KR20110078774A

KR20110078774A - 고순도 무수결정형 도세탁셀 제조방법

Info

Publication number: KR20110078774A
Application number: KR1020090135668A
Authority: KR
Inventors: 조진숙; 김문숙; 송재영; 윤정환; 윤종원; 최호준
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2009-12-31
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2011-07-07
Also published as: JP5911989B2; EP2519510A4; WO2011081373A3; JP2013516406A; EP2519510A2; US20130046104A1; JP2015178520A; KR101149600B1; EP2519510B1; WO2011081373A2; US8410294B2

Abstract

본 발명은 고순도 무수결정형 도세탁셀 제조방법에 관한 것으로 보다 구체적으로 본 발명은 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법은 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있으며, 나아가 잔류용매 함량이 의약품 잔류용매 기준보다 현저히 낮아, 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

고순도, 무수결정형, 도세탁셀, 크로마토그래피, 농축

Description

고순도 무수결정형 도세탁셀 제조방법{Method for preparing highly pure anhydrous docetaxel}

본 발명은 고순도 무수결정형 도세탁셀 제조방법에 관한 것으로 보다 구체적으로 본 발명은 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도세탁셀은 탁소이드 족에 속하는 광범위한 항종양 및 항백혈병 활성을 갖는 암화학요법제이다. 유럽 또는 인도 주목의 잎 및 껍질에서 추출된 10-Deacetylbaccatin III의 화학적 변형으로부터 유도한 반합성 항암제이며, 특히 유럽을 비롯하여 세계 여러 국가에서 널리 인정받아 유방암 및 난소암 등에 대한 치료제로서 시판되고 있는 의약품이다.

현재 반합성 도세탁셀을 재결정화하여 무수결정형 도세탁셀을 제조하기 위해서, 디클로로메탄과 헥산을 이용한 재결정, 아세톤과 헥산을 이용한 재결정 및 아세토나이트릴과 정제수를 이용한 재결정하는 방법이 알려져 있으나 상기 방법에 의하여 제조된 무수결정형 도세탁셀은 순도가 현저히 낮아, 문제가 되고 있다. 특히 의학 용도로 이용되는 도세탁셀의 경우 순도를 높이는 것이 무엇보다 중요하다.

특히 고순도의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는데 있어서 어려운 점은 불순물이나 잔류용매를 제거하는 것이며, 특히 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 경우, 도세탁셀의 안정성이 파괴되어 7-에피머(epimer), 즉 4-아세톡시-2α-벤조일옥시-5-β, 20-에폭시-1,7α,10β-트리하이드록시-9-옥소-탁-11-엔-13-α-일(2R,3S)-3-t-부톡시카르보닐아미노-2'-하이드록시-3-페닐프로피오네이트라는 불순물이 생성되므로 고순도의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 것이 매우 어려운 실정이다.

따라서 불순물의 함량이 적어 고순도의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있는 방법의 개발이 간절히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 고순도 무수결정형 도세탁셀을 제조하기 위한 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 (a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 2차 정제 후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계 및 (d) 상기 (c) 단계에서 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 (a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 고압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 2차 정제 후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계 및 (d) 상기 (c) 단계에서 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 (a) 반합성 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 1차 정제후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 농축된 도세탁셀을 고압 순상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계 및 (d) 상기 (c) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 2차 정제 후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계 및 (d) 상기 (c) 단계에서 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 고압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 2차 정제 후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계 및 (d) 상기 (c) 단계에서 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 반합성 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계, b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 1차 정제후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계, (c) 상기 (b) 단계에서 농축된 도세탁셀을 고압 순상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계 및 (d) 상기 (c) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 고순도 무수결정형 도세탁셀을 제조하기 위하여 크게 3가지로 조합된 공정들을 포함하며, 이를 통해 반합성 도세탁셀로부터 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있다. 즉 도 1에서 기재한 바와 같이 반합성 도세탁셀 시료의 대한 순도 HPLC 결과와, 도 5, 도 8 및 도 11에 기재된 바와 같이 본 발명의 정제 공정을 거쳐 제조된 무수결정형 도세탁셀의 HPLC 결과를 비교해 보면, 본 발명의 제조방법에 의하여 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀이 제조될 수 있음을 알 수 있다.

특히 저압 또는 고압 역상 크로마토그래피를 실시 한 후 수득한 도세탁셀 분취액의 정제효율을 높이기 위해서, 산을 첨가하여 농축을 실시한 후 생성된 도세탁셀 침전물은, 역상 크로마토그래피의 분취액에 포함되어 있던 일부 불순물의 제거 및 함량을 감소시킴으로써 상대적으로 도세탁셀의 순도를 매우 높일 수 있다.

본 발명에서 상기 분취액(aliquot)은 크로마토그래피의 실험결과로 수득한 도세탁셀이 함유된 분획물을 의미하며, 상기 수득방법은 당업자가 용이하게 결정할 수 있다.

본 발명에서 저압은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 5 psi 내지 1000psi 이며, 본 발명에서 고압은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1500 psi 내지 4000psi이다.

이하 본 발명을 조합 공정별로 보다 상세히 설명한다.

1. 고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법 I

(a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계

반합성 도세탁셀을 먼저 저압 순상 크로마토그래피로 1차 정제한다.

상기 저압 순상 크로마토그래피를 수행하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 전개용매로 탄소수 1 내지 2의 할로겐화 알칸류 및 탄소수 1 내지 6의 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 2의 할로겐화 알칸류는 디클로로메탄 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 탄소수 1 내지 6의 유기용매는 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 바람 직하게는 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출(step elution) 방법을 이용할 수 있으며, 1.0%(v/v) 내지 20%(v/v) 메탄올/디클로로메탄 혼합용액, 더욱 바람직하게는 2.5%(v/v) 내지 10%(v/v) 메탄올/디클로로메탄 혼합용액을 전개용매로 사용할 수 있다.

상기 저압 순상 크로마토그래피를 실시하기 위해서는 이외 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 바람직하게는 컬럼의 충진제로 실리카겔 60(63~200㎛)를 사용할 수 있다.

본 공정을 수행함으로써 반합성 도세탁셀(순도 45%)을 순도 94% 정도로 정제할 수 있다.

(b) 1차 정제된 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계

상기 (a) 단계에서 얻은 순도 90% 이상의 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피로 2차 정제한다.

상기 저압 역상 크로마토그래피를 수행하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 전개용매로 탄소수 1 내지 3의 유기용매 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 3의 유기용매는 탄소수 1 내지 3의 알코올 또는 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 알코올은 바람직하게는 메탄올, 에탄올 및 프로판올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 아이소크래틱(isocratic) 또는 스텝 용출(step elution) 방법을 이용할 수 있으며, 30%(v/v) 내지 90%(v/v) 메탄올/ 정제수 혼합용액, 바람직하게는 60%(v/v) 내지 85%(v/v) 메탄올/정제수 혼합용액을 사용할 수 있다.

상기 저압 순상 크로마토그래피를 실시하기 위해서는 이외 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 실시할 수 있으며, 바람직하게는 컬럼의 충진제로 통상적인 소수성 수지로 63~200㎛ ODS(Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 사용할 수 있다.

본 공정을 수행함으로써 반합성 도세탁셀(순도 45%)을 순도 99.4% 정도로 정제할 수 있다.

(c) 2차 정제된 도세탁셀을 산으로 농축하는 단계

상기 (b)에서 얻은 순도 99.4%의 도세탁셀 분취액에 산(acid)을 첨가하여 농축한다.

상기 유기용매를 제거하기 위해 산으로 농축하는 경우 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 35℃ 내지 60℃, 더 바람직하게는 40 내지 50℃에서 농축할 수 있으며, 농축시간은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 1 내지 10시간 동안 농축할 수 있다.

상기 산은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid) 및 트리프루오로아세틱 엑시드(trifluoroacetic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 농축시 전 단계(즉 b 단계)에서 수득한 도세탁셀 분취액(aliquot)에 대하여 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v), 더 바람직하게는 0.2%(v/v) 내지 5%(v/v)의 산을 가하여 농축할 수 있다.

상기 농축 후 필요한 경우 감압 건조하여 건고물을 수득할 수도 있다.

상기 공정에 의해서 반합성 도세탁셀(순도 45%)을 순도 99.5% 이상으로 정제할 수 있다.

(d) 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계

상기 (c)에서 수득한 순도 99.5% 이상의 도세탁셀을 재결정하여 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있다.

상기 재결정 용매는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 아세톤과 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 (c) 단계에서 수득한 도세탁셀을 아세톤에 녹인 후 헥산을 첨가시켜서 재결정할 수 있다. 상기 아세톤은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 도세탁셀의 농도가 1%(w/v) 내지 30%(w/v)가 되도록 투여될 수 있으며, 상기 헥산은 상기 아세톤 투여량에 대하여 1배 내지 10배 부피로 투여될 수 있다.

2. 고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법 Ⅱ

상기 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계는 상기 1의 (a) 단계에 기술한 바와 동일한 방법으로 수행될 수 있다.

(b) 1차 정제된 도세탁셀을 고압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계

상기 (a) 단계에서 얻은 순도 90% 이상의 도세탁셀을 고압 역상 크로마토그래피로 2차 정제한다.

상기 고압 역상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계는 상기 1의 (b) 단계에 기술한 바와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 다만 컬럼의 충진제로 바람직하게는 통상적인 소수성 수지로서 5 내지 100㎛, 바람직하게는 10 내지 50㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18), C8 또는 C4 등을 이용할 수 있다.

상기 (b) 단계를 통하여 순도 99.4% 정도의 도세탁셀 활성을 갖는 분취액을 제조할 수 있다.

(c) 2차 정제된 도세탁셀을 산으로 농축하는 단계

상기 (b)에서 얻은 도세탁셀 분취액에 산(acid)을 첨가하여 농축한다.

상기 산에 의한 농축방법에 대해서는 상기 1의 (c)에 기재된 바와 같다.

상기 산에 의한 농축을 통하여 순도 99.7% 이상의 도세탁셀을 수득할 수 있다.

(d) 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계

상기 (c)에서 수득한 순도 99.7% 이상의 도세탁셀을 재결정하여 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있다.

상기 재결정 방법에 대해서는 상기 1의 (d)에 기재된 바와 같다.

본 공정에 의해서 순도 99.8% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 수득할 수 있다.

3. 고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법 Ⅲ

(a) 반합성 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계

반합성 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피로 1차 정제할 수 있다.

상기 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계는 상기 1의 (b) 단계에 기술한 바와 동일한 방법으로 수행될 수 있다.

상기 공정에 의하여 순도 80 내지 84% 정도의 도세탁셀 활성을 갖는 분취액을 분리할 수 있다.

(b) 1차 정제된 도세탁셀을 산으로 농축하는 단계

상기 (a)에서 얻은 도세탁셀 분취액에 산(acid)을 첨가하여 농축한다.

상기 산에 의한 농축을 통하여 순도 90 내지 94% 이상의 도세탁셀을 수득할 수 있다.

(c) 농축된 도세탁셀을 고압 순상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계

상기 (b)에서 얻은 도세탁셀을 고압 순상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제할 수 있다.

상기 고압 순상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계는 상기 1의 (a) 단계에 기술한 바와 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 다만 컬럼의 충진제로 바람직하게는 실리카겔 20㎛를 이용할 수 있다.

상기 공정에 의하여 순도 99.5 내지 99.6%의 도세탁셀을 정제할 수 있다.

(d) 2차 정제된 도세탁셀을 재결정하는 단계

상기 (c)에서 2차 정제된 도세탁셀을 재결정하여 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있다.

본 공정에 의해서 순도 99.7 내지 99.8% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 수득할 수 있다.

상기 본 발명의 순도 99.5%이상, 수율 77% 내지 88%인 고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법에 대한 결과를 정리하면 하기 표 1과 같다.

본 발명에서 도세탁셀의 순도 및 회수율은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 측정할 수 있으며, 바람직하게는 하기 표 2의 HPLC 분석방법을 이용하여 측정할 수 있다.

기기	휴렛펙커드 1100 HPLC
컬럼	옥타데실실리카(C18) 4.6x250 mm, 5micro
컬럼 온도	35℃
이동상	아세토나이트릴:물 = 35 : 65%(v/v) ; 농도구배
유속	1ml/분
주입량	10ul
검출기	UV(230nm)

본 발명의 고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법은 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있으며, 나아가 잔류용매 함량이 의약품 잔류용매 기준보다 현저히 낮아, 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법 I

<1-1> 저압 순상 크로마토그래피

반합성 도세탁셀 180g(순도 45%)을 디클로로메탄 1000ml에 완전히 녹여 시료로 준비하였다. 실리카겔 60(63~200㎛)으로 충진한 컬럼을 이용하여 하기 표 3의 운전 조건으로 크로마토그래피를 실시하였다.

상기 시료주입 후 약 40분 경과후 도세탁셀의 활성분액을 분취한 뒤, 온도 45℃에서 감압농축을 실시하여 도세탁셀 분취액을 농축하였다. 상기 농축이 완료되면, 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시하였다.

상기 실시후 회수된 건고물의 양은 98g, 순도 94%, 수율은 97%이었다.

<1-2> 저압 역상 크로마토그래피

상기 실시예 <1-1>의 건고물 98g을 메탄올 1100ml에 완전히 녹인 후, 정제수 275ml를 첨가하여 시료로 준비하였다. 소수성 수지 63~200㎛ ODS (Octadecylsilylated, C18)로 충진한 컬럼으로 표 4의 운전조건으로 실시하였다.

상기 시료 주입 후 약 45 분 경과한 다음 도세탁셀의 활성분액을 분취하였다.

상기 도세탁셀 분취액은 3510ml로 순도 99.4%, 수율은 97%이었다.

<1-3> 산에 의한 농축

1-3-1. 산에 의한 농축 (0.2%)

상기 실시예 <1-2>의 도세탁셀 분취액 2000ml(도세탁셀 양 43g, 순도 99.4)에 대해서 아세트산 4ml(0.2%(v/v))을 첨가하고 온도 45℃에서 감압 농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하여 도세탁셀 침전물의 생성을 유도하고, 상기 침전물을 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 후 수득한 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 2일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 41g, 순도 99.7%, 수율은 98%이었다.

1-3-2. 산에 의한 농축 (1%)

상기 실시예 <1-2>의 도세탁셀 분취액 350ml(도세탁셀 양 7.6g, 순도 99.4)에 대해서 아세트산 3.5ml(1%(v/v))을 첨가하고 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하여 도세탁셀 침전물 생성을 유도하고, 상기 생성된 침전물을 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과하였다. 감압여과후 수득한 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 2일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 7.5g, 순도 99.6%, 수율은 98%이었다.

1-3-3. 산에 의한 농축 (5%)

상기 실시예 <1-2>의 도세탁셀 분취액 350ml(도세탁셀 양 7.6g, 순도 99.4)에 대해서 아세트산 17.5ml(5%(v/v))을 첨가하고, 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하여 도세탁셀 침전물 생성을 유도하고, 상기 생성된 침전물을 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과하였다. 상기 감압여과후 수득한 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 2일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 7.4g, 순도 99.7%, 수율은 98%이었다.

<1-4> 재결정

1-4-1. 아세톤: 헥산 = 1:1.8 (v/v)

상기 실시예 <1-3-1>의 순도 99.7%의 건고물 7.17g을 상온에서 아세톤 72ml에 완전히 녹인 후 헥산 129.6ml을 교반하면서 10분 동안 첨가한 뒤, 4℃ 온도 하에 12시간 동안 보관하여 재결정을 유도하였다. 12시간 경과 후, 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

회수된 건고물의 양은 6.7, 순도 99.8%, 수율은 93%인 무수결정형 도세탁셀을 수득하였다.

1-4-2. 아세톤: 헥산 = 1:2.0 (v/v)

상기 실시예 <1-3-2>의 순도 99.6%의 건고물 7.2g을 상온에서 아세톤 72ml에 완전히 녹인 후 헥산 144ml을 교반하면서 10분 동안 첨가한 뒤, 4℃ 온도 하에 12시간 동안 보관하여 재결정을 유도하였다. 12시간 경과 후, 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 6.9 순도 99.8%, 수율은 96% 인 무수결정형 도세탁셀을 수득하였다.

1-4-3. 아세톤: 헥산 = 1:2.3 (v/v)

상기 실시예 <1-3-3>의 순도 99.7%의 건고물 7.3g을 상온에서 아세톤 72ml에 완전히 녹인 후 헥산 165.6ml을 교반하면서 10분 동안 첨가한 뒤, 4℃ 온도 하에 12시간 동안 보관하여 재결정을 유도하였다. 12시간 경과 후, 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 감압여과 해서 얻은 도세탁셀은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 6.9, 순도 99.8%, 수율은 94% 인 무수결정형 도세탁셀을 수득하였다.

<1-5> 실시예 1의 결과 정리

상기 실시예 1에 대한 각 공정별 순도 및 수율을 정리하여 하기 표 5 내지 에 기재하였다.

상기 실시예 1에 대한 잔류용매 함량은 표 6에 기재하였다.

	메탄올(ppm)	디클로로메탄(ppm)	아세톤(ppm)	헥산(ppm)	초산(ppm)
제한농도기준(ICH가이드라인^*)	3,000	600	5,000	290	5,000
실시예 1-4-1	35	26	20	58	25
실시예 1-4-2	42	34	27	64	31
실시예 1-4-3	37	28	32	61	48

* ICH 가이드라인: International conference on Harmonization, 의약품 허용 잔류용매 기준 가이드 라인

상기와 같이, 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피, 저압 역상 크로마토그래피, 산에 의한 농축 및 재결정의 공정을 실시함으로써 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있으며, 나아가 잔류용매 함량이 의약품 잔류용매 기준보다 현저히 낮아, 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 2>

고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법 Ⅱ

<2-1> 저압 순상 크로마토그래피

반합성 도세탁셀 0.6g(순도 45%)을 디클로로메탄 3.2 ml에 완전히 녹여 시료로 준비하였다. 실리카겔 60(63~200㎛)로 충진한 컬럼으로 표 7의 운전조건으로 실시하였다.

상기 시료주입 후 약 40 분이 경과한 다음, 도세탁셀의 활성분액을 분취한 뒤 온도 45℃에서 감압농축을 실시하여 도세탁셀 분취액을 농축하였다. 상기 농축이 완료되면 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.34g, 순도 94%, 수율은 96%이었다.

<2-2> 고압 역상 크로마토그래피

상기 실시예 <2-1>의 건고물 0.34g을 메탄올 2.7ml에 완전히 녹인 후 정제수 1.1ml를 첨가하여 시료를 준비하였다. 소수성 수지 옥타데실실리카(c18, 20um)로 충진한 컬럼으로 표 8의 운전조건으로 실시하였다.

상기 시료주입 후 약 45 분 경과한 다음 도세탁셀의 활성분액을 분취하였다.

상기 도세탁셀 분취액은 105ml로 순도 99.4%, 수율은 97%이었다.

<2-3> 산에 의한 농축(1%)

상기 실시예 <2-2>의 도세탁셀 분취액 105ml에 대해서 아세트산 1.05ml(1%(v/v))을 첨가하고 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하여 도세탁셀 침전물 생성을 유도하고, 상기 침전물을 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 후 수득한 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.25g, 순도 99.8%, 수율은 98%이었다.

<2-4> 재결정

상기 실시예 <2-3>의 순도 99.8%의 도세탁셀 0.25g을 상온에서 아세톤 2.5ml에 완전히 녹인 후 헥산 2.75ml(아세톤의 2.3배)을 교반하면서 10분 동안 첨가한 뒤, 4℃ 온도 하에 12시간 동안 보관하여 재결정을 유도하였다. 12시간 경과 후, 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

회수된 건고물의 양은 0.22g, 순도 99.9%, 수율은 92% 인 무수결정형 도세탁셀을 수득하였다.

<2-5> 실시예 2의 결과 정리

상기 실시예 2에 대한 각 공정별 순도 및 수율은 표 9과 같다.

	도세탁셀 순도(%)	7-에피머(%)	회수율(%)
출발물질: 반합성 도세탁셀	45	10.045	100
저압순상크로마토그래피	94	1	96
고압역상크로마토그래피	99.4	0.021	95
산에 의한 농축(1%)	99.8	0.018	96
재결정[아세톤 : 헥산 = 1: 2.3(v/v)]	99.9	0.010	92
총	99.9	0.010	80

상기 실시예 2에 대한 잔류용매 함량은 표 10과 같다.

	메탄올(ppm)	디클로로메탄(ppm)	아세톤(ppm)	헥산(ppm)	초산(ppm)
제한농도기준(ICH가이드라인^*)	3,000	600	5,000	290	5,000
재결정	45	30	25	48	35

상기와 같이, 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피, 고압 역상 크로마토그래피, 산에 의한 농축 및 재결정의 공정을 실시함으로써 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있으며, 나아가 잔류용매 함량이 의약품 잔류용매 기준보다 현저히 낮아, 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

< 실시예 3>

고순도 무수결정형 도세탁셀의 제조방법 Ⅲ

<3-1> 저압 역상 크로마토그래피

3-1-1. 메탄올: 정제수 = 65.5:34.5(v/v)

반합성 도세탁셀 0.6g(순도 45%)을 메탄올 4.8ml에 완전히 녹인 후 정제수 1.2ml를 첨가하여 시료를 준비하였다. 옥타데실실리카(c18, 100um)로 충진한 컬럼으로 상기 표 4의 운전조건으로 실시하였다 상기 시료주입 후 약 45분 경과한 다음 도세탁셀의 활성분액을 분취하였다.

상기 도세탁셀 분취액은 120ml로 순도 84%, 수율은 95%이었다.

3-1-2. 메탄올: 정제수 = 67.5:32.5(v/v)

반합성 도세탁셀 0.6g(순도 45%)을 메탄올 4.8ml에 완전히 녹인 후 정제수 1.2ml 를 첨가하여 시료를 준비하였다. 옥타데실실리카(c18, 100um)로 충진한 컬럼으로 표 4의 운전조건으로 실시하였다 상기 시료주입 후 약 45 분 경과한 다음, 도세탁셀의 활성분액을 분취하였다.

상기 도세탁셀 분취액은 105ml로 순도 84%, 수율은 94%이었다.

3-1-3. 메탄올: 정제수 = 70:30(v/v)

반합성 도세탁셀 0.6g(순도 45%)을 메탄올 4.8ml에 완전히 녹인 후 정제수 1.2ml의 정제수를 첨가하여 시료를 준비하였다. 옥타데실실리카(c18, 100um)로 충진한 컬럼으로 표 4의 운전조건으로 실시하였다. 상기 시료주입 후 약 45 분 경과한 다음, 도세탁셀의 활성분액을 분취하였다.

상기 도세탁셀 분취액은 85ml로 순도 80%, 수율은 96%이었다.

상기 실시예 <3-1>을 정리하면 하기 표 11과 같다.

<3-2> 산에 의한 농축

3-2-1. 산에 의한 농축(0.5%)

상기 실시예 <3-1-1>의 도세탁셀 분취액 120ml에 대해서 아세트산 0.6ml(0.5%)을 첨가하고 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거함으로써 도세탁셀 침전물 생성을 유도하고, 상기 침전물을 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 후 수득한 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.27g, 순도 94%, 수율은 99%이었다.

3-2-2. 산에 의한 농축(1%)

상기 실시예 <3-1-2>의 도세탁셀 분취액 105ml에 대해서 아세트산 1.05ml(1%)을 첨가하고 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거함으로써 도세탁셀 침전물 생성을 유도하고, 상기 침전물을 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 후 수득한 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시한다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.27g, 순도 94%, 수율은 98%이었다.

3-2-3. 산에 의한 농축(5%)

상기 실시예 <3-1-3>의 도세탁셀 분취액 85ml에 대해서 아세트산 4.2ml(5%)을 첨가하고 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하면 도세탁셀 침전물이 생기며, 이 침전물을 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.26g, 순도 92%, 수율은 98%이었다.

<3-3> 고압 순상 크로마토그래피

실시예 <3-2>에서 수득한 건고물을 디클로로메탄 2 ml에 완전히 녹여 시료로 준비하였다. 실리카겔 20㎛로 충진한 컬럼으로 표 12의 운전조건으로 실시하였다. 상기 시료주입 후 약 40 분 경과한 다음, 도세탁셀의 활성분액을 분취한 뒤 온도 45℃에서 감압농축을 실시하여 도세탁셀 분취액을 농축하였다. 상기 농축이 완료되면 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 1일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 순도 및 수율을 표 13에 기재하였다.

<3-4> 재결정

상기 실시예 <3-3>의 순도 99.8%의 도세탁셀을 표 14와 같이 실시한 뒤 4℃ 온도 하에 12시간 동안 보관하여 재결정을 유도하였다. 12시간 경과 후, 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 감압여과 해서 얻은 도세탁셀은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하여 무수결정형 도세탁셀을 수득하였다.

상기 회수된 건고물의 순도 및 수율을 하기 표 14에 기재하였다.

<3-5> 실시예 3의 결과 정리

상기 실시예 3 에 대한 각 공정별 순도 및 수율은 표 15과 같다.

상기 실시예 3에 대한 잔류용매 함량은 표 16에 기재하였다.

	메탄올 (ppm)	디클로로메탄 (ppm)	아세톤 (ppm)	헥산 (ppm)	초산 (ppm)
제한농도기준 (ICH가이드라인^*)	3,000	600	5,000	290	5,000
재결정-1	29	45	31	65	40
재결정-2	38	40	40	48	38
재결정-3	31	37	39	55	22

상기와 같이, 반합성 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피, 산에 의한 농축, 고압 순상 크로마토그래피 및 재결정의 공정을 실시함으로써 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조할 수 있으며, 나아가 잔류용매 함량이 의약품 잔류용매 기준보다 현저히 낮아, 항암제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

< 비교예 1>

저압 순상 크로마토그래피로 1차 정제 후, 저압 역상 크로마토그래피로 2차 정제한 다음 산을 첨가하지 않고 농축한 경우

상기 실시예 <1-2>에서 얻은 도세탁셀 분취액 중 70ml(도세탁셀 양 1.0g, 순도 99.4%)을 산을 첨가하지 않고 바로 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하면 도세탁셀 침전물이 생기며, 이 침전물을 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.94g, 순도 88%, 수율은 80%이었다.

< 비교예 2>

저압 순상 크로마토그래피로 1차 정제 후, 저압 역상 크로마토그래피로 2차 정제한 다음 0.01%의 산을 첨가하여 농축한 경우

상기 실시예 <1-2>에서 얻은 도세탁셀 분취액 중 70ml(도세탁셀 양 1.0g, 순도 99.4%)을 아세트산 0.007ml(0.01%(v/v))을 첨가하고, 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하면 도세탁셀 침전물이 생기며, 이 침전물을 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압 하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.90g, 순도 85%, 수율은 77%이다.

< 비교예 3>

저압 순상 크로마토그래피로 1차 정제 후, 저압 역상 크로마토그래피로 2차 정제한 다음 20%의 산을 첨가하여 농축한 경우

상기 실시예 <1-2>에서 얻은 도세탁셀 분취액 중 70ml(도세탁셀 양 1.0g, 순도 99.4%)을 아세트산 14ml(20%(v/v))을 첨가하고 온도 45℃에서 감압농축을 실시하였다. 상기 감압농축으로 메탄올을 최대한 제거하면 도세탁셀 침전물이 생기며, 이 침전물을 여과지(Whatman No. 42)를 이용하여 감압여과 하였다. 상기 감압여과 해서 얻은 도세탁셀 침전물은 온도 45℃, 760mmHg 감압하에 진공건조를 6일 동안 실시하였다.

상기 회수된 건고물의 양은 0.87g, 순도 85%, 수율은 72%이다.

도 1은 정제공정 전 시료, 즉 반합성 도세탁셀의 순도를 분석한 HPLC 결과이다.

도 2은 실시예<1-4-2>로 정제된 도세탁셀의 순도를 분석한 HPLC 결과이다.

도 3은 실시예 <1-1>의 저압 순상 크로마토그래피의 분취 크로마토그램 결과이다.

도 4은 실시예 <1-2>의 저압 역상 크로마토그래피의 분취 크로마토그램 결과이다.

도 5는 실시예 <1-1>, <1-2>, <1-3-2> 및 <1-4-2>의 순도를 분석한 HPLC 결과를 위에서부터 나타낸 것이다.

도 6은 실시예 <2-1>의 저압 순상 크로마토그래피의 분취 크로마토그램 결과이다.

도 7은 실시예 <2-2>의 고압 역상 크로마토그래피의 분취 크로마토그램 결과이다.

도 8은 실시예 <2-1>, <2-2>, <2-3>, <2-4>의 순도를 분석한 HPLC 결과를 위에서부터 나타낸 것이다

도 9는 실시예 <3-1-1>의 저압 역상 크로마토그래피의 분취 크로마토그램 결과이다.

도 10은 실시예 <3-3> 고압 순상 크로마토그래피의 분취 크로마토그램 결과이다.

도 11는 실시예 <3-1-1>, <3-2-1>, <3-3>, <3-4>의 순도를 분석한 HPLC 결과를 위에서부터 나타낸 것이다

도 12은 실시예 <1-4-2>의 XRD 결과이다.

도 13은 실시예 <1-2>의 순도와 비교예 1, 2 와 3의 순도를 비교한 HPLC 결과를 위에서부터 나타낸 것이다.

Claims

(a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 2차 정제 후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계 및;

(d) 상기 (c) 단계에서 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
(a) 반합성 도세탁셀을 저압 순상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 고압 역상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 2차 정제 후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계 및;

(d) 상기 (c) 단계에서 농축된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
(a) 반합성 도세탁셀을 저압 역상 크로마토그래피를 수행하여 1차 정제하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 1차 정제된 도세탁셀을 1차 정제후 수득한 도세탁셀 분취액 대비 0.05%(v/v) 내지 10%(v/v) 농도의 산을 가하여 농축하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 농축된 도세탁셀을 고압 순상 크로마토그래피를 수행하여 2차 정제하는 단계 및;

(d) 상기 (c) 단계에서 2차 정제된 도세탁셀을 재결정하는 단계를 포함하는 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저압 순상 크로마토그래피 또는 고압 순상 크로마토그래피를 수행하는 경우, 전개용매로 탄소수 1 내지 2의 할로겐화 알칸류 및 탄소수 1 내지 6의 유기용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것인 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 탄소수 1 내지 2의 할로겐화 알칸류는 디클로로메탄 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 탄소수 1 내지 6의 유기용매는 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저압 역상 크로마토그래피 또는 고압 역상 크로마토그래피를 수행하는 경우, 전개용매로 탄소수 1 내지 3의 유기용매 및 정제수로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것인 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 탄소수 1 내지 3의 유기용매는 탄소수 1 내지 3의 알코올 또는 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산은 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid) 및 트리프루오로아세틱 엑시드(trifluoroacetic acid)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재결정 용매는 아세톤과 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 순도 99.5% 이상의 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 아세톤을 도세탁셀의 농도가 1%(w/v) 내지 30%(w/v)가 되도록 투여하고, 상기 헥산은 상기 아세톤 투여량에 대하여 1배 내지 10배 부피로 투여하는 것인 무수결정형 도세탁셀을 제조하는 방법.