KR20120088854A - 활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법 - Google Patents

활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 재조합 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 동물세포주, 활성형 혈액응고 제 9 인자(aFIX)의 생산을 최대화할 수 있는 동물세포 배양용 최적화 배지 및 상기 최적화 배지에 상기 동물세포주를 배양하기 위한 최적화 배양 방법이 제공된다.

Description

활성형 재조합 혈액응고 9인자의 대량생산 방법{METHOD FOR MANUFACTURING ACTIVE RECOMBINANT BLOOD COAGULATION FACTOR IX}
본 발명은 재조합 혈액응고 제 9 인자를 대량생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 활성을 가지는 재조합 혈액응고 제 9 인자(aFIX)를 과발현하는 발현벡터를 제조하고 상기 발현 벡터를 특정 세포주에 도입한 후, 상기 세포주를 배양함으로써 활성형 재조합 혈액응고 제 9 인자를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
혈우병(hemophilia)은 X 성염색체에 연관된 혈액응고 체계의 문제로 출혈을 일으키는 유전적 질병이다. 이 질병은 혈액응고 제 8 인자(factor VIII)가 부족하여 생기는 혈우병 A 와 혈액응고 제 9 인자(coagulation factor IX; FIX)가 결핍되어 나타나는 혈우병 B 로 구분되며, 대개 전체 혈우병 환자 중 혈우병 A 가 80％ 정도를 차지하며 나머지 20％는 혈우병 B 이다.
혈우병 환자들은 출혈을 예방하고 치료하기 위하여 장기간 지속적으로 결핍된 혈액응고인자를 투여 받아야 하므로 안전성이 확보된 혈액응고 인자의 공급이 필요하다. 이를 위해 최근에는 재조합 유전공학 기술과 무혈청 배지를 이용하여 재조합 혈액응고 제 9 인자 제품을 생산하여 공급하고 있다.
일반적으로 재조합 혈액응고 제 9 인자는 최적화된 무혈청 배양배지에서 CHO (Chinese hamster ovary) 세포주들을 배양하여 얻고 있으나 과발현되는 혈액응고 제 9 인자 재조합 단백질에 비해 PACE(paired basic amino acid converting enzyme) 나 γ-카복실라제 등의 효소가 불충분하기 때문에 분비생산된 혈액응고 제 9 인자들 중 일부만이 활성을 가지게 된다. 결과적으로 배양상층액에는 활성형 혈액응고 제 9 인자(active coasulation factor IX; aFIX) 외에도 카복실화되지 않은 FIX 또는 pro-FIX, 카복실화는 되었으나 프로펩티드가 제거되지 않은 pro-FIX 등의 전혀 혈액응고 활성을 갖지 못하는 형태들이 많이 존재하게 된다. 이러한 문제를 극복하기 위해 CHO 세포주에 인간 γ-카복실라제나 PACE 프로테아제(protease)를 도입하여 보다 완전한 활성을 갖는 재조합 혈액응고 제 9 인자를 생산하도록 변형된 CHO 세포주가 개발되었다.
한편으로 분비된 FIX 는 세포배양조건이나 배양시간에 따라 활성화된 혈액응고 제 9 인자(activated coagulation factor IX; FIXa) 로 일부 변형되게 된다. 결과적으로 활성이 없는 FIX 형태들이나 분비된 후 활성화되어 버리는 FIXa 등이 FIX 와 섞여 있게 됨으로써 FIX 생산수율 향상과 정제에 어려움이 매우 크다. 이런 불필요한 혈액응고 제 9 인자 형태들의 분비를 최소화하고 활성형 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 최대화할 수 있는 생산세포주 및 배양공정개발이 요구되어 왔다.
최근 생산되는 EPO(erythropoietin)나 치료용 항체 등 대부분의 단백질 의약품들은 동물세포 배양법을 통해 생산되는데, 그 이유는 박테리아, 효모 및 곤충세포들이 당쇄 부가능력이 없거나 제한적인데 반해, 동물세포는 인간과 유사한 당쇄 부가 단백질을 가장 효율적으로 생산할 수 있기 때문이다. 재조합 의약품을 산업적으로 생산하는데 사용되는 동물세포주로서 CHO 세포, BHK(Baby hamster kidney) 세포 등이 많이 이용되는데, 이 숙주세포들은 재조합 단백질 발현율이 높고 발현 단백질의 번역-후 수식과정(post-translational modification)이 인간 단백질과 거의 유사한 장점이 있다.
재조합 단백질을 생산하는 동물세포 배양 시 오랜 기간 혈청(serum)을 사용하여 왔으나 동물혈청유래의 감염인자들 때문에 무혈청 배지가 개발되어 왔고, 최근에는 무단백질 배양배지가 개발되고 있다. 그러나 혈청을 사용하지 않으면 재조합 단백질의 생산성이 저하되는 문제점이 있으므로 재조합 단백질을 생산하여 제품화하고자 하는 경우에는 혈청을 대신할 수 있는 동물유래가 아닌 가수분해산물(hydrolysate)과 같은 배지첨가물이나 재조합 단백질들을 무혈청 배지에 첨가하여 배양에 이용하고 있다. 구체적으로, 식물성 또는 효모 가수분해산물을 이용한 배지가 개발된 바 있다(WO 96/15231, WO 98/15614, WO 01/23527, WO 00/03000 참고). 그러나, 이들 배양배지들은 종종 재조합 단백질 생산세포주 배양에 필요한 영양분이 부족하여 단백질 생산성이 저하되기도 하므로 이를 보완하기 위해 동물유래의 단백질을 첨가물로 사용하기도 한다.
이러한 다양한 배양배지 개발에도 불구하고 특정 재조합 단백질의 발현효율 및 생산성을 높이기 위한 최적의 세포배양 배지 및 이의 배양 방법을 개발하기 위한 노력은 계속되고 있다.
본 발명의 목적은 인간 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 동물세포 발현용 재조합 발현벡터로서, 인간 베타 글로빈 MAR 엘리먼트 염기서열과, 인간 혈액응고 제 9 인자의 인트론 1 의 절편을 갖는 인간 혈액응고 제 9 인자의 염기서열을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 동물세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물세포 배양용 무혈청 배지에, 효모 가수분해산물 또는 콩 가수분해산물을 단독으로 또는 혼합하여 첨가하고, 상기 배지에 인간 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 동물세포주를 배양함으로써 인간 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물세포 배양용 무혈청 배지의 삼투압이 312 내지 388 mOsm 의 범위인 배지에 인간 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 동물세포주를 배양함으로써 인간 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 방법 을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물세포 배양용 무혈청 배지의 칼슘이온 농도가 1.0 내지 1.3 mM 의 범위인 배지에, 인간 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 동물세포주를 배양함으로써 인간 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 방법 을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효모 가수분해산물을 2.5 내지 5 g/L 의 농도로 함유하고, 350 내지 388 mOsm 의 범위의 삼투압을 가지며, 1.0 내지 1.3 mM 의 범위의 농도의 칼슘이온을 함유하는 동물세포 배양용 무혈청 배지에, 인간 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 동물세포주를 배양함으로써 인간 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 목적에 따라, 본 발명은 상기 인간 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 방법에 사용되는 무혈청 배지를 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다:
도 1a 는 혈액응고 제 9 인자 발현벡터 pMSG-FIX 과 pMSG-FIXI 의 모식도이고;
도 1b 는 pMSG 벡터에 클로닝된 퓨린(furin), 분비형 퓨린 그리고 γ-카복실레이즈(γ-carboxylase) 효소들 각각에 대한 발현벡터 모식도이며,
도 2 는 혈액응고 제 9 인자의 인트론 1 절편을 가진 벡터가 도입된 동물세포주에서 혈액응고 제 9 인자의 발현증가 효과를 나타낸 것이고;
도 3 은 1 μM MTX 에 적응된 세포주들에 도입된 재조합 혈액응고 제 9 인자 발현벡터들에 따른 혈액응고 제 9 인자의 발현량을 분석한 것이며;
도 4a 및 도 4b 는 혈액응고 제 9 인자 생산 세포주들의 무혈청 배지배양에서 세포성장과 혈액응고 제 9 인자의 활성 및 그의 생산성을 나타내는 결과이고;
도 4c 는 F24 세포주의 GC-P1 무혈청 배지를 이용한 무혈청 현탁배양에 따른 세포성장과 생존도(A), 혈액응고 제 9 인자 생산성(B) 및 활성(C) 그리고 혈액응고 제 9 인자에 대한 면역블롯 결과(D)를 나타내며,
도 5a 는 무혈청 GC-P1 배지(SFM)에 효모 가수분해산물(Y), 콩 가수분해산물(S) 또는 밀 가수분해산물(WG)들을 첨가한 후 배양시간에 따른 F24 세포주의 세포성장을 비교한 것이고;
도 5b 는 무혈청 GC-P1 배지(SFM)에 효모 가수분해산물(Y), 콩 가수분해산물(S) 또는 밀 가수분해산물(WG)들을 첨가한 후의 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 GC-P1 배지만 사용한 경우와 비교하여 상대적으로 나타낸 것이며;
도 6a 는 무혈청 GC-1(SFM) 배지에 효모 가수분해산물(Y) 및 콩 가수분해산물(S)을 첨가한 배양에서 이들의 혼합비율에 따른 F24 세포주의 세포성장을 비교한 것이고;
도 6b 는 무혈청 GC-1(SFM) 배지에 효모 가수분해산물(Y) 및 콩 가수분해산물(S)을 첨가한 배양에서 이들의 혼합비율에 따른 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 GC-P1 배지만 사용한 경우와 비교하여 상대적으로 나타낸 것이며;
도 7a 는 효모 가수분해산물의 첨가량과 첨가시기를 동시에 조절한 무혈청 배양에서 F24 세포주의 세포성장을 나타낸 것이고;
도 7b 는 효모 가수분해산물의 첨가량과 첨가시기를 동시에 조절한 무혈청 배양에서 F24 세포주의 혈액응고 제 9 인자의 활성을 나타낸 것이다.
본 발명은 인간 재조합 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 발현벡터 내에 인간 베타 글로빈 MAR 엘리먼트와 인간 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 의 절편을 포함시키는 것을 특징으로 하는 발현벡터를 제공한다.
상기 인간 베타 글로빈 MAR 엘리먼트(human β-globin MAR element; 대한민국 특허공보 제 408844 호 참조; 서열번호 1)는 동물세포 내에서 유전자 복제 및 발현조절 등의 기능을 가진 것으로 알려진 핵산요소인 매트릭스 부착 부위인자(matrix attachment region element; MAR element)로서 동물세포를 이용한 재조합 단백질 발현에 있어 삽입된 유전자의 위치에 따라 단백질 발현효율이 달라지는 점을 극복하기 위하여 이용된다. 이러한 발현벡터를 이용함으로써 단백질 발현량을 최대화 할 수 있을 뿐 아니라 재조합 단백질 발현유전자의 증폭을 용이하게 하여 최종세포주를 확보하는 기간을 1-2 개월로 단축할 수 있다. 상기 인간 베타 글로빈 MAR 엘리먼트를 포함하는 벡터로서 공지된 벡터인 pMSG 벡터(기탁번호 KCCH 10202)를 이용할 수 있다.
본 발명에서는 발현을 더욱 증가시킬 목적으로 인간 혈액응고 제 9 인자 인트론 1의 절편(Kurachi, S. et al. Journal of biological chemistry 270:5276-5281, 1995)을 이용하는데, 이는 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 의 서열 중 5' 말단의 스플라이싱 공여체(splicing donor)를 포함하는 141 bp 내지 981 bp 길이 부위와 3' 말단의 스플라이싱 수용체(splicing acceptor)를 포함하는 157 bp 내지 444 bp 길이 부위를 서로 연결한 유전자 절편을 의미한다. 바람직하게는 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 의 서열 중 5' 말단의 스플라이싱 공여체를 포함하는 141 bp 길이 부위와 3' 말단의 스플라이싱 수용체를 포함하는 157 bp 길이 부위를 서로 연결한 유전자 절편을 의미한다.
이렇게 얻은 인트론 1 의 절편을 혈액응고 제 9 인자 유전자 내의 인트론 1 의 원래 위치에 클로닝하여 사용한다. 상기 인트론 1 의 절편은 298 bp 내지 1425 bp 길이의 염기서열을 갖는 것이 바람직하며, 298 bp 길이의 인트론 1 의 절편과 클로닝을 위한 연결부위를 포함하여 316 bp 길이의 염기서열을 갖는 것이보다 바람직하다. 구체적으로, 상기 인트론 1 의 절편은 서열번호 2 의염기서열을 가질 수 있다.
이러한 MAR 엘리먼트 부위와 인트론 1 의 절편을 동시에 갖는 혈액응고 제 9 인자 발현벡터를 사용함으로써 인트론 1 의 절편이 없는 경우에 비해 약 10 배 이상 혈액응고 제 9 인자 발현을 증가시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포주들의 혈액응고 제 9 인자의 세포주당 비생산성(specific productivity: 세포생산성을 나타내는 것으로 단위시간에 세포당 생산성을 나타내는 값)은 약 8 ∼ 14 ㎍/106 세포/일로 매우 높은 발현수준을 나타낸다.
본 발명의 동물세포배양 방법에서 사용되는 동물세포로는 당업계에 공지된 CHO, BHK, COS7 세포주 등을 이용할 수 있다. 이 중 CHO 세포로는 DG44 세포를 이용할 수 있는데, 이 세포주는 핵산 합성에 관여하는 주효소인 디하이드로폴레이트 리덕테이즈(Dihydrofolate reductase; DHFR)가 결손된 세포주이다. 따라서 DHFR 유전자를 가진 플라스미드와 타겟 단백질 유전자를 가진 플라스미드를 동시에 CHO 세포에 도입한 후 핵산이 없는 선택배지에서 배양하여 재조합 세포주를 선별하고, 그 후 DHFR 효소의 기질로 이용되는 폴레이트(folate)의 유사체인 메쏘트렉세이트(methotrexate; MTX)를 배지 중에 첨가함으로써 외부에서 도입된 DHFR 유전자의 증폭을 유도하고 이 과정에서 함께 도입된 목적 유전자의 증폭을 동시에 유도함에 따라 본 발명의 목적물질인 재조합 인간 혈액응고 제 9 인자의 생산도 증폭될 수 있다.
또한, 상기 혈액응고 제 9 인자 발현벡터는 CHO 세포 등에 단독으로 도입되거나 인간의 퓨린, 분비형 퓨린(퓨린 효소의 골지체 루멘(lumen)쪽 부위로서 퓨린 효소의 3' 말단의 막관통(transmembrane) 부위 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 부위를 제외한 부위), γ-카복실레이즈 발현벡터들과 복합적으로 CHO 세포주에 도입될 수 있다. 혈액응고 제 9 인자 발현벡터가 도입된 세포주로부터 재조합 혈액응고 제 9 인자의 높은 발현수준을 나타내는 세포주를 분리하여 무혈청배양에 이용한다.
본 발명에서는 재조합 혈액응고 제 9 인자 발현세포주들을 녹십자의 GC-P1 무혈청 배지 및 공지된 여러 종류의 상용 무혈청 배지(예, Hyclone 및 Sigma 의 무혈청 배지 등)에서 현탁배양을 실시하여 현탁배양에 적응된 세포주를 제조한다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에서는 재조합 혈액응고 제 9 인자 발현세포주들 중, 특히 FS09, F24 세포주와 GFSC-15 세포주 등의 생산성이 높게 나타나며, 생산된 재조합 혈액응고 제 9 인자의 비활성(specific activity)은 FS09, F24 세포주의 경우 20 ∼ 40 U/mg 이며, 또한 GFSC-15 세포주의 경우 50 ∼ 100 U/mg 수준으로 모두 높은 비활성을 나타낸다. 혈액 내 5 ug/ml 수준으로 존재하는 혈액응고 제 9 인자의 비활성을 보통 200 U/mg 으로 나타낼 경우, 본 특허에서 얻어진 세포주들을 배양함으로써 배양상층액으로 분비된 혈액응고 9 인자들 중 약 10 ∼ 50％를 활성형 혈액응고 제 9 인자로 얻을 수 있다. 이러한 시험에서 안정적으로 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 GC-P1 무혈청 배지를 이후 무혈청 현탁배양배지로 선정하여 사용할 수 있다. 또한 GC-P1 무혈청 배지에서 혈액응고 제 9 인자의 높은 생산성과 비활성을 나타내는 F24 세포주와 GFSC-15 세포주를 최종세포주로 활용한다.
한편 본 발명에서는 콩 가수분해산물(Soy Hydrolysate), 효모 가수분해산물(Yeast Hydrolysate)을 첨가하여 재조합 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 높이는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 배양초기부터 또는 세포성장의 대수기(exponential period)에 콩 가수분해산물과 효모 가수분해산물을 첨가한 경우, 배양초반에는 세포성장에 큰 영향을 주지 않지만 배양후반에는 세포성장이나 생존기간(longevity)을 높일 수 있다.
또한, 콩 가수분해산물 또는 효모 가수분해산물을 단독으로 또는 혼합하여 사용하면 GC-P1 무혈청 배지에 배양했을 때보다 혈액응고 제 9 인자 생산성이 약 1.8∼2.0 배 증가된다. 상기 첨가되는 가수분해산물의 바람직한 함량은 배지의 양을 기준으로 1∼10 g/L 이고, 더 바람직하게는 2.5∼5 g/L 이다. 효모 가수분해산물을 첨가하는 양을 1 ∼ 10 g/L, 바람직하게는 2.5∼5 g/L 첨가하여 배양할 경우 첨가물의 첨가시기에 따라 초기 접종농도를 조절하여 배양하면 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 70∼100％ 증가시킬 수 있다.
세포성장과 생산성 측면에서 본다면, 효모 가수분해효소를 단독으로 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 가수분해산물을 첨가하는 시기는 배양시작 초기부터도 가능하며 특히 배양 3∼4 일째인 세포배양 대수기에 가수분해산물을 첨가하는 경우 세포성장 및 세포생존기간을 늘려서 혈액응고 제 9 인자 생산을 최대화할 수 있다.
무혈청배양 말기에는 세포사멸 및 세포분비물로 인하여 생산된 활성형 혈액응고 제 9 인자의 일부가 활성화되어 활성화된(activated) 혈액응고 제 9 인자(FIXa)를 생성하게 된다. 본 발명에서는 이러한 활성화를 억제하기 위하여 배양액의 삼투압을 NaCl 등으로 고삼투압으로 조절함으로써 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa) 생성을 억제하는 조건을 제공한다. 이 때 고삼투압의 범위는 312∼533 mOsm 이며, 특히 활성화 혈액응고 제 9 인자 전체생산성을 감소시키지 않으면서 활성화된 혈액응고 인자를 최소화하는 조건은 350∼400 mOsm 범위이며, 활성화 혈액응고 제 9 인자의 최대 생산조건을 위한 고삼투압 조건은 388 mOsm 부근이다.
본 발명은 혈액응고 제 9 인자의 활성과 관련이 있는 칼슘이온(Ca2+)의 농도를 염화칼슘(CaCl2) 첨가로 조절함으로써 GC-P1 기본배지에 효모 가수분해산물을 첨가한 무혈청 배양시 배양상층액에서 활성형 혈액응고 제 9 인자의 생산을 최대화하는 조건을 제공한다. 적어도 2.6 mM 염화칼슘 농도까지는 활성형 혈액응고 제 9 인자의 전체 생산량을 높일 수 있으며, 특히 활성형 혈액응고 제 9 인자가 활성화된 형태(FIXa)로 변화하지 않는 조건에서 혈액응고 제 9 인자 생산을 최대화하는 칼슘이온 농도는 약 1.0∼1.3 mM 이다.
또한 본 발명에서는 상기에서 언급한 조건들을 복합적으로 적용함으로써 혈액응고 제 9 인자 생산 동물세포주를 무혈청배양하여 활성형 혈액응고 제 9 인자를 생산하는 최적의 배양공정을 제공한다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
시험예 : 재조합 혈액응고 제 9 인자의 정량 및 활성 측정
혈액응고 제 9 인자 생산세포주의 배양상층액으로 발현된 혈액응고 제 9 인자의 발현양은 샌드위치 ELISA 법(sandwich ELISA method)(Affinity Biologicals, 캐나다)으로 인간혈장 유래 혈액응고 제 9 인자(Heamatologic Technologles Inc., 미국)를 표준품으로 사용하여 비교 정량하였다. 혈액응고 제 9 인자의 활성은 내인성 응고 기전의 초기단계인 접촉활성화의 인공적인 촉진을 이용한 APTT(activated partial thromboplastin time) 방법(Dade Behring, 독일)으로 인간 정상혈장(normal plasma)을 표준으로 사용하여 코아규로미터(coagulometer)(KC-10A, Heinrich Amelung, 독일)로 측정하였다. 기활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa)는 NAPTT(Non-activated partial thromboplastin time) 방법(Bio/Data Corp., 미국)으로 측정하였으며, 이 방법은 접촉 활성화 반응 없이 활성화 9 인자의 활성으로 발생하는 응고의 정도를 측정하는 방법이다. 활성을 가진 활성형 혈액응고 9 인자(aFIX)의 활성은 APTT 법으로 측정된 전체 활성에서 NAPTT 방법으로 측정된 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa) 활성을 뺀 값으로 정의하였다. 활성화 9 인자의 희석농도에 따라 혈액이 응고되는 시간은 달라지며, 일정 희석배수 구간에서 선형(linearity)이 확인되면 시료를 희석하여 선형구간에 들어가게 하고 그 때의 농도를 계산에 의해 구하였다.
실시예 1: 재조합 혈액응고 제 9 인자 유전자 클로닝 및 발현벡터의 제조
인간의 간 RNA 를 추출하고 cDNA 를 합성한 후 인간 혈액응고 제 9 인자 유전자(GenBank accession No. M11309, 1∼2775 bp)를 기초로 제작된 서열번호 3 및 서열번호 4 의 프라이머를 이용하여 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction) 방법으로 혈액응고 제 9 인자 절편을 얻은 후, 본 발명자들이 개발한 pMSG 벡터(기탁번호 KCCH 10202; 대한민국 특허공보 제 408844 호 참조)의 NheI 과 BgIII 제한효소자리에 클로닝하여 pMSG-FIX 를 제조하였다(도 1a). 또한 혈액응고 제 9 인자의 인트론 1 중 5' 말단의 스플라이싱 공여체를 포함하는 141 bp 길이 부위와 3' 말단의 스플라이싱 수용체를 포함하는 157 bp 길이 부위를 게놈 PCR(genomic PCR)로 확보하였다. 구체적으로, 인간 간세포(Clontech, 미국)로부터 게놈 유전자를 분리한 후 인간 혈액응고 제 9 인자 게놈 유전자를 기초로 제작된 서열번호 6 와 7 의 프라이머를 이용하여 인간 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 의 5' 말단 절편을 얻었으며, 서열번호 8 와 9 의 프라이머를 이용하여 인간 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 의 3' 말단 절편을 얻었다. 이들 유전자 절편들은 클로닝을 위하여 서열번호 6 프라이머는 SaII 제한효소를, 서열번호 7 프라이머는 MluI 제한효소를 5'에 가지고 있으며, 서열번호 8 프라이머는 MluI 제한효소를, 서열번호 9 프라이머는 SpeI 프라이머를 5'에 가지도록 제작되었다. 한편 인간 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 의 절편을 원래 위치에 삽입하기 위하여 혈액응고 9 인자 인트론 1 의 5'쪽 FIX 코딩유전자는 서열번호 3 의 프라이머와 서열번호 10 의 프라이머로 PCR 하여 얻었으며, 혈액응고 9 인자 인트론 1 의 3'쪽 FIX 코딩유전자는 서열번호 11 의 프라이머와 서열번호 4 의 프라이머로 PCR 하여 얻었다. 이들 서열번호 10 과 11 프라이머들은 혈액응고 9 인자 인트론 1 을 사이에 삽입하기 위하여 각각 SaII 및 SpeI 제한효소를 갖도록 제작되었다. 이렇게 PCR 로 얻어진 혈액응고 9 인자와 인트론 1 에 해당하는 4 조각의 유전자들은 차례로 pMSG 벡터의 NheI 과 BgIII 제한효소 자리에 삽입하여 pMSG-FIXI 벡터를 완성하였다(도 1a).
pMSG-FIXI 벡터의 전체 서열목록은 서열번호 5 에 기재되어 있다. pMSG-FIXI 벡터는 SV40 프로모터(promoter)를 1∼419 bp 에 가지고 있으며, 316 bp 로 구성된 혈액응고 제 9 인자 유전자의 인트론 1 절편부위(518∼833 bp)를 코딩부위에 가지고 있는 혈액응고 제 9 인자 발현유전자를 430∼2131 bp 에 가지고 있고, 유전자의 전사종결부위를 2152∼2368 bp 에 가지고 있으며, 항생제 내성 유전자(AmpR)를 2974∼3834 bp 위치에, MAR 유전자를 5067∼8035 bp 위치에 가지고 있다.
실시예 2: 혈액응고 제 9 인자 인트론 1 절편의 혈액응고 제 9 인자 발현증가 효과
COS7, CHO(DG44) 세포에 각각 지질(lipid)을 이용한 방법으로 pMSG-FIX 과 pMSG-FIXI 발현벡터를 형질전환(transfection) 시킨 후, 48 시간 뒤에 배양상층액으로 분비된 재조합 혈액응고 제 9 인자의 양을 ELISA 방법으로 정량하였다. 확보된 혈액응고 제 9 인자의 인트론 1 절편을 가진 벡터(pMSG-FIXI)를 사용하였을 때, COS7 세포에서는 약 2.6 배, CHO 세포에서는 약 6.7 배로 혈액응고 제 9 인자 의 발현량이 증가함을 확인하였다(도 2). 한편, pMSG-FIX 과 pMSG-FIXI 발현벡터를 pSVneo 벡터(Promega, 미국)와 공동-형질전환(co-transfection)하고 48 시간 뒤, G418(500 ㎍/ml) 이 포함된 선택배지(데옥시리보핵산 및 리보핵산이 없는 MEM-a 배지, Invitrogen, 미국)로 계대배양하고, 약 2 주간 배양하여 안정한 CHO 세포주를 얻었다. 이 경우 혈액응고 제 9 인자의 인트론 1 절편을 가진 세포주에서 약 11.5 배 정도 혈액응고 제 9 인자 발현이 증가하였다(도 2).
실시예 3: 퓨린 등을 발현하는 벡터에 의한 혈액응고 제 9 인자 발현증가 효과
혈액응고 제 9 인자 발현을 도울 수 있는 한 방법으로 인간의 퓨린(pSVLFur, ATCC ＃79822, GenBank Accession No. X17094)과 카복실레이즈 유전자(pCMV.hGC+, ATCC ＃ 686)를 ATCC 에서 구입하여 PCR(polymerase chain reaction) 방법으로 pMSG 벡터(기탁번호 KCCH 10202; 대한민국 특허공보 제 408844 호 참조)에 서브클로닝 한 후, 각각 pMSG-F 와 pMSG-C 로 명명하였다(도 1b). 또한, 세포외로 분비되는 퓨린 단백질(분비형 퓨린)을 클로닝하기 위하여 퓨린 유전자의 3' 말단의 막관통(transmembrane) 부위 및 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 부위를 제외한 나머지 부위를 PCR 방법으로 얻은 후 pMSG 벡터에 클로닝 하여 pMSG-FS 발현벡터를 완성하였다(도 1b).
pMSG-F, pMSG-FS, pMSG-C 발현벡터를 단독으로, 또는 pMSG-F 와 pMSG-C, pMSG-FS 와 pMSG-C 유전자 조합을 각각 pSVneo 벡터(Promega, 미국)와 공동-형질전환시킨 후, 48 시간 뒤, G418(500 ㎍/ml)이 포함된 선택배지로 계대배양하고, 약 2 주간 배양하여 안정한 CHO 세포주를 형성하였으며, 각각 약 24 개 콜로니를 선별하고 배양하여 퓨린 또는 카복실레이즈 발현 CHO 세포주를 얻었다. 각 유전자의 도입 및 발현은 RT-PCR 을 실시하여 확인하였으며, 위의 5 가지 모든 경우에서 퓨린 또는 카복실레이즈 효소의 RNA 양이 가장 많은 세포주를 퓨린 또는 카복실레이즈를 많이 발현하는 세포주로 선택하여 혈액응고 제 9 인자 발현을 위한 CHO 세포주로 사용하였다.
혈액응고 제 9 인자 발현벡터 pMSG-FIX 를 대조군으로 CHO(DG44) 세포주에 형질전환하고, pMSG-FIXI 를 단독으로, 또는, 퓨린 발현벡터 pMSG-F, pMSG-FS 와 카복실레이즈 발현벡터 pMSG-C 들과 복합적으로 CHO(DG44) 세포주에 공동-형질전환시키거나(도 3 의 그룹 A), 이미 확보된 퓨린, 분비형 퓨린, 카복실레이즈들 중에 하나 이상을 가진 CHO 최적 발현세포주 5 가지에 pMSG-FIXI 을 형질전환 시킨 후 (도 3 의 그룹 B), 선택배지 MEH-α(minimum essential medium-alPha) (뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 무함유)에서 선별하여 콜로니를 형성하였다. 이들 세포주들의 형질전환시 유전자증폭을 위하여 DHFR 유전자를 가진 pDCH1P 플라스미드를 세포주에 함께 도입하였다.
형성된 콜로니들로부터 개별 콜로니들을 확보한 후, 혈액응고 제 9 인자에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하거나 ELISA 방법을 이용하여 혈액응고 제 9 인자를 많이 발현하는 세포주들을 확보하였다. 선택된 혈액응고 제 9 인자 과발현 세포주들을 MTX 농도를 0.01, 0.05, 0.25, 1 μM 순서로 순차적으로 증가시키는 환경에서 적응시킴으로써 유전자 증폭을 실시하였다. 한편으로는 형성된 콜로니 전체를 함께 모은 후 MTX 로 일차 유전자 증폭을 실시한 후 개별 세포주로 분리하고 혈액응고 제 9 인자 발현양을 확인하고 과발현세포주를 얻은 후 다음 단계의 유전자 증폭을 실시하였다. 또한 유전자 증폭단계마다 필요시 개별 세포주를 얻기 위한 선별 작업을 병행하였으며 최종적으로 1 μM MTX 농도까지 유전자 증폭이 끝난 후에도 개별 세포주를 얻기 위한 선별 작업을 다시 실시하여 최종 세포주를 얻었다.
대체적으로 1 μM MTX 에 적응된 재조합 세포주들은 인트론 1 절편을 가진 경우 인트론 1 절편을 가지지 않은 세포주들보다 높은 혈액응고 제 9 인자 발현 양상을 나타내었다(도 3). 1 μM MTX 에 적응된 세포주들 중 높은 발현수준을 보이는 세포주들은 약 8 ∼ 14 ㎍/106 세포/일의 혈액응고 제 9 인자 생산성을 나타내었으며, 이 중에서 각 그룹을 대표하는 13 개의 대표 세포주를 선별하여 RT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통하여 혈액응고 제 9 인자 발현 특성분석을 실시하였으며 이들 세포주들을 이후 무혈청배양 실험에 이용하였다. 대표적인 세포주들의 혈액응고 제 9 인자 생산성을 아래 표 1 에 정리하였다.
[표 1] 혈액응고 제 9 인자 생산 세포주들의 생산성
Figure pat00001

실시예 4: 무혈청 배지의 제조
1 L 의 무혈청 GC-P1 배지(녹십자사, 한국)를 제조하기 위해, 먼저 탈이온 증류수 900 mL 에 GC-P1 합성배지(serum-free media) 10.27g 을 녹인 후 0.75 mL 의 지질 혼합물 (Sigma, C-7902, 미국)과 2 g 의 NaHCO3(Sigma, S-1554, 미국)을 차례로 첨가하여 녹이고 0.1N HCl 또는 1N NaOH 를 사용하여 pH 7.2 로 적정하였다. 이 혼합액에 탈이온 증류수를 첨가하여 배지 총 용량이 1 L 가 되도록 제조하였다. 1 L 배지 혼합액을 0.22 ㎛ 필터(Millipore, 미국)를 사용하여 여과 후, 2∼8℃에 보관하였다. 무혈청배양 전에 필터로 멸균화된 비타민 K1(Sigma, 미국)을 10 ㎍/ml 농도로 첨가하여 사용하였다.
실시예 5: 재조합 혈액응고 제 9 인자 발현세포주들의 무혈청 배지에서의 배양
녹십자의 GC-P1 무혈청 배지를 포함하여 여러 상용 무혈청 배지들, 미국 Hyclone 의 HyQ(HyQSFM4), Sigma의 C5467 및 C8862, Invitrogen의 CHO-PMIII 및 CDmedia 그리고 Cellgro 의 무단백 배지 등을 이용하여 엘렌마이어 쉐이커(Erlenmeyer Shaker) 플라스크 또는 교반 플라스크에서 현탁배양을 실시하였다. 현탁배양은 10 g/mL 비타민 K 와 1.0 M MTX 을 첨가한 무혈청 배지 30 ml 을 125mL 쉐이커 플라스크에 넣고 세포를 접종한 후, 습도가 유지되고 37℃, 5％ CO2 분위기 하의 배양기 내에서 100rpm 으로 회전하는 교반기로 실시하였다. 3 ∼ 5 계대 이상 배양을 실시하고 세포성장을 측정하여 현탁배양 적응을 확인한 후, 적응에 성공한 8 개 세포주 (I01, F11, F12, F21, F24, FS09, FS14, GFSC-15)를 선별하였다.
각 세포주들의 무혈청 배지 현탁배양에서의 재조합 혈액응고 제 9 인자 생산성을 확인하기 위하여 7∼10 일간 쉐이커 또는 교반 플라스크에서 장기 배양한 후, 배양상층액으로 분비된 재조합 혈액응고 제 9 인자의 양과 활성을 ELISA 와 APTT 법으로 각각 측정하였다. 6 일간 배양한 결과, FSO9, F24, GFSC-15 세포주 등의 생산성이 높게 나타났으며, 이들 세포주에서의 재조합 혈액응고 제 9 인자의 비활성은 각각 FS09 세포주가 20 ∼ 30 U/mg, F24 세포주가 30 ∼ 40 U/mg(도 4a 참조), GFSC-15 세포주가 50 ∼ 100 U/mg (도 4b 참조)으로 높게 나타났다. 이러한 재조합 혈액응고 제 9 인자 생산 세포주들은 무혈청 배지에서 약 2∼3 개월 동안 안정적으로 성장하는 것을 확인하였다.
이 중 F24 세포주를 대상으로 쉐이커 플라스크(100mL)를 이용하여 GC-P1 무혈청 배지별로 배양한 결과, 세포성장은 배양 6 일째 약 4.0 - 5.0 x 106 세포/mL 까지 성장하였으며(도 4c (A)), 혈액응고 제 9 인자 생산성은 배양 9 일째 약 25 ㎍/ml 에 도달하였다(도 4c (B)). 혈액응고 제 9 인자의 활성은 배양 8∼9 일 사이에 약 1.0∼12 U/ml 로 매우 높게 나타났다(도 4c (C)). 웨스턴 블롯으로 분석한 결과, 배양시간에 따라 56 ∼ 67 kD 크기의 혈액응고 제 9 인자의 생산량이 증가하였다(도 4c (D)). 이것은 혈액응고 제 9 인자의 글리코실화와 카복실화 정도의 차이에 기인한 것이다. F24 세포주의 무혈청 배지인 GC-P1 으로 교반 플라스크 배양시 배양 4, 6, 8 일째의 시료를 분석한 결과, 배양 기간에 따라 활성형 혈액응고 제 9 인자의 활성 정도가 증가하였으며, 전체에서 FIXa 의 비율은 1 ∼ 8％ 정도 수준이었다.
실시예 6: 무혈청 배지에 가수분해산물을 첨가한 경우의 혈액응고 제 9 인자 발현 증가 효과
GC-P1 무혈청 배지에서 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 증가시킬 목적으로 여러 가지 가수분해산물을 첨가한 후 F24 세포주의 세포성장, 생산성, 활성을 조사하였다. GC-P1 무혈청 배지에 콩 가수분해산물(Quest International, USA), 효모 가수분해산물(Yeastolate, BD Science, USA), 밀 가수분해산물(Quest International, USA)을 각각 5 g/L 로 첨가하여 F24 세포주의 세포배양 특성과 혈액응고 제 9 인자 생산성을 GC-P1 단독배지 사용군과 비교하였다.
무혈청 배양을 위하여 125mL 쉐이커 플라스크에 상기 실시예 4 의 방법으로 제조한 GC-P1 무혈청 배지 30ml 을 각각 플라스크에 넣고 여기에 혈액응고 제 9 인자를 발현하도록 형질전환된 F24 세포주를 초기 세포농도가 2 x 105 세포/ml 이 되도록 접종한 후, 37℃, 5％ CO2 배양기 내에서 교반기 위에 올려놓고 회전수 120 rpm 으로 배양을 실시하였다. 배양 시작 직후부터 매일 각각의 플라스크에서 1ml 의 배양액을 취하여 트리판 블루(tryphan blue) 용액에 희석 후, 헤마토사이토미터(hematocytometer)를 이용하여 현미경으로 세포수 및 세포생존율을 측정하였으며, 배양액 중에 생산된 혈액응고 제 9 인자의 함량은 인간 혈액응고 제 9 인자 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.
도 5a 는 GC-P1 배지에 가수분해산물들을 첨가한 후 배양시간에 따른 세포성장성을 비교한 것이다. 밀 가수분해산물을 첨가한 배지에서는 배양 4 일째 1.7 x 106 세포/ml 정도로 세포성장이 그쳐 오히려 세포성장이 저하되었다. 반면에 효모 가수분해산물을 첨가한 배양에서는 GC-P1 기본배지만 사용한 수준과 유사한 세포성장을 보였으며, 콩 가수분해산물을 첨가한 배양은 초반에는 GC-P1 기본배지배양과 유사한 성장을 보여주었으나 배양후반에 좀 더 빠른 세포감소가 나타났다. 결국, 효모 가수분해산물을 첨가한 경우 최고 3∼3.5 x 106 세포/ml 까지 세포성장이 유지되었다.
도 5b 는 GC-P1 배지에 가수분해산물들을 첨가한 후의 무혈청 배양에서 배양 8 일째 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 GC-P1 배지만 사용한 경우와 비교하여 상대적으로 나타낸 도면이다. 세포성장이 높은 효모 가수분해산물 첨가배양에서 혈액응고 제 9 인자 생산성은 GC-P1 배지만 사용하였을 때보다 약 1.8∼2.0 배 증가되었다. 콩 가수분해산물을 첨가한 배양의 경우 혈액응고 제 9 인자 생산성은 효모 가수분해산물 첨가배양과 비교하여 약 10％ 정도 낮았으나 큰 차이가 없었던 반면, 밀 가수분해산물을 첨가한 배양은 혈액응고 제 9 인자의 생산은 낮았으며 대부분 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa)로 변화되어 사용할 수 없는 형태였다. 결과적으로 효모 가수분해산물이나 콩 가수분해산물을 첨가한 배양에서만 특이적으로 활성형 혈액응고 제 9 인자(aFIX)의 생산성 증가가 가능하였다.
실시예 7: 효모 가수분해산물 및 콩 가수분해산물을 혼합하여 첨가하였을 때 혼합비율에 따른 무혈청배양
F24 세포주 무혈청 배양에 유효한 효모 가수분해산물(Y) 및 콩 가수분해산물(S)의 최적 혼합비율을 찾아 생산공정을 최적화하고자 하였다. GC-P1 배지에 효모 가수분해산물(Y) 및 콩 가수분해산물(S)을 각각 3:1, 1:1, 1:3 으로 섞어서 첨가하고 배양한 세포성장(도 6a)과 혈액응고 9 인자 생산(도 7b)을 조사하였다. 그 결과 세포성장은 콩 가수분해산물(S)만을 사용한 경우 배양후반에 세포가 빠르게 사멸하여 세포수가 조금 낮은 것을 제외하고 다른 조건에서는 두 가수분해산물 혼합비율에 상관없이 큰 차이가 없었다. 이러한 현상은 혈액응고 9 인자 분비생산에도 비슷하게 관찰되었다(도 6b).
결과적으로 GC-P1 기본배지에 효모 가수분해산물(Y), 콩 가수분해산물(S)을 단독 또는 적절하게 혼합하여 사용하는 경우, 특히 효모 가수분해산물(Y)을 콩 가수분해산물(S) 대비하여 적어도 25％∼100％ (w/w) 혼합하여 사용한 무혈청배양에서 혈액응고 9 인자 생산성을 1.8∼2.2 배 증가시키는 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 8: 효모 가수분해산물 첨가량 및 첨가시기에 따른 무혈청배양
GC-P1 배지에 효모 가수분해산물을 첨가한 F24 세포주의 무혈청배양 최적화를 위하여 효모 가수분해산물 첨가시기와 첨가량에 따른 세포성장성과 생산성의 변화를 조사하였다. 세포성장 대수기(exponential phase)인 배양 3 일과 4 일로 첨가시기를 달리하고 첨가농도를 2.5 g/L 와 5.0 g/L 로 달리하여 각기 다른 4 가지 조건으로 배양하여 가수분해산물을 첨가하지 않은 배양과 비교하였다.
실험 결과, 5.0 g/L 효모 가수분해산물을 배양 3 일째 첨가하는 경우 세포성장 증가가 다른 조건들보다 다소 둔하게 나타났고(도 7a), 혈액응고 제 9 인자의 활성은 첨가량이나 첨가시기에 따라 거의 차이가 나타나지 않았으며 전체적으로 GC-P1 기본배지배양보다 약 70-80％ 이상 증가하였다(도 7b).
실시예 9: 효모 가수분해산물을 첨가한 GC - P1 무혈청배양에서 배양배지 삼투압에 따른 혈액응고 제 9 인자의 생산성
GC-P1 기본배지에 5.0 g/L 의 효모 가수분해산물을 첨가한 무혈청배양에서 배양시간이 지남에 따라서 일부 생기는 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa)의 생성을 억제하기 위하여 세포배양시 NaCl 을 첨가하여 삼투압을 증가시킨 후 변화를 조사하였다.
실험 결과 삼투압이 증가함에 세포성장은 저하되었으나 세포당 혈액응고 제 9 인자의 비생산성(specific productivity)은 증가되어 생산되는 혈액응고 제 9 인자의 전체 생산성에는 변화가 없었다. 특히 배양 후반에 삼투압을 350∼388 mOsm 까지 높였을 때 혈액응고 제 9 인자 생산량의 감소 없이 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa)의 생성을 억제할 수 있었다. 반면 과도한 고삼투압은 세포성장을 과도하게 억제하여 전체 생산성을 낮추기 때문에 적절하지 않았다. 표 2 는 배지삼투압이 약 312 mOsm 인 GC-P1 무혈청 배지 사용시 혈액응고 제 9 인자 생산성을 100％로 하여 다른 조건의 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 상대적으로 나타낸 것이다.
[표 2] 무혈청 배지의 삼투압에 따른 혈액응고 제 9 인자 생산특성 비교
Figure pat00002

실시예 10: 효모 가수분해산물을 첨가한 GC - P1 무혈청배양에서 칼슘이온( Ca 2 + ) 농도에 따른 혈액응고 제 9 인자 생산성
혈액응고 제 9 인자의 효소활성은 칼슘이온(Ca2+)을 필요로 한다. 본 발명에서는 GC-P1 기본배지에 5.0 g/L 의 효모 가수분해산물을 첨가한 무혈청 배양에서 칼슘이온(Ca2+)을 염화칼슘(CaCl2) 형태로 첨가하였을 때 F24 세포주의 세포성장과 혈액응고 제 9 인자 생산성에 대한 영향을 조사하였다(표 3).
F24 세포주 배양에서 배양상층액에 분비된 혈액응고 제 9 인자의 생산성을 조사하기 위하여 배양 7 일째 배양상층액에 대하여 혈액응고 제 9 인자의 활성과 활성화 정도를 APTT 와 NAPTT 방법으로 측정한 후 비교하였다(표 3). 칼슘이온(Ca2 +)이 존재하지 않는 배양에서는 혈액응고 제 9 인자 단백질이 칼슘이온이 있는 배양과 같은 수준으로 생산되었으나 활성을 갖지 않았으며, 0 mM 에서 2.6 mM 까지 염화칼슘을 첨가하여 칼슘이온 농도를 높일 경우 활성형 혈액응고 제 9 인자(aFIX)가 생성되고 그 함량이 점점 증가되었다. 표 3 은 GC-P1 배지의 칼슘 농도를 1.0 mM 로 조절하였을 때 혈액응고 제 9 인자 생산성을 기준(이하 '대조군')으로 염화칼슘 농도에 따른 혈액응고 제 9 인자의 생산특성을 나타낸 것이다. 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa)의 증가가 거의 없도록 유지한 상태에서 칼슘이온의 농도가 1.0∼1.3 mM 일 때 약 30％ 정도 활성형 혈액응고 제 9 인자(aFIX) 생산성이 증가하였으며, 2.6 mM 까지 염화칼슘을 더욱 증가시켰을 때 전체적으로 활성형 혈액응고 제 9 인자(aFIX) 생산성은 GC-P1 배지에 비해 약 1.6배 (aFIX = FIX-FIXa 라는 개념에서 아래 표 3 을 보면 대조군에 비해 2.6 mM 칼슘농도에서 100％ 정도 증가하였으나 활성화된 FIXa 도 약 40％ 증가하였기 때문에 실제 aFIX 의 증가량은 대조군에 비해 60％ 정도 증가했다. 결국 비교군 대비 1.6 배 정도 aFIX 가 증가한 것이다.) 정도 증가하여 최고수준을 이루었으나 이미 활성화된 혈액응고 제 9 인자(FIXa)도 많이 생성되는 것으로 나타났다.
[표 3] 무혈청 배지의 칼슘이온 ( Ca 2 + ) 농도에 따른 혈액응고 제 9 인자 생산특성 비교
Figure pat00003

실시예 11: 활성형 혈액응고 제 9 인자 최대 생산을 위한 최적배양 조건
활성형 혈액응고 제 9 인자의 최대 생산을 위하여 상기 실시예에서 효과적이었던 배양조건들을 복합적으로 적용하여 활성형 혈액응고 제 9 인자 생산공정을 확립하였다. 우선 효모 가수분해산물 2.5 ∼ 5 g/L 과 칼슘이온 공급원으로서 염화칼슘(CaCl2) 1.0 ∼ 1.3 mM 을 첨가한 GC-P1 무혈청 배지에 초기 접종농도를 최적 접종농도인 5x105 세포/ml (일반 접종농도: 2x105 세포/ml)로 조정하고 적절한 고삼투압 조건(350∼388 mOsm)하에서 배양하였다. 그 결과 GC-P1 기본배지에서 배양한 것에 비해 활성형 혈액응고 제 9 인자의 생산량은 약 2.2∼3.5 배 정도 증가되었다(표 4).
[표 4] 무혈청 배지에 배지첨가물 , 배양환경 조건 등의 복합적( combinational ) 조절에 의한 혈액응고 제 9 인자 최적 생산공정 특성분석
Figure pat00004
본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 당 분야의 숙련자는 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있다.
본 특허에서 제시한 방법처럼 가수분해산물들을 적절히 조합 선택하여 사용함으로써 혈액응고 제 9 인자를 포함한 재조합 단백질의 생산성을 높일 수 있다. 또한 적절한 가수분해산물의 사용, 적절한 삼투압 처리, Ca2 + 농도 최적화 및 이들 조건의 최적화 공정개발을 통해 활성형 혈액응고 제 9 인자(aFIX)의 생산을 극대화할 수 있다.
이러한 공정은 혈액응고 제 9 인자와 유사한 특성을 갖는 재조합 단백질의 생산성이나 활성형 인자의 분비를 높이기 위하여 사용될 수 있다. 특히 비타민 K 의존적 재조합 단백질들(혈액응고 제 5 인자, 제 7 인자, 제 9 인자, 단백질 C, 단백질 S 등)을 발현하는 세포주의 배양에 이용할 경우 활성형 단백질 생산 증가에 응용될 수 있을 것이다.
<110> Mogam Biotechnology Research Institute <120> METHOD FOR MANUFACTURING ACTIVE RECOMBINANT BLOOD COAGULATION FACTOR IX <130> FPL/201205-0148 <150> US60/944186 <151> 2007-06-15 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence for Human beta-globin MAR Element <400> 1 cctcctgagt agctggggac tacaggtgta catcacatgc ctggctaatt tttttttttt 60 taagtagaga cgaggtcttg ctatgttgtc caggataata tcaaactctt gagctcaagc 120 agtcctccca cttctacctc tccagtgctg gaattacaga catgagccac cactcctggc 180 ttgcagacta tttaaatgac taattcctga cactacttga gggatactag acagtagaca 240 acacatcttt aatataccaa atgggtgact gtagggttga gagggagatt agaattcaat 300 gttttatgac caaaaaggct taaatcaggc acaagcttag gtcttttcaa ctgtgaggac 360 cggactgaaa gtgtgcagtt caaggccctg tagttgctgt ttaactgttc ccaggtggaa 420 gtctcttcaa agaaccactg gtgcaaaaag ggaactacct ggggataaat atttcctcca 480 gaaaggggga aagtgcaagc tcccctacca aaagcaccag gcaagtcctt gtctattttc 540 cctgaagttc tcaaagaaat gagacccttg 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gagccacatg tcttcgatct acaaagttca ccatctataa 1920 caacatgttc tgtgctggct tccatgaagg aggtagagat tcatgtcaag gagatagtgg 1980 gggaccccat gttactgaag tggaagggac cagtttctta actggaatta ttagctgggg 2040 tgaagagtgt gcaatgaaag gcaaatatgg aatatatacc aaggtatccc ggtatgtcaa 2100 ctggattaag gaaaaaacaa agctcactta atgaagatct gttaactcga gaacttgttt 2160 attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 2220 tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 2280 tggatccagg ataatatatg gtagggttca tagccagagt aacctttttt tttaattttt 2340 attttatttt attttgagct gcaggcatgc aagctggcac tggccgtcgt tttacaacgt 2400 cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc 2460 gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc 2520 ctgaatggcg aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca 2580 caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 2640 cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 2700 tacagacaag ctgtgaccgt 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gagaaatggg gagggtagaa ggaaggaaga tagggtaaga 6960 gacagggaag gaggtgtggg gaaagaaatt aaattattct tttctctgtc tcttgaaaga 7020 gctctttcca ttacattgaa tcaaaggtaa tgttgccatt tctggactct tgaaataaag 7080 aaagaccgat gtatgaaatg attttgaaag tctatggcat tttcaaaatg caaggtgatg 7140 tcttactaac tagcctttgc tttattatta gaaatgggga agtgagtata gacattttat 7200 caggagatat attaggaaaa agggaaactg gagaaactgg gaggagtatc cagatgtcct 7260 gtccctgtaa ggtgggggca cccaccttca atcaaaaggg ctccttaaca acttccttgc 7320 ttggggctcc accatcttgg accattagct ccacaggtat cttcttccct ctagtggtca 7380 taacagcagc ttcagctacc tctctaaaga gtcctgccag atataggtca ggaaatataa 7440 tccactaata aaaagagaaa cattttgact gtagttgttt gttttttgtc attgtgacta 7500 tcaataacat tcccactctt tcatcagtaa tcactcaggt tattctgtga ccaacagact 7560 gtgggaaaaa tcagagaagg aggcatcctc atgcttacta gcctaaactg aaattgctat 7620 agcagagtga accagaaggt ttacagatat tttccacaaa gagtaaaagg attgaagcct 7680 tctccagatc aatgcatagg aaataataat ggaccataaa acccatatta tgacgaacaa 7740 cattaggata agtccatatc aatttttaat ccagtcataa gcacagacta cgtgaagcac 7800 gtccaagtga aggcaggaga aatgagagga gcaagaaaga ggagccattt gatcaagaat 7860 agcagaaaaa ggaaaggcaa gtcatattaa caaatgattg tcatgccaac agtacagata 7920 actctgctaa taaaggtaga ggcataatac aggtagtagc agatatctac atagtagtta 7980 aaggacatgg ccatcagtac agaagattcc ataaaggaga acctaaagag gaaaaatcga 8040 taagcttgat ccc 8053 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 5' fragment of FIX intron I <400> 6 gcgtcgaccc ttttttaaaa tacattgag 29 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 5' fragment of FIX intron I <400> 7 cgacgcgtta ccaacctgcg tgctggct 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 3' fragment of FIX intron I <400> 8 cgacgcgtgt actgtgggaa catcacag 28 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 5' fragment of FIX intron I <400> 9 gactagttaa ttctttagtt ttagcaaa 28 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for 5' fragment of FIX in pMSG-FIXI <400> 10 gcgtcgacaa acaaacctgt acattcagca ct 32 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for 3' fragment of FIX in pMSG-FIXI <400> 11 gactagtttc ttttacattt cagtttttct tgatcatgaa 40

Claims (9)

  1. 312 내지 388 mOsm의 삼투압 및 2.6 mM 이하의 칼슘 이온을 갖는 것을 특징으로 하는 동물세포 배양용 무혈청 배지에서, 인간 혈액응고 제 9 인자를 발현하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하는, 인간 혈액 응고 제 9 인자를 생산하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 삼투압이 350 내지 388 mOsm인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 칼슘 이온이 1.0 내지 1.3 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터가 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 인간 베타 글로빈 MAR 엘리먼트(human β-globin MAR element) 뉴클레오티드 서열; 및 인간 혈액응고 제 9 인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 본래의 인트론 1 대신에, 인트론 1의 5'-말단 스플라이싱 공여체를 갖는 141 bp 내지 981 bp 길이의 뉴클레오티드 서열과 인트론 1의 3'-말단 스플라이싱 수용체를 갖는 157 bp 내지 444 bp 길이의 뉴클레오티드 서열을 연결한 인트론 1 의 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 인트론 1의 절편이 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 재조합 발현 벡터가 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 CHO, BHK 또는 COS7 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가 퓨린(furin), 분비형 퓨린 및 카복실레이즈를 각각 발현하는 발현벡터로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 벡터로 추가로 형질전환된 것임을 특징으로 하는 방법.
  9. 312 내지 388 mOsm의 삼투압 및 2.6 mM 이하의 칼슘 이온을 갖는, 인간 혈액응고 제 9 인자 생산용 무혈청 배지.
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