JP6322144B2 - 血小板凝集能の総合的評価方法 - Google Patents
血小板凝集能の総合的評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6322144B2 JP6322144B2 JP2014553233A JP2014553233A JP6322144B2 JP 6322144 B2 JP6322144 B2 JP 6322144B2 JP 2014553233 A JP2014553233 A JP 2014553233A JP 2014553233 A JP2014553233 A JP 2014553233A JP 6322144 B2 JP6322144 B2 JP 6322144B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- blood
- container
- filter
- platelet
- pressure
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 title claims description 42
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 181
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 178
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 56
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 44
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 39
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 22
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 22
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 21
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 15
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 10
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 71
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 17
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 17
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 17
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 14
- ZQXUQOHLHUWLSA-WOUKDFQISA-N [[[[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-amino-2-propylsulfanylpurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl]-difluoromethyl]phosphonic acid Chemical compound C12=NC(SCCC)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)C(F)(F)P(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZQXUQOHLHUWLSA-WOUKDFQISA-N 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 12
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 238000009530 blood pressure measurement Methods 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 9
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 7
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 6
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 3
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 101000613565 Homo sapiens PRKC apoptosis WT1 regulator protein Proteins 0.000 description 2
- 101001113471 Homo sapiens Proteinase-activated receptor 4 Proteins 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108010003541 Platelet Activating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100023710 Proteinase-activated receptor 4 Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940083542 sodium Drugs 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- VULJVZXXUQIUEM-OZDPOCAXSA-N (2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[2-[[(2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]hexanoyl]amino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 VULJVZXXUQIUEM-OZDPOCAXSA-N 0.000 description 1
- HFCUBKYHMMPGBY-UHFFFAOYSA-N 2-methoxyethyl prop-2-enoate Chemical compound COCCOC(=O)C=C HFCUBKYHMMPGBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009268 Collagen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010012088 Fibrinogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 101001098529 Homo sapiens Proteinase-activated receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713169 Homo sapiens Solute carrier family 52, riboflavin transporter, member 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010044027 PAR-1-activating peptide Proteins 0.000 description 1
- 102100038394 Platelet glycoprotein VI Human genes 0.000 description 1
- 101710194982 Platelet glycoprotein VI Proteins 0.000 description 1
- 102100037136 Proteinase-activated receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010081391 Ristocetin Proteins 0.000 description 1
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 108010079670 alanyl-tyrosyl-prolyl-glycyl-lysyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N chembl1095986 Chemical compound C1[C@@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(C(=C(O)C=4)C)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@@H](C(=O)N3)[C@H](O)C=3C=CC(O4)=CC=3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1)=CC=C1OC1=C(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]5[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O5)O)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C4=CC2=C1 BGTFCAQCKWKTRL-YDEUACAXSA-N 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- -1 polydimethylsiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 description 1
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 description 1
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108091006082 receptor inhibitors Proteins 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 229950004257 ristocetin Drugs 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012780 transparent material Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N7/00—Analysing materials by measuring the pressure or volume of a gas or vapour
- G01N7/10—Analysing materials by measuring the pressure or volume of a gas or vapour by allowing diffusion of components through a porous wall and measuring a pressure or volume difference
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/4905—Determining clotting time of blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
Description
動脈における血栓形成(白色血栓)又は一次止血において血小板の活性化及び凝集は中心的機能を果たす。
血小板は血管が障害を受けた場合に、血管内皮細胞下に存在するコラーゲンに対し、直接的、非直接的に結合する。血流の緩やかな環境下(低ずり応力下)ではGPVIなどコラーゲン受容体により直接的な結合が主となり、血流の早い環境下(高ずり応力下)ではコラーゲンにvWFが結合し、vWFに対し血小板のGPIbα受容体が結合することで間接的にコラーゲンに結合する。コラーゲンとの直接的、間接的相互作用は血小板を活性化し、この刺激により濃染顆粒及びα顆粒からアデノシン二リン酸(ADP),セロトニンなど様々な血小板活性化物質が放出される。
これら放出された血小板活性化因子は自己の血小板及び周囲の血小板を活性化させる。活性化を受けた血小板はフィブリノゲン受容体であるGPIIbIIIaが活性化型に構造変化を受け、フィブリノゲンに対し高親和性型となる。2量体であるフィブリノゲンを介して活性化血小板が次々架橋を受け血小板凝集塊を形成する。
また、吸引の場合には血液と吸引用シリンジの間に存在する空気の存在により特に低流速域(100μm/分以下)において流速を一定に保つことが出来ず、また、一定流速下におけるフィルター通過による正確な圧力変化を経時的に測定することはできない。さらに、種々の濃度の血小板活性化試薬を調整し、吸引する必要があるので、手間がかかるという問題もあった。
前記血液と混ざらない液体はミネラルオイルであることが好ましい。
前記血小板活性化試薬は終濃度1〜10μMのADP、終濃度0.5〜10μg/mlのコラーゲン、または終濃度0.2〜20mMのアラキドン酸であることが好ましい。
前記血液と混ざらない液体の注入速度は5〜200μl/分であることが好ましい。5分の反応とすると25μl〜1mlの血液で足りるので、適量の血液サンプルで測定が可能である。
前記フィルターは、メッシュのピッチサイズまたは径が10μm〜50μmであることが好ましい。
また、前記血液と混ざらない液体を前記容器に注入する際には、前記血小板活性化試薬と血液の混合液が、血小板活性化試薬と血液を混合してから20秒以上2分以内に前記フィルターへ到達するようにすることが好ましい。
本発明はまた、密閉容器と、該容器の第一の端に接続されたポンプと、該ポンプにかかる圧力を測定するセンサーと、該容器の第二の端に気密に接続されたフィルターデバイスとを含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析するための装置を提供する。密閉容器は血液収容部とそれを密閉するキャップからなることが好ましく、密閉容器は該キャップを介してフィルターデバイスと接続されることが好ましく、ここで、フィルターデバイスはフィルター部と廃液貯留部を含むことが好ましく、この廃液貯留部は空気穴を有することが好ましい。
前記血液と混ざらない液体はミネラルオイルであると、血液を効率よく容器から押し出してフィルターデバイスに到達させることができるため好ましい。
前記血小板活性化試薬は終濃度が1〜10μMのADP,終濃度が0.5〜10μg/mlのコラーゲン,または終濃度が0.2〜20mMのアラキドン酸であると、血小板凝集塊が形成されやすく、圧力上昇波形が効率よく得られるため、好ましい。
前記血液と混ざらない液体の注入速度は5〜200μl/分であると、正確な送液が可能で、且つ少量の血液で一定時間測定可能であるため、好ましい。
前記フィルターのメッシュのピッチサイズまたは径が10μm〜50μmであると、血小板凝集塊による圧力上昇波形が再現性良く得られるため、好ましい。
血小板凝集能反応が開始されたのち、終了する前に迅速にフィルターを通過させることで、圧力波形の積分値には、血小板凝集塊の形成速度、安定性、持続性が総合的に反映される。
以下、図1に基づいて説明する。
フィルターデバイス4は、測定時に容器1の第二の端の開孔を有する突起部を、フィルター部に連通する開口部(貫通孔)に連結して使用することができる。
フィルターデバイス4は、例えば、円筒形の容器の内部に、円の中央にフィルターを有するフィルター部5を、フィルターの外周が密着するようにはめ込むことで作製することが可能である。これにより、フィルターを通過した血液試料を廃液として廃液貯留部6にため込むことができる。廃液貯留部6には空気穴7が開いており、これによって通気され、正確な圧力測定が可能となる。
容器1内に収容される血液は抗凝固処理されたものであることが好ましい。
ここで、抗凝固処理剤としては、クエン酸ナトリウムまたはカリウム、シュウ酸ナトリウムまたはカリウム、ACD(Acid Citrate Dextrose)、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)塩などを挙げることができる。このような抗凝固処理剤は、粉末、凍結乾燥品、水溶液などの溶液として使用することができる。これらの抗凝固処理剤のうち、一般的な3.2%クエン酸ナトリウムが容易に入手できることから好ましい。この場合、血液9容に対してこの抗凝固処理剤1容とするのが好ましい。
その他の抗凝固処理剤としてはへパリン、ヒルジン、トロンビン阻害剤、コーン由来トリプシンインヒビター(1977. J.Biol.Chem 252.8105)等の利用が可能である。なお、抗凝固処理剤は、複数用いられてもよい。
抗凝固処理された血液を得る方法としては、シリンジまたは真空採血管に予め上記の抗凝固処理剤を入れて採血を行うか、または、採血直後の血液に抗凝固処理剤を速やかに加える等の方法で抗凝固処理した血液を得ることができる。
例えば、容器1のフィルターデバイス接続側の端をゴムなどの素材でできた、針で貫通可能なキャップにしておき、シリンジで採血した血液を注入することで、予め容器1内に収容された血小板活性化試薬と反応させることができる。
しかし、この方法では異なる濃度の血小板活性化試薬の調整の必要が有り手間となる他、凝集を引き起こす濃度閾値の決定は可能であるが、形成された血小板凝集塊の安定性や持続性等は結果に反映されない。
一方、本発明では、健常人において血小板活性化が起こる濃度域の血小板活性化試薬と血液を混合後20秒以上〜2分以内(好ましくは20秒以上1分以内)以内の血液をフィルターを通過させる。圧力の上昇開始に、血小板凝集塊の形成度合(速度)が反映され、最大圧力は凝集塊の安定性が反映される。さらに、圧力の積分値には、凝集形成と形成された凝集塊の安定性の両者が反映される。
そして、フィルターを通過した血液は、廃液貯留部6に収容される。
また、2分〜10分間かけて、試料をフィルターに通過させることが望ましい。
本発明の方法によれば、低流速、例えば50μl/分で、10分フィルターを経時的に通過させた場合にも、500μlと比較的少量の全血サンプルの使用で十分である。
なお、血液容器及びフィルターはヒーターによって約37℃に加温されることが望ましい。
密閉した容器内の血小板が活性化された血液をマイクロポンプでフィルターに流入させることで、一定流速でフィルターを通過した際の、圧力変化を0.1kPa単位で正確に測定することが可能である。
また、フィルターが血小板凝集塊による目詰まりして圧力が上昇開始した後に、さらに一定時間(2〜10分程度)、血液をフィルターに一定流速で通過させ続け、その後の圧力変化を引き続き測定することで、血小板凝集塊の安定性・強度を同時に測定することが可能となる。
例えばADPを5μMの濃度で用いた場合は、コラーゲンを1.5μg/mlの濃度で用いた場合に比較し圧力上昇開始(凝集塊形成)が早いが2〜3分後には圧力が一定に達する。その一方で、コラーゲンを1μg/mlの濃度で用いた場合は、上昇開始は遅いが、5〜6分後まで持続的な圧力上昇が観察される。
このように用いる血小板活性化試薬や、それを抑制する抗血小板薬によって、圧力上昇開始、最大圧力等が異なる影響を受ける。
図8Bに示すように、血液収容容器1は、送液ポンプと連結するための管を挿入するための連結部となる貫通孔を有する第一の端9と、血液を収容するための血液収容部13と、キャップ8と、キャップ8に接続されてフィルターデバイス4と連結するための突起部を有する第二の端11からなる。血液収容部内部で血小板活性化試薬と血液とを混合したのち、キャップ8をつけて密閉し、血液収容容器1とフィルターデバイス4を接続する。
なお、血液収容部内部に血小板活性化試薬と血液との混合液を充満させたのちに、血液収容容器1とフィルターデバイス4を接続して、混合液をフィルターデバイスに流すことが測定誤差をなくすためには好ましい。そのために、まず、血液収容容器1の第二の端に気密に密閉容器を接続し、血液収容容器1から該密閉容器に混合液を少し排出させて、血液収容容器1に混合液が充満した状態にさせたのち、この密閉容器を外し、血液収容容器1をフィルターデバイス4に接続してもよい。
フィルター5は、廃液貯留部6の、血液収容容器1に接続される側の面の、貫通孔12に該当する部分を覆うように設置されており、これにより、血液収容容器1から貫通孔12を通って流れてきた血液と血小板活性化試薬の混合液がフィルター5を通過する。
一定の流速でフィルターを通過させることで血液凝集によってフィルター目詰まりは発生し、それによって生じる微妙な圧力変化を感度良く測定し、2〜10分間の圧力波形の積分値を算出することで、血小板凝集能を評価することができる。
図10Aが血液収容容器1を、図10Bがフィルターデバイス4を示す。血液収容容器1は、図8Bの第二の態様の血液収容容器とは異なり、第二の端側にキャップを有しない。一方、フィルターデバイスは、血液収容容器1の第二の端に気密に接続されるような端を有する。すなわち、血液収容部13で血小板活性化試薬と血液が混合されたのち、血液収容容器1の第二の端は、フィルターデバイス4の端に直接、気密に接続される。そして、混合液はフィルターデバイス4の貫通孔12を通ってフィルターを通過し、廃液貯留部6に貯留される。
容器1(血液リザーバー)はアクリル製の内容量450μlの円柱状(内径6mm、深さ16mm)のものを用いた。
フィルターはニッケル製マイクロメッシュフィルター 30μm×30μm角型開口(ピッチサイズ45μm)で直径1mm、の円形のフィルターをフィルター部の中央に配置して用いた。
血液リザーバーに200mMのADP 試薬(Dynabite社;ドイツ)13μl(終濃度5.6μM)を添加した後、テルモ採血管(ベノジェクト 3.13%クエン酸ナトリウム含有)に採血した血液450μlを加えて血液リザーバー内で混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とADP試薬を混合した1分後に、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、AR-C66096(血小板P2Y12受容体阻害剤;Tocris Bioscience社;イギリス)を終濃度25,50,100,250nM添加した血液を用い同様の測定を行った。
AR-C66096は圧力上昇開始を遅延すると共に、濃度依存的に圧力上昇を抑制した。特に、50nM, 100nMのAR-C66096存在下においては、山なりの圧力曲線を描いた。これらの結果より、AR-C66096の存在により血小板凝集塊の安定性と持続性が抑制されたことが示される。また、表1に示すように圧力下部面積がAR-C66096の濃度依存的に抑制された。これらの結果から、本発明の方法は圧力上昇開始の遅延、圧力の安定性の双方を反映しており、定量的な血小板凝集の評価ができることが分かる。
血液リザーバーに25μg/ml(終濃度0.7μg/ml)のコラーゲン試薬(Dynabite社製)13μlを添加した後、テルモ採血管(ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有)に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μM、またはアスピリン50μMとAR-C66096 250μMの両方を添加した血液を用い同様の測定を行った。
アスピリンは圧力上昇開始を遅延すると共に、圧力上昇を抑制した。また、アスピリンとAR−C66096の併用で相乗的に圧力上昇を抑制した。
血液リザーバーに50μg/ml(終濃度1.4μg/ml)のコラーゲン試薬(Dynabite社製)13μlを添加した後、テルモ採血管(ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有)に採血した血液450μlを加え混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。繰り返し5回測定を行った。
それぞれの圧力波形を図4に示す。5回の測定による下部圧力面積は15.11±0.8(平均±SD)でCV値は5.3%と良好な再現性を示した。
血液リザーバーに100mMのアラキドン酸試薬(Dynabite社製)30または50μl(それぞれ終濃度6.25mMおよび10mM) 終濃度、を添加した後、テルモ採血管(ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有)に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μMで添加した血液をアラキドン酸試薬50μlと混合し同様の測定を行った。
圧力波形結果を図5に示す。その結果、アラキドン酸によって血小板が活性化されて圧力が上昇したが、アスピリンによって圧力上昇は抑制された。
血液リザーバーに1mMのPAR1活性化試薬(ペプチド配列SLFFRN;Dynabite社製)20μlを添加した後、テルモ採血管(ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有)に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μMで添加した血液を用い同様の測定を行った。
圧力波形結果を図6に示す。ADP凝集に比較的近い、圧力波形となった。また。PAR1活性化ペプチドによる凝集波形はアスピリンの阻害を受けなかった。
血液リザーバーに20mMのPAR4活性化試薬(ペプチド配列AYPGKF;Dynabite社製)20μlを添加した後、テルモ採血管(ベネジェクト3.13%クエン酸ナトリウム含有)に採血した血液450μlを加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した1分後、ミネラルオイルを流速60μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。さらに、アスピリンを終濃度100μMで添加した血液を用い同様の測定を行った。
圧力波形結果を図7に示す。圧力上昇は1分以内におき、2〜3分の間に上昇し、その後ほぼ一定圧を持続した。ADP凝集に比較的近い、圧力波形となった。また。PAR4活性化ペプチドによる凝集波形はアスピリンの阻害を受けなかった。
容器1(血液リザーバー)はアクリル製の内容量250μlの(内径6mm、深さ16mm)のものを用いた。
フィルターはニッケル製マイクロメッシュフィルター 25μm×25μm角型開口(ピッチサイズ45μm)で直径1mmの円形のフィルターをフィルター部の中央に配置して用いた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。
それぞれの圧力波形を図11に示す。
圧力パターンの結果より、ADP試薬混合後90秒後にフィルターを通過させた検体では、30秒、1分後にフィルターを通過させた場合に比べ圧力上昇が低下することが分かる。
血液リザーバー内でコラーゲン試薬(モリヤ産業)(終濃度4μg/ml)とクエン酸ナトリウムによって抗凝固処理した血液(240μl)を加えて混合した後、フィルターデバイスと血液リザーバーを接続した。血液とコラーゲン試薬を混合した30,60,90秒後、ミネラルオイルを流速25μl/分で血液リザーバーに注入し、血液をフィルターデバイスに注入させた。
ミネラルオイルにかかるバックプレッシャーを圧力センサーによって、1秒間隔で5分間連続的にモニタリングした。
圧力波形結果を図12に示す。
コラーゲンによって活性化した血液は、ADP試薬と比べて混合後の時間に大きな影響を受けず、堅調な圧力上昇を示した。血小板活性化試薬によって、混合後フィルターを通過させるまでの時間の影響が異なることが分かる。
Claims (10)
- 密閉された容器内で血小板活性化試薬と血液を反応させる工程、該容器の第一の端に接続されたポンプによって血液と混ざらない液体を該容器に注入することにより、血小板活性化試薬と血液の混合液を該容器の第二の端から押し出して、該容器の第二の端に接続されたフィルターデバイスのフィルターを通過させる工程、およびポンプにかかる圧力を測定する工程を含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析する方法であって、前記フィルターはメッシュ状であり、メッシュのピッチサイズまたは径が10μm〜50μmであり、フィルターの厚みは、10〜100μmである、前記方法。
- 血液と混ざらない液体がミネラルオイルである、請求項1に記載の方法。
- 前記血小板活性化試薬が終濃度1〜10μMのADP、終濃度0.5〜10μg/mlのコラーゲン、または終濃度0.2〜20mMのアラキドン酸である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記血液と混ざらない液体の注入速度が5〜200μl/分である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血小板活性化試薬と血液の混合液が、血小板活性化試薬と血液を混合してから20秒以上2分以内に前記フィルターへ到達するように、前記血液と混ざらない液体を前記容器に注入する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 血液を収容するための容器と、該容器の第一の端に気密に接続されたポンプと、該ポンプにかかる圧力を測定するセンサーと、該容器の第二の端に気密に接続されたフィルターデバイスとを含む、血小板凝集能及び血小板凝集塊の安定性を解析する為の装置であって、前記フィルターデバイスはメッシュ状フィルターを含み、メッシュのピッチサイズまたは径が10μm〜50μmであり、フィルターの厚みは、10〜100μmである、前記装置
- 血液を収容するための容器は、血液収容部とそれを密閉するキャップからなる、請求項6に記載の装置。
- 血液を収容するための容器は、前記キャップを介してフィルターデバイスと接続される、請求項7に記載の装置。
- 該フィルターデバイスは、フィルター部と廃液貯留部を含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の装置。
- 前記廃液貯留部が空気穴を有する、請求項9に記載の装置。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012278452 | 2012-12-20 | ||
JP2012278452 | 2012-12-20 | ||
PCT/JP2013/084369 WO2014098242A1 (ja) | 2012-12-20 | 2013-12-20 | 血小板凝集能の総合的評価方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2014098242A1 JPWO2014098242A1 (ja) | 2017-01-12 |
JP6322144B2 true JP6322144B2 (ja) | 2018-05-09 |
Family
ID=50978555
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014553233A Active JP6322144B2 (ja) | 2012-12-20 | 2013-12-20 | 血小板凝集能の総合的評価方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150338330A1 (ja) |
EP (1) | EP2937699A4 (ja) |
JP (1) | JP6322144B2 (ja) |
CN (1) | CN104871005B (ja) |
AU (1) | AU2013364840B2 (ja) |
CA (1) | CA2895693C (ja) |
WO (1) | WO2014098242A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6750443B2 (ja) | 2016-10-05 | 2020-09-02 | ソニー株式会社 | 血小板凝集能解析方法、血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析用プログラム及び血小板凝集能解析システム |
JP6973585B2 (ja) * | 2016-10-05 | 2021-12-01 | ソニーグループ株式会社 | 血小板凝集能解析方法、血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析用プログラム及び血小板凝集能解析システム |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL7303522A (ja) * | 1973-03-13 | 1974-09-17 | ||
JPS57552A (en) * | 1980-06-03 | 1982-01-05 | Kowa Co | Method for measuring agglutination power of blood platelet and kit for measuring agglutination power of bood platelet |
US4828543A (en) * | 1986-04-03 | 1989-05-09 | Weiss Paul I | Extracorporeal circulation apparatus |
JPH0810226B2 (ja) | 1989-06-01 | 1996-01-31 | Ssrエンジニアリング株式会社 | 血小板凝集能判定方法及び装置並びに凝集能判定具 |
CN2123078U (zh) * | 1992-05-16 | 1992-11-25 | 中国医学科学院血液学研究所 | 血小板聚集动态图象分析仪 |
CN1064706C (zh) * | 1993-12-29 | 2001-04-18 | 博士伦有限公司 | 用于接触镜片清洗和杀菌的糖类组合物及使用方法 |
JPH1090254A (ja) * | 1996-09-18 | 1998-04-10 | Godai Enbodei Kk | 血液検査装置 |
US20010044584A1 (en) * | 1997-08-28 | 2001-11-22 | Kensey Kenneth R. | In vivo delivery methods and compositions |
EP1369128A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-10 | Procorde GmbH | Inhibitors of glycoprotein VI and their therapeutic use |
AU2003267147A1 (en) * | 2002-09-10 | 2004-04-30 | Placor, Inc. | Method and device for monitoring platelet function |
US7393690B2 (en) * | 2003-05-06 | 2008-07-01 | Thrombodyne, Inc. | Systems and methods for measuring fluid properties |
JP2005291849A (ja) | 2004-03-31 | 2005-10-20 | Isk Kk | 全血血小板凝集能測定方法、その装置、及び吸引ノズル |
JP4621942B2 (ja) * | 2004-12-14 | 2011-02-02 | 国立大学法人 東京大学 | レーザ加熱による液体膨張圧を用いたマイクロインジェクション法 |
JP2006300859A (ja) | 2005-04-25 | 2006-11-02 | Ssr Engineering Co Ltd | 全血血小板凝集能測定方法及び装置並びに薬効評価方法 |
US7205115B2 (en) * | 2005-04-28 | 2007-04-17 | Accumetrics, Inc. | Method and system for stabilization of arachidonic acid for use in platelet function assay |
CN101292161B (zh) * | 2005-10-18 | 2012-11-28 | 藤森工业株式会社 | 监测血栓形成的装置和监测血栓形成的方法 |
CN101360678B (zh) * | 2005-12-05 | 2013-01-02 | 恩特格里公司 | 用于泵的误差容积系统和方法 |
CA2733361C (en) * | 2008-08-11 | 2017-08-29 | Fujimori Kogyo Co., Ltd. | Blood-platelet test method and blood-platelet test device |
WO2011099569A1 (ja) * | 2010-02-10 | 2011-08-18 | 藤森工業株式会社 | 血小板検査用マイクロチップ及びそれを用いた血小板検査装置 |
-
2013
- 2013-12-20 JP JP2014553233A patent/JP6322144B2/ja active Active
- 2013-12-20 CN CN201380065229.7A patent/CN104871005B/zh active Active
- 2013-12-20 EP EP13865542.8A patent/EP2937699A4/en not_active Withdrawn
- 2013-12-20 CA CA2895693A patent/CA2895693C/en active Active
- 2013-12-20 WO PCT/JP2013/084369 patent/WO2014098242A1/ja active Application Filing
- 2013-12-20 AU AU2013364840A patent/AU2013364840B2/en active Active
- 2013-12-20 US US14/652,866 patent/US20150338330A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2937699A1 (en) | 2015-10-28 |
AU2013364840A1 (en) | 2015-07-09 |
AU2013364840B2 (en) | 2017-03-16 |
JPWO2014098242A1 (ja) | 2017-01-12 |
US20150338330A1 (en) | 2015-11-26 |
CN104871005B (zh) | 2016-07-06 |
WO2014098242A1 (ja) | 2014-06-26 |
CA2895693C (en) | 2017-02-28 |
EP2937699A4 (en) | 2016-08-24 |
CN104871005A (zh) | 2015-08-26 |
CA2895693A1 (en) | 2014-06-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2543652C2 (ru) | Способ тестирования тромбоцитов и устройство для тестирования тромбоцитов | |
JP5937612B2 (ja) | 血液安定剤を含む採血用デバイス | |
US8796031B2 (en) | Microchip for platelet examination and platelet examination device using same | |
WO2007046450A1 (ja) | 血栓観測装置および血栓観測方法 | |
KR20110025819A (ko) | 폐쇄된 용기 시료 채취 시스템을 위한 허브에 꽂힌 이중 캐뉼러 기기 | |
JP6407255B2 (ja) | 血液凝固を分析する装置及び方法 | |
US10234469B2 (en) | Blood state analysis device, blood state analysis system, blood state analysis method, and storage device | |
JP6322144B2 (ja) | 血小板凝集能の総合的評価方法 | |
JP6596768B2 (ja) | 血液性状検査用マイクロチップおよび血液性状検査用装置 | |
Ho et al. | Platelet function testing in uraemic patients | |
JP5860736B2 (ja) | 血小板機能を決定するための装置及び方法 | |
Seo et al. | Measurement of platelet aggregation functions using whole blood migration ratio in a microfluidic chip | |
Roche et al. | Just scratching the surface: varied coagulation effects of polymer containers on TEG variables | |
JP7230429B2 (ja) | 血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析方法及び血小板凝集能解析システム | |
Murthy et al. | Electrical resistance during blood coagulation-A pilot study. | |
JP2014122836A (ja) | 血小板機能を測定するシステムにおいて測定結果を標準化する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161026 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171227 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180313 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180406 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6322144 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |