KR20110056497A - 혈소판 검사 방법 및 혈소판 검사 장치 - Google Patents

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Abstract

미약한 혈소판 활성화 시약을 혼합한, 항응고 처리된 혈액을, 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면(血小板易接着面)을 구비한 캐필러리(capillary)를 통과시켜, 상기 혈액의 캐필러리 내에서의 거동(擧動)을 관찰 또는 측정함으로써, 혈소판의 기능을 검사하는 것을 특징으로 하는, 혈소판 기능 검사 방법.

Description

혈소판 검사 방법 및 혈소판 검사 장치{BLOOD-PLATELET TEST METHOD AND BLOOD-PLATELET TEST DEVICE}
본 발명은, 미량의 혈액을 사용하여 혈액의 혈소판 기능을 조사하기 위한 방법 및 검사 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 혈액의 혈소판 기능 검사를 행하기 위한 마이크로칩을 사용한 방법 및 검사 장치에 관한 것이다.
(혈소판 응집 검사의 종래 기술의 문제점)
동맥에서의 혈전(血栓) 형성(백색 혈전) 또는 1차 지혈(止血)에서 혈소판의 활성화 및 응집은 중심적 기능을 한다.
혈소판은 혈관이 장해를 입었을 경우에, 혈관 내피 세포 하에 존재하는 콜라겐에 대하여, 직접적, 비직접적으로 결합한다. 혈류가 완만한 환경 하[낮은 전단응력(shearing stress) 하]에서는 GPVI 등 콜라겐 수용체에 의한 직접적인 결합이 주가 되고, 혈류가 빠른 환경 하(높은 전단응력 하)에서는 콜라겐에 vWF가 결합하고, vWF에 대하여 혈소판의 GPIbα 수용체가 결합함으로써 간접적으로 콜라겐에 결합한다. 콜라겐과의 직접적, 간접적 상호 작용은 혈소판을 활성화하고, 이 자극에 의해 농염(濃染) 과립 및 α 과립으로부터 ADP, 세라토닌 등 다양한 혈소판 활성화 물질이 방출된다.
이들 방출된 혈소판 활성화 인자는 자기(自己)의 혈소판 및 주위의 혈소판을 활성화시킨다. 활성화된 혈소판은 피브리노겐 수용체인 GPIIb, IIIa가 활성화형으로 구조 변화되어, 피브리노겐에 대해 높은 친화성형(親和性型)이 된다. 2량체인 피브리노겐을 통하여 활성화 혈소판이 계속해서 가교(架橋)되어 혈소판 응집을 형성한다.
그러나, 종래의 혈소판 응집능(凝集能) 측정 장치의 대부분은, 다량의 혈소판 활성화 시약의 자극에 의한 혈소판의 활성화 및 응집 과정을 측정하는 방법이었다(비특허 문헌 1).
그러므로, 생리적 혈소판 활성화 조건과는 동떨어진 환경 하에서의 혈소판 활성화 반응이었으며, 각 수용체의 선천적 기능 이상 등 분명한 기능의 차이를 측정할 수는 있었으나, 보다 생리적인 혈소판 기능을 측정하기가 곤란했다.
PFA-100(Platelet Function Analyzer: 비특허 문헌 2)은 고층화(固層化)된 콜라겐에 대한 접촉, 전단응력, 혈소판 야기(惹起) 물질과의 접촉에 의한 종합적인 혈소판의 활성화에 의해 구멍의 폐색을 측정하는 측정계이며, 종래의 단독 혈소판 활성화 야기 물질의 자극에 의한 혈소판 응집보다 생리적으로 근사한 환경 하에서의 측정계이다. 그러나, 데이터의 불균일, 및 구멍을 통과하는 혈액에 포함되는 야기 물질의 농도의 조정이 불가능하고, 혈전증 발증(發症)에 의해 혈소판이 이미 활성화되어 있는 환자에서 볼 수 있는, 혈소판 활성화 야기 물질이 매우 낮은 농도, 또는 존재하지 않는 상황에서 야기되는 혈소판 응집 및 혈소판 기능 부전 환자의 혈소판 기능 측정의 경우에 있어서 매우 높은 농도의 혈소판 야기 물질의 자극에 의한 혈소판 응집능을 적절하게 측정할 수 없었다.
또한, 특허 문헌 1에는, 혈액을 모세관 내로 통과시키고, 다음으로, 칸막이 부재의 개구부를 통과시키고; 그리고, 칸막이 부재의 개구부에서, 혈전의 형성이 개구부를 폐지(閉止)할 때까지 필요한 시간을 측정하는 것을 특징으로 하는 혈소판 기능의 측정 방법이 개시되어 있지만, 이 방법으로는, 혈소판 활성화 시약이 대량으로 부가되고 있고, 생체 내에서 혈소판이 활성화되어 있지만 혈소판의 수가 감소하고 있는 경우나, 혈소판의 수는 정상적이지만 혈소판 기능이 약한 경우 등, 생체를 반영한 상세한 혈소판 기능을 측정하기가 곤란했다.
일본 특허출원 공개번호 2007-298511호 공보
「혈소판 응집능 검사」Thrombosis and Circulation, vol.12, No.4, p17-20, 2004 「PFA-100에 의한 혈소판 응집능 측정」Thrombosis and Circulation, vol.13, No.3, p90-94, 2005
예를 들면, 패혈증, 파종성 혈관 내 응고 증후군(DIC) 등의 질환에 있어서는, 혈관 내피 장애 및 혈전 형성에 의해 혈소판은 활성화된 상태에 있고, 또한 혈소판과 백혈구의 복합체 등도 형성된다. 또한, 지속적인 혈전 형성에 의해 혈소판은 현저하게 소모되어 생체 내에서 혈전이 형성됨에도 불구하고, 이와 동시에 출혈 증상을 초래하는 경우가 있다. 종래의 혈소판 기능 시험에 있어서는, 이와 같은 증상을 엄밀하게 반영한 검사를 행하기가 곤란했다.
예를 들면, 탁도법(濁度法)으로는, 혈소판의 수가 감소하고 있어도, 혈소판 야기 물질에 대한 반응성이 항진(亢進)하고 있으면, 혈소판 기능 항진(강함)으로 판정되었다. 또한, 생체 내의 염증 반응 등에 의해 형성되어 혈전 형성에 큰 영향을 미치는 혈소판·백혈구의 복합체는 다혈소판 혈장을 만들기 위한 원심 분리에 의해 적혈구와 함께 침전되므로 다혈소판 혈장에는 포함되지 않는다.
또한, PFA-100을 사용한 경우에는, 혈소판의 기능이 강한 환자도 약한 환자도 동일한 야기 물질의 농도로 측정하므로, 야기 물질이 없거나 또는 매우 희박한 상태에서 일어나는 자연 응집 야기 또는 항혈소판약 투여 환자에 대하여 야기 물질 농도가 매우 높은 상태에서 그 약제 효과를 확인하는 검사를 적절하게 실시할 수 없다. 또한, PFA-100에 의한 측정으로 폐색 시간이 연장된 경우에도 혈소판 기능이 약한 경우와 혈소판 기능이 항진되고 있으나(생체 내에서 활성화되고 있음), 혈소판의 수가 적은 경우의 데이터의 비교 등이 곤란했다.
본 발명은, 전술한 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 혈류와 동등 환경 하에서의 혈소판 기능을 미량의 혈액을 사용하여 효율적으로 정확하게 평가할 수 있는 장치 및 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 항응고 처리된 혈액을, 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면(血小板易接着面)을 가진 캐필러리(capillary)를 통과시켜, 상기 혈액의 캐필러리 내에서의 거동(擧動)을 관찰 또는 측정함으로써, 혈소판의 기능을 검사하는 것을 특징으로 하는, 혈소판 기능 검사 방법을 제공한다.
여기서, 상기 항응고 처리가 구연산 또는 헤파린 또는 히루딘에 의한 것이 바람직하다.
또한, 상기 혈소판이접착면은 코팅된 콜라겐 또는 유리로 된 것이 바람직하다.
또한, 상기 항응고 처리된 혈액은 미약한 혈소판 활성화 처리가 행해진 것이 바람직하고, 미약한 혈소판 활성화 처리는, 불가역적인 혈소판 응집을 일으키지 않는 양의 혈소판 활성화 시약을 항응고 처리된 혈액에 혼합한 것에 의한 것이 바람직하다.
여기서, 혈소판 활성화 처리가 혈소판 활성화 시약에 의해 이루어지고, 상기 혈소판 활성화 시약이 아데노신2인산이며, 0.001∼5 μM의 농도로 되도록 항응고 처리된 혈액과 혼합되거나, 또는 상기 혈소판 활성화 시약이 아라키돈산이며, 0.001∼1 mM의 농도로 되도록 항응고 처리된 혈액과 혼합되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 캐필러리 내의 적어도 일부가, 상기 캐필러리에서의 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되고, 또한 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로(流路) 분할벽을 구비한 유로 분할부를 가지는 것이 바람직하다.
상기 유로 분할부의 각 유로의 폭은 10∼200 ㎛인 것이 바람직하다.
상기 혈소판이접착면은 캐필러리의 유로 분할부에 설치되는 것이 바람직하다.
상기 캐필러리는 마이크로칩 내에 형성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 혈소판 기능 검사 방법에 있어서는, 상기 항응고 처리된 혈액, 바람직하게는 미약한 혈소판 활성화 처리가 행해진 항응고 처리된 혈액이, 펌프에 의해 캐필러리 내에 도입되어, 상기 펌프에 인가되는 상기 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 압력 센서에 의해 측정함으로써, 혈소판 기능을 검사하는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 항응고 처리된 혈액은, 캐필러리 및 펌프에 접속된 혈액 수용부 내에 저장되고, 펌프에 의해 혈액보다 비중이 가벼운 액체를 혈액 수용부에 도입함으로써, 혈액을 캐필러리에 도입하고, 상기 액체의 유입압을 측정함으로써 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 항응고 처리된 혈액은, 캐필러리 및 펌프에 접속된 혈액 수용부 내에 저장되고, 펌프에 의해 혈소판 활성화 시약을 혈액 수용부에 도입함으로써 상기 혈액 수용부 내에서 혈소판 활성화 시약과 항응고 처리된 혈액을 혼합하고, 상기 혈소판 활성화 시약과 혼합된 혈액을 캐필러리에 도입하여, 상기 혈소판 활성화 시약의 유입압을 측정함으로써 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 혈소판 기능 검사 방법에 있어서는, 상기 캐필러리는 혈액 수용부에 접속되어 있고, 상기 혈액 수용부 내에서 혈소판 활성화 시약과 혼합된 항응고 처리된 혈액이 캐필러리를 통과하도록 구성되어 있는 것이 바람직하다. 여기서, 혈소판 활성화 시약은, 측정 직전에 항응고 처리된 혈액에 혼합되는 것이 바람직하다. 또는, 혈소판 활성화 시약은 항응고 처리된 혈액과 혈소판 활성화 시약과의 혼합액 중의 혈소판 활성화 시약의 농도가 직선적 농도 구배(勾配) 또는 단계적 농도 구배로 증가하도록, 항응고 처리된 혈액과 혼합되는 것이 바람직하다. 또한, 항응고 처리된 혈액과 혈소판 활성화 시약과의 혼합액은 교반되는 것이 바람직하다.
본 발명은, 또한, 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면을 구비한 캐필러리와, 상기 캐필러리 내의 적어도 일부에 설치되고, 상기 캐필러리에서의 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되고, 또한 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로 분할벽을 구비한 유로 분할부를 가지는, 혈소판 기능 검사 장치를 제공한다.
여기서, 상기 캐필러리가 마이크로칩 내에 형성되어 있는 것이 바람직하고, 2개 이상의 캐필러리가 마이크로칩 내에 형성되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 후자의 경우, 캐필러리의 폭이 10∼150 ㎛ 및 50∼200 ㎛의 2종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 상기 혈소판 기능 검사 장치는, 송액(送液) 펌프를 구비한 것이 바람직하다. 또한, 상기 마이크로칩의 내부를 촬영하는 카메라를 구비한 것이 바람직하다.
또한, 상기 혈소판 기능 검사 장치는, 마이크로칩 내부의 혈소판이접착면의 하류에 혈소판이접착면을 통과한 혈액의 폐액(廢液)을 저류(貯留)하는 폐액 저류부를 구비한 것이 바람직하다. 이 경우, 폐액 저류부의 깊이가 100㎛ 이상인 것이 더욱 바람직하다. 폐액 저류부의 1개소에 마이크로칩의 외부로 관통하는 구멍이 형성되어 있는 것이 더욱 바람직하고, 마이크로칩 표면의 상기 구멍에 상당하는 위치에 혈액 흡수재가 설치되어 있는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 청구항 1에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 항응고 처리된 혈액을, 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면을 구비한 캐필러리를 통과시켜, 상기 혈액의 캐필러리 내에서의 거동을 관찰 또는 측정함으로써, 혈소판이접착면을 통과할 때의 전단응력에 의한 혈소판 활성화를 지표로 하여, 혈소판의 기능을 검사할 수 있다.
본 발명의 청구항 2에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 항응고 처리가 구연산 또는 헤파린 또는 히루딘에 의한 것이므로, 염가로 항응고 처리를 행할 수 있다.
혈소판이접착면으로서 코팅한 콜라겐을 사용하는 경우에 있어서, 사용하는 항응고제가 구연산 등의 칼슘 킬레이트제인 경우에는, 혈소판 활성화 시약을 혼합한 혈액을 코팅한 콜라겐 상을 통과시켜 혈소판 기능 측정을 행하는 것이 더욱 적합하다. 한편, 칼슘 킬레이트제 이외의 항응고제, 특히 히루딘을 사용한 경우에는 구연산으로 항응고 처리한 경우에 비해, 콜라겐 상에서 더욱 신속하게 강고(强固)한 혈소판 응집이 일어나, 캐필러리를 폐색시키므로 혈소판 활성화 시약을 사용하지 않아도 혈소판 기능 검사를 안정적으로 행할 수 있게 된다. 이 때에도 혈소판 기능의 비정상, 항혈소판제의 사용 등으로 인해 혈소판 응집을 관찰할 수 없는 경우에 있어서는 혈소판 활성화 시약을 혼합한 후 측정함으로써 혈소판 기능의 저하 상태나 항혈소판제의 효과를 측정할 수 있게 된다. 1장의 칩에 유로의 홈 폭이 상이한 유로를 배치하고, 히루딘 및 구연산에 의해 항응고 처리된 혈액을 사용하여 측정함으로써, 혈소판 응집능의 강도 및 혈소판 야기 물질에 대한 감수성, 항혈소판제의 효과 등을 종합적으로 측정할 수 있게 된다.
본 발명의 청구항 3에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 혈소판은 접착면이 코팅된 콜라겐으로 이루어지므로, 보다 생리적인 혈소판 기능의 측정을 행할 수 있다.
본 발명의 청구항 4에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 혈소판이접착면이 유리로 이루어지므로, 더욱 염가의 물질로 혈소판 기능을 측정할 수 있다.
본 발명의 청구항 5에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 항응고 처리된 혈액은 미약한 혈소판 활성화 처리가 행해진 것이므로, 보다 생리적인 조건으로 혈소판 기능의 측정을 행할 수 있고, 또한, 다양한 질환을 반영한 검사 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구항 6에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 미약한 혈소판 활성화 처리는, 불가역적인 혈소판 응집을 일으키지 않는 양의 혈소판 활성화 시약을 항응고 처리된 혈액에 혼합하는 것에 의하기 때문에, 미약한 혈소판 활성화 처리를 간편하게 행할 수 있고, 또한, 혈소판 활성화 시약에 의한 혈소판 활성화와 혈소판이접착면에서의 전단응력에 의한 혈소판 활성화를 종합하여 보다 생리적인 혈소판 활성화를 관찰할 수 있다.
본 발명의 청구항 7에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 혈소판 활성화 시약이 아데노신2인산이며, 0.001∼5 μM의 농도로 되도록 항응고 처리된 혈액과 혼합되므로, 보다 생리적 조건 하에서 혈소판 기능을 검사할 수 있어, 다양한 질환을 반영한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구항 8에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 혈소판 활성화 시약이 아라키돈산이며, 0.001∼1 mM의 농도로 되도록 항응고 처리된 혈액과 혼합되므로, 보다 생리적 조건 하에서 혈소판 기능을 검사할 수 있어, 다양한 질환을 반영한 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구항 9에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 캐필러리 내의 적어도 일부가, 상기 캐필러리에서의 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되고, 또한 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로 분할벽을 구비한 유로 분할부를 가지므로, 전단응력에 의한 혈소판의 활성화가 일어나기 쉽다.
본 발명의 청구항 10에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 유로 분할부의 각 유로의 폭이 10∼200 ㎛이므로, 작은 혈소판 응집괴가 형성된 경우 그 스캐폴드(scaffold)가 되어, 높은 혈류, 높은 전단응력 하에서도 혈류에 의해 쓸려버리지 않아 내부 압력을 상승시킬 수 있다.
본 발명의 청구항 11에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 혈소판이접착면이, 캐필러리의 유로 분할부에 설치되어 있으므로, 혈소판 응집과가 유로 분할부에서 더욱 유지되기 쉽다.
본 발명의 청구항 12에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 캐필러리가 마이크로칩 내에 형성된 것이므로, 미량의 혈액으로 검사를 행할 수 있다.
본 발명의 청구항 13에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 항응고 처리된 혈액은, 펌프에 의해 캐필러리 내에 도입되고, 상기 펌프에 인가되는 상기 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 압력 센서에 의해 측정함으로써, 혈소판 기능을 검사하여, 혈소판 기능을 정량적으로 측정할 수 있다.
본 발명의 청구항 14에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 항응고 처리된 혈액은, 캐필러리 및 펌프에 접속된 혈액 수용부 내에 저장되고, 펌프에 의해 혈액보다 비중이 가벼운 액체를 혈액 수용부에 도입함으로써, 혈액을 캐필러리에 도입하고, 상기 액체의 유입압을 측정함으로써 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정하기 때문에, 펌프가 혈액으로 오염되지 않아 바람직하다.
본 발명의 청구항 15에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 상기 항응고 처리된 혈액은, 캐필러리 및 펌프에 접속된 혈액 수용부 내에 저장되고, 펌프에 의해 혈소판 활성화 시약을 혈액 수용부에 도입함으로써 상기 혈액 수용부 내에서 혈소판 활성화 시약과 항응고 처리된 혈액을 혼합하고, 상기 혈소판 활성화 시약과 혼합된 혈액을 캐필러리에 도입하여, 상기 혈소판 활성화 시약의 유입압을 측정함으로써 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정하기 때문에, 신속한 검사가 가능하게 된다.
본 발명의 청구항 16에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 혈소판 활성화 시약은, 항응고 처리된 혈액과 혈소판 활성화 시약과의 혼합액 중의 혈소판 활성화 시약의 농도가 직선적 농도 구배 또는 단계적 농도 구배로 증가하도록, 항응고 처리된 혈액과 혼합되므로, 폭 넓은 혈소판 활성화 시약의 농도에서의 혈소판 활성화를 측정할 수 있어서, 혈소판의 기능 항진 및 기능 저하를 한 번의 실험으로 측정할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명의 청구항 17에 따른 혈소판 기능 검사 방법에 의하면, 항응고 처리된 혈액과 혈소판 활성화 시약과의 혼합액이 교반되므로 더욱 정확한 검사 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 청구항 17에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면을 구비한 캐필러리와, 상기 캐필러리 내의 적어도 일부에 설치되고, 상기 캐필러리에서의 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되고, 또한 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로 분할벽을 구비한 유로 분할부를 가지므로, 혈소판을 효율적으로 활성화할 수 있어 상기 혈소판 검사 방법에 적합하다.
본 발명의 청구항 18에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 상기 캐필러리가 마이크로칩 내에 형성된 것이므로, 작성이 용이하며, 또한, 미량 샘플에서의 검사가 가능하다.
본 발명의 청구항 19에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 상기 마이크로칩 내에 2개 이상의 캐필러리가 형성된 것이므로, 복수의 검사를 동시에 행할 수 있다.
본 발명의 청구항 20에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 캐필러리의 폭이 10∼150 ㎛ 및 50∼200 ㎛의 2종 이상이므로, 미량의 샘플로 복수의 검사를 동시에 행할 수 있다.
본 발명의 청구항 21에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 송액 펌프를 구비한 것이므로, 캐필러리 내로의 혈액의 유입 속도를 제어할 수 있으므로, 바람직하다.
본 발명의 청구항 22에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 상기 마이크로칩의 내부를 촬영하는 카메라를 구비한 것이므로, 혈소판의 활성화를 관찰할 수 있다. 설치되는 카메라는 동영상, 정지화상을 촬영할 수 있는 것이 바람직하다. 일정 시간 간격으로 자동적으로 내부의 동영상 및 정지화상을 촬영해 보존하면, 측정 후에 혈소판의 활성화 상태를 경시적(經時的)으로 또한 시각적으로 평가할 수 있어 바람직하다. 유로 내를 파노라마 사진 또는 연속적인 정지화상으로서 전체를 촬영할 수 있으면 보존 및 객관적 비교가 용이하여 더욱 바람직하다. 정지화상, 동영상을 촬영할 때, 투과형 광원, 즉 카메라와 반대측에 광원을 설치하여 촬영을 행하면 더욱 선명한 화상을 촬영할 수 있다.
본 발명의 청구항 23에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 마이크로칩 내부의 혈소판이접착면의 하류에 혈소판이접착면을 통과한 혈액의 폐액을 저류하는 폐액 저류부를 구비한 것이므로, 혈액의 폐액을 흡인하여 제거할 필요가 없어, 간편하게 검사를 행할 수 있다.
본 발명의 청구항 24에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 폐액 저류부의 깊이가 100㎛ 이상이므로, 혈액의 폐액을 충분히 수용할 수 있다.
본 발명의 청구항 25에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 폐액 저류부의 1개소에 마이크로칩의 외부로 관통하는 구멍을 형성한 것이므로, 폐액 저류부의 공기가 외부로 빠져 내압이 상승하지 않고 저류부에 혈액을 저류할 수 있게 된다.
본 발명의 청구항 26에 따른 혈소판 기능 검사 장치에 의하면, 마이크로칩 표면의 상기 구멍에 상당하는 위치에 혈액 흡수재를 설치한 것이므로, 혈액 흡수재에 혈액의 폐액을 흡수시킬 수 있고, 혈액의 폐액이 비산되지 않아 바람직하다.
도 1은 본 발명의 혈소판 관측 장치를 구성하는 마이크로칩의 제1 형태예를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 혈소판 관측 장치의 제1 형태예를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 혈소판 관측 장치를 구성하는 마이크로칩의 제2 형태예를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 혈소판 관측 장치의 제2 형태예를 나타낸 도면이다.
도 5는 실시예 1에서의 펌프(109)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 6은 실시예 2에서의 펌프(109)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 3에서의 펌프(109)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 8은 실시예 4에서의 펌프(109)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 9는 실시예 5에서의 펌프(109)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 10은 실시예 6에서의 펌프(109)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 11은 실시예 7에서의 혈소판 활성화의 상태를 나타낸 도면(사진)이다. A: ADP 없음, B: 0.025μM ADP, C: 0.05μM ADP, D: 0.1μM ADP.
도 12는 실시예 8∼10에서의 펌프(209)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 혈소판 관측 장치의 제3 형태예를 나타낸 도면이다.
도 14는 실시예 11∼13에서의 펌프(209)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 15는 실시예 14 및 15에서의 펌프(209)의 압력 변화를 나타낸 도면이다.
도 16은 아라키돈산 첨가 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내는 도면이다. A는 실시예 16(a)의 검체(檢體) G의 아라키돈산 첨가 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내고, B는 검체 G의 아스피린 100mg 복용 후의 실시예 16(a)와 동일한 실험에서의 압력 상승을 나타낸다.
도 17은 아라키돈산 첨가 혈액의 10μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸 도면이다. C는 실시예 16(b)의 검체 G의 아라키돈산 첨가 혈액의 10μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내고, D는 검체 G의 아스피린 100mg 복용 후의 실시예 16(b)와 동일한 실험에서의 압력 상승을 나타낸다.
도 18은 아라키돈산 첨가 혈액의 5μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸 도면이다. E는 실시예 16(c)의 검체 G의 아라키돈산 첨가 혈액의 5μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내고, F는 검체 G의 아스피린 100mg 복용 후의 실시예 16(c)와 동일한 실험에서의 압력 상승을 나타낸다.
도 19는 콜라겐 첨가 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸 도면이다. A는 실시예 16(d)의 검체 G의 콜라겐 6μl 첨가 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내고, B는 실시예 18의 콜라겐 18μl 첨가 혈액, C는 실시예 18의 12μl 첨가 혈액, D는 검체 G의 아스피린 100mg 복용 후, 실시예 16(d)와 동일한 실험에서의 압력 상승을 나타낸다.
도 20은 콜라겐 첨가 혈액의 10μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸 도면이다. E는 실시예 16(e)의 검체 G의 콜라겐 첨가 혈액의 10μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내고, F는 검체 G의 아스피린 100mg 복용 후의 실시예 16(e)와 동일한 실험에서의 압력 상승을 나타낸다.
도 21은 콜라겐 첨가 혈액의 5μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸 도면이다. F는 실시예 16(f)의 검체 G의 콜라겐 첨가 혈액의 5μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내고, G는 검체 G의 아스피린 100mg 복용 후의 실시예 16(f)와 동일한 실험에서의 압력 상승을 나타낸다.
도 22는 실시예 21의 0.4μg/ml 또는 0.8μg/ml의 ReoPro로 처리된 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내는 도면이다. control은 실시예 19의 혈액(ReoPro 처리하지 않음)의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸다.
도 23은 실시예 21의 0.4μg/ml 또는 0.8μg/ml의 ReoPro로 처리된 혈액의 7μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내는 도면이다. control은 실시예 20의 혈액(ReoPro 처리하지 않음)의 7μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸다.
도 24는 실시예 22의 0.01μg/ml 또는 0.1μg/ml의 OS-1으로 처리된 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내는 도면이다. control은 OS-1으로 처리하지 않은 혈액의 20μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸다.
도 25는 실시예 22의 0.01μg/ml 또는 0.1μg/ml의 OS-1으로 처리된 혈액의 7μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타내는 도면이다. control은 OS-1으로 처리하지 않은 혈액의 7μl/min에서의 압력 상승 결과를 나타낸다.
먼저, 도면을 참조하여 본 발명의 혈소판 검사 장치를 설명한다. 그리고, 본 발명에 있어서, 「혈액」이란, 전혈(全血) 및 다혈소판 혈장을 포함한다.
도 1은, 본 발명의 혈소판 검사 장치를 구성하는 마이크로칩의 제1 형태예를 나타내는 개념도이다. 이하, 도 1을 참조하여 설명한다.
도 1의 (A)는, 마이크로칩(1)의 캐필러리(101)가 되는 홈이 표면에 파인 제1 기판(100)의 평면도이다. 이 홈의 단면 형상은, 요자(凹字)형, U자형, V자형 등 임의의 형상을 가질 수 있다. 혈소판 응집괴(凝集塊)는 무르기 때문에, 압력 상승을 측정하기 위해서는 홈의 깊이는 10∼200 ㎛ 이하인 것이 바람직하다. 홈의 폭은 10∼100 ㎛인 것이 바람직하다.
그리고, 캐필러리(101)가 되는 홈의 제1 단부(端部)(유입구측 단부)와 제2 단부(배출구측 단부) 사이의 일부에는, 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되는 복수개의 유로 분할벽(103)이 설치되어, 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로 분할부(102)를 형성하고 있다.
또한, 유로 분할벽(103)의 간격은 200㎛ 이하인 것이 바람직하다. 폭이 200㎛ 이하이면 혈소판 응집괴가 형성된 경우, 높은 혈류, 높은 전단응력 하에서도 혈류에 의해 쓸려버리지 않아 내부 압력을 상승시킬 수 있다. 또한, 유로 분할부(102)에 서, 캐필러리(101)의 폭은 유로 분할벽(103)에 의해 5개 이상으로 분할되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 유로의 폭이 5개 이상으로 분할되어 있으면, 각 분할 유로의 폐색이 평균화되어 불균일이 적은 데이터를 얻기 쉽다.
그리고, 유로 분할벽(103)의 형상은, 캐필러리(101)의 폭을 복수개로 분할할 수 있기만 하면 특별히 제한되지 않는다.
도 1의 (B)는, 마이크로칩(1)의 유입구(104) 및 배출구(105)가 되는 관통공이 파인 제2 기판(110)의 평면도이다. 유입구(104)가 되는 관통공 및 배출구(105)가 되는 관통공의 위치는, 제1 기판(100)과 적층되었을 때, 각각, 제1 기판(100) 상의, 캐필러리(101)의 제1 단부에 상당하는 위치, 캐필러리(101)의 제2 단부에 상당하는 위치로 되어 있다. 또한, 제1 기판(100) 상의 유로 분할부(102)에 덮히는 제2 기판(110)의 배면에 콜라겐 등을 코팅함으로써 혈소판이접착면(106)이 형성된다. 구체적으로는, 도 1의 (C)에 나타낸 바와 같이, 혈소판이접착면(106)이 되는 위치에, 안전을 고려하여 폭 넓게 도포된다.
그리고, 혈소판이접착면은 도 3(제2 형태예)과 같이 캐필러리의 전체 길이에 걸쳐져 있어도 된다. 제2 형태예에서는 제2 기판(210)이 유리를 소재로 하고 있으며, 마이크로칩(2)의 캐필러리(201) 내부의 제2 기판측 전체 길이가 혈소판이접착면(206)이 된다.
그리고, 도 1이나 도 3과 같이 제2 기판에 있어서 캐필러리의 제2 단부에 상당하는 위치에 관통공을 형성하여 배출구로 하는 대신, 도 13(제3 형태예)에 나타낸 바와 같이, 제2 기판(310)에 있어서 캐필러리(301)의 제2 단부에 상당하는 위치를 에워싸도록 홈을 형성하여, 제1 기판(300)과 접합시킴으로써, 혈소판이접착면(306)을 통과한 혈액의 폐액을 저류하는 폐액 저류부(307)로 해도 된다. 폐액 저류부(307)의 용적을 시험에 사용하는 혈액 양보다 크게 함으로써, 제1 및 제2 형태예와 같이 혈액의 폐액을 배출구로부터 펌프 등으로 흡인하여 배출할 필요가 없어, 더욱 간편하게 검사할 수 있다. 그리고, 폐액 저류부(307)에는 관통공을 형성하여 이것을 공기 구멍(305)으로 해도 된다. 그리고, 마이크로칩(3)의 표면의 관통공(305)에 상당하는 위치에 혈액 흡수재(308)를 설치하면, 혈액 샘플의 양이 많은 경우라도 마이크로칩 외부로 혈액의 폐액이 비산되지 않는다. 혈액 흡수재로서는, 예를 들면, 스펀지나 옷감 등을 부착한 것이 있다.
도 1의 (C)는, 제1 기판(100)의 홈과 제2 기판(110)의 혈소판이접착면이 내측으로 되도록, 제1 기판(100)과 제2 기판(110)이 적층된 마이크로칩(1)의 평면도이다. 파선은, 캐필러리(103)가 마이크로칩(1)의 내부에 존재하는 것을 나타낸다.
혈소판이접착면으로서는, 코팅된 콜라겐이나 유리 등을 예로 들 수 있다. 이들 중에서, 입수가 용이하며, 취급하기 쉽고, 실제 혈관에 근사한 모델이 되므로 콜라겐이 특히 바람직하고, 콜라겐과 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 것이라도 된다. 혈소판이접착면은 혈류에 의해 유출되지 않도록 콜라겐 등의 물질은, 혈소판이접착면(106)에 높은 접착 강도로 코팅되어 있다.
콜라겐의 코팅은, 예를 들면, 일본 특허출원 공개번호 평05-260950호 공보나 Blood. 1995 Apr1; 85(7): 1826-35.에 기재되어 있는 바와 같이, 콜라겐을 산성 용액에 용해하고, 이것을 친수성이 부여된 유리나 폴리스티렌 등의 기판의 소정의 위치에 도포하고, 세정, 건조하는 등의 방법에 의해 간편하게 높은 접착 강도로 코팅할 수 있다.
소수성의 수지 등에 코팅하는 경우에는, 수지 표면을 플라즈마 처리 등으로 친수화한 후, 원하는 영역에 콜라겐 용액을 도포하고, 자연 건조 내지는 감압 하에서 건조함으로써 코팅할 수 있다.
기재(基材)로서 플라스틱을 사용한 경우에는 플라즈마 처리 등으로 친수화하여, 원하는 영역에 콜라겐 용액을 피펫이나 시린지 등의 디스펜서로 도포하고, 자연 건조 또는 감압하에서 건조함으로써 콜라겐 또는 조직 트롬보플라스틴을 포함하는 콜라겐을 용이하게 코팅할 수 있다.
혈소판이접착면으로서 유리를 사용하는 경우, 제2 기판(110) 상의 혈소판이접착면(106)에 상당하는 위치만 유리로 하고, 그 이외의 부분은 플라스틱, 실리콘 등으로 형성된 제2 기판(110)을 사용해도 되지만, 도 3과 같이, 제2 기판(210)으로서 유리 기판을 사용하고, 플라스틱, 실리콘 등으로 형성된 제1 기판(200)과 적층했을 때 혈소판이접착면(206)이 캐필러리(201)의 전체 길이에 걸쳐져 있도록 해도 된다.
마이크로칩(1)의 재질은, 금속, 유리나 플라스틱, 실리콘 등이 바람직하다. 또한, 혈액 관측(특히 화상 해석)에 사용하는 관점에서는 투명한 재질이 바람직하다. 또한, 회로를 형성하는 관점에서는 플라스틱이 바람직하고, 투명한 플라스틱이 특히 바람직하다. 재질을 PDMS(폴리디메틸실록산) 등의 실리콘 제품으로 한 경우에는, 기판끼리의 밀착성이 우수하기 때문에, 제1 기판(100)과 제2 기판(110)을 접착제 등으로 접착하지 않아도 압착함으로써 적층할 수 있지만, 마이크로칩(1)의 내부에 높은 압력이 인가될 경우에는, 접착제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트(PMEA)에 의해서도 의도하지 않은 부위에서의 혈액 응고를 간편하고 효과적으로 억제할 수 있다. 그리고, 마이크로칩(1)의 기판에 형성되는 홈이나 구멍은, 칼이나 레이저 광선으로 형성할 수도 있지만, 마이크로칩(1)의 재질이 플라스틱인 경우에는, 사출 성형으로 형성할 수 있다. 사출 성형으로 형성하면, 일정한 품질의 마이크로칩(1)을 효율적으로 작성 가능하므로 바람직하다.
본 형태예의 마이크로칩(1)을 사용한 혈소판 기능 검사의 일례를 도 1의 (C)에 따라 설명한다. 제1 유입구(104)에는 도시하지 않은 튜브가 접속되고, 튜브를 통하여 도시하지 않은 혈액 리저버(혈액 수용부)(107) 및 송액 펌프(109)가 접속된다. 그리고, 접속된 펌프(109)로부터 상기 펌프 내의 액체를 리저버(107)에 주입함으로써, 상기 리저버 내의 혈액이 마이크로칩(1)에 주입된다. 이 때, 펌프 내의 액체가 혈소판 활성화 시약이면 리저버 내의 항응고 처리된 혈액의 혈소판이 활성화되고, 또한 혈소판이접착면을 통과할 때 전단 효과(shear effects)에 의해 활성화된다. 또한, 리저버 내의 혈소판 활성화 시약의 농도를 지속적으로 상승시켜도 된다. 혈액 리저버 내에 교반자를 넣고 내부 혈액을 교반하면 혈소판 활성화 시약이 항상 혈액에 혼합되어 바람직하다.
또한, 송액 펌프의 액체는 미네랄 오일 또는 생리 식염수 등 혈액보다 비중이 작은 액체로 하고, 송액 펌프에 의해 상기 액체를 항응고 처리된 혈액이 미리 충전된 리저버에 도입함으로써, 혈액이 캐필러리에 도입되도록 할 수 있다. 상기 액체의 유입압을 측정함으로써 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정할 수 있다. 그리고, 리저버에 미리 충전된, 항응고 처리된 혈액은 혈소판 활성화 시약이 혼합된 것이 바람직하다. 또한, 혈소판 활성화 시약을 건조 또는 액체 상 태로 리저버 내에 미리 넣어 두어, 혈액과 혼합할 수도 있다. 또한, 송액 펌프의 유속을 단계적으로 높여, 전단응력을 단계적으로 상승시킬 수도 있다.
여기서, 혈액의 응고를 억제하는 항응고 처리에 사용하는 항응고 처리제로서는, 구연산 나트륨 또는 옥살산 칼륨, 옥살산 나트륨 또는 옥살산 칼륨, ACD(Acid Citrate Dextrose), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)염 등을 예로 들 수 있다. 이와 같은 항응고 처리제는, 분말, 동결 건조품, 수용액 등의 용액으로서 사용할 수 있다. 이들 항응고 처리제 중에서, 일반적인 3.2%의 구연산 나트륨이 용이하게 입수할 수 있으므로 더욱 바람직하다. 이 경우, 혈액 9부피에 대하여 이 항응고 처리제 1부피로 하는 것이 바람직하다.
그 외의 항응고 처리제로서는 헤파린, 히루딘, 트롬빈앱타머, 콘유래의 트립신 저해제(1977. J. Biol. Chem 252. 8105) 등을 이용할 수 있다. 그리고, 항응고 처리제는, 복수를 사용할 수도 있다. 사용하는 항응고제가 히루딘인 경우에는, 구연산에 의한 항응고 처리의 경우에 비해, 혈소판 활성화 시약의 처리가 없어도, 더욱 견고한 혈소판 응집이 일어나므로, 전단응력 의존적인 혈소판 기능의 측정에 적합하다. 구연산에 의한 항응고 처리 혈액의 경우에는, 혈소판 활성화 시약의 자극에 의존적인 혈소판 기능 측정이 양호한 정밀도로 측정되어, 항혈소판제의 평가 등에 더욱 적합하다.
항응고 처리된 혈액을 얻는 방법으로서는, 시린지 또는 진공 채혈관에 미리 상기 항응고 처리제를 넣어 채혈을 행하거나, 또는 채혈 직후의 혈액에 항응고 처리제를 신속하게 부가하는 등의 방법으로 항응고 처리된 혈액을 얻을 수 있다.
또한, 헤파린을 포함하는 진공 채혈관 등으로 채혈한 후, 헤파리나아제와 관측 목적에 적합한 항응고 처리제를 부가하여, 헤파리나아제에 의해 헤파린을 분해시켜, 측정 목적에 적합한 항응고 처리제와 치환해도 된다.
항응고 처리된 혈액과 혼합하는 혈소판 활성화 시약으로서는, ADP, 콜라겐, 트롬빈, 아라키돈산 및 리스토세틴 등을 예로 수 있다. 혈소판 활성화 시약은, 미약한 혈소판 활성화가 일어나는 농도로 항응고 처리된 혈액과 혼합한다. 미약한 혈소판 활성화가 일어나는 농도란, 정지 상태에서는 불가역적 혈소판 응집(혈소판 2차 응집)을 일으키지 않는 농도, 예를 들면, ADP의 경우, 0.001∼5 μM이며, 아라키돈산의 경우, 0.001∼1 mM이다. 다만, 혈소판 기능의 비정상 및 항혈소판제의 투여에 의해 이들 혈소판 활성화 시약에 대한 반응성이 분명히 저하되어 있는 경우, 그 저하 상태를 측정하는 경우에는, 이들 농도를 초과하는 혈소판 활성화 시약을 부가하여 측정하는 것이 바람직하다. 특히 클로피도그렐 및 아스피린의 효과의 정도를 측정하는 경우에는, 각각 ADP, 아라키돈산의 농도를 높여서 측정하는 것이 바람직하다.
유입구(104)로부터 도입되어 캐필러리(101)를 통과한, 미약한 혈소판 활성화 시약과 항응고 처리된 혈액의 혼합액은, 유로 분할부(102)를 통과함으로써, 전단응력이 생기고, 혈소판의 활성화가 증강되어, 혈소판이표면(血小板易表面)에서 점착·적층된다. 유속 및 마이크로칩을 조정하여 높은 전단응력과 낮은 전단응력 하에서의 비교 실험을 행함으로써, 더욱 상세한 혈소판 기능 평가 및 항혈소판제의 약효의 평가 등을 행할 수 있다. 그리고, 유로 분할부(102)를 통과하는 혼합액의 유속이나 성상(性狀)을 관측함으로써, 혈소판 기능의 관측을 행할 수 있다. 관측에 제공된 혈액은, 캐필러리(101)의 종단(終端)에 형성된 배출구(105)로부터 배출된다.
다음으로, 마이크로칩(1)을 사용한 본 발명의 혈소판 검사 장치에 대하여 설명한다.
도 2는, 마이크로칩(1)을 투명한 기판으로 구성하여 내장한 본 발명의 혈소판 검사 장치의 제1 형태예인 혈소판 검사 장치 A의 모식도이다. 이하, 도 2에 따라 제1 형태예를 설명한다.
마이크로칩(1)의 유입구(104)에는, 항응고 처리된 혈액이 수용되고, 교반자(108)를 내포하는 리저버(107)(혈액 수용부)가 거꾸로 세워져서 접속되어 있고, 리저버(107)는 튜브를 통하여 혈소판 활성화 시약을 공급하는 송액 펌프(109)에 접속되어 있다. 송액 펌프(109)에는 도시하지 않은 압력 센서가 접속되어 있다.
그리고, 송액 펌프(109)로부터, 혈소판 활성화 시약이 리저버(107) 내에 압입되어, 혈소판 활성화 시약과 항응고 처리된 혈액이, 자석 교반기(magnetic stirrer)(113)에 의해 회전되는 교반자(108)에 의해 혼합된다.
송액 펌프(109)로부터 리저버(107) 내에 혈소판 활성화 시약을 도입할 때, 펌프의 유속을 조절함으로써, 혈액과 혼합되었을 때의 혈소판 활성화 시약의 농도가, 0∼혈소판을 충분히 야기할 수 있는 농도까지 자동적으로 상승하도록 하면, 혈소판의 기능 항진 및 기능 저하를 한 번의 실험으로 측정할 수 있으므로 바람직하다. 예를 들면, ADP 농도 0∼0.1 μM로 농도 구배적으로 상승시켜도 되고, 0, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 μM과 같이 단계적으로 야기 물질의 농도가 상승될 수도 있다.
혈소판 활성화 시약과 혼합된 항응고 처리 혈액은, 마이크로칩(1)의 캐필러리(101) 내로 밀려나온다. 혼합액은 캐필러리(101)를 통과하여, 콜라겐이나 유리 등의 혈소판이접착표면을 가지는 유로 분할부(102)에 도달한다.
유로 분할부(102)에서의 혈소판의 활성화(혈소판의 점착·응집 등)나 그에 따른 캐필러리의 폐색을 카메라(111)로 관찰함으로써 혈소판 기능을 검사할 수 있다. 또는, 유로 내의 압력을 송액 펌프(109)에 접속된 압력 센서에 의해 측정함으로써 더욱 정량적인 혈소판 기능 검사를 행할 수 있게 된다. 또한, 혈액과 혈소판 활성화 시약과의 혼합액의 캐필러리(101)의 통과 시간 또는 통과량을 측정함으로써도 혈소판 기능 검사를 행할 수 있다.
카메라(111)는 화상 해석 장치(114)에 접속되어 있고, 이에 따라 혈소판 활성화의 상태를 화상화할 수 있다. 내부의 혈소판 활성화를 촬영함으로써 시각적 평가 및 압력 상승에 의한 혈소판 활성화의 정량적 검사의 병용은, 환자의 혈액 상태를 종합적으로 판단하는데 있어서 매우 중요하다. 예를 들면, DIC 등의 병태(病態)에 있어서 혈소판이 생체 내에서 이미 활성화되고, 또한 혈소판이 소모되어 현저하게 감소하고 있는 경우에는, 압력 상승이나 폐색 시간은 지연된다. 이와 같은 경우에도, 내부를 카메라에 의해 촬영함으로써 검사 개시 직후부터 혈소판이접착표면에 대한 혈소판의 점착 및 응집의 상승 등을 확인할 수 있어, 환자의 혈소판 상태를 종합적으로 판단할 수 있게 된다.
카메라(111)는 캐필러리(101)의 혈류 방향을 따라 이동 가능한 것일 수도 있다.
그리고, 퀴나크린 등에 의해 혈소판을 형광 표지하여 해석할 수도 있으며, 그러한 경우, 형광 발색(發色)에 의한 단위 면적당 휘도를 화상 해석에 의해 관측함으로써 관측 결과를 수치화하여, 데이터로서 취득할 수 있다.
그리고, 마이크로칩(1)은 스테이지형의 히터(115) 상에 설치되어 있고, 히터(115)에 의해 37℃로 가온(加溫)함으로써 더욱 생체 내와 근사한 조건에서 측정을 행할 수 있다.
유로 분할부(102)를 통과한 혈액 혼합액은, 배출구(105)로부터 배출관(112)에 의해 원활하게 배출된다.
교반자는, 항응고 처리되어 있는 것이 바람직하다. 항응고 처리는, 헤파린, 폴리비닐락톤아미드(PVLA)나 폴리2-메톡시에틸아크릴레이트(PMEA) 등을 자성체의 표면에 용융 수지에의 침지(浸漬)에 의한 피복(被覆)을 행하거나 인몰드 사출 성형 등의 수지 가공을 이용하여 교반자의 표면을 형성하는 처리로 행할 수 있다.
이상과 같이, 마이크로칩 외부의 리저버에서 혈소판 활성화 시약과 항응고 처리 혈액이 혼합되어, 마이크로칩 내의 캐필러리에 도입되는 태양을 예시하여 설명하였으나, 본 발명의 혈소판 기능 검사 장치는 상기 태양으로 한정되지 않는다.
예를 들면, 마이크로칩 내에, 항응고 처리 혈액과 혈소판 활성화 시약을 혼합하는 혼합부가 설치된 마이크로칩을 사용하여, 마이크로칩 내에서 혈액과 혈소판 활성화 시약이 혼합되어, 상기 혼합액이 혼합부로부터 캐필러리로 흐르도록 구성할 수도 있다.
[실시예]
이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
[마이크로칩 및 혈소판 기능 검사 장치의 작성]
도 1의 (A)에 나타내는 제1 기판(100) 및 도 1의 (B)에 나타내는 제2 기판(110)의 2개의 투명한 기판(가부시키가이샤리첼 제조, 사출 성형품)을 준비하였다. 제1 기판(100)의 캐필러리(101)가 되는 홈이 개구된 면과 제2 기판(110)의 혈소판이접착면(106)을 가지는 면을 대향시켜, 실란 커플링제 및 60℃에서 16시간의 열압착에 의해 맞붙여서, 도 1의 (C)에 도시된 마이크로칩(1)으로 만들었다. 그리고, 제1 기판(100)에서, 유로(캐필러리)(101)의 길이는 20mm, 깊이는 50㎛, 폭은 2mm로 하고, 유로 분할부(102)에는, 길이 2mm, 폭 25㎛, 높이 50㎛의 유로 분할벽(103)을 25㎛의 등간격으로 설치하여, 이 부분을 유로 분할부(102)로 하였다. 제2 기판(100)에서는, 유입구(104) 및 배출구(105)로 되는 구멍은 내경 2mm, 깊이 2mm의 단면이 원형인 관통공으로 형성하였다. 또한, 제2 기판(110)과, 제1 기판(100)의 유로 분할부(102)와 중첩되는 위치에 3mg/ml의 콜라겐 타입 I(닛타젤라틴 제조)을 도포하고 진공 건조하여 혈소판이접착면(106)으로 만들었다.
도 2에 도시한 바와 같이, 작성된 마이크로칩(1)을, 스테이지형의 히터(115) 상에 설치하고, 마이크로칩(1)의 유입구(104)에 리저버(107)를 접속하고, 리저버(107)에는 튜브를 통하여 펌프(109)를 접속하여, 펌프에 인가되는 압력을 도시하지 않은 압력 센서로 측정하였다. 리저버(107) 내에는, 철제(鐵製)의 원기둥을 PMEA로 피복한 직경 2mm, 길이 5mm의, 원기둥 형상의 교반자(108)를 수납했다. 교반자(108)는, 37℃로 가온한 히터(115)의 아래에 설치된 교반기(113)의 자력에 의해 60∼180 rpm으로 회전하도록 했다. 배출구에는 배출관(112)을 접속하여, 해석 종료 후의 혈액을 배출할 수 있도록 하였다. 또한, 마이크로칩(1)의 유로 분할부(102)의 상부에는 화상 해석 장치(114)가 접속된 카메라(111)를 설치하여, 유로 분할부(102)의 혈소판 활성화 상태를 관찰할 수 있도록 했다.
(실시예 1)
도 1에 나타낸 마이크로칩(1) 및 도 2에 나타낸 혈소판 검사 시스템 A를 사용하여 측정을 행하였다. 구연산에 의해 항응고 처리를 행한 혈액을 피험자(被驗者) A로부터 채혈했다.
리저버(107)에는 구연산으로 항응고 처리된 전혈을 충전하고, 접속된 펌프(109)에 의해 생리 식염수를 주입구로부터 리저버(107) 내에 주입함으로써 혈액을 리저버(107)로부터 밀어내어 마이크로칩(1) 내에 유입시켰다. 리저버(107) 내에는 교반자(108)가 들어 있으며 혈액은 교반자(108)에 의해 교반되었다.
펌프(109)의 유속은 최초 10초동안 100μl/분으로 흐르게 하고, 이후는 3μl/min로 흐르게 하였다.
펌프(109)의 압력 변화를 도 5에 나타낸다.
(실시예 2)
실시예 1의 실험에서, 3μl/min의 유속을 6μ/min로 흐르도록 한 점 이외는 동일한 실험을 행하였다.
(실시예 1과 동일한 피험자의 혈액 검체 A를 사용하였다). 펌프(109)의 압력 변화를 도 6에 나타낸다.
(고찰) 동일 검체에서 유속을 3μl/min ∼ 6μl/min로 상승시킴으로써 전단응력의 상승이 일어났으며, 압력 상승이 확인되었다.
(실시예 3)
펌프(109)에 생리 식염수 대신 0.5μM의 ADP 용액을 충전한 점 이외는 실시예 2와 동일한 실험을 행하였다.
(실시예와 동일한 피험자 A의 혈액 검체를 사용하였다). 펌프(109)의 압력 변화를 도 7에 나타낸다.
(실시예 4∼6)
실시예 1∼3의 실험을 다른 피험자 검체(검체 B)를 사용하여 측정하였다. 펌프(109)의 압력 변화를 도 8, 도 9, 도 10에 각각 나타낸다.
(비교 실험)
피험자 A 및 B의 혈액을 800rpm으로 원심 분리를 행하여 다혈소판 혈장을 얻고, 양쪽 검체에 대하여 혈소판 응집능 측정 장치(PA-20 교와주식회사)에 의해 ADP에 의한 혈소판 응집능을 측정하였다. 1μM의 ADP에 의한 대형 응집은 피험자 A에 비해 피험자 B의 혈액은 절반 정도였다.
(고찰)
피험자 A와 B의 결과로부터, 피험자 A는 전단응력 하에서의 콜라겐의 점착·응집에 의한 압력 상승은 피험자 B에 비해 약하였지만, ADP에 의한 응집능은 강하여, ADP 첨가 시에는 피험자 B와 콜라겐과의 점착·응집에 의한 압력 상승이 동등한 것이 확인되었다.
(실시예 7)
화상에 의한 진단 실시예 1의 마이크로칩(1) 및 시스템 A를 사용하여 실험을 행하였다. 펌프(109)에는 미네랄 오일을 충전하고, 리저버(107)에는 구연산으로 항응고 처리된 혈액을 충전하였다. 유속 8μl/min로 펌프(109)로부터 리저버(107)에 미네랄 오일을 송액하여, 혈액을 마이크로칩(1)에 흐르게 하였다. 동일한 실험을 각각 구연산 혈액에 최종 농도 0.025μM, 0.05μM, 0.1μM의 ADP를 첨가한 혈액을 사용하여 실시하였다. 도 11은 각각 약 1분 후의 마이크로칩(1) 내의 상태를 카메라(111)에 의해 촬영한 것이다.
(고찰)
ADP 첨가 시에는 ADP의 농도 의존적으로, 빗살 부분(유로 분할벽(103))에 부착되는 혈소판의 양의 상승이 확인되었고 압력 상승을 수반하지 않는 레벨에서도 혈소판의 부착을 시각적으로 확인할 수 있었다.
[마이크로칩 및 혈소판 기능 검사 장치의 작성]
도 3의 (A)에 나타내는 제1 기판(200)과 도 3의 (B)에 나타내는 제2 기판(210)을 적층하여 접착시켜 도 3의 (C)에 나타내는 마이크로칩(2)을 작성하였다. 기판(200)은 PDMS제의 기판[플루이드웨어사(Fluidware Technologies Inc.)]과, 모든 유로의 깊이를 120㎛로 하고, 유로 폭은 1mm, 빗살의 길이 1mm, 빗살의 폭 50㎛, 홈 폭을 50㎛로 하였다. 기판(210)에는 슬라이드글라스를 사용하고, 기판(110)과 마찬가지로, 유입구와 배출구에 상당하는 관통공은 형성하였으나, 유리가 혈소판이접착면의 역할을 하기 때문에, 기판(110)과는 달리 콜라겐은 도포하지 않았다. 즉, 캐필러리(201) 내부의 제2 기판측이 전체 길이에 걸쳐서 혈소판이접착면(206)으로 되는 도 4에 나타내는 혈소판 기능 검사 장치 B는, 마이크로칩(1) 대신 마이크로칩(2)을 사용한 점, 및 교반자와 교반기를 구비하고 있지 않은 점 이외에는, 도 2의 혈소판 기능 검사 장치 A와 동일하다. 이하의 실시예에서는 미리 ADP와 혼합한 항응고 처리 혈액을 리저버에 넣었기 때문에, 교반자와 교반기는 불필요하였다.
(실시예 8)
도 3에 나타내는 마이크로칩(2)과 도 4에 나타내는 혈소판 기능 검사 장치 B를 사용하였다.
혈액 리저버(207)에 구연산에 의해 항응고 처리한 혈액 약 600μl를 충전하였다. 펌프(209)에 미네랄 오일을 충전하고, 펌프(209)에 리저버(207)를 접속하고 그리고 리저버(207)의 선단(先端)은 마이크로칩(2)의 유입구(204)에 접속하였다. 펌프(209)로부터 미네랄 오일을 20μl/분의 유속으로 마이크로칩(2)에 주입하여, 도시하지 않은 압력 센서에 의해 미네랄 오일의 유입 압력을 측정하였다.
(실시예 9)
리저버(207) 내에 구연산에 의해 항응고 처리한 혈액에 최종 농도 2nM로 되도록 ADP(와코순약 제조)를 더 부가한 혈액을 사용한 점 이외는 실시예 8과 동일한 실험을 행하여 압력의 변화를 측정하였다.
(실시예 10)
75mg의 클로피도그렐(Sanofi-aventis사) 복용 후 3시간 후의 혈액을 사용한 점 이외는 실시예 9와 동일한 실험을 행하여 압력 변화를 측정하였다.
실시예 8∼10에서의 펌프(209)의 압력 변화를 도 12에 나타낸다. 극소량의 ADP 첨가에 의해 압력 상승이 일어났으나, 이 상승은 클로피도그렐의 복용에 의해 억제되었다.
[마이크로칩 및 혈소판 기능 검사 장치의 작성]
도 1의 (A)에 나타낸 제1 기판(100) 및 도 1의 (B)에 나타낸 제2 기판(110)의 2개의 투명한 기판(가부시키가이샤리첼 제조, 사출 성형품)을 준비하였다. 제1 기판(100)의 캐필러리(101)로 되는 홈이 개구된 면과 제2 기판(110)의 혈소판이접착면(106)을 가지는 면을 대향시켜 실란 커플링제 및 열압착에 의해 맞붙여서, 도 1의 (C)에 도시한 마이크로칩(1)으로 만들었다. 그리고, 제1 기판(100)에서는, 유로(캐필러리)(101)의 길이는 20mm, 깊이는 50㎛, 폭은 2mm로 하고, 유로 분할부(102)에는, 길이 1.5mm, 폭 50㎛, 높이 50㎛의 유로 분할벽(103)을 50㎛의 등간격으로 설치하여, 이 부분을 유로 분할부로 하였다. 제2 기판에서는, 유입구 및 배출구로 되는 구멍은 내경 2mm, 깊이 2mm이며, 단면이 원형인 관통공으로 만들었다. 또한, 제2 기판(110)과, 제1 기판(100)의 유로 분할부(102)와 중첩되는 위치에 3mg/ml의 콜라겐 타입 I(닛타젤라틴 제조)을 약 10μl 도포하고 진공 건조하여 혈소판이접착면(106)으로 만들었다. 콜라겐은 빗살을 포함하여, 빗살로부터 상류에 4mm, 하류에 2mm의 영역에 각각 도포되어 있다.
도 4에 도시한 바와 같이 제작된 마이크로칩(1)을 히터(215) 상에 설치하고, 실시예 8과 동일하게 펌프(209) 및 리저버(207)를 접속하였다.
(실시예 11)
(a) 검체 D로부터 히루딘 채혈관(Multiplate Services GmbH)을 사용하여 채혈을 행한, 히루딘에 의해 항응고 처리된 혈액을 리저버(207)에 약 600μl 충전하였다. 펌프(209)에 미네랄 오일을 충전하고, 펌프(209)와 리저버(207)를 접속하고, 그리고 리저버(207)의 선단은 마이크로칩(1)의 유입구(104)에 접속하였다. 펌프(209)로부터 미네랄 오일을 처음 5초간은 200μl/분, 그 이후는 20μl/분의 유속으로 리저버에 주입함으로써, 리저버 내의 혈액을 동일한 유속에 의해 마이크로칩(1)에 주입하여, 도시하지 않은 압력 센서에 의해 미네랄 오일의 유입 압력을 측정하였다.
(b) 펌프(209)로부터 미네랄 오일을 처음 5초간은 200μl/분, 그 이후는 10μl/분의 유속으로 리저버에 주입함으로써, 리저버 내의 혈액을 동일한 유속에 의해 마이크로칩(1)에 주입한 점 이외는, 상기 (a)와 동일한 실험을 행하여, 미네랄 오일의 유입 압력을 측정하였다.
(c) 펌프(209)로부터 미네랄 오일을 처음 5초간은 200μl/분, 그 이후는 5μl/분의 유속으로 리저버에 주입함으로써, 리저버 내의 혈액을 동일한 유속에 의해 마이크로칩(1)에 주입한 점 이외는, 상기 (a)와 동일한 실험을 행하여, 미네랄 오일의 유입 압력을 측정하였다.
실시예 11(a), 11(b), 11(c)의 결과를 도 14의 (A)에 나타낸다. 가로축은 시간, 세로축은 칩 폐색에 의한 압력 상승을 나타낸다. 압력 상승은 검체 D에서 실시예 11(a), 11(b), 11(c)의 순서, 즉 전단응력이 높은 순으로 일어났다.
(실시예 12)
실시예 11과 동일한 실험을 검체 E에 대해서도 실시하였다. 결과를 도 14의 (B)에 나타낸다.
(실시예 13)
실시예 11과 동일한 실험을 검체 F에 대하여 실시하였다. 결과를 도 14의 (C)에 나타낸다.
(참고예)
검체 D, E, F에 대하여, 전혈혈소판 응집능 측정 장치 Multiplate(다이나바이트사)를 사용하여 혈소판 응집능을 측정하였다. 채혈은 히루딘 채혈관을 사용하고, 6μM의 ADP에 의한 응집능을 측정하였다. 결과를 이하에 나타낸다. D 691AU/min, E 525AU/min, F 652AU/min의 ADP 응집은 검체 D, F, E의 차례로 강하였다.
고찰 검체 D, E, F 모두에, 고, 중, 저 전단응력의 차례대로 압력 상승이 일어났다. 또한, 압력 상승은 D, F, E의 순서로 일어났으며, 그 결과는 Multiplate에서 실시한 ADP 응집능과 상관성을 나타낸다.
그리고, 실시예 11(a)와 동일한 실험을, 구연산 채혈관에 의해 채혈하여, 구연산 나트륨에 의해 항응고 처리한 바에 의하면, 10분 후에도 압력 상승은 확인되지 않았다.
(실시예 14)
구연산으로 항응고 처리한 검체 E의 혈액 약 600μl와 100μM의 ADP 시약(크로놀로그사) 6μl를 혼화(混和)한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 동일하게, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터 상에서, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 20μl/분으로 흐르게 하였다.
(실시예 15)
(a) 실시예 14와 동일한 실험을 검체 D의 혈액을 사용하여 실시하였다. (b)실시예 14와 동일한 실험을, 100mg의 클로피도그렐을 경구 투여하고 6시간 후의 검체 D의 혈액을 사용하여 실시하였다.
실시예 15, 14의 결과를 도 15에 나타낸다. 도 15에서, A는 실시예 15(a)의 결과, B는 실시예 15(b)의 결과, C는 실시예 14의 결과이다. 검체 D에서 클로피도그렐 투여에 의해 압력 상승이 지연되고 있으며, 클로피도그렐 투여 후에는 검체 E의 혈액에 비해서도 압력 상승이 지연되고 있는 것을 알 수 있다.
(실시예 16)
(a) 구연산으로 항응고 처리한 검체 G의 혈액 약 600μl와 50mM의 아라키돈산(크로놀로그사) 6μl를 혼화한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 마찬가지로, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터 상에 설치되고, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 20μl/분으로 흐르게 하였다.
(b) 구연산으로 항응고 처리한 검체 G의 혈액 약 600μl와 50mM의 아라키돈산(크로놀로그사) 6μl를 혼화한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 마찬가지로, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터에 설치되고, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 10μl/분으로 흐르게 하였다.
(c) 구연산으로 항응고 처리한 검체 G의 혈액 약 600μl와 50mM의 아라키돈산(크로놀로그사) 6μl를 혼화한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 마찬가지로, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터에 설치되고, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 5μl/분으로 흐르게 하였다.
(d) 구연산으로 항응고 처리한 검체 G의 혈액 약 600μl와 100μg/ml의 콜라겐(크로놀로그사) 6μl를 혼화한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 마찬가지로, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터에 설치되고, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 20μl/분으로 흐르게 하였다.
(e) 구연산으로 항응고 처리한 검체 G의 혈액 약 600μl와 100μg/ml의 콜라겐(크로놀로그사) 6μl를 혼화한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 마찬가지로, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터에 설치되고, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 10μl/분으로 흐르게 하였다.
(f) 구연산으로 항응고 처리한 검체 G의 혈액 약 600μl와 100μg/ml의 콜라겐(크로놀로그사) 6μl를 혼화한 직후의 혈액을 리저버에 충전하고, 이것을, 실시예 11(a)와 마찬가지로, 미네랄 오일을 충전한 펌프를 접속하고 마이크로칩에 접속하였다. 마이크로칩(1)은 히터 상에 설치되고, 처음 5초동안 200μl/분으로 흐르게 하고, 이후 5μl/분으로 흐르게 하였다.
(실시예 17)
실시예 16의 (a)∼(f)의 실험을 검체 G가 아스피린 100mg을 복용하고 6시간 후에 실시하였다.
(실시예 18)
검체 G가 아스피린 100mg을 복용하고 6시간 후의 혈액을 사용하여, 실시예 16의 (d)∼(f)와 동일한 실험을, 첨가하는 콜라겐을 12μl 및 18μl로 증량하여 실시하였다.
실시예 16∼18의 결과를 도 16∼21에 나타낸다.
이들 결과로부터 아스피린의 항혈소판 효과가 아라키돈산, 콜라겐을 구연산 혈액에 첨가하고, 마이크로칩에 흐르게 하고 압력 상승을 측정함으로써 해석할 수 있었다. 또한, 도 19에 나타낸 바와 같이 아스피린을 복용한 혈액에서도 첨가하는 콜라겐을 증량함으로써 압력이 상승하는 것을 알았다. 이와 같이, 본 방법에 의해 아스피린의 효과의 유무뿐만 아니라, 혈소판 기능의 억제 상태도 평가할 수 있는 것을 알 수 있었다.
이와 같이 화상능(畵像能)에 의한 활성화 혈소판 응집괴의 시각적 확인과 압력 상승의 병용적인 진단에 의해, 환자의 혈소판 상태를 더욱 상세하게 파악할 수 있다.
(실시예 19)
검체 H의 혈액을 사용하여 실시예 11(a)와 동일한 실험을 행하였다.
(실시예 20)
펌프(209)로부터 미네랄 오일을 처음 5초간은 200μl/분, 그 이후에는 7μl/분의 유속으로 리저버에 주입함으로써, 리저버 내의 혈액을 동일한 유속에 의해 마이크로칩(1)에 주입한 점 이외는, 실시예 19와 동일한 실험을 행하여, 미네랄 오일의 유입 압력을 측정하였다.
(실시예 21)
실시예 19 및 실시예 20과 동일한 측정을 히루딘에 의해 항응고 처리한 혈액에 대하여, 0.4μg/ml, 0.8μg/ml의 혈소판막 상의 수용체 GPIIbIIIa에 대한 항체인 ReoPro(Eli lilly사)를 첨가하여 각각 실시하였다.
(실시예 22)
실시예 19 및 실시예 20과 동일한 측정을 히루딘에 의해 항응고 처리한 혈액에 대하여, 혈소판막 상의 수용체 GPIb에 대한 저해제인 OS-1[Biochemistry. 2008 Apr22; 47(16): 4674-82]을 0.01μg/ml 및 0.1μg/ml 첨가하여 실시하였다.
실시예 19, 20, 21의 결과를 도 22 및 도 23에 나타낸다.
도 22는 유속 20μl/min에서의 ReoPro의 억제 효과, 도 23은 유속 7μl/min에서의 ReoPro의 억제 효과를 각각 나타낸다.
실시예 22의 결과를 도 24, 도 25에 나타낸다.
도 24는 유속 20μl/분에서의 OS-1의 억제 효과, 도 25는 유속 7μl/분에서의 OS-1의 억제 효과를 나타낸다.
(고찰)
GPIIbIIIa는 주로 피브리노겐과 결합하여 혈소판 응집에 관여하고, GPIb는 vWF와 결합하여 높은 전단응력 하의 혈소판 점착 반응에 관여하는 수용체이다.
혈소판의 점착 반응을 억제하는 OS-1은 높은 전단응력 하에서 보다 강한 항혈소판 작용을 나타내는 것에 비해, ReoPro는 낮은 전단응력 하에서 약간 강한 항혈소판 효과를 나타낸다.
A, B: 혈소판 관측 장치 1, 2, 3: 마이크로칩
100, 200, 300: 제1 기판 101, 201, 301: 캐필러리
102, 202, 302: 유로 분할부 103, 203, 303: 유로 분할벽
104, 204, 304: 유입구 105, 205: 배출구
106, 206, 306: 혈소판이접착면 107, 207: 리저버
108: 교반자 109, 209: 펌프
110, 210: 제2 기판 111, 211: 카메라
112, 212: 배출관 113: 교반기
114, 214: 화상 해석 장치 115, 215: 히터
305: 공기 구멍 307: 폐액 저류부
308: 혈액 흡수재

Claims (27)

  1. 항응고 처리된 혈액을, 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면(血小板易接着面)을 구비한 캐필러리(capillary)를 통과시켜, 상기 혈액의 캐필러리 내에서의 거동(擧動)을 관찰 또는 측정함으로써, 혈소판의 기능을 검사하는, 혈소판 기능 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항응고 처리는 구연산 또는 헤파린 또는 히루딘에 의한 것인, 검사 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 혈소판이접착면은 코팅된 콜라겐으로 이루어지는, 검사 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 혈소판이접착면은 유리로 이루어지는, 검사 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항응고 처리된 혈액은 미약한 혈소판 활성화 처리가 행해진 것인, 검사 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 미약한 혈소판 활성화 처리는, 불가역적인 혈소판 응집을 일으키지 않는 양의 혈소판 활성화 시약을 항응고 처리된 혈액에 혼합하는 것에 의한, 검사 방법
  7. 제6항에 있어서,
    상기 혈소판 활성화 시약은 아데노신2인산이며, 0.001∼5 μM의 농도로 되도록 항응고 처리된 혈액과 혼합되는, 검사 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 혈소판 활성화 시약은 아라키돈산이며, 0.001∼1 mM의 농도로 되도록 항응고 처리된 혈액과 혼합되는, 검사 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캐필러리 내의 적어도 일부가, 상기 캐필러리에서의 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되고, 또한 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로(流路) 분할벽을 포함하는 유로 분할부를 가지는, 검사 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 유로 분할부의 각 유로의 폭은 10∼200 ㎛인, 검사 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 혈소판이접착면이, 상기 캐필러리의 상기 유로 분할부에 설치된, 검사 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캐필러리가 마이크로칩 내에 형성된, 검사 방법.
  13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항응고 처리된 혈액은 펌프에 의해 상기 캐필러리 내에 도입되고 상기 펌프에 인가되는 상기 혈액의 상기 캐필러리에 대한 유입압을 압력 센서에 의해 측정함으로써 혈소판 기능을 검사하는, 검사 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 항응고 처리된 혈액은 상기 캐필러리 및 상기 펌프에 접속된 혈액 수용부 내에 저장되고, 상기 펌프에 의해 혈액보다 비중이 작은 액체를 혈액 수용부에 도입함으로써, 혈액을 캐필러리에 도입하여, 상기 액체의 유입압을 측정함으로써 혈액의 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정하는, 검사 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 항응고 처리된 혈액은 상기 캐필러리 및 상기 펌프에 접속된 상기 혈액 수용부 내에 저장되고, 상기 펌프에 의해 혈소판 활성화 시약을 상기 혈액 수용부에 도입함으로써 상기 혈액 수용부 내에서 혈소판 활성화 시약과 항응고 처리된 혈액을 혼합하고, 상기 혈소판 활성화 시약과 혼합된 혈액을 상기 캐필러리에 도입하여, 상기 혈소판 활성화 시약의 유입압을 측정함으로써 혈액의 상기 캐필러리에 대한 유입압을 간접적으로 측정하는, 검사 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 혈소판 활성화 시약은, 상기 항응고 처리된 혈액과 상기 혈소판 활성화 시약과의 혼합액 중의 상기 혈소판 활성화 시약의 농도가 직선적 농도 구배(勾配) 또는 단계적 농도 구배로 증가하도록, 항응고 처리된 혈액과 혼합되는, 검사 방법.
  17. 제15항 또는 16항에 있어서,
    상기 항응고 처리된 혈액과 상기 혈소판 활성화 시약과의 혼합액이 교반되는, 검사 방법.
  18. 적어도 내면의 일부에 혈소판이접착면을 가지는 캐필러리와, 상기 캐필러리 내의 적어도 일부에 설치되고, 상기 캐필러리에서의 혈액이 흐르는 방향을 따라 연장되고, 또한 상기 캐필러리의 폭을 복수개로 분할하는 유로 분할벽을 포함하는 유로 분할부를 가지는 혈소판 기능 검사 장치.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 캐필러리는 마이크로칩 내에 형성된, 혈소판 기능 검사 장치.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 마이크로칩 내에 2개 이상의 상기 캐필러리가 형성된, 혈소판 기능 검사 장치.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 캐필러리의 폭이 10∼150 ㎛ 및 50∼200 ㎛의 2종 이상인, 혈소판 기능 검사 장치.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    송액 펌프를 더 포함하는 혈소판 기능 검사 장치.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로칩의 내부를 촬영하는 카메라를 더 포함하는 혈소판 기능 측정 장치.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로칩 내부의 상기 혈소판이접착면의 하류에 상기 혈소판이접착면을 통과한 혈액의 폐액을 저류(貯留)하는 폐액 저류부를 포함하는 혈소판 기능 검사 장치.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 폐액 저류부의 깊이는 100㎛ 이상인, 혈소판 기능 검사 장치.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    상기 폐액 저류부의 1개소에 상기 마이크로칩의 외부로 관통하는 구멍이 형성된, 혈소판 기능 검사 장치.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 마이크로칩 표면의 상기 구멍에 상당하는 위치에 혈액 흡수재를 설치한, 혈소판 기능 검사 장치.
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