JP2007513150A - ウリ科植物の抽出物またはウリ科植物の抽出物から単離した精製抽出物から構成される抗脂肪生成および抗肥満活性を有する組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明による抽出物は、製剤的な観点から許容範囲にある担体、アジュバントまたは希釈剤を含有する製剤組成物として提供することができる。例えば、本発明の抽出物はオイル、プロピレングリコール、または注射剤を製造する際に通常使用するその他溶媒に溶解させることができる。適当な担体の例としては、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性油、ミリスチン酸イソプロピルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。外用としては、本発明の抽出物を軟膏やクリームにすることが可能である。
韓国の市場で購入したカボチャ(Cucurbita moschata DUCH)、スイカ(Citrullus vulgaris SCHRAD)、ヘチマタワシ(Luffa cylindrical L. ROEM)の茎を乾燥させたものそれぞれ2キロを切断し、メタノール20リットルと混合し、還流抽出器を用いて90℃で1時間抽出した。この抽出工程を3回繰り返して上清を回収し、フィルターペーパーでろ過した後、上清を減圧下で濃縮して、カボチャ、スイカ、ヘチマタワシの乾燥温水抽出物を300g、350g、240g、それぞれ得た。各抽出物を蒸留水に溶解して濃度100 mg/mlとし、以下の実験例においてテストサンプルとして使用した。
実施例1で調製した乾燥させた温水可溶性抽出物200gを1リットルの蒸留水に懸濁させ、そこに1リットルのヘキサンを添加した。得られた水溶液をヘキサン層と水層との分別に3回供して、回収したヘキサン層を濾過した後、真空ロータリーエバポレータで乾燥させて180mgのヘキサン可溶性抽出物を得た。残った水層1リットルは以下の工程で使用した。
残った水層に1リットルに1リットルのクロロホルムを添加し、得られた水溶液をクロロホルム層と水層との分別に3回供した。回収したクロロホルム層を濾過し、ロータリーエバポレータで乾燥させて770mgのクロロホルム可溶性抽出物を得た。残った水層は以下の工程で使用した。
残った水層1リットルに1リットルの酢酸エチルを添加し、得られた水溶液を、酢酸エチル層と水層との分別に3回供した。回収した酢酸エチル層を濾過した後、真空ロータリーエバポレータで乾燥させて2.1gの酢酸エチル可溶性抽出物を得た。残った水層は以下の工程で使用した。
残った水層1リットルに1リットルのブタノールを添加し、得られた水溶液をブタノール層と水層との分別に3回供した。回収したブタノール層を濾過した後、真空ローターリーエバポレータで乾燥させて7.4gのブタノール可溶性抽出物を得た。残った水層は以下の工程で使用した。
25gのシリカゲル(メルク社。No−9385)を充填したカラム(3x27cm)を使用して、770mgのクロロホルム可溶性抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。混合溶媒(ヘキサン:クロロホルム:メタノール=16:15:1)を移動相として溶出させた。回収した成分を乾燥させて11の成分に分けた。つまり第1成分(31mg)、第2成分(18mg)、第3成分(65mg)、第4成分(18mg)、第5成分(54mg)、第6成分(75mg)、第7成分(39mg)、第8成分(200mg)、第9成分(20mg)、第10成分(163mg)、および第11成分(64mg)である。最も強力な抗肥満活性を示す第9成分20mgを、シリカゲル2g(メルク社。9385)を充填したシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、直線勾配のクロロホルム:メタノールを含有する混合溶媒を用いて(30:1?>10:1)段階的に行った。さらに第9成分を精製するために、20〜70%のメタノールを移動相として40%メタノールを流速2ml/mで使用したHPLCを行って26.8分で溶出された本発明の独創的な「cmc−9」抽出物を得た。図18および図19に示されるように、TLC溶出溶媒(クロロホルム:メタノール=20:1)を用いた場合、cmc−9抽出物は15分で溶出され、Rf値は0.32だった。
実施例1〜6で調製した抽出物の脂肪細胞分化およびトリグリセリドレベルの阻害活性を測定するために、以下の実験を行った。
(1−1.テストサンプルの未精製抽出物)
ATCC(米国・アメリカンティッシューカルチャーコレクション社)から購入した脂肪細胞(3T3−L1)を10%のFBSを含有するRPMI培地で培養し、成熟した脂肪細胞に分化させるためにMDIカクテル(イソブチルメチルキサンチン、デキサメタゾン、インシュリン)を添加した。2日後、培地を交換してインシュリンのみで処理した。その後、培地を交換し同濃度のインシュリンで処理する作業を一日おきに行った。分化が起こったら濃度2.5〜1000ug/mlのMDIで処理し、培地を交換する度に同濃度のMDIで処理した。トログリタゾン(シグマ社)および10 uM SB203580(シグマ社) を対照グループとして使用し、カボチャ、スイカ、ヘチマタワシの温水抽出物を乾燥させたもの各1 mg/mlで処理して、それぞれのテストサンプルグループとした。8日後、分化した細胞内に蓄積された脂肪をオイルレッドO染色試薬で染色して、吸光度を光学濃度から定性的に測定した。阻害率(%)は、以下の実験式1を用いて計算した。
阻害率(%)=[テストグループのO.D.]/[対照グループのO.D.値]x100
結果、前駆脂肪細胞3T3−L1細胞は分化して成熟細胞となり、トリグリセリドがMDI処理グループの細胞内に蓄積されていることが確認された。トログリタゾン処理グループにおいてはトリグリセリドがより多く生成され、他のグループよりも濃い赤に染色された。一方、SB203580処理グループではトリグリセリドは生成されなかった。テストサンプル処理グループ、つまりカボチャ、スイカ、ヘチマタワシの抽出物、特にカボチャ処理グループにおける生成したトリグリセリドのレベルは、その投与量に応じて著しく低下した(図1と図2を参照のこと)。
実施例3〜5で調製した、カボチャの茎から単離したクロロホルム、酢酸エチル、ブタノールに可溶な成分の脂肪細胞分化とトリグリセリドレベルに対する阻害活性を測定するために、上記記載の実験例1−1と同一の工程を行った。各成分の処理濃度は100 ug/mlである。
実施例6で調製した、カボチャの茎から単離したcmc−9精製抽出物の脂肪細胞分化とトリグリセリドレベルに対する阻害活性を測定するために、上記記載の実験例1−1と同一の工程を行った。
実施例1〜6で調製した抽出物の、脂肪細胞分化工程における遺伝子の発現に対する制御効果を測定するために、以下の実験を行った。
実施例1〜6で調製した抽出物の、PPARアルファの活性化に対する制御効果を測定するために、以下の実験を行った。
[実験例4 高脂肪食マウスにおける、トリグリセリドの蓄積に対する阻害効果]
実施例1〜6で調製した抽出物の、高脂肪食マウスにおけるトリグリセリドの蓄積に対する阻害活性を測定するために、以下の実験を行った。
18〜20グラムの生後8〜10週間のC57/BLマウス(米国・ジャクソンラボ)を換気ケージにいれ、5つのグループに分けた。グループ1には通常の食餌を、残り4つのグループ、つまりグループ2〜5には脂肪分45%以上の高脂肪食(米国・ジャクソンラボ)を与えた。グループ1および2には蒸留水と、グループ3には実施例1で調製したPG105を8mg、16週間にわたって毎日経口で与えた。40 ugのゼニカル(ロシェ社)をグループ4に、5 ugのリダクティル(アボット社)をグループ5に毎日経口投与した。投与6週間後と13週間後にそれぞれ、血液サンプルを採取し、血中トリグリセリドレベルとコレステロールレベルを測定した。13週間後、マウスを殺して肝臓を取り出し、その血中トリグリセリドレベルを測定した。脂肪内臓および肝臓からmRNAを単離して、脂質吸収と代謝経路に関する遺伝子の発現をRT−PCR法を用いて調べた。
投与後6週間後と13週間後にそれぞれ、血液サンプルを採取し、血中トリグリセリドレベルとコレステロールレベルを測定した。
裸眼で肝臓を観察した結果、蒸留水のみを与えられた高脂肪食グループの投与13週後の肝臓は黄色がかった脂肪肝であり、一方、PG105抽出物を与えられた高脂肪食グループの肝臓は鮮紅色であった(図12を参照のこと)。
投与13週間後の肝臓内のトリグリセリド蓄積レベルを測定した。結果、蒸留水を与えられた高脂肪食マウスの蓄積トリグリセリドレベルは117.53 mg/dlであり、高脂肪食を与えられていないグループの結果の5倍であり、肝臓における過剰なトリグリセリドの蓄積を示した。これに対し、PG105を投与されたグループのトリグリセリド濃度は46.15 mg/dlであり正常の範囲にあり、裸眼での観察結果と一致した(図13を参照のこと)。
脂肪分解と脂質生成を含む脂肪代謝に関わる遺伝子の発現に対するウリ科植物の抽出物の効果を調査するために、脂肪細胞と肝臓からRNAを取り出し、RT−PCR法に供して脂肪代謝に関連する遺伝子の発現における変化を調査した。
実施例1〜6で調製した抽出物の、肥満体のマウス(db/db)の減量および脂質レベル制御効果を測定するために、以下の実験を行った。
実施例1〜6で調製した抽出物の、人間のボランティア患者の減量および脂質レベルの制御効果を測定するために、以下の実験を行った。
結果、以下の表1からわかるように、ヘチマタワシの茎から抽出した温水抽出物は強力な減量および脂質代謝制御効果を示した。
[表1]
<試験方法>
生後6週間のSPF SDラットに投与したテストサンプルの急性毒性試験を以下の手順で行った。
<結果>
いずれのグループまたは性別に関しても、死亡率、臨床的徴候、体重変化、および全体の所見に処置による効果の違いは見られなかった。経口投与における最低LD50値は100g/kgより高かった。これらの結果から、本発明によるテスト化合物が安全でありながらも強力であることがわかった。
以下に、製剤方法と賦形剤の種類とを説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。代表的な製剤例は以下に記載のとおりである。
<粉剤の調製>
PG105・・・・・・・・・・50mg
乳糖・・・・・・・・・・・・・100mg
タルク・・・・・・・・・・・・10mg
上記成分を混合して密封容器に充填することで粉剤を調製した。
<錠剤の調製>
PG105・・・・・・・・・50mg
コーンスターチ・・・・・・・100mg
乳糖・・・・・・・・・・・・100mg
ステアリン酸マグネシウム・・2mg
上記成分を混合、錠剤状にすることで錠剤を調製した。
<カプセルの調製>
PG105・・・・・・・・・50mg
コーンスターチ・・・・・・・100mg
乳糖・・・・・・・・・・・・100mg
ステアリン酸マグネシウム・・2mg
錠剤は、上記成分を混合し、通常のゼラチン調製方法でゼラチンカプセルに充填することで調製した。
<注射剤の調製>
cmc−9抽出物・・・・・・50mg
注射用蒸留水・・・・・・・・最適量
pH調整剤・・・・・・・・・最適量
注射剤は、通常の注射剤調製法に従って有効成分を溶解し、pHを約7.5に調整し、2mlのアンプルに全成分を充填して殺菌することで調製した。
<液剤の調製>
cmc−9抽出物・・・・・・0.1〜80g
糖・・・・・・・・・・・・・5〜10g
クエン酸・・・・・・・・・・0.05〜0.3%
カラメル・・・・・・・・・・0.005〜0.02%
ビタミンC・・・・・・・・・0.1〜1%
蒸留水・・・・・・・・・・・79〜94%
CO2ガス・・・・・・・・・0.5〜0.82%
液剤は、通常の液剤調製法に従って有効成分を溶解し、全成分を充填・殺菌することで調製した。
<ヘルスケア食品の調製>
cmc−9抽出物・・・・・・1000mg
ビタミン混合物・・・・・・・最適量
酢酸ビタミンA・・・・・・・70mg
ビタミンE・・・・・・・・・1.0mg
ビタミンB1・・・・・・・・0.13mg
ビタミンB2・・・・・・・・0.15mg
ビタミンB6・・・・・・・・0.5mg
ビタミンB12・・・・・・・・0.2mg
ビタミンC・・・・・・・・・10mg
ビオチン・・・・・・・・・・10mg
ニコチン酸アミド・・・・・・1.7mg
葉酸・・・・・・・・・・・・50mg
カルシウムパントテン酸・・・0.5mg
ミネラル混合物・・・・・・・最適量
硫酸鉄・・・・・・・・・・・1.75mg
酸化亜鉛・・・・・・・・・・0.82mg
炭酸マグネシウム・・・・・・25.3mg
リン酸一カリウム・ ・・・・15mg
第二リン酸カルシウム・・・・55mg
クエン酸カリウム・・・・・・90mg
炭酸カルシウム・・・・・・・100mg
塩化マグネシウム・・・・・・24.8mg
上記記載のビタミンおよびミネラル混合物には様々な変更を加えてもよく、そういった変更は本発明の精神と範囲から外れるものとはみなされない。
<健康飲料の調製>
PG105・・・・・・・・・1000mg
クエン酸・・・・・・・・・・1000mg
オリゴ糖・・・・・・・・・・100g
アプリコット濃縮物・・・・・2g
タウリン・・・・・・・・・・1g
蒸留水・・・・・・・・・・・900ml
健康飲料は、通常の健康飲料調製方法に従って有効成分を溶解、混合、85℃で1時間攪拌、濾過、全成分を1000mlのアンプルに充填・殺菌することで調製した。
Claims (13)
- ウリ科植物を乾燥させたものに重量で約5〜15倍の蒸留水を添加し抽出して植物抽出物を得たあと、抽出物を減圧下で濾過および乾燥させて温水に可溶な植物抽出物を得る第1工程と;前記温水可溶性抽出物を水に懸濁させたあと、ヘキサン、クロロホルム、酢酸エチル、ブタノール溶媒による分別に極性の低い順で供してそれぞれの有機溶媒に可溶な成分を得る第2工程と;前記クロロホルム可溶性成分をヘキサン:クロロホルム:メタノール(16:15:1)の混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して11の副成分に分ける第3工程と;前記副成分のうち第9番目の成分をクロロホルム:メタノールの混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーとHPLCに繰り返し供し、「cmc−9」と命名された、強力な抗肥満および抗脂肪生成活性を有し図12のTLCスペクトルを示す独創的な精製抽出物を得る工程からなる方法によって調製される、ウリ科植物から単離した精製抽出物。
- 抗脂肪生成活性と抗肥満活性とを有する、請求項1に記載のウリ科植物の抽出物または精製抽出物を有効成分として、肥満と脂肪生成関連疾病を治療および予防するに効果的な量で含むことを特徴とする医薬品組成物。
- 前記ウリ科植物が、カボチャ(Cucurbita moschata DUCH)、スイカ(Citrullus vulgaris SCHRAD)、ヘチマタワシ(Luffa cylindrical L. ROEM)、ヒョウタン(Lagenaria siceraria STANDL. var. depressa HERA)、およびきゅうり(Cucumis sativus L)から選択されることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記ウリ科植物がカボチャ(Cucurbita moschata DUCH)、スイカ(Citrullus vulgaris SCHRAD)、ヘチマタワシ(Luffa cylindrical L. ROEM)から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の化合物。
- 前記ウリ科植物の抽出物がその茎または葉から抽出されることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記肥満および脂肪生成関連疾病が、肥満、2型糖尿病、脂肪症、高脂血症、心疾患、アテローム性動脈硬化症等を含むことを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記抽出物が未精製抽出物または無極性溶媒可溶性抽出物であることを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 前記未精製抽出物が温水可溶性抽出物であることを特徴とする、請求項7に記載の組成物。
- 前記無極性溶媒がヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチルから選択されることを特徴とする、請求項7に記載の組成物。
- 前記無極性溶媒がクロロホルムであることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
- 組成物が上記抽出物を組成物の総重量につき約0.02〜90重量%含有することを特徴とする、請求項2〜10のいずれかに記載の組成物。
- 肥満と脂肪生成関連疾病を予防および緩和するための、請求項1に記載のウリ科植物の未精製抽出物、無極性溶媒可溶性抽出物、またはcmc−9抽出物、および食品学的に許容範囲にある添加物を含むことを特徴とするヘルスケア食品。
- 前記食品がヘルスケア飲料であることを特徴とする、請求項12に記載のヘルスケア食品。
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