JPWO2010018833A1 - 血小板検査方法及び血小板検査装置 - Google Patents
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Abstract
Description
動脈における血栓形成(白色血栓)又は一次止血において血小板の活性化及び凝集は中心的機能を果たす。
血小板は血管が障害を受けた場合に、血管内皮細胞下に存在するコラーゲンに対し、直接的、非直接的に結合する。血流の緩やかな環境下(低ずり応力下)ではGPVIなどコラーゲン受容体により直接的な結合が主となり、血流の早い環境下(高ずり応力下)ではコラーゲンにvWFが結合し、vWFに対し血小板のGPIbα受容体が結合することで間接的にコラーゲンに結合する。コラーゲンとの直接的、間接的相互作用は血小板を活性化し、この刺激により濃染顆粒及びα顆粒からADP,セロトニンなど様々な血小板活性化物質が放出される。
これら放出された血小板活性化因子は自己の血小板及び周囲の血小板を活性化させる。活性化を受けた血小板はフィブリノゲン受容体であるGPIIb、IIIaが活性化型に構造変化を受け、フィブリノゲンに対し高親和性型となる。2量体であるフィブリノゲンを介して活性化血小板が次々架橋を受け血小板凝集を形成する。
その為、生理的血小板活性化条件とはかけ離れた、環境下での血小板活性化反応であり、各受容体の先天的機能異常など明らかな機能の違いを測定することは可能であったが、より生理的な血小板機能を測定することは困難であった。
また、特許文献1には、血液を毛細管中に通過させ、そして次に、仕切部材の開口部を通過させ;そして仕切部材の開口部で、血栓の形成が開口部を閉止するまでに必要な時間を測定することを特徴とする血小板機能の測定方法が開示されているが、この方法では、血小板活性化試薬が大量に加えられており、生体内で血小板が活性化されているが血小板数が減少している場合や、血小板数は正常であるが血小板機能が弱い場合など、生体を反映した詳細な血小板機能を測定することが困難であった。
従来の血小板機能試験においては、このような症状を厳密に反映した検査を行うことは困難であった。
例えば、濁度法では、血小板数が減少していても、血小板惹起物質に対する反応性が亢進しているならば、血小板機能亢進(強い)と判定された。また生体内の炎症反応などで形成され血栓形成に大きな影響を与える血小板・白血球の複合体は多血小板血漿を作成するための遠心分離にて赤血球とともに沈殿してしまうので多血小板血漿には含まれない。
また、PFA−100を用いた場合には、血小板の機能が強い患者においても弱い患者においても同じ惹起物質の濃度で測定するので、惹起物質のないまたは非常に薄い状態で起こる自然凝集惹起又は抗血小板薬投与患者に対し惹起物質濃度が非常に高い状態でその薬剤効果を確認するような検査が適切に実施出来ない。また、PFA-100による測定で閉塞時間が延長された場合においても血小板機能が弱い場合と血小板機能が亢進している(生体内で活性化を受けている)が、血小板数が少ない場合のデータの比較等が困難であった。
ここで、前記抗凝固処理がクエン酸又はヘパリン又はヒルジンによるものであることが好ましい。
また、前記血小板易接着面はコーティングされたコラーゲンまたはガラスからなることが好ましい。
また、前記抗凝固処理された血液は微弱な血小板活性化処理がなされたものであることが好ましく、微弱な血小板活性化処理は、不可逆的な血小板凝集を引き起こさない量の血小板活性化試薬を抗凝固処理された血液に混合することによるものであることが好ましい。
ここで、血小板活性化処理が血小板活性化試薬によって行われ、前記血小板活性化試薬がアデノシン2リン酸であり、0.001〜5μMの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されるか、あるいは、前記血小板活性化試薬がアラキドン酸であり、0.001〜1mMの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されることが好ましい。
また、前記キャピラリー内の少なくとも一部が、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部を有することが好ましい。
前記流路分割部の各流路の幅は10〜200μmであることが好ましい。
前記血小板易接着面はキャピラリーの流路分割部に設けられていることが好ましい。
前記キャピラリーはマイクロチップ内に形成されていることが好ましい。
本発明の血小板機能検査方法においては、前記抗凝固処理された血液、好ましくは微弱な血小板活性化処理がなされた抗凝固処理された血液が、ポンプによってキャピラリー内に導入され、該ポンプにかかる該血液のキャピラリーへの流入圧を圧力センサーによって測定することによって、血小板機能を検査することが好ましい。ここで、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血液より比重の軽い液体を血液収容部に導入することで、血液をキャピラリーへ導入し、該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定することが好ましい。
また、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血小板活性化試薬を血液収容部に導入することで該血液収容部内で血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液を混合し、該血小板活性化試薬と混合された血液をキャピラリーへ導入して、該血小板活性化試薬の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定することが好ましい。
また、本発明の血小板機能検査方法においては、前記キャピラリーは血液収容部に接続されており、該血液収容部内で血小板活性化試薬と混合された抗凝固処理された血液がキャピラリーを通過するように構成されていることが好ましい。ここで、血小板活性化試薬は、測定直前に抗凝固処理された血液に混合されることが望ましい。または血小板活性化試薬は抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液中の血小板活性化試薬の濃度が直線的濃度勾配又は段階的濃度勾配で増加するように、抗凝固処理された血液と混合されることが好ましい。また、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液が撹拌されることが好ましい。
ここで、前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成されていることが好ましく、2本以上のキャピラリーがマイクロチップ内に形成されていることがより好ましい。後者の場合、キャピラリーの幅が10〜150及び50〜200μmの2種以上であることが好ましい。
また、前記血小板機能検査装置は、送液ポンプを備えたものであることが好ましい。また、前記マイクロチップの内部を撮影するカメラを備えたものであることが好ましい。
また、前記血小板機能検査装置は、マイクロチップ内部の血小板易接着面の下流に血小板易接着面を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部を備えたものであることが好ましい。この場合、廃液貯留部の深さが100μm以上であることがより好ましい。廃液貯留部の一箇所にマイクロチップの外部に貫通する穴が設けられていることがさらに好ましく、マイクロチップ表面の当該穴に相当する位置に血液吸収材が設けられていることが特に好ましい。
本発明の請求項2に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理がクエン酸又はヘパリン又はヒルジンによるものであるため、安価に抗凝固処理を行うことができる。
血小板易接着面としてコーティングしたコラーゲンを用いる場合において、用いる抗凝固剤がクエン酸などのカルシウムキレート剤の場合には、血小板活性化試薬を混合した血液をコーティングしたコラーゲン上を通過させ血小板機能測定がより適している。一方、カルシウムキレート剤以外の抗凝固剤特にヒルジンを用いた場合はクエン酸で抗凝固処理した場合に比べ、コラーゲン上でより迅速に強固な血小板凝集が置き、キャピラリーを閉塞させるので血小板活性化試薬を用いずとも安定な血小板機能検査も可能となる。その際においても血小板機能の異常、抗血小板剤の使用などで血小板凝集が見られない場合においては血小板活性化試薬を混合したのち測定することで血小板機能の低下具合や抗血小板剤の効果を測定することが可能となる。1枚のチップに流路溝幅の異なる流路を配置し、ヒルジン及びクエン酸によって抗凝固処理された血液を用い測定することで、血小板凝集能の強さ及び血小板惹起物質への感受性、抗血小板剤の効果などを総合的に測定することが可能となる。
本発明の請求項3に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板易接着面がコーティングされたコラーゲンからなるため、より生理的な血小板機能の測定が可能である。
本発明の請求項4に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板易接着面がガラスからなるため、より安価な物質で血小板機能の測定が可能である。
本発明の請求項5に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は微弱な血小板活性化処理がなされたものであるため、より生理的な条件で血小板機能の測定を行うことができ、また、様々な疾患を反映した検査結果を得ることができる。
本発明の請求項6に係る血小板機能検査方法によれば、微弱な血小板活性化処理は、不可逆的な血小板凝集を引き起こさない量の血小板活性化試薬を抗凝固処理された血液に混合することによるため、簡便に微弱な血小板活性化処理を施すことができ、また、血小板活性化試薬による血小板活性化と血小板易接着面でのずり応力による血小板活性化を合わせてより生理的な血小板活性化を見ることができる。
本発明の請求項7に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板活性化試薬がアデノシン2リン酸であり、0.001〜5μMの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されるため、より生理的条件下での血小板機能が検査でき、様々な疾患を反映した結果を得ることができる。
本発明の請求項8に係る血小板機能検査方法によれば、前記血小板活性化試薬がアラキドン酸であり、0.001〜1mMの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合されるため、より生理的条件下での血小板機能が検査でき、様々な疾患を反映した結果を得ることができる。
本発明の請求項10に係る血小板機能検査方法によれば、前記流路分割部の各流路の幅が10〜200μmであるため、小さな血小板凝集塊が形成された場合その足場となり、高血流、高ずり応力下においても血流に飛ばされず内部圧力を上昇させることが可能である。
本発明の請求項11に係る血小板機能検査方法によれば、血小板易接着面が、キャピラリーの流路分割部に設けられているため、流路分割部でより血小板凝集塊が保持されやすい。
本発明の請求項12に係る血小板機能検査方法によれば、前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成されたものであるため、微量の血液で検査を行うことができる。
本発明の請求項13に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は、ポンプによってキャピラリー内に導入され、該ポンプにかかる該血液のキャピラリーへの流入圧を圧力センサーによって測定することによって、血小板機能を検査するため、血小板機能を定量的に測定できる。
本発明の請求項14に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血液より比重の軽い液体を血液収容部に導入することで、血液をキャピラリーへ導入し、該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定するため、ポンプが血液で汚染されることがないので好ましい。
本発明の請求項15に係る血小板機能検査方法によれば、前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血小板活性化試薬を血液収容部に導入することで該血液収容部内で血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液を混合し、該血小板活性化試薬と混合された血液をキャピラリーへ導入して、該血小板活性化試薬の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定するため、素早い検査が可能となる。
本発明の請求項16に係る血小板機能検査方法によれば、血小板活性化試薬は、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液中の血小板活性化試薬の濃度が直線的濃度勾配又は段階的濃度勾配で増加するように、抗凝固処理された血液と混合されるため、幅広い血小板活性化試薬の濃度における血小板活性化を測定することが可能であり、血小板の機能亢進及び機能低下を一度の実験で測定することが出来て望ましい。
本発明の請求項17に係る血小板機能検査方法によれば、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液が撹拌されるため、より正確な検査結果を得ることができる。
本発明の請求項18に係る血小板機能検査装置によれば、前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成されたものであるため、作成が容易であり、また、微量サンプルでの検査が可能である。
本発明の請求項19に係る血小板機能検査装置によれば、前記マイクロチップ内に2本以上のキャピラリーが形成されたものであるため、複数の検査を同時に行うことができる。
本発明の請求項20に係る血小板機能検査装置によれば、キャピラリーの幅が10〜150及び50〜200μmの2種以上であるため、微量のサンプルで複数の検査を同時に行うことができる。
本発明の請求項21に係る血小板機能検査装置によれば、送液ポンプを備えたものであるため、キャピラリー内への血液の流入速度を制御でき、好ましい。
本発明の請求項22に係る血小板機能検査装置によれば、前記マイクロチップの内部を撮影するカメラを備えたものであるため、血小板の活性化を観察ができる。設置されるカメラは動画、静止画を撮影可能であることが望ましい。一定時間間隔で自動的に内部の動画及び静止画を撮影し保存すると、測定後に血小板の活性化の状態を経時的に視覚的に評価でき好ましい。流路内をパノラマ写真又は静止画の連続として全体を撮影できると保存および客観的比較が容易でありより望ましい。静止画、動画を撮影するにあたり、透過型の光源、即ちカメラと反対側に光源を設置して撮影するとより鮮明な画像の撮影が可能である。
本発明の請求項23に係る血小板機能検査装置によれば、マイクロチップ内部の血小板易接着面の下流に血小板易接着面を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部を備えたものであるため、血液廃液を吸引して除去する必要がなく、簡便に検査を行うことができる。
本発明の請求項24に係る血小板機能検査装置によれば、廃液貯留部の深さが100μm以上であるため、血液廃液を十分収容できる。
本発明の請求項25に係る血小板機能検査装置によれば、廃液貯留部の一箇所にマイクロチップの外部に貫通する穴を設けたものであるため、廃液貯留部の空気が外部に抜け、内圧が上昇することなく貯留部に血液を貯留することが可能となる。
本発明の請求項26に係る血小板機能検査装置によれば、マイクロチップ表面の前記穴に相当する位置に血液吸収材を設けたものであるため、血液吸収材に血液廃液を吸収させることができ、血液廃液が飛散することがなく好ましい。
図1は、本発明の血小板検査装置を構成するマイクロチップの第1の形態例を示す概念図である。以下、図1に基づいて説明する。
そして、キャピラリー101となる溝の第1の端部(流入口側端部)と第2の端部(排出口側端部)の間の一部には、血液の流れる方向に沿って延在する複数の流路分割壁103が設けられ、該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割部102を形成している。
また、流路分割壁103の間隔は200μm以下であることが望ましい。幅が200μm以下であれば血小板凝集塊が形成された場合、高血流、高ずり応力下においても血流に飛ばされず内部圧力を上昇させることが可能である。また、流路分割部102において、キャピラリー101の幅は流路分割壁103によって5つ以上に分割されていることが望ましい。すなわち、流路の幅が5本以上に分割されていれば、各分割流路の閉塞が平均化され、バラツキの少ないデータが得られやすい。
なお、流路分割壁103の形状は、キャピラリー101の幅を複数に分割できさえすれば特に制限されない。
なお、血小板易接着面は図3(第2の形態例)のようにキャピラリーの全長に及んでもよい。第2の形態例では第2の基板210がガラスを素材としており、マイクロチップ2のキャピラリー201内部の第2の基板側全長が血小板易接着面206となる。
なお、図1や3のように第2の基板においてキャピラリーの第2の端部に相当する位置に貫通孔を設けて排出口とする代わりに、図13(第3の形態例)に示されるように、第2の基板310においてキャピラリー301の第2の端部に相当する位置を取り囲むように溝を設けて、第1の基板300と貼り合わせることにより、血小板易接着面306を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部307としてもよい。廃液貯留部307の容積を試験に用いる血液量よりも大きくすることにより、第1および第2の形態例のように血液廃液を排出口からポンプ等で吸引して排出する必要がなく、より簡便な検査が可能である。なお、廃液貯留部307には貫通孔を設けてこれを空気穴305としてもよい。そして、マイクロチップ3の表面の貫通孔305に相当する位置に血液吸収材308を設置すれば、血液サンプルの量が多い場合でもマイクロチップ外に血液廃液が飛散することがない。血液吸収材としては、例えば、スポンジや布などを貼り付けることができる。
コラーゲンのコーティングは、例えば、特開平05−260950号公報やBlood.1995 Apr 1;85(7):1826−35.に記載されているように、コラーゲンを酸性溶液に溶解し、これを親水性が付与されたガラスやポリスチレン等の基板の所定の位置に塗布し、洗浄、乾燥するなどの方法にて簡便に高い接着強度でコーティングが可能である。
疎水性の樹脂等にコートする場合には、樹脂表面をプラズマ処理等で親水化した後、所望の領域にコラーゲン溶液を塗布し、自然乾燥ないしは減圧下にて乾燥することでコーティングすることが出来る。
基材としてプラスチックを用いた場合はプラズマ処理等で親水化し、所望の領域にコラーゲン溶液をピペットやシリンジ等のディスペンサーで塗布し、自然乾燥または減圧下で乾燥することでコラーゲンまたは組織トロンボプラスチンを含むコラーゲンを容易にコーティングすることが可能である。
血小板易接着面としてガラスを用いる場合、第2の基板110上の血小板易接着面106に相当する位置のみガラスで、それ以外の部分はプラスチック、シリコーン等で形成された第2の基板110を用いてもよいが、図3のように、第2の基板210としてガラス基板を用い、プラスチック、シリコーン等で形成された第1の基板200と積層したときに血小板易接着面206がキャピラリー201の全長に及ぶようにしてもよい。
また送液ポンプの液体はミネラルオイル又は生理食塩水などの血液より比重の小さい液体とし、送液ポンプで当該液体を抗凝固処理された血液があらかじめ充填されたリザーバーに導入することで、血液がキャピラリーへ導入されるようにしてもよい。該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定することができる。なお、リザーバーに予め充填された抗凝固処理された血液は血小板活性化試薬が混合されたものであることが好ましい。また、血小板活性化試薬を乾燥又は液体状態でリザーバー内に予め入れておき、血液と混合することも可能である。又、送液ポンプの流速を段階的に高めることで、ずり応力を段階的に上昇させることも可能である。
その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、トロンビンアプタマー、コーン由来トリプシンインヒビター(1977. J.Biol.Chem 252.8105)等の利用が可能である。なお、抗凝固処理剤は、複数用いられてもよい。用いる抗凝固剤がヒルジンの場合には、クエン酸による抗凝固処理の場合に比べ、血小板活性化試薬の処理が無くとも、より強固な血小板凝集が引き起こされるので、ずり応力依存的な血小板機能を測定するのに適している。クエン酸による抗凝固処理血液の場合には、血小板活性化試薬の刺激依存的な血小板機能測定が精度良く測定でき、抗血小板剤の評価などにより適している。
さらに、ヘパリンを含む真空採血管等で採血した後、へパリナーゼと観測目的に適した抗凝固処理剤を加え、ヘパリナーゼでヘパリンを分解させ、測定目的に適した抗凝固処理剤と置き換えることも可能である。
図2は、マイクロチップ1を透明な基板で構成して組み込んだ本発明の血小板検査装置の第1の形態例である血小板検査装置Aの模式図である。以下、図2に基づいて第1の形態例を説明する。
そして、送液ポンプ109から、血小板活性化試薬がリザーバー107内に圧入され、血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液とが、磁力スターラー113によって回転される攪拌子108により混合される。
流路分割部102における血小板の活性化(血小板の粘着・凝集など)やそれに伴うキャピラリーの閉塞をカメラ111で観察することで血小板機能の検査を行うことができる。あるいは、流路内の圧力を送液ポンプ109に接続された圧力センサーによって測定することでより定量的な血小板機能検査が可能となる。また、血液と血小板活性化試薬との混合液のキャピラリー101の通過時間または通過量を測定することによっても血小板機能検査を行うことができる。
カメラ111は画像解析装置114に接続されており、それによって血小板活性化の様子を画像化したりすることができる。内部の血小板活性化を撮影することにより視覚的評価及び圧力上昇による血小板活性化の定量的検査の併用は、患者血液の状態を総合判断する上で非常に重要である。例えば、DIC等の病態において血小板が生体内で既に活性化を受けるとともに血小板が消耗し著しく減少しているケースにおいては、圧力上昇や閉塞時間は遅延される。そのようなケースにおいても、内部をカメラにより撮影することで検査開始直後から血小板易接着表面への血小板の粘着及び凝集の上昇などを確認することができ、患者の血小板の状態を総合的に判断することが可能となる。
カメラ111はキャピラリー101の血流方向に沿って移動可能なものでもよい。
なお、キナクリン等によって血小板を蛍光標識して解析することもでき、その場合、蛍光発色による単位面積あたりの輝度を画像解析で観測することで観測結果を数値化し、データとして取得することが可能である。
流路分割部102を通過した血液混合液は、排出口105から排出管112により円滑に排出される。
例えば、マイクロチップ内に、抗凝固処理血液と血小板活性化試薬を混合する混合部が設けられたマイクロチップを用い、マイクロチップ内で血液と血小板活性化試薬が混合され、該混合液が混合部からキャピラリーへと流れるように構成することもできる。
図1(A)に示す第1の基板100および図1(B)に示す第2の基板110の2枚の透明な基板(株式会社リッチェル製射出成型品)を用意した。第1の基板100のキャピラリー101となる溝が開口する面と第2の基板110の血小板易接着面106を有する面を対向させてシランカップリング剤及び60度16時間の熱圧着により貼り合せ、図1(C)に示すマイクロチップ1とした。なお、第1の基板100においては、流路(キャピラリー)101の長さは20mm、深さは50μm、幅は2mmとし、流路分割部102には、長さ2mm、幅25μm、高さ50μmの流路分割壁103を25μmの等間隔で設置し、この部分を流路分割部102とした。第2の基板100においては、流入口104および排出口105となる穴は内径2mm深さ2mmの断面円形の貫通孔とした。また、第2の基板110の、第1の基板100の流路分割部102と重なる位置に3mg/mlのコラーゲンタイプI(新田ゼラチン製)を塗布し真空乾燥して血小板易接着面106とした。
図2のように、作成したマイクロチップ1を、ステージ状のヒーター115の上に設置し、マイクロチップ1の流入口104にリザーバー107を接続し、リザーバー107にはチューブを介してポンプ109を接続し、ポンプにかかる圧力を図示しない圧力センサーで測定した。リザーバー107内には、鉄製の円柱をPMEAで被覆した直径2mm、長さ5mmの円柱形状の撹拌子108を収納した。撹拌子108は、37℃に加温したヒーター115の下に設置されたスターラー113の磁力によって60〜180rpmで回転するようにした。排出口には排出管112を接続し、解析終了後の血液を排出できるようにした。また、マイクロチップ1の流路分割部102の上方には画像解析装置114が接続したカメラ111を設置し、流路分割部102における血小板活性化の様子を観察できるようにした。
図1に示すマイクロチップ1及び図2に示す血小板検査システムAを用いて測定を行った。クエン酸によって抗凝固処理を行った血液を被験者Aより採血した。
リザーバー107にはクエン酸で抗凝固処理された全血を満たし、接続されるポンプ109によって生理食塩水を注入口よりリザーバー107内に注入することで血液をリザーバー107から押し出しマイクロチップ1内に流入させた。リザーバー107内には攪拌子108が入っており血液は攪拌子108によって攪拌されている。
ポンプ109の流速は最初の10秒間100μl/分で流し、以降は3μl/minで流した。
ポンプ109の圧力変化を図5に示す。
実施例1の実験で、3μl/minの流速を6μ/minで流した以外は全く同様の実験を行った
(実施例1と同じ被験者の血液検体Aを用いた。)。ポンプ109の圧力変化を図6に示す。
(考察)同一検体において流速を3μl/min〜6μl/minに上昇させることでずり応力の上昇が起き、圧力上昇が確認された。
ポンプ109に生理食塩水の代わりに0.5μMのADP溶液を充填した以外は実施例2と全く同様の実験を行った。(実施例と同じ被験者Aの血液検体を用いた。)ポンプ109の圧力変化を図7に示す。
実施例1〜3の実験を別被験者検体(検体B)を用いて測定した。ポンプ109の圧力変化を図8,9,10にそれぞれ示す。
被験者A及びBの血液を800rpmで遠心分離を行い多血小板血漿を得、両検体について血小板凝集能測定装置(PA-20興和株式会社)によってADP惹起血小板凝集能を測定した。1μMのADPによる大凝集は被験者Aに比し被験者Bの血液は半分程度であった。
被験者AとBの結果より、被験者Aはずり応力下におけるコラーゲンの粘着・凝集による圧力上昇は被験者Bに比べて弱めであるが、ADPによる凝集能は強めで、ADP添加時には被験者Bと同等のコラーゲンへの粘着・凝集による圧力上昇が確認された。
画像による診断実施例1のマイクロチップ1及びシステムAを用いて実験を行った。ポンプ109にはミネラルオイルを充填し、リザーバー107にはクエン酸で抗凝固処理された血液を満たした。流速8μl/minでポンプ109よりリザーバー107にミネラルオイルを送液し、血液をマイクロチップ1に流した。全く同様の実験をそれぞれクエン酸血液に終濃度0.025μM、0.05μM、0.1μMのADPを添加した血液を用いて実施した。図11はそれぞれ約1分後のマイクロチップ1内の様子をカメラ111により撮影したものである。
ADP添加時はADPの濃度依存的に、櫛部分に付着する血小板の量の上昇が確認され圧力上昇を伴わないレベルにおいても血小板の付着を視覚的に確認することが出来た。
図4に示す血小板機能検査装置Bは、マイクロチップ1の代わりにマイクロチップ2を用いたこと、および、撹拌子とスターラーを備えていないこと以外は、図2の血小板機能検査装置Aと同じである。以下の実施例ではあらかじめADPと混合した抗凝固処理血液をリザーバーに入れたため、撹拌子とスターラーは不要である。
図3に示されるマイクロチップ2と図4に示される血小板機能検査装置Bを用いた。
血液リザーバー207にクエン酸により抗凝固処理した血液約600μl充填した。ポンプ209にミネラルオイルを充填し、ポンプ209とリザーバー207を接続しリザーバー207の先端はさらにマイクロチップ2の流入口204に接続した。ポンプ209からミネラルオイルを20μl/分の流速でマイクロチップ2に注入し、図示しない圧力センサーによってミネラルオイルの流入圧力を測定した。
リザーバー207内にクエン酸によって抗凝固処理した血液にさらに終濃度2nMになるようにADP(和光純薬製)を加えた血液を用いた以外は全く実施例8と同様の実験を行い圧力の変化を測定した。
75mgクロピドグレル(Sanofi-aventis社)を服用3時間後の血液を用いた以外は実施例9と全く同様の実験を行い圧力変化を測定した。
図4のように、作製したマイクロチップ1をヒーター215上に設置し、実施例8同様にポンプ209及びリザーバー207を接続した。
(a)検体Dからヒルジン採血管(Multiplate Services GmbH)を用いて採血を行ったヒルジンによって抗凝固処理された血液をリザーバー207に約600μl充填した。ポンプ209にミネラルオイルを充填し、ポンプ209とリザーバー207を接続し、リザーバー207の先端はさらにマイクロチップ1の流入口104に接続した。ポンプ209からミネラルオイルをはじめの5秒間は200μl/分、それ以降は20μl/分の流速でリザーバーに注入することで、リザーバー内の血液を同様の流速にてマイクロチップ1に注入し、図示しない圧力センサーによってミネラルオイルの流入圧力を測定した。
実施例11と同様の実験を検体Eに対しても実施した。結果を図14(B)に示す。
検体D、E、Fに対し、全血血小板凝集能測定装置multiplate(ダイナバイト社)を用いて血小板凝集能を測定した。採血はヒルジン採血管を使用し、6μMのADPによる凝集能を測定した。結果を以下に示す。D 691AU/min、 E 525AU/min、 F 652AU/minADP凝集は検体D、F、Eの順に強かった。
クエン酸で抗凝固処理した検体Eの血液約600μlと100μMのADP試薬(クロノログ社)を6μlとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例11a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ1はヒーター上で、はじめの5秒を200μl/分で流し、以降20μl/分で流した。
a)実施例14同様の実験を検体Dの血液を用いて実施した。b)実施例14同様の実験を、100mgのクロピドグレルを経口投与し6時間後の検体Dの血液を用いて実施した。
a)クエン酸で抗凝固処理した検体Gの血液約600μlと50mMのアラキドン酸(クロノログ社)6μlとを混和した直後の血液をリザーバーに満たし、これを、実施例11a同様に、ミネラルオイルを満たしたポンプを接続しマイクロチップに接続した。マイクロチップ1はヒーター上に設置され、はじめの5秒を200μl/分で流し、以降20μl/分で流した。
実施例16のa〜fの実験を検体Gがアスピリン100mgを服用してから6時間後に実施した。
検体Gのアスピリン100mg服用6時間後の血液を用い、実施例16d〜f同様の実験を、添加するコラーゲン12μl及び18μlに増量して実施した。
これらの結果よりアスピリンの抗血小板効果がアラキドン酸、コラーゲンをクエン酸血液に添加し、マイクロチップに流し圧力上昇を測定することで解析することが可能であった。また図19に示すようにアスピリンを服用した血液においても添加するコラーゲンを増量することで圧力上昇することが分かった。このことより本手法でアスピリンの効果の有無のみならず、血小板機能の抑制具合も評価可能であることが分かった。
検体Hの血液を用いて実施例11(a)同様の実験を行った。
ポンプ209からミネラルオイルをはじめの5秒間は200μl/分、それ以降は7μl/分の流速でリザーバーに注入することで、リザーバー内の血液を同様の流速にてマイクロチップ1に注入した以外は、実施例19と同様にして実験を行い、ミネラルオイルの流入圧力を測定した。
実施例19及び実施例20と同様の測定をヒルジンによって抗凝固処理した血液に対し0.4μg/ml、0.8μg/mlの血小板膜上の受容体GPIIbIIIaに対する抗体であるReoPro(Eli lilly社)を添加してそれぞれ実施した。
実施例19及び実施例20と同様の測定をヒルジンによって抗凝固処理した血液に対し、血小板膜上の受容体GPIbに対する阻害剤であるOS−1(Biochemistry. 2008 Apr 22;47(16):4674-82)を0.01μg/ml及び 0.1μg/ml添加してぞれぞれ実施した。
図22は流速20μl/minにおけるReoProの抑制効果、図23は流速7μl/minにおけるReoProの抑制効果を示す。
図24は流速20μl/分におけるOS−1の抑制効果、図25は流速7μl/分におけるOS−1の抑制効果を示す。
GPIIbIIIaは主にフィブリノゲンと結合し血小板凝集に関与し、GPIbはvWFと結合し高ずり応力下の血小板粘着反応に関与する受容体である。
Claims (27)
- 抗凝固処理された血液を、少なくとも内面の一部に血小板易接着面を備えたキャピラリーを通過させ、該血液のキャピラリー内での挙動を観察又は測定することによって、血小板の機能を検査することを特徴とする、血小板機能検査方法。
- 前記抗凝固処理がクエン酸又はヘパリン又はヒルジンによるものである、請求項1記載の検査方法。
- 前記血小板易接着面はコーティングされたコラーゲンからなる、請求項1または2記載の検査方法。
- 前記血小板易接着面はガラスからなる、請求項1または2記載の検査方法。
- 前記抗凝固処理された血液は微弱な血小板活性化処理がなされたものである、請求項1ないし4のいずれかに記載の検査方法。
- 前記微弱な血小板活性化処理は、不可逆的な血小板凝集を引き起こさない量の血小板活性化試薬を抗凝固処理された血液に混合することによる請求項5記載の検査方法
- 前記血小板活性化試薬がアデノシン2リン酸であり、0.001〜5μMの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合される、請求項6記載の検査方法。
- 前記血小板活性化処理がアラキドン酸であり、0.001〜1mMの濃度になるように抗凝固処理された血液と混合される、請求項6記載の検査方法。
- 前記キャピラリー内の少なくとも一部が、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部を有する、請求項1ないし8のいずれかに記載の検査方法。
- 前記流路分割部の各流路の幅が10〜200μmである、請求項9記載の検査方法。
- 血小板易接着面が、キャピラリーの流路分割部に設けられた、請求項9または10記載の検査方法。
- 前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成された、請求項1ないし11のいずれかに記載の検査方法。
- 前記抗凝固処理された血液は、ポンプによってキャピラリー内に導入され、該ポンプにかかる該血液のキャピラリーへの流入圧を圧力センサーによって測定することによって血小板機能を検査する、請求項1ないし12のいずれかに記載の検査方法。
- 前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血液より比重の小さい液体を血液収容部に導入することで、血液をキャピラリーへ導入し、該液体の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定する、請求項13記載の検査方法。
- 前記抗凝固処理された血液は、キャピラリー及びポンプに接続された血液収容部内に貯蔵され、ポンプによって血小板活性化試薬を血液収容部に導入することで該血液収容部内で血小板活性化試薬と抗凝固処理された血液を混合し、該血小板活性化試薬と混合された血液をキャピラリーへ導入し、該血小板活性化試薬の流入圧を測定することで血液のキャピラリーへの流入圧を間接的に測定する、請求項13記載の検査方法。
- 前記血小板活性化試薬は、抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液中の血小板活性化試薬の濃度が直線的濃度勾配又は段階的濃度勾配で増加するように抗凝固処理された血液と混合される、請求項15記載の検査方法。
- 抗凝固処理された血液と血小板活性化試薬との混合液が撹拌される、請求項15または16記載の検査方法。
- 少なくとも内面の一部に血小板易接着面を有するキャピラリーと、該キャピラリー内の少なくとも一部に設けられ、該キャピラリーにおける血液の流れる方向に沿って延在し且つ該キャピラリーの幅を複数に分割する流路分割壁を備えた流路分割部とを有する、血小板機能検査装置。
- 前記キャピラリーがマイクロチップ内に形成された、請求項18記載の血小板機能検査装置。
- 前記マイクロチップ内に2本以上のキャピラリーが形成された、請求項19記載の血小板機能検査装置。
- キャピラリーの幅が10〜150μm及び50〜200μmの2種以上である、請求項20記載の血小板機能検査装置。
- 送液ポンプを備えた、請求項18ないし21のいずれかに記載の血小板機能検査装置。
- 前記マイクロチップの内部を撮影するカメラを備えた、請求項19ないし22のいずれかに記載の血小板機能測定装置。
- マイクロチップ内部の血小板易接着面の下流に血小板易接着面を通過した血液廃液を貯留する廃液貯留部を備えた、請求項19ないし23のいずれかに記載の血小板機能検査装置。
- 廃液貯留部の深さが100μm以上である、請求項24記載の血小板機能検査装置。
- 廃液貯留部の一箇所にマイクロチップの外部に貫通する穴を設けた、請求項24または25記載の血小板機能検査装置。
- マイクロチップ表面の前記穴に相当する位置に血液吸収材を設けた、請求項26記載の血小板機能検査装置。
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