有限公司 螺双环类似物
US11788064B2 (en) 2018-01-05 2023-10-17 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method of increasing proliferation of pancreatic beta cells, treatment method, and composition
CA3093340A1 (en) 2018-03-20 2019-09-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Kinase inhibitor compounds and compositions and methods of use
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US20220152072A1 (en) * 2019-04-05 2022-05-19 Prelude Therapeutics, Incorporated Selective Inhibitors Of Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5)
TW202112375A (zh) 2019-06-06 2021-04-01 比利時商健生藥品公司 使用ｐｒｍｔ５抑制劑治療癌症之方法
LV15670B (lv) * 2021-03-10 2023-11-20 Latvijas Organiskās Sintēzes Institūts Jauni adenozilmerkaptāna atvasinājumi kā vīrusu m-RNS kapinga metiltransferāžu inhibitori

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5547942A (en) * 1994-01-04 1996-08-20 Rapaport; Eliezer Method of treatment of diabetes mellitus by administration of adenosine 5'-t
WO2000047721A2 (en) * 1999-02-10 2000-08-17 Ontogeny, Inc. Methods of inducing insulin positive progenitor cells
JP2003503319A (ja) * 1999-06-23 2003-01-28 ザ ユニバーシティ オブ バーモント アンド ステイト アグリカルチュラル カレッジ アンカップリングタンパク質発現を操作する方法および産物
US20040170705A1 (en) * 2001-03-08 2004-09-02 Dusan Miljkovic Compositions and methods for non-insulin glucose uptake
AU2003242672B2 (en) * 2002-06-07 2009-12-17 Universitair Medisch Centrum Utrecht New compounds for modulating the activity of exhange proteins directly activated by camp (EPACS)
US8017634B2 (en) * 2003-12-29 2011-09-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions for treating obesity and insulin resistance disorders
WO2007075956A2 (en) * 2005-12-21 2007-07-05 The Govt. Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Department Of Health & Human Services Methods for producing and using pancreatic endocrine cells
NZ700583A (en) * 2009-04-22 2016-04-29 Acad Of Science Czech Republic Novel 7-deazapurine nucleosides for therapeutic uses

Also Published As

Publication number Publication date
CN102803474A (zh) 2012-11-28
US20130023491A1 (en) 2013-01-24
CA2784596A1 (en) 2011-06-23
IL220401A0 (en) 2012-08-30
WO2011075665A2 (en) 2011-06-23
JP2013514781A (ja) 2013-05-02
SG181703A1 (en) 2012-07-30
BR112012014925A2 (pt) 2017-03-01
WO2011075665A3 (en) 2011-11-17
EA201270661A1 (ru) 2013-06-28
AU2010330823A1 (en) 2012-07-05
ZA201204521B (en) 2013-09-25
EP2513298A2 (en) 2012-10-24
KR20120113228A (ko) 2012-10-12
EP2513298A4 (en) 2013-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
MX2012007026A (es) Compuestos que promueven la replicacion de celula beta y metodos de su uso.
Annes et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet β-cell replication
JP5762979B2 (ja) 膵ホルモン産生細胞の製造法
AU2014278178B2 (en) SC-beta cells and compositions and methods for generating the same
JP6445422B2 (ja) ゼブラフィッシュ割球細胞培養物における高スループット画像ベース化学スクリーニング
EP3498824A1 (en) Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
US10941384B2 (en) Compositions and methods for promoting the generation of endocrine cells
US11788064B2 (en) Method of increasing proliferation of pancreatic beta cells, treatment method, and composition
WO2004073633A2 (en) Methods and compositions for modulating the development of stem cells
US20150119399A1 (en) Beta-cell replication promoting compounds and methods of their use
JP2018507889A (ja) 肥満及び２型糖尿病（ｔ２ｄ）の治療のための膵内分泌前駆細胞療法
US9617517B2 (en) Small chemical compound which promotes induction of differentiation of stem cells into insulin-producing cells and method for inducing differentiation of stem cells into insulin-producing cells using said small chemical compound
Pucelik et al. DYRK1A inhibitors leucettines and TGF-β inhibitor additively stimulate insulin production in beta cells, organoids, and isolated mouse islets
US20230364153A1 (en) Method for direct reprogramming from somatic cells into pancreatic beta cells by using microrna, and differentiation composition
US10881683B2 (en) Nucleic acid molecule
CN112119154A (zh) 褐色脂肪细胞的产生
Moon Metabolic Immaturity of Stem Cell-Derived β Cells Impairs Glucose Stimulated Insulin Secretion
WO2004010933A2 (en) Insulin-producing cell compositions and related methods
Porter et al. Renewable Human Cell Model for Type 1 Diabetes Research: EndoC‐βH5/HUVEC Coculture Spheroids
Barzowska Novel approaches for diabetes management by inhibition of DYRK1A kinase

Legal Events

Date Code Title Description
FA Abandonment or withdrawal