CN103193781B - 一种sahn酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法 - Google Patents

一种sahn酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高分子合成技术领域，具体涉及一种SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法，通过有机合成的方法有针对性地获得大肠埃希氏菌SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物，开发新型抗感染药物先导化合物。

Description

一种SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法
技术领域
本发明涉及高分子合成技术领域，具体涉及一种SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法，通过有机合成的方法有针对性地获得大肠埃希氏菌SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物，开发新型抗感染药物。
背景技术
在感染病领域，耐药细菌的感染是目前全球关注的重要问题之一。2011年6月，德国暴发肠出血性大肠埃希氏菌感染，后证实大肠埃希氏菌血清组O104:H4为病原体，该疫情在欧洲至少14个国家蔓延，感染患者超过4000例，确认死亡52例，470例出现肾功能衰竭。研究发现，该菌株携带多种常用抗生素的耐药基因，耐药基因表达产物可对抗包括抑制细菌蛋白质合成的氨基糖苷类（与细菌细胞的核糖体30S亚基结合）、大环内酯类（与细菌细胞的核糖体50S亚基结合）等抗生素，导致抗生素治疗无效。2010年9月，《Lancet》杂志一篇文献报道发现带有NDM-1基因的大肠埃希氏菌、克雷伯氏肺炎杆菌等，携带该基因的病原菌对绝大多数常用抗生素耐药，媒体称之为“超级细菌”。研究发现，该类细菌细胞内存在β-内酰胺酶基因，基因表达产物能水解内酰胺类抗菌药物，使其对广谱抗生素具有耐药性。针对耐药细菌，目前所能采用的相应策略除合理使用抗生素，以降低致病菌的耐药变异速度外，探讨新的抑菌生化途径，研发新型抗菌药物用于对抗泛耐药菌仍是目前采用的有效手段。
大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)虽然被认为是人和温血动物肠道内正常菌群成员之一，但也是临床感染的重要条件致病菌。特殊血清型的致病性大肠埃希氏菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可危及生命。肠出血性大肠埃希氏菌O157:H7是导致1996年日本食物中毒暴发的罪魁祸首，它是出血性大肠埃希氏菌中的致病性血清型，主要侵犯小肠远端和结肠。2012年8月，日本卫生部门报道，一批污染大肠埃希氏菌的泡菜产品致7人死亡、104人身体不适。2012年10月16日，英国北爱尔兰公共卫生局发布公告，北爱首府贝尔法斯特出现大肠埃希氏菌疫情，确认和疑似的总病例数已达170人。多起大肠埃希氏菌引发的严重疫情使E.coli成为目前临床抗感染治疗关注的焦点之一。另外，科学家现在越来越怀疑，原来被认为无害的人体肠道内寄生的大肠埃希氏菌菌群可能是饮食与癌症等疾病之间的关键联系，2012年《科学》杂志发表的一项研究发现，炎性肠病实验鼠体内高于常规标准比例的大肠埃希氏菌与结肠癌的发生有关。因此，原本在临床感染方面被忽视和边缘化的大肠埃希氏菌又引起了越来越多研究者的关注。
大肠埃希氏菌的致病力往往体现在其较强的耐药性。随着抗菌药物的广泛应用，耐药菌株往往同时携带氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素、磺胺类等几种抗菌药物耐药基因，可同时存在多种耐药机制。
通过甲基化修饰改变抗菌药物靶点的结构是致病菌重要的耐药机制之一，病原菌通用甲基供体SAM受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocystein，SAH），SAH被发现对胞内蛋白质和核酸的甲基化过程具有普遍的反馈抑制作用，是转甲基化反应的有效竞争性抑制剂。在哺乳动物细胞内，SAH通过SAH水解酶（SAHhydrolase，SAHH，EC3.3.1.1）催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸，而在大多数病原微生物的细胞内，SAH的代谢则采用完全不同的方式——通过S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocysteinnucleosidase，SAHN，EC3.2.2.9）催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH进一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH，EC4.4.1.21)的作用下生成高半胱氨酸和4,5二羟-2,3-乙酰基丙酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）。高半胱氨酸最后通过几种甲硫氨酸合成酶（MetH、MetE）重新生成SAM的前体——甲硫氨酸，或者经过多步酶催化生成半胱氨酸；DPD则通过自发环化生成甲基四羟呋喃（或对应的硼酸二酯），该产物是细菌群感效应（又称为细菌密度感应效应或群体效应，Quorum-sensing，QS）重要的信号分子——Autoinducer-2（AI-2），被称为通用QS信号分子，它的主要功能是调节病原菌毒力因子的表达和菌膜的形成，对病原菌和宿主的相互作用具有显著的影响。
作为病原微生物的原核生物和作为宿主的真核生物在SAH的代谢机制上存在显著的差异，真核生物通过SAHH酶蛋白水解一步反应生成高半胱氨酸，而在大多数的原核生物细胞内则不表达SAHH蛋白，SAH是通过SAHN和SRHH两步酶催化反应才生成高半胱氨酸。正是由于病原微生物和宿主在S-腺苷高半胱氨酸代谢节点上的显著差异，使S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）成为抗感染药物潜在的新靶点。
发明内容
本发明的目的就是针对上述病原微生物和宿主在SAH的代谢机制上存在显著的差异而提供一种SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物及其合成方法。
本发明的一种技术方案为：该化合物的母核结构为其中，R’是苄基（Bn），对甲基苄基（p-CH3Bn），3,5二甲基苄基（3,5-（CH3）2Bn），对乙基苄基（p-C2H5Bn），对氟苄基（p-FBn）中的一种。
该化合物合成步骤包括：
步骤1：将二烯丙基胺滴加到二碳酸二叔丁酯的甲醇溶液中，保持温度在0°C以下，搅拌0.5h，得N-叔丁氧羰基二烯丙基胺；反应液无需分离，加入二氯甲烷，搅拌下加入Grubbs催化剂，逐渐升温至室温，反应1h，滤除催化剂，旋蒸除掉溶剂，再减压蒸馏，得N-叔丁氧羰基-3-吡咯啉，N-叔丁氧羰基-3-吡咯啉水解、减压蒸馏，得到3,4-环氧-N-叔丁氧羰基吡咯；化学式如下：
步骤2：取3,4-环氧-N-叔丁氧羰基吡咯，以四氢呋喃溶解，加入三甲基硅基乙烯和正丁基锂的三氟化硼-乙醚溶液，于-78°C反应2h，得到3-三甲基硅基乙炔基-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯；反应液中加入四丁基氟化铵，逐渐升温至室温，搅拌反应2h，乙酸乙酯萃取，得到3-乙炔基-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯；3-乙炔基-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯以叔丁醇溶解，室温下加入苄基叠氮，抗坏血酸钠，硫酸铜，搅拌反应2h，以正己烷-乙酸乙酯萃取，得3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯；在酸性甲醇溶液中，3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯脱除叔丁氧保护基，得到3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基吡咯；通过Mannich反应，3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基吡咯与9-脱氮腺嘌呤反应得到9-[[3’-[2’’,3’’,4’’-三唑]-4’-羟基-1’-甲基吡咯]]-9-脱氮腺嘌呤。该产物即为SAHN核苷酶特异性抑制化合物的母核结构；化学式如下：
所述化合物作为抑制以下致病菌：埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、奈瑟氏菌属、耶尔森氏菌属、螺杆菌属、链球菌属、克雷伯氏菌属而对宿主极小或无副作用的先导化合物方面的应用。
所述化合物作为抑制大肠埃希氏菌病原菌而对宿主极小或无副作用的先导化合物。
本发明的有益效果为：
SAHN被发现是细菌物种间序列高度同源保守又活跃表达的蛋白，对于大部分微生物病原菌，SAHN是细胞毒性中间产物SAH唯一的代谢酶，这些病原菌包括：埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、奈瑟氏菌属、耶尔森氏菌属、螺杆菌属、链球菌属、克雷伯氏菌属等。
SAHN核苷酶活性下降会影响病原菌的生长分裂。首先，SAHN核苷酶活性的下降会造成胞内SAH的累积，野生型大肠埃希氏菌细胞内SAH的正常浓度为1.3μM，作为有效的SAM依赖甲基转移酶的反馈抑制剂，胞内低浓度的SAH的积累就会使甲基转移反应得到全面抑制，从而影响基因的表达调控和蛋白的修饰，降低病原菌适应性，进而阻碍细菌细胞的生长和分裂。其次，SAHN酶的抑制会造成下游QS信号分子AI-2前体的缺失，病原菌无法合成AI-2信号分子，从而可有效控制病原菌毒力因子表达、菌膜形成等细菌群体感应效应。再有，SAHN酶的抑制将会造成甲基循环的中断，甲基循环中的重要化合物甲硫氨酸和SAM无法再生，因为SAM是不能透过菌体细胞膜的，如果环境中没有甲硫氨酸供应，病原菌是根本无法生长的。
本发明通过有机合成的方法有针对性地获得大肠埃希氏菌SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物，开发一种新型抗感染药物先导化合物。该先导药物可以高效特异性地抑制SAHN核苷酶的活性，而对宿主同工酶基本无影响，从而保证了该药物先导化合物具有良好的抑菌活性，而对宿主基本没有任何副作用。
附图说明
图1所示为诱导表达、亲和层析分离纯化SAHN酶蛋白的电泳图；带有6个组氨酸标签的SAHN蛋白分子量为25.3kDa，Lane1:蛋白分子量标准；Lane2:IPTG诱导前细胞裂解液;Lane3:IPTG诱导后细胞裂解液;Lane4～7:亲和层析洗脱组分；
图2所示为诱导表达、亲和层析分离纯化SRHH酶蛋白的电泳图；带有6个组氨酸标签的SRHH蛋白分子量为19.0kDa，由于该蛋白84位的半胱氨酸残基可被氧化，所以呈现为两条带；Lane1:蛋白分子量标准；Lane2:IPTG诱导前细胞裂解液;Lane3-4:IPTG诱导后细胞裂解液;Lane5-6:亲和层析洗脱组分；
图3所示为SAHN核苷酶酶偶联反应转化S-ribosylhomocycteine（SRH）生成的TNB的化学计量；
图4所示为诱导表达、亲和层析分离纯化SAHN酶蛋白的电泳图；带有6个组氨酸标签的SAHH蛋白分子量为49kDa；
图5所示为SAHH水解酶反应转化S-ribosylhomocycteine生成的TNB的化学计量；
图6所示为酶偶联技术分析SAHN核苷酶在不同底物浓度下酶促反应速度v(μM/min)的变化图；
注：SAHN核苷酶浓度为1.0nM；检测系统包含有10μMSRHH，1.0mM的二硫苏糖醇，pH7.0的50mMHepes缓冲液，反应温度为37°C；图7所示为图6酶促反应曲线中酶促反应速度v对于底物浓度的双倒数图；
图8所示为酶偶联技术分析SAHH水解酶在不同底物浓度下酶促反应速度v(μM/min)的变化图；
注：SAHH水解酶浓度为1.0nM；检测系统包含有1.0mM的二硫苏糖醇，pH7.0的50mMHepes缓冲液，反应温度为37°C；
图9所示为图8酶促反应曲线中酶促反应速度v对于底物浓度的双倒数图；
图10几种典型致病菌（大肠埃希氏菌K12、大肠埃希氏菌O157:H7、伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌等）SAHN酶蛋白的氨基酸序列比对（保守序列以及底物结合和催化位点分别在图中以*标注）。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
在下述实施例中所给出的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。其中所用试剂均有市售。
实施例1
大肠埃希氏菌SAHN、SRHH蛋白以及宿主SAHH蛋白的克隆、表达和纯化
1.大肠埃希氏菌基因序列SAHN与SRHH重组载体的构建：从Genebank中获得相应的基因序列，Primer5.0设计PCR引物，采用PCR扩增技术分别从E.coliXL1-Blue中获取DNA序列。PCR产物与前期构建的pYEMF-T载体连接，转化E.coliK-12DH5α，选取白色阳性克隆，培养后提取质粒，酶切后琼脂糖电泳分离鉴定，酶切片段通过MagExtractor(TOYOBOInc.)Kit纯化，克隆入pCA24N质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)，在氯霉素或氨苄青霉素LB平板上筛选。
2.人源基因序列SAHH重组载体的构建：人胎盘组织液氮速冻后研碎，加入TRIZOLE试剂，采用QIAGENRneasyMinikit提取总RNA，琼脂糖电泳鉴定纯度，从Genebank中获得SAHH基因序列，Primer5.0设计PCR引物，以提取的总RNA为模板，在7500定量PCR仪（ABI）上反转录扩增。PCR产物与pYEMF-T载体连接，转化DH5α，选取白色阳性克隆，培养后提取质粒，酶切后琼脂糖电泳分离鉴定，酶切片段通过MagExtractor(TOYOBOInc.)Kit纯化，克隆入pCA24N质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)，在氯霉素或氨苄青霉素LB平板上筛选。
3.融合蛋白的表达与纯化：转化株菌体细胞接种于含有氯霉素或氨苄青霉素的LB培养液中，37°C、225r/min振荡培养至OD600达到0.5～0.6，加入0.1mMIPTG诱导表达目标蛋白，离心收集菌体，1×PBS缓冲液洗三次，超声波裂解离心（30,000×g）去沉淀，裂解液上样于Ni2+琼脂糖亲和层析柱，用含有20mM磷酸钾、0.1MNaCl，以及5mM或10mM咪唑的pH7.8溶液的洗5-6个柱体积，最后用20mM磷酸钾、0.1MNaCl、以及500mM咪唑pH7.8洗脱液洗脱，SDS-PAGE确定产率和纯度。
实施例2
SAHN和SAHH的酶偶联分析检测系统的建立
S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（SAHN）的酶偶联分析检测反应机理如下：
S-腺苷高半胱氨酸水解酶（SAHH）的分析检测反应机理如下：
酶偶联分析检测系统包含有0.1-20μM不同浓度SAH，10μMSRHH（SAHH酶检测时不加SRHH），1.0mM的二硫苏糖醇，pH7.4的50mMHepes缓冲液以及不同浓度的酶抑制剂，37°C水浴振荡平衡5min后，加入SAHN或SAHH的蛋白启动酶反应，37°C反应10min，用四倍体积的5,5'-联硫-2,2'-双硝基苯甲酸(DTNB)(133μM)-盐酸胍(8M)溶液终止反应，412nm比色测定生成的5-硫代-2-硝基苯甲酸（TNB），通过计算酶蛋白每分钟裂解的SAH量检测SAHN和SAHH的酶活性及药物抑制率。
实施例3
1.通过PCR扩增获取SAHN序列，并构建pEX-sahn表达载体，转化BL21(DE3)后，IPTG诱导表达得到带有组氨酸标签的SAHN融合蛋白，通过Ni2+琼脂糖亲和层析柱吸附，咪唑洗脱分离纯化得到重组酶蛋白，如说明书附图图1所示。
2.构建pCA-SRHH表达载体，转化BL21(DE3)后，IPTG诱导表达得到带有组氨酸标签的SRHH融合蛋白，Ni2+琼脂糖亲和层析柱吸附，咪唑洗脱分离纯化得到重组酶蛋白SRHH，该蛋白可用于SAHN酶活性的酶偶联分析检测，如说明书附图图2所示。
3.酶偶联分析检测SAHN核苷酶活性的线性相关分析：
基于重组酶SRHH的酶偶联分析检测反应生成的TNB与SAHN核苷酶裂解生成的S-ribosylhomocycteine（SRH）浓度呈现显著的线性正相关，如说明书附图图3所示。
4.构建pCA-SAHH表达载体，转化BL21(DE3)后，IPTG诱导表达得到带有组氨酸标签的SAHH融合蛋白，Ni2+琼脂糖亲和层析柱吸附，咪唑洗脱分离纯化得到重组酶蛋白SAHH，如说明书附图图4所示。
5.SAHH水解酶活性的线性相关分析：
酶反应生成的TNB与SAHN核苷酶裂解生成的S-ribosylhomocycteine（SRH）浓度呈现显著的线性正相关，如说明书附图图5所示。
6.SAHN酶促反应动力学表征
实验结果表明，SAHN酶促反应过程具有典型的酶促反应动力学特征，通过双倒数作图（说明书附图图6、图7）计算出37°C、pH7.0条件下，SAHN酶促反应米氏常数Km值为4.70μM，最大反应速度Vmax值为2.87μM/min。
7.SAHH水解酶酶促反应动力学表征
实验结果表明，SAHH水解酶酶促反应过程具有典型的酶促反应动力学特征，通过双倒数作图（说明书附图图8、图9）计算出37°C、pH7.0条件下，SAHH酶促反应米氏常数Km值为5.29μM，最大反应速度Vmax值为1.07μM/min。
8.SAHN酶蛋白序列及结构的分析
通过DNAMAN核酸蛋白序列分析软件对几种典型致病菌（大肠埃希氏菌K12、大肠埃希氏菌O157:H7、伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、炭疽芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌）的SAHN蛋白的氨基酸序列进行同源性分析，结果表明，埃希氏杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、奈瑟氏菌属、耶尔森氏菌属、螺杆菌属、链球菌属、克雷伯氏菌属等SAHN酶蛋白的氨基酸序列高度同源保守，如说明书附图图10所示。
实施例4
几种大肠埃希氏菌SAHN核苷酶的有效抑制化合物的有机合成
步骤1：将0.1mol（9.7g）二烯丙基胺（1）滴加到0.1mol二碳酸二叔丁酯（21.8g）100mL甲醇溶液中，保持温度在0℃以下，搅拌半小时，得N-叔丁氧羰基二烯丙基胺（2）。反应液无需分离，加入100mL二氯甲烷，搅拌下加入Grubbs催化剂，逐渐升温至室温，反应1h。旋蒸除掉溶剂，再减压蒸馏，得11.4gN-叔丁氧羰基-3-吡咯啉（3）。N-叔丁氧羰基-3-吡咯啉（3）水解、减压蒸馏，得到11.0g3,4-环氧-N-叔丁氧羰基吡咯（4）。
步骤2：取1.83g（0.01mol）3,4-环氧-N-叔丁氧羰基吡咯（4），以四氢呋喃溶解，加入三甲基硅基乙炔和正丁基锂的三氟化硼-乙醚溶液，于-78℃反应2h，得到3-三甲基硅基乙炔基-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯（8）。反应液中加入四丁基氟化铵，逐渐升温至室温，搅拌反应2h，乙酸乙酯萃取，得到3-乙炔基-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯（9）。3-乙炔基-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯（9）以叔丁醇溶解，室温下加入苄基叠氮，抗坏血酸钠，硫酸铜，搅拌反应2h，以正己烷-乙酸乙酯萃取，得3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯（10a）。在酸性甲醇溶液中，3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基-N-叔丁氧羰基吡咯（10a）脱除叔丁氧保护基，得到3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基吡咯（11a）。通过Mannich反应，3-[2’,3’,4’-三唑]-4-羟基吡咯（11a）与9-脱氮腺嘌呤反应得到9-[[3’-[2’’,3’’,4’’-三唑]-4’-羟基-1’-甲基吡咯]]-9-脱氮腺嘌呤（12a），产物以柱层析纯化得到0.6781g纯品。
实施例5
本发明的几种大肠埃希氏菌SAHN核苷酶的有效抑制化合物对大肠埃希氏菌SAHN核苷酶，以及对人源SAHH水解酶的抑制常数Ki值的比较
表1.抑制剂对E.coliSAHN核苷酶及人源SAHH水解酶的抑制常数Ki值的比较
*表明没有检测到酶活性的抑制
抑制常数Ki越小表明抑制效率越高，由此可见，对于母核12的各衍生侧链化合物均对于大肠埃希氏菌SAHN核苷酶具有较高的抑制率，更重要的是该组大肠埃希氏菌SAHN核苷酶的抑制剂，对人源SAHH水解酶的酶活性有很低的抑制作用，甚至没有检测到抑制作用。所以，该组SAHN核苷酶的抑制剂可成为有效抑制大肠埃希氏菌病原菌而对宿主无副作用的先导化合物的备选。

Claims (2)

1.一种SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物，其特征在于，该化合物的结构为其中，R’是对甲基苄基，3,5-二甲基苄基，对乙基苄基，对氟苄基中的一种；所述SAHN酶蛋白为S-腺苷高半胱氨酸核苷酶酶蛋白。
2.如权利要求1所述的一种SAHN酶蛋白的特异性抑制化合物的合成方法，其特征在于，该化合物合成步骤为：
步骤1：
步骤2：
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