CN109549942A - 刺囊酸在治疗脑梗死药物制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于制药技术领域的一种刺囊酸在治疗脑梗死药物制备中的应用。本发明的刺囊酸属于小分子三萜类化合物,可减少脑缺血再灌注损伤后神经组织死亡,减轻脑缺血再灌注损伤后脑梗塞体积,减轻神经功能缺损。刺囊酸可以用作活性成分应用于溶剂中,加入药学上可接受的辅料或辅助性成分可制成口服剂或注射剂。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域,具体涉及一种刺囊酸在治疗脑梗死药物制备中的应用。
背景技术
缺血性脑卒中是全球数百万人残疾和死亡的主要原因之一,具有高发病率,高致残率,高死亡率的特点。脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion,CIR)是脑卒中后脑细胞功能障碍加重及继发损伤的主要原因。其病理机制包括氧自由基损伤、钙离子超载、线粒体损伤、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、炎症损伤以及血脑屏障破坏。在上述影响因素的相互作用下,最终引起脑细胞水肿,神经细胞损伤、甚至坏死以及凋亡。目前,静脉组织纤溶酶原激活物被认为是最有效的急性缺血性中风治疗措施(《Stroke》,2018 03;49(3),e46-e110)。然而,由于时间窗口狭窄和严格的入选标准,其临床应用受到很大限制。因此,寻找能够拮抗或减少有害的生物化学和分子信号通路或增加或增强保护缺血损伤后神经元凋亡或坏死而减轻缺血性脑损伤神经保护剂被认为在急性缺血性中风治疗研究中具有广阔前景。化学药物如神经保护剂和自由基清除剂以及钙离子拮抗剂已被用于治疗脑缺血。目前研究较多的神经保护药物主要包括Na+通道阻断剂、NMDA谷氨酸受体拮抗剂、氧自由基清除剂和抗炎药物。在动物实验中证实的这些神经保护剂的治疗试验尚未在人体中显示出治疗益处。在过去的几十年中,许多临床试验都失败了,因为这些药物对患者没有任何保护作用,或者对患者的毒性、副作用不能耐受。在药物研究领域,应用中成药及其提取物改善脑缺血再灌注损伤引起了越来越多的注意,许多中成药及其有效成分对缺血性脑损伤的治疗具有多靶点、多环节的作用特点,因此在预防和治疗脑缺血再灌注损伤方面具有极大的价值。寻找天然来源(如草药或植物)副作用最小的神经保护剂可能是开发安全有效的中风治疗药物的理想策略。
刺囊酸(Echinocystic acid,EA),一种五环三萜类化合物,来源于皂荚、孟自合欢,猪牙皂等多种药用植物中。近年来,它的多种功能在不同领域得到了广泛的研究,越来越多的数据表明EA具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗心肌细胞缺氧复氧损伤、保护血管内皮细胞(EPCs)氧化损伤等药理活性。最近的研究发现,EA可促进神经母细胞瘤Neuro2a细胞的神经突生长,增强老龄小鼠的空间记忆;此外EA能够改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆和学习障碍。表明EA可以穿透血脑屏障,并可以对脑功能产生积极影响。然而目前没有任何研究证实EA对脑缺血再灌注神经损伤及远期功能改善有恢复作用。
发明内容
本发明的目的在于提供刺囊酸(EA)在治疗脑梗死药物制备中的应用。
本发明基于脑组织在大脑中动脉闭塞(MCAO)后,通常导致局部脑血流量显著减少,从而降低灌注压和血氧含量,并导致一系列相互依赖的神经毒性事件,包括谷氨酸兴奋毒性,Ca2+超负荷,氧化应激,一氧化氮(NO)生产和炎症,最终导致神经细胞死亡,如细胞凋亡,坏死,铁坏死和自噬等。
本发明创造性地将五环三萜类化合物刺囊酸,制备为溶剂,通过小剂量腹腔给药的方式,在脑缺血前1小时将其注射入小鼠MCAO模型中,发现其可以有效减轻小鼠的神经功能缺损。随后我们在脑缺血再灌注时,再灌注后1小时,再灌注后3小时分别腹腔注射该药物溶剂,用药老鼠的脑梗塞体积及神经功能缺损均好于单纯脑缺血再灌注损伤未干预的老鼠。
既往研究显示,EA具备穿过血脑屏障的能力,发明人在脑缺血再灌注后1小时我们使用尾静脉注射的方式,将EA的溶剂注入脑缺血再灌注小鼠体内,发现该干预手段对脑缺血再灌注的神经损伤仍具有保护作用。
本发明人对该神经保护的机制进行了研究,发现EA可以有效抑制脑缺血再灌注损伤后神经组织的凋亡反应,具体表现为使用EA干预后Western blot测定的凋亡标志蛋白明显下降。脑组织损伤后抑制神经细胞凋亡可以保护神经组织,减轻神经功能缺损这一结论是公知的。因此EA对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的抑制是控制脑缺血再灌注后神经功能缺损发生和发展的关键。
本发明所涉及的物质EA在脑缺血再灌注前和脑缺血再灌注后注入动物体内,均起到了很好的神经保护作用,这涉及了该药物对脑缺血再灌注后神经损伤的预防和治疗双方面的作用。EA可以通过腹腔注射和静脉注射的用药途径对脑缺血再灌注后神经损伤进行干预,尤其静脉注射剂型更加适合临床的运用。所以在本发明的工业实施中可将药品制成适应以上用药途径的各种剂型。
与现有技术相比,本发明具有如下优异效果:本发明阐述的EA属于小分子三萜类化合物,可以用作活性成分应用于溶剂中,开拓了其在脑缺血再灌注损伤中的新用途,可减少脑缺血再灌注损伤后神经组织死亡,减轻脑缺血再灌注损伤后脑梗塞体积,减轻神经功能缺损。
附图说明
图1为EA对小鼠脑缺血再灌注损伤后Longa神经功能评分的影响图(*,P<0.05versus I/R group,)。
图2EA对小鼠脑缺血再灌注损伤后mNSS神经功能评分的影响图(*,P<0.05versusI/R group,)。
图3为EA对小鼠脑缺血再灌注损伤后体积的影响图(*,P<0.05versus I/Rgroup,)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述,但本发明的实施不仅限于此。
实施例1对小鼠脑出血后神经行为学评分的影响
刺囊酸,批号:510-30-5,使用时以2%DMSO溶解后加少量吐温80助溶后稀释成所需浓度。试验动物为雄性ICR小鼠,非近交系封闭群,体重25-30g,合格证号:医动字01-300l,由中国扬州大学比较医学院实验动物中心提供。实验室室温20-22℃,相对湿度40%-60%,换气扇通气,自然光源12h/日,笼养,每笼8只,每三日清扫笼舍一次。
本实验参照Longa法采用小鼠左侧大脑中动脉闭塞模型(middle cerebralartery occlusion model,MCAO),ICR小鼠术前禁食6-8小时,异氟烷气体诱导麻醉,小鼠面罩连接扣于口鼻处,约30s后小鼠四肢松弛,自主呼吸深而慢,提示麻醉诱导成功,迅速剪掉颅顶部鼠毛,消毒颈部及颅顶部后,75%酒精脱碘1次在小鼠的颅顶部位横向切口,暴露颅骨,用镊子轻轻剥离颅骨表面的结缔组织,将激光多普勒血流仪的光纤探头用生物胶固定在前囟后方2mm左侧5mm的部位,即大脑中动脉供血区域.将小鼠仰卧固定,颈正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),用微动脉夹暂时夹闭ICA、CCA,在ECA远心端结扎和剪一小口,用硅胶包被的尼龙单丝线由剪口送入ICA,当线栓进入深度在9-11mm时遇阻力,此时可在多普勒血流仪器上观察到血流的急剧下降,固定线栓从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时开始计时,45min后缓慢将丝线拔出,并将ECA近心端结扎,迅速松开CCA处动脉夹缝合小鼠颈部及头部皮肤,并用活力碘消毒伤口,完成动物模型。手术结束后将小鼠置于调温型电热台板上维持小鼠体温,控制温度在36-37℃直至小鼠从手术中恢复清醒。实验组小鼠在建立脑缺血再灌注模型后立即腹腔注射EA 25mg/kg。假手术加药组只予EA 25mg/kg。假手术(Sham)组动物麻醉后,仅分离暴露ICA、ECA分支,电凝笔凝断颈外侧血管分支,不闭塞大脑中动脉。将小鼠放回笼中,24h后,由一不了解分组情况的观察者对小鼠进行神经行为学评分,包括Longa评分、mNSS评分,而后进行统计学分析。
Longa评分:0分:无神经功能缺损症状;1分:不能完全伸展对侧前肢;2分:行走时向对侧旋转,出现“追尾”现象;3分:站立不稳,向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识障碍。
mNSS评分:改良的神经严重程度评分(mNSS)测试由运动、感觉、反射和平衡检测组成。1分代表不能完成检测或者缺少反射,分数越高代表缺损越严重。神经功能评分在0-18(正常为0,最大缺损为18)。
本试验数据均以Excel软件处理。实验数据结果见表1、2:
表1
假手术组与假手术加药组相比无统计学差异,与缺血再灌注组或加药组相比P<0.05,n=7,均有统计学差异。缺血再灌注组与加药组相比P<0.05,n=7。
表2
假手术组与假手术加药组相比无统计学差异,与缺血再灌注组或加药组相比P<0.05,n=7,均有统计学差异。缺血再灌注与加药组相比P<0.05,n=7。
上述两项神经行为学评分均提示EA预处理后可以减轻脑缺血再灌注损伤小鼠的神经功能缺损,对预后有一定的保护作用。
实施例2对小鼠脑缺血再灌注损伤体积的影响
刺囊酸,批号:510-30-5,使用时以2%DMSO溶解后加少量吐温80助溶后稀释成所需浓度。试验动物为雄性ICR小鼠,非近交系封闭群,体重25-30g,合格证号:医动字01-300l,由中国扬州大学比较医学院实验动物中心提供。实验室室温20-22℃,相对湿度40%-60%,换气扇通气,自然光源12h/日,笼养,每笼8只,每三日清扫笼舍一次。
本实验参照Longa法采用小鼠左侧大脑中动脉闭塞模型(middle cerebralartery occlusion model,MCAO)模型,ICR小鼠术前禁食6-8小时,异氟烷气体(4-5%)诱导麻醉,小鼠面罩连接扣于口鼻处,约30s后小鼠四肢松弛,自主呼吸深而慢,提示麻醉诱导成功,迅速剪掉颅顶部鼠毛,消毒颈部及颅顶部后,75%酒精脱碘1次在小鼠的颅顶部位横向切口,暴露颅骨,用镊子轻轻剥离颅骨表面的结缔组织,将激光多普勒血流仪的光纤探头用生物胶固定在前囟后方2mm左侧5mm的部位,即大脑中动脉供血区域.将小鼠仰卧固定,颈正中线切口,沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜,分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)用微动脉夹暂时夹闭ICA、CCA,在ECA远心端结扎和剪一小口,用硅胶包被的尼龙单丝线由剪口送入ICA,当线栓进入深度在9-11mm时遇阻力,此时可在多普勒血流仪器上观察到血流的急剧下降,固定线栓从线栓进入脑血管至血流下降遇阻力时开始计时,45min后缓慢将丝线拔出,并将ECA近心端结扎,迅速松开CCA处动脉夹缝合小鼠颈部及头部皮肤,并用活力碘消毒伤口,完成动物模型。手术结束后将小鼠置于调温型电热台板上维持小鼠体温,控制温度在36-37℃直至小鼠从手术中恢复清醒。实验组小鼠在建立脑缺血再灌注模型后立即腹腔注射EA25mg/kg。假手术加药组只予EA25mg/kg。假手术(Sham)组动物麻醉后,仅分离暴露ICA、ECA分支,电凝笔凝断颈外侧血管分支,不闭塞大脑中动脉。
脑血流再灌注24h后将小鼠腹腔注射10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉,经小鼠心脏左心室灌注0.9%的氯化钠溶液处死,迅速取出脑组织,将脑组织置于-20℃冰箱冰冻10-15min自前极(anterior pole,AP)连续切取5片2mm厚度脑冠状切片,置于1%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)37℃水浴中避光反应30min,每隔5分钟翻动一次,使着色均匀,然后置于4%甲醛中性缓冲液(pH7.4)中固定过夜。将固定后的脑片按序置于平板上,微距相机(Canon,Japan)拍摄脑片,利用Image J(IPP.6.0)图像分析软件计算并统计脑梗死体积,统计方法如前所述。
本试验数据均以Excel软件处理。实验数据结果见表3:
表3
两组相比:P<0.05;n=4
实验结果显示,实验组小鼠脑缺血再灌注损伤体积较单纯缺血再灌注组减少,提示EA可明显减轻小鼠脑缺血再灌注损伤体积。
以上公开的仅为本发明的具体实施例,但是,本发明并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (5)
1.刺囊酸在治疗脑梗死药物制备中的应用。
2.刺囊酸在治疗脑缺血再灌注损伤药物制备中的应用。
3.刺囊酸在治疗脑缺血后神经功能损伤药品制备中的应用。
4.一种治疗脑梗死的药物组合物,其特征在于,所述药物由有效量的刺囊酸为活性成分,加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
5.根据权利要求4所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物为口服剂或注射剂。
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