KR20120010273A

KR20120010273A - 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물 및 그 용도

Info

Publication number: KR20120010273A
Application number: KR1020117029292A
Authority: KR
Inventors: 샤오펭 하오; 리신 구오
Original assignee: 쳉두 캉홍 파마슈티칼 코., 엘티디.
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2012-02-02
Also published as: CN101884637A; WO2010130152A1; EP2431041A1; JP5671524B2; KR101337422B1; EP2431041A4; CN101884637B; JP2012526730A

Abstract

본 발명은 활성성분으로서 에키노시스트산 3-1중량부 및 올레아놀산 1중량부를 포함하는, 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 총 중량이 90.0%-99.9%인 에키노시스트산 및 올레아놀산을 포함하고, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비가 3:1-1:3인 조각자나무 추출물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 추출물의 제조방법 및 용도를 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 조성물의 에키노시스트산 및 올레아놀산의 비율을 조절하여 간독성을 저하시킨다.

Description

심혈관 장애 치료용 약학적 조성물 및 그 용도{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING CARDIOVASCULAR DISORDER AND USE THEREOF}

본 발명은 의료 기술 분야, 특히 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물 및 그 용도에 관한 것이다.

조각자나무[Fructus gleditsiae (Gleditsia sinensis Lam.라고도 알려짐)]는 중국에 널리 분포하며, 우수한 삼림 가치를 가지는 동시에 임상 중국 전통 매약(clinical Chinese traditional patent medicine) 개발에 상당히 넓은 적용 측면을 갖는다. 조각자나무는 다른 개발 조건에서 두 가지 타입의 과실, 즉 성숙하고 비대한 꼬투리인 대조각(Chinese honeylocust fruit; Fructus Gleditsiae Sinensis), 및 발육이 늦고 홀쭉한 꼬투리인 저아조(Chinese honeylocust abnormal fruit; Fructus Gleditsiae abnormalis)를 형성할 수 있다.

판 케후아(Fan Kehua) 등은 심근허혈로 고통받는 개의 심근경색증에 대한 조각자나무 추출물(gleditsiae extract)의 보호를 제안하였다 [Fan Kehua, et al. West China Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006, 21(4): 339-342]. 딩 윤루(Ding Yunlu) 등은 마비된 개에 관상동맥의 결찰로 인한 급성 심근허혈에 대한 보호를 연구하였고, 조각자나무 사포닌이 심근허혈을 개선시키고 심근경색 부위를 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다 [Ding Yunlu, et al. Natural Product Research and Development, 2006, 18: 275-278]. 또한, 딩 윤루 등은 조각자나무 사포닌의 쥐 심근허혈에 대한 효과를 연구하였고, 조각자나무 사포닌이 쥐의 심근허혈을 개선시키고 심근경색 부위 축소에 우수한 효능을 갖는다는 것을 발견하였다 [Ding Yunlu, et al. Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies, 2006, 26(2):110-113].

현재, 하기 문헌은 조각자나무 사포닌의 추출 방법을 포함한다. 명칭 '조각자나무 사포닌 추출물, 그 제조방법 및 용도(A Gleditsia Saponin Extract, Preparation Methods for the same and uses thereof)' 인 중국 특허 출원번호 200910020233.7은 조각자나무 사포닌 추출물, 그 제조방법 및 폐암, 간암, 위암, 대장암, 및 백혈병에의 용도를 개시하였다. 조각자나무 사포닌 추출물은 저아조 또는 대조각을 원재료로 하여 물 또는 에탄올을 이용하여 추출하고 매크로다공성 수지로 정제함으로써 조제되었다. 사포닌의 총 함량은 60% 이상이었고, 조각자나무 사포닌은 주로 다양한 오환원성 트리테르펜 사포닌을 포함하였다. 명칭 '대조각으로부터 트리테르펜산을 추출하는 방법, 트리테르펜산의 의학적 용도 및 그를 포함하는 한의학 약제 제제(A METHOD FOR EXTRACTING TRITERPENIC ACID FROM FRUCTUS GLEDITSIAE, MEDICAL USE OF TRITERPENIC ACID AND CHINESE MEDICINE FORMULATIONS COMPRISING THE SAME)'의 중국 특허 출원번호 02109825.5은 대조각으로부터 트리테르펜산을 추출하는 방법, 트리테르펜산의 의학적 용도 및 그를 포함하는 한방 제제를 개시하였는데, 여기서 대조각 꼬투리는 에탄올 50-70%를 이용한 추출, 탈색, 여과 및 에탄올 재활용, 그리고 나서 탈이온수로 희석하고, 용리에 의하여 매크로다공성 흡착 수지 칼럼에 정제하고, 농축시키고, 건조시켜 총 트리테르페노이드 사포닌을 수득하였다. 이 발명의 추출물은 고지혈증, 지방간, 죽종(atheroma) 등과 같은 질병 치료 및 예방을 위한 약의 제조에 사용될 수 있다.

하오 유 팡(HAO Yu-fang)은 조각자나무 사포닌이 꽤 높은 독성을 가지며, 이는 임상 적용에서의 그 용도를 제한한다는 것을 발견하였다 [HAO Yu-fang, Preparation of Gleditsia Sapogein and Study on its Anti-Myocardial Ischemia Efficacy, Master's Degree thesis, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2006]. 또한, 활성성분인 에키노시스트산이 조각자나무 사포닌에 함유되어 있다. 명칭 '에키노시스트산의 제조방법, 그를 포함하는 약학적 제형 및 그의 새로운 의학적 용도 (A PREPARATION METHOD OF ECHINOCYSTIC ACID, PHARMACEUTICAL FORMULATIONS COMPRISING THE SAME AND NOVEL MEDICAL USE THEREOF)'의 중국 특허 출원 번호 03100676.0에는 조각자나무 사포닌의 산 가수분해로부터 제조된 에키노시스트산은 관상동맥질환, 협심증, 및 심근허혈의 치료에 우수한 효능을 보인다는 것이 개시되어 있다. 현재, 조각자나무 사포게닌에 대한 보고는 약간만 있다. 에키노시스트산 뿐만 아니라, 첸 샤올란(Chen Xiaolan) 등은 두 종류의 사포게닌: 3-히드록시-12-올레아넨-28-오익산 및 3,16-디히드록시-12-올레아넨-28-오익산이 추출, 완전 가수분해, 크로마토그라피 등을 수행하여 대조각의 꼬투리로부터 수득된 조각자나무 사포게닌의 화학적 구조를 보고하였다 [Chen Xiaolan, et al. Studies on Structure of Sapogenins from Pod of Gleditsia sinensis, Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2001, 32(3)]. 그러나, 조각자나무 사포게닌에 대한 현재의 연구는 단일의 활성성분에 기반한 것일 뿐이었다. 약재로부터의 추출물은 다양한 알려진 그리고 알려지지 않은 성분을 함유하고, 또한 조각자나무 사포게닌은 다양한 화합물을 함유하기 때문에, 조각자나무 사포게닌의 활성을 어떻게 충분히 이용하는지가 시급히 해결해야 할 과제이다.

본 발명의 한 실시예는 심혈관 장애를 치료하는 약학적 조성물을 제공하고, 또 다른 실시예는 에키노시스트산(echinocystic acid) 및 올레아놀산(oleanolic acid)을 포함하는 조각자나무 추출물(gleditsiae extract), 그 제조방법 및 용도를 제공한다.

본 발명은 활성성분이 에키노시스트산 3-1중량부 및 올레아놀산 1중량부로 이루어지는, 보다 바람직하게는, 에키노시스트산 3-2중량부 및 올레아놀산 1중량부로 이루어지는, 보다 더 바람직하게는, 에키노시스트산 3중량부 및 올레아놀산 1중량부로 이루어지는, 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

에키노시스트산 및 올레아놀산은 식물 추출물 또는 화학 합성 물질로부터 수득될 수 있다.

본 발명은 또한 심혈관 장애 예방 또는 치료용 약물의 제조에서의 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

상기 약물은 관상동맥질환, 협심증, 심근허혈, 심근경색, 부정맥, 고지혈증 또는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 예방 또는 치료용이다.

본 발명은 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 중량%가 90.0%-99.9%이고 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비가 3:1-1:1인 조각자나무 추출물을 제공한다.

보다 바람직하게는, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비는 3:1-2:1이고, 보다 더 바람직하게는 3:1이다.

또한, 본 발명은

a. 대조각(Fructus Gleditsiae Sinensis) 약재를 준비하고, 상기 약재를 물로 달이고, 여과한 후, 여과액을 농축하는 단계;

b. 상기 농축된 여과액에 물 또는 수성 에탄올과 함께 산을 첨가하여 산의 농도가 2 mol/L이, 임의적 에탄올 함량이 1-45%(v/v)가 되게 하고, 이를 가수분해를 위하여 교반하고 끓인 뒤 가수분해 용액을 여과하고, 수득된 여과 케이크를 용출액의 pH가 6 이상이 될 때까지 정제수를 이용하여 세정하고, 세정된 여과 케이크를 80℃에서 건조하여 조 조각자나무 사포게닌(crude gleditsia sapogenin)을 수득하는 단계;

c. 상기 조 조각자나무 사포게닌을 가열하면서 95% 에탄올에 용해시키고 (95%에탄올의 양은 일부로서의 조 조각자나무 사포게닌의 중량(g)에 대하여 15-40용적(ml)부이다), 약학적으로 허용가능한 활성탄소를 그 안에 첨가하고 (활성탄소의 양은 95% 에탄올의 부피에 대하여 1-4%(w/v)이다), 30분 동안 교반하고 끓인 후, 뜨거운 상태에서 여과하고; 여과액의 pH를 2-6으로 맞춘 뒤 상기 여과액에서 에탄올을 회수한 뒤, 냉각하고 결정화한 후, 수득된 결정을 80℃에서 건조시켜 조각자나무 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 조각자나무 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 심혈관 장애 예방 또는 치료용 약물의 제조에의 상기 조각자나무 추출물의 용도를 제공한다.

상기 약물은 관상동맥질환, 협심증, 심근허혈, 심근경색, 부정맥, 고지혈증 또는 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료용이다.

실험에서, 출원인은 에키노시스트산의 적용시 비교적 강한 독성 부작용을 일으킨다는 것을 발견하였고, 에키노시스트산이 일정 독성을 보일 뿐만 아니라, 조각자나무 사포게닌 (에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 약 70%였다)도 일정 독성 부작용을 나타낸다는 것을 발견하였다. 특히, 하루에 3번, 한 번에 500mg의 조각자나무 사포게닌을 투약한 여섯 명의 실험대상 (남자와 여자 구성 비율 같음) 중 4명(남자와 여자 구성 비율 같음)은 누적 5-11회 투약되었을 때 ALT 및 AST가 모두 증가하였다. 에키노시스트산의 약효를 더 잘 이용하고 그 독성 부작용을 줄이기 위하여, 출원인은 많은 실험 연구 후 중량비 3:1 내지 1:1의 에키노시스트산과 올레아놀산으로 이루어지는 활성성분은 심혈관 장애의 치료에서의 에키노시스트산의 독성 부작용을 줄일 수 있고, 따라서 에키노시스트산의 안전역을 넓히고, 따라서 안전 및 효능을 높일 수 있다는 것을 발견하였다. 동시에, 조각자나무 추출물은 에키노시스트산과 올레아놀산의 총 함량을 조절하고 두 개의 산 간의 중량비를 조절함으로써 조각자나무로부터 제조되고 최적화될 때, 총 함량 90.0-99.9%의 에키노시스트산 및 올레아놀산(에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비 3:1-1:1)을 포함하는 조각자나무 추출물은 상당한 효능으로 심혈관 장애를 치료하고 간독성을 유의적으로 줄이는 것이 가능했다. 또한, 그 생산 비용도 크게 줄었다.

결론적으로, 본 발명은 선행기술에 비하여

1. 에키노시스트산의 간독성은 약학적 조성물의 에키노시스트산 및 올레아놀산 사이의 비율을 조절함으로써 크게 감소하였고, 따라서 심혈관 장애의 치료에 있어서 에키노시스트산이 훨씬 안전해지고 더 효과적이게 되며,

2. 조각자나무 추출물의 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비를 조절함으로써, 에키노시스트산의 간독성을 줄일 뿐만 아니라, 그 생산비용을 상당히 감소시킬 수 있는 최적화된 조각자나무 추출물이 수득되는 장점을 갖는다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 약물 A: 에키노시스트산, B: 올레아놀산, C: 조각자나무 추출물 (에키노시스트산:올레아놀산=1:1), 실시예 2에서 제조한 D: 조각자나무 추출물 (에키노시스트산:올레아놀산=2.1:1), 실시예 3에서 제조한 E: 조각자나무 추출물 (에키노시스트산:올레아놀산=2.4:1), 실시예 4에서 제조한 F: 조각자나무 추출물 (에키노시스트산:올레아놀산=3:1)의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 Z01 그룹의 HE-착색된 대동맥의 병리학적 도면이다(×100).
도 3은 Z02 그룹의 HE-착색된 대동맥의 병리학적 도면이다(×100).
도 4는 Lipitor 그룹의 HE-착색된 대동맥의 병리학적 도면이다(×100).
도 5는 Lipanthyl 그룹의 HE-착색된 대동맥의 병리학적 도면이다(×100).
도 6은 모델 그룹의 HE-착색된 대동맥의 병리학적 도면이다(×100).
도 7은 대조군의 HE-착색된 대동맥의 병리학적 도면이다(×100).

실시예 1 본 발명의 조각자나무 추출물의 제조

약재인 대조각 600g을 달아서, 약 1cm의 짧은 단편으로 쪼개고, 물의 중량의 10배를 이용하여 두 번 달이는데, 제 1 달임은 1.5시간 동안, 제 2 달임은 1시간 동안이다. 제 1 및 제 2 달임으로부터의 여과액을 모으고 감압 하에 상대 밀도 1.05 (상온에서)로 농축시켰다. 물 및 에탄올 뿐만 아니라, 적절한 양의 염산을 농축용액에 첨가하여, 그 결과 만들어진 용액이 농축 용액의 부피보다 4배 큰 부피를 갖고, 2mol/L의 산의 농도, 및 45%(v/v)의 에탄올 함량을 갖게 하였다. 그 결과 만들어진 용액을 3시간 동안 가열하고, 교반하고, 끓여서 가수분해하고, 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6 이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 15.5g의 조(crude) 조각자나무 추출물을 수득하였다. 상기 조 조각자나무 추출물을 에탄올 230ml에 첨가하고, 가열로 용해시키고, 약학적으로 수용가능한 활성탄소 2.3g을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 가열하고, 뜨거운 채로 여과하였다. 여과액을 pH값 2-3으로 조절하였고, 상온에서 24시간 동안 둔 후 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 6.3의 조각자나무 추출물을 수득하였다. 수득된 조각자나무 추출물의 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과 97.78%였고, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 비율은 1:1이었다.

실시예 2 본 발명의 조각자나무 추출물의 제조

약재인 대조각 800g을 달아서, 약 1cm의 짧은 단편으로 쪼개고, 물의 중량의 8배를 이용하여 두 번 달이는데, 제 1 달임은 1.5시간 동안, 제 2 달임은 1시간 동안이다. 제 1 및 제 2 달임으로부터의 여과액을 모으고 감압 하에 상대 밀도 1.10(상온에서)으로 농축시켰다. 염산 및 물의 적절한 양을 농축용액에 첨가하여 그 결과 만들어진 용액이 농축 용액의 부피보다 4배 큰 부피를 갖고, 2mol/L의 산의 농도를 갖게 하였다. 그 결과 만들어진 용액을 3시간 동안 가열하고, 교반하고, 끓여서 가수분해하고, 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6 이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 61.2g의 조 조각자나무 추출물을 수득하였다. 상기 조 조각자나무 추출물을 에탄올 2450ml에 첨가하고, 가열로 용해시키고, 약학적으로 수용가능한 활성탄소 49.0g을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 가열하고, 뜨거운 채로 여과하였다. 여과액을 pH값 3-4으로 조절하였고, 감압 하에 두꺼운 반죽처럼 되도록 농축시키고, 냉각하고, 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 8.5g의 조각자나무 추출물을 수득하였다. 수득된 조각자나무 추출물의 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과 94.11%였고, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 비율은 2.1:1이었다.

실시예 3 본 발명의 조각자나무 추출물의 제조

약재인 대조각 2400g을 달아서, 약 1cm의 짧은 단편으로 쪼개고, 물의 중량의 6배를 이용하여 두 번 달이는데, 제 1 달임은 1.5시간 동안, 제 2 달임은 1시간 동안이다. 제 1 및 제 2 달임으로부터의 여과액을 모으고 감압 하에 상대 밀도 1.20 (상온에서)로 농축시켰다. 염산 및 물의 적절한 양을 농축용액에 첨가하여 그 결과 만들어진 용액이 농축 용액의 부피보다 4배 큰 부피를 갖고, 2mol/L의 산의 농도를 갖게 하였다. 그 결과 만들어진 용액을 3시간 동안 가열하고, 교반하고, 끓여서 가수분해하고, 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6 이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 153.0g의 조 조각자나무 추출물을 수득하였다. 상기 조 조각자나무 추출물을 에탄올 6120ml에 첨가하고, 가열로 용해시키고, 약학적으로 수용가능한 활성탄소 122.4g을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 가열하고, 뜨거운 채로 여과하고; 여과액을 pH값 4-5으로 조절하였고, 감압 하에 850ml로 농축시키고, 냉각하고, 여과하였다; 여과 케이크를 용출액의 pH가 6이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 24.1g의 조각자나무 추출물을 수득하였다. 수득된 조각자나무 추출물의 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과 100.28%였고, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 비율은 2.4:1이었다.

실시예 4 본 발명의 조각자나무 추출물의 제조

약재인 대조각 800g을 달아서, 약 1cm의 짧은 단편으로 쪼개고, 물의 중량의 8배를 이용하여 두 번 달이는데, 제 1 달임은 1.5시간 동안, 제 2 달임은 1시간 동안이다. 제 1 및 제 2 달임으로부터의 여과액을 모으고 감압 하에 상대 밀도 1.10 (상온에서)으로 농축시켰다. 염산 및 물의 적절한 양을 농축용액에 첨가하여 그 결과 만들어진 용액이 농축 용액의 부피보다 4배 큰 부피를 갖고, 2mol/L의 산의 농도를 갖게 하였다. 그 결과 만들어진 용액을 3시간 동안 가열하고, 교반하고, 끓여서 가수분해하고, 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6 이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 51.0g의 조 조각자나무 추출물을 수득하였다. 상기 조 조각자나무 추출물을 에탄올 2040ml에 첨가하고, 가열로 용해시키고, 약학적으로 수용가능한 활성탄소 81.6g을 첨가하고, 30분 동안 교반하고 가열하고, 뜨거운 채로 여과하였다. 여과액을 pH값 5-6으로 조절하였고, 감압 하에 두꺼운 반죽처럼 되게 농축시키고, 냉각하고, 여과하였다. 여과 케이크를 용출액의 pH가 6이상이 될 때까지 정제수로 세정하고, 80℃에서 건조하여 6.2g의 조각자나무 추출물을 수득하였다. 수득된 조각자나무 추출물의 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정한 결과 96.33%였고, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 비율은 3:1이었다.

측정 방법

크로마토그래피 조건: 고성능액체크로마토그래피 사용: Dionex U-3000 및 크로마토그래픽 칼럼: Agilent TC-C18 250×4.6mm(5㎛); 이동상 A로서 아세토니트릴, 이동상 B로서 물(인산을 이용하여 pH를 3.7로 맞춤)을 이용하여, 1.0ml/분의 유속, 30℃의 칼럼 온도, 215mm의 감지 파장으로 하기 표에 따른 구배 용출을 수행함.

크로마토그램은 도 1에 도시되어 있고, 그 데이터는 하기와 같다:

대조 샘플의 제조

상기 제조된 조각자나무 추출물을 크로마토그래피적으로 순수한 메탄올을 이용하여 그 최대 농도까지 용해시키고, 크로마토그래픽 칼럼 Kromasil Cl8 250×20mm(5㎛), 이동상으로서 메탄올:물(인산을 이용하여 pH를 3.7로 맞춤)=85:15을 이용하고, 유속 10.0ml/분, 칼럼 온도 30℃, 및 감지 파장 215nm의 GE AKTA 기본 조제용 고성능 액체 크로마토그래프에 넣었다. 에키노시스트산 또는 올레아놀산의 피크에 해당하는 부분을 각각 수집하고 결정화하여 에키노시스트산(98.5%) 또는 올레아놀산(99.0%)을 수득하였다.

에키노시스트산: 백색 침상 결정, m.p.305-307.5℃

IRmaxcm-1: 3572, 3388, 3209, 2641 (알코올 히드록실-OH의 신축 진동에 의해 야기됨); 2947, 2925, 2866 (메틸); 1692, 1679 (카르복실기의 C=O의 신축 진동에 의해 야기됨); 1465, 1449, 1368, 1363, 1307 (카르복실); 1286, 1333, 1235 (헥사카본 링); 1140, 1204, 1187, 1029, 998, 979, 965, 950, 816 (에틸렌 결합); 788, 744

EI-MSm/z (%): 471 (M-H+: 100), 453 (M-H+: 55.0), 441 (M-H+: 80.0), 425 (M-H+: 92.0), 407 (M-H+: 100)

¹HNMR (DMSO-d6, δ: 0.67-1.95 (41H: -CH₂-, -CH<, -CH₃)； 2.21 (1H: -CH₂-)； 2.88-3.00 (2H: -CH<)； 4.32-4.71 (2H:-CH<)； 5.20 (1 H: -CH<)； 12.01 (1H: -COOH)

¹³CNMR (DMSO-d6, δ: 38.17 (C-1), 27.02 (C-2), 76.89 (C-3), 38.42 (C-4), 54.97 (C-5), 18.00 (C-6), 32.70 (C-7), 38.96 (C-8), 46.23 (C-9), 36.63 (C-10), 22.90 (C-11), 121.25 (C-12), 143.98 (C-13), 41.04 (C-14), 35.21 (C-15), 72.98 (C-16), 47.30 (C-17), 40.10 (C-18), 46.38 (C-19), 30.26 (C-20), 34.69 (C-21), 31.50 (C-22), 28.28 (C-23), 16.08 (C-24), 15.25 (C-25) 16.85 (C-26), 26.50 (C-27), 178.24 (C-28), 32.92 (C-29), 24.20 (C-30).

올레아놀산: 백색 침상 결정, mp 307℃ -308℃, (α) 20D + 73°.

¹HNMR (DMSO-d6, δ: δppm: 5.16 (m), 3.36 (t), 1.09 (s, Me), 0.91 (s, Me), 0.84 (s, Me), 0.81 (s, Me), 0.80 (s, Me), 0.71 (s, Me), 0.67 (s, Me).

¹³CNMR (DMSO-d6, δ: 38.5 (C-1), 27.19 (C-2), 76.8 (C-3), 38.22 (C-4), 54.7 (C-5), 18 (C-6), 32.85 (C-7), 39.66 (C-8), 47 (C-9), 37 (C-10), 23.36 (C-11), 121.53 (C-12), 143.82 (C-13), 41.31 (C-14), 25.99 (C-15), 22.86 (C-16), 45.66 (C-17), 41.3 (C-18), 45.68 (C-19), 30.19 (C-20), 33.31 (C-21), 32.41 (C-22), 28.21 (C-23), 15.15 (C-24), 16.1 (C-25), 16.8 (C-26), 26.99 (C-27), 178.6 (C-28), 32.1 (C-29), 22.6 (C-30).

실시예 5 본 발명 약물의 캡슐의 제조

조각자나무 추출물 500g, 락토오스 1600g, 녹말 340g, 및 카르복시메틸스타치 나트륨 50g을 균일하게 혼합하고, 적절한 양의 70% 에탄올을 이용하여 과립화하고, 건조하고, 스테아린산마그네슘 10g과 혼합하고, 수득된 혼합물을 캡슐 당 250mg씩 캡슐 번호 1로 캡슐화하였다.

실시예 6 본 발명 약물의 정제의 제조

조각자나무 추출물 400g, 미세결정셀룰로스 800g, 락토오스 500g, 폴리비닐피롤리돈 K30 125g, 크로스카르멜로스 나트륨 125g, 및 실리시독시둠(SiliciiDoxydum) 40g을 균일하게 혼합하고, 적절한 양의 50% 에탄올을 이용하여 과립화하고, 건조하고, 스테아린산마그네슘 10g과 혼합하고, 정제 당 200mg로 정제로 압축하였다.

조각자나무 추출물 대신 각각 에키노시스트산 (자체제조, 순도 98.5%) 300.4g 및 올레아놀산 (자체제조, 순도 99.0%) 99.6g, 또는 에키노시스트산 (자체제조, 순도 98.5%) 200.5g 및 올레아놀산 (자체제조, 순도 99.0%)199.5g을 이용하여 상기 과정에 따라 다른 종류의 정제를 조제하였다.

실시예 7 본 발명의 약학적 조성물의 제조

에키노시스트산 (상기 제조한 것, 순도 98.5%) 300.4g, 올레아놀산 (상기 제조한 것, 순도 99.0%) 99.6g, 미세결정셀룰로스 1815g, 도데실 황산나트륨 50g, 가교된 폴리비닐피롤리돈 100g, 및 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 125g을 균일하게 혼합하고, 적정량의 정제수를 이용하여 결정화하고, 건조하고, 스테아린산마그네슘 10g으로 혼합하고, 이 혼합물을 캡슐 당 250mg씩 캡슐 번호 1로 캡슐화하였다.

에키노시스트산 (상기 제조한 것, 순도 98.5%) 200.5g 및 올레아놀산 (상기 제조한 것, 순도 99.0%) 199.5g을 이용하여 상술한 과정에 따라 다른 종류의 캡슐을 제조하였다.

비교예: 조각자나무 사포게닌을 하오 유팡(HAO Yufang), "Preparation of Gleditsia Sapogenin and Study on its Anti-Myocardial Ischemia Efficacy," Master's Degree thesis, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2006에 설명된 조각자나무 사포게닌 추출 방법에 따라 제조하였다. 대조각의 건조 약재의 무게를 달아서 덜고, 약 1cm의 짧은 단편으로 쪼개고, 역류 하에 75% 에탄올로 세 번 추출하였는데, 세 번의 추출에 사용된 에탄올의 양은 조 약물의 중량의 6배, 5배, 5배(v/w)이고, 시간은 각각 3시간, 2시간, 1.5시간이었다. 세 번의 추출로부터의 추출물을 모으고, 감압 하에 농축시켜 상대 밀도가 1.20-1.30이 되게 하고 (50℃에서 측정), 감압 하에 건조시켜 (80℃) 조각자나무 사포닌을 수득하였다. 그 결과 생성된 조각자나무 사포닌을 조각자나무 사포닌의 중량의 12배의 부피(v/w)의, 2mol/L 염산을 함유하는 에탄올 용액 (에탄올의 농도는 45%) 에서 100℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 가수분해 산물을 여과하고 가수분해 생성물을 폐기하였다. 여과 케이크를 중성이 될 때까지 탈이온수로 세정하고, 건조하여 조 조각자나무 사포게닌을 수득하였다. 그리고 나서, 조 조각자나무 사포게닌을 그 중량의 40배의 부피(v/w)를 갖는 95% 에탄올에 용해시키고, 그 용액을 가열하여 끓게 하고 여기에 1%의 약학적으로 수용가능한 활성탄소(용액의 부피에 대하여)를 첨가한 뒤, 뜨거운 동안 여과하였다. 여과액을 감압 하에 농축시켜 여과액으로부터 에탄올을 회수하고, 고체를 건조시켜 (80℃) 조각자나무 사포게닌을 수득하였다. 총 세 개의 배치가 조제되었고 실험 결과를 표 1에 나타낸다.

표 1

비교 과정으로부터의 세 배치의 실험 결과

사포게닌의 평균 수율은 2.25%, 에키노시스트산의 평균 함량은 55.53%, 올레아놀산의 평균 함량은 20.23%, 에키노시스트산과 올레아놀산의 평균 총 함량은 75.76%였다.

비교 공정은 하기의 단점이 내재한다:

a. 많은 양의 에탄올이 추출 및 가수분해 과정에 사용되어, 생산비용이 증가한다.

b. 감압 하의 건조 과정이 모액의 혼합물에서 수행되어, 안전하지 않을 뿐만 아니라 산업적 생산에 적합하지 않다.

c. 제조된 사포게닌은 다른 성분 및 불순물을 20% 이상 함유한다.

d. 수득된 사포게닌은 회색빛이 나는 백색 파우더이고, 제조시 물, 알코올등과 같은 용매에 노출되면 어두운 갈색으로 변하고, 이는 환자의 순응도가 증가되는 새로운 복용 형태, 예를 들어 구강 붕해 정제, 지속 및/또는 조절 제제 등과 같은 복용 형태의 개발에 불리하다.

비교 공정에 비하여, 본 발명의 조각자나무 추출물 제조방법은 추출 공정의 조건 예를 들어 가수분해의 pH값, 사용되는 약학적으로 수용가능한 활성탄소의 양 등을 조절하여 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 및 둘 사이의 중량비를 조절할 수 있다. 본 발명의 조각자나무 추출물 제조방법은 하기와 같은 장점을 갖는다:

a. 추출 과정에서, 추출 용매로서 물이 알코올 대신 사용되며, 가수분해 과정은 알코올 없이 수행될 수 있어서 제조비용을 크게 줄인다.

b. 직접적 가수분해가 감압 하에 건조 과정 대신에 사용되는데, 이는 에너지 소비를 줄이고 생산 효율성을 높이며, 알코올 없이 산가수분해가 이루어지는데, 이는 제조비용을 줄인다.

조각자나무 추출물의 산업적 제조는 상기 두 장점에 의해 가능해진다. 즉, 증가된 생산 효율 및 감소한 제조비용 뿐만 아니라 향상된 제조상 안전성은 조각자나무 추출물이 보다 많은 환자를 돕는 약제로 더 개발될 수 있게 한다.

c. 본 발명의 조각자나무 추출물은 백색 또는 미색의 결정이고, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 90% 이상인데, 이는 크게 향상된 질의 매우 순수한 조각자나무 추출물이 추출물 표준 확립 및 시장 경쟁의 필요에 따른 다양한 새로운 제형의 개발에 유리하다는 것을 가리킨다.

d. 증진된 방법은 조각자나무 추출물의 질을 크게 향상시키고 그 질에 대한 안정성 및 제어성을 증진시켜 약제 개발에 보다 유리하다.

본 발명의 다른 유리한 효과는 하기 독성 테스트 및 약력학 테스트에 의해 설명될 것이다.

시험예 1 본 발명의 약학적 조성물과 에키노시스트산 간의 독성 테스트 비교

재료 및 방법

동물: 몸무게 9-11kg의 6-8개월령 통상적이고 건강한 다 자란 비글 개(Beagle canines), 수컷과 암컷이 균등하게 구성됨.

약제: Z01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 실시예 4의 방법으로 제조, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 99%), 자체제조(in-house made) 미색 정제, 로트 넘버: 090205; Z02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 실시예 1의 방법으로 제조, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 양은 추출물 양의 94.2%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090206; 자체제조 에키노시스트산 EA (에키노시스트산 98.5% 함유), 순백색 파우더, 로트 넘버: 090107; 생리 식염수, 무색 정화액, Chengdu QingShan LiKang Pharmarceutical co., Ltd.사 제조, 로트 넘버: A0803025; 알라닌 트랜스아르미나제(ALT) 키트, Sichuan MiKe Science & Technology Co., Ltd.사 제조, 로트 넘버: 1007071.

주요 기기: 완전 자동 혈액 생화학 분석기 (Roche Integra 400 Plus, Switzerland), 완전 자동 혈액 분석기 (Abbott CELL-DYN 3700SL, USA), 완전 자동 혈액 응고 분석기 (SYSMEX CA-500, Japan), 4개 채널의 생리적 기록 시스템(RM6240, Chengdu Instrument Factory, China), 전자 저울 등.

과정: 정상의 비글 개를 2주 동안 격리하고 이상 인자를 나타낸 개는 불합격시켰다. 선택된 개를 10 그룹으로 임의로 나누었다: 대조군, Z01 낮은 복용량 그룹 (에키노시스트산의 복용량, 50 mg/kg), Z01 중간 복용량 그룹 (에키노시스트산의 복용량, 150 mg/kg), Z01 높은 복용량 그룹 (에키노시스트산의 복용량, 250 mg/kg), Z02 낮은 복용량 그룹 (에키노시스트산의 복용량, 50 mg/kg), Z02 중간 복용량 그룹 (에키노시스트산의 복용량, 150 mg/kg), Z02 높은 복용량 그룹 (에키노시스트산은 250 mg/kg), 낮은 복용량 그룹 (50mg/kg), EA 중간 복용량 그룹 (150mg/kg), EA 높은 복용량 그룹 (250mg/kg). 한 그룹 당 8마리, 수컷과 암컷이 균일하게 구성됨. 각 그룹의 모든 개는 하루에 한 번씩 21일 연속으로 부피 10 ml/kg을 위내로 투여하였다. 투여 전 및 투여 21일째 후, 아침에 자연적으로 배설된 소변의 샘플 및 앞다리 정맥에서 뽑은 피를 각각 일상의 소변(urine routine), 일상의 혈액(blood routine), 응고 시간 측정을 위하여 수집하였는데, 그 동안에 lead II 심전도를 추적하였다. 투여 전 및 제 1 투여 후 4일, 7일, 14일, 21일에, 혈액 샘플을 개 앞다리 정맥으로부터 수집하여 간 기능 관련 생화학적 지표에 대하여 검사하였다. 마지막 투여 후 24시간이 지난 뒤, 각 그룹의 동물을 해부하여 조직적으로 부검하고, 육안으로 관찰하였다. 실질 기관(parenchymal organs)의 무게를 달고, 장기 계수를 계산하고, 병리조직학적으로 검사하였다. 실험의 데이터는 소프트웨어 패키지 SPSS 11.5를 이용하여 처리하였고, 평균±표준편차(

)로 나타냈다. 다수의 그룹 사이의 비교는 일원분산분석에 의하여 테스트하였고, 두 그룹 사이의 비교는 t-테스트로 테스트하였다. 병리학적 결과를 기술적으로 논의하었다. 상세한 결과를 표 1에 나타내었다.

결과:

1. 시험된 동물의 생화학적 테스팅 및 ALT 결과

표 1의 결과는 단일 성분으로서 에키노시스트산을 투여한 그룹에게는 복용량 50, 150, 250mg/kg로 투여한 세 그룹의 혈액 내의 알라닌트랜스아미나제 모든 수치가 투여 7일째에 증가하였고 21일째까지 유지되었으며, 알라닌트랜스아미나제의 수치의 증가 정도는 에키노시스트산의 복용량에 의존하였다. 투여 후, 150 및 250mg/kg로 투여한 두 그룹의 혈액 내 알라닌트랜스아미나제 수치는 개의 정상 범위 이상이었다. Z01 그룹 (에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비 = 3:1)에 대하여는, 50 및 150mg/kg의 복용량으로 에키노시스트산을 투여한 그룹의 알라닌트랜스아미나제 (ALT) 수치는 투여 후 크게 영향받지 않은 것으로 나타난 반면; 250mg/kg 복용량으로 에키노시스트산을 투여한 그룹은 투여 7일 째에 증가하는 추세를 보였고, 투여 14일 째에 가장 높은 값에 도달했으나 (개의 정상 범위 이상), 투여 21일 째에 약간 감소하였다. 세 개의 Z02 그룹에 복용량 50, 150, 250mg/kg로 에키노시스트산 투여 (에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비 1:1) 후 알라닌트랜스아미나제의 수치는 크게 영향받지 않았다.

2. 다른 테스트 및 결과

투여 동안, 몇 마리의 동물만이 구토, 설사 등의 증상을 보였다. 다른 이상 징후는 각 동물에게서 관찰되지 않았으며, 동물들의 몸무게는 투여 전과 비교하여 크게 변하지 않았다. 일상의 소변, 일상의 혈액, 및 응고-시간 측정, lead II 심전도 및 모든 모니터링 포인트에서의 ALT를 제외한 다양한 생화학적 지표로부터의 모든 테스트 결과는 투여 전 및 대조군과 비교하여 크게 변하지 않았으며, 이 결과는 통계적 유의도 면에서 의미가 없다.

3. 결론: 실험에서 세 가지 약제에 설정된 복용량은 에키노시스트산의 함량에 기초하였다. 즉, 낮은, 중간, 높은 복용량 그룹의 에키노시스트산 함량은 각각 50, 150, 250 mg/kg이었다. 이러한 실험의 결과는 에키노시스트산이 혈액 내의 ALT 수치를 증가하게 하고 ALT 수치와의 복용량-효과 관계를 보여준다는 것을 나타낸다. 즉, 에키노시스트산은 일정 간독성을 야기할 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, 간에서의 에키노시스트산의 독성 반응은 약학적 조성물에서의 에키노시스트산 대 올레아놀산의 비를 3:1-1:1 범위에서 조절함으로써 크게 감소될 수 있다.

비고: *평균의 차이는 투여 전과 비교할 때 통계적 유의도가 있다 (P＜ 0.05)

** 평균의 차이는 투여 전과 비교할 때 통계적 유의도가 있다 (P＜0.01)

시험예 2 본 발명 약학적 조성물의 마취된 개의 관상동맥 결찰에 의한 심근경색에의 영향

재료 및 방법

동물: 건강한 다 자란 잡종 개, 몸무게 12-16kg의 수컷 및 암컷 사용.

약제: Z01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 99.0%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090205; Z02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 94.2%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090206; 란타나 뿌리 화합물 정제(Compound Tablet of Red Sage Root, 약자로 "CTRSR"), 갈색 정제, Sichuan Shuzhong Pharmaceutical Co., Ltd.사 제조, 로트 넘버: 080202; 펜토바비탈 나트륨, 백색 또는 미색 파우더, Sigma Corporation(USA)사 제조, 로트 넘버: P3761; 헤파린 나트륨, 무색 또는 노르스름한 맑은 액체, Qilu Pharmaceutical. Co., Ltd.사 제조, 로트 넘버: P20080227152652765; 니트로테트라졸륨 블루 클로라이드(nitrotetrazolium blue chloride), Shanghai Jingchun Reagent Co.,Ltd사 제조, 황색 파우더, 로트 넘버: 1124927.

기기: 동물용 HX-300 인공호흡기 (Chengdu TME Technology Co, Ltd, China), 및 완전 자동 생화학 분석기 (Roche Integra 400 Plus, Switzerland).

과정: 실험용 개에게 순응 섭식(acclimation feedling)을 하고 무작위로 7 그룹 (그룹 당 6마리) 으로 나누었다: 모델 그룹, 음성 대조군 (모의 수술 그룹), 양성 대조군 (란타나 뿌리 화합물 정제 25 mg/kg), Z01 높은 복용량 그룹 (44.4 mg/kg), Z01 낮은 복용량 그룹 (22.2 mg/kg), Z02 높은 복용량 그룹 (70 mg/kg), Z02 낮은 복용량 그룹 (35 mg/kg). 각 실험용 동물을 3% 펜토바비탈나트륨(30 mg/kg)을 정맥 주사하여 마취하였다. 목 수술 및 기관내 삽관술을 수행하고, 인공호흡기에 연결하였다. 한 쪽의 경동맥을 분리하고 압력변환기에 연결하였다. 가슴이 열렸다. 심장막을 가위로 세로로 자르고 쌈지봉합에 의해 고정하여 심장을 잡도록 하였다. 좌측회선관상동맥 및 대동맥 뿌리를 분리하였다. 3ml의 혈액을 샘플로 채취하고 결찰 전에 테스트하여 인산크레아틴키나아제(CK), 젖산탈수소효소(LDH), 및 글루타민산 옥살로초산 트란스아미나제(AST)의 활성을 측정하였다. 그리고 나서, 관상동맥을 결찰하였다 (모의 수술 그룹은 결찰하지 않았다). 15분 후, 개별 지표를 측정하였다. 동시에, 시험 그룹의 동물을 십이지장을 통하여 약제를 투여하고 모델 그룹 및 모의 수술 그룹은 같은 경로를 통하여 같은 양의 생리식염수를 투여하였다. 개별 지표를 각각 투여 후 30분, 60분, 90분, 120분, 및 180분에 측정하였다. 마지막으로, 혈액 3 ml 를 샘플로 채취하고 테스트하여 결찰 또는 투여 후의 CK, LDH, 및 AST의 활성을 측정하였다. 그리고 나서, 동물들을 희생시켰다. 심장을 제거하고, 물로 세정하여 잔여 혈액을 제거하고, 여과지로 닦아 수분을 건조시키고 무게를 달았다. 그리고 나서, 심실을 두께 약 1.0cm의 얇은 조각으로 썰었다. 이 얇은 조각을 2% 적색 테트라졸린(Red tetrazoline; TTC) 용액에 넣고 15분 동안 37℃에서 배양하여 착색시키고, 용액에서 꺼냈다. 착색되지 않은 심근을 얇은 조각으로부터 분리하여 무게를 달고 심실 대비 경색부위의 퍼센트를 계산하였다. 실험의 데이터는 소프트웨어 SPSS 11.5를 이용하여 통계적으로 처리하였다. 그룹 내에서 평균의 비교 및 그룹 간 평균의 비교를 일원배치분산분석을 이용하여 테스트하였고, 그 결과는

로 표시하였다.

결과:

1. 개의 심근경색 부위에의 영향

개의 측정된 심근경색 부위인 표 2의 결과는 치료 그룹 및 CTRSR 그룹으로부터의 경색된 개의 심근경색 부위가 모델 그룹에 비하여 크게 감소하였으며(P＜0.01), CTRSR 그룹에 비하여는 투여 그룹 사이에서 큰 차이가 없었다는 것을 나타낸다.

2. 개의 심근 효소에의 영향

심근 효소의 활성을 측정한 것인 표 3의 결과는 각 투여 그룹의 심근허혈이 있는 개에서의 인산크레아틴키나아제(CK)의 활성은 모델 그룹과 비교하여 크게 감소하였으며, CTRSR 그룹과 비교하면 큰 차이가 없었다는 것을 보여준다. Z01 높은 그룹 및 Z02 높은 그룹으로부터의 심근허혈이 있는 개에서 젖산탈수소효소(LDH)의 활성은 모델 그룹과 비교하여 크게 감소하였다; 각 투여 그룹의 활성은 CTRSR 그룹과 비교하여 큰 차이가 없었다.

상기 결과는 본 발명의 두 타입의 약학적 조성물이 개의 심근경색에 큰 개선을 준다는 것을 암시한다.

시험예 3 본 발명 약학적 조성물의 마취된 개의 심근허혈 후 혈액동력학에의 영향

재료 및 방법

약제: Z01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 99.0%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090205; Z02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 94.2%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090206; CTRSR, 갈색 정제, Sichuan Shuzhong Pharmaceutical Co., Ltd.사 제조, 로트 넘버: 080202; 펜토바비탈 나트륨, 백색 또는 미색 파우더, Sigma Corporation(USA)사 제조, 로트 넘버: P3761

기기: 4개 채널의 생리적 기록 시스템 (RM-6000) (Nihon Kohden Co.사), 전자유량계 5.0mm, 1.0mm (Nihon Kohden Co.사), 자동 혈액 가스 분석기 (AVLCOMPACT-3，Sweden).

과정: 실험용 개를 순응 섭식을 하고 무작위로 7 그룹 (그룹 당 6마리) 으로 나누었다: 모델 그룹, 음성 대조군 (모의 수술 그룹), 양성 대조군 (란타나 뿌리 화합물 정제 25 mg/kg), Z01 높은 복용량 그룹 (44.4 mg/kg), Z01 낮은 복용량 그룹 (22.2 mg/kg), Z02 높은 복용량 그룹 (70 mg/kg), Z02 낮은 복용량 그룹 (35 mg/kg). 각 실험용 동물을 3% 펜토바비탈나트륨(30 mg/kg)의 정맥 주사에 의해 마취하였다. 목 수술 및 기관내 삽관술을 수행하고, 인공호흡기에 연결하였다. 동맥 조각을 전하행 관상동맥의 주요 분지 아래를 조심스럽게 분리하고 즉시 사용할 수 있도록 봉합하고 나서, 상행대동맥의 뿌리를 분리한 뒤 이것을 이용하여 전자 유량계를 고정시켜서 심박출량을 기록하였다. 좌측 심실 끝에 심장 카테터를 삽입하여 좌심실압 및 미분(±dp/dtmax)을 압력센서에 의하여 기록하였다. 심전도용 전극을 동물의 다리에 고정시키고 심전도를 모니터하고 기록하였다. 정상 혈압, 심전도, 심박출력, 좌심실압 및 ±dp/dtmax를 기록한 후, 좌전하행관상동맥의 자유 말단(free terminus)에서 결찰을 수행하여 심근허혈을 유발하였다. 동시에, 지정된 그룹의 동물들에 십이지장을 통하여 약물을 투여하였다; 그리고 모델 및 모의 수술 그룹의 동물들에게는 같은 경로를 통하여 같은 양의 생리식염수를 투여하였다. 각각 경동맥 및 정맥동으로부터 수득한 혈액 샘플을 자동 혈액 가스 분석기를 이용하여 혈액 산소 함량을 분석하였다. 실험의 데이터는 소프트웨어 SPSS 11.5를 이용하여 통계적으로 처리하였다. 그룹 내 평균의 비교 및 그룹 간 평균의 비교를 일원배치분산분석을 이용하여 테스트하였고, 그 결과는

로 표시하였다.

결과:

1. 심근경색을 앓는 개의 심근 산소 소비에의 영향

표 4에서, 각 그룹의 심근 산소소비량(VO2)을 계산한 결과는 모든 복용량 그룹의 심근 산소 소비량은 모델 그룹과 비교하여 결찰 1-4시간 후에 크게 감소하였고, CTRSR 그룹에 비하여 큰 차이는 없었다는 것을 보여준다.

2. 심근경색을 앓는 개의 심박출력에의 영향

표 5에서, 측정된 심박출력(AF)의 결과는 각 복용량 그룹의 심박 출력이 모델 그룹과 비교하여 투여 30분-4시간 후에 큰 차이가 있었고 (P＜0.05，P＜0.01), CTRSR 그룹과 비교하여는 큰 차이가 없었다는 것을 보여준다.

3. 심근경색을 앓는 개의 심작업량(cardiac work)에의 영향

표 6에서, 심작업량(MW)을 계산한 결과는 복용량 그룹과 CTRSR 그룹의 심작업량이 투여 30분 후 크게 감소하였고, 복용량 그룹의 심작업량은 모델 그룹과 비교하여 투여 30분-4시간 후에 크게 감소하였다는 것을 보여준다(P＜ 0.05). Z01 높은 복용량 그룹 및 Z02 높은 복용량 그룹의 심작업량은 각각 투여 후 1시간 및 2시간 후의 시점에서 보다 크게 감소하였다 (P＜ 0.01); 복용량 그룹과 CTRSR 그룹 사이에는 큰 차이가 없었다.

한 마디로, 두 타입의 약학적 조성물은 심근 역학을 개선시킴으로써 심근 산소 소비를 줄일 뿐만 아니라, 허혈성 심근세포의 세포막을 어느 정도 안정화하고 보호하는 원리의 항심근경색 효과를 보여준다. 상기 조성물은 심근경색, 협심증 및 관련 장애를 치료하는 새로운 약물로 개발될 수 있다.

시험예 4 본 발명 약학적 조성물의 피투이트린(pituitrin (PIT))에 의해 유발되는 쥐 심근허혈에의 영향

재료 및 방법

동물: 몸무게 200-250 g, 생후 5-6주 된 깨끗한 등급의 SD 쥐, 수컷 및 암컷을 이용함.

약제: X01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 실시예 4의 방법으로 제조, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 92.8%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090309; X02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 실시예 1의 방법으로 제조, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량은 98.8%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090310; 피투이트린 (PIT): 로트 넘버: 080315, Bengbu Hongye Biochemical pharmaceuticals Factory사 제조, 펜토바비탈나트륨: 로트 넘버: F20020915; Sinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China) Co., Ltd사가 수입 및 배포; Tongxinluo capsule, 로트 넘버: 080749, Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd.사가 제조.

기기: ASB240U 생체신호 수득 시스템(Biosignal Acquisiton System), Chengdu Aosheng Electronics Co., Ltd; KQ5200B 초음파 세정기, Kunshan Ultrasonic Instrument Co. Ltd.; Milli-Q Gradient A10 Pure Water Device: USA Millipore Co.; AB 104-N 전자 저울: METTLER TOLEDO Co.

과정: 몸무게 200-250 g이고 생후 5-6주인 피투이트린(PIT)에 민감하고 정상 ECG를 갖는 SD 쥐 112마리를 가려냈다. 가려낸 쥐를 무작위로 7 그룹으로 나누었다: 모델 그룹, 대조군, 양성 대조군(Tongxinluo capsule of 360 mg/kg), X01 높은 복용량 그룹 (69.5 mg/kg), X01 낮은 복용량 그룹 (34.7 mg/kg), X02 높은 복용량 그룹 (97.7 mg/kg), X02 낮은 복용량 그룹 (48.8 mg/kg), 각 그룹 당 15마리, 수컷과 암컷이 균일하게 구성됨. 각 그룹의 동물들에 해당 약물을 10 ml/kg의 양을 7일 동안 연속으로 위내 투여하였다. 마지막 투여 100분 후 1% 펜토바비탈 나트륨 (30 mg/kg)을 복강주사하였다. 마취가 되면, 동물을 개구리판(frog board)에 고정시키고 Lead II를 이용하여 2분 동안 정상 심전도 추적을 하였다. 그리고 나서, PIT (1.5 IU/kg)를 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 20초 동안 천천히 주사하였다. 심전도의 변화를 PIT 주사 후 15분 안에 추적하였다. ST 단편으로부터의 데이터를 10초, 30초, 1분, 2분, 4분, 6분. 8분, 10분, 13분, 15분 시점에 수집하였다. 모델링 후 다양한 시점에서의 ST 단편 이동을 비교하였다.

결과:

표 7의 ST 단편 이동의 합 분석으로부터 두 샘플의 높은 복용량 및 낮은 복용량은 어느 정도 ST 단편 이동을 길항할 수 있고, X01 높은 복용량 그룹, X02 높은 복용량 그룹 및 낮은 복용량 그룹에서의 길항작용은 가장 두드러진다(P<0.05 또는 P <0.01)는 것을 알 수 있다. 다양한 시점에서의 심근허혈의 ST 단편 이동의 결과에 따르면, X02는 PIT의 주사 10초, 10분, 13분. 15분 후에 항심근허혈 효과가 두드러지게 나타난다. 이 결과는 약학적 조성물 X01 및 X02의 샘플은 항심근허혈에 큰 효과를 가지며 관상동맥 심장병의 초기 및 회복기에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

시험예 5 약물의 피투이트린(PIT)에 의해 유발된 쥐 심근허혈에의 영향.

재료 및 방법

약제: Y01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 실시예 4의 방법으로 제조, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 97.4%), 자체제조 미색 파우더; 에키노시스트산 EA (에키노시스트산 98.4% 함유), 자체제조 순백색 파우더; 올레아놀산 OA (올레아놀산 97.8% 함유), 자체제조 순백색 파우더; 피투이트린, 로트 넘버: 080315, Bengbu Hongye Biochemical pharmaceuticals Factory사 제조; 펜토바비탈 나트륨, Chengdu Changzheng Huabo Co., Ltd.사 제조; Tongxinluo capsule, tShijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd사 제조.

기기: ASB240U 생체신호 수득 시스템(Biosignal Acquisiton System), Chengdu Aosheng Electronics Co., Ltd; KQ5200B 초음파 세정기, Kunshan Ultrasonic Instrument Co. Ltd.; Milli-Q Gradient A10 Pure Water Device: USA Millipore Co.; AB 104-N 전자 저울: METTLER TOLEDO Co..

과정: 몸무게 200-240g이고 생후 5-6주인 피투이트린(PIT)에 민감하고 정상 ECG를 갖는 SD 쥐 90마리를 가려냈다. 그 쥐들을 무작위로 6 그룹으로 나누었다: 모델 그룹, 대조군, 양성 대조군(Tongxinluo capsule 360 mg/kg), Y01 그룹 (68.4 mg/kg, 에키노시스트산의 함량 50 mg/kg, 올레아놀산의 함량 16.7 mg/kg), EA 그룹 (50.8 mg/kg, 에키노시스트산의 함량 50 mg/kg), OA 그룹 (17.0 mg/kg, 올레아놀산의 함량 16.7 mg/kg), 각 그룹 당 15마리, 수컷과 암컷이 균일하게 구성됨. 각 그룹의 동물들에 해당 약물을 10 ml/kg의 양을 7일 동안 연속으로 위내 투여하였다. 마지막 투여 100분 후 1% 펜토바비탈 나트륨 (30 mg/kg)을 복강주사하였다. 마취가 되면, 동물을 개구리판(frog board)에 고정시키고 Lead II를 이용하여 2분 동안 정상 심전도 추적을 하였다. 그리고 나서, PIT (1.5 IU/kg)를 쥐의 꼬리 정맥을 통하여 20초 동안 천천히 주사하였다. 심전도의 변화를 PIT 주사 15분 안에 추적하였다. ST 단편으로부터의 데이터를 10초, 30초, 1분, 2분, 4분, 6분, 8분, 10분, 13분, 15분 시점에 수집하였다. 모델링 후 다양한 시점에서의 ST 단편 이동을 비교하였다. 실험 데이터를 통계 소프트웨어 패키지 SPSS, 버전 13.0으로 처리하였다. 측정된 데이터를 평균±표준편차(

)로 표시하였다. 다수의 그룹 간 비교는 랜덤화 블록 디자인은 ANOVA에 의해, 두 그룹 간 비교는 SNK-q 테스트에 의해 테스트하였다.

결과:

표 8의 ST 단편 이동의 합 분석으로부터 Y01 및 EA는 ST 단편 이동을 길항할 수 있고, Y01의 ST 단편 이동의 합은 모델 그룹과 비교하여 가장 두드러지는 반면(P＜0.01), OA의 ST 단편 이동에 대한 길항작용은 모델 그룹(P＞0.05) 및 Y01 그룹(P＜0.05)의 ST 단편 이동의 합과 비교하여 현저하지 않다는 것을 알 수 있다. 다양한 시점에서의 심근허혈 모델의 ST 단편 이동의 결과에 따르면, Y01 및 EA는 PIT 주사 후 거의 모든 시점에서 상당한 항심근허혈 효과를 보이는 반면, OA는 PIT 주사 후 각 시점에서 현저하지 않은 항심근허혈 효과를 나타낸다.

표 8의 데이터는 조각자나무 추출물 Y01 및 에키노시스트산 샘플이 현저한 항심근허혈 효과를 가지며, 관상동맥 심장병의 초기 및 회복기에 사용될 수 있는 반면, 올레아놀산은 심근허혈에 큰 개선을 가져오지 않는다는 것을 가리킨다. 작용의 강도를 고려하면, 조각자나무 추출물 Y01이 에키노시스트산 또는 올레아놀산에 비하여 훨씬 우수하다.

시험예 6 본 발명 약학적 조성물의 염화바륨에 의해 유발된 쥐 부정맥에의 영향

재료 및 방법

약제: X01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 92.8%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090309; X02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총량 98.8%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090310; 염화바륨, A.P, Kaiyuan Chemical Reagent Factory사, 로트 넘버: 0807002; CTRSR, Sichuan Shuzhong Pharmaceutical Co., Ltd.사, 갈색 정제, 로트 넘버: 080202.

기기: ASB240U 생체신호 수득 시스템(Biosignal Acquisiton System), Chengdu Aosheng Electronics Co., Ltd사; KQ5200B 초음파 세정기, Kunshan Ultrasonic Instrument Co. Ltd.사; Milli-Q Gradient A10 Pure Water Device, USA Millipore Co.사; AB 104-N 전자 저울, METTLER TOLEDO Co.사.

과정: 몸무게 200-250g이고 생후 5-6주인 염화바륨에 민감하고 정상 ECG를 갖는 SD 쥐 112마리를 가려냈다. 그 쥐를 무작위로 6그룹으로 나누었다: 모델 그룹, 양성 대조군(란타나 뿌리 화합물 정제 75 mg/kg), X01 높은 복용량 그룹 (69.5 mg/kg), X01 낮은 복용량 그룹 (34.7 mg/kg), X02 높은 복용량 그룹 (97.7 mg/kg), X02 낮은 복용량 그룹 (48.8 mg/kg), 각 그룹 당 15마리, 수컷과 암컷이 균일하게 구성됨. 본 발명의 목적을 위하여, 각 그룹의 동물들에 해당 약물을 매일 5일 동안 연속으로 위내 투여하였다. 마지막 투여 후 10% 클로랄수화물 (400 mg/kg)을 주사하여 마취시키고, 앙와위로 고정시키고 30분 둔 후, Lead II의 정상 심전도기를 추적하였다. 마지막 투여 45분 후 설정맥을 통하여 4 mg/kg의 0.4% 염화바륨을 주사하여 쥐의 부정맥을 유발하였다. Lead II 심전도의 변화를 관찰하였다. 양방향심실부정맥의 발생 시점 (이른 또는 늦은) 및 그 지속기간을 지표로 간주하였다. 30분 넘게 지속된 양방향심실부정맥의 지속기간을 30분으로 기록하였다.

결과:

표 9로부터 시험된 약물은 염화바륨의 정맥주사로 유발된 쥐의 양방향심실부정맥의 발생 시점을 늦출 수 있으며 이 부정맥의 지속기간을 줄일 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 예방치료의 효능을 구배 방식으로 나타내었는데 명확한 복용량-효과 관계를 보인다. 복용량 그룹의 효능이 양성대조(CTRSR)그룹과 비교하여 큰 차이는 없지만, 표 9의 데이터로부터 약학적 조성물 X01 및 X02의 높은 복용량 그룹이 부정맥 발생 연기 및 그 지속시간 감소에 약간 더 나은 것을 알 수 있다. 이는 본 발명의 약학적 조성물이 부정맥 치료에 장점을 갖는다는 것을 시사한다.

시험예 7 본 발명 약학적 조성물 및 에키노시스트산의 토끼 지질장애에의 효과

재료 및 방법

동물: 생후 3개월, 1.5-2.0kg의 I등급 수컷 순종 일본 흰 토끼.

약제: Z01 (에키노시스트산 : 올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 99.0%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090205; Z02 (에키노시스트산 : 올레아놀산 = 1:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 94.2%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090206; 아토르바스타틴 칼슘 정제 (Lipitor), Pfizer Inc.사, 로트 넘버: 95837012; 페노피브레이트 캡슐 (Lipanthyl), Laboratories Fournier S.A.사 France, 로트 넘버: 12094; 생리식염수, Chengdu Qingshan Likang Pharmarceutical Co., Ltd.사, 맑은 무색 액체, 로트 넘버: A0703025.

기기: 완전 자동 생화학 분석기 (Roche Integra 400 Plus, Switzerland); TGL-16G 원심분리기; AB104-N 전자 저울; BP211D 전자 저울.

과정: 동물에게 10일 동안 순응 섭식을 하였다. 그리고 나서, 60마리의 동물을 고지방 먹이(1 % 콜레스테롤 + 5% 정제 돼지기름 + 10% 달걀 노른자 파우더 + 84% 기본 사료로 구성됨)로 키우고 추가 6마리를 기본 먹이사료로 키웠다. 15일 후, 동물을 굶기면서 중앙 이동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈청을 분리하고 다양한 혈중 지질 지수를 분석하였다. 고지방 먹이를 먹고 자란 60마리의 동물 중 42마리를 TC 함량을 기초로 선택하여 그룹 당 6마리로 랜덤화 블록 디자인에 의해 7 그룹으로 나누었다; 기본 먹이를 먹고 자란 6마리를 대조군으로 사용하였다. 그룹으로 나눈 후, 모든 그룹의 동물을 기본 먹이를 먹여 기르고 그룹 스케쥴에 따라 위내 투여를 시작하였다: Z01 낮은 복용량 그룹 (8.4 mg/kg), Z01 높은 복용량 그룹 (16.8 mg/kg), Z02 낮은 복용량 그룹 (13.3 mg/kg), Z02 높은 복용량 그룹 (26.5 mg/kg), Lipitor 그룹 (2.5 mg/kg), Lipanthyl 그룹 (20 mg/kg), 모델 그룹, 및 대조군. 4주 동안 투여하였다. 실험 데이터를 통계 소프트웨어 패키지 SPSS, 버전 13.0을 이용하여 처리하였다. 측정된 데이터를 평균±표준편차(

)로 표현하였다. 다수의 그룹 간 비교는 랜덤화 블록 디자인용 ANOVA에 의해 테스트하였고, 두 그룹 간 비교는 SNK-q 테스트에 의해 시험하였다.

결과:

투여 전 그리고 마지막 투여 24시간 후 실험 그룹의 모든 굶는 동물로부터 혈액 샘플을 수집하고 총 콜레스테롤(TC) 및 트리글리세리드(TG)의 함량을 측정하였다. 데이터를 통계적으로 처리하였고 표 10에 나타내었다.

표 10에서, 시험된 약물의 그룹의 혈청 TC 수치에의 영향의 결과는 Z01 높은 복용량 그룹, Z01 낮은 복용량 그룹, 및 Z02 높은 복용량 그룹의 약학적 조성물이 지질 장애를 갖는 토끼의 혈청 TC 수치를 조정하는 데 각각 다른 정도의 효능이 있지만, Lipitor 그룹 빛 Lipanthyl 그룹과 비교하면 큰 차이가 없다는 것을 보여준다 (P ＞0.05). 혈청 TC 수치를 감소시키는 효능의 추세를 고려하면, 약학적 조성물은 다른 효능을 갖는다: Z01 높은 복용량 그룹의 효능 > Z02 높은 복용량 그룹의 효능 > Z01 낮은 복용량 그룹의 효능 > Z02 낮은 복용량 그룹의 효능. 총괄하여, 첫 세 샘플은 토끼의 지질장애를 조절하고 개선하는 데 효과가 있다.

시험한 약물의 그룹의 혈청 TG 수치에의 영향의 결과는 Z01 높은 복용량 그룹, Z01 낮은 복용량 그룹, Z02 높은 복용량 그룹의 약학적 조성물이 지질장애를 갖는 토끼의 혈청 TG 수치를 조절하는 데 각각 다른 정도의 효능이 있지만, Lipitor 그룹 및 Lipanthyl 그룹과 비교하면 큰 차이가 없다는 것을 보여준다 (P ＞0.05). 혈청 TG 수치를 감소시키는 효능의 추세를 고려하면, 약학적 조성물은 다른 효능을 갖는다: Z01 높은 복용량 그룹의 효능 ＞ Z01 낮은 복용량 그룹의 효능 ＞ Z02 높은 복용량 그룹의 효능.

시험예 8 토끼 지질장애에 대한 영향의 비교

재료 및 방법

동물: 생후 3개월, 1.5-2.0kg의 I등급 수컷 순종 일본 흰 토끼.

약제: Y01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 97.4%), 자체제조 미색 파우더; 에키노시스트산 EA (에키노시스트산 98.4% 함유), 자체제조 순백색 파우더; 올레아놀산 OA (올레아놀산 97.8% 함유), 자체제조 순백색 파우더; 아토르바스타틴 칼슘 정제 (Lipitor), Pfizer Inc.사; 생리식염수, Sichuan Meida Kangjiale Pharmaceutical Co, Ltd.사.

기기: 완전 자동 생화학 분석기(Roche Integra 400 Plus, Switzerland); TGL-16G 원심분리기; AB104-N 전자 저울; BP211D 전자 저울.

과정: 동물에게 10일 동안 순응 섭식을 하였다. 그리고 나서, 40마리의 동물을 고지방 먹이(1 % 콜레스테롤 + 5% 정제 돼지기름 + 10% 달걀 노른자 파우더 + 84% 기본 사료로 구성됨)로 키우고 추가 6마리를 기본 먹이사료로 키웠다. 15일 동안 상기 먹이로 키운 후, 동물을 굶기면서 중앙 이동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 혈청을 분리하고 다양한 혈중 지질 지수를 분석하였다. 고지방 먹이를 먹고 자란 40마리의 동물 중 30마리를 TC 함량을 기초로 선택하여 그룹 당 6마리로 랜덤화 블록 디자인에 의해 5 그룹으로 나누었다; 기본 먹이를 먹고 자란 6마리를 대조군으로 사용하였다. 그룹으로 나눈 후, 모든 그룹의 동물을 기본 먹이를 먹여 기르고 그룹 스케쥴에 따라 위내 투여를 시작하였다: Y01 그룹 (16.4 mg/kg, 에키노시스트산의 양 2 mg/kg, 올레아놀산의 양 4 mg/kg), EA 그룹 (12.2 mg/kg, 에키노시스트산의 양 12 mg/kg), OA 그룹 (4.0 mg/kg, 올레아놀산의 양 4 mg/kg), Lipitor 그룹 (2.5 mg/kg), 모델 그룹, 및 대조군. 4주 동안 투여하였다. 실험 데이터를 통계 소프트웨어 패키지 SPSS, 버전 13.0을 이용하여 처리하였다. 측정된 데이터를 평균±표준편차(

)로 표현하였다. 다수의 그룹 간 비교는 랜덤화 블록 디자인의 ANOVA에 의해 테스트하였고, 두 그룹 간 비교는 SNK-q 테스트에 의해 시험하였다.

결과:

투여 전 그리고 마지막 투여 24시간 후 실험 그룹의 모든 굶는 동물로부터 혈액 샘플을 수집하고 총 콜레스테롤(TC) 및 트리글리세리드(TG)의 함량을 측정하였다. 데이터를 통계적으로 처리하였고 표 11에 나타내었다.

표 11에서, 시험된 약물의 각 그룹의 혈청 TC 수치에의 영향의 결과는 Y01 그룹 및 EA 그룹이 지질 장애를 갖는 토끼의 혈청 TC 수치를 조정하는 데 다른 효능을 가지며, 모델 그룹과 비교하여 투여 후 큰 차이 (P＜0.01 또는 P＜0.05)를 보이고; OA 그룹은 지질 장애를 갖는 토끼의 혈청 TC 수치를 조정하는 데 뚜렷하지 않은 효능을 갖고, 투여 후 모델 그룹과 비교하여 큰 차이가 없으며 (P＞0.05) Y01 그룹과 비교하여 큰 차이를 보인다 (P＜0.05) 는 것을 보여준다.

각 그룹의 혈청 TG 수치에 대한 시험된 약물의 결과는 Y01 그룹 및 EA 그룹은 지질장애를 앓는 토끼의 혈청 TG 수치를 조정하는 데 다른 정도의 효능을 갖는데, 모델 그룹과 비교하여 큰 차이를 보이고 (P＜0.01 또는 P＜0.05); OA 그룹은 지질장애를 앓는 토끼의 혈청 TG 수치를 조정하는 데 뚜렷하지 않은 효능을 갖는데, 모델 그룹과 비교하여 큰 차이가 없으며 (P＞0.05), Y01 그룹과 비교하여 큰 차이가 있다(P＜0.05)는 것을 보여준다.

위 결과를 보면, Y01 그룹에 사용된 약물 및 에키노시스트산은 토끼 지질장애를 조절하고 개선하는 데 명백한 효능이 있다. 그러나, 올레아놀산은 토끼 지질장애 개선에 뚜렷한 효능이 없다. 작용의 강도를 고려하면, Y01 그룹에 사용된 약물이 에키노시스트산 및 올레아놀산보다 명백히 우수하다.

시험예 9 토끼 죽상동맥경화증에 대한 본 발명 약학적 조성물의 예방 효과

재료 및 방법

동물: 생후 3개월, 1.5-2.0kg의 I등급 수컷 순종 일본 흰 토끼.

약제: Z01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 99.0%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090205; Z02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총량 94.2%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090206; 아토르바스타틴 칼슘 정제 (Lipitor), Pfizer Inc.사, 로트 넘버: 95837012; 페노피브레이트 캡슐 (Lipanthyl), Laboratoires Fournier S.A.사 France, 로트 넘버: 12094; 생리식염수, Chengdu Qingshan Likang Pharmarceutical Co., Ltd.사, 맑은 무색 액체 , 로트 넘버: A0703025; 소혈청알부민(BSA), Sigma Corporation사, USA.

기기: 완전 자동 생화학 분석기 (Roche Integra 400 Plus, Switzerland); TGL-16G 원심분리기; AB104-N 전자 저울; BP211D 전자 저울; electric glass homogenizer DY89-II.

과정: 동물에게 10일 동안 순응 섭식을 하고 나서, 50마리의 동물을 완전 무작위로 그룹으로 나누었다: Z01 그룹 (16.8 mg/kg), Z02 그룹 (26.5 mg/kg), Lipitor 그룹 (2.5 mg/kg), Lipanthyl 그룹 (20 mg/kg), 모델 그룹, 그룹 당 9 마리의 동물; 대조군은 6마리의 동물로 구성됨. 그룹으로 나눈 뒤, 복용량 그룹 및 모델 그룹의 동물을 고지방 먹이(1 % 콜레스테롤 + 5% 정제 돼지기름 + 10% 달걀 노른자 파우더 + 84% 기본 사료로 구성됨)로 키우고 대조군의 동물은 기본 먹이사료로 키웠다. 동시에, 모든 동물을 12주 동안 그룹 스케쥴에 따라 위내 투여하였다. 투여 중 4째 주 마지막에, 동물을 200mg/kg 복용량을 토끼 모서리 이정맥을 통하여 10% BSA를 한 번 투여하여 동물 AS 모델의 확립을 가능하게 하였다. 실험 데이터를 통계 소프트웨어 패키지 SPSS, 버전 13.0을 이용하여 처리하였다. 측정된 데이터를 평균±표준편차(

)로 표현하였다. 다수의 그룹 간 비교는 랜덤화 블록 디자인의 일원분산분석에 의해 테스트하였고, 두 그룹 간 비교는 SNK-q 테스트에 의해 시험하였다. 비모수(nonparametric) 정보의 통계는 Kruskal-wallis H 테스트로 수행하였고 두 그룹 간 비모수 정보의 비교는 Nemenyi 테스트로 시험하였다.

결과:

1. 조직 호모게네이트의 지질 수치에의 영향

(1) 마지막 투여 24시간 후 실험 그룹의 동물을 희생시켰다. 대동맥을 제거하고 그 안의 지질 수치의 측정을 균질화하였다. 데이터를 통계적으로 처리하였고 표 12에 나타내었다.

표 12에서, 시험된 약물의 각 그룹의 대동맥 조직 호모게네이트의 TC 수치에의 영향의 결과는 Z01 그룹 및 Z02 그룹은 지질장애를 앓는 토끼의 대동맥의 TC 수치를 감소시키는 데 다른 정도의 효능을 갖고, 그 효능은 Lipitor 및 Lipanthyl 그룹과 비교하여 큰 차이가 없다(P＞0.05)는 것을 보여준다. 대동맥의 TC 수치를 줄이는 효능의 추세를 고려하면, Z01 그룹의 약학 조성물의 효능이 Z02 그룹의 약학적 조성물의 효능보다 크다.

각 그룹의 대동맥 조직 호모게네이트의 TG 수치에의 시험된 약물의 영향의 결과는 Z01 그룹 및 Z02 그룹이 지질장애를 앓는 토끼의 대동맥의 TG 수치를 감소시키는 데 다른 정도의 효능을 가지며, 이 효능은 Lipitor 및 Lipanthyl 그룹에 비하여 큰 차이가 없다(P＞0.05)는 것을 보여준다. 효능의 추세를 고려하면, Z01 그룹의 약학적 조성물의 효능은 Z02 그룹의 약학적 조성물의 효능보다 크다.

각 실험 그룹의 대동맥 조직 호모게네이트의 지질 수치에의 시험된 약물의 영향으로부터 본 발명의 약학적 조성물 Z01 및 Z02는 모두 대동맥의 지질 수치를 줄이는 데 효과가 있는 것을 알 수 있는데, 이는 고지방식으로 인한 scleratheroma를 개선하는 것으로서 구현된다.

(2) 실험의 각 그룹의 각 동물은 마지막 투여 24시간 후 희생시켰다. 간 속 지질 수치 측정을 위하여 간을 제거하고 균질화하였다. 데이터를 통계적으로 처리하였고 표 13에 나타내었다.

표 13에서, 각 그룹에 시험된 약물의 간조직 호모게네이트 내 TC 수치에의 영향을 결과는 Z01 그룹 및 Z02 그룹은 지질 장애를 앓는 토끼의 간조직의 TC 수치를 감소시키는 데 다른 정도의 효능을 가지며, 그 효능은 Lipitor 및 Lipanthyl 그룹과 비교하여 큰 차이가 없다 (P＞0.05)는 것을 보여준다. 간조직 내 TC 수치를 감소시키는 효능의 추세를 고려하면, Z01 그룹의 약학적 조성물의 효능이 Z02 그룹의 약학적 조성물의 효능보다 크다.

각 그룹의 실험된 약물의 간조직 호모게네이트 내 LDL-C 수치에의 영향의 결과는 Z01 그룹 및 Z02 그룹이 지질 장애를 앓는 토끼의 간조직 내 LDL-C 수치 감소에 다른 정도의 효능을 가지며, 그 효능은 Lipitor 및 Lipanthyl 그룹과 비교하여 큰 차이가 없다 (P＞0.05)는 것을 보여준다. 효능의 추세를 고려하면, Z01 그룹의 약학적 조성물의 효능이 Z02 그룹의 약학적 조성물의 효능보다 크다.

각 실험 그룹에 시험된 약물의 간조직 호모게네이트 내 지질 수치에의 영향으로부터, 본 발명의 약학적 조성물은 간조직 내 콜레스테롤 수치를 줄이는 데 효과가 있다는 것을 알 수 있는데, 이는 간조직 내 콜레스테롤의 합성의 억제로서 구현된다.

2. 대동맥 내 죽상경화판 부위에의 영향

마지막 투여 24시간 후 각 실험 그룹의 모든 동물을 희생시켰다. 대동맥을 제거하고 과도하게 착색하였다. 죽상경화판(atherosclerotic plaque) 부위의 백분율을 계산하여 통계적으로 처리하였다. 데이터를 표 14에 나타내었다.

표 14에서, 각 실험 그룹의 대동맥 내 죽상경화판 부위에의 영향으로부터의 결과는 Z01 그룹 및 Z02 그룹은 대동맥 내 죽상경화판 개선에 다른 정도의 효능을 갖는데, 이 효능은 Lipitor 및 Lipanthyl 그룹에 비하여 큰 차이가 없다(P＞0.05)는 것을 보여준다. 대동맥 내 죽상경화판 부위 개선의 효능의 추세를 고려하면, Z01 그룹의 약학적 조성물의 효능은 Z02 그룹의 약학적 조성물의 효능보다 높다.

한 마디로, 본 발명의 약학적 조성물은 토끼의 죽상동맥경화증 예방 및 개선에 효능이 있다.

시험예 10 본 발명의 약학적 조성물의 토끼 죽상동맥경화증에의 치료 효과

재료 및 방법

동물: 생후 3개월, 1.5-2.0kg의 I등급 수컷 순종 일본 흰 토끼.

약제: Z01 (에키노시스트산:올레아놀산 = 3:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 99.0%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090205; Z02 (에키노시스트산:올레아놀산 = 1:1, 에키노시스트산 및 올레아놀산의 총 함량 94.2%), 자체제조 미색 정제, 로트 넘버: 090206; 아토르바스타틴 칼슘 정제 (Lipitor), Pfizer Inc.사, 로트 넘버: 95837012; 페노피브레이트 캡슐 (Lipanthyl), Laboratoires Fournier S.A.사 France, 로트 넘버: 12094; 생리식염수, Chengdu Qingshan Likang Pharmarceutical Co., Ltd.사, 맑은 무색 액체, 로트 넘버: A0703025; 소혈청알부민 (BSA), Sigma Corporation사, USA.

기기: 완전 자동 생화학 분석기 (Roche Integra 400 Plus, Switzerland); TGL-16G 원심분리기; AB104-N 전자 저울; BP211D 전자 저울; OLYMPUS 광학현미경; 도립현미경 (color imaging system 구비), Zeiss Corporation사.

과정: 10일 동안 순응 섭식을 한 후, 동물 50마리를 완전 무작위로 그룹으로 나누었다: Z01 그룹 (16.8 mg/kg), Z02 그룹 (26.5 mg/kg), Lipitor 그룹 (2.5 mg/kg), Lipanthyl 그룹 (20 mg/kg), 모델 그룹, 그룹 당 동물 9마리; 대조군은 6마리의 동물로 구성됨. 그룹으로 나눈 후, 복용량 그룹 및 모델 그룹의 동물을 매일 고지방 먹이 (1 % 콜레스테롤 + 5% 정제 돼지기름 + 10% 달걀 노른자 파우더 + 84% 기본 먹이사료로 구성됨) 로 키우고, 대조군의 동물은 기본 먹이사료로 키웠다. 키운 지 4주 째 마지막에, 동물을 200mg/kg 복용량을 토끼 모서리 이정맥을 통하여 10% BSA를 한 번 투여하여 동물 AS 모델의 확립을 가능하게 하였다. 모델링은 8주 째에 끝났고, 고지방식 사료 대신, 각 그룹의 동물에게 기본 먹이사료를 먹여 키우고, 그룹 스케쥴에 따라 12주 동안 위내 투여하였다. 실험 데이터를 통계 소프트웨어 패키지 SPSS, 버전 13.0을 이용하여 처리하였다. 측정된 데이터를 평균±표준편차(

)로 표현하였다. 비모수(nonparametric) 데이터는 Kruskal-wallis H 테스트로 수행하였고 두 그룹 간 비모수 데이터의 비교는 Nemenyi 테스트로 시험하였다.

결과:

1. 관의 내막-중막 두께에의 영향

마지막 투여 후 각 실험 그룹의 모든 동물을 희생시켰다. 흉대동맥을 과도하게 착색시켰다. 그리고 나서, 작은 동맥 조각을 심장의 근위단에서 (심장의 근위단에서 각각 2cm 그리고 4cm 떨어진 곳) 가로로 잘라, 파라핀에 넣고, 얇게 썰고, HE로 착색시켰다. 혈관 내막의 두께 대 혈관 중막의 두께의 비율을 계산하였다. 데이터를 통계적으로 분석하였고 표 15에 나타내었다.

표 15의 실험 결과로부터 샘플 그룹의 두 실험 약물 모두가 혈관 내막 두께 대 혈관 중막 두께의 비율을 감소시키는 데 효능이 있으며, 그 효능은 양성대조군 (Lipitor 및 Lipanthyl 그룹)과 비교하여 큰 차이가 없다는 것으로 결론지을 수 있다. 효능은 죽상동맥경화증 치료에서의 치료 효과로서 구현된다.

2. 대동맥의 조직병리학에의 영향

각 실험 그룹의 모든 동물을 마지막 투여 후 희생시켰다. 흉대동맥을 과도하게 착색하였다. 그리고 나서, 작은 동맥 조각을 심장의 근위단에서 (심장의 근위단에서 각각 2cm 그리고 4cm 떨어진 곳) 가로로 잘라, 파라핀에 넣고, 얇게 썰고, HE로 착색시키고, 조직병리학적으로 관찰하였다. HE로 착색된 대동맥의 단면을 도 2-7에 나타낸다.

현저한 대동맥의 내피증은 모델 그룹으로부터의 HE-착색 샘플에서 관찰될 수 있고, 콜레스테롤을 운반하는 대식세포-유도 거품세포는 (파라핀에) 넣기 및 (HE로) 착색 동안 지질을 잃었으며 따라서 남은 거품 같은 액포 및 뚜렷한 세포핵을 갖는 거품 같은 거품세포가 되는 것으로 보인다. 샘플 그룹의 대동맥의 내피증의 두께는 더 얇았고, 이는 개선된 항-죽상동맥경화증 효과를 보여주는데, 이는 Lipitor 및 Lipanthyl 그룹과 비교하여 큰 차이가 없다. 시험된 샘플의 대동맥 내피증 개선에의 효능의 추세를 고려하면, Z01 그룹의 약학적 조성물의 효능이 Z02 그룹의 약학적 조성물의 효능보다 크다.

한 마디로, 본 발명의 약학적 조성물은 토끼의 죽상동맥경화증 치료에 효능이 있다.

산업적 적용

본 발명 약학적 조성물의 간독성은 그 안의 에키노시스트산 대 올레아놀산의 비율을 조절함으로써 크게 감소하였고, 따라서 심혈관 장애의 치료에 보다 안전하고 잠재력 있는 약학적 조성물이 되게 한다. 조각자나무 추출물의 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비를 조절함으로써, 최적화된 조각자나무 추출물이 수득되며, 조각자나무 추출물의 간독성을 감소시킬 뿐만 아니라, 그 제조비용도 크게 감소시키고, 따라서 산업적 적용에 능동적 가치, 유망성 및 적합성을 갖게 된다.

Claims

활성성분이 에키노시스트산 3 내지 1 중량부 및 올레아놀산 1 중량부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 활성성분이 에키노시스트산 3 내지 2 중량부 및 올레아놀산 1 중량부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 활성성분이 에키노시스트산 3 중량부 및 올레아놀산 1 중량부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에키노시스트산 및 올레아놀산은 식물 추출물 또는 화학적 합성물질로부터 유래하는 것임을 특징으로 하는 심혈관 장애 치료용 약학적 조성물.
심혈관 장애 예방 또는 치료용 약제 제조에의 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 약학적 조성물의 용도.
제 5항에 있어서, 상기 약제는 관상동맥질환, 협심증, 심근허혈, 심근경색, 부정맥, 고지혈증 또는 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 용도.
총 함량 90.0%-99.9%의 에키노시스트산 및 올레아놀산을 함유하고, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비는 3:1-1:1인 것을 특징으로 하는 조각자나무 추출물.
제 7항에 있어서, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비는 3:1-2:1인 것을 특징으로 하는 조각자나무 추출물.
제 8항에 있어서, 에키노시스트산 대 올레아놀산의 중량비는 3:1인 것을 특징으로 하는 조각자나무 추출물.
a. 대조각(Fructus Gleditsiae Sinensis) 약재를 준비하고, 상기 약재를 물로 달이고 여과한 후, 여과액을 농축하는 단계;
b. 상기 농축된 여과액에 물 또는 수성 에탄올과 함께 산을 첨가하여 산 농도가 2 mol/L이, 임의의 에탄올 함량이 1-45%가 되게 하고, 이를 가수분해를 위하여 교반하고 끓인 뒤 가수분해 용액을 여과하고, 수득된 여과 케이크를 용출액의 pH가 6 이상이 될 때까지 정제수를 이용하여 세정하고, 세정된 여과 케이크를 80℃에서 건조시켜 조(crude) 조각자나무 사포게닌을 수득하는 단계;
c. 상기 조 조각자나무 사포게닌을 95% 에탄올 15-40용적부에 가열하면서 용해시키고, 거기에 약학적으로 허용가능한 활성탄소를 1-4% 첨가하고, 30분 동안 교반하고 끓인 후, 뜨거울 때 여과하고; 여과액의 pH를 2-6으로 조절하고, 상기 여과액에서 에탄올을 회수한 뒤, 냉각하고 결정화한 후, 수득된 결정을 80℃에서 건조시켜 조각자나무 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 의한 조각자나무 추출물의 제조방법.
심혈관 장애 예방 또는 치료용 약제 제조에의 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 의한 조각자나무 추출물의 용도.
제 11항에 있어서, 상기 약제는 관상동맥질환, 협심증, 심근허혈, 심근경색, 부정맥, 고지혈증 또는 죽상동맥경화증 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 용도.