CN102803474A - 促进β细胞复制的化合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过用腺苷激酶（ADK）的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的抑制剂或AMP活化蛋白激酶（AMPK）的活化剂与β细胞进行接触，从而使β细胞的复制或生长得以刺激或增加的方法。

Description

促进β细胞复制的化合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年12月18日提交的美国临时申请号61/288,001在35U.S.C.§119(e)下的权益，以引用的方式将其内容整体并入本文。
政府支持
本发明是在美国国家卫生研究院授予的批准号DK072505和DK084206的政府支持下作出的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本发明涉及促进β细胞复制和/或生长的组合物与方法。
背景技术
存在以下两种形式的糖尿病：（1）胰岛素依赖型糖尿病或1型糖尿病（又名，幼年型糖尿病、脆弱性糖尿病，胰岛素依赖性糖尿病（IDDM））以及（2）非胰岛素依赖型糖尿病或2型糖尿病（又名NIDDM）。1型糖尿病最经常在青少年身上发病，但可在成年人中出现。2型糖尿病最经常在中年或老年人身上发病，但也可在年轻人中出现。糖尿病是一种由多种诱发因素引发的疾病，其特征在于禁食状态下或口服葡萄糖耐量试验期间服用葡萄糖后血浆葡萄糖水平上升（高血糖症）。在1型和2型糖尿病中都发生β细胞团块（β-cell mass）的减少。
1型糖尿病是一种自身免疫疾病状况，其特征在于由完全没有胰岛素（即，胰腺β细胞功能和团块的丧失）而引起的高血糖水平。当人的免疫系统对在胰腺中的产胰岛素β细胞进行攻击并将其破坏时，发生1型糖尿病。目前普遍相信，细胞因子的白细胞介素12（IL-12）家族以及信号转导与转录活化因子家族中的成员、如STAT-4（被认为是参与免疫应答的T-细胞分化调节剂）的下游活化，在导致自身免疫性的β细胞毁坏过程中起主要作用。胰腺随后几乎或完全不产生胰岛素。所经历的最常见的1型糖尿病症状中包括过度口渴（烦渴）、频繁排尿（尿频）、极度饥饿（多食）、极度疲劳以及体重下降。这些症状是由高血糖症以及身体脂肪分解造成的。被诊断患有1型糖尿病的人通常表现出高于300mg的血糖水平，并且在尿中出现酮。β细胞团块的恢复与胰岛素生产可以完全逆转糖尿病的状态。有证据表明，患有长期1型糖尿病的人持续有β细胞生成，但是被持续的自身免疫毁坏作用令人不希望地加以破坏。因此，使β细胞的复制得以增加的组合物与方法可以提供使正常的β细胞团块水平得以恢复、并逆转或治愈1型糖尿病的有效途径。
LADA是1型糖尿病最新认识到的一种亚型，被认为占到所有糖尿病病例的高达10%-20%。LADA也被称作1.5型糖尿病。LADA经常在起初被诊断患有2型糖尿病的人之中出现。尽管它具有类似于成年人1型糖尿病发病的特征，但β细胞的毁坏在其进程中被认为没有那么严重。
2型糖尿病是由胰岛素抵抗与胰岛素分泌受损结合产生的，但是患有2型糖尿病的很多人最终都显示出胰腺β细胞团块与功能的明显减少，转而使得患有2型糖尿病的人胰岛素“相对”不足，这是因为胰腺β细胞仍然产生部分胰岛素，但是这些胰岛素或者太少，或者不能合适地工作以便使葡萄糖充分进入细胞中产生能量。最近的尸检研究中获得明显的证据，显示了在患有2型糖尿病的人体内身体中持续的β细胞死亡（细胞凋亡）。所以，提供更多β细胞的治疗途径可以为逆转或治愈2型糖尿病提供明显的治疗作用。
不加以控制的2型糖尿病引起血液中的葡萄糖过量，导致高血糖症。患有2型糖尿病的人会感觉到疲劳、口渴加重、尿频、皮肤干燥发痒、视力模糊、伤口愈合慢、多于正常水平的感染以及足部的麻木刺痛感。如不进行治疗，患有2型糖尿病的人会脱水，且血液总量会发展到危险的低位。如果2型糖尿病的病人在很长时间内不加以控制，会产生更多严重的症状，包括重度高血糖（血糖超过600mg）、昏睡、混乱、颤抖、以及最终的“高渗透压高血糖非酮性昏迷”。持续或不加以控制的高血糖症还与婴儿发病率与死亡率（premature morbidity and mortality）的增长相关。因此，对葡萄糖动态平衡、脂质代谢作用、肥胖和高血压的治疗控制在临床管理和糖尿病治疗方面是非常重要的。
治疗糖尿病的目标是通过改善高血糖状态来避免出现上述所提及的慢性并发症（缓慢疾病进程）的出现，或是使其得以逆转/治愈。治疗糖尿病的传统方法包括：对于1型糖尿病的情况，给予流食与胰岛素；对于2型糖尿病的情况，给予各种降血糖药。诸如胰岛素制剂、胰岛素促分泌剂、胰岛素增敏剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂等降血糖药被广泛地用作临床治疗的方法。其实例包括阿卡波糖（Precose J）、glimeprimide（AmarylJ）、二甲双胍（Glucophage V）、那格列奈（Starlix V）、吡格列酮（ActosV）、瑞格列奈（PrandinJ）、罗格列酮（AvandiaV）、磺酰脲类、奥利司他（XenicalV）和艾塞那肽（Byetta）等。然而，很多已知的降血糖药都表现出了不合人意的副作用，并且在某些情况下是有毒的。举例而言，对于糖尿病患者患有严重的胰腺胰岛素分泌降低的情况，胰岛素促分泌剂与胰岛素增敏剂的有效性降低。类似地，对于糖尿病患者的胰岛素抵抗明显很高时，胰岛素制剂与胰岛素促分泌剂的有效性降低。
原则上，可以采用对含有分泌或产生胰岛素的细胞组织（即胰岛）进行成功移植来治疗糖尿病。对产胰岛素细胞进行移植的方法已经被尝试作为一种用于逆转或治愈1型糖尿病的方法，但是存在与外科手术有关和与有毒的免疫抑制型药物（需要服用该药物来预防或减轻异体移植排异以及自身免疫的复发）有关的显著风险。此外，如今在美国有超过一百万名患有1型糖尿病的人，但是由尸体的胰腺组织供应胰岛却是有限的。例如，每年仅能获得6000个器官，需要2个或3个器官才能提供足够的胰岛来逆转一个人的1型糖尿病。所以，急迫地需要提供具有功能（胰岛素生成）的β细胞的新来源。
对于可诱导β细胞增殖的化合物的高通量筛选分析，本领域中只记载了一个实例。这一筛选方法利用了生长阻滞、可逆性永生化的小鼠β细胞。这一方法的主要缺点是经过这种筛选方法鉴定出的化合物对原代β细胞可能不具有相同的效果，也就是说，所鉴定出的化合物只是专门用于在生长阻滞、可逆性永生化的小鼠β细胞中诱导增殖。所以，需要对可诱导原代β细胞（例如，没有发生转化的β细胞）增殖的化合物进行筛选的方法。
发明内容
本发明一方面提供了使胰腺细胞群中的β细胞复制增加的方法，所述方法包括：用腺苷激酶（ADK）的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的抑制剂或AMP活化蛋白激酶（AMPK）的活化剂与胰腺细胞群进行接触。
本发明另一方面提供了对用于增加β细胞复制的候选化合物进行筛选的方法，所述方法包括如下步骤：（a）将测试化合物与胰腺细胞群进行接触；（b）选择如下化合物：（i）使培养物中的细胞总数增加；（ii）相比于未处理的对照，使培养物中表达至少一种β细胞标记的细胞总数增加；（iii）相比于未经处理的对照，使表达至少一种β细胞标记的细胞相对于培养物中细胞总数的比例增加；（iv）相比于未经处理的对照，使表达至少一种细胞复制标记的细胞数增加；或者（v）相比于未经处理的对照，使表达至少一种细胞复制标记的细胞比例增加；并且其中，胰腺细胞是原代胰腺细胞。
附图说明
图1描述了示出由A10和B8引起的、PH3相对于PDX1增加的百分比的柱状图。
图2a和图2b描述了示出化合物A10（5-IT）的浓度对β细胞增殖（图2a）和小鼠皮肤成纤维细胞增殖（图2b）的影响的曲线图。对β细胞的EC50经测定为0.47μM。
图3描述了示出化合物B8的浓度对β细胞增殖的影响的曲线图（EC50=9.1μM）。
图4描述了示出在处理4天后，化合物A10和B8对Ki-67的诱导倍数的折线图。在第0天加入化合物，并在第2天更换介质。
图5描述了示出介质的血清浓度对Ki-67诱导作用（由1μM A10在β细胞中引起）的影响的柱状图。
图6描述了示出葡萄糖对β细胞中的Ki-67诱导作用和PDX+表达（由A10引起）没有影响的曲线图。
图7描述了示出腺苷不以浓度依赖的方式引起对大鼠胰岛中PDX+和Ki-67诱导作用的曲线图。
图8a和图8b描述了示出腺苷受体拮抗剂对A10诱导的Ki-67增加作用的影响的柱状图。图8a：以2μM、1μM、0.2μM、0.04μM或0.0μM（无拮抗剂）浓度的拮抗剂进行试验。图8b：以0.2μM浓度的拮抗剂进行试验。
图9描述了示出腺苷激酶抑制剂A10和腺苷单磷酸活化激酶活化剂AICAR对β细胞复制的影响的柱状图。
图10描述了示出AMPK-抑制作用对A10诱导的β细胞复制的影响的柱状图。
图11a和图11b描述了某些示例性腺苷激酶抑制剂的结构，分别为基于核苷的腺苷激酶抑制剂（图11a）和基于非核苷的腺苷激酶抑制剂（图11b）。
图12为示出体内β细胞复制的增加作用的柱状图。
图13a-图13d显示出腺苷激酶抑制剂（ADK-Is）诱导了大鼠、小鼠和猪的β细胞的增殖。图13a显示出促进β细胞复制的某些示例性ADK-Is的化学结构与名称。图13b显示出剂量反应曲线，示出了在对ABT-702处理的应答中，鼠β细胞增殖（上图）和猪β细胞增殖（下图）之间的关系。图13c显示出大鼠胰岛培养物的剂量反应曲线，所述曲线示出了用化合物5-IT（左图，EC50=4.7μM）和ABT-702（右图，EC50=7.0μM）进行处理与β细胞增殖之间的关系。图13d显示出用DMSO或5-IT（2μM）处理96h和144h后对β细胞数的定量。误差棒表示标准差，相对于用辅料进行处理的情况*P<0.01。
图14a和图14b显示出β细胞表达出核腺苷激酶（ADK），其作为增殖作用的细胞自主负性调节剂。图14a为示出siRNA介导的ADK下调作用（knockdown）的Western印迹，该下调作用使用来自经稳定转导的细胞的H4IIE（大鼠肝细胞系）裂解物进行评价，所述转导使用阴性对照siRNA（1道和3道）或ADK导向的siRNA（2道和4道）。用γ-微管蛋白将负载标准化。图14b为示出在感染含有对照siRNA序列（左图）或ADK导向的siRNA序列（右图）的病毒后，对β细胞复制进行定量的柱状图。在病毒编码的GFP表达的基础上，分别对同一孔中的未感染细胞和感染细胞的复制速率进行分析。误差棒表示SEM（n=8个独立的孔）；*P<0.01。
图15a和图15b显示出由ADK-Is诱导的β细胞复制对葡萄糖和胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）激动剂的加合作用。图15a为示出在多种葡萄糖浓度加上DMSO或5-IT（2μM）存在的情况下，对培养24h、48h或96h后的β细胞复制速率进行定量的柱状图。将各时间点的值归一化至5mM葡萄糖加上DMSO处理条件。各处理条件的标准差小于10%，误差棒未示出。在相同葡萄糖浓度和时间点下，当将经5-IT处理的孔与经DMSO处理的孔相比时，*P＜0.01；当将经DMSO或5-IT处理的孔与在相同时间点并采用相同处理（DMSO或5-IT）的5mM葡萄糖处理条件相比时，**P＜0.01。图15b为示出在用DMSO、5-IT、GLP-1、Ex4、5-IT加上GLP-1或5-IT加上Ex4处理24h后，对β细胞复制速率进行定量的柱状图。5-IT的浓度为2μM。GLP-1和Ex-4的浓度为20nM（左侧柱）和4nM（右侧柱）。将各值归一化至DMSO处理条件。误差棒表示标准差；对于所指示出的比较，*P＜0.01且**P＜0.03。
图16a-图16e显示了ADK-Is在体外和体内选择性地促进β细胞的复制。图16a显示出描述在用DMSO、5-IT（2μM）或ABT-702（15μM）处理后，对δ细胞（生长抑素+，左图）、α细胞（胰高血糖素+，中间图）和成纤维细胞（波形蛋白+，右图）的体外复制速率进行定量的柱状图。相比于DMSO处理条件，*P＜0.01和**P＜0.05。图16b是显示出对在EGF（40ng/mL）和HGF（20ng/mL）加上DMSO或ABT-702（15μM）存在的情况下生长的经分离鼠肝细胞的复制速率进行定量的柱状图。图16c是显示出在用BRDU以及辅料或ABT-702处理24h后，对小鼠胰岛β细胞的体内复制速率进行定量的柱状图。图16d是显示出在用BRDU以及辅料或ABT-702处理24h后，对小鼠外分泌细胞的体内复制速率进行定量的柱状图。图16e是显示出在用BRDU以及辅料或ABT-702处理24h后，对小鼠肝细胞的体内复制速率进行定量的柱状图。误差棒表示标准差，使用双尾t检验得到p值。
图17a和17b是显示出ADK-Is使得β细胞复制得以增加的柱状图。图17a显示出在用DMSO或5-IT（2μM）处理后，对β细胞复制进行的定量。通过PDX-1的存在和胰岛素染色对β细胞进行鉴定。*P＜0.001。图17b显示出在用DMSO、7-碘-2,3-二脱氧-7-脱氮腺苷（20μM、10μM）或芒霉素（6μM、1μM）处理后，对β细胞复制进行的定量。误差棒表示标准差。
图18a是显示出利用PDX-1和磷酸化组蛋白-H3共表达对β细胞复制进行定量的柱状图。用DMSO、5-IT（2μM）或ABT-702（15μM）对培养物进行处理。相比于DMSO处理条件，*P＜0.001。
图18b是显示出在DMSO、5-IT（2μM）或ABT-702（15μM）存在的情况下利用两天BRDU脉冲，随后继续进行两天而无化合物处理，对β细胞复制进行定量的柱状图。以化合物处理的孔中BRDU+和PDX-1+细胞相比于DMSO处理的孔所增加的倍数示出数据。相比于DMSO，*P＜0.002。
图19是显示出在注射对照siRNA或ADK导向的siRNA后，对ADK阳性胰岛细胞百分比进行自动定量的柱状图。误差棒表示标准差；*P＜0.001。
图20是显示出用ABT-702对小鼠进行体内处理使β细胞复制得以增加、而不使外分泌细胞的复制增加的柱状图。使用胰岛素免疫染色来鉴定β细胞、并使用BRDU免疫染色来鉴定复制细胞（左图），从而对体内的β细胞复制速率进行定量。同时，使用相同的组织切片对胰岛外的外分泌细胞的复制速率进行定量（右图）。
图21描述了用于鉴定促进β细胞复制的化合物的筛选方案的示意草图。
图22描述了示出SAHH抑制剂阿糖腺苷对β细胞增殖的影响的柱状图。
图23是对ADK途径进行总览的示意图。
具体实施方式
本发明一方面提供了使胰腺细胞群中的β细胞复制得以增加的方法，所述方法包括：用腺苷激酶（ADK）的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的抑制剂或AMP活化蛋白激酶（AMPK）的活化剂与胰腺细胞群或制备品进行接触。
本文所使用的“使β细胞复制得以增加”意味着β细胞以更快的速率和/或更高的频率进行复制。在本发明的这一方面或其它方面的一些实施方式中，相对于未经处理的对照，β细胞复制增加了至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。可通过测定与本文所述的化合物接触时发生复制的β细胞数目（相对于β细胞不与化合物接触的对照），从而确定β细胞复制的增加百分比或增加倍数。复制的增加也可基于发生复制的细胞同分别处理的细胞和未经处理的对照中的细胞总数的比值。在一些实施方式中，经处理和未经处理的对照中的细胞总数被用来确定复制频率。
在某些实施方式中，“使β细胞复制得以增加”也包括由于β细胞祖细胞分化成β细胞而引起的β细胞数的增加。在可选的实施方式中，“使β细胞复制得以增加”不包括由于β细胞祖细胞分化成β细胞而引起的β细胞数的增加。
本文所使用的术语“β细胞”包括：原代胰腺β细胞；由去分化细胞衍生而来的胰腺β样细胞，所述去分化细胞例如诱导的多能干细胞（iPSCs）；或者直接由内胚层起源的细胞（例如，肝细胞或外分泌的胰腺细胞）重编程而来的胰腺β样细胞。在一个实施方式中，β细胞不是永生化细胞系（例如在培养物中无限增殖）。在一个实施方式中，β细胞不是经转化的细胞、例如显示出转化特性（如在软琼脂上生长或不存在接触抑制）的细胞。
本文所使用的术语“胰腺β样细胞”是指如下细胞：表达出内源性胰腺β细胞所表达的胰岛素量的至少15%、或至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或至少约100%或者高于100%、例如是内源性胰腺β细胞所分泌胰岛素的量的至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约2.5倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或者高于约5倍。在一个实施方式中，胰腺β样细胞表现出内源性胰腺β细胞的至少一种或至少两种特性，例如但不限于：作为对葡萄糖的响应而分泌出胰岛素，和表达β细胞标记物（例如c-肽、Pdx-1和glut-2）。本文中胰腺β样细胞有时是指“重编程β细胞”，本文中该术语可与术语“胰腺β样细胞”互换使用。在一个实施方式中，胰腺β样细胞不是永生细胞（例如在培养物中无限增殖）。在一个实施方式中，胰腺β样细胞不是经转化的细胞、例如显示出转化特性（如在软琼脂上生长或不存在接触抑制）的细胞。
本文所使用的术语“去分化细胞（de-differentiated cell）”指的是由已分化细胞重编程的细胞。本文所使用的术语“经重编程”或“重编程”是指改变或逆转体细胞分化状态的方法。在重编程前，细胞可部分分化或终末分化。重编程涵盖了将体细胞分化状态完全逆转为多能细胞。分化作用的这种完全逆转产生了经诱导的多能（iPS）细胞。重编程还涵盖了分化状态的部分逆转，例如逆转至多功能状态（multipotent state）或逆转至既非多能也非多功能的体细胞（丧失了其所来源的已分化细胞的一种或多种特征的细胞），例如由已分化细胞直接重编程至不同的体细胞类型。重编程通常包括改变（例如逆转）至少一些可遗传类型的核酸修饰（例如甲基化）、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等，上述作用发生在作为受精卵发育为成体的细胞分化期间。
本文所述的方法可应用于由重编程（去分化）细胞衍生而来的胰腺β样细胞。例如，通过使用本领域技术人员已知的因子和条件分化成胰腺β样细胞的iPS细胞得到。也可通过对内胚层体细胞/外分泌体细胞直接进行重编程而无需逆转至多能干细胞状态（例如，iPS细胞）来衍生得到胰腺β样细胞，例如在Zhou等，Nature，第455卷，2008年10月2日，第627-633页中所述，以引用的方式将其整体并入本文。
本文所使用的术语“iPS细胞”和“诱导的多能干细胞”可以互换使用，是指由非多能细胞（通常为成年体细胞）人工衍生（即，去分化、重编程）得到的多能干细胞，例如通过诱导一个或多个基因的强制表达。
本文所使用的术语“内源性胰腺β细胞”或者“原代胰腺β细胞”是指哺乳动物胰腺的产胰岛素细胞或者哺乳动物的胰腺β细胞表型的细胞。胰腺β细胞表型是本领域普通技术人员所公知的，包括例如作为对葡萄糖水平增高的响应而分泌胰岛素、表达出标记物（如c-肽、PDX-1多肽和Glut2）、以及显著的形态特征（如排布在体内胰腺的胰岛中、通常具有直径约9-15μm的小的纺锤样细胞）。可在胰岛中发现内源性胰腺β细胞。在本发明的方法中，作为胰岛的一部分，原代胰腺β细胞可在体外被接触。
本文所使用的术语“产胰岛素细胞”包括本文所述的术语原代β细胞以及本文所述的术语胰腺β样细胞，所述“产胰岛素细胞”以组成型或可诱导型方式来合成（即，转录胰岛素基因、翻译胰岛素原mRNA、将胰岛素原mRNA修饰为胰岛素蛋白）、表达（即，表明由胰岛素基因携带的表型性状）或分泌（将胰岛素释放至胞外空间）胰岛素。
本文所使用的术语“内胚层起源的细胞”是指包含由内胚层细胞发育而来的任何细胞在内的内胚层起源的细胞，是来自处于极早期胚胎中的三个原胚层之一的细胞，分化形成胚胎内脏、然后再形成呼吸道和消化道的内层以及肝脏和胰脏。对不同模型的生物体和人进行的研究提示出，在进化上保守的诱导信号和转录因子网络诱发了肝细胞和胰腺细胞的分化，并且对如何促进来自不同干细胞类型和祖细胞类型的肝细胞和β细胞分化提供了指导。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，相对于未经抑制的对照，腺苷激酶的活性被抑制或被降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%（即，完全丧失活性）。不希望受理论的束缚，可通过使用本领域已知的测定该类磷酸化反应的方法来测定腺苷的磷酸化，从而测定腺苷激酶的活性。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，腺苷激酶抑制剂的IC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于10nM、小于或等于1nM、小于或等于0.1nM、小于或等于0.01nM或者小于或等于0.001nM。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，相对于未经活化的对照，AMP活化激酶的活性增加至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少1倍、至少1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍以上。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，AMP活化激酶的活化剂的EC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于10nM、小于或等于1nM、小于或等于0.1nM、小于或等于0.01nM或者小于或等于0.001nM。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，相对于未经抑制的对照，SAHH的活性被抑制或被降低至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或者100%（即，完全丧失活性）。可使用例如下述文献中描述的方法测定SAHH的活性：美国专利申请号10/836,953和11/389,393，以引用的方式将二者的内容并入本文。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，SAHH抑制剂的IC50小于或等于500nM、小于或等于250nM、小于或等于100nM、小于或等于50nM、小于或等于10nM、小于或等于1nM、小于或等于0.1nM、小于或等于0.01nM或者小于或等于0.001nM。
将认识到的是，本文所述的许多化合物可对细胞施加多重影响。例如，SAHH类似物和杀结核菌素在甲基化途径中的多个点发挥作用。因此，将化合物和分子分入某些组（例如ADK抑制剂或SAHH抑制剂）并非意在进行精确的、不重叠的科学分组。对这类信息进行阐明以协助本领域技术人员理解发明人所考虑的某些科学数据。例如，本文所述的许多ADK抑制剂也可作为SAHH抑制剂适合于本发明。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，腺苷激酶抑制剂为式（I）及其药学上可接受的盐和酰胺：
Figure BDA00002034784300111
式（I）
其中：
R1为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、OR5、SR5、N(R6)2、(CH2)mR7，或者R1和R2连同它们所连接的原子形成可被任选取代的5-8元杂环；
R2和R3各自独立地为H、OR5、SR5、N(R5)2，或者R2和R3连同它们所连接的原子形成可被任选取代的5-8元杂环；
R4为H、卤素、CN、N2、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基或任选取代的杂芳基烷基；
R5各自独立地为H、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选任选取代的杂芳基烷基，或者两个R5连同它们所连接的氮原子形成5-7元环，所述5-7元环任选包含选自N、O和S的1-3个另外的杂原子；
R6为R5、OR5、SR5、N(R5)2、N2、CN、卤素或
R7各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
X为O、S、NH或CH2；
Y和Z各自独立地为N或CR8；
R8各自独立地为H、卤素、CN、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Z1各自独立地为O或S；
Z2各自独立地为OM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基。
M为碱金属阳离子；
m为1、2、3或4；
N为0、1或2。
在一些优选的实施方式中，M是Na+。
在一些实施方式中，R1为任选取代的C1-C6烷基、OR5、N(R5)2或(CH2)mR6。优选C1-C6烷基是甲基。当R1是N(R5)2时，R5中的至少一个是H，优选两个R5均是H。当R1是OR5时，R5可以是H或C1-C6烷基，优选R5是H。
当R1是(CH2)mR6时，m是1或2，优选m是1。在一些实施方式中，R6是OR5或N(R5)2。当R6是N(R5)2时，R5中的至少一个是H，优选两个R5均是H。当R6是OR5时，R5可以是H或任选取代的C1-C6烷基，优选是R5是H。R1最优选是CH3、CH2OH或NH2。
在一些实施方式中，式（I）中的R1和R2连同它们所连接的原子形成5-8元杂环，其中，所述杂环的骨架包含其中Z3独立地为O或S，Z4为H、OM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基或者任选取代的杂芳基烷基。
在一些实施方式中，Y或Z中的至少一个是CR8，优选Y是CR8，并且更优选Y是CH2。在一个实施方式中，Y是CR8且Z是N。
在一些其它实施方式中，Y和Z两者都是CR8。优选Y是CH2且Z是CR8，其中，R8选自于由CN、卤素、芳基和杂芳基所组成的组。芳基优选是苯基，所述苯基可被任选取代。当R8是卤素时，优选为I和Br，更优选为I。
在一些其它实施方式中，R4是卤素或N(R5)2。卤素包括Br、F、I或Cl，优选卤素是Cl。当R4是N(R5)2时，两个R5都可以是H，或优选一个R5是H而另一R5选自于由芳基和杂芳基所组成的组。所述芳基优选是苯基。在一些实例中，所述苯基为任选取代的苯基、例如4-氟-苯基。
在一些其它实施方式中，X选自于由O、NH和CH2所组成的组。在一些优选的实施方式中，X是O。
在一些实施方式中，R2和R3都是OR5。R2和R3优选都是OH。
在一些实施方式中，式（I）化合物具有式（Ia）所示的立体化学构型：
式（Ia）。
在其它的实施方式中，式（I）化合物具有式（Ib）所示的立体化学构型：
式（Ib）。
在一些实施方式中，式（I）化合物不是7-脱氮-7-碘-2′-脱氧腺苷、7-脱氮-2′-脱氧腺苷、7-脱氮-2′,3′-二脱氧腺苷、桑吉瓦霉素、杀结核菌素或腺苷。
在一些实施方式中，式（I）化合物是芒霉素、5′-脱氧腺苷、5′-氨基腺苷、5′-脱氧-5-碘代杀结核菌素、5-碘代杀结核菌素（本文也称为A10或5-IT）、7-脱氮-7-碘-2′,3′-二脱氧腺苷（本文也称为二脱氧-7-碘代脱氮腺苷或d7IdAdo）、去甲芒霉素、去甲杀结核菌素、A-134974、丰加霉素、GP-515（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、GP-3269（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-氟苯基氨基)-5-苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-四氢-5-甲基呋喃-3,4-二醇）、GP-683（(2R,3S,4R,5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3,4-二醇）、GP-947（(2S,3S,4R,5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3,4-二醇）、化合物1（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、化合物2（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、化合物3（(1S,2R,3S,5R)-3-氨基-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)环戊烷-1,2-二醇）、化合物4（(1S,2R,3S,5R)-3-氨基-5-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)环戊烷-1,2-二醇）或化合物5（(1S,2R,3S,4R)-4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1,2,3-三醇）。
在本发明这一方面和其它方面的一些实施方式中，腺苷激酶抑制剂为式（II）及其药学上可接受的盐和酰胺：
式（II）
其中：
R9各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R9连同它们所连接的氮原子形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O和S的另外的杂原子；
R10、R11和R12各自独立地为H、OR14、N(R14)2、N2、NO2、CN、卤素、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基；
R13各自独立地为卤素、CN、NH2或者任选取代的C1-C6烷基；
R14为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R14连同它们所连接的氮原子形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
X2为N或CR15；
R15为NHR16、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基或者任选取代的杂芳基烷基；
R16为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基或者任选取代的杂芳基烷基；
Y2为N或CH；
q为0、1、2或3。
在一些实施方式中，R9是H或任选取代的C1-C6烷基。
在优选的实施方式中，R10是H。
在一些实施方式中，R11选自于由H、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳基烷基和任选取代的杂芳基烷基所组成的组。当R11是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳基烷基或者任选取代的杂芳基烷基时，R14可选自于由如下基团所组成的组：苯基、噻吩-2-基、1-甲基-2-氧代苯并噁唑啉-5-基、2-(二甲基氨基)-5-嘧啶基、2-(N-甲酰基-N-甲基氨基)-3-嘧啶基、2-(N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基氨基)-5-嘧啶基、5-二甲基氨基-2-吡啶基、5-(N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基氨基)-2-吡啶基、2-(N-甲基氨基)-5-嘧啶基、2-(1-吗啉基)-5-嘧啶基、2-(1-吡咯烷基)-5-嘧啶基、2-二甲基氨基-5-嘧啶基、2-呋喃基、2-氧代苯并噁唑啉-5-基、2-吡啶基、3-(二甲基氨基)苯基、3-氨基-4-甲氧基苯基、3-溴-4-(二甲氧氨基)苯基、3-甲氧基苯基、3-甲基-4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基、3-甲基-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基、3-甲基-4-(N-甲基-N-(三氟乙酰基)氨基)苯基、3-甲基-4-(N-甲基氨基)苯基、3-甲基-4-吡咯烷基苯基、3-吡啶基、3,4-二氯苯基、3,4-亚甲二氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、4-(乙酰基氨基)苯基、4-(二甲基氨基)-3-氟苯基、4-(二甲基氨基)苯基、4-(咪唑-1-基)苯基、4-(甲硫基)苯基、4-(吗啉基)苯基、4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基)苯基、4-(N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基、4-(N-乙基-N-甲酰基氨基)苯基、4-(N-乙基氨基)苯基、4-(N-甲酰基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-(N-异丙基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-((2-二甲基氨基)乙基)氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙酰基)氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(2-氰基)乙基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(3-甲氧基)丙酰基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-乙酰基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-甲酰氨基)苯基、4-(N-甲基-N-三氟乙酰基氨基)苯基、4-(N-吗啉基)苯基、4-(噻吩-2-基)苯基、4-(脲基)苯基、4-(2-(二甲基氨基)乙酰基氨基)苯基、4-(2-(2-甲氧基)乙酰基氨基)乙基)氨基)苯基、4-(2-甲氧基)乙氧基苯基、4-(2-氧代-1-噁唑啉基)苯基、4-(4-甲氧基-2-丁基)苯基、4-(4-甲基哌啶基)苯基、4-(5-嘧啶基)苯基、4-丁氧基苯基、4-氨甲酰基苯基、4-氯苯基、4-氰基苯基、4-二乙基氨基苯基、4-二乙基丙二酰基烯丙基苯基、4-二甲基氨基苯基、4-乙氧基苯基、4-乙基苯基、4-羟基苯基、4-咪唑基苯基、4-碘苯基、4-异丙基苯基、4-甲氧基苯基、4-甲基氨基苯基、4-甲基磺酰基苯基、4-吗啉基苯基、4-N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲酰基氨基)苯基、4-N-(3-甲氧基丙酰基)-N-5-异丙基-氨基)苯基、4-N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-N-甲酰基哌啶基苯基、4-硝基苯基、4-哌啶基苯基、4-吡啶基苯基、4-吡咯烷基苯基、4-叔丁基丙烯酰基苯基、5-(二甲基氨基)-噻吩-2-基、5-氨基-2-吡啶基、5-二甲基氨基-2-吡嗪基、103-二甲基氨基-哒嗪-6-基、5-二甲基氨基-2-吡啶基、5-嘧啶基苯基、6-(N-甲基-N-甲酰基氨基)-3-吡啶基、6-(N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)-3-吡啶基、6-(2-氧代-噁唑啉基)-3-吡啶基、6-二甲基氨基-3-吡啶基、6-咪唑基-3-吡啶基、6-吗啉基-3-吡啶基、6-吡咯烷基-3-吡啶基、(2-丙基)-3-吡啶基、以及(4-甲酰基氨基)苯基、(噻吩-2-基)甲基、(噻吩-3-基)甲基、丁基、环庚基、戊基、噻吩-2-基、1-(3-溴苯基)乙基、2-(N-苯基甲氧基羰基)氨基苯基、2-(3-溴苯基)乙基、2-(3-氰基苯基)甲基、2-(4-溴苯基)乙基、2-(5-氯-2-(噻吩-3-基)苯基、2-溴苯基、2-呋喃基、2-甲基丙基、2-苯基乙基、苯基甲基、2,3-二甲氧基苯基、2,3-亚甲二氧基苯基、3-(呋喃-2-基)苯基、3-(噻吩-2-基)苯基、3-(2-吡啶基)苯基、3-(3-甲氧基苄基)苯基、3-(氨基)丙炔基、3-苄氧基苯基、3-溴-4-氟苯基、3-溴-5-碘苯基、3-溴-5-甲氧基苯基、3-溴苯基、3-溴苯基甲基、3-氨甲酰基苯基、3-氯苯基、3-氰基苯基、3-二乙基丙二酰基烯丙基苯基、3-二甲基氨基苯基、3-乙氧基苯基，3-氟-5-三氟甲基苯基、3-氟苯基、3-羟基苯基、3-碘苯基、3-甲氧基乙氧基苯基、3-甲氧基苯基、3-甲基苯基、3-甲基磺酰基苯基、3-甲基噻吩基、3-叔丁基丙烯酰基苯基、3-三氟甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、3-乙烯基吡啶基苯基、3,4-二氯苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,4-亚甲二氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3,5-二(三氟甲基)苯基、3,5-二溴苯基、3,5-二氯苯基、3,5-二甲氧基苯基、3,5-二甲基苯基、4-(2-丙基)苯基、4-(2-丙基)氧基苯基、4-苄氧基苯基、4-溴苯基、4-溴噻吩-2-基、4-丁氧基苯基、4-二甲基氨基苯基、4-氟-3-三氟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-新戊基苯基、4-苯氧基苯基、5-溴噻吩-2-基、环己基、环丙基、己基、甲基、苯基、(2-溴-5-氯苯基)甲基、(2-溴苯基)甲基、6-环丙基甲基氨基-3-吡啶基、以及(5-氯-2-(3-甲氧基苯基)苯基)甲基。在一些实施方式中，R11是H。
在一些实施方式中，R12选自于由N(R14)2、OR14、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳基烷基和任选取代的杂芳基烷基所组成的组。当R12是N(R14)2时，R14中的一个是H或者两个R14都可以是H。优选至少一个R14不是H，例如一个R14是H，而另一R14为任选取代的C1-C6烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳基烷基或者任选取代的杂芳基烷基，最优选两个R14独立地为C1-C6烷基。在一些实施方式中，R12选自于由二烷基氨基（例如二甲基氨基）和任选取代的5-8元杂环所组成的组，其中所述杂环包含至少一个氮原子（例如吗啉、吡啶）。
在某些优选的实施方式中，q是0。
在某些实施方式中，R14为任选取代的C1-C6烷基，例如任选取代的甲基或任选取代的乙基。所述C1-C6烷基可被C1-C6烷基、C2-C6烯基、芳基或环基取代，所述这些取代基团各自可被任选取代。在一些实施方式中，R14是取代的甲基或取代的乙基，其中，所述甲基或乙基被任选取代的芳基所取代。在一些实施方式中，R14是环基，例如环戊烷、环己烷或环庚烷。环烷基优选是环己烷。在一些实施方式中，R14是杂环基，杂环基优选包含至少一个O原子或N原子。在一些其它实施方式中，R14是任选取代的芳基，例如任选取代的苯基，例如由至少一个卤素取代的芳基。
在一些实施方式中，X2是CR15，R15选自于由如下基团所组成的组：NHR16、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基以及任选取代的杂芳基烷基。R16优选是任选取代的烷基，例如任选取代的甲基、任选取代的乙基，例如由芳基或杂芳基（例如吲哚基）取代的甲基。
在一些实施方式中，R15选自于由如下基团所组成的组：苯基、噻吩-2-基、1-甲基-2-氧代苯并噁唑啉-5-基、2-(二甲基氨基)-5-嘧啶基、2-(N-甲酰基-N-甲基氨基)-3-嘧啶基、2-(N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基氨基)-5-嘧啶基、5-二甲基氨基-2-吡啶基、5-(N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基氨基)-2-吡啶基、2-(N-甲基氨基)-5-嘧啶基、2-(1-吗啉基)-5-嘧啶基、2-(1-吡咯烷基)-5-嘧啶基、2-二甲基氨基-5-嘧啶基、2-呋喃基、2-氧代苯并噁唑啉-5-基、2-吡啶基、3-(二甲基氨基)苯基、3-氨基-4-甲氧基苯基、3-溴-4-(二甲基氨基)苯基、3-甲氧基苯基、3-甲基-4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基、3-甲基-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基、3-甲基-4-(N-甲基-N(三氟乙酰基)氨基)苯基、3-甲基-4-(N-甲基氨基)苯基、3-甲基-4-吡咯烷基苯基、3-吡啶基、3,4-二氯苯基、3,4-亚甲二氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、4-(乙酰基氨基)苯基、4-(二甲基氨基)-3-氟苯基、4-(二甲基氨基)苯基、4-(咪唑-1-基)苯基、4-(甲硫基)苯基、4-(吗啉基)苯基、4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基)苯基、4-(N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基、4-(N-乙基-N-甲酰基氨基)苯基、4-(N-乙基氨基)苯基、4-(N-甲酰基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-(N-异丙基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-((2-二甲基氨基)乙基)氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙酰基)苯基、4-(N-甲基-N-(2-氰基)乙基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-(N-甲基-N-(3-甲氧基)丙酰基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-乙酰基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-甲酰基氨基)苯基、4-(N-甲基-N-三氟乙酰基氨基)苯基、4-(N-吗啉基)苯基、4-(噻吩-2-基)苯基、4-(脲基)苯基、4-(2-(二甲基氨基)乙酰基氨基)苯基、4-(2-(2-甲氧基)乙酰基氨基)乙基)氨基)苯基、4-(2-甲氧基)乙氧基苯基、4-(2-氧代-1-噁唑啉基)苯基、4-(4-甲氧基-2-丁基)苯基、4-(4-甲基哌啶基)苯基、4-(5-嘧啶基)苯基、4-丁氧基苯基、4-氨甲酰基苯基、4-氯苯基、4-氰基苯基、4-二乙基氨基苯基、4-二乙基丙二酰基烯丙基苯基、4-二甲基氨基苯基、4-乙氧基苯基、4-乙基苯基、4-羟基苯基、4-咪唑基苯基、4-碘苯基、4-异丙基苯基、4-甲氧基苯基、4-甲基氨基苯基、4-甲基磺酰基苯基、4-吗啉基苯基、4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲酰基氨基)苯基、4-(N-(3-甲氧基丙酰基)-N-5-异丙基-氨基)苯基、4-N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基、4-N-甲酰基哌啶基苯基、4-硝基苯基、4-哌啶基苯基、4-吡啶基苯基、4-吡咯烷基苯基、4-叔丁基丙烯酰基苯基、5-(二甲基氨基)-噻吩-2-基、5-氨基-2-吡啶基、5-二甲基氨基-2-吡嗪基、103-二甲基氨基-哒嗪-6-基、5-二甲基氨基-2-吡啶基、5-嘧啶基苯基、6-(N-甲基-N-甲酰基氨基)-3-吡啶基、6-(N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)-3-吡啶基、6-(2-氧代-噁唑啉基)-3-吡啶基、6-二甲基氨基-3-吡啶基、6-咪唑基-3-吡啶基、6-吗啉基-3-吡啶基、6-吡咯烷基-3-吡啶基、(2-丙基)-3-吡啶基、以及(4-甲酰基氨基)苯基、(噻吩-2-基)甲基、(噻吩-3-基)甲基、丁基、环庚基、戊基、噻吩-2-基、1-(3-溴苯基)乙基、2-(N-苯基甲氧基羰基)氨基苯基、2-(3-溴苯基)乙基、2-(3-氰基苯基)甲基、2-(4-溴苯基)乙基、2-(5-氯-2-(噻吩-3-基)苯基、2-溴苯基、2-呋喃基、2-甲基丙基、2-苯基乙基、苯基甲基、2,3-二甲氧基苯基、2,3-亚甲二氧基苯基、3-(呋喃-2-基)苯基、3-(噻吩-2-基)苯基、3-(2-吡啶基)苯基、3-(3-甲氧基苄基)苯基、3-(氨基)丙炔基、3-苄氧基苯基、3-溴-4-氟苯基、3-溴-5-碘苯基、3-溴-5-甲氧苯基、3-溴苯基、3-溴苯基甲基、3-氨甲酰基苯基、3-氯苯基、3-氰基苯基、3-二乙基丙二酰基烯丙基苯基、3-二甲基氨基苯基、3-乙氧基苯基、3-氟-5-三氟甲基苯基、3-氟苯基、3-羟基苯基、3-碘苯基、3-甲氧基乙氧基苯基、3-甲氧基苯基、3-甲基苯基、3-甲基磺酰基苯基、3-甲基噻吩基、3-叔丁基丙烯基苯基、3-三氟甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、3-乙烯基吡啶基苯基、3,4-二氯苯基、3,4-二甲氧基苯基、3,4-亚甲二氧基苯基、3,4,5-三甲氧基苯基、3,5-二(三氟甲基)苯基、3,5-二溴苯基、3,5-二氯苯基、3,5-二甲氧基苯基、3,5-二甲基苯基、4-(2-丙基)苯基、4-(2-丙基)氧基苯基、4-苄氧基苯基、4-溴苯基、4-溴噻吩-2-基、4-丁氧基苯基、4-二甲基氨基苯基、4-氟-3-三氟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-新戊基苯基、4-苯氧苯基、5-溴噻吩-2-基、环己基、环丙基、己基、甲基、苯基、(2-溴-5-氯苯基)甲基、(2-溴苯基)甲基、6-环丙基甲基氨基-3-吡啶基、(5-氯-2-(3-甲氧苯基)苯基)甲基、2-溴苯基、3-溴苯基、4-溴苯基、(2-溴苯基)甲基、2-氯苯基、3-氯苯基、4-氯苯基、2-氟苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、2-硝基苯基、3-硝基苯基、4-硝基苯基、2-甲氧基苯基、3-甲氧基苯基、4-甲氧基苯基、2-氨基苯基、3-氨基苯基、4-氨基苯基、环己烷、四氢吡喃（例如四氢呋喃-4-基）、1-(2-溴苯基)乙基、4-甲基戊-1-烯-4-基、以及(吲哚-2-基甲基)氨基。
在一些实施方式中，Y2是N。
在一些实施方式中，式（II）化合物是ABT-702（5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺，本文也称为B8）、化合物6（7-(4-(二甲基氨基)苯基)蝶啶-4-胺）、化合物7（5-(3-溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物8（5-(2-溴苄基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物9（5-环己基-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物10（5-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物11（5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物12（5-(2-甲基戊-4-烯-2-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）或化合物13（N5-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,5-二胺）。
在一些实施方式中，式（II）化合物选自于由如下化合物所组成的组：4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(4-硝基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-7-(4-硝基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基5-(4-氟苯基)-7-(4-氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-氯苯基)-7-(4-氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基-7-(4-氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-7-(4-氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5,7-二苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-新戊基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-丁氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-丁氧基苯基)-7-(4-N-甲酰基哌嗪基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-苄氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)苯基)-7-(4-二乙基丙二酰基烯丙基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)苯基)7-(4-叔丁基丙烯酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-叔丁基丙烯酰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-二乙基丙二烯基烯丙基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-乙烯基吡啶基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-三氟甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氨甲酰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-苄氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-丁氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(2-吡啶基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氟苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-乙基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羟基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-碘苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-乙氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-三氟甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二氯苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-羟基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-哌啶基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(咪唑-1-基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氯苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-异丙基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-三氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(3-甲氧基苄基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基乙氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4-亚甲二氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-乙氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-二甲基氨基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-硝基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3,4-亚甲二氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氨甲酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-甲氧基)乙氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-三氟甲基苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(2-呋喃基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-咪唑基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-(噻吩-2-基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-(3-吡啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(4-甲基哌啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-吗啉基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(5-溴噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(5-嘧啶基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(4-氟苯基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(二甲基氨基)噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-碘苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二溴苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-(4-甲基哌啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基磺酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲氧苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(甲硫基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3,4-二氯苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-甲基磺酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氨基-4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-溴-4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-三氟乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基-3-氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙基-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4,4-双(乙酰基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-异丙基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(3-甲氧基丙酰基)-N-异丙基-氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-氰基)乙基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(3-甲氧基)丙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(4-甲氧基-2-丁基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙酰基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-甲基-N-(三氟乙酰基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氰基苯基)-7-(4-甲基磺酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氰基苯基)-7-(4-(N-甲基-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-甲酰基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-甲氧基乙基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吡咯烷基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(二甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(N-甲氧基乙基-N-甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(N-甲酰基-N-甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(N-甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(1-吡咯烷基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(1-吗啉基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(2-氧代-3-噁唑啉基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(噻吩-2-基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(呋喃-2-基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(3-甲氧基苯基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-(吗啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-(噻吩-2-基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-(5-嘧啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)甲基-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-苯基乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-甲基丙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(丁基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(4-溴苯基)乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(丁基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(3-氰基苯基)甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(N-苯基甲氧基羰基)氨基乙基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环庚基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(5-氯-2-(噻吩-3-基)苯基甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(戊基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-己基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(3-溴苯基)乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴苯基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环丙基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴-5-氯苯基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-甲基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2,3-亚甲二氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氟-5-三氟甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4-二氯苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-氟-3-三氟甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-哌啶基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲基噻吩基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2,3-二甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲基磺酰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-乙酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-甲酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(甲氧基乙酰基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-三氟乙酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-戊酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-苯甲酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(N-BOC-甘氨酰)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(N-邻苯二甲酰基甘氨酰)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(乙氧基羰基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(乙基氨基羰基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-烯丙基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(2-(N,N-二甲基氨基)乙基氨基)-5-(4-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(4-(N,N-二甲基氨基)丁基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(N-烯丙基-N-甲酰基氨基)-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-二乙酰基氨基-5-(对二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-氨基-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-二甲基氨基-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-二甲基氨基-2-吡嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-氧代苯并噁唑啉-6-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(1-甲基-2-氧代苯并噁唑啉-6-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((5-氯-2-(3-甲氧基苯基)苯基)甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((噻吩-2-基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((噻吩-3-基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴苯基)甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲酰基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-((2-二甲基氨基)乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-甲氧基)乙酰基氨基)乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-((4-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-(二甲基氨基)乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-氧代-3-噁唑啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(2-丙基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-咪唑基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基甲基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(3-氨基丙炔基)苯基甲基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(3-溴苯基)乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-呋喃基)-7-(4-(N-吗啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-二甲基氨基-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(脲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-苯基甲基-3-哌啶基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(3-甲基-5-异噁唑基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-氯-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-甲氧基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(1,2,4-三唑-4-基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-吗啉基-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-噻唑基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吡唑基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-甲基-脲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-嘧啶)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氟-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-甲酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氟-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-甲基磺酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-甲基磺酰基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(1-甲基-5-二氢吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(1-甲基-5-苯并咪唑基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-二甲基氨基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吡咯烷基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-吗啉基-2-吡嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基氨基)2-吡嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(吗啉基甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基)2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(咪唑基甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(1-吗啉基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-((二甲基氨基)甲基)-苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(4-羟基-1-哌啶基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(N-甲酰基-N-甲基氨基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(2-丙烯基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-6-苯并噁唑基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-(N-甲酰基氨基)乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(甲基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶盐酸盐；4-(2-甲氧基乙基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶盐酸盐；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-甲基-2-咪唑基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶三盐酸盐；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(氨基甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-溴-4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(3-(二甲基氨基)丙炔基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(3-氨基-3-甲基丁炔基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基膦酸基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(3-甲氧基丙炔基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基-3-氧代-2H-4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-二甲基氨基)乙基-3-氧代-2H-4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2,3-二氢-3-(二甲基氨基乙基)-2-氧代苯并噁唑-6-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基-3-氧代-2H-4H-苯并-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2,2,4-三甲基-3-氧代-2H-4H-苯并-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(4-(2-二甲基氨基)乙基)-2H-4H-苯并-3-氧代-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(1-甲基乙基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-哌啶-1-基-吡啶-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(4-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉基-吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-((N-甲酰基氨基)甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-甲基-1-(N-甲基氨基)乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-(二甲基氨基)-1-甲基乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(N-乙酰基-5-二氢吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-氯-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-二乙基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(4-(N-甲基-N-甲酰基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴苯基)甲基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-四氢吡喃基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-乙基丙基)-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环戊基-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(2-氯-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲基环己基)-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((N-(苄氧基羰基)-4-哌啶基)甲基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-溴-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(3-氰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-二甲基氨基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-咪唑基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(氮杂环庚基)-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-(1-甲基乙基)氨基)-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-乙酰基哌嗪基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-乙酰基-1,4-二氮杂环庚基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲基-N-(2-(2-吡啶基)乙基)氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-2-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙基)-N-甲基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-吖丁啶基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(3-(N-甲基乙酰胺基)吡咯烷基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(3-(甲酰胺基)吡咯烷基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(4-氧代-1-苯基-1,3,8-三氮杂螺[4,5]癸烷-8-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(2-甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲氧基乙基-N-丙基氨基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(N-甲基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-(二甲基氨基)哌啶基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-(氨基羰基)哌啶基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(N-甲基-N-(3-(二乙基氨基)丙基)氨基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲基-N-(4-吡啶基)乙基氨基)吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲基-N-(3-吡啶基甲基氨基)吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(1-甲基-5-吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(1-甲基-2,3-二氧代-5-吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氟-4-(1-吗啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羟基-3-硝基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4,4-亚乙二氧基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4-氧代哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4-甲酰基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4-甲基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-硫代吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4,4-二氧代硫代吗啉基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-甲氧基苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-氯-6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-氧化吗啉基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-(2-羟基乙氧基乙基)氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-(2-羟基乙氧基乙基)-N-甲酰基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-(2-羟基乙氧基乙基)-3-吡啶基-N-氧化)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(3-羟基)吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；1-(5-(4-氨基-5-(3-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-吡啶)哌啶-4-磷酸二钠盐；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲烯基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羟基-4-(羟甲基)哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4,4-亚乙二氧基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-氧代-哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-甲烯基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-N-(亚氨基甲基)氨基-5-环己基-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-新戊基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-丁氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-甲氧基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-丁氧基苯基)-7-(4-(N-甲酰基哌嗪基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-苄氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-苯氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)苯基)-7-(4-二乙基丙二酰基烯丙基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-(2-丙基)苯基)-7-(4-叔丁基丙烯酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4-二甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-叔丁基丙烯酰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-二乙基丙二酰基烯丙基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-乙烯基吡啶基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-三氟甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲酰胺基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-苄氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-丁氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(2-吡啶基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氟苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-乙基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羟基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-碘苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-乙氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-三氟甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二氯苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-羟基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-哌啶基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(咪唑-1-基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氯苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-异丙基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-三氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3,4,5-三甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(3-甲氧基苄基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲氧基乙氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4-亚甲二氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-乙氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2′-噻吩)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-二甲基氨基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-硝基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-氨基-S-(3-溴苯基)-7-(3,4-亚甲二氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲酰胺基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-甲氧基)乙氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-三氟甲基苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(2-呋喃基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-咪唑基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-噻吩2-基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(4-(3-吡啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(4-甲基哌啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-吗啉基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(5-溴噻吩-2-基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲氧基苯基)-7-(5-嘧啶基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-((4-氟苯基)氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(二甲基氨基)噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-碘苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二溴苯基)-7-(4-二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二溴苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-(4-甲基哌啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基磺酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(甲硫基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3,4-二氯苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-甲基磺酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氨基-4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-溴-4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-三氟乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)-3-氟苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙基-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4,4-双(乙酰基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-异丙基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-乙基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(3-甲氧基丙酰基)-N-异丙基-氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(2-(二甲基氨基)乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-氰基)乙基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(3-甲氧基)丙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲氧基-2-丁基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-(N-邻苯二甲酰亚胺基)乙酰基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-甲基-N-(三氟乙酰基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-(N-乙酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氰基苯基)-7-(4-甲基磺酰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氰基苯基)-7-(4-(N-甲基-N-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-甲酰基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-甲氧基乙基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吡咯烷基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(二甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(N-甲氧基乙基-N-甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(N-甲酰基-N-甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(N-甲基氨基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(1-吡咯烷基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-(1-吗啉基)-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(2-氧代-3-噁唑烷基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(噻吩-2-基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(呋喃-2-基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-(3-甲氧基苯基)苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-(吗啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-(噻吩-2-基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(4-(5-嘧啶基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-氟苯基)-7-(4-碘苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴噻吩-2-基)-7-(4-甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)甲基-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-苯基乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-甲基丙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(丁基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(4-溴苯基)乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(丁基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(3-氰基苯基)甲基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(N-苯基甲氧基羰基)氨基乙基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(环庚基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(5-氯-2-(噻吩-3-基)苯基甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(戊基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-己基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(3-溴苯基)乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴苯基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环丙基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴-5-氯苯基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-甲基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2,3-亚甲二氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氟-5-三氟甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,4-二氯苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-氟-3-三氟甲基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-吗啉基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-哌啶基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲基噻吩基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-5-甲氧基苯基)-7-(噻吩-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2,3-二甲氧基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-甲基磺酰基苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-乙酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-甲酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(甲氧基乙酰基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-三氟乙酰氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-戊酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-苯甲酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(N-BOC-甘氨酰)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(N-邻苯二甲酰亚胺基甘氨酰)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(乙氧基羰基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(乙基氨基羰基)氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-烯丙基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(2-(N,N-二甲基氨基)乙基氨基)-5-(4-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(4-(N,N-二甲基氨基)丁基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(N-烯丙基-N-甲酰基氨基)-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-二乙酰基氨基-5-(对二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-氨基-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-二甲基氨基-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-二甲基氨基-2-吡嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-氧代苯并噁唑啉-6-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(1-甲基-2-氧代苯并噁唑啉-6-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((5-氯-2-(3-甲氧基苯基)苯基)甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((噻吩-2-基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((噻吩-3-基)甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴苯基)甲基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲酰基-N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-(2-甲氧基乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-((2-二甲基氨基)乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-甲氧基)乙酰基氨基)乙基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-((4-甲酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-((2-二甲基氨基)乙酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-氧代-3-噁唑啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(2-丙基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-甲基-4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-咪唑基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-苯基甲基-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-(3-氨基丙炔基)苯基甲基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(3-溴苯基)乙基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-二甲基氨基苯基)-7-(4-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-呋喃基)-7-(4-(N-吗啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-二甲基氨基-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(脲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-苯基甲基-3-哌啶基)-7-(4-二乙基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(3-甲基-5-异噁唑基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-氯-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-甲氧基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(1,2,4三唑-4-基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-吗啉基-5-嘧啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-噻唑基)-7-(4-吡咯烷基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吡唑基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-甲基脲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-(2-嘧啶基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氟-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-甲酰基氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氟-4-(N-甲酰基-N-甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(N-甲基-N-甲基磺酰基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-甲基磺酰基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(1-甲基-5-二氢吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(1-甲基-5-苯并咪唑基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-二甲基氨基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-吡咯烷基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-吗啉基-2-吡嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基氨基)-2-吡嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(吗啉基甲基)-苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(N,N-双(2-甲氧基乙基)氨基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(咪唑基甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(1-吗啉基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-((二甲基氨基)甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(4-羟基-1-哌啶基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(N-甲酰基-N-甲基氨基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(2-丙烯基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-(2-甲氧基乙基)-2-氧代-6-苯并噁唑基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-(N-甲酰基氨基)乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-(甲基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶盐酸盐；4-(2-甲氧基乙基氨基)-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基氨基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶盐酸盐；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-甲基-2-咪唑基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶三盐酸盐；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(氨基甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2-溴-4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(3-(二甲基氨基)丙炔基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(3-氨基-3-甲基丁炔基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-二甲基膦酸基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(3-(甲氧基丙炔基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基-3-氧代-2H-4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(2-(二甲基氨基)乙基-3-氧代-2H-4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2,3-二氢-3-(二甲基氨基乙基)-2-氧代苯并噁唑-6-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲基-3-氧代-2H-4H-苯并-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(2,2,4-三甲基-3-氧代-2H-4H-苯并-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(4-(2-二甲基氨基)乙基-2H-4H-苯并-3-氧代-1,4-噁嗪-7-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-(1-甲基乙基)-2-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-哌啶-1-基吡啶-2-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(4-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-((N-甲酰基氨基)甲基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-甲基-1-(N-甲基氨基)乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-(1-(二甲基氨基)-1-甲基乙基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(N-乙酰基-5-二氢吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-氯-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-二乙基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(4-(N-甲基-N-甲酰基)氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((2-溴苯基)甲基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-四氢吡喃基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-乙基丙基)-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环戊基-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(2-氯-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3,5-二甲基环己基)-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-((N-(苄氧基羰基)-4-哌啶基)甲基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-溴-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(3-氰基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-二甲基氨基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-咪唑基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(氮杂环庚烷-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-甲基-N-(1-甲基乙基)氨基)-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉基-3-哒嗪基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-乙酰基哌嗪基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-乙酰基-1,4-二氮杂环庚基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-甲基-1,4-二氮杂环庚基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲基-N-(2-(2-吡啶基)乙基)氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-2-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙基)-N-甲基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-吖丁啶基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(3-(N-甲基乙酰胺基)吡咯烷基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(3-(N-甲酰胺基)吡咯烷基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(4-氧代-1-苯基-1,3,8-三氮杂螺[4,5]癸烷-8-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(2-甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲氧基乙基-N-丙基氨基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(N-甲基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-(二甲基氨基)哌啶基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-(氨基羰基))哌啶基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(N-甲基-N-(3-(二乙基氨基)丙基)氨基吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲基-N-(4-吡啶基)乙基氨基)吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(N-甲基-N-(3-吡啶基甲基氨基)吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(1-甲基-5-吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(1-甲基-2,3-二氧代-5-吲哚基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(3-氟-4-(1-吗啉基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羟基-3-硝基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4,4-亚乙二氧基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4-氧代哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4-甲酰基哌嗪基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4-甲基哌嗪基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-硫代吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4,4-二氧代硫代吗啉基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(2-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴-4-甲氧基苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(4-溴苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-氯苯基)-7-(6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(5-氯-6-吗啉基-3-吡啶基)吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-氧化吗啉基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-(2-羟基乙氧基乙基)氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-(2-羟基乙氧基乙基)-N-甲酰基氨基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(N-(2-羟基乙氧基乙基)-3-吡啶基-N-氧化)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(3-羟基)吗啉基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；1-(5-(4-氨基-5-(3-溴苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2-吡啶)哌啶-4-磷酸二钠盐；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-甲烯基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(4-羟基-(4-羟基甲基)哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-(3-溴苯基)-7-(6-(4,4-亚乙二氧基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-氧代哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-氨基-5-环己基-7-(6-(4-甲烯基哌啶基)-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；4-N-(亚氨基甲基)氨基-5-环己基-7-(6-二甲基氨基-3-吡啶基)吡啶并[2,3-d]嘧啶；以及上述化合物药学上可接受的盐。
式（Ⅱ）化合物可以通过本领域已知的方法进行合成，对于本领域技术人员而言可容易地得到。例如，5,7-二取代以及5,6,7-三取代的4-氨基吡啶并[2,3-d]嘧啶化合物的制备记载于国际专利申请公开号WO98/46605和美国专利号6,0303,969中，将这两篇专利的内容以引用的方式整体并入本文。Victory,P等，Tetrahedron（1995），51，10253-10258描述了4-氨基-5,7-二苯基吡啶并[2,3-d]嘧啶化合物的合成，将该文献的内容以引用的方式整体并入本文。
可适用于本发明的其他腺苷激酶抑制剂记载于下述美国专利号：5,506,347、5,763,696、5,763,597、5,674,998、5,721,356、5,726,302、5,795,977以及5,864,033，将上述专利的内容以引用的方式整体并入本文。
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）是普遍存在的、对细胞内S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的水平进行控制的细胞酶。SAHH在本领域中也被称为AA987153、腺苷同型半胱氨酸酶、AdoHcyase、AL024110、CuBP、CUBP、肝铜结合蛋白、MGC102079、MGC118063、MGC19228、S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶以及SAH水解酶。SAHH催化S-腺苷同型半胱氨酸水解为腺苷和同型半胱氨酸的反应，SAH是一些S-腺苷甲硫氨酸依赖型甲基转移酶的强效产物抑制剂，SAHH的抑制作用对S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）依赖型甲基化反应产生抑制。
S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂包括但不限于腺苷及其同系物和衍生物。示例性的腺苷同系物与衍生物包括但不限于：9(S)-(2,3-二羟基丙基)腺嘌呤[(S)-DHPA]；D-香菇嘌呤（D-eritadine）；(R,S)-3-腺嘌呤-9-基-2-羟基丙酸[(R,S)-AHPA]；腺苷（Ado）二醛；3-脱氮腺苷（c3-Ado）；芒霉素（Ari）与类似物；瓶菌素（neplanocin）A（NPA或NpcA）；二羟基环戊烯基腺嘌呤（DHCeA）；二羟基环戊烯基-3-脱氮腺嘌呤（c3-DHCeA）；二羟基环戊烷基腺嘌呤（DHCaA）；二羟基环戊烷基-3-脱氮腺嘌呤（c3-DHCaA）；3-脱氮瓶菌素A（c3-NpcA）；3-脱氮芒霉素（c3-Ari）；碳环-3-脱氮腺苷（C-c3-Ado）；6′-C甲基瓶菌素A；2′-脱氧腺苷；杀结核菌素；利巴韦林；pyraazofurin；2′-脱氧-2′-氯腺苷；异戊烯基腺苷；甲硫基腺苷（MTA）；9-β-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤（Ara-A，阿糖腺苷）；2′-脱氧腺苷；N-甲基芒霉素、8-氮杂芒霉素与3-脱氮芒霉素，以及它们的二醛与二醇衍生物；(±)-5-去甲芒霉素及其2,6-二氨基类似物。芒霉素类似物与衍生物包括但不限于：2′-脱氧-、3′-脱氧-、3′-氨基-3′-脱氧-、3′-氨基-3′-脱氧阿拉伯呋喃糖基、6′-羟基、6′-巯基、8′-溴、8-羟基芒霉素、芒霉素-3′-环磷酸酯以及芒霉素-6′-环磷酸酯。
S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的某些结构类似物（对分子中的氨基酸、碱、糖部分进行修饰）也可以用作SAH水解酶抑制剂。示例性的SAH类似物包括但不限于：2-氟-S-腺苷同型半胱氨酸（2-FSAH）、S-腺苷-L-同型半胱氨酸亚砜、S-腺苷-L-同型半胱氨酸砜、S-芒霉素-L-同型半胱氨酸、5′-S-(3-羰基-4-硝基苯基)硫代腺苷以及5′-S-(甲基)-5′-S-(丁基)硫代腺苷。
其他的SAHH抑制剂包括了以下文献所描述的物质，例如：Yuan等人，Exp.Opin.Ther.Patents，1999，9：1197-1206；Wolfe和Borchardt，Journal of Medicinal Chemistry，1991，34：1521-1530；Votruba和Holy，Coll Czech.Chem.Commun.，1980，45：3039；Schanche等，MolecularPlarmacology，1984，26：553-558；De Clercq E.，Nucleosides Nucleotides，1998，17（1-3）：625-634；以及美国专利申请号10/410,879；上述文献的内容以引用的方式整体并入本文。
通过提高AMP的浓度或通过作为AMP类似物的化合物，可将AMP活化蛋白激酶变构活化。例如，AMP类似物可以是腺苷-5′-硫代单磷酸酯、腺苷-5′-氨基磷酸酯、间型霉素A-5′-单磷酸酯、或5′-单磷酸酯-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷（ZMP）。
在本方面以及本发明其他方面的实例中，AMP活化蛋白激酶活化剂是式（Ⅲ）及其药学上可接受的盐和酰胺：
Figure BDA00002034784300451
式（Ⅲ）
其中：
R17为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、OR22、SR22、N(R22)2、(CH2)mR23，或者R17与R18连同它们所连接的原子共同形成可任选取代的5-8元杂环；
R18和R19各自独立地为H、OR22、SR22、N(R22)2，或者R18与R19连同它们所连接的原子共同形成可任选取代的5-8元杂环；
R20和R21各自独立地为卤素、CN、N2、OR22、SR22、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R22各自独立地为H、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R23为R22、OR22、SR22、N(R22)2、N2、CN、卤素或
Figure BDA00002034784300461
R24各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
X为O、S、NH或CH2；
Y和Z各自独立地为N或CR25；
R25各自独立地为H、卤素、CN、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Z1各自独立地为O或S；
Z2各自独立地为H、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
M为碱金属阳离子；
m为1、2、3或4；
n为0、1或2。
在一些实施方式中，M是Na+。
在一些实施方式中，R17是任选取代的C1-C6烷基、OR22、N(R22)2或(CH2)mR23。优选C1-C6烷基是甲基。当R17是N(R22)2时，至少一个R22是H，优选两个R22都是H。当R17是OR22时，R22可以是H或C1-C6烷基，优选R22是H。
当R17是(CH2)mR23时，m是1或2，优选m是1。在一些实施方式中，R23是OR22或N(R22)2。当R23是N(R22)2时，至少一个R22是H，优选两个R22都是H。当R23是OR22时，R22可以是H或C1-C6烷基，优选R22是H。在一些实施方式中，R17是CH2OH。
在一些实施方式中，式（Ⅲ）化合物中的R17和R18连同它们所连接的原子共同形成5-8元杂环，其中杂环的骨架包含其中Z3各自独立地为O或S，Z4是H、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基。优选Z3是O，Z4是OM或SM。
在一些其他的实施方式中，X选自于由O、NH和CH2所组成的组。优选X是O。
在一些其他的实施方式中，R18和R19都是OR22。在一些优选的实施方式中，R18和R19都是OH。
在一些实施方式中，R20选自于由以下基团所组成的组：卤素、CN、OR22、任选取代的C1-C6烷基、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24和C(O)N(R24)2；其中R22和R24如上文所定义。优选R20是NHR22，更优选R20是NH2。
在某些实施方式中，R21选自于以下基团所组成的组：卤素、CN、OR22、C1-C6烷基、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24和C(O)N(R24)2；其中R22和R24如上文所定义。优选R21是C(O)NHR24，更优选R21是C(O)NH2。
在一些实施方式中，R20不是NH2，并且R21不是C(O)NH2。
在一些实施方式中，Y或Z中的至少一个是CR25，优选Y是CR25，更优选Y是CH2。在一些实施方式中，Y是CR25且Z是N。
在一些其他的实施方式中，Y和Z都是CR25。优选Y是CH2且Z是CR25，其中R25选自于由以下基团所组成的组：CN、卤素、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的芳基烷基、和任选取代的杂芳基烷基。优选地，芳基是任选取代的苯基。
在一些实施方式中，式（Ⅲ）化合物的立体化学构型如式（Ⅲa）所示：
Figure BDA00002034784300481
式（Ⅲa）。
在一些实施方式中，式（Ⅲ）化合物的立体化学构型如式（Ⅲb）所示：
Figure BDA00002034784300482
式（Ⅲb）。
在一些实施方式中，AMP活化激酶活化剂是5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷（在本文中也称AICAR）。
式（Ⅲ）化合物可以例如通过美国专利号3,450,693和5,658,889中描述的方法进行制备，将上述专利的内容以引用的方式整体并入本文。下述文献描述了5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷的衍生物与类似物：Mioyoshi等，Chem.Pharm.Bull（1976），24：2089-2093；Chambers等，Nucleosides&Nucleotides（1988），7：339-346；以及Srivastava等，J.Org.Chem.（1975），40：2920-2924。
可适用于本发明的其他AMPK活化剂记载于美国专利号7,119,205和美国专利公开号2006/0287356、2007/0015665以及2007/024420，将这些专利的内容以引用的方式整体并入本文。
胰腺细胞
本文所使用的术语“胰腺细胞”是指胰腺组织（包括内分泌组织与外分泌组织）的细胞、细胞群、细胞制剂以及由此衍生而来的细胞系。内分泌胰腺由在称为胰岛的集落（clusters）中排列的产激素细胞组成。在形成胰岛的四种主要类型的细胞（“胰岛细胞”）中，α细胞产生胰高血糖素，β细胞产生胰岛素，δ细胞产生生长抑素，PP细胞产生胰多肽（PP）。外分泌胰腺包括胰腺腺泡与胰管。胰腺腺泡细胞合成了各种消化酶。导管细胞分泌碳酸氢根离子和水，作为对胃肠道所分泌的激素的应答。因此，术语“胰腺细胞”包括：存在于胰腺内的细胞，包括α细胞、β细胞、δ胞、PP细胞、腺泡细胞、导管细胞、间充质细胞、成纤维细胞以及其它存在于胰结缔组织中的细胞；或其它细胞（例如内皮细胞、神经细胞、未分化或未完全分化或待分化的祖细胞）；或上述细胞的混合物或组合。
胰腺细胞的标记物特征包括：细胞表面蛋白或编码基因的表达、胞内蛋白或编码基因的表达、细胞形态特征、分泌产物（如胰高血糖素、胰岛素和生长抑素）的产生。本领域技术人员将认识到，已知的免疫荧光、免疫组织化学、聚合酶链反应、原位杂交、Northern印迹分析、化学或放射化学或生物学方法可容易地确定胰岛细胞的特异性特征是否存在。
如果希望的话，可使用本领域公知的技术来测定胰腺细胞群中的细胞类型。例如，使用细胞类型特异性的染色剂，例如双硫腙是胰岛细胞的特异性染色剂。或者，可使用针对各种胰腺细胞特异性蛋白（例如，胰岛素、生长抑素、胰高血糖素、胰多肽细胞角蛋白、淀粉酶和脂肪酶）的抗体来进行免疫荧光染色。此外，可使用如光学显微镜或电子显微镜的技术通过其形态来确定细胞类型。
在一些实施方式中，胰腺细胞来自胰腺内分泌组织。在一些实施方式中，胰腺细胞位于胰岛中。本文所使用的术语“胰岛”包括胰岛中的组成型细胞类型，包括α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞、完整的胰岛、胰岛片段或上述类型的组合。
本文所使用的术语“胰腺细胞”包括原代胰腺细胞、由已去分化的细胞（例如由诱导的多能干细胞（iPSCs））衍生的胰腺细胞样细胞、或者由内胚层起源的细胞（例如肝细胞或外分泌胰腺细胞）直接重编程的胰腺细胞样细胞。在一个实施方式中，胰腺细胞不是永生化细胞系（例如在培养物中无限增殖）。在一个实施方式中，胰腺细胞不是经转化的细胞，例如显示出转化特性（如在软琼脂上生长或不存在接触抑制）的细胞。
胰腺细胞群可只由一种胰腺细胞类型组成，或由不同胰腺细胞类型的混合物组成。在本文所述的本发明这一方面和其它方面的一些实施方式中，胰腺细胞群由选自于以下组的胰腺细胞类型组成，该组由α细胞、β细胞、δ细胞、ε细胞以及它们的组合所组成。在一些实施方式中，胰腺细胞群是β细胞群。在一些实施方式中，胰腺细胞群还包括非胰腺细胞类型。
将理解的是，当胰腺细胞群包含不同胰腺细胞类型的混合物时，所述不同细胞类型相对于其它细胞类型能够以任何比例存在。不希望受理论的束缚，混合物中的各细胞类型可占细胞总数的1-99%。在一些实施方式中，胰腺细胞群包含占细胞群中细胞总数1-99%的β细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞群包含占细胞群中细胞总数1-50%的β细胞。
在一个实施方式中，胰腺细胞是原代胰腺细胞，在一些实施方式中，胰腺细胞是原代胰腺β细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞不是经转化的胰腺细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞不是经转化的胰腺β细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞不是永生化的胰腺细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞不是永生化的胰腺β细胞。
在一些实施方式中，胰腺细胞是再分化胰腺细胞。本文所使用的术语“再分化胰腺细胞”是指由去分化胰腺细胞分化而来的胰腺细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞是再分化β细胞。本文所使用的术语“再分化β细胞”是指由去分化β细胞分化而来的β细胞。再分化β细胞具有β细胞类型的形态并能够形成粘附连接（adherens junctions），能以葡萄糖调节的方式分泌出胰岛素。参见例如Volk等，Arch Pathol.，88(4)：413-22（1969）。
在一些实施方式中，胰腺细胞由去分化体细胞（例如重编程细胞）衍生。例如，去分化成为多能干细胞或成为胰腺细胞（例如通过将内胚层起源的细胞直接重编程）的体细胞。不希望受理论的束缚，去分化细胞具有类似于其所衍生的更原始细胞类型的形态，例如间充质细胞的形态。
胰腺细胞还可由受试者或供体的胚胎干细胞（ESCs）衍生（即分化）。在一些实施方式中，诱导的多能干细胞可由受试者或供体生成，然后分化成为胰腺细胞或胰腺细胞样细胞。在如下文献中描述了人类细胞中的β细胞分化的诱导：美国专利号6,84,585、6,911,324和7,276,352以及美国专利申请公开号2006/02,922,127，以引用的方式将其内容整体并入本文。Brolen,G.K.等，Diabetes（2005），54：2867-2874和Segev,H.，Stem Cells（2004）22：265-274描述了人类胚胎干细胞分化成β细胞样细胞的方法，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在一些实施方式中，胰腺细胞处于稳定状态，例如，从受试者取得细胞并对其进行处理以使其可以存放一段时间。举例来说，可对细胞进行冷冻（例如，使用本领域已知的用于冷冻原代细胞的方法）使得所述细胞在解冻时仍有活力。例如，可将本领域已知的对胚胎细胞进行冷冻和解冻、从而生成活体哺乳动物的方法适用于本方法中。此类方法可包括将例如一种或多种冷冻保护剂（例如防止对细胞造成冷冻-解冻伤害的试剂）与液氮一起使用。
由受试者或供体获得的胰腺细胞群可以是实质上纯的，例如：不多于约40%的未分化细胞，即，至少约60%的完全分化胰腺细胞。在一些实施方式中，所述细胞群为至少约70%、75%、80%、90%、95%以上的完全分化胰腺细胞。可使用本领域已知的方法来测定和操纵细胞群的纯度。例如，可使用荧光活化细胞分选的方法。举例来说，如本文所述，例如通过用荧光标记的导管特异性凝集素（例如，双花扁豆凝集素（DBA））对细胞进行标记，从而对导管上皮细胞进行检测和计数；通过荧光活化细胞分选方法（例如流式分选）或免疫吸附至与DBA结合的基质（如柱或珠）将导管上皮细胞从细胞群中移出。可使用类似方法（包括基于自体荧光的流式分选）移出其它非β细胞。
从受试者得到的胰腺细胞群可以是同质或异质的（homogeneous orheterogeneous）。在一些实施方式中，从受试者得到的胰腺细胞具有单一的细胞类型，如α细胞、β细胞、δ细胞或ε细胞。在其它实施方式中，从受试者得到的胰腺细胞包含不同胰腺细胞类型的混合物。
在一些实施方式中，胰腺细胞来自哺乳动物，例如小鼠、大鼠或人类。在一些实施方式中，胰腺细胞来自受试者，其中，基于受试者对额外β细胞的需求来选择受试者。
使胰腺细胞与化合物进行接触
可使胰腺细胞群与本文所述的化合物在例如体外或离体的细胞培养物中进行接触，或者可将化合物例如在体内给予受试者。在本发明的一些实施方式中，可将本文所述的化合物给予受试者，从而治疗和/或预防由β细胞功能减弱和/或数量减少导致的病症，例如高血糖症或糖尿病。
术语“离体”是指从活的机体中移出并在机体外（例如，在试管中）培养的细胞。
本文所使用的与接触胰腺细胞群有关的术语“接触”包括将胰腺细胞放入至合适的培养基，所述培养基含有指定的化合物或试剂。当胰腺细胞群处于体内时，“接触”包括通过合适的给药途径向受试者给予处于药物组合物中的试剂或化合物，从而使所述化合物或试剂在体内与胰腺细胞群进行接触。
对于体内方法，可向受试者给予治疗有效量的本文所述化合物。向受试者给予药物的方法是本领域已知的，并且对于本领域技术人员来说可容易地使用。
促进受试者体内的β细胞复制可治疗、预防或改善由β细胞功能减弱和/或数量减少引起的多种病症，例如高血糖症或糖尿病。不希望受理论的束缚，使受试者体内的β细胞复制增加可使β细胞（例如，β细胞团块）的密度和/或数量得以增加。
本文所使用的β细胞团块的增加是指β细胞数的增加，例如，相比于处理开始前受试者体内的β细胞数，用本文所述的化合物处理后的受试者体内的β细胞（例如胰腺β细胞）数的增加。相对于处理开始前受试者体内的β细胞团块，处理后的受试者体内的β细胞团块可增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。
可根据本领域技术人员公知的方法由胰腺制备用于离体方法中的胰腺细胞。例如，可将所得到的胰脏在37℃或约37℃下用酶溶液进行孵育，从而将胰腺组织消化成细胞和组织的小集落。在合适的消化时间后，可将组织消化液进行过滤以移除大的未消化组织。然后，可向经消化组织施加密度梯度，例如Ficoll、聚蔗糖和右旋糖酐等。密度梯度可以是连续或不连续的。然后，可将载有组织的密度梯度进行离心，消化液中所含的细胞根据其密度在所述梯度内进行迁移。可将细胞从所述梯度中回收、洗涤并放置于培养物中。以这一方式制备的胰腺细胞可包含多种细胞类型。
对于离体方法，胰腺细胞可包括自体胰腺细胞，即，从需要额外β细胞的受试者取得的细胞（即，供体和受体是同一个体）。自体胰腺细胞具有避免任何基于免疫学的细胞排斥的优势。或者，细胞可以是异源的，例如从供体取得。第二受试者可以是同种或不同种的。通常而言，当细胞来自供体时，所述细胞将会来自与受体在免疫学上充分相容的供体，即，不会引起移植排斥，以减轻或消除对免疫抑制的需求。在一些实施方式中，从异种来源（即，经遗传工程化、从而与受体或受体物种在免疫学上充分相容的非人类哺乳动物）取得细胞。对免疫相容性进行测定的方法是本领域已知的，包括组织分型以评价HLA和ABO决定簇的供体-受体相容性。参见例如，Transplantation Immunology，Bach和Auchincloss著（Wiley，John & Sons,Incorporated，1994）。在一些实施方式中，胰腺细胞是重组的β细胞，例如在美国专利号6,114,599、6,242,254和6,448,045中所述，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在一些实施方式中，受试者患有1型糖尿病、1.5型糖尿病或2型糖尿病，或者具有糖尿病前期病情。
不希望受理论的束缚，可将任何合适的细胞培养基用于本发明的离体方法。在一些实施方式中，在细胞基质蛋白存在的情况下对β细胞进行培养，所述蛋白能够促进半桥粒形成。例如，由大鼠膀胱癌细胞系804G或NBT-II所产生的细胞基质蛋白在本领域中已知促进半桥粒的形成。因此，美国专利号5,510,263公开了在804G和NBT-II基质上培养的胰岛细胞生长的增强，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在一些实施方式中，将细胞在来自大鼠膀胱癌细胞系804G或NBT-II的条件培养基（conditioned media）中进行培养。还可将细胞在添加了来自条件培养基的一种或多种基质蛋白的培养基中进行培养。此类基质蛋白可从天然来源进行纯化，或使用本领域已知的重组方法进行生产。
在一些其它实施方式中，将细胞在与层粘连蛋白5接触的培养基中进行培养。优选地，所述层粘连蛋白5选自于由缰蛋白（Kalinin）和表皮整联配体蛋白（epiligrin）所组成的组。层粘连蛋白5可从多种来源获得，所述来源包括但不限于从由MCF 10A细胞得到的胞外基质获得。
在与本文所述的化合物进行离体接触后，当胰腺细胞（例如β细胞）达到期望的细胞群数量或密度（例如，约1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个以上的细胞）时，可将所述细胞移植到需要额外β细胞的受试者体内。可将所述细胞移植到最初得到该细胞的受试者体内或不同的受试者体内。用于从哺乳动物手术移出或移植合适的胰腺细胞（例如，β细胞）的方法是本领域已知的；参见例如Shapiro等，N.Engl.J.Med.，343(4)：230-8（2000）和Ryan等，Diabetes，50(4)：710-9（2001）。
当使胰腺细胞与化合物进行接触时，所述化合物可直接或间接地作用于β细胞。本文所使用的“直接作用”意味着所述化合物直接与β细胞发生相互作用（例如，结合至β细胞上的细胞表面受体），从而进入至β细胞中。本文所使用的“间接作用”意味着化合物并不直接与β细胞相互作用。例如，化合物可与非β细胞相互作用，并间接影响β细胞复制或生长的速率。不希望受理论的束缚，化合物可通过诱导来自非β细胞的分子的表达和/或分泌、然后该分子直接或间接地影响β细胞复制或生长的速率，从而间接地影响β细胞。
对β细胞复制的增加进行监测的方法
对于本发明的离体方法，可通过本领域已知的用于测量细胞复制的任何方法对β细胞复制的增加进行监测。例如，可通过测量至少一种细胞复制标记物（例如，Ki-67或PH3）的表达来测定β细胞复制。一个非限制性实例是定量免疫荧光分析，所述定量免疫荧光分析通过监测丝氨酸10上的组蛋白H3磷酸化（H3-P）来测量有丝分裂指数（mitotic index），H3-P是有丝分裂特异性事件（Ajiro等，J.Biol.Chem.，271：13197-201，1996；Goto等，J.Biol.Chem.，274：25543-9，1999）。β细胞复制的增加还可基于与未处理的对照相比，处理后的β细胞总数的增加。在一些实例中，β细胞复制的增加可基于β细胞相对于总细胞的比例（对于处理后和未处理的对照）。可通过监测共表达Ki-67和/或PH3以及PDX-1的细胞数对β细胞的复制进行测量。
对于本发明的体内方法，可通过测量血液胰岛素水平来间接地评价β细胞复制的增加。不希望受理论的束缚，血液胰岛素水平是对β细胞数（例如，受试者体内的β细胞团块）的间接测量。因此，处理开始前后的血液胰岛素水平可间接地提供对处理开始前后受试者体内β细胞数的相对测量结果。还可通过测量受试者的禁食血糖浓度来确定受试者体内的β细胞团块。在如下文献中公开了人类β细胞团块与禁食血糖浓度之间的曲线关系：Ritzel等，Diabetes Care（2006），29：717-718，以引用的方式将其内容整体并入本文。或者，可通过正电子发射断层扫描术（P.E.T）进行扫描，来测量通过β细胞对放射性配体[11C]DTBZ（二氢丁苯那嗪）（特异性结合至VMAT2）进行的体内摄取。这一放射性配体此前在临床试验中被用于人类受试者，该临床试验对患有双相障碍（bipolar illness）和精神分裂症的患者相比于健康受试者进行的脑部P.E.T扫描进行评价。美国专利公开号2009/0202428描述了DTBZ用于反映1型糖尿病中的内分泌胰腺β细胞团块的用途，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在如下文献中也描述了对体内β细胞团块进行估计的方法，例如：Antkowiak,P.F.等，Noninvasive assessment of pancreatic-beta-cell functionin vivo with manganese-enhanced magnetic resonance imaging，Am JPhysiol Endocrinol Metab（2009），296：E573-E5788；Bergman,R.N.等，Quantitative estimation of insulin sensitivity，Am J Physiol（1979），236：E667-E677；Brunzell J.D.等，Relationships between fasting plasma glucoselevels and insulin secretion during intravenous glucose tolerance tests，J.Clin.Endocrinol.Metab（1976），42：222-229；DeFronzo,R.A.等，Glucoseclamp technique:a method for quantifying insulin secretion and resistance，Am J Physoil（1979），237：E214-223；Evgenov N.V.等，In vivo imagingof islet transplantation，Nat Med（2006），12：144-148；Kjems,L.L.等，Decrease in beta-cell mass leads to impaired pulsatile insulin secretion,reduced postprandial hepatic insulin clearance,and relativehyperglucagonemia in the minipig，Diabetes（2001），50：2001-2012；Larsen,M.O.等，Loss of beta-cell mass leads to a reduction of pulse mass withnormal periodicity,regularity and entrainment of pulsatile insulin secretionin
Figure BDA00002034784300561
minipigs，Diabetologia（2003），46：195-202；Larsen,M.O.等，Measurements of insulin secretory capacity and glucose tolerance topredict pancreatic beta-cell mass in vivo in the nicotinamide/streptozotocin
Figure BDA00002034784300562
minipig,a model of moderate insulin deficiency and diabetes，Diabetes（2003），52：118-123；Larsen,M.O.等，Measuress of InsulinResponses as Predictive Markers of Pancreatic Beta-Cell Mass in Normaland Bet-Cell Reduced Lean and Obese
Figure BDA00002034784300563
minipigs in vivo，Am JPhysoil Endocrinol Metab（2005），2006，290：E670-677；McCulloch,D.K.等，Correlations of in vivo beta-cell function tests with beta-cell mass andpancreatic insulin content in streptozocin-administered baboons，Diabetes（1991），40：673-679；Meier,J.J.等，Functional Assessment of Pancreatic{beta}-Cell Area in Humans，Diabetes（2009），58：1595-1603；Souza F等，Longitudinal noninvasive PET-based beta cell mass estimates in aspontaneous diabetes rat model，J.Clin.Invest.（2006），116：1506-1513；Tobin B.W.等，Insulin secretory function in relation to transplanted isletmass in STZ-induced diabetic rats，Diabetes（1993），42：98-105；以及Ward,W.K.等，Diminished B cell secretory capacity in patients withnoninsulin dependent diabetes mellitus，J Clin Invest（1984），74：1318-1328；以引用的方式将其内容整体并入本文。
糖尿病的治疗
可将本文所述的方法用于治疗与β细胞丧失有关的病症（例如，高血糖症或糖尿病）。所述方法可包括向受试者给予ADK抑制剂、SAHH抑制剂和/或AMPK活化剂。可全身性地或局部地给予化合物，例如通过注射或植入向胰腺组织（例如，胰岛）提供稳定剂量化合物的装置。此类装置是本领域已知的，包括微泵和控释基质，例如随时间发生分解而将调节剂释放至组织中的基质。
或者，所述方法包括基于细胞的疗法。例如，所述方法可包括向受试者体内植入已通过本文所述方法扩增或增加的β细胞群。在一些实施方式中，细胞是自体细胞，例如，该细胞来自于其即将被植入的相同受试者。植入此类细胞的手术方法是本领域已知的，包括微创方法和内视镜方法。通常对于人类而言，每千克体重需要移植约10,000胰岛当量的平均（±SD）胰岛团块，参见例如Shapiro等，N.Engl.J.Med.，343(4)：230-8（2000）。
本发明一方面提供了使受试者体内β细胞团块或胰岛素生产增加的方法，所述方法包括：（a）用ADK抑制剂、SAHH抑制剂或AMPK活化剂在细胞培养物中与β细胞进行接触；（b）使细胞复制足够长的时间以产生期望的细胞数量或密度；以及（c）将来自（b）步骤中的细胞引入受试者体内。
在一些实施方式中，所述方法包括从受试者获得β细胞的额外步骤。
在一些实施方式中，使细胞复制足够长的时间，从而使得细胞培养物中有1×106个、2×106个、3×106个、4×106个、5×106个、6×106个、7×106个、8×106个、9×106个、1×107个、2×107个以上的细胞。
本文描述了向受试者体内引入此类细胞的方法。一个代表性的方法包括将细胞封装入生物相容的包衣中。在这一途径中，将细胞包入囊状包衣中，从而保护所封装的细胞免于免疫应答，并且也能用来防止细胞不受控地增殖和扩张。一个示例性的封装技术包括用藻酸盐-聚赖氨酸-藻酸盐进行封装。在特定的实施方式中，使用这一技术制作的胶囊通常包含数百个细胞，并具有约1mm的直径。
可使用O'Shea和Sun（1986），Diabetes，35：943的藻酸盐-聚赖氨酸封装技术以及Fritschy等（1991），Diabetes，40：37所描述的改进来植入细胞。根据这一方法，将细胞悬浮于1.3%的藻酸钠中，通过注射器将细胞/藻酸盐悬浮液滴挤出至CaCl2中进行封装。在数个洗涤步骤后，将液滴在聚赖氨酸中悬浮，并再次洗涤。然后，通过将胶囊中的藻酸盐悬浮在1mL EGTA中而再次液化，并用Krebs平衡盐缓冲液再次洗涤。每个胶囊应包含数百个细胞，并具有约1mm的直径。
与未封装胰岛相比，将通过上述方法封装的胰岛植入糖尿病动物模型中，通过异种移植存活的延长显示出显著增加了正常糖血控制的时间。（O'Shea和Sun（1986），Diabetes，35：943；Fritschy等（1991），Diabetes，40：37）。此外，封装可防止克隆细胞（clonal cell）的不受控增殖。可将含细胞的胶囊进行腹膜内植入（例如，约500、1,000或2,000个细胞/动物至5,000、10,000或20,000个细胞/动物），每天取血样以监测血糖与胰岛素。
替代途径是用细胞对Amicon纤维进行接种。细胞埋入半透性的纤维中，因此，以类似于微包封物的方式加以保护。（Altman等（1986），Diabetes，35：625）。
在成功封装或纤维接种后，可将细胞（通常约1,000-10,000个）进行腹膜内植入，一般通过由大号针（23号）向腹腔内注射。
已经开发出了多种可用于本发明实践中的其它封装技术（参见例如Lacy等（1991），Science，254：1782-1784；Sullivan等，Science，252：718-721；PCT公开WO 91/10470、WO 91/10425、WO 90/15637、WO90/02580、WO 89/01967；美国专利号5,011,472；美国专利号4,892,538；以引用的方式将其内容整体并入本文）。Cyto Therapeutics公司已经开发出了目前可商购的封装技术，并可用于本发明的应用中。Biohybrid（Shrewbury，马萨诸塞州）也已经开发出了血管装置，可在本发明的技术中加以应用。
关于植入方法，在最近由Lacy等（1991），Science，254，1782-1784和Sullivan等（1991），Science，252：718-721所述的方法中可知其特定的优势，以引用的方式将二者各自的内容整体并入本文以用于植入方法的教导。首先，这些植入方法涉及经封装胰岛的皮下异种移植；其次，这些植入方法涉及胰岛组织在“人工胰腺”中的长期植入，所述“人工胰腺”可作为动静脉短路（arteriovenous shunt）连接至血管系统。通过在上述出版物中所述的“胰岛组织”处使用如本文所述扩增后的细胞，这些植入方法可有利地适宜用于本发明。
Lacy等（（1991），Science，254：1782-1784）描述了将大鼠胰岛封装入中空丙烯酸纤维中，并将其固定在藻酸盐水凝胶中。随后，将经封装胰岛经由腹膜内移植入糖尿病小鼠中，据报道恢复了正常血糖。使用皮下植入物也得到了类似结果，所述皮下植入物具有在纤维上适当构建的外表面。也可将本发明的经扩增的细胞通过类似的皮下注射直接“移植”入哺乳动物体内。
还可使用生物杂交灌注的“人工胰腺”，所述人工胰腺将胰岛组织封装入选择性渗透膜中（Sullivan等（1991），Science，252：718-721）。在这一实施方式中，在保护壳（protecting housing）中卷绕出管形半渗透膜，从而为胰岛细胞提供区室（compartment）。然后，将所述膜的各端连接至人工聚四氟乙烯（PTFE）动脉移植物，所述移植物伸出所述壳并将所述装置作为动静脉短路连接至血管系统。据报道，将这一包含胰岛同种异体移植物的装置植入切除胰腺的狗中使得禁食血糖水平得以控制。根据本发明，还可使用本文所述的这类封装改良细胞的移植物。
封装的替代途径是单纯将细胞注射到糖尿病小鼠或大鼠的肩胛区域或腹腔内，据报道这些细胞形成了肿瘤（Sato等，（1962）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：1184）。
药物组合物
为了向受试者给药，可以药学上可接受的组合物来提供化合物。这些药学上可接受的组合物包含治疗有效量的一种或多种上述ADK抑制剂和AMPK活化剂，所述ADK抑制剂和AMPK活化剂与一种或多种药学上可接受的载体（添加剂）和/或稀释剂一起配制。如下详述，本发明的药物组合物可被具体配制用于以固体或液体形式给药，包括适宜于如下给药的形式：（1）口服给药，例如顿服药（水性或非水性的溶液或悬浮液）、锭剂、糖衣剂、胶囊剂、丸剂、片剂（例如，目标是用于口含吸收、舌下吸收和全身吸收的片剂）、大丸剂、散剂、颗粒剂、应用于舌部的膏剂；（2）胃肠道外给药，例如，作为如无菌溶液或悬浮液或缓释制剂通过皮下注射、肌内注射、静脉注射或硬膜外注射给药；（3）局部施用，例如，作为霜剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾剂施用至皮肤；（4）阴道内给药或直肠内给药，例如作为阴道栓剂、霜剂或泡沫剂；（5）舌下给药；（6）眼部给药；（7）经皮给药；（8）经粘膜给药；（9）鼻部给药。此外，可使用药物递送系统将化合物注射入或植入患者体内。参见例如，Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，24：199-236（1984）；Lewis编著，“Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals”（PlenumPress，纽约，1981）；美国专利号3,773,919和美国专利号353,270,960。
本文所使用的术语“药学上可接受”是指在健全的医疗判断范围内，适合用于与人类和动物的组织相接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，具有合理的收益/风险比的化合物、材料、组合物和/或剂型。
本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意味着参与将主题化合物从生物体的一个器官或部分搬运或转运至生物体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料，如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂（如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸）、或溶剂包封材料。从与制剂的其它成分相容和对患者无害的意义上来说，各载体必须是“可接受的”。一些可作为药学上可接受载体的材料的实例包括：（1）糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；（2）淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；（3）纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；（4）西黄蓍胶粉；（5）麦芽；（6）明胶；（7）润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；（8）赋形剂，如可可脂和栓蜡；（9）油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；（10）二醇，如丙二醇；（11）多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇（PEG）；（12）酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；（13）琼脂；（14）缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；（15）海藻酸；（16）无热原水；（17）等渗盐水；（18）林格氏溶液；（19）乙醇；（20）pH缓冲液；（21）聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；（22）填充剂，如多肽和氨基酸；（23）血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；（24）C2-C12醇，如乙醇；和（25）其它可用于药物制剂中的无毒相容性物质。湿润剂、着色剂、隔离剂（release agent）、包衣剂、甜味剂、增香剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。本文所使用的术语如“赋形剂”、“载体”或“药学上可接受的载体”等可互换使用。
本文所使用的短语“治疗有效量”意味着以合理的收益/风险比可应用至任何医学治疗、至少在动物体内的细胞亚群中有效产生一些期望的治疗效果的化合物、材料或组合物（包含本发明所述化合物）的量。例如，向受试者给予的化合物的量足以在1型糖尿病、1.5型糖尿病或2型糖尿病的至少一种症状（如糖化血红蛋白水平、禁食血糖水平、低胰岛素血症等）中产生统计学上显著的可测量的变化。对治疗有效量的测量完全在本领域技术人员的能力范围之内。一般而言，治疗有效量可随着受试者的病史、年龄、病情、性别以及受试者医学病情的严重程度与类型和其它药学活性剂的给药而变化。
本文所使用的术语“给药/给予”是指通过使得至少部分地将组合物定位于期望的位点以产生期望效果的方法或途径，将组合物放置入受试者体内。本文所述的化合物或组合物可通过本领域已知的任何合适途径进行给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药（气雾剂）、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药（包括口腔含化给药和舌下给药）。
示例性的给药模式包括但不仅限于：注射、输液、滴注、吸入或摄食。“注射”不受限制地包括：静脉注射和输液、肌内注射和输液、动脉内注射和输液、鞘内注射和输液、室内注射和输液、囊内注射和输液、眼内注射和输液、心内注射和输液、真皮内注射和输液、腹膜内注射和输液、经气管注射和输液、皮下注射和输液、表皮下注射和输液、关节内注射和输液、囊下注射和输液、蛛网膜下注射和输液、脊髓内注射和输液、脑脊髓内注射和输液以及胸骨内注射和输液。在优选的实施方式中，通过静脉内输液或注射给予所述组合物。
疾病或病症的“治疗”、“预防”或“改善”意味着推迟或预防这种疾病或病症的发作；逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与这种疾病或病症相关的病情的发展或严重程度的发展、加重或恶化。在一个实施方式中，疾病或病症的症状减轻至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%。
通过标准医学方法测定糖尿病的治疗情况。糖尿病治疗的目标是将糖水平尽可能安全地降低至接近正常水平。通常设定的目标是餐前80-120毫克每分升（mg/dL）而就寝时为100-140mg/dL。特定的医师可能会根据其它因素（如间隔多久病人会有低血糖反应）为患者设定不同的目标。有用的医疗测试包括：对病人的血液和尿液进行测试以确定血糖水平、对糖化血红蛋白水平的测试（HbA1c，测定过去2-3月内的平均血糖水平，正常范围为4-6%）、对胆固醇水平和脂肪水平的测试、对尿蛋白水平的测试。此类测试均是本领域技术人员已知的标准测试（参见例如，美国糖尿病协会，1998）。还可通过方案中较少的患者患有与糖尿病相关的并发症（如眼病、肾病或神经疾病）来确定成功的治疗方案。
推迟受试者体内糖尿病的发作是指将糖尿病的至少一种症状的发作推迟至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少1年、至少2年、至少5年、至少20年、至少30年、至少40年以上，并且可包括受试者的整个生命期，所述症状例如：高血糖症、低胰岛素血症、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、失明、记忆力丧失、肾衰竭、心血管疾病（包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化和高血压）、神经病变、自主功能障碍、高血糖高渗性昏迷或上述症状的组合。
本文所使用的术语“受试者”是指人或动物。通常，所述动物为脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴（如恒河猴）。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔子或仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种（如，家猫）、犬科物种（如，狗、狐狸、狼）、鸟类物种（如，鸡、鸸鹋、鸵鸟）和鱼类（如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼）。患者和受试者包括前面所述的任何子集，例如除了一个或多个组或物种（如人类、灵长类动物或啮齿动物）的上述所有。在特定的实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，如人类。本文所使用的术语“患者”和“受试者”可互换使用。
优选地，受试者是哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不仅限于这些实例。除人以外的哺乳动物可被有利地用作代表1型糖尿病、2型糖尿病或糖尿病前期病情的动物模型的受试者。此外，本文所述的方法可被用来治疗家畜和/或宠物。受试者可以为雄性或雌性。受试者可以是下述动物：先前被诊断患有或被认为正在遭受或患有糖尿病（例如，1型糖尿病或2型糖尿病）、一种或多种与糖尿病有关的并发症或者糖尿病前期病情；任选但不必已经对糖尿病、一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情进行了治疗。受试者还可以是未遭受糖尿病或糖尿病前期病情的个体。受试者还可以是已经被诊断患有或被认为正在遭受糖尿病、一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情，但作为接受一种或多种针对糖尿病、一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的治疗的结果，在已知的糖尿病风险因素方面显示出改进的个体。或者，受试者还可以是先前未被诊断出患有糖尿病、一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的个体。例如，受试者可以是显示出糖尿病、与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的一种或多种危险因素的受试者，或者是未显示出糖尿病危险因素的受试者，或者没有糖尿病、一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的症状的受试者。受试者还可以是正在遭受或者处于糖尿病或糖尿病前期病情发展风险中的个体。受试者还可以是已被诊断患有或被认为患有如本文所述的一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的个体，或者，受试者可以是先前未被诊断患有或被认为患有一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的个体。
本文所使用的短语“需要额外β细胞的受试者”是指被诊断患有或被认为正在遭受、患有或处于糖尿病（例如，1型糖尿病、1.5型糖尿病、2型糖尿病）、一种或多种与糖尿病有关的并发症或糖尿病前期病情的发展风险中的受试者。
可使用任何用于糖尿病诊断的方法来鉴定需要额外β细胞的受试者。例如，可使用糖化血红蛋白（A1C）测试来诊断1型糖尿病，所述A1C测试是随机的血糖测试和/或禁食血糖测试。用于诊断糖尿病的参数在本领域中已知，并且本领域技术人员无需付出大量努力即可得到。
在一些实施方式中，本发明的方法进一步包括选择被鉴定为需要额外β细胞的受试者。可基于所存在的症状（如1型糖尿病、1.5型糖尿病或2型糖尿病的症状）选择需要额外β细胞的受试者。示例性的糖尿病的症状包括但不限于：过度口渴（烦渴）、频繁排尿（尿频）、极度饥饿（多食）、极度疲劳、体重下降、高血糖症、低胰岛素水平、高血糖（例如，血糖水平超过250mg、超过300mg）、在尿中出现酮、疲劳、皮肤干燥和/或瘙痒、视力模糊、伤口或疮口愈合缓慢、多于正常水平的感染、足部的麻木刺痛感、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、失明、记忆力丧失、肾衰竭、心血管疾病（包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化和高血压）、神经病变、自主功能障碍、高血糖高渗性昏迷或上述症状的组合。
可将ADK抑制剂、SAHH抑制剂和/或AMPK活化剂与药学活性剂结合向受试者给药。示例性的药学活性化合物包括但不限于如下文献中所记载的化合物：Harrison’s principles of Internal Medicine，第13版，T.R.Harrison等编著，McGraw-Hill N.Y.，NY；Physicians Desk Reference，第50版，1997，Oradell，新泽西州，Medical Economics公司；Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Goodman and Gilman，1990；United States Pharmacopeia,The National Formulary，USP XII NFXVII，1990；The Pharmacological Basis of Therapeutics，现行版本，Goodman and Gilman；The Merck Index，现行版本；以引用的方式将其内容整体并入本文。在一些实施方式中，药学活性剂包括本领域已知用于治疗糖尿病和/或具有抗高血糖活性的试剂，例如：二肽基肽酶4（DPP-4）的抑制剂（例如，阿格列汀、利拉利汀、沙格列汀、西格列汀、维格列汀和小檗碱）；双胍类（例如，二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍）；过氧物酶体增殖物激活受体（PPAR）调节剂，如噻唑烷二酮类（TZDs）（例如，吡格列酮、利格列酮、罗格列酮和曲格列酮）；双重PPAR激动剂（例如，阿格列扎、莫格列扎和替格列扎）；磺酰脲（例如，醋磺环己脲、氨磺丁脲、氯磺丙脲、格列齐特、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列本脲（优降糖）、格列吡嗪、格列喹酮、格列比脲和格列美脲）；氯茴苯酸（“格列奈类”）（例如，那格列奈、瑞格列奈和米格列奈）；胰高血糖素样肽-1（GLP-1）及其类似物（例如，Exendin-4、艾塞那肽、利拉糖肽、Albiglutide）；胰岛素与胰岛素类似物（例如，赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、Exubera和NPH胰岛素）；α-葡萄糖苷酶抑制剂（例如，阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖）；胰淀素（amylin）类似物（例如普兰林肽）；钠依赖性葡萄糖共转运体T2（SGLT T2）抑制剂（例如，Dapgliglozin、Remogliflozin和舍格列净）；以及其它试剂（例如苯氟雷司和托瑞司他）。
在1型糖尿病中，β细胞被持续的自身免疫应答不期望地破坏。通过使用抑制或阻断此类自身免疫应答的化合物可使这一自身免疫应答衰减。这可降低为确立所需要的和/或所要求的β细胞团块水平而需要的治疗方案的长度。在一些实施方式中，所述药学活性剂为免疫应答调节剂。本文所使用的术语“免疫应答调节剂”是指抑制受试者体内的自身免疫应答的化合物（例如，小分子、抗体、肽、核酸或基因治疗剂）。不希望受理论的束缚，免疫应答调节剂通过抑制炎性细胞因子（例如，IL-12、IL-23或IL-27）或STAT-4的活性、活化或表达而抑制自身免疫应答。示例性的免疫应答调节剂包括但不限于由美国专利号US6,774,130中所述的利索茶碱（LSF）和LSF类似物及衍生物所组成的组中的成员，以引用的方式将其内容整体并入本文。
可将ADK抑制剂、SAHH抑制剂和/或AMPK活化剂与药学活性剂以同一药物组合物或不同药物组合物（在相同时间或不同时间下）给予受试者。当在不同时间给药时，可将本发明的化合物和所述药学活性剂在给予其它药物后的5min、10min、20min、60min、2h、3h、4h、8h、12h、24h内给予。当以不同的药物组合物给予ADK抑制剂、SAHH抑制剂或AMPK活化剂以及药学活性剂时，给药途径可以不同。例如，通过本领域已知的任何合适的途径给予ADK抑制剂、SAHH抑制剂或AMPK活化剂，所述途径包括但不限于口服途径或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌内给药、皮下给药、透皮给药、气道给药（气雾剂）、肺部给药、鼻部给药、直肠给药、局部给药（包括口腔含化给药和舌下给药）；而药学活性剂通过不同途径、例如用于给予所述药学活性剂的本领域常用途径进行给予。在非限制性的实例中，式（II）的ADK抑制剂（例如B8）可被口服给予，而药学活性剂（例如DPP-4抑制剂）可被皮下给予。
可与载体材料结合生成单一剂型的化合物的量通常为产生治疗效果的化合物的量。一般而言，以百分比表示，该量为约0.1%-99%、优选约5%到约70%、最优选10%到约30%的化合物。
可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序测定毒性和疗效，例如测定LD50（使50%的群体致死的剂量）和ED50（对50%的群体在治疗上有效的剂量）。毒性和疗效之间的剂量比为治疗指数，可以用LD50/ED50的比值来表示。优选显示出治疗指数大的组合物。
可将由细胞培养试验和动物研究得到的数据用于得出人用剂量的范围。该化合物的剂量优选处于循环浓度（包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50）范围内。该剂量可在这一范围内根据所使用的剂型和所利用的给药途径而变化。
可由细胞培养试验初步估计所述治疗有效量。可在动物模型中得出达到循环血浆浓度范围的剂量，所述范围包括在细胞培养物中测定的IC50（即，达到症状的半最大抑制的治疗剂浓度）。可通过例如高效液相色谱测定血浆中的水平。可通过合适的生物分析监测任何特定剂量的效果。
可由医师确定剂量，如果有必要的话，可将剂量调整至适合所观察到的治疗效果。一般而言，给予所述组合物使得以如下剂量给予ADK抑制剂、SAHH抑制剂和/或AMPK活化剂：1μg/kg到150mg/kg、1μg/kg到100mg/kg、1μg/kg到50mg/kg、1μg/kg到20mg/kg、1μg/kg到10mg/kg、1μg/kg到1mg/kg、100μg/kg到100mg/kg、100μg/kg到50mg/kg、100μg/kg到20mg/kg、100μg/kg到10mg/kg、100μg/kg到1mg/kg、1mg/kg到100mg/kg、1mg/kg到50mg/kg、1mg/kg到20mg/kg、1mg/kg到10mg/kg、10mg/kg到100mg/kg、10mg/kg到50mg/kg或10mg/kg到20mg/kg。将会理解的是，这里给出的范围包含了所有的中间范围，例如：1mg/kg到10mg/kg包含1mg/kg到2mg/kg、1mg/kg到3mg/kg、1mg/kg到4mg/kg、1mg/kg到5mg/kg、1mg/kg到6mg/kg、1mg/kg到7mg/kg、1mg/kg到8mg/kg、1mg/kg到9mg/kg、2mg/kg到10mg/kg、3mg/kg到10mg/kg、4mg/kg到10mg/kg、5mg/kg到10mg/kg、6mg/kg到10mg/kg、7mg/kg到10mg/kg、8mg/kg到10mg/kg、9mg/kg到10mg/kg等。将进一步理解的是，上述给定范围中间的范围也是在本发明的范围内，例如，在1mg/kg到10mg/kg的范围内包含了例如2mg/kg到8mg/kg、3mg/kg到7mg/kg、4mg/kg到6mg/kg等范围。
关于治疗持续时间和频率，对熟练的临床医师而言，一般对受试者进行监测以确定所述治疗何时提供治疗益处，并确定是否增加或减少剂量、是否增加或减少给药频率、是否中止治疗、是否恢复治疗或是否对治疗方案进行其它改变。给药计划可根据多个临床因素（如，受试者对多肽的敏感性）在一周一次至一天一次的范围内变动。可一次给予期望的剂量，或分成亚剂量（例如，2-4份亚剂量）并在一段时间内（例如，以一天中的合适间隔或其它合适的计划）给予期望的剂量。这样的亚剂量可以采用单元剂型进行投药。在一些实施方式中，给药是长期的，例如，在数周或数月的时间段内每天给予一份或多份剂量。给药计划的实例为：在一周、二周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月以上的时间段内每天给予一次、每天给予两次、每天给予三次或每天给予四次以上。
筛选试验
本发明另一方面提供了筛选用于刺激或提高胰腺细胞群中的β细胞复制或生长的候选化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）用测试化合物与胰腺细胞群进行接触；
（2）对β细胞复制进行评价；以及
（3）选择使β细胞复制得以增加或增强的化合物。
所述胰腺细胞群可包含不同类型的胰腺细胞，包括但不限于：α细胞、β细胞、δ细胞和成纤维细胞。因此，在一些实施方式中，胰腺细胞群中的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的细胞是β细胞。
在一些实施方式中，所述胰腺细胞群中的90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下或5%以下的细胞是α细胞。
在一些实施方式中，所述胰腺细胞群中的90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下或5%以下的细胞是δ细胞。
在一些实施方式中，所述胰腺细胞群中的90%以下、80%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、10%以下或5%以下的细胞是成纤维细胞。
在一些实施方式中，所述胰腺细胞群包含50-90%的β细胞、10-30%的α细胞、5-10%的成纤维细胞和5-10%的其它细胞类型。在一个进一步的实施方式中，所述胰腺细胞群包含约75%的β细胞、约18%的α细胞、约3%的成纤维细胞和约5%的其它细胞类型。
本文所使用的术语“测试化合物”是指将要对其刺激和/或增加β细胞复制和/或生长的能力进行筛选的化合物和/或组合物。测试化合物可包括各种不同的化合物，包括化学化合物和化学化合物的混合物，例如：小的有机分子或无机分子；糖精；寡糖；多糖；生物大分子，例如肽、蛋白以及肽的类似物和衍生物；拟肽；核酸；核酸的类似物和衍生物；生物材料（如细菌、植物、真菌或动物细胞）的提取物；动物组织；天然存在或合成的组合物；以及上述物质的任意组合。在某些实施方式中，测试化合物是小分子。
本文所使用的术语“小分子”可以指“类似天然产物”的化合物，然而，术语“小分子”并不限于“类似天然产物”的化合物。应该说，小分子其特征一般在于其含有数个碳-碳键，并且具有小于5000道尔顿（5kD）、优选小于3kD、更优选小于2kD、最优选小于1kD的分子量。在一些实例中，小分子优选具有小于或等于700道尔顿的分子量。
可能的测试化合物的数量达到数百万。在如下文献中描述了对基于小分子、多聚体和基因组的库进行开发的方法：例如，Ding等，JAm.Chem.Soc.，124：1594-1596（2002）和Lynn等，JAm.Chem.Soc.，123：8155-8156（2001）。可从例如ArQule、Pharmacopia、graffinity、Panvera、Vitas-MLab、Biomol International和Oxford等处获得可商购的化合物库。可使用本文所述的筛选设备和方法对这些库进行筛选。还可使用如来自NIHRoadmap、Molecular Libraries Screening Centers Network（MLSCN）的化学化合物数据库。可在www.broad.harvard.edu/chembio/platform/screening/compound_libraries/index.htm找到化合物库的综合清单。化学品库或化合物库是通常最终用于高通量筛选或工业生产的已储存化学品的集合。简单来说，所述化合品库可由一系列已储存化学品组成。各化学品具有储存于某种数据库中、与诸如化合物的化学结构、纯度、量和物理化学特征有关的信息。
根据所实践的特定实施方式，可以在溶液中游离的形式提供测试化合物，或者测试化合物可连接至载体或固体支持物（例如珠）。可将许多合适的固体支持物用于固定测试化合物。合适的固体支持物的实例包括琼脂糖、纤维素、右旋糖酐（可商购，例如Sephadex、Sepharose）、羧甲基纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇（PEG）、滤纸、硝基纤维素、离子交换树脂、塑料薄膜、聚胺甲基乙烯基醚马来酸共聚物、玻璃珠、氨基酸共聚物、乙烯-马来酸共聚物、尼龙、丝绸等。此外，对本文所述的方法而言，可对测试化合物单独筛选或按组筛选。在预计有效的测试化合物的命中率很低、使得对于给定组预计阳性结果不高于一个的情况下，按组筛选特别有用。
在一些实施方式中，相对于未处理的对照，测试化合物使β细胞复制或生长增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。
在一些实施方式中，对β细胞复制进行评价的步骤包括：检测β细胞标记和细胞复制标记。可将选定的测试化合物进一步限定为使β细胞标记和细胞复制标记共定位于同一细胞中的化合物。
可通过如下方面对β细胞复制的增加或增强进行评价：（i）与未处理的对照相比，培养物中细胞总数增加；（ii）与未处理的对照相比，使培养物中表达至少一种β细胞标记的细胞总数增加；（iii）与未处理的对照相比，使培养物中的表达至少一种β细胞标记的细胞相对于细胞总数的比例增加；（iv）与未处理的对照相比，使表达至少一种细胞复制标记的细胞数增加；（v）与未处理的对照相比，使表达至少一种细胞复制标记的细胞比例增加；或（vi）上述方面的组合。
在一些实施方式中，通过使用Cellomics ArrayScan VTI进行自动图像采集和分析来对β细胞复制进行评价。建立采集阈值/参数，从而使复制事件基于计算机的响应（computer-based calls）与基于人的响应相一致。此类自动图像采集和分析可以进行化合物的高通量筛选。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，在能够促进半桥粒形成的细胞基质蛋白（例如由大鼠膀胱癌细胞系804G或NBT-II产生的细胞基质蛋白）存在的情况下，对胰腺细胞进行培养。美国专利号5,510,263公开了在804G和NBT-II基质上培养的胰岛细胞其生长得以增强，以引用的方式将其内容整体并入本文。
在本发明这一方面和其它方面的一些实施方式中，将细胞在来自大鼠膀胱癌细胞系804G或NBT-II的条件培养基中进行培养。还可将细胞在添加了来自条件培养基的一种或多种基质蛋白的培养基中进行培养。此类基质蛋白可由天然来源纯化，或使用本领域已知的重组方法生产。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，将细胞在与层粘连蛋白5相接触的培养基中进行培养。优选地，所述层粘连蛋白5选自于由缰蛋白和表皮整联配体蛋白所组成的组。层粘连蛋白5可从多种来源获得，所述来源包括但不限于来自由MCF 10A细胞得到的胞外基质。
将会理解的是，可将条件培养基或基质蛋白加入到培养基中。或者，可将条件培养基或基质蛋白用于对将要培养胰腺细胞的容器表面进行预涂。优选地，在胰腺细胞点板前，用804G或NBT-II条件培养基对容器表面进行涂覆。
点板密度（plating density）一般为约10k个细胞/孔到约100k个细胞/孔。在一些实施方式中，细胞的点板密度为约25k个细胞/孔到约75k个细胞/孔。在一个实施方式中，细胞的点板密度为约60k个细胞/孔。一般来说，在点板时至少75%、80%、85%、90%、95%以上的细胞具有活力。
在点板后，胰腺细胞在与测试化合物接触前可附着至表面足够长时间，例如至少1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h以上。在一些实施方式中，在化合物处理前，将细胞附着48h。在细胞已附着足够长时间后，在用感兴趣的化合物处理前更换培养基。
一般来说，在合适的时间段内，可将化合物在能够增强β细胞复制（相对于对照）的任何浓度下进行测试。在一些实施方式中，可在约0.1nM到约1000mM的浓度下对化合物进行测试。优选地，在约0.1μM到约20μM、约0.1μM到约10μM、或约0.1μM到约5μM的浓度下对化合物进行测试。在一个实施方式中，在1μM下对化合物进行测试。
可将胰腺细胞群维持在适合胰腺细胞培养物的任何温度下。在一个实施方式中，将胰腺细胞维持在约15℃到约55℃的温度下。在一个实施方式中，将胰腺细胞维持在37℃。
一般来说，在胰腺细胞与测试化合物接触足够长时间（例如，至少1h、至少2h、至少3h、至少4h、至少5h、至少6h、至少7h、至少8h、至少9h、至少10h、至少11h、至少12h、至少24h、至少36h、至少48h、至少5天、至少1周、至少2周、至少3周以上）后，可对培养物中的β细胞的数目进行计数。可手动或通过自动系统对细胞进行计数。使用自动系统使得对化合物得以进行高通量筛选。
在胰腺细胞与测试化合物接触足够长时间（例如，至少1h、至少2h、至少3h、至少4h、至少5h、至少6h、至少7h、至少8h、至少9h、至少10h、至少11h、至少12h、至少24h、至少36h、至少48h、至少5天、至少1周、至少2周、至少3周以上）后，可对β细胞标记和复制细胞标记进行检测。在检测标记后，可对表达细胞复制标记和/或β细胞标记的细胞的数目进行计数。对标记的检测可包括对用于合适分析的细胞进行制备的步骤，例如对细胞进行固定和/或染色。
在一些实施方式中，所述方法还包括选择与未处理的对照相比，使β细胞相对于细胞总数的比例增加的化合物。
术语“β细胞标记”不受限地指：特异性地在β细胞中表达或存在于β细胞中的蛋白、肽、核酸、蛋白和核酸的多态（polymorphism）、剪接变体（splice variant）、蛋白或核酸的片段、元素以及其它分析物。示例性的β细胞标记包括但不限于：胰十二指肠同源框-1（PDX-1）多肽；胰岛素；c-肽；胰淀素；E-钙粘蛋白；Hnf3β；PCI/3；β2；Nkx2.2；Nkx6.1；GLUT2；PC2；ZnT-8；MAFA；MAFB；以及Zhang等，Diabetes，50(10)：2231-6（2001）中所述的标记。在一些实施方式中，β细胞标记是核β细胞标记。在一些实施方式中，β细胞标记是PDX-1或PH3。
不希望受理论的束缚，在先的β细胞复制筛选失败的主要原因是使用细胞质标记（胰岛素）作为β细胞鉴定物。细胞质标记的使用使得无法将核复制准确地归于具体的细胞身份（cell identity），也就是说，在密集的培养物中不能将细胞质归于邻近多个核的具体核。因此，在一些实施方式中，β细胞标记不是细胞质β细胞标记。在一个实施方式中，β细胞标记不是胰岛素。
术语“细胞复制标记”不受限地指：特异性地与细胞增殖相关的蛋白、肽、核酸、蛋白和核酸的多态、剪接变体、蛋白或核酸的片段、元素以及其它分析物。此外，“细胞复制标记”包括酶活性的变化（如增高或降低）特异性地与细胞增殖相关时的酶活性。示例性的细胞复制标记包括但不限于：磷酸化组蛋白H3（PH3）、Ki-67蛋白、磷酸化MPM-2抗原、增殖细胞核抗原（PCNA，在细胞周期的DNA合成期中在细胞核中表达的蛋白）、磷酸-S780-Rb表位（Jacobberger,JW等，Cytometry A（2007），73A：5-15）、Cenp-F（分裂激素）、III类β微管蛋白（class IIIβ-Tublin）、纺锤体检验点蛋白hMad2、磷酸化肌球蛋白轻链激酶、拓扑异构酶II、检验点激酶1（Chk 1）、囊泡单胺转运体2（VMAT2）、细胞周期蛋白依赖激酶1（Cdk 1）激酶活性的丧失。组蛋白H3可在Ser28或Ser10位磷酸化。
在一些实施方式中，细胞复制标记是Ki-67蛋白或PH3。
Ki-67蛋白（也称为MKI67）是增殖的细胞标记。Ki-67蛋白与细胞增殖严格相关。在分裂间期，Ki-67蛋白可仅仅在细胞核内检测到；而在有丝分裂中，所述蛋白中的大多数重新定位至染色体的表面。Ki-67蛋白存在于细胞周期的全部活跃期中（G1、S、G2和有丝分裂），但是在静息细胞（G0）中不存在。Ki-67是用于确定给定细胞群的生长分数（growthfractions）的出色标记。
细胞复制标记和β细胞标记可通过本领域已知、且对本领域技术人员来说容易得到的方法进行检测，例如合适的ELISA、荧光免疫或免疫组织化学分析都可用于检测。MIB-1是检测Ki-67蛋白常用的单克隆抗体。MIB-1被用于测定Ki-67标记指数的临床应用。在如下文献中对Ki-67ELISA进行了描述：Klein,CL等，J.Mater.Sci.Mater.Med.（2000），11：125-132；Frahm,SO等，J.Immunol.Methods（1990），211：43-50；以及Key G等，J.Immunol.Methods（1994），177：113-117。用于检测磷酸化组蛋白H3的磷酸-组蛋白H3抗体可从Cell Signaling Technology和Millipore商购得到。针对PCNA的抗体可从Sigma Aldrich商购得到。MPM-2抗原的抗体对于有丝分裂中的细胞是特异性的，识别出分享共同的磷酸化表位的蛋白家族。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，胰腺细胞是胰岛或其片段。在一些实施方式中，胰腺细胞来自哺乳动物，如小鼠、大鼠或人类。在一些实施方式中，胰腺细胞来自受试者，其中，基于受试者对额外β细胞的需要而选择受试者。在一些实施方式中，胰腺细胞是原代胰腺细胞，例如原代胰岛细胞。在一些实施方式中，胰腺细胞不是经转化的胰腺细胞。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，胰腺细胞分离自受试者并培养过夜。
在本发明的这一方面和其它方面的一些实施方式中，胰腺细胞经胰蛋白酶消化成为1-10个细胞的细胞集落。优选地，胰腺细胞经胰蛋白酶消化成为1-7个细胞、更优选1-5个细胞、最优选1-3个细胞的细胞集落。在点板前，经胰蛋白酶消化的胰腺细胞可被重悬浮于合适的胰岛介质中。在一些实施方式中，将经胰蛋白酶消化的胰腺细胞在点板前过夜恢复。
在一个实施方式中，对刺激或增加β细胞复制的候选化合物进行筛选的方法包括：
（a）将胰岛用胰蛋白酶消化成1-3个细胞的细胞集落；
（b）使细胞过夜恢复；
（c）将从步骤（b）得到的细胞向96孔板的孔中点板，其中将所述孔用804G条件培养基包被，细胞点板密度为60k个细胞/孔；
（d）使细胞附着至孔表面48小时；
（e）使1μM测试化合物与β细胞接触24小时；
（f）用PDX-1抗体和Ki-67和/或PH3抗体对细胞进行染色；并对β细胞复制进行评价。
本文所使用的术语“经转化的细胞”是本领域已知的，是指已转变至不受控生长状态的细胞，也就是说，所述细胞在培养中获得了通过无限次分裂进行生长的能力。考虑到经转化的细胞丧失了生长控制，经转化的细胞可用术语“肿瘤性”、“间变性”和/或“增生性”加以表征。一般来说，术语“经转化的β细胞”是指显示出在连续的继代培养中的持续能力增加、或体外生长速率增加的β细胞。
在一些实施方式中，筛选方法是高通量筛选。高通量筛选（HTS）是使用了机器人、数据加工与控制软件、液体操作装置以及敏感检测器的科学实验方法。高通量筛选或HTS使研究人员快速地实施数百万个生物化学、基因或药理学的测试。高通量筛选是本领域技术人员所公知的，例如在美国专利号5,976,813、6,472,144、6,692,856、6,824,982和7,091,048中所述的高通量筛选，以引用的方式将其内容整体并入本文。
HTS使用自动化技术对候选化合物库进行分析筛选。分析是对具体活性进行的测试：通常是生化机理或生物机理的抑制作用或刺激作用。一般的HTS筛选库或“平台（decks）”可包含100,000种至多于2,000,000种的化合物。
HTS中关键的实验室器皿或测试容器是微量滴定板：通常为由塑料制成的一次性小容器，特点在于小的开口凹坑（open divots，称作孔）的网格。用于HTS的现代的微板通常具有384、1536或3456个孔。这些均为96的倍数，反映了其源于具有8×12个9mm间距的孔的96孔微板。
为了对试验进行准备，研究人员用其所希望的用于实施实验的合适试剂（如胰腺细胞群）填充板的各孔。在孵育一段时间使试剂得以吸收、结合至或另外与孔中的化合物反应（或不能反应）后，手动或通过机器对板中的所有孔进行测定。当研究人员使用显微镜去寻找电脑自身不易确定的变化（举例）时，手动测定通常是必要的。否则，专门的自动分析器可在孔上进行大量实验，如比色计测量、放射性计数等。在这种情况下，所述机器以数值网格的形式输出各实验的结果，每个数字映射至由单个孔中得到的值。高容量分析器可在数分钟间隔内测量许多培养板，极其快速地生成数千个实验数据点。
另一方面，本发明提供了由本文所述的筛选分析所选择的化合物。将会理解的是，本文还请求保护由本文所述筛选分析所选择的化合物的类似物、衍生物和同分异构体。
糖尿病的诊断
1型糖尿病是引起胰腺的产胰岛素β细胞破坏的自身免疫疾病。胰岛素缺乏引起禁食血糖的增高（对于非糖尿病人约为70-120mg/dL）而以高于阈值（对于多数人为约190-200mg/dL）出现在尿中。世界卫生组织将糖尿病定义为禁食血浆葡萄糖浓度的诊断值为7.0mmol/L（126mg/dL）以上（全血为6.1mmol/L或110mg/dL）、或2小时血糖水平为11.1mmol以上（200mg/dL以上）。
可使用多种诊断测试对1型糖尿病进行诊断，所述诊断测试包括但不限于如下测试：（1）糖化血红蛋白（A1C）测试；（2）随机血糖测试；和/或（3）禁食血糖测试。
糖化血红蛋白（A1C）测试是一种反映受试者在过去的2-3个月内的平均血糖水平的血液测试。该测试测量了附着至血红蛋白的血糖的百分比，该百分比与血糖水平相关（例如，血糖水平越高，糖基化的血红蛋白就越多）。两次独立测试的A1C水平为6.5%以上表现出糖尿病。6%-6.5%的结果被视为糖尿病前期（prediabetic），表明具有发展成糖尿病的高风险。
随机血糖测试包括在随机时间点从疑似患有糖尿病的受试者体内获得血样。血糖值可表示为毫克每分升（mg/dL）或毫摩尔每升（mmol/L）。200mg/dL（11.1mmol/L）以上的随机血糖水平表明受试者很可能患有糖尿病，尤其是伴有糖尿病的任何征象和症状时（如尿频和极度口渴）。
对于禁食条件血糖测试，在过夜禁食后取血样。禁食血糖水平低于100mg/dL（5.6mmol/L）被视为正常。禁食血糖水平在100mg/dL-125mg/dL（5.6mmol/L-6.9mmol/L）时被视为糖尿病前期，而两次独立测试该水平在126mg/dL（7mmol/L）以上表示糖尿病。
还可使用c-肽分析来区分1型糖尿病和2型糖尿病，所述c-肽试验对内源性胰岛素的产生进行测量。通过葡萄糖耐量试验测定的存在抗-胰岛抗体（针对谷氨酸脱羧酶、胰岛素瘤相关肽-2或胰岛素）或者是胰岛素抵抗不足也表现出1型糖尿病，因为很多2型糖尿病持续在体内产生胰岛素，并且都具有某种程度的胰岛素抵抗。
已经提出GAD 65抗体测试作为用于区分1型糖尿病和2型糖尿病的改进测试，因为看起来免疫系统参与了1型糖尿病的病因。
定义
除非本文中另有说明，与本发明有关的科技术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求，单数术语涵盖复数，并且复数术语涵盖单数。
术语“糖尿病（diabetes）”和“糖尿病（diabetes mellitus）”可互换使用。世界卫生组织将糖尿病定义为禁食血浆葡萄糖浓度的诊断值为7.0mmol/L（126mg/dL）以上（全血为6.1mmol/L或110mg/dL）、或2小时血糖水平为11.1mmol以上（200mg/dL以上）。其它暗示或表明糖尿病高风险的值包括：升高的动脉压，140/90mmHg以上；升高的血浆甘油三酯（1.7mmol/L；150mg/dL）和/或低HDL胆固醇（男性低于0.9mmol/L、35mg/dL；女性低于1.0mmol/L、39mg/dL）；向心性肥胖（男性：腰臀比高于0.90；女性：腰臀比高于0.85）和/或超过30kg/m2的体重指数；微白蛋白尿，其中尿白蛋白排泄速率为20μg/min以上，或白蛋白与肌酸酐的比为30mg/g以上。
本文所使用的术语“包含/包括（comprising or comprises）”表示对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要都仍然对未指定的要素保持开放。
本文所使用的术语“基本上由…组成”表示给定的实施方式所需的那些元素。该术语允许存在实质上不影响本发明实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外成分。
术语“由…组成”表示本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式描述中详述的任何要素。
除了在操作实施例中或另有指示的地方，本文所用的表示成分或反应条件的量的全部数值在所有例子中都应该被理解为被术语“约”修饰。与百分比相连使用的术语“约”可意味着±1%。
除非文中明确地另有所指，单数术语“一（a/an）”和“该/所述（the）”涵盖复数的所指物。相似地，除非文中明确地另有所指，单词“或（or）”意在涵盖“和”。应进一步理解对核苷酸或多肽而言所有的碱基尺寸或氨基酸尺寸以及所有的分子量或分子质量值都是近似值，并且都是为描述而提供。
尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可被用于本文公开的实践或试验中，合适的方法和材料见下述。术语“包含/包括（comprises）”意思是“含有（includes）”。缩写“e.g.”源自拉丁文的例如（exempli gratia），并且用于此处表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如（for example）”同义。
本文使用的术语“降低（decrease）”、“减少（reduced/reduction）”、“降低（decrease）”或“抑制（inhibit）”都意味着减少有统计学意义的量。然而，为避免疑义，“减少（reducedreduction）”或“降低（decrease）”或“抑制（inhibit）”表示相对于参比水平降低至少10%，例如降低至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括降低100%（如，相对于参比水平的缺乏水平）、或相对于参比水平降低在10%到100%之间的任意量。
本文使用的术语“增加（increased/increase）”或“增强（enhance）”或“活化（activate）”通常都意味着增加有统计学意义的量；为避免疑义，术语“增加（increased/increase）”或“增强（enhance）”或“活化（activate）”表示相对于参比水平增加至少10%，例如增加至少约20%、或至少约30%、或至少约40%、或至少约50%、或至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或至少约90%、或上至并包括增加100%、或相对于参比水平增加在10%到100%之间的任意量；或相对于参比水平至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加、或增加在2倍和10倍或之间的任意量、或是更大量的增加。
术语“统计学显著（statistically significant）”或“显著地（significantly）”表示统计显著性，并且通常意味着参比水平以上或以下两个标准差。这个术语表示统计证明存在差异。它被定义为当无效假设实际上是真时作出否决该无效假设的决定的可能性。通常利用p值来作出决定。
本文所使用的术语“IC50”是指在抑制剂不存在的情况下，可使用相同分析所测量的产生出ADK活性50%最大抑制的抑制剂浓度。IC50可在体外或体内测量。可通过使用常规的体外激酶分析来测量体外腺苷激酶活性，从而确定IC50。可通过例如本领域公知的标准程序对腺苷激酶进行抑制（Yamada等，Comp.Biochem.Physiol.，1982，71B：367-372）。通常，一般通过将化合物加入到含有酶、放射性标记的底物腺苷、氯化镁和ATP的水溶液中，使腺苷激酶与抑制剂化合物相接触。酶可存在于完整的细胞内，或存在于含有该酶的经分离亚细胞部分（isolatedsubcellular fractions）内。然后，在抑制剂存在的情况下，将该酶在合适的生理条件下维持一段时间。确定维持时间的方法是本领域公知的，并且尤其取决于酶的浓度和生理条件。合适的生理条件是维持腺苷激酶活力所必需的条件，包括温度、酸度和弹性（tonicity）等。举例来说，可在存在和不存在抑制剂的情况下，对含有腺苷激酶的细胞（如IMR-32人成神经细胞瘤细胞）进行培养。以对内源性或外部施加的14C-腺苷的磷酸化进行抑制的能力来测量抑制作用。在一些实施方式中，通过如下文献所述的分析测量ADK活性：Cowart M.等，Structure-activity studies of5-substituted pyridopyrimidines as adenosine kinase inhibitors，Bioorg MedChem Lett，2001，1：83-86；Davies LP等，Halogenated pyrrolopyrimidineanalogues of adenosine from marine organisms:Pharmacological activitiesand potent inhibition of adenosine kinase，Biochem Pharmacol，1984，33：347-355；Erion MD等，Design,synthesis and anticonvulsant activity of thepotent adenosine kinase inhibitor GP3269，Nucleosides Nucleotides，1997，16：1013-1021；Hajduk PJ等，Design of adenosine kinase inhibitors from theNMR-based screening of fragments，J Med Chem，2000，3：4781-4786；Jarvis,MF等，ABT-702,a novel orally effective adenosine kinase(AK)inhibitor analgesic with anti-inflammatory properties:I.In vitrocharacterization and acute antinociceptive effects in mice，J Pharmacol ExpTher，2000，295：1156-1164；Kowaluk EA，Bhagwat SS和Jarvis MF，Adenosine kinase inhibitors，Curr Pharmaceut Des，1998，4：403-416；Kowaluk EA等，Characterization of the effects of adenosine kinaseinhibitors on acute thermal nociception in mice，Pharmacol Biochem Behav，1999，63：83-91；Miller LP等，Pre-and peristroke treatment with theadenosine kinase inhibitor,5’deoxyiodotubercidin,significantly reducesinfarct volume after temporary occlusion of the middle cerebral artery inrats，Neurosci Lett，1996，220：73-76；Miller RL，Adamczyk DL和MillerWH等，Adenosine kinase from rabbit liver.II.Substrate and inhibitorspecificity，J Biol Chem，1979，254：2346-2352；Ugarkar BG等，Adenosinekinase inhibitors.2.Synthesis,enzyme inhibition,and antiseizure activity ofdiaryltubercidin analogues，J Med Chem，2000，43：2984-2905；UgarkarBG等，Adenosine kinase inhibitors.1.Synthesis,enzyme inhibition,andantiseizure activity of 5-iodotubercidin analogues，J Med Chem，2000，43：2883-2893；Wiesner JB等，Adenosine kinase inhibitors as a novel pproachto anticonvulsant therapy，J Pharmacol Exp Ther，1999，289：1669-1677；以引用的方式将其内容整体并入本文。
本文所使用的术语“EC50”是指在活化剂不存在的情况下，可使用相同试验测量的产生出AMPK活性50%最大活化的活化剂浓度。换句话说，“EC50”是当将100%活化设定为活性不再随更多活化剂的加入而增高的量时，产生50%活化时的活化剂浓度。EC50可在体外或体内测量。可通过使用常规的体外激酶分析来测量体外AMPK活性，从而确定EC50。在一些实施方式中，通过如下文献所述的分析测定AMPK活性：Gorton,JM等，5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside:a specificmethod for activating AMP-activated protein kinase in intact cells?，Eur.J.Biochem.，1995，229：558-565，以引用的方式将其内容整体并入本文。
“葡萄糖耐量减低”（IGT）被定义为具有高于正常水平、但尚未足够高至被归为糖尿病的血糖水平。患有IGT的受试者在75g口服葡萄糖耐量测试中具有140mg/dL-199mg/dL（7.8mmol-11.0mmol）的2小时血糖水平。这些血糖水平高于正常水平，但低于诊断为糖尿病的水平。患有葡萄糖耐量减低或禁食血糖减低的受试者具有发展为糖尿病的显著风险，因此这些受试者是早期预防的重要目标群体。
“正常血糖水平”与术语“血糖量正常”可互换使用，是指低于6.1mmol/L（110mg/dL）的禁食静脉血浆葡萄糖浓度。尽管该量是人为指定的，但是在已证实具有正常葡萄糖耐量的受试者（尽管通过口服葡萄糖耐量测试（OGTT）测定，一些受试者可能患有IGT）中观察到了此值。本文所定义的和本发明上下文中的基准值、指数值（index value）或参比值可包括例如“正常血糖水平”。
“糖尿病前期病情”是指介于正常的葡萄糖稳态、代谢与明确（frank）糖尿病中可见的状态之间的代谢状态。糖尿病前期病情不受限地包括：代谢综合征（“综合征X”）、葡萄糖耐量减低（IGT）和禁食血糖减低（IFG）。IGT是指餐后血糖调节的异常，而IFG是指在禁食状态下测量到的异常。世界卫生组织将IFG的值定义为禁食血浆葡萄糖浓度为6.1mmol/L（100mg/dL）以上（全血为5.6mmol/L、100mg/dL），但低于7.0mmol/L（126mg/dL）（全血为6.1mmol/L、110mg/dL）。根据美国国家胆固醇教育规划（NCEP）所述的代谢综合征的标准被定义为具有如下指标中的至少三种：130/85mmHg以上的血压；6.1mmol/L以上的禁食血浆葡萄糖；腰围大于102cm（男性）或大于88cm（女性）；1.7mmol/L以上的甘油三酯；以及HDL胆固醇小于1.0mmol/L（男性）或小于1.3mmol/L（女性）。
“2型糖尿病相关的并发症”或“糖尿病前期病情相关的并发症”可不受限地包括：糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、失明、记忆力丧失、肾衰竭、心血管疾病（包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病、脑血管疾病、动脉粥样硬化和高血压）、神经病变、自主功能障碍、高血糖高渗性昏迷、或上述并发症的组合。
本文所使用的术语“HBA1c”是指糖化血红蛋白，而且是一段时间（例如2-3个月）内的血糖水平的指标。与对受试者开始治疗前的HBA1c的水平相比，如果用本文所述的化合物处理后降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%以上，则HBA1c的水平“下降”。类似地，如果用本文所述化合物处理后降低至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%以上时，则酮体“下降”。
为简单起见，对化学基团进行定义，在对本领域技术人员来说清楚的合适结构环境下，全文所定义和所意指的化学基团可为一价化学基团（例如，烷基、芳基等）或者多价化学基团。例如，“烷基”基团可以是指单价基团（例如CH3-CH2-）；或在其它情况下，二价连接基团可以是“烷基”，在这种情况下本领域技术人员将会理解该烷基为等同于术语“亚烷基”的二价基团（例如-CH2-CH2-）。类似地，在需要二价基团，并且这些二价基团被表示为“烷氧基”、“烷基氨基”、“芳氧基”、“烷硫基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”、“烷基”、“烯基”、“炔基”、“脂烃基（aliphatic）”或“环烷基”的情况下，本领域技术人员将会理解的是，术语“烷氧基”、“烷基氨基”、“芳氧基”、“烷硫基”、“芳基”、“杂芳基”、“杂环基”、“烷基”、“烯基”、“炔基”、“脂烃基”或“环烷基”是指相应的二价基团。
术语“卤代/卤素”是指氟、氯、溴或碘的任何基团。
术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基取代基，上述基团中的任何基团可被取代基进一步取代。示例性的酰基基团包括但不限于：(C1-C6)烷酰基（例如，甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、叔丁基乙酰基等）；(C3-C6)环烷基羰基（例如，环丙基羰基、环丁基羰基、环戊基羰基、环己基羰基等）；杂环基羰基（例如，吡咯烷基羰基、吡咯烷-2-酮-5-羰基、哌啶羰基、哌嗪羰基、四氢呋喃基羰基等）；芳酰基（例如，苯甲酰基）和杂芳酰基（例如，噻吩基-2-羰基、噻吩基-3-羰基、呋喃基-2-羰基、呋喃基-3-羰基、1H-吡咯基-2-羰基、1H-吡咯基-3-羰基、苯并[b]噻吩基-2-羰基等）。此外，酰基基团中的烷基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基部分可以是各自定义中的任何一种基团。
术语“烷基”是指饱和的非芳香烃链，所述烃链可以是直链或支链，含有所示数目的碳原子（这些烃链不受限制地包括甲基、乙基、丙基、烯丙基或炔丙基），可任选将N、O、S、SS、SO2、C(O)、C(O)O、OC(O)、C(O)N或NC(O)插入所述烃链中。例如，C1-C6表示在其中可具有1-6个（含端值）碳原子的基团。
术语“烯基”是指含有至少一个双键的烷基。示例性的烯基基团包括例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等，但不限于此。
术语“炔基”是指含有至少一个三键的烷基。
术语“烷氧基”是指-O-烷基基团。
术语“氨基烷基”是指用氨基取代的烷基。
术语“巯基”是指-SH基团。
术语“硫代烷氧基”是指-S-烷基基团。
术语“芳基”是指单环、双环、或三环芳环体系，其中，各环上的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代。示例性的芳基基团包括但不限于：苯基、萘基、蒽基、薁基（azulenyl）、芴基、茚满基、茚基、萘基、苯基、四氢化萘基等。
术语“芳基烷基”是指用芳基取代的烷基。
术语“环基”、“环”或“环烷基”是指具有3-12个碳原子、例如3-8个碳原子、例如3-6个碳原子的饱和和部分不饱和的环状烃基，其中，环烷基可另外任选被取代。示例性的环烷基包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基等。
术语“杂芳基”是指具有1-3个杂原子的5-8元芳香单环环系、具有1-6个杂原子的8-12元芳香双环环系或具有1-9个杂原子的11-14元芳香三环环系，所述杂原子选自O、N或S（例如，如果分别为单环、双环或三环，则分别具有碳原子和1-3个、1-6个或1-9个N、O或S杂原子），其中，各环上的0、1、2、3或4个原子可被取代基取代。示例性的杂芳基基团包括但不限于：吡啶基、呋喃基、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基、哒嗪基、吡嗪基、喹啉基、吲哚基、噻唑基和萘啶基等。
术语“杂芳基烷基”是指用杂芳基取代的烷基。
术语“杂环基”、“杂环”或“杂环的”是指具有1-3个杂原子的5-8元非芳香单环、具有1-6个杂原子的8-12元非芳香双环或具有1-9个杂原子的11-14元非芳香三环环系，所述杂原子选自O、N或S（例如，如果分别为单环、双环或三环，则分别具有碳原子和1-3个、1-6个或1-9个N、O或S杂原子），其中，各环上的0、1、2、或3个原子可被取代基取代。示例性的杂环基包括但不限于：哌嗪基、吡咯烷基、二噁烷基、吗啉基和四氢呋喃基等。
术语“卤代烷基”是指具有1个、2个、3个以上与其连接的卤原子的烷基基团。示例性的卤代烷基包括但不限于：氯甲基、溴乙基和三氟甲基等。
术语“任选取代的”意味着，指定的基团或部分（如烷基、芳基、杂芳基等）未被取代，或者被一个或多个（通常是1-4个取代基）取代基所取代，所述取代基独立选自于由下文“取代基”定义中列举的取代基或另外指定的取代基所组成的组。
术语“取代基”是指在烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂环基、杂芳基、酰基、氨基的任意原子上“取代”的基团。合适的取代基不受限地包括：卤素、羟基、氧代、硝基、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳基、芳烷基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰基氨基、烷基羰基、芳基羰基、氨基烷基、烷氧基羰基、羧基、羟基烷基、烷硫基、CF3、N-吗啉代、苯硫基、烷磺酰基、芳烃磺酰基、烷亚磺酰胺基、芳烃亚磺酰胺基、芳烷基亚磺酰胺基、烷基羰基、酰氧基、氰基或脲基。在一些实施方式中，取代基自身可被任选取代。在一些情况下，两个取代基连同它们所连接的碳原子形成环。
本文所述的化合物及其盐包含不对称碳原子，因此可作为单独的立体异构体、外消旋体和作为对映异构体与非对映异构体的混合物存在。通常，此类化合物将制成外消旋混合物。然而，如果需要的话，此类化合物可制成或分离为纯的立体异构体（即，单独的对映异构体或非对映异构体），或作为富含立体异构体的混合物。如下文所详细讨论的，通过如下方法制备化合物的单独的立体异构体：由包含期望的手性中心的光学活性原料进行合成；或者是制备对映异构产物的混合物、随后进行分离或拆分，例如转变为非对映异构体的混合物，然后进行分离或重结晶（色谱技术、使用手性拆分剂、或者将对映异构体在手性色谱柱上直接分离）。特定立体化学结构的起始化合物是可商购的，或可使用下文所述方法进行制造并通过本领域公知的技术进行拆分。
本文所使用的术语“立体异构体”或“光学异构体”意味着具有至少一个手性原子或造成垂直不对称平面的旋转受限（例如，特定的联苯类化合物、丙二烯类化合物和螺环化合物）、可使平面偏振光旋转的稳定异构体。由于适合用于本发明的本文所述化合物中存在可产生立体异构的不对称中心和其它化学结构，其立体异构体及其混合物也在本发明的考虑之列。术语“对映异构体”意味着相互为不能重叠的镜像的一对立体异构体。术语“非对映异构体”或“非对映体”意味着相互不为镜像的光学异构体。术语“外消旋混合物”或“外消旋体”意味着含有等份的各对映异构体的混合物。术语“非外消旋混合物”意味着含有不等份的各对映异构体的混合物。
本文所使用的术语“对映异构体富集”是指相对于一种对映异构体增加另一种对映异构体的量。对所达到的对映异构体富集进行表示的简便方法是对映异构体过量（或“ee”）的概念，用以下方程式进行计算：
ee=100x(E1-E2)/(E1+E2)
其中，E1是第一对映异构体的量，而E2是第二对映异构体的量。
在一些实施方式中，本文所述的化合物具有至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上的对映异构体过量。一般来说，优选高于90%的ee、最优选高于95%的ee、并且最特别优选高于99%的ee。
对映异构体富集很容易由本领域普通技术人员使用标准技术或程序（如装有手性柱的气相色谱或高效液相色谱）来测定。对实现对映异构体对的分离所必须的合适的手性柱、洗脱液与条件进行的选择，完全处于本领域普通技术人员的知识范围内。此外，化合物的对映异构体可由本领域普通技术人员使用本领域公知的标准技术来进行拆分，所述标准技术如记载在下述文献中的技术：J.Jacques等，“Enantiomers,Racemates,and Resolutions”，John Wiley and Sons,Inc.，1981。拆分的实例包括重结晶技术或手性色谱。
为了描述和公开的目的，所有的专利和其它已确定的出版物在此明确地引入本文作为参考，例如，所述出版物中描述的方法学的使用可能与本发明相关。这些出版物仅因为它们的公开早于本发明的申请日而提供。这方面的任何内容不应视为承认发明者没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。
本发明可以由任何下列编号的段落进行定义：
1.一种使胰腺细胞群中的β细胞复制得以增加的方法，所述方法包括：用腺苷激酶（ADK）的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的抑制剂或AMP活化蛋白激酶（AMPK）的活化剂与胰腺细胞群进行接触。
2.段落1中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制剂为式（I）及其药学上可以接受的盐和酰胺：
Figure BDA00002034784300851
式（I）
其中：
R1为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、OR5、SR5、N(R6)2、(CH2)mR7，或者R1和R2连同它们所连接的原子形成可被任选取代的5-8元杂环；
R2和R3各自独立地为H、OR5、SR5、N(R5)2，或者R2和R3连同它们所连接的原子形成可被任选取代的5-8元杂环；
R4为H、卤素、CN、N2、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R5各自独立地为H、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R5连同它们所连接的氮原子一起形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
R6为R5、OR5、SR5、N(R5)2、N2、CN、卤素或
R7各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
X为O、S、NH或CH2；
Y和Z各自独立地为N或CR8；
R8各自独立地为H、卤素、CN、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Z1各自独立地为O或S；
Z2各自独立地为OM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
M为碱金属阳离子；
m为1、2、3或4；
n为0、1或2。
3.段落1中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制剂为式（Ⅱ）及其药学上可以接受的盐和酰胺：
Figure BDA00002034784300871
式（II）
其中：
R9各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R9连同它们所连接的氮原子一起形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
R10、R11和R12各自独立地为H、OR14、N(R14)2、N2、NO2、CN、卤素、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基；
R13各自独立地为卤素、CN、NH2、或任选取代的C1-C6烷基；
R14为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R14连同它们所连接的氮原子一起形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
X2为N或CR15；
R15为NHR16、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R16为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Y2为N或CH；
Q为0、1、2或3。
4.段落1-3中任一项所述的方法，其中，所述ADK抑制剂的IC50为小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM。
5.段落1-4中任一项所述的方法，其中，相对于未被抑制的对照，所述ADK的活性被抑制或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%（例如完全丧失活性）。
6.段落1-5中任一项所述的方法，其中，所述ADK抑制剂选自于由下列化合物所组成的组：芒霉素、5′-脱氧腺苷、5′-氨基腺苷、5′-脱氧-5-碘代杀结核菌素、5-碘代杀结核菌素（A10）、7-脱氮-7-碘-2′,3′-二脱氧腺苷、去甲芒霉素、去甲杀结核菌素、A-134974、丰加霉素、GP-515（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、GP-3269（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-氟苯基氨基)-5-苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-四氢-5-甲基呋喃-3,4-二醇）、GP-683（(2R,3S,4R,5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3,4-二醇）、GP-947（(2S,3S,4R,5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3,4-二醇）、ABT-702（5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺，B8）、化合物1（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、化合物2（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、化合物3（(1S,2R,3S,5R)-3-氨基-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)环戊烷-1,2-二醇）、化合物4（(1S,2R,3S,5R)-3-氨基-5-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)环戊烷-1,2-二醇）、化合物5（(1S,2R,3S,4R)-4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1,2,3-三醇）、化合物6（7-(4-(二甲基氨基)苯基)蝶啶-4-胺）、化合物7（5-(3-溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物8（5-(2-溴苄基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物9（5-环己基-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物10（5-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物11（5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物12（5-(2-甲基戊-4-烯-2-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物13（N5-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,5-二胺）、以及上述物质的组合。
7.段落1中所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂为式（Ⅲ）及其药学上可接受的盐和酰胺：
Figure BDA00002034784300891
式（Ⅲ）
其中：
R17为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、OR22、SR22、N(R22)2、(CH2)mR23，或者R17与R18连同它们所连接的原子共同形成可任选取代的5-8元杂环；
R18和R19各自独立地为H、OR22、SR22、N(R22)2，或者R18与R19连同它们所连接的原子共同形成可任选取代的5-8元杂环；
R20和R21各自独立地为卤素、CN、N2、OR22、SR22、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R22各自独立地为H、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R23为R22、OR22、SR22、N(R22)2、N2、CN、卤素或
Figure BDA00002034784300892
R24各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
X为O、S、NH或CH2；
Y和Z各自独立地为N或CR25；
R25各自独立地为H、卤素、CN、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-CX炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Z1各自独立地为O或S；
Z2各自独立地为H、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
M为碱金属阳离子；
m为1、2、3或4；
n为0、1或2。
8.段落1或7中所述的方法，其中，相对于未被活化的对照，所述AMP活化激酶的活性增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍以上。
9.段落1、7和8中任一项所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂的EC50小于或等于500nM、250nM、100nM、50nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
10.段落1和7-9中任一项所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂是5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷（AICAR）。
11.段落1中所述的方法，其中，所述SAHH的抑制剂的IC50小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM。
12.段落1或11中所述的方法，其中，相对于未抑制的对照，所述SAHH的活性被抑制或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%（例如完全丧失活性）。
13.段落1、11和12中任一项所述的方法，其中，所述SAHH抑制剂选自于由下列化合物所组成的组：9(S)-(2,3-二羟基丙基)腺嘌呤[(S)-DHPA]；D-香菇嘌呤；(R,S)-3-腺嘌呤-9-基-2-羟基丙酸[(R,S)-AHPA]；腺苷（Ado）二醛；3-脱氮腺苷（c3-Ado）；芒霉素（Ari）；瓶菌素A（NPA或NpcA）；二羟基环戊烯基腺嘌呤（DHCeA）；二羟基环戊烯基-3-脱氮腺嘌呤（c3-DHCeA）；二羟基环戊烷基腺嘌呤（DHCaA）；二羟基环戊烷基-3-脱氮腺嘌呤（c3-DHCaA）；3-脱氮瓶菌素A（c3-NpcA）；3-脱氮芒霉素（c3Ari）；碳环-3-脱氮腺苷（C-c3Ado）；6′-C甲基瓶菌素A；2′-脱氧腺苷；杀结核菌素；利巴韦林；pyraazofurin；2′-脱氧-2′-氯腺苷；异戊烯基腺苷；甲硫基腺苷（MTA）；9-β-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤（Ara-A，阿糖腺苷）；2′-脱氧腺苷；N-甲基芒霉素、8-氮杂芒霉素和3-脱氮芒霉素，以及它们的二醛和二醇衍生物；(±)-5-去甲芒霉素及其2,6-二氨基类似物；2′-脱氧芒霉素；3′-脱氧芒霉素；3′-氨基-3′-脱氧芒霉素；3′-氨基-3′-脱氧阿拉伯呋喃糖基-芒霉素；6′-羟基芒霉素；6′-巯基芒霉素；8′-溴芒霉素；8-羟基芒霉素、芒霉素-3′-环磷酸酯、芒霉素-6′-环磷酸酯；2-氟-S-腺苷同型半胱氨酸（2-FSAH）；S-腺苷-L-同型半胱氨酸亚砜；S-腺苷-L-同型半胱氨酸砜；S-芒霉素-L-同型半胱氨酸；5′-S-(3-羰基-4-硝基苯基)硫代腺苷；5′-S-(甲基)-5′-S-(丁基)硫代腺苷；以及上述物质的任意组合。
14.段落1-13中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞来自受试者，其中所述受试者需要额外的β细胞。
15.段落1-14中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞来自受试者，其中所述受试者不需要额外的β细胞。
16.段落1-15中任一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
17.段落1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
18.段落1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是小鼠。
19.段落1-18中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞是原代胰腺细胞。
20.段落1-19中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞由去分化细胞衍生。
21.段落1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触在体外进行。
22.段落1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触离体进行。
23.段落1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触在体内进行。
24.段落23所述的方法，其中，所述体内接触在哺乳动物体内进行。
25.段落24中所述的方法，其中，所述体内接触在小鼠体内进行。
26.段落24中所述的方法，其中，所述体内接触在人类体内进行。
27.段落23中所述的方法，其中，所述体内接触在受试者内进行，所述受试者需要额外的β细胞。
28.段落27中所述的方法，其中，所述受试者患有1型糖尿病。
29.段落27中所述的方法，其中，所述受试者患有2型糖尿病。
30.段落27中所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
31.段落27-30中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
32.段落1-31中任一项所述的方法，其中，相对于对照，β细胞复制增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍以上。
33.一种用于对增加胰腺细胞群中的β细胞复制的化合物进行筛选的高通量分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
（a）用测试化合物与胰腺细胞群或胰腺细胞制剂进行接触，其中所述胰腺细胞是原代胰腺细胞；
（b）对β细胞的复制或生长进行评价；以及
（c）选择使β细胞的复制或生长得以增加或增强的化合物。
34.段落33中所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞在细胞培养容器中进行培养，所述容器的表面包被有来自大鼠膀胱癌细胞系804G的条件培养基。
35.段落33-34中任一项所述的分析方法，其中，对β细胞复制进行评价的步骤包括检测β细胞标记和细胞复制标记。
36.段落35中所述的分析方法，其中，所述细胞复制标记是Ki-67或PH3。
37.段落35-36中任一项所述的分析方法，其中，所述β细胞标记选自于由下列标记所组成的组：PDX-1、胰岛素、c-肽、胰淀素、E-钙粘着蛋白、Hnf3β、PCI/3、Beta2、Nkx2.2、Nkx6.1、GLUT2、PC2、ZnT-8、MAFA、MAFB、以及上述标记的任意组合。
38.段落35-37中任一项所述的分析方法，其中，所述β细胞标记为PDX-1。
39.段落35-38中任一项所述的分析方法，其中，所述β细胞标记不是胰岛素。
40.段落33-39中任一项所述的分析方法，其中，所述测试化合物的浓度范围是0.1nM到1000nM。
41.段落33-40中任一项所述的分析方法，其中，所述分析方法在约15℃到约55℃的温度范围下进行。
42.段落33-41中任一项所述的分析方法，其中所述测试化合物与所述胰腺细胞接触至少1个小时。
43.段落30-42中任一项所述的分析方法，其中，相对于未被处理的对照，所述测试化合物使β细胞的复制或生长增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。
44.段落33-43中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞不是胰腺细胞系。
45.段落33-44中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞群是胰岛或其片段。
46.段落33-45中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞是原代胰腺β细胞。
47.段落33-46中任一项所述的分析方法，其中，在与所述测试化合物接触前，将所述胰腺细胞附着到所述细胞培养容器表面约12-48小时。
48.段落33-47中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞由去分化细胞衍生。
49.段落33-48中任一项所述的分析方法，其中，所述去分化细胞是诱导的多能干细胞。
50.段落33-49中任一项所述的分析方法，其中，所述分析方法包括如下步骤：
（a）将胰岛用胰蛋白酶消化成1-3个细胞的细胞集落；
（b）使细胞过夜恢复；
（c）将从步骤（b）得到的细胞向96孔板的孔中点板，其中将所述孔用804G条件培养基包被，细胞点板密度为60k个细胞/孔；
（d）将细胞附着至所述孔的表面48小时；
（e）使测试化合物与所述β细胞接触24小时；
（f）用PDX-1抗体与Ki-67和/或PH3抗体对细胞进行染色；
（g）对β细胞的复制进行评价；以及
（h）选择使β细胞复制得以增加或增强的化合物。
对于没有指出的范围，本领域普通技术人员将会理解的是，本文描述和阐明的各种实施方式中的任何一个都能被进一步修改，以将本文公开的任何其它实施方式中的特征并入。
下列实施例阐明了本发明的一些实施方式和一些方面。很明显地，对本领域技术人员来说，各种修改、增加、替换等都能在不改变本发明的精神或范围的情况下实现，并且这些修改和变化都包含在下述权利要求限定的本发明的范围之内。不管怎样，本发明并不局限于下述实施例。
实施例
实施例1：筛选分析
如在先的下述文献中所述分离大鼠胰岛：Gotoh M，Maki T，Kiyoizumi T，Satomi S和Monaco AP，An improved method for isolation ofmouse pancreatic islets，Transplantation，40，437-438，1985；以引用的方式将其内容整体并入本文。将分离后的胰岛在组织培养孵育箱中培养过夜。次日上午，将胰岛用胰蛋白酶消化为1-3个细胞的细胞集落，将其重悬浮于胰岛培养基中（Mediatech 99-786-CV；10%FBS血清（ValleyBiomedial BS3033）；8.3mM葡萄糖（Sigma G7528）；1X青霉素/链霉素（Invitrogen 15070-063）；1X Glutamax（Invitrogen 35050-079）），并向已包被有804G（大鼠膀胱癌细胞系）条件培养基的96孔板（Sigma CLS3904）的孔中点板。细胞点板密度为60k个细胞/孔，并且确认了点板时多于95%的细胞具有活力。使胰岛细胞附着48小时，更换培养基（Mediatech99-786-CV 2%血清、5mM葡萄糖、1X青霉素/链霉素、1X glutamax），并用测试化合物对细胞进行处理。为了筛选，将化合物以1μM的浓度进行两组重复测试。在化合物处理24小时后，将细胞用新鲜的4%PFA（Electron Microscopy Services 15710）固定20min，并用PBS（VWR45000-446）进行洗涤。通过将细胞在处于PBS中的0.1mM EDTA（AmbionAM9260G）中加热至90℃来进行抗原修复。然后，将细胞进行洗涤，并用PBS/0.3%Triton X-100（J.T.Baker X198-07）透性处理（permeablized）15min。随后进行下述免疫细胞化学染色。用处于PBS中的5%正常驴血清（Jackson ImmunoResearch 017-000-121）的进行1小时的抗原封闭。通过在4℃下用一抗孵育过夜进行染色。对于初筛，将PDX-1抗体（R&DAF2419）用于示出β细胞，而将Ki-67抗体（BD Bioscience 556003）用于使增殖细胞可视化。不希望受理论的束缚，在先的β细胞复制筛选失败主要是因为使用细胞质标记（胰岛素）作为β细胞标识物。细胞质标记的使用使得无法将核复制准确地归于具体的细胞身份，也就是说，在密集的培养物中不能将细胞质归于邻近多个核的具体核。另外的免疫组织化学抗体包括磷酸化组蛋白3（Millipore 06-570）、胰岛素（DakoA0564）、胰高血糖素（Millipore 4031-01F）和波形蛋白（Millipore ab5733）。对于western印迹，抗体包含ADK（Abcam ab38010、ab64825）和RAN（BD Bioscience 610340）作为负载对照。
将经化合物处理的胰岛细胞进行染色后，即使用Cellomics ArrayScanVTI通过自动图像采集和分析对β细胞复制进行评价。建立采集阈值/参数，从而使复制事件基于计算机的响应与基于人的响应相一致。所使用的参数旨在鉴别（1）PDX-1+细胞和（2）PDX-1阳性区域内的ki-67阳性染色。算法为三步方法。第一步，基于预期的PDX-1染色图案（stainingpattern）通过软件预测核区域。第二步，基于所预测的核区域内的平均染色强度对PDX-1阳性细胞（所选择的目标）进行计数（注：总信号强度在质量上基本等同，但不常用）；第三步，通过测定所预测的核区域内ki-67染色的平均荧光强度，来测定PDX-1阳性细胞（所选择的目标）同时也为Ki-67阳性的数目（同样，偶尔使用总强度，具有等同的效力）。具体的阈值（荧光强度）随实验的不同而变化。一般来说，基础复制速率设定在1%左右，也就是说，直至经DMSO处理的PDX+细胞中的1%被报告为PDX-1和ki-67双阳性时，算法才发生变化。所筛选的高含量库包括激酶抑制剂库（约300个化合物）、大麻素库（80个化合物）、激素库（80个化合物）和磷酸二酯酶抑制剂库（40个化合物）。对总共约500个化合物进行了测试。随后购买命中的化合物（A10，5-碘代杀结核菌素（Calbiochem 407900）；ABT-702（B8，Sigma A2721）），并在剂量曲线和其它研究中加以确认。在筛选分析中，对于与A10对应的化合物，观测到了β细胞复制的2.3倍诱导（数据未示出）。尽管化合物D7和F3也显示了多于2标准差的荧光增高，但是这两种化合物被观察到为自发荧光（auto-fluorescing）。
实施例2：A10和B8产生的PH3诱导
使用类似于实施例1所述的实验方案，用A10（2μM）或B8（15μM）对β细胞进行处理。使用磷酸化组蛋白3抗体（Millipore 06-570）使增殖细胞可视化。如图1中所示，相对于对照的DMSO处理，A10和B8均使PH3对PDX-1的比例增加。
实施例3：A10特异性地使β细胞复制增加
使用类似于实施例1所述的实验方案，用10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM、0.078μM、0.04μM或0.019μM的A10对β细胞或小鼠皮肤成纤维细胞进行处理。如图2a中所示，Ki-67阳性β细胞的百分比以剂量依赖的方式增加。然而，如图2b中所示，当用A10处理时，Ki-67阳性的小鼠皮肤成纤维细胞的百分比不发生变化。这些结果与由Western印迹分析中所观察到的在小鼠成纤维细胞中（相对于小鼠胰岛）几乎没有或没有ADK表达相一致（数据未示出）。
实施例4：B8的剂量曲线
使用类似于实施例1所述的实验方案，用30μM、15μM、7.5μM、3.75μM、1.875μM、0.94μM、0.47μM或0.23μM的B8对β细胞进行处理。如图3中所示，当用B8处理时，PDX和Ki-67阳性的细胞的百分比以剂量依赖的方式增加。
实施例5：A10和B8处理的时间过程（Time course）
使用类似于实施例1所述的实验方案，用A10（2μM）或B8（15μM）对β细胞进行处理。在不同的时间点对Ki-67诱导（相对于DMSO对照）进行测量。在第0天加入化合物，并在第2天更换培养基，结果在图4中示出。
实施例6：血清浓度对A10处理的影响
使用类似于实施例1所述的实验方案，将β细胞用A10（2μM）在含有0.2%、2.0%或20%不同浓度血清的培养基中进行处理。如图5中所示，在经A10处理的样品中，Ki-67阳性细胞的百分比随血清浓度增加而增加。另一方面，在经DMSO处理的样品中，Ki-67阳性细胞的百分比随血清浓度增加而降低。
实施例7：葡萄糖对A10处理的影响
使用类似于实施例1所述的实验方案，将β细胞用2μM A10或DMSO在含有25mM、20mM、15mM、12.5mM、10mM、8mM、6mM、4mM、1mM或0mM葡萄糖的培养基中进行处理。如图6中所示，葡萄糖浓度对经A10或DMSO处理的样品中的β细胞复制百分比几乎没有影响。
实施例8：腺苷对β细胞复制的影响
为测试A10对β细胞复制的影响是否是因为细胞中腺苷浓度的增加，将大鼠胰岛用1000μM、330μM、110μM、37μM、12μM、4μM、1.4μM、0.46μM、0.156μM或0.05μM的腺苷进行处理。如图7中所示，腺苷对表达PDX-1和Ki-67的细胞的百分比几乎没有影响。
实施例9：腺苷受体拮抗剂对用A10引起的β细胞复制增强的影响
为测试A10的作用是否由腺苷受体所介导，在包含不同浓度腺苷受体拮抗剂茶碱（Theophylin）、CPT、咖啡因、Allox和MRS的培养基中，用5μM、1μM、0.2μM或0.04μM的A10或DMSO对β细胞进行处理。结果在图8a和8b中示出。如图8b中所示，0.2μM的腺苷拮抗剂对用A10引起的β细胞复制增长倍数几乎没有影响。
实施例10：AMPK活化
据推测，A10通过间接活化AMPK而引起β细胞复制增加。为验证该推测，用A10（2μM）和AMPK活化剂AICAR（3.3μM）对β细胞进行处理。如图9中所示，用AICAR对AMPK进行活化使得β细胞复制百分比增加。
实施例11：AMPK抑制作用对用A10引起的β细胞复制增强的影响
对于用A10引起的β细胞复制增强，测试用Cpd C引起的AMPK抑制作用对其造成的影响。如图10中所示，相比于未抑制的对照，用CpdC（10μM）引起的AMPK抑制作用使得β细胞复制降低。
实施例12：体内β细胞复制
向12周龄C57/B6雌性动物注射10μL/g的BRDU（Sigma B5002），并注射ABT-702（21mg/kg）或DMSO辅料。处理24小时后，将动物处死，将其胰腺进行固定、切片并对PDX-1和BRDU（Amaersham RPN202）进行染色。每四张切片进行一次分析，对最少2000PDX-1+/动物进行计数。结果在图12中示出。
实施例13：腺苷激酶抑制作用选择性地促进胰岛β细胞复制
胰岛分离和初筛的实验方案：按在先所述分离大鼠和小鼠的胰岛（M.Gotoh等，Transplantation，43，725-730（1987））。所有动物操作均得到了我们学院的动物管理与使用委员会的批准，按照其规定来进行。猪胰岛由VitaCyte（Indianapolis，ID）提供。将胰岛在胰岛培养基（Mediatech99-786-CV；10%FBS血清（Valley Biomedial BS3033）；8.3mM葡萄糖（Sigma G7528）；1X青霉素/链霉素（Invitrogen 15070-063）；1X Glutamax（Invitrogen 35050-079））孵育过夜（37℃，5%CO2）。次日上午，将胰岛用胰蛋白酶消化为1-3个细胞的细胞集落，重悬浮于胰岛培养基中，并向已包被有804G（大鼠膀胱癌细胞系）条件培养基的96孔板（SigmaCLS3904）的孔中点板。细胞点板密度为60k个细胞/孔，并且确认了点板时多于95%的细胞具有活力。使胰岛细胞附着48小时，更换培养基（除2%血清和5mM葡萄糖外与上文中所述一样），并用测试化合物对细胞进行处理。为了筛选，将化合物在单一情形下以1μM和10μM的浓度进行两组重复测试。在化合物处理24小时后，将细胞用新鲜的4%PFA固定。通过将细胞在在处于蒸馏水中的0.1M EDTA中加热至90℃来进行抗原修复。然后，将细胞进行洗涤，并用PBS/0.3%Triton X-100（J.T.BakerX198-07）透性处理15min。随后进行下述免疫细胞化学染色。用处于PBS中的5%正常驴血清（Jackson ImmunoResearch 017-000-121）进行1小时的抗原封闭。通过在4℃下用一抗孵育过夜进行染色。对于初筛，将PDX-1抗体（R&D AF2419；1:300）用于示出β细胞，而将ki-67抗体（BDBioscience 556003；1:300）用于使增殖细胞可视化。
使用Cellomics ArrayScan VTI通过自动图像采集和分析对β细胞复制进行评价。建立采集阈值/参数，从而使复制事件基于计算机的响应与基于人的响应相一致。所筛选的高含量库包括激酶抑制剂库（约300个化合物）、大麻素库（80个化合物）、激素库（80个化合物）和磷酸二酯酶抑制剂库（40个化合物）和部分NIH临床采集物（250个化合物）。使所有的有机化合物悬浮于DMSO中，并以1:1000的最小稀释度使用。随后，由不同供应商处购得如下化合物：5-碘代杀结核菌素（Calbiochem407900）；ABT-702（Sigma A2721；Tocris）；芒霉素（Sigma A0928）和二脱氧-7-碘-脱氮腺苷（chem-ipex 15132）。按如上所述用Exendin-4（Sigma E7114）和GLP-1（AbCam，ab50245）进行β细胞复制实验。按如上所述并改变葡萄糖浓度和培养持续时间，用葡萄糖进行β细胞复制实验。在所有的长期培养物（extended culture）中，每48小时更换一次培养基。
免疫组织化学：通过免疫组织化学标记鉴定多种细胞群：β细胞（豚鼠抗猪胰岛素；Dako，A0564）；α细胞（豚鼠抗胰高血糖素；Millipore，4031-01F）；PP细胞（兔抗胰多肽；Pierce，PAI-36141）；δ细胞（兔抗生长抑素；Dako，A0566）和成纤维细胞（鸡抗波形蛋白；Millipore，AB5733）。将具有N端特异性抗体（针对ADK的兔pAB；Abcam，ab38010-100）的腺苷激酶（ADK）用于腺苷激酶免疫荧光。通过用ADKcDNA（Invitrogen）瞬时转染Cos-7细胞（ATCC；CRL-1651），对用于免疫荧光的ADK抗体加以验证。另外的抗体包括磷酸化组蛋白3抗体（Millipore 06-570）和BRDU。
β细胞数目定量：为在培养0h、96h和144h时对β细胞的数目进行定量，在仅有辅料或在5-IT和15mM葡萄糖存在的情况下，将细胞按上文所述向96孔板中进行点板；所有孔中的最终DMSO稀释度均为1:1000。从时间0h开始，使细胞附着48h。各条件由每个板上的16个独立的孔来体现，从而对点板密度的小波动进行调节。每48小时进行培养基的更换。在合适的时间点将细胞进行固定并储存，从而同时对PDX-1进行染色。使用识别PDX-1+细胞的Cellomics ArrayScanVTI进行自动细胞计数。
BRDU试验：按上文所述将胰岛细胞点板并使之附着48h，将培养基进行更换，使之包含BRDU和DMSO或5-IT（2μM）或ABT-702（15μM）。48小时后，将细胞进行洗涤并加入常规培养基。在固定前，使培养物再另外生长48小时。通过在0.1M EDTA中于90℃下加热10min，来进行抗原修复。使用PDX-1免疫荧光（如上所述）进行染色来鉴定β细胞，使用BRDU染色试剂盒（Amersham，RPN20）来鉴定复制细胞。使用Cellomics ArrayScan VTI进行定量图像分析，对同时也为BRDU+的PDX-1+细胞的百分比进行计数。
ADK下调：具将有EmGFP的Block-iT polII miR RNAi表达系统（Invitrogen，K4938-00）用于ADK的慢病毒下调。使用Fast-Trap试剂盒（Millipore，FTLV00003）进行病毒浓缩。使用大鼠H4IIE肝癌细胞系（ATCC，CRL-1600）的稳定慢病毒转导，随后通过western印迹评价ADK水平，来对数种ADK导向的miRNA进行测试。选择如下最有效的序列用于胰岛细胞实验中：（上游：5’-TGCTGAAGAACTGGCTAATGAACGGTGTTTTGGCCACTGACTGACACCGTTCAAGCCAGTTCTT（SEQ IDNO：1）；下游：5’-CCTGAAGAACTGGCTTGAACGGTGTCAGTCAGTGGCCAAAACACCGTTCATTAGCCAGTTCTTC（SEQ ID NO：2））。阴性对照序列为：（上游：5’-TGCTGGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT（SEQ ID NO：3）；下游：5’-CCTGGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTTC（SEQ ID NO：4））。在点板48小时后开始，将已分散的大鼠胰岛细胞培养物（如上所述）在96孔板中进行转导。将已浓缩的病毒在48h的过程内用于连续感染胰岛培养物，随后在细胞固定前培养4天。将Cellomics ArrayScan VTI用于对荧光强度进行定量，并测定多个参数：病毒转导效率（DAPI+，GFP+）、ADK表达细胞的百分比（DAPI+，ADK+）、未感染β细胞（GFP-，PDX-1+，ki-67+）和已感染β细胞（GFP+，PDX-1+，ki-67+）的复制速率。使用检测长型异构体和短型异构体（long and short isoform）的C-端特异性抗体（Abgent，AP709b，1:100），通过western印迹测定ADK表达。
肝细胞的分离与增殖：使用在先所述的两步胶原酶灌注技术分离肝细胞，然后将其在补充有10%FBS、hEGF（40ng/mL；R&D Systems236-EG-200）和mHGF（20ng/mL；R&D Systems 2207-HG-025）的William’sE培养基中进行培养（P.O.Seglen，Methods in cell biology，13，29-83（1976））。如在先所述，将培养物用化合物处理过夜，然后进行固定和染色。用DAPI评价总细胞数，复制细胞为ki-67+，将Cellomics ArrayScanVTI用于图像采集和分析。
体内复制的定量：将12周龄的C57/B6雌性动物用BRDU（SigmaB5002；10μL/g）以及ABT-702（21mg/kg）或DMSO辅料进行注射。处理24小时后，将所述动物处死，收集相关器官。以每处理组最少4只动物进行全部实验。将每四个12μM切片用于分析，对每只动物每个器官的最少2,000个β细胞、外分泌细胞和肝细胞进行计数。通过手动图片采集和细胞计数进行分析。通过具有类似结果的PDX-1染色或胰岛素染色对β细胞进行鉴别。通过对所有位于胰岛结构外部的细胞核进行计数来估计外分泌细胞。这些细胞中的少数不是外分泌细胞。肝细胞被鉴别为DAPI+白蛋白+细胞（Bethyl Laboratories，A90-234A）。分裂细胞是BRDU+（Amaersham RPN202）。
统计：数据以多个同时进行的重复实验（所示每个数据点最少为4个孔）的平均值表示。所有示出的实验结果均重复多于两次。除非另有说明，误差棒示出标准差。使用双尾t检验对结果进行比较。使用非线性回归并限制最高复制速率来计算EC50。
结果
高通量原代β细胞复制分析的发展和实施：为鉴别使β细胞复制增加的化合物，本发明提供了使用新鲜分离的大鼠胰岛细胞的筛选平台（图21）。尽管原代细胞的使用限制了β细胞供应，并可能预计引入行为差异（behavioral variability），但是这一策略最大程度地保留了与β细胞有丝分裂行为有关的体内代谢特征（Y.Zimmer等，FEBS letters，457，65-70（1999））。这些已分散的培养物包含~75%的β细胞（PDX-1+）、~18%的α细胞（胰高血糖素+）、~3%的成纤维细胞（波形蛋白+）和~5%的其它细胞类型。对已分散的大鼠胰岛细胞对于β细胞转录因子PDX-1、α细胞激素胰高血糖素、成纤维细胞标记波形蛋白和DNA以组合的方式进行免疫荧光染色（数据未示出）。通过自动图像采集和分析（n=来自代表性的大鼠胰岛制备品的80个图像）获得百分比。所有值的标准差均小于10%。PDX-1阳性细胞表达出胰岛素或生长抑素（数据未示出）。在这些原代胰岛培养物中的多种细胞群的分析使得人们得以对复制分析中的β细胞特异性进行检查。
将分离后的胰岛在组织培养孵育箱中过夜恢复，然后在第二天进行分散和点板。为使细胞附着，将胰岛细胞孵育48小时，然后加入新鲜培养基，再用化合物处理。化合物处理24小时后，将细胞进行固定、染色和分析。PDX-1是由β细胞和δ细胞表达的转录因子（P.Serup等，TheBiochemical journal，310（Pt 3），997-1003（1995））。在PDX-1群中，>90%的细胞是胰岛素+β细胞（数据未示出）（J.Suckale等，Front Biosci 13，7156-7171（2008））。使用核PDX-1染色作为原代β细胞标记，这是由于胰岛细胞在致密不规则的集落中生长（引起与多个细胞核模糊相关的细胞质染色、如胰岛素）。作为这一模糊相关的结果，来自快速复制细胞（如成纤维细胞）的ki-67+细胞核存在不正确地归于胰岛素+细胞的可能。基础的体外β细胞复制速率显示出中等程度的实验间差异（0.4-3.5%），并且一般高于类似年龄动物的体内β细胞复制速率（0.8±0.2%），这由共表达ki-67的PDX-1+细胞的百分比来确定。
ADK-Is促进β细胞复制：对来自仔细挑选的、细胞通透生物活性化合物库的约750种化合物筛选其使β细胞复制增加的能力。通过使用PDX-1免疫染色鉴别β细胞，使用ki-67免疫染色鉴别分裂细胞，通过PDX-1和ki-67的共同定位可容易地区分复制的PDX-1+细胞与分裂的PDX-1-细胞（数据未示出）。鉴别出两种化合物，二者均为充分表现出特征的腺苷激酶（ADK）抑制剂（ADK-Is）。24小时后，5-碘代杀结核菌素（5-IT；CAS 24386-93-4）和ABT-702（CAS 214697-26-4）使分裂的β细胞的百分比高于背景2-3倍，并且显著地影响β细胞数（见下文）。独立于可变的基准β细胞复制速率，ADK-Is始终引起β细胞复制速率2-3倍的增加。在所示出的实验中，命中的化合物使β细胞复制速率增加~2.5%到~6.5%。为确认我们使用PDX-1鉴别β细胞的结果，我们使用PDX-1和胰岛素共染色进行类似实验，来鉴别β细胞（图17a）。
接下来，测试了另外的ADK-Is促进β细胞复制的能力。两种另外的ADK-Is显示出与初步选中的化合物类似的功效（图17b），并在图13a中示出（E.A.Kowaluk和M.F.Javis，Expert opinion on investigationaldrugs 9，551-564（2000））。还测试了ABT-702对小鼠和猪胰岛的影响。建立来自这些物种的已分散胰岛细胞的健康培养物，在先用于大鼠胰岛细胞培养物的相同抗体有效地鉴别出β细胞（PDX-1）和复制细胞（ki-67）（数据未示出）。
对来自上述两种物种的胰岛细胞进行的化合物处理引起了类似于对大鼠胰岛细胞的所观察到的、β细胞复制的诱导（虽然效力上稍有不同）（图13b和图13c）。这两种化合物均显示出功效随着剂量增加而增加。尽管5-IT比ABT-702更强效，但这两种化合物均具有最大为~2-3倍的诱导作用。一个值得注意的观察结果是在浓度高于~20μM时，ABT-702的分析受到背景荧光的限制。
通过对表达有丝分裂期标记物（作为对化合物处理的响应）磷酸化组蛋白-H3（PH3）的β细胞的百分比进行评价，来确认这些化合物的复制效应（数据未示出）。使用PH3，在β细胞复制方面观察到了类似的2-3倍的增加（图18a）。此外，使用BRDU标记S-期细胞进行脉冲追踪实验。在BRDU和辅料或化合物存在的情况下将胰岛细胞培养两天，随后为两天的洗涤期。用ADK-Is处理的胰岛培养物在并入BRDU细胞的β细胞的百分比方面显示出2倍的增加（图18b）。ADK-Is对宽的细胞周期标记（ki-67）和窄的有丝分裂期标记（PH3）引起类似的诱导作用以及使BRDU并入增加的能力，都表明了这些化合物增加了有丝分裂活性。
为测试ADK-Is是否可使β细胞的绝对数目增加，在5-IT或DMSO存在的情况下将胰岛细胞培养数天，然后对β细胞总数进行计数，并与时间为0时的β细胞数进行比较。96小时后，β细胞数仅显现出很小的差别，但是在144小时后β细胞数有了相当大的增加（图13d）。在第6天，相比于对照孔中的增加20%，经5-IT处理的孔中的β细胞数增加了40%。由ADK-I处理引起的增加与β细胞复制增加2倍相一致，表明了在我们的培养物中，基础复制速率从~3%/天变化到~6%/天。
由β细胞表达ADK以及ADK对β细胞复制进行负调节：ADK是酶的糖激酶组的成员，所述糖激酶组由在细胞代谢中扮演重要角色的三个代谢家族（己糖激酶、核糖激酶和半乳糖激酶）组成（P.Bork，C.Sander和A.Valencia，Protein Sci，2，31-40（1993））。ADK是通过其使用ATP作为磷酸供体催化腺苷磷酸化为AMP的能力，对胞内和胞外的腺苷水平进行调节的核糖激酶（T.A.Krenitsky，R.L.Miller&J.A.Fyfe，Biochemical pharmacology，23，70-72（1974）以及J.Park&R.S.Gupta，Cell Mol Life Sci，65，2875-2896（2008））。尽管这一酶广泛表达，但是其在肝和胰腺中高度表达（M.Andres&I.H.Fox，The Journal ofbiological chemistry，254，11388-11393（1979））。ADK具有两种已知形式：长型细胞核异构体和短型细胞质异构体（X.A.Cui等，Biochemical andbiophysical research communications，388，46-50（2009））。所述细胞质形式参与嘌呤补救途径（purine salvage pathway），而长型形式是甲基转移酶反应的全局性调节剂（通过S-腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的腺苷反馈调节）（N.M.Kredich&D.V.Martin,Jr，Cell，12，931-938（1977）以及Boison,L等，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America，99，6985-6990（2002））。因此，ADK的抑制具有对增加胞外腺苷和抑制甲基转移酶反应的双重作用。
ADK免疫染色揭示了β细胞中ADK的细胞核表达（数据未示出）。相反，在成纤维细胞和α细胞中，ADK染色在细胞质而非细胞核中进行（数据未示出）。尽管δ细胞（生长抑制素+细胞）中的ADK定位是可变的，但ADK通常存在于这些细胞的细胞核中（数据未示出）。为确保染色是特异性的，通过瞬时转染具有全长ADK cDNA的COS细胞对所使用的抗体进行验证，其显示出强烈的核表达模式并确认了我们的胰岛细胞染色的特异性（数据未示出）。核染色存在于β细胞而非α细胞中表明，长型形式的ADK在β细胞而非α细胞中表达。
接下来测试了β细胞中的ADK是否充当了复制的负调节剂。我们使用慢病毒感染，将非特异抑制性RNA（siRNA）或被靶向的RNA以及GFP的表达导向至ADK。通过western印迹和免疫染色来确认ADK导向的siRNA下调ADK蛋白水平的能力（图14a和图19）。如同由GFP表达所测定，通过使约一半的胰岛细胞培养物感染，可分别对同一孔中的感染与未感染细胞的β细胞复制速率进行分析。据推断，如果ADK充当了β细胞复制的细胞自主调节剂，则接受了阴性对照质粒的β细胞和保持未感染的β细胞都将具有相同的复制速率，而用ADK靶向的siRNA病毒感染的β细胞将具有增加的复制速率。事实上，所得结果证实了这一预期（图14b）。未感染的β细胞和对照的已感染的β细胞都具有~2%的基础增殖速率。相反，接受ADK导向siRNA的β细胞在其复制速率方面显示出2.5倍的增加。这一结果说明，ADK是β细胞复制的细胞自主负调节剂，并且可作为ADK-Is的分子靶标。
ADK-Is和葡萄糖或GLP-1R激动剂对β细胞复制具有加合效应：高血糖被认为是β细胞增殖的主要生理驱动，尽管相对而言几乎没有体外证据来支持这一广为接受的原理（S.Bonner-Weir等，Diabetes，38，49-53（1989）以及L.C.Alonso等，Diabetes，56，1792-1801（2007））。利用本文所述的β细胞复制平台，证明了葡萄糖对β细胞增殖具有浓度依赖的作用（图15a）。然而，应答动力学表现出不同于ADK-Is。ADK-Is在24小时内使ki-67染色增加，而直到晚些时候（48h）也未观察到葡萄糖的作用。不希望受理论的束缚，在所有的测试葡萄糖浓度下，5-IT的加合效应支持了葡萄糖与ADK-Is的不同作用机理（图15a）。高葡萄糖与5-IT的组合引起高于基线速率5倍的复制速率诱导作用。这一实验的结果说明，向高血糖环境中加入ADK-Is可使β细胞生长显著增加。
GLP-1R激动剂由于其促进胰岛素释放、改进血糖控制和使β细胞复制增加的能力而受到关注（J.H.Nielsen等，Diabetes，50Suppl 1，S25-29（2001）；D.J.Drucker&M.A.Nauck，Lancet 368，1696-1705（2006））。鉴于其增强了β细胞对葡萄糖的应答，这些激动剂也可增强ADK-Is对β细胞复制的影响。因此，用GLP-1R激动剂（高血糖素样肽-1（GLP-1）或Extenatide-4（Ex-4））在有或没有5-IT的情况下，对大鼠胰岛培养物进行孵育。GLP-1R激动剂与5-IT（~2.5倍）相比仅仅使β细胞复制适度增加（~1.5倍），而向GLP-1R激动剂中加入5-IT产生了加合的复制效应（~4倍）（图15b）。这些结果与以非GLP-1依赖的方式起作用的ADK-Is相一致，显示出组合调节这两条途径以使β细胞复制增加的潜力。
ADK-Is选择性地促进β细胞复制：对胰岛培养物中的多种细胞的复制速率进行评价：PP细胞、α细胞、δ细胞和成纤维细胞（图16a）。δ细胞也可对ADK-Is应答而显示出复制增加，这是由于类似于β细胞，δ细胞表达核ADK，并享有对葡萄糖进行响应而分泌激素的生理性质（M.Braun等，Diabetologia，52，1566-1578（2009））。事实上，作为对ADK-I处理的应答，δ细胞确实在复制方面显示出显著增加，而成纤维细胞、α细胞和PP细胞则不会（图16a）。由于PP细胞在本文所用的培养条件下很少分裂，所以未示出PP细胞的复制速率。
除了β细胞，肝细胞也表达高水平的ADK，因此可预计作为对ADK-Is的应答而发生增殖（Boison,L.等，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，99，6985-6990（2002））。为测试这一可能性，将小鼠肝细胞进行分离，放置于培养物中，并用ABT-702（肝细胞无法很好地耐受5-IT）进行处理。作为对药物处理的应答，这些细胞的复制速率未增加（图16b）。因此，ADK-Is的复制作用是选择性的。
ADK-Is促进体内β细胞复制：受体外结果的启发，对ABT-702选择性地促进体内β细胞复制的能力进行测试。由于ABT-702相比于5-IT具有的更长的半衰期，因而选择ABT-702（G.Z.Zheng等，Bioorganic&medicinal chemistry letters 11，2071-2074（2001））。事实上，ABT-702的单次腹膜内注射使得被β细胞并入的BRDU增加2倍（图16c）。该结果在独立的动物组中得到确认，其中由胰岛素而非PDX-1的存在而对β细胞加以（图20）。显著地，用ABT-702进行处理并未使外分泌细胞的复制速率增加，同时再次突出了ADK-Is的选择性（图16d和图20）。此外，还对同一组动物中的ABT-702处理应答，而被肝细胞并入的BRDU进行检测（图16e）。作为对药物处理的应答，肝细胞并未示出细胞分裂速率的增加。因此，ABT-702选择性地促进体外和体内的β细胞复制。
讨论
DM2是需要改进治疗的全球性流行病。虽然通过饮食和行为实践的改进进行的疾病预防仍然极为重要，但这些策略并没有获得广泛成功。历史上，DM2疗法曾尝试通过降低外周抵抗来减少胰岛素需求（双胍、噻唑烷二酮）或增强胰岛素分泌（磺酰脲）。然而，DM2患者表现出受限的适合β细胞生长的能力，而这些途径并未解决这一缺陷。因此，大多数糖尿病患者显示出进行性的β细胞功能衰竭。因此，本发明提供了鉴别促进β细胞分裂增加的药理平台。虽然本研究集中于单类型的药剂（腺苷激酶抑制剂），本文所述的筛选试验可被用于发现另外的化合物。
施用生长促进剂以增加β细胞团块主要受限于其特异性。已经鉴定了促进β细胞复制的广谱因子，包括细胞周期调节因子（如cyclin2）、信号分子（如AKT2）、生长因子和激素（包括肝细胞生长因子、生长激素和促乳素及数种小分子）（S.Georgia和A.Bhushan，The Journal of clinicalinvestigation，114，963-968（2004）；S.Fatrai等，Diabetes 55，318-325（2006）；J.H.Nielsen等，Diabetes 50Suppl 1，S25-29（2001）；R.C.Vasavada等，The international journal of biochemistry&cell biology 38，931-950（2006）；以及W.Wang等，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 106，1427-1432（2009））。然而，这些文献中的大部分显示出限制其使用或未能始终增加β细胞复制的多向性效应（pleitropic effects）。本发明提供的ADK-Is作为能够促进体外和体内β细胞复制的新型药剂。最重要的是，这些化合物对β细胞而非α细胞、肝细胞、外分泌细胞或成纤维细胞具有选择性增殖作用。此外，本文给出的结果显示出ADK-Is具有使高血糖和GLP-1R激动剂的β细胞复制效应得以增强的诱人性质。
对作为β细胞复制调节剂的ADK的鉴别是出乎意料的发现，该发现突出了使用化学制品筛选发现新生物学活性的价值。在几乎所有用腺苷或ADK-Is处理的其它细胞类型中，观察到了生长抑制作用。仅举几例，在如下细胞或细胞系中ADK-Is的作用是抑制复制而非刺激复制：成心肌纤维细胞、主动脉平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、软骨细胞、星形细胞、淋巴细胞、结肠癌细胞系、乳腺癌细胞系、胃癌细胞系、肝癌细胞系和甲状腺细胞系。参见例如：R.K.Dubey等，Circulation 96，2656-2666（1997）；R.K.Dubey等，Hypertension 31，516-521（1998）；R.K.Dubey等，Hypertension 46，628-634（2005）；Mistry,M.G.Chambers&R.M.Mason，Osteoarthritis and cartilage/OARS，Osteoarthritis Research Society14，486-495（2006）；J.Faller等，Metabolism:clinical and experimental 33，369-374（1984）；M.Saito等，Cancer letters 290，211-215；Y.Yasuda等，Journal of gastroenterology 44，56-65（2009）；M.Hashemi等，Cellproliferation 38，269-285（2005）；K.Sai等，Neurotoxicology 27，458-467（2006）；M.Saitoh等，Biochemical pharmacology 67，2005-2011（2004）；L.T.Wen&A.F.Knowles，British journal of pharmacology 140，1009-1018（2003）；L.F.Wu等，Acta pharmacologica Sinica 27，477-484（2006）；以及M.Vainio，P.Saarinen&K.Tornquist，Journal of cellular physiology171，336-342（1997）。这些在先结果与我们的观察相一致，作为对ADK-Is的应答，肝细胞、成纤维细胞、外分泌细胞和α细胞没有增殖。
不希望受理论的束缚，ADK-Is对PDX-1+细胞不寻常的生长促进作用不可能通过胞外腺苷信号进行介导，有以下三个原因。第一，作为对ADK下调的应答，在β细胞增殖方面观察到细胞自主增加。如果由胞外腺苷介导这一作用，则将预计产生旁分泌效应（paracrine effect）。第二，在分析中，腺苷或腺苷受体拮抗剂的加入对于β细胞增殖无影响（数据未示出）。第三，β细胞主要表达ADK的核亚型（nuclear isoform），被认为主要调节甲基转移活性。不希望受理论的束缚，ADK活性的抑制预防了用于阻止β细胞复制的甲基化反应。例如，menin是β细胞复制的重要的负调节因子，作为组蛋白甲基化转移酶复合体的部分而起作用（S.K.Karnik等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 102，14659-14664（2005））。因此，可通过ADK抑制作用来抑制menin的活性。
ADK-Is表现出可以被动物很好地耐受，并且作为用于多种病情（包括癫痫、脑缺血、疼痛和炎症）的治疗剂处于开发阶段（E.A.Kowaluk&M.F.Jarvis，Expert opinion on investigational drugs 9，551-564（2000））。本发明提供了在先未认识到的对β细胞复制具有选择性活性的β细胞复制调节剂。因此，可将ADK作为治疗和预防糖尿病的治疗靶标。此外，β细胞的离体扩增使得能够克服用于治疗1型糖尿病的尸体胰岛受限的有效性。
参考文献
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为了所有目的，在申请文件与实施例中标明的所有专利与其他出版物以引用的方式明确并入本文。这些出版物仅仅由于它们的公开早于本申请的申请日而提供。在这一方面不应当视作承认本发明人没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请人可得的信息，并且不构成关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的任何承认。

Claims (50)

1.一种使胰腺细胞群中的β细胞复制得以增加的方法，所述方法包括：用腺苷激酶（ADK）的抑制剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH）的抑制剂或AMP活化蛋白激酶（AMPK）的活化剂与胰腺细胞群进行接触。
2.权利要求1中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制剂为式（I）及其药学上可以接受的盐和酰胺：
Figure FDA00002034784200011
式（I）
其中：
R1为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、OR5、SR5、N(R6)2、(CH2)mR7，或者R1和R2连同它们所连接的原子形成可被任选取代的5-8元杂环；
R2和R3各自独立地为H、OR5、SR5、N(R5)2，或者R2和R3连同它们所连接的原子形成可被任选取代的5-8元杂环；
R4为H、卤素、CN、N2、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R5各自独立地为H、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R5连同它们所连接的氮原子一起形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
R6为R5、OR5、SR5、N(R5)2、N2、CN、卤素或
R7各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
X为O、S、NH或CH2；
Y和Z各自独立地为N或CR8；
R8各自独立地为H、卤素、CN、C(O)R7、C(O)OR7、C(O)N(R7)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Z1各自独立地为O或S；
Z2各自独立地为OM、SM、OR5、SR5、N(R5)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
M为碱金属阳离子；
m为1、2、3或4；
n为0、1或2。
3.权利要求1中所述的方法，其中，所述腺苷激酶抑制剂为式（Ⅱ）及其药学上可以接受的盐和酰胺：
Figure FDA00002034784200022
式（II）
其中：
R9各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R9连同它们所连接的氮原子一起形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
R10、R11和R12各自独立地为H、OR14、N(R14)2、N2、NO2、CN、卤素、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基；
R13各自独立地为卤素、CN、NH2、或任选取代的C1-C6烷基；
R14为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、任选取代的杂芳基烷基，或者两个R14连同它们所连接的氮原子一起形成5-7元环，所述5-7元环任选包含1-3个选自N、O或S的另外的杂原子；
X2为N或CR15；
R15为NHR16、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R16为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Y2为N或CH；
Q为0、1、2或3。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述ADK抑制剂的IC50为小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，相对于未被抑制的对照，所述ADK的活性被抑制或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%（例如完全丧失活性）。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述ADK抑制剂选自于由下列化合物所组成的组：芒霉素、5′-脱氧腺苷、5′-氨基腺苷、5′-脱氧-5-碘代杀结核菌素、5-碘代杀结核菌素（A10）、7-脱氮-7-碘-2′,3′-二脱氧腺苷、去甲芒霉素、去甲杀结核菌素、A-134974、丰加霉素、GP-515（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-3-溴-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、GP-3269（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-(4-氟苯基氨基)-5-苯基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-四氢-5-甲基呋喃-3,4-二醇）、GP-683（(2R,3S,4R,5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3,4-二醇）、GP-947（(2S,3S,4R,5R)-四氢-2-甲基-5-(5-苯基-4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)呋喃-3,4-二醇）、ABT-702（5-(3-溴苯基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺，B8）、化合物1（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、化合物2（(2R,3R,4S,5R)-2-(4-氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-(氨基甲基)-四氢呋喃-3,4-二醇）、化合物3（(1S,2R,3S,5R)-3-氨基-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)环戊烷-1,2-二醇）、化合物4（(1S,2R,3S,5R)-3-氨基-5-(7-氨基-3H-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)环戊烷-1,2-二醇）、化合物5（(1S,2R,3S,4R)-4-(4-氨基-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)环戊烷-1,2,3-三醇）、化合物6（7-(4-(二甲基氨基)苯基)蝶啶-4-胺）、化合物7（5-(3-溴苯基)-7-(4-(二甲基氨基)苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物8（5-(2-溴苄基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物9（5-环己基-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物10（5-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物11（5-(1-(2-溴苯基)乙基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物12（5-(2-甲基戊-4-烯-2-基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4-胺）、化合物13（N5-((1H-吲哚-3-基)甲基)-7-(6-吗啉代吡啶-3-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,5-二胺）、以及上述物质的组合。
7.权利要求1中所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂为式（Ⅲ）及其药学上可接受的盐和酰胺：
Figure FDA00002034784200051
式（Ⅲ）
其中：
R17为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、OR22、SR22、N(R22)2、(CH2)mR23，或者R17与R18连同它们所连接的原子共同形成可任选取代的5-8元杂环；
R18和R19各自独立地为H、OR22、SR22、N(R22)2，或者R18与R19连同它们所连接的原子共同形成可任选取代的5-8元杂环；
R20和R21各自独立地为卤素、CN、N2、OR22、SR22、N(R22)2、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R22各自独立地为H、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
R23为R22、OR22、SR22、N(R22)2、N2、CN、卤素或
Figure FDA00002034784200052
R24各自独立地为H、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
X为O、S、NH或CH2；
Y和Z各自独立地为N或CR25；
R25各自独立地为H、卤素、CN、C(O)R24、C(O)OR24、C(O)N(R24)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
Z1各自独立地为O或S；
Z2各自独立地为H、OM、SM、OR22、SR22、N(R22)2、任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基、任选取代的C2-C6炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、任选取代的环基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基烷基、或任选取代的杂芳基烷基；
M为碱金属阳离子；
m为1、2、3或4；
n为0、1或2。
8.权利要求1或7中所述的方法，其中，相对于未被活化的对照，所述AMP活化激酶的活性增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍以上。
9.权利要求1、7和8中任一项所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂的EC50小于或等于500nM、250nM、100nM、50nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
10.权利要求1和7-9中任一项所述的方法，其中，所述AMPK的活化剂是5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷（AICAR）。
11.权利要求1中所述的方法，其中，所述SAHH的抑制剂的IC50小于或等于500nM、250nM、200nM、100nM、75nM、50nM、25nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM。
12.权利要求1或11中所述的方法，其中，相对于未被抑制的对照，所述SAHH的活性被抑制或降低至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%（例如完全丧失活性）。
13.权利要求1、11和12中任一项所述的方法，其中，所述SAHH的抑制剂选自于由下列化合物所组成的组：9(S)-(2,3-二羟基丙基)腺嘌呤[(S)-DHPA]；D-香菇嘌呤；(R,S)-3-腺嘌呤-9-基-2-羟基丙酸[(R,S)-AHPA]；腺苷（Ado）二醛；3-脱氮腺苷（c3-Ado）；芒霉素（Ari）；瓶菌素A（NPA或NpcA）；二羟基环戊烯基腺嘌呤（DHCeA）；二羟基环戊烯基-3-脱氮腺嘌呤（c3-DHCeA）；二羟基环戊烷基腺嘌呤（DHCaA）；二羟基环戊烷基-3-脱氮腺嘌呤（c3-DHCaA）；3-脱氮瓶菌素A（c3-NpcA）；3-脱氮芒霉素（c3Ari）；碳环-3-脱氮腺苷（C-c3Ado）；6′-C甲基瓶菌素A；2′-脱氧腺苷；杀结核菌素；利巴韦林；pyraazofurin；2′-脱氧-2′-氯腺苷；异戊烯基腺苷；甲硫基腺苷（MTA）；9-β-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤（Ara-A，阿糖腺苷）；2′-脱氧腺苷；N-甲基芒霉素、8-氮杂芒霉素和3-脱氮芒霉素，以及它们的二醛和二醇衍生物；(±)-5-去甲芒霉素及其2,6-二氨基类似物；2′-脱氧芒霉素；3′-脱氧芒霉素；3′-氨基-3′-脱氧芒霉素；3′-氨基-3′-脱氧阿拉伯呋喃糖基-芒霉素；6′-羟基芒霉素；6′-巯基芒霉素；8′-溴芒霉素；8-羟基芒霉素、芒霉素-3′-环磷酸酯、芒霉素-6′-环磷酸酯；2-氟-S-腺苷同型半胱氨酸（2-FSAH）；S-腺苷-L-同型半胱氨酸亚砜；S-腺苷-L-同型半胱氨酸砜；S-芒霉素-L-同型半胱氨酸；5′-S-(3-羰基-4-硝基苯基)硫代腺苷；5′-S-(甲基)-5′-S-(丁基)硫代腺苷；以及上述物质的任意组合。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞来自受试者，其中所述受试者需要额外的β细胞。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞来自受试者，其中所述受试者不需要额外的β细胞。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
18.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述受试者是小鼠。
19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞是原代胰腺细胞。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述胰腺细胞由去分化细胞衍生。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触在体外进行。
22.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触离体进行。
23.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中，所述接触在体内进行。
24.权利要求23所述的方法，其中，所述体内接触在哺乳动物体内进行。
25.权利要求24中所述的方法，其中，所述体内接触在小鼠体内进行。
26.权利要求24中所述的方法，其中，所述体内接触在人类体内进行。
27.权利要求23中所述的方法，其中，所述体内接触在受试者内进行，所述受试者需要额外的β细胞。
28.权利要求27中所述的方法，其中，所述受试者患有1型糖尿病。
29.权利要求27中所述的方法，其中，所述受试者患有2型糖尿病。
30.权利要求27中所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
31.权利要求27-30中任一项所述的方法，其中，所述受试者是人类。
32.权利要求1-31中任一项所述的方法，其中，相对于对照，β细胞复制增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍以上。
33.一种用于对增加胰腺细胞群中的β细胞复制的化合物进行筛选的高通量分析方法，所述分析方法包括如下步骤：
（a）用测试化合物与胰腺细胞群或胰腺细胞制剂进行接触，其中所述胰腺细胞是原代胰腺细胞；
（b）对β细胞的复制或生长进行评价；以及
（c）选择使β细胞的复制或生长得以增加或增强的化合物。
34.权利要求33中所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞在细胞培养容器中进行培养，所述容器的表面包被有来自大鼠膀胱癌细胞系804G的条件培养基。
35.权利要求33-34中任一项所述的分析方法，其中，对β细胞复制进行评价的步骤包括检测β细胞标记和细胞复制标记。
36.权利要求35中所述的分析方法，其中，所述细胞复制标记是Ki-67或PH3。
37.权利要求35-36中任一项所述的分析方法，其中，所述β细胞标记选自于由下列标记所组成的组：PDX-1、胰岛素、c-肽、胰淀素、E-钙粘着蛋白、Hnf3β、PCI/3、Beta2、Nkx2.2、Nkx6.1、GLUT2、PC2、ZnT-8、MAFA、MAFB、以及上述标记的任意组合。
38.权利要求35-37中任一项所述的分析方法，其中，所述β细胞标记为PDX-1。
39.权利要求35-38中任一项所述的分析方法，其中，所述β细胞标记不是胰岛素。
40.权利要求33-39中任一项所述的分析方法，其中，所述测试化合物的浓度范围是0.1nM到1000nM。
41.权利要求33-40中任一项所述的分析方法，其中，所述分析方法在约15℃到约55℃的温度范围下进行。
42.权利要求33-41中任一项所述的分析方法，其中所述测试化合物与所述胰腺细胞接触至少1个小时。
43.权利要求30-42中任一项所述的分析方法，其中，相对于未被处理的对照，所述测试化合物使β细胞的复制或生长增加至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍以上。
44.权利要求33-43中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞不是胰腺细胞系。
45.权利要求33-44中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞群是胰岛或其片段。
46.权利要求33-45中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞是原代胰腺β细胞。
47.权利要求33-46中任一项所述的分析方法，其中，在与所述测试化合物接触前，将所述胰腺细胞附着到所述细胞培养容器表面约12-48小时。
48.权利要求33-47中任一项所述的分析方法，其中，所述胰腺细胞由去分化细胞衍生。
49.权利要求33-48中任一项所述的分析方法，其中，所述去分化细胞是诱导的多能干细胞。
50.权利要求33-49中任一项所述的分析方法，其中，所述分析方法包括如下步骤：
（a）将胰岛用胰蛋白酶消化成1-3个细胞的细胞集落；
（b）使细胞过夜恢复；
（c）将从步骤（b）得到的细胞向96孔板的孔中点板，其中将所述孔用804G条件培养基包被，细胞点板密度为60k个细胞/孔；
（d）将细胞附着至所述孔的表面48小时；
（e）使测试化合物与所述β细胞接触24小时；
（f）用PDX-1抗体与Ki-67和/或PH3抗体对细胞进行染色；
（g）对β细胞的复制进行评价；以及
（h）选择使β细胞复制得以增加或增强的化合物。
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