CN104871005B - 血小板凝集能力的综合评价方法 - Google Patents

Abstract

综合且定量地分析血小板凝集能力和血小板凝集块的稳定性和持续性的方法，所述方法包括以下步骤：在密闭容器内使血小板活化试剂和血液反应的步骤；利用被连接于该容器的第一端的泵，将与血液不混溶的液体注入该容器，由此将血小板活化试剂和血液的混合液从该容器压出，使通过被连接于该容器的第二端的过滤器设备的过滤器的步骤；以及测定泵承受的压力的步骤。

Description

血小板凝集能力的综合评价方法

技术领域

本发明有关研究血小板凝集能力的方法和检査装置，更详细地说，本发明有关用于进行血小板凝集能力和形成的凝集块的稳定性和持续性的综合评价方法及其所使用的装置：将与血小板活化试剂混合的血液使用泵从容器压出后通过过滤器，由此时压力变化的积分值来综合评价血小板凝集能力和形成的凝集块的稳定性和持续性。

背景技术

(血小板凝集检査的现有技术的问题)

在动脉中血栓形成(白色血栓)中或在初级止血中，血小板的活化和凝集起到核心作用。

血小板在血管受到伤害的情况下，与在血管内皮细胞下存在的胶原蛋白直接地、间接地结合。在血流缓慢的环境下(过低应力下)，以与糖蛋白VI(GPVI)等胶原蛋白受体直接结合为主；在血流快速的环境下(过高应力下)，血管性血友病因子(vWF)与胶原蛋白结合，通过vWF与血小板的糖蛋白Ibα(GPIbα)受体结合，间接地与胶原蛋白结合。与胶原蛋白直接的、间接的相互作用使血小板活化，通过该刺激使腺苷二磷酸(ADP)、血清素等各种各样的血小板活化物质从致密颗粒和α颗粒释放。

这些释放的血小板活化因子将自身的血小板和周围的血小板活化。

受到活化的血小板受到纤维蛋白原受体GPIIbIIIa向活化型的构造变化的影响，变为对纤维蛋白原的高亲和型。活化的血小板借助于二聚体纤维蛋白原被逐个交联，形成血小板凝集块。

以往主要利用光透过法进行血小板凝集能力的测定。在该方法中，将从血液分离的富血小板血浆(以下称PRP)与血小板活化试剂混合，通过血小板凝集的浊度相对于时间的变化(降低)作成凝集率曲线(例如，专利文献1)。

另外，由于从血液制备PRP麻烦，为了更简便地测定血小板凝集，有人提议可以使用全血进行测定的血小板凝集测定装置。作为主要的装置，是将全血和血小板活化物质混合后，测定血小板的粘附/凝集导致的浸渍在血液中的电极的电阻变化的装置(例如，非专利文献1、2)。

另外，也有报告以下方法：将与多种浓度的血小板活化试剂混合后的血液静置数分钟使其反应后，通过吸引使之通过滤网，通过吸引压力确定血小板活化试剂的临界值，确定血小板凝集能力的正常与异常(专利文献2、专利文献3)。该方法为全血血小板凝集能力测定方法，由凝集曲线和凝集临界值算出全血中的血小板凝集临界值系数，通过血小板凝集临界值系数包含在哪个范围来判定全血中的血小板凝集能力正常与否。

另外，专利文献4中公开了血小板机能检査方法，其特征为：使混合了微量血小板活化试剂进行抗凝处理后的血液通过至少在内面的一部分具备血小板易粘接面的毛细管，观察或测定该血液在毛细管内的行为以检査血小板的机能。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特公平8-10226号公报

专利文献2：日本特开2005-291849号公报

专利文献3：日本特开2006-300859号公报

专利文献4：国际公开文本第2010/018833号

非专利文献

非专利文献1：Morphologicalterationsofbloodcellsintheimpedanceaggregometer.BloodCells.1985；11(2):325-36,337-9.

非专利文献2：Amethodoftestingplateletaggregationinnativewholeblood.ThrombRes.1985年4月1日；38(1)：91-100.

发明内容

在以往的血小板凝集能力测定中，可以通过添加血小板活化试剂来测定凝集块形成和其发生的临界值，而定量地测定其稳定性和持续性却很困难。即，在该方法中，与不同浓度的血小板活化试剂反应数分钟后，经吸引使之通过过滤器，通过由堵塞造成的负压来测定导致血小板凝集的浓度，虽然可以确定引起堵塞的血小板活化试剂的临界值浓度，然而由于通过的血液流速对滤网的堵塞程度存在依赖关系因而产生变化，从而不能正确且定量地评价。

而且，在吸引的情况下，由于血液和吸引用注射器之间存在空气，特别是在低流速范围(100μm/分钟以下)内，流速不能保持恒定，而且不能随时间变化测定在恒定流速下通过过滤器的正确的压力变化。进一步地，要调整各种浓度的血小板活化试剂，还必须进行吸引，也存在操作麻烦的问题。

本发明正是鉴于上述情况而作出的，本发明的课题是提供能够定量评价血小板凝集开始的速度以及凝集块的稳定性和持续性的方法和装置。

为解决上述课题，本发明提供血小板凝集能力和血小板凝集块的稳定性的分析方法，所述方法包括以下步骤：在密闭容器内使血小板活化试剂和血液反应的步骤；利用被连接于该容器的第一端的泵，将与血液不混溶的液体注入该容器，由此将血小板活化试剂和血液的混合液从该容器的第二端压出，使通过被连接于该容器的第二端的过滤器设备的过滤器的步骤；以及测定泵承受的压力的步骤。

上述与血液不混溶的液体优选为矿物油。

上述血小板活化试剂优选为终浓度1～10μM的ADP、终浓度0.5～10μg/ml的胶原蛋白或终浓度0.2～20mM的花生四烯酸。

上述与血液不混溶的液体的注入速度优选为5～200μl/分钟。如果进行5分钟的反应，只需25μl～1ml的血液就够了，因此可以测定适量的血液样品。

上述过滤器优选滤网的节距尺寸或直径(ピッチサイズまたは径)为10μm～50μm。

另外，优选将上述与血液不混溶的液体注入上述容器时，上述血小板活化试剂和血液的混合液在血小板活化试剂和血液混合后20秒以上、2分钟以内到达上述过滤器。

本发明还提供用于血小板凝集能力和血小板凝集块的稳定性分析的装置，所述装置包括：密闭容器、被连接于该容器的第一端的泵、测定该泵承受压力的传感器以及被气密连接于该容器的第二端的过滤器设备。所述密闭容器优选由血液收纳部以及用于将其密封的盖形成，所述密闭容器优选借助于所述盖与过滤器设备连接，此处，过滤器设备优选包含过滤器部和废液储留部，该废液储留部优选具有空气孔。

如果使用本发明的方法和装置，能够定量评价血小板凝集的稳定性和持续性。

上述与血液不混溶的液体优选为矿物油，原因在于矿物油能将血液高效地从容器压出到达过滤器设备。

上述血小板活化试剂优选为终浓度为1～10μM的ADP、终浓度为0.5～10μg/ml的胶原蛋白或终浓度为0.2～20mM的花生四烯酸，原因在于容易形成血小板凝集块，有效地得到压力上升波形。

上述与血液不混溶的液体的注入速度优选为5～200μl/分钟，原因在于可以正确地输送液体，且使用少量的血液就能够在一定时间内测定。

上述过滤器的滤网的节距尺寸或直径优选为10μm～50μm，原因在于可以再现性良好地得到由血小板凝集块导致的压力上升波形。

而且，将上述与血液不混溶的液体注入上述容器时，如果上述血小板活化试剂和血液的混合液在血小板活化试剂与血液混合后20秒以上、2分钟以内到达上述过滤器，由于血小板在被活化的同时通过过滤器，凝集块的形成速度容易反映于压力波形的上升时间。

通过使得在血小板凝集反应开始后、结束前迅速地通过过滤器，压力波形的积分值综合反映血小板凝集块的形成速度、稳定性和持续性。

附图说明

图1表示本发明的血小板凝集能力测定装置的第一实施方式的例子的图。

图2为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例1)。

图3为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例2)。

图4为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例3)。

图5为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例4)。

图6为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例5)。

图7为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例6)。

图8表示本发明的血小板凝集能力测定装置的第二实施方式的例子的图。

图9表示本发明的血小板凝集能力测定装置中的过滤器的一个例子的图。

图10表示本发明的血小板凝集能力测定装置(血液收纳容器和过滤器设备)的第三实施方式的例子的图。

图11为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例7)。

图12为使用本发明的血小板凝集能力测定装置的压力测定结果的图(实施例8)。

具体实施方式

本发明是在气密连接有输送矿物油等与血液不混溶的液体的泵的容器内，将血小板活化试剂和血液混合后，将该液体以恒定流速注入容器，使血小板活化试剂和血液的混合液以恒定流速流入被连接于容器的另一端的过滤器设备的过滤器，随时间变化测定此时压力的变化波形，从而对血小板凝集能力、血小板凝集块稳定性以及它们进行综合评价。

首先，参照附图对本发明的血小板凝集能力测定方法和装置进行说明。并且，本发明中“血液”包括全血和富血小板血浆。图1表示本发明的血小板凝集能力测定装置的实施方式的例子的概念图。但是，本发明的装置不仅限于该实施方式。

以下，基于图1进行说明。

有关本发明的第一实施方式的装置10具有：血液收纳容器1(以下，有时仅称为容器1)、被气密连接于该容器1的第一端的送液泵2、测定该泵2承受的压力的压力传感器3以及被连接于该容器1的第二端的过滤器设备4。

过滤器设备4包含过滤器部5和废液储留部6。

过滤器设备4测定时可以与在容器1的第二端具有开孔的突起部、通过滤器部的开口部(贯通孔)连结使用。

过滤器设备4例如可以制作成：在圆筒形的容器的内部，将在圆的中央具有过滤器的过滤器部5嵌入使之与过滤器的外周靠紧。由此，通过过滤器的血液样品作为废液能够储留在废液储留部6。在废液储留部6上开有空气孔7，由此使之通气，使正确测定压力成为可能。

容器1的材质可以列举：金属、玻璃、塑料、硅树脂等，优选透明的材质。而且，为了抑制在意外的部位发生血液凝固，也可以在内部使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚丙烯酸2-甲氧基乙酯(PMEA)等进行处理。

在本发明的方法中，首先，在容器1内使血液与血小板活化试剂反应。

容器1内收纳的血液优选为经过抗凝处理的血液。

此处，作为抗凝处理剂，可以列举：柠檬酸钠或柠檬酸钾、乙二酸钠或乙二酸钾、柠檬酸葡萄糖(ACD)、乙二胺四乙酸(EDTA)盐等。这样的抗凝处理剂可以使用粉末、冻干品、水溶液等溶液。在这些抗凝处理剂中，由于能够容易得到，一般优选3.2％柠檬酸钠。在该情况下，优选相对于血液9份体积，该抗凝处理剂为1份体积。

作为其他的抗凝处理剂，可以使用肝素、水蛭素、凝血酶抑制剂、来自于玉米的胰蛋白酶抑制剂(1977.J.Biol.Chem252.8105)等。另外，也可以使用多种抗凝处理剂。

作为得到抗凝处理的血液的方法，可以采用在注射器或真空采血管内预先放入上述抗凝处理剂然后进行采血的方法，或者采用在刚刚采集的血液中迅速加入抗凝处理剂等的方法，得到抗凝处理后的血液。

作为与抗凝处理后的血液混合的血小板活化试剂，可以列举ADP、胶原蛋白、花生四烯酸和瑞斯托霉素等。血小板活化试剂使用引起健康人的血小板活化的浓度。引起血小板活化的浓度为：例如，对于ADP，终浓度为1～10μM；对于胶原蛋白，终浓度为0.5～10μg/ml；对于花生四烯酸，终浓度为0.2～20mM。

也可以预先将血液与血小板活化试剂混合后，将该混合液放入容器1内，但优选将血小板活化试剂以干燥或液体状态放入容器1内，再向其中加入血液使其反应。

例如，容器1的过滤器设备连接侧的端部可以由橡胶等材料制成，设置有针能穿透的盖，用注射器将采集的血液注入，可以使之与预先收纳在容器1内的血小板活化试剂发生反应。

通过借助于管被气密连接于容器1的第一端的送液泵2，将该泵2内的与血液不混溶的液体注入容器1，将该容器1内的血小板活化试剂和血液的混合液向被连接于该容器1的第二端的过滤器设备4压出。

另外，作为将与血液不混溶的液体注入容器1而将血小板活化试剂和血液的混合液向过滤器部压出的时间点，优选将血小板活化试剂和血液的混合液在血液与血小板活化试剂混合后20秒以上、2分钟以内(优选20秒以上、1分钟以内)到达过滤器的时间点开始注入。

例如，专利文献2中，将0.5μM、1μM、2μM、4μM的ADP与血液混合5分钟反应后，吸引使之通过过滤器，通过由堵塞造成的吸引压力绘制凝集曲线，确定引起血小板凝集的血小板活化物质的临界值浓度。

但是，使用该方法不仅具有需要调整不同浓度的血小板活化试剂的麻烦，而且，虽然可以确定发生凝集的浓度临界值，然而在结果中不能反映形成的血小板凝集块的稳定性和持续性等。

另一方面，在本发明中，将在健康人中的血小板发生活化的浓度范围以内的血小板活化试剂与血液混合后在20秒以上、2分钟以内(优选20秒以上、1分钟以内)的血液通过过滤器。在压力的上升开始时，反映血小板凝集块的形成程度(速度)，最大压力反映了凝集块的稳定性。进一步来说，压力的积分值反映了凝集形成以及形成的凝集块的稳定性两方面。

送液泵的液体在注入容器1时与血液不混合，只要是能够将血液和血小板活化试剂的混合液从容器1压出的液体即可，例如可以列举：矿物油。再者，可以通过阶段性地提高送液泵的流速，使剪应力阶段性地上升。

从容器1压出的血小板活化试剂和血液的混合液到达过滤器设备4，在由血小板凝集引起的过滤器发生堵塞的同时，该混合液通过过滤器。

然后，通过过滤器的血液收纳于废液储留部6。

过滤器为滤网状，滤网的节距尺寸或直径优选10μm～50μm，较优选20μm～50μm。并且，过滤器的面积优选为1～100mm²。过滤器的厚度优选10～100μm。

为了测定血小板的稳定性，流速优选为5～200μl/分钟的恒定流速，较优选10～100μl/分钟的恒定流速。

而且，优选用时2分钟～10分钟，使样品通过过滤器。

就本发明的方法而言，即使在低流速，例如以50μl/分钟、10分钟随时间通过过滤器的情况下，使用500μl这样较少量的全血样品也已经足够了。

并且，优选血液容器和过滤器经加热器加热至约37℃。

以恒定流速通过过滤器，因血液凝集导致过滤器发生堵塞，高感度地测定由此产生的微妙的压力变化，算出2～10分钟之间的压力波形的积分值，从而能够评价血小板凝集能力。

压力上升开始时间(从测定开始到压力开始上升的时间段)主要与血小板凝集能力以及凝集速度相关，对此，最大压力反映形成的血小板凝集块的稳定性和强度，相对于时间绘制的压力波形的积分值/下部面积(AUC)成为其综合指标。

通过将密闭容器内的血小板活化后的血液使用微泵(Micropump)使之流入过滤器，在以恒定流速通过过滤器时，可以以0.1kPa单位正确测定压力变化。

并且，在过滤器因血小板凝集块造成堵塞、压力开始上升后，再经过一定时间(2～10分钟左右)，继续使血液以恒定流速通过过滤器，连续测定此后的压力变化，可以同时测定血小板凝集块的稳定性、强度。

就本发明的方法而言，由依赖于所使用的血小板活化试剂的种类、浓度等的血小板凝集块形成所引起的闭塞开始，可以测定凝集块的稳定性和持续性。

例如，与使用1.5μg/ml浓度的胶原蛋白的情况相比，在使用5μM浓度的ADP的情况下，压力上升开始(凝集块形成)得早，2～3分钟后压力达到恒定。另一方面，在使用1μg/ml浓度的胶原蛋白的情况下，上升开始得晚，直至5～6分钟后才可以观察到持续的压力上升。

如此使用的血小板活化试剂等，根据对其抑制的抗血小板药的不同，压力上升开始、最大压力等受到不同的影响。

图8表示根据本发明第二实施方式的血小板凝集能力测定装置。

如图8B所示，血液收纳容器1具有以下构成：具有贯通孔的第一端9，所述贯通孔作为用于插入与送液泵连结的管的连结部；用于收纳血液的血液收纳部13；盖8；具有突起部的第二端11，所述突起部用于与被连接于盖8的过滤器设备4连结。在血液收纳部的内部，将血小板活化试剂和血液混合后，盖上盖8密闭，将血液收纳容器1与过滤器设备4连接。

另外，优选在血液收纳部的内部，使血小板活化试剂和血液的混合液充满后，将血液收纳容器1与过滤器设备4连接，这样使混合液流到过滤器设备中以消除测定误差。因此，首先，也可以将血液收纳容器1的第二端与密闭容器气密连接，从血液收纳容器1向该密闭容器少量排出混合液，在使血液收纳容器1达到充满混合液的状态之后，取下该密闭容器，将血液收纳容器1连接于过滤器设备4。

另外，如图8C所示，过滤器设备4包括：具有用于插入血液收纳容器1的第二端的突起部的贯通孔12的部分、过滤器5和废液储留部6。在废液储留部6中设有空气孔7。

过滤器5以如下方式设置：在废液储留部6的与血液收纳容器1连接一侧的面覆盖相当于贯通孔12的部分，由此，从血液收纳容器1通过贯通孔12流入的血液和血小板活化试剂的混合液通过过滤器5。

如图8A所示，使用时，用于与送液泵2连结的管被插入血液收纳容器1的第一端9，设置在血液收纳容器1的盖8的外侧的第二端11的突起部被插入过滤器设备4的贯通孔12中，在血液收纳容器1内与血小板活化试剂混合的血液经送液泵2向过滤器设备4压出，通过过滤器5，储留在废液储留部6中。

由于以恒定流速通过过滤器，由血液凝集引起过滤器堵塞发生，高感度地测定由此产生的微妙的压力变化，算出2～10分钟之间的压力波形的积分值，从而能够评价血小板凝集能力。

图9表示过滤器5的构造的例子。如图9A的整体图所示，在中央部设置过滤器，使之覆盖从容器1压出的血小板活化试剂和血液的混合液通过的部分。过滤器部分的放大图如图9B所示，开孔部分的放大图如图9C所示。

图10表示根据本发明第三实施方式的血小板凝集能力测定装置。

图10A表示血液收纳容器1，图10B表示过滤器设备4。血液收纳容器1与图8B的第二实施方式的血液收纳容器不同，在第二端一侧没有盖。另一方面，过滤器设备具有端部，使过滤器设备被气密连接于血液收纳容器1的第二端。即，在血液收纳部13中血小板活化试剂和血液混合后，血液收纳容器1的第二端被直接气密连接于过滤器设备4的端部。于是，混合液流经过滤器设备4的贯通孔12通过过滤器，储留在废液储留部6中。

实施例

以下，列举具体实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并未受到这些实施例的限定。

在以下的实验中使用了按照图1制作的装置。

容器1(血液储存器)使用丙烯酸制的容量为450μl的圆柱状(内径6mm，深度16mm)容器。

过滤器使用在过滤器部的中央设置的镍制微网过滤器，所述过滤器为以30μm×30μm正方形开口(节距尺寸45μm)的、直径1mm的圆形过滤器。

实施例1

在血液储存器中添加200mM的ADP试剂(德国Dynabite社)13μl(终浓度5.6μM)后，加入在日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)中采集的血液450μl，在血液储存器内混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与ADP试剂混合1分钟后，将矿物油以流速60μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油所承受的回压。进而，采用以终浓度25nM、50nM、100nM、250nM添加了AR-C66096(血小板P2Y₁₂受体抑制剂，英国TocrisBioscience社)后的血液进行同样的测定。

图2表示各自的压力波形。

AR-C66096在使压力上升开始发生延迟的同时，浓度依赖性地抑制了压力上升。特别是，在50nM、100nM的AR-C66096存在下，绘出了山形的压力曲线。从这些结果表明，AR-C66096的存在使血小板凝集块的稳定性和持续性受到抑制。而且，如表1所示的压力下部面积受到AR-C66096的浓度依赖性地抑制。从这些结果可知，本发明的方法反映了压力上升开始的延迟、压力的稳定性的两方面，能够定量评价血小板凝集。

表1

作为对照，将同样以终浓度25nM、50nM、100nM、250nM添加了AR-C66096的血液使用阻抗式血小板凝集能力分析装置(Multiplate，Dynabite社)测定全血血小板凝集。作为血小板活化试剂使用了ADP(终浓度6.5μM)。AUC值表示于表2。其结果为未观察到浓度依赖性，特别是在高浓度的AR-C66096存在下的AUC值，难以反映高浓度的AR-C66096的效果。并且，全部的阻抗曲线为右肩高。即，考虑由于未加载血流等物理负荷，一旦粘附/凝集到电极的血小板凝集块未被破坏而得到保持，电阻则增高。

表2

实施例2

在血液储存器中添加25μg/ml(终浓度0.7μg/ml)的胶原蛋白试剂(Dynabite社制)13μl后，加入在日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)采集的血液450μl，混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与胶原蛋白试剂混合1分钟后，将矿物油以流速60μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油所承受的回压。进而，采用以终浓度100μM添加了阿司匹林的血液、或者添加了50μM阿司匹林和250μM的AR-C66096两者的血液进行同样的测定。

图3表示各自的压力波形。

阿司匹林在使压力上升开始发生延迟的同时，抑制了压力上升。并且，阿司匹林和AR-C66096的合用协同性地抑制了压力上升。

作为对照，同样采用以终浓度100μM添加了阿司匹林的血液、或者添加了50μM阿司匹林和250μM的AR-C66096两者的血液，使用阻抗式血小板凝集能力分析装置(Multiplate，Dynabite社)测定了全血血小板凝集。作为血小板活化试剂，使用了胶原蛋白(终浓度3.2μg/ml)。电阻的AUC值表示于表3。其结果观察到阿司匹林的效果，然而未观察到阿司匹林和AR-C66096的协同效果。

表3

对照	阿司匹林100μM	阿司匹林50μM+AR-C 250μM
			38	28	24

实施例3

在血液储存器中添加50μg/ml(终浓度1.4μg/ml)的胶原蛋白试剂(Dynabite社制)13μl后，加入在日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)中采集的血液450μl，混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与胶原蛋白试剂混合1分钟后，将矿物油以流速60μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油所承受的回压。反复测定5次。

图4表示各自的压力波形。5次测定显示，下部压力面积为15.11±0.8(平均±标准偏差)，变异系数为5.3％，再现性良好。

实施例4

在血液储存器中添加终浓度100mM的花生四烯酸试剂(Dynabite社制)30μl或50μl(终浓度分别为6.25mM和10mM)后，加入在日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)中采集的血液450μl，混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与花生四烯酸试剂混合1分钟后，将矿物油以流速60μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油承受的回压。进而，将以终浓度100μM添加阿司匹林后的血液与花生四烯酸试剂50μl混合后进行同样的测定。

图5表示压力波形的结果。其结果，花生四烯酸使血小板活化，压力上升，通过阿司匹林抑制了压力上升。

实施例5

在血液储存器中添加1mM的PAR1活化试剂(肽序列SLFFRN，Dynabite社制)20μl后，加入在日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)中采集的血液450μl，混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与PAR1试剂混合1分钟后，将矿物油以流速60μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油承受的回压。进而，将以终浓度100μM添加了阿司匹林后的血液进行同样的测定。

图6表示压力波形的结果。呈现出与ADP凝集较接近的压力波形。并且，PAR1活化肽引起的凝集波形未受到阿司匹林的抑制。

实施例6

在血液储存器中添加20mM的PAR4活化试剂(肽序列AYPGKF；Dynabite社制)20μl后，加入在日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)中采集的血液450μl，混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与PAR4试剂混合1分钟后，将矿物油以流速60μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油承受的回压。进而，将以终浓度100μM添加了阿司匹林后的血液进行同样的测定。

图7表示压力波形的结果。压力在1分钟内未上升，在2～3分钟之间上升，此后几乎以恒定压力持续。呈现出ADP凝集较接近的压力波形。而且，PAR4活化肽引起的凝集波形未受到阿司匹林的抑制。

以下实验中使用按照图8制作的装置。

实施例7

容器1(血液储存器)使用丙烯酸制的容量为250μl的(内径6mm，深度16mm)容器。

过滤器使用在过滤器部的中央设置的镍制微网过滤器，所述过滤器为以25μm×25μm正方形开口(节距尺寸45μm)的、直径1mm的圆形过滤器。

在血液储存器中添加ADP试剂(日本MCMedical社制)使终浓度为3μM后，加入在37℃加热后的日本泰尔茂采血管(Venoject，含有3.13％柠檬酸钠)中采集的血液240μl，在血液储存器内混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液和ADP试剂混合后30秒、60秒、90秒后，将矿物油以流速25μl/分钟注入血液储存器后，注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油承受的回压。

图11表示各自的压力波形。

从压力图形的结果可知，与ADP试剂混合后90秒后通过过滤器的样本，与30秒、1分钟后通过过滤器的情况相比，压力的上升变低。

实施例8

在血液储存器内，加入利用胶原蛋白试剂(日本MoriyaSangyo)(终浓度4μg/ml)和柠檬酸钠进行抗凝处理后的血液(240μl)，混合后，将过滤器设备和血液储存器连接。将血液与胶原蛋白试剂混合后30秒、60秒、90秒后，将矿物油以流速25μl/分钟注入血液储存器后，使血液注入过滤器设备。

使用压力传感器以1秒间隔连续5分钟监控矿物油承受的回压。

图12表示压力波形的结果。

与ADP试剂相比，经胶原蛋白活化后的血液，混合后的时间对其没有大的影响，均显示出强健的压力上升。可知，根据血小板活化试剂的不同，从混合后开始至通过过滤器的时间对压力上升的影响也不同。

符号说明

10血小板凝集能力测定装置

1血液收纳容器

2泵

3压力传感器

4过滤器设备

5过滤器

6废液储留部

7空气孔

8盖

9血液收纳容器的第一端

11血液收纳容器的第二端

12贯通孔

13血液收纳部

Claims (11)

1.血小板凝集能力和血小板凝集块的稳定性的分析方法，其中，所述方法包括以下步骤：在密闭容器内使血小板活化试剂和血液反应的步骤；利用被连接于该容器的第一端的泵，将与血液不混溶的液体注入该容器，由此将血小板活化试剂和血液的混合液从该容器的第二端压出，使该混合液通过被连接于该容器的第二端的过滤器设备的过滤器的步骤；以及测定泵承受的压力的步骤。

2.如权利要求1所述的方法，所述与血液不混溶的液体为矿物油。

3.如权利要求1所述的方法，所述血小板活化试剂为终浓度1～10μM的ADP、终浓度0.5～10μg/ml的胶原蛋白或终浓度0.2～20mM的花生四烯酸。

4.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，所述与血液不混溶的液体的注入速度为5～200μl/分钟。

5.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，所述过滤器的滤网的节距尺寸或直径为10μm～50μm。

6.如权利要求1～3中任意一项所述的方法，将所述与血液不混溶的液体注入所述容器，使所述血小板活化试剂和血液的混合液在血小板活化试剂和血液混合后20秒以上、2分钟以内到达所述过滤器。

7.用于分析血小板凝集能力和血小板凝集块的稳定性的装置，其中，所述装置包括：用于收纳血液的容器、被气密连接于该容器的第一端的泵、测定该泵承受的压力的传感器以及被气密连接于该容器的第二端的过滤器设备。

8.如权利要求7所述的装置，其中，所述用于收纳血液的容器由血液收纳部以及用于将其密封的盖形成。

9.如权利要求8所述的装置，其中，所述用于收纳血液的容器借助于所述盖与过滤器设备连接。

10.如权利要求7～9中任意一项所述的装置，其中，所述过滤器设备包括过滤器部和废液储留部。

11.如权利要求10所述的装置，其中，所述废液储留部具有空气孔。