KR20120073265A

KR20120073265A - 황화수소 산생 효소 저해제

Info

Publication number: KR20120073265A
Application number: KR1020127008514A
Authority: KR
Inventors: 사나에 기쿠치; 아츠시 나리세; 고지 사쿠라이
Original assignee: 가부시키가이샤 롯데
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2010-09-01
Publication date: 2012-07-04
Also published as: WO2011027551A1; JP2011051946A; TW201124135A; CN102482662A

Abstract

황화수소 발생의 억제를 목적으로 하고, 특히, 황화수소 산생 효소 저해제를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명자들은 예의 연구의 결과, 카테킨류가 황화수소 산생 효소 저해 활성을 갖는 것을 알아내어 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 카테킨류를 유효 성분으로 하는 황화수소 산생 효소 저해제를 제공한다.

Description

황화수소 산생 효소 저해제{HYDROGEN SULFIDE-PRODUCING ENZYME INHIBITOR}

본 발명은 카테킨류를 유효 성분으로 하는 황화수소 산생 효소 저해제에 관한 것이다.

황화수소는 자극취를 갖는 기체이고, 피부 점막을 자극하고, 또, 호흡 마비를 일으키는 등의 독성이 알려져 있다. 그 독성은 사회적으로도 문제시되어 있어, 황화수소의 제거가 바람직하다. 황화수소는 자연계에서는, 화산 가스나 온천 등에 포함되고, 인위적으로는 석유 화학 공업 등에 의해 발생한다. 또, 혐기성 세균 등에 의해 황 화합물이 환원되어 황화수소가 발생되는 경우가 있고, 예를 들어, 오물이나 배수 등에 혐기성 세균이 번식되어, 황화수소가 발생하는 경우가 있다. 또, 황화수소를 발생시키는 세균 중에는, 구강 내 세균이나, 장 내 세균으로서, 생체 내에 생식하는 것도 있다. 이들 세균은 음식 잔류물이나 생체 내의 단백질을 원료로 하여 황화수소를 발한다. 나아가서는, 생체 내에서는 내인성의 황화수소가 산생되는 경우도 알려져 있다.

황화수소의 독성의 기구는 황화수소의 반응성의 높이에 따른 피부 점막에 대한 자극, 및, 시토클롬 c 옥시다아제의 저해가 알려져 있다. 시토클롬 c 옥시다아제 저해 작용은 급속히 발생하기 때문에, 고농도의 황화수소에 노출되었을 경우, 급속히 폐의 산소 분압이 저하되어, 졸도에 이른다. 또, 황화수소는 뇌 내에서 NMDA 수용체의 활성을 증강시킨다고 한다 (비특허문헌 1).

상기 서술한 바와 같이, 황화수소는 구강 내 세균이나 장 내 세균에 의해서도 발생한다. 구강 내 세균이나 장 내 세균에 의해 발생하는 황화수소는 자연계나, 공업 레벨에서 발생하는 황화수소와 비교하면 소규모이긴 하다. 그러나, 생체 내에서 황화수소가 발생되면, 그 개체는 매우 폐쇄된 상태에서 황화수소에 노출되게 되어, 그 영향은 직접적이다. 또, 발생된 황화수소는 구취나, 장 내 가스취와 같은, 꺼려서 피하게되는 불쾌취를 야기시킨다. 따라서, 구강 내 세균이나 장 내 세균에 의해 발생하는 황화수소는 그 저해 혹은 억제가 갈망되고 있다. 또한, 호기 중의 휘발성 황화물 (VSC) 중, 약 90 ％ 는 황화수소, 메틸메르캅탄 및 황화디메틸이 차지하여, 황화수소는 구취의 주된 원인 중 하나라고 할 수 있다.

구강 내에서는, 구강 내의 탈락 상피 세포나 백혈구, 음식 잔류물 등이 세균 유래의 프로테아제에 의해 시스테인이나 메티오닌 등의 함황아미노산에 분해되고, 그 후 황화수소 산생 효소나 메티오니나아제에 의해 황화수소가 산생되는 것이다. 구강 내의 황화수소 산생 효소에 있어서는 시스테인데술프하이드라아제나 시스타티오닌 β-신타아제 등이 보고되어 있다.

특허문헌 1 은 슈도모나스속 세균이나, 대장균이 정제하는 휘발성 황 화합물 생성 억제제를 개시한다. 그러나, 그 저해제는 특정한 알데히드, 운데세날, 지환식 케톤 등의 향료를 유효 성분으로 하는 하우스 홀드 제품에 사용하는 것이 목적이 되는 저해제로, 인체 등에 안전하게 사용할 수 있는 것은 아니다.

특허문헌 2 는 수용성 난소화성 당질을 유효 성분으로서 함유하는 장 내 황화수소 저감 조성물을 개시한다. 그러나, 특허문헌 2 의 장 내 황화수소 저감 효과는 장 내에 한정된 것으로, 그 저감의 기구에 대해서도 불명확하다.

특허문헌 3 은 생체 내에서의 황화수소의 산생을 저해하고, 억제하는 진통용 조성물을 개시한다. 그러나, 특허문헌 3 의 DL-프로파르길글리신 및 β-시아노알라닌을 포함하는 진통용 조성물은 시스타티오닌 γ-리아제를 저해시켜, 생체 내의 내인성의 황화수소의 산생을 억제하는 것이다.

비특허문헌 4 는 카테킨 유도체가 포르피로모나스?진지바리스 유래의 프로테아제를 저해하는 것을 나타내는 것이다. 그러나, 황화수소 산생 효소의 저해 에 대해서는 개시도 시사도 없다.

비특허문헌 5 는 녹차 카테킨이 메탈로프로테아제를 저해하는 것을 나타내는 것이다.

그러나, 황화수소 산생 효소의 저해에 대해서는 개시도 시사도 없다.

일본 공개특허공보 2008-173441호 일본 공개특허공보 2007-99672호 일본 공개특허공보 2007-112735호

Abe, K, Kimura H, J. Neurosci. 16, 1066-71, 1996 Persson S, Edlund M-B, Claesson R, Carlsson J: Oral Microbiol Immunol.1990;5:195-201, Tanaka M, Yamamoto Y, Kuboniwa M, Nonaka A, Nishida N, Maeda K, Kataoka K, Nagata H, Shizukuishi S: Microbes and Infection 2007; 6: 1078-1083 Okamoto M, Sugimoto A, Leung K-P, Nakayama K, Kamaguchi A, Maeda N: Oral Microbiol. Immunol. 2004; 19: 118-120 Demeule M, Brossard M, Page M, Gingras D, Beliveau R: Biochim Biophys Acta. 2000;1478:51-60.

황화수소 발생의 억제를 목적으로 하고, 특히, 황화수소 산생 효소 저해제를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서, 부작용이 없고 안전성이 높아 예로부터 이용되는 녹차 유래 성분에 주목하여, 세균의 황화수소 산생에 대한 저해 시험을 실시한 결과, 카테킨류가 황화수소 산생 효소 저해 활성을 갖는 것을 알아내어 본 발명을 완성시켰다.

본 발명에 의하면, 카테킨류를 유효 성분으로서 사용함으로써, 황화수소 산생 효소를 효과적으로 저해하여, 황화수소의 산생을 저해하고, 억제할 수 있다.

또, 카테킨류는, 녹차 유래의 성분으로, 안전성이 높고, 이미지가 좋다. 따라서, 카테킨류를 유효 성분으로 하는 황화수소 산생 효소 저해제는 소비자에게 받아들여지기 쉽다.

도 1a 는 비색 분석에서 얻어지는 시스테인데술프하이드라아제 및 메티오니나아제에 대한 EGCg 및 염화아연의 저해 활성의 결과를 나타낸다. 도 1a 는 F.n 의 결과이다.
도 1b 는 비색 분석에서 얻어지는 시스테인데술프하이드라아제 및 메티오니나아제에 대한 EGCg 및 염화아연의 저해 활성의 결과를 나타낸다. 도 1b 는 P.g 의 결과이다.
도 1c 는 비색 분석에서 얻어지는 시스테인데술프하이드라아제 및 메티오니나아제에 대한 EGCg 및 염화아연의 저해 활성의 결과를 나타낸다. 도 1c 는 T.d 의 결과이다.
도 2a 는 가스 크로마토그래피에 의한 분석에서 얻어지는 황화수소 산생 효소 및 메티오니나아제에 대한 EGCg 및 염화아연의 저해 활성의 결과를 나타낸다. 도 2a 는 F.n 의 결과이다.
도 2b 는 가스 크로마토그래피에 의한 분석에서 얻어지는 황화수소 산생 효소 및 메티오니나아제에 대한 EGCg 및 염화아연의 저해 활성의 결과를 나타낸다. 도 2b 는 P.g 의 결과이다.
도 2c 는 가스 크로마토그래피에 의한 분석에서 얻어지는 황화수소 산생 효소 및 메티오니나아제에 대한 EGCg 및 염화아연의 저해 활성의 결과를 나타낸다. 도 2c 는 T.d 의 결과이다.

본 발명은 카테킨류를 유효 성분으로 하는 황화수소 산생 효소 저해제를 제공한다.

카테킨 (catechin) 은 좁은 의미로는 C₁₅H₁₄O₆, 분자량 290.27 의 목본식물의 목심에 많이 함유되는 수용성 다가 페놀을 가리키고, 넓은 의미로는 그 유도체가 되는 폴리페놀을 포함한다. 본 명세서에서는, 정의를 명확하게 하기 위해, 카테킨은 좁은 의미의 카테킨을 가리키고, 카테킨류라고 하는 경우에, 카테킨 및 그 유도체가 되는 일련의 폴리페놀을 가리키는 것으로 한다. 카테킨류는 특히 차에 함유되는 차 카테킨이 알려져 있다. 카테킨류로서 (＋)-카테킨, (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨, (-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트, (-)-가로카테킨갈레이트, (-)-카테킨갈레이트 등이 알려져 있다.

본 발명의 제 2 는 카테킨류가 (-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트, (-)-가로카테킨갈레이트, (-)-카테킨갈레이트 혹은 이들의 혼합물을 유효 성분으로 하는 황화수소 저해제를 제공한다.

본 발명의 제 3 은 (-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트, (-)-가로카테킨갈레이트, (-)-카테킨갈레이트 중 어느 것, 혹은 이들의 혼합물을 유효 성분으로 하는, 푸소박테리움?뉴글레아튬 (Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스?진지바리스 (Porphyromonas gingivalis), 또는 트레포네마?덴티콜라 (Treponema denticola) 유래의 황화수소 산생 효소를 저해하는 황화수소 산생 효소 저해제를 제공한다.

푸소박테리움?뉴글레아튬, 포르피로모나스?진지바리스, 트레포네마?덴티콜라는 모두, 구강 내 세균으로서 알려져 있고, 황화수소나 메틸메르캅탄의 산생 능력이 높은 것, 또 치주 병균으로서도 알려져 있다 (비특허문헌 2, 비특허문헌 3).

또, 본 발명은 상기 황화수소 산생 효소 저해제를 함유하는 음식품을 제공한다. 음식품이란, 신선 식품, 고기, 생선 등의 동물성 식품, 곡물, 야채 등의 식물성 식품, 유제품, 빵, 인스턴트 식품 등의 가공 식품, 과자류 등의 기호 식품, 감미료, 조미료 등의 조리 조미용 재료, 건강 식품, 특별 용도 식품, 물, 청량 음료수, 알코올 음료, 차 등의 음료, 식품 가공 재료, 식품 첨가물 등을 포함한다.

나아가서는, 본 발명은 상기 황화수소 산생 효소 저해제를 함유하는 구강용 조성물을 제공한다. 구강용 조성물로서 크림 치약, 액체 치약, 액상 치약, 윤제 치약 등의 치약류, 세구제, 마우스워시, 트로치제, 츄잉껌 등의 형태를 취할 수 있다.

이하에 본 발명의 예를 들어 설명하는데, 본 발명의 범위는 이하의 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

황화수소 산생 효소 및 메티오니나아제에 대한 카테킨류의 효소 저해 활성에 관한 시험을 실시하였다. 즉, 기질로서, 시스테인 및 메티오닌을 사용하고, 푸소박테리움?뉴글레아튬, 포르피로모나스?진지바리스, 트레포네마?덴티콜라 유래의 조 (粗) 효소액을 첨가하여, 각 시약을 혼합하고, 메티오니나아제의 생성물인 α-케토부티르산, 및 메틸메르캅탄, 또는 황화수소 산생 효소의 생성물인 피루브산, 및 황화수소를 정량함으로써, 메티오니나아제 및 황화수소 산생 효소에 대한 저해 활성을 측정하였다.

재료 및 방법

1-1 재료

1-1-1 황화수소 산생 효소 저해제 후보

이하의 시약을 황화수소 산생 효소 저해제 후보로서 사용하였다. 즉, 카테킨류로서 (+)-카테킨, (-)-에피카테킨, (-)-에피갈로카테킨, (-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트, (-)-가로카테킨갈레이트, (-)-카테킨갈레이트 (카테킨류는 나가라 사이언스에서 구입하였다), 및, 갈산, 염화아연을 사용하였다. 이들 저해제 후보는 본 명세서에 있어서, (+)-카테킨 : C, (-)-에피카테킨 : EC, (-)-에피갈로카테킨 : EGC, (-)-에피카테킨갈레이트 : ECg, (-)-에피갈로카테킨갈레이트 : EGCg, (-)-가로카테킨갈레이트 : GCg , (-)-카테킨갈레이트 : Cg, 갈산 : G, 염화아연 : ZnCl₂ 로 약기하는 경우가 있다. 갈산은 살균 활성이 알려져, 그 유도체가 구강용 조성물로서 사용된다. 염화아연은 구취 예방 활성이 알려져 세구제로 사용된다.

1-1-2 사용 균주

황화수소 산생 세균으로서, 푸소박테리움?뉴글레아튬 (본 명세서 중 F.n 으로 약기하는 경우가 있다), 포르피로모나스?진지바리스 (본 명세서 중 P.g 로 약기하는 경우가 있다), 트레포네마?덴티콜라 (본 명세서 중 T.d 로 약기하는 경우가 있다) 를 사용하였다. 균주는 푸소박테리움?뉴글레아튬은 JCM8532 를, 포르피로모나스?진지바리스는 W83, 트레포네마?덴티콜라는 ATCC 의 기탁 번호 35405 의 균주를 사용하였다.

1-2 시험 방법

1-2-1 각 균에 의한 조효소액의 조제

F.n 을 Trypticase Soy Broth (TSB) 15 ㎖ 에 식균하여, 생육이 정상기에 이를 때까지 혐기배양하였다. 또한, Trypticase Soy Broth (TSB) 는, Trypticase Soy Broth (DIFCO) 3 g 과 Yeast Extract (DIFCO) 0.3 g 을 물 100 ㎖ 에 용해 후, hemin (5 ㎎/㎖ in 0.1 N NaOH) 0.1 ㎖ 와 menadione (0.5 ㎎/㎖ in 50 ％ EtOH) 0.1 ㎖ 를 첨가하여 조제되었다.

상기 배양을 전 배양으로 하고, 다시 TSB 200 ㎖ 에 식균하여, 생육이 정상기에 이르고 나서 24 시간 후까지 (배양 기간 2 days), 37 ℃ 에서 혐기배양하였다.

다음으로 배양액을 3,000×g, 10 min, 4 ℃ 에서 원심분리하여 배지 성분을 제거하고, 균체를 회수하였다. 그 후 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) (트리스하이드록시메틸아미노메탄 (분자량 121) 6.05 g 을 물에 용해하고, HCl 에서 pH 7.5 로 조정 후, 1 ℓ 로 메스업하여 조제하였다) 을 첨가하여 다시 원심하고, 균체를 세정 후, 완충액을 제거하고 균체를 -80 ℃ 로 동결시켰다. 또한, 균체를 Tris-HCl 완충액 20-25 ㎖ 중에 현탁시키고, 세포막을 초음파 파쇄하였다 (20 W, 30 sec×15 times, 0 ℃).

이것을 20,000×g, 30 min, 4 ℃ 에서 원심하고, 상청을 조효소액으로 하였다. 조효소액은 DC Protein Assay kit (Pierce) 를 사용하여 단백 정량하고, 시험계에 있어서는 최종 농도 0.3 ㎎ protein/㎖ 가 되도록 희석하여 사용하였다.

P.g 는 F.n 과 동일하게 TSB 배지에서 배양하였다. 또 T.d 는 TYGVS 배지에서 배양하였다. 배양 기간은 7 일간이었다. 조효소액의 조제는 P.g 및 T.d 에 대해서도, F.n 과 동일하게 실시하였다.

또한, TYGVS 배지의 조제는 이하와 같다. 즉,

heart infusion broth 5 g, tryptone 10 g, yeast extract 10 g, 젤라틴 10 g, 황산암모늄 0.5 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO4 0.1 g 을 750 ㎖ 의 수용액으로 하여 pH 7.0 으로 조정 후, 121 ℃ 에서 15 분간 오토클레이브한 I 액,

L-시스테인 HCl 1 g,

글루코오스 1 g,

피루브산나트륨 0.25 g,

VFA 액 (아세트산 1.7 ㎖, 프로피온산 0.6 ㎖, n-부티르산 0.4 ㎖, n-발레르산 0.1 ㎖, 이소발레르산 0.1 ㎖, 이소부티르산 0.1 ㎖, DL-metylbutyric acid 0.1 ㎖ 및 증류수 27.9 ㎖ 를 혼합) 5 ㎖,

TPP 액 (티아민피롤린산 0.25 g 에 증류수 100 ㎖ 를 첨가하여 혼합) 5 ㎖,

1-N KOH 16 ㎖

를 혼합하고, 추가로 물을 첨가하여 50 ㎖ 의 수용액으로 하고 pH 7.2 로 조정 후, 여과 멸균한 Ⅱ 액,

펙틴 1 g 을 증류수 100 ㎖ 로 용해하고, 121 ℃ 에서 15 분 오토클레이브 한 Ⅲ 액의 I 액으로부터 Ⅲ 액과, 또한 불활화한 토끼 혈청 100 ㎖ 를 혼합하여 조제하였다.

1-2-2 비색 정량에 있어서의 황화수소 산생 효소 (시스테인데술프하이드라아제) 저해 시험

황화수소 산생 효소의 일종인 시스테인데술프하이드라아제는 시스테인으로부터 피루브산, 암모니아 및 황화수소를 생성한다. 비색 정량에 있어서의 황화수소 산생 효소 저해 시험에서는, 시스테인을 기질로 하고, 시스테인데술프하이드라아제에 의해 생성하는 피루브산의 양을 지표로 하여, 각 시약의 황화수소 산생 효소에 대한 저해 활성을 비교하였다.

용액의 조제

이하와 같이, 300 mM 시스테인 용액, 효소?보조효소 혼합 용액, 시료 용액, 3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라존 (MBTH) 반응 용액을 조제하였다.

300 mM 시스테인 용액 : 300 mM 이 되도록 시스테인을 Tris-HCl 완충액으로 희석하였다.

효소?보조효소 혼합 용액 : 반응계에서 조효소액의 단백량이 0.3 ㎎/㎖, 피리독살-5'-인산이 0.05 mM 이 되도록 Tris-HCl 완충액으로 시험 직전에 조제하였다.

시료 용액 : 염화아연 또는 카테킨류를 여러가지 농도로 Tris-HCl 완충액으로 희석하였다.

3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라존 (MBTH) 반응 용액 : MBTH 30 ㎎ 을 50 ㎖ 의 증류수에 용해하였다. 그 후, 100 ㎖ 의 1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0) (아세트산나트륨 82.03 g 을 물에 용해하고, 아세트산으로 pH 5.0 으로 조정 후, 1 ℓ 로 메스업하여 조제하였다) 을 첨가하였다.

피루브산의 정량

300 mM 시스테인 용액 0.1 ㎖ 및 시료 용액 0.2 ㎖ 에 효소?보조효소 혼합 용액 0.7 ㎖ 를 첨가하여 37 ℃ 에서 진탕하였다. 1 시간 후, 6 ％ 과염소산 0.5 ㎖ 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 원심분리 (3,000×g, 10 분간, 4 ℃) 후, 상청을 회수하였다.

상청 0.4 ㎖ 에, MBTH 반응 용액 1.2 ㎖ 를 첨가하여, 50 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 반응액은 아세트산나트륨 완충액으로 3 배 희석하여 335 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시험은 2 회 실시하여, 그 평균값을 구하였다. 또 피루브산의 검량선의 작성도 실시하였다.

저해율

저해율은 시료 용액을 넣었을 때의 피루브산량을 P_i, 저해제 용액 대신에 Tris-HCl 완충액을 첨가했을 때의 피루브산량을 P₀ 로 하여 이하와 같이 구하였다.

저해율 (％) = (P₀ - P_i)/P₀×100

1-2-3 비색 정량에 의한 메티오니나아제 저해 시험

시스테인데술프하이드라아제의 대조로서, 메티오니나아제에 대한 효소 저해 활성을 측정하였다. 메티오니나아제는 메티오닌을 기질로하여, 메틸메르캅탄, 암모니아 및 α-케토부티르산을 생성한다. 비색 정량에 의한 메티오니나아제 저해 시험에서는, 메티오니나아제에 의해 생성되는 α-케토부티르산의 양을 지표로 하여, 각 시약의 메티오니나아제에 대한 저해 활성을 비교하였다.

시약의 조제

이하와 같이, 300 mM 메티오닌 용액을 조제하였다. 효소?보조효소 혼합 용액, 시료 용액, 3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라존 (MBTH) 반응 용액의 조제에 대해서는, 상기와 동일하게 실시하였다.

300 mM 메티오닌 용액 : 300 mM 이 되도록 메티오닌을 Tris-HCl 완충액으로 희석하였다.

α-케토부티르산의 정량

300 mM 메티오닌 용액 0.1 ㎖ 및 시료 용액 0.2 ㎖ 에 효소?보조효소 혼합 용액 0.7 ㎖ 를 첨가하여 37 ℃ 에서 진탕하였다. 1 시간 후, 6 ％ 과염소산 0.5 ㎖ 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 원심분리 (3,000×g, 10 분간, 4 ℃) 후, 상청을 회수하였다.

상청 0.4 ㎖ 에, MBTH 반응 용액 1.2 ㎖ 를 첨가하여, 50 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 반응액은 아세트산나트륨 완충액으로 3 배 희석하여 335 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 모든 시험은 2 회 실시하여, 그 평균값을 구하였다. 또 α-케토부티르산의 검량선의 작성도 실시하였다.

저해율

메티오니나아제의 저해율은 시료 용액을 넣었을 때의 α-케토부티르산량을 K_i, 저해제 용액 대신에 Tris-HCl 완충액을 첨가했을 때의 α-케토부티르산량을 K₀ 와 같이 하여 구하였다.

저해율 (％) = (K₀ - K_i)/K₀×100

1-2-4 가스 크로마토그래피에 의한 황화수소 산생 효소 저해 시험

황화수소 산생 효소는 시스테인으로부터 황화수소를 생성한다. 가스 크로마토그래피에 의한 황화수소 산생 효소 저해 시험에서는, 시스테인을 기질로 하여 황화수소 산생 효소에 의해 생성되는 황화수소의 양을 지표로 하여, 각 시약의 황화수소 산생 효소에 대한 저해 활성을 비교하였다.

황화수소의 정량

시험관에 L-시스테인 용액 0.1 ㎖, 시료 (저해제 후보) 용액 0.2 ㎖, 효소-보조효소 혼합 용액 0.7 ㎖ 를 넣고, 고무마개로 밀봉, 37 ℃ 의 수욕에서 교반하면서 보온하였다. 60 분 후, 3 M 인산 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 다시 10 분간 37 ℃ 에서 교반하여 보온하였다. 헤드 스페이스 가스를 F.n 에서는 15 ㎕, P.g 에서는 100 ㎕, T.d 는 50 ㎕ 를 발취하여 가스 크로마토그래피로 황화수소량을 측정하였다. 또한, 분석 조건은 이하와 같았다.

칼럼 : HP-PLOT/Q (φ 0.53 ㎜×30 m)

온도 : 70 ℃ (2.5 min)→30 ℃/min 에서 190 ℃ 까지→190 ℃ (3.5 min)

검출기 : FPD

스플릿비 : 48:1

주입량 : 15, 50 및 100 ㎕

1-2-5 가스 크로마토그래피에 의한 메티오니나아제 저해 시험

황화수소 산생 효소의 대조로서, 메티오니나아제에 대한 효소 저해 활성을 측정하였다. 메티오니나아제는 메티오닌을 기질로 하여, 메틸메르캅탄, 암모니아 및 α-케토부티르산을 생성한다. 가스 크로마토그래피에 의한 메티오니나아제 저해 시험에서는, 메티오니나아제에 의해 생성되는 메틸메르캅탄의 양을 지표로 하여, 각 시약의 메티오니나아제에 대한 저해 활성을 비교하였다.

메틸메르캅탄의 정량

시험관에 L-메티오닌 용액 0.1 ㎖, 시료 용액 0.2 ㎖, 효소-보조효소 혼합 용액 0.7 ㎖ 를 넣고, 고무마개로 밀봉, 37 ℃ 의 수욕에서 교반하면서 보온하였다. 60 분 후, 3 M 인산 수용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 다시 10 분간 37 ℃ 에서 교반하여 보온하였다. 헤드 스페이스 가스를 F.n 에서는 40 ㎕, P.g 및 T.d 에서는 200 ㎕ 를 발취하여 가스 크로마토그래피로 메틸메르캅탄량을 측정하였다. 또한 분석 조건은 상기 서술한 바와 같다.

2-3 결과

2-3-1 비색 정량에 의한 카테킨류에 의한 F.n 의 황화수소 산생 효소 (시스테인데술프하이드라아제) 및 메티오니나아제 저해 시험의 결과

1-2-2 의 결과를 표 1, 2 에, 1-2-3 의 결과를 표 3 에 나타낸다. 카테킨류의 F.n 의 황화수소 산생 효소 (시스테인데술프하이드라아제) 에 대한 저해 활성은 Cg＞GCg＞EGCg＞ECg＞갈산, (＋)-C 의 순서로 높고, 특히 Cg, GCg, EGCg 및 ECg 에 있어서 높은 저해 활성을 가지고 있었다. 카테킨류의 F.n 의 메티오니나아제에 대한 저해 활성은 EGCg＞ECg＞EGC＞EC, 갈산, C 의 순서로 높고, 특히 EGCg 및 ECg 에 있어서 높은 저해 활성을 가지고 있었다. 그 때의 IC50 은 EGCg 에 있어서는 0.4 mM, ECg 에 있어서는 0.8 mM 였다.

2-3-2 비색에 의한 EGCg 의 F.n, P.g 및 T.d 의 효소 저해 시험

1-2-2 의 황화수소 산생 효소 저해 시험 결과 및 1-2-3 의 메티오니나아제 저해 시험 중, EGCg 와 염화아연의 저해 활성을 비교한 것을 도 1 에 나타낸다. 또 IC50 을 표 4 에 나타낸다. 도 1 중, 흰 동그라미는 EGCg 를 검은 동그라미는 염화아연의 결과를 가리킨다. 또한, 염화아연은 구취 예방 활성이 알려져 황화수소 산생 효소 및 메티오니나아제의 억제가 기대되는 물질이다. 도 1 의 결과로부터, 메티오니나아제 저해에 대해서는, F.n, P.g 및 T.d 유래의 어느 경우에도 염화아연에 의한 저해 활성이 EGCg 에 의한 저해 활성을 상회하고 있었다. 한편, 황화수소 산생에 대해서는, F.n, P.g 및 T.d 유래의 어느 경우에도 EGCg 에 의한 저해 활성이 염화아연에 의한 저해 활성을 상회하고 있었다. 표 4 로부터도 동일한 것을 말할 수 있다.

2-3-3 가스 크로마토그래피에 의한 EGCg 의 F.n, P.g 및 T.d 의 효소 저해 시험

1-2-4 의 황화수소 산생 효소 저해 시험 및 1-2-5 의 메티오니나아제 저해 시험 결과를 도 2 에 나타낸다. 또 IC50 에 관해서는 표 5 에 나타낸다. 도 2 의 결과로부터, 메티오니나아제 저해에 대해서는, F.n, P.g 및 T.d 유래의 어느 경우도 염화아연에 의한 저해 활성이 EGCg 에 의한 저해 활성을 상회하고 있었다. 한편, 황화수소 산생에 대해서는, F.n, P.g 및 T.d 유래의 어느 경우에도 EGCg 에 의한 저해 활성이 염화아연에 의한 저해 활성을 상회하고 있었다. 표 5 로부터도 동일한 것을 말할 수 있다.

2-4 실시예 1 의 정리

이상으로부터, 카테킨류, 그 중에서도, GCg, Cg, ECg 및 EGCg 는 황화수소 산생 효소 저해 활성을 갖는 것을 알았다. 특히, 황화수소 산생 효소의 일종인, 시스테인데술프하이드라아제에 대한 저해 활성을 현저하게 갖는 것을 알았다. 또한, EGCg 의 활성은 염화아연의 활성을 크게 상회하는 것을 알았다. EGCg 의 황화수소 산생 효소 저해 활성은 P.g 및 T.d 유래의 조효소액에서 특히 활성이 높고, 이어서, F.n 유래의 조효소액에 있어서 활성이 확인되는 것을 알았다.

실시예 2

본 발명의 카테킨류로 이루어지는 황화수소 산생 효소 저해제를 함유하는 크림 치약, 마우스 스프레이, 트로키, 추잉껌, 캔디, 구미 젤리, 음료를 통상적인 방법으로 제조하였다. 이하에 그들의 처방을 나타냈다. 또한, 이들에 의해 본 발명품의 범위를 제한하는 것은 아니다.

크림 치약의 처방

탄산칼슘 50.0 중량％

글리세린 20.0

카르보옥시메틸셀룰로오스 2.0

라우릴황산나트륨 2.0

향료 1.0

사카린 0.1

EGCg 1.0

클로르헥시딘 0.01

물 잔류

100.0

마우스 스프레이의 처방

에탄올 10.0 중량％

글리세린 5.0

향료 0.05

착색료 0.001

ECg 1.0

물 잔류

100.0

트로키의 처방

포도당 73.3 중량％

젖당 16.0

아라비아검 6.0

향료 1.0

모노플루오로인산나트륨 0.7

GCg 1.0

젖당 2.0

100.0

추잉껌의 처방

껌 베이스 20.0 중량％

설탕 54.7

글루코오스 15.3

물엿 9.3

EGCg 0.2

향료 0.5

100.0

캔디의 처방

설탕 50.0 중량％

물엿 34.0

시트르산 2.0

EGCg 0.6

향료 0.2

물 잔류

100.0

구미 젤리의 처방

젤라틴 60.0 중량％

물엿 20.5

설탕 8.5

식물 유지 4.5

만니톨 3.0

말산 2.0

Cg 1.0

향료 0.5

100.0

음료의 처방

오렌지 과즙 30.0 중량％

이성화당 (異性化糖) 15.24

시트르산 0.10

비타민 C 0.04

향료 0.10

ECg 0.10

물 잔류

100.0

이 출원은 2009년 9월 3일에 출원된 일본 특허 출원 제2009-203689호로부터의 우선권을 주장하는 것으로, 그 내용을 인용하여 이 출원의 일부로 하는 것이다.

Claims

카테킨류를 유효 성분으로 하는 황화수소 산생 효소 저해제.
제 1 항에 있어서,
카테킨류가 (-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트, (-)-가로카테킨갈레이트, (-)-카테킨갈레이트 중 어느 것, 혹은 이들의 혼합물인 황화수소 산생 효소 저해제.
(-)-에피카테킨갈레이트, (-)-에피갈로카테킨갈레이트, (-)-가로카테킨갈레이트, (-)-카테킨갈레이트 중 어느 것, 혹은 이들의 혼합물을 유효 성분으로 하는, 푸소박테리움?뉴글레아튬 (Fusobacterium nucleatum), 포르피로모나스?진지바리스 (Porphyromonas gingivalis), 또는 트레포네마?덴티콜라 (Treponema denticola) 유래의 황화수소 산생 효소를 저해하는 황화수소 산생 효소 저해제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 황화수소 산생 효소 저해제를 함유하는 음식품.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 황화수소 산생 효소 저해제를 함유하는 구강용 조성물.