JP7230429B2 - 血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析方法及び血小板凝集能解析システム - Google Patents

血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析方法及び血小板凝集能解析システム Download PDF

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Description

本技術は、血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析方法及び血小板凝集能解析システムに関する。
従来行われている抗凝固療法や抗血小板療法は、血栓症予防に欠くことのできない治療法であり、その有用性は大規模な臨床試験により示されている。しかし、抗血小板療法が動脈血栓症を低減する効果は、抗凝固療法の脳梗塞低減効果よりも低い。これは、抗凝固療法においては、プロトロンビン時間国際標準比（ＰＴ－ＩＮＲ）やトロンボテストにより患者ごとに薬効が適切にモニタリングされている一方で、抗血小板薬の感受性や効果の持続にはかなりの個体差があることが報告されているにも関わらず、抗血小板療法におけるモニタリング方法が確立していないことが原因の一つとして考えられる。したがって、抗血小板療法においても、分かりやすい方法で薬効が適切にモニタリングできれば、各症例における薬品の適正な使用方法を探る手段となり、治療効果の向上が期待できる。
血小板の最も基本的な機能は、粘着と凝集である。血小板同士の付着状態を判定する血小板凝集能は、この基本的な現象を定量的に測定する方法として最も普及しており、その検査法には、（１）透過度法、（２）インピーダンス法、（３）粒子算定法等がある。これらの検査法に用いる凝集惹起物質の種類・濃度によって、血小検機能低下及び亢進の詳細を知ることが可能である。特に、日常検査として一般的なのは透過度法である。
前記（１）の透過度法は、血小板刺激物質を加え、多血小板血漿（ＰＲＰ）中の血小板凝集に伴い、多血小板血漿の透明度が上昇することを利用して経時的に血小板凝集を定量化する方法であるが、その問題点として、以下の（ｉ）～（ｉｖ）等が知られている。
（ｉ）血漿の分離が必須のため、測定までの検体処理が複雑で、遠沈条件によって得られるＰＲＰの量はそれぞれ異なり、血小板の回収率も一定でない。また、ＰＲＰ分離操作の際に、密度の高い血小板は赤血球と共に沈殿し、それらの凝集態度は観察できない。
（ｉｉ）血小板凝集の強さ（凝集率）は、ＰＲＰ中の血小板数にある程度依存するので、血小板数が１０万／μＬ以下の場合には、凝集前後の吸光度の差が小さく、僅かな変化は検出できない。
（ｉｉｉ）全血及び乳糜血漿など混濁した血漿を用いての検査は不可能である。
（ｉｖ）血小板凝集塊の形成と光透過性の相関が悪い。
前記（２）のインピーダンス法は、血小板の凝集を電極間の電気抵抗の変化として検出する方法であり、全血中の血小板の凝集能を観察でき、遠沈操作が無いため全ての血小板の凝集態度を観察出来るが、その問題点として、以下の（ｖ）、（ｖｉ）等が知られている。
（ｖ）電気抵抗の初期の減少は電極間の赤血球の存在に由来し、血小板凝集の初期状態の判定が困難である。
（ｖｉ）透過度法と比較して、凝集パターンは安定でない。
前記（３）の粒子算定法は、血小板凝集塊、又は凝集塊の形成に関与しない単一血小板の数をコールターカウンターで算定し、凝集の程度を知る方法であるが、その問題点として、以下の（ｖｉｉ）～（ｉｘ）等が知られている。
（ｖｉｉ）手技が煩雑である。
（ｖｉｉｉ）継時的変化を記録できない。
（ｉｘ）凝集惹起物質による血小板溶解を単一血小板の減少と誤って算定される。
ところで、血液凝固系解析においては、近年、血液凝固測定を簡便且つ正確に評価することができる手法として、血液凝固過程の誘電率の測定を行う方法が考案された（特許文献１）。この手法は、一対の電極からなるコンデンサー状の試料部に血液を充填し、それに交番電圧を印加して血液の凝固過程に伴う誘電率の変化を測定する方法である。ここで、血液検体は、クエン酸を抗凝固剤として用いて静脈から採血されたものであり、測定開始直前に塩化カルシウム水溶液を添加することでクエン酸の抗凝固作用を解除して血液凝固反応を進行させる。こうして得られたデータを所定のアルゴリズムに従って解析することで、血液凝固時間等、血液凝固に係る各種パラメーターを得ることができる。
前記誘電率測定による血液凝固系解析系装置は、血小板が凝固に与える影響に関する情報を取得することもできる。例えば、血小板を活性化或いは不活化する物質を血液に添加することにより該血液の凝固過程で測定される複素誘電率スペクトルに生じる変化に基づいて、前記血液の凝固能に関する情報を取得する血液凝固系解析を行うことができる（特許文献２）。この血液凝固系解析方法では、前記物質に血小板活性化物質を用いた場合には、該物質による血小板活性化に伴って前記複素誘電率スペクトルに生じる変化に基づき、血液中に不活性な状態で含まれる血小板の凝固能に関する情報を取得することができる。また、前記物質に血小板不活化物質を用いた場合には、該物質による血小板不活化に伴って前記複素誘電率スペクトルに生じる変化に基づき、血液中に活性な状態で含まれる血小板の凝固に関する情報を取得することができる。
一方で、プロトロンビン時間国際標準比（ＰＴ－ＩＮＲ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）等の従来の血液凝固能検査では、実質的には抗凝固薬の過剰投与による血液凝固能の低下に伴う出血リスクしか評価できず、血液凝固能の亢進に伴う血栓リスクの評価はできない。また、多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いた既存の血小板凝集能検査は、遠心分離手順が必須となり、該手順中に血小板が活性化してしまうことにより正確な検査結果が得られず、操作も煩雑である。
また、従来の血液凝固能検査では、以下の（ｘ）、（ｘｉ）等の問題点がある。
（ｘ）正常な凝固能を有するサンプル（全血）を用いて、予め基準となる血液凝固時間の短縮幅Δｔｓ（基準値）を設定する必要がある。
（ｘｉ）凝固反応を進行させる際、加速試薬を添加していないため測定時間が長い（加速試薬を添加すると、血小板機能による差が見えなくなる）。
特開２０１０－１８１４００号公報 特開２０１２－１９４０８７号公報 国際公開第２０１５／１５９６２３号パンフレット
そこで、本技術では、血小板の凝集能を測定する際の新たな技術を提供することを主目的とする。
すなわち、本技術では、まず、血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、を含み、前記血液凝固系解析部において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする、血小板凝集能解析装置を提供する。
本技術では、前記凝固過程の測定データは、電気的特性の測定データであるものとすることができる。この場合、前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料に一定の周波数を有する交流電場をかけたインピーダンス、或いは前記血小板含有試料の複素誘電率とすることができる。
また、本技術では、前記凝固過程の測定データが前記血小板含有試料の複素誘電率である場合、前記血液凝固系解析部において、前記複素誘電率のスペクトル変化における特徴量を用いることができる。この場合、前記特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量及び／又は勾配特徴量であってもよく、前記勾配特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量に基づいて抽出されるものであってもよい。また、この場合、前記特徴量は、１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ未満の低周波数で複素誘電率の極大値を与える時間ＣＴ０、低周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ１、低周波数での最大勾配ＣＦＲ、ＣＴ１以降で傾きの絶対値がＣＦＲの所定割合になった際の時間ＣＴ４、低周波数での誘電率極大値と誘電率最小値との差又はそれに準じた値を誘電率極大値又は測定開始時の初期値で除して規格化しこれに定数を乗じることで得られる値ＤＳＣ、３～３０ＭＨｚの高周波数で複素誘電率の極小値を与える時間ＣＴ、ＣＴから任意の時刻までの誘電率増加量、高周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ３、高周波数での最大勾配ＣＦＲ２、ＣＴ以降ＣＴ３以前でＣＴ３からＣＦＲ２の傾きで直線を引いた時に複素誘電率の最小値を与える時間ＣＴ２、及びＣＴ３以降で傾きの絶対値がＣＦＲ２の所定割合になった際の時間ＣＴ５からなる群より選ばれるいずれか１つ以上であるものとすることができる。
更に、本技術では、前記凝固過程の測定データが前記血小板含有試料の複素誘電率である場合、各血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量に基づいて、血小板の活性化残余率ＡＲ（％）を算出することができる。この場合、前記活性化残余率ＡＲ（％）は、下記式(１)により算出されてもよい。
Figure 0007230429000001
 αｄｂｃｍ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍａｘ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍｉｎ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
加えて、本技術では、前記血小板凝集阻害物質は、サイトカラシンＤ、サイトファイシンＣ、ラトランクリンＡ、及びケトグロボシンＡからなる群より選ばれるいずれか１種以上であるものとすることができる。
また、本技術では、前記血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料には、ＮａＣｌ及び／又は塩化カルシウムが添加されているものとすることができる。
更に、本技術では、前記血小板含有試料は、全血であるものとすることができる。この場合、前記全血は、抗血小板薬を投与された被験者から採取されたものであってもよい。
加えて、本技術に係る血小板凝集能解析装置は、前記血液凝固系解析部の解析結果に基づいて抗血小板薬の奏功性に関する情報を出力する薬剤奏功性出力部を更に有していてもよい。この場合、前記抗血小板薬の奏功性に関する情報に基づいて前記抗血小板薬の投与量に関する情報を出力する薬剤投与量出力部を更に有していてもよい。
また、本技術に係る血小板凝集能解析装置は、各血小板含有試料を保持する生体試料保持部を更に有していてもよく、或いは、各血小板含有試料の凝固過程を測定する測定部を更に有していてもよい。
また、本技術では、血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析工程と、前記血液凝固系解析工程における解析の結果の出力を制御する出力制御工程と、を含み、前記血液凝固系解析工程において、更に、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする、血小板凝集能解析方法も提供する。
更に、本技術では、血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、を含み、前記血液凝固系解析部において、更に、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする、血小板凝集能解析装置と、前記血小板凝集能解析装置による解析の結果を表示する表示装置と、を備える、血小板凝集能解析システムも提供する。
本技術において、「複素誘電率」の用語は、複素誘電率に等価な電気量をも包含する。複素誘電率に等価な電気量としては、複素インピーダンス、複素アドミッタンス、複素キャパシタンス、複素コンダクタンスなどがあり、これらは単純な電気量変換によって相互に変換可能である。また、「複素誘電率」の測定には、実数部のみ、或いは虚数部のみの測定も含まれる。また、本技術において、「血小板含有試料」とは、血小板を含む試料であればよく、血液自体に限定されるものではない。より具体的には、例えば、全血、血漿、又はこれらの希釈液及び／又は薬剤添加物等の血液成分を含有する液体試料等が挙げられる。
血小板凝集能解析システムの概念の一例を模式的に示す模式概念図である。 血小板凝集能解析装置の概念の一例を模式的に示す模式概念図である。 血小板凝集能解析装置による測定フローチャートの一例を示す図である。 血液凝固系解析部による解析フローチャートの一例を示す図である。 複素誘電率のスペクトル（三次元）の測定例を説明する図面代用グラフである。 複素誘電率のスペクトル（二次元）の測定例を説明する図面代用グラフである。 複素誘電率のスペクトルから抽出される特徴量の例を説明する図面代用グラフである。 投薬前（抗血小板薬服用なし）の血液サンプルの測定後の波形の一例を示す図面代用グラフである。 投薬後（プラスグレル服用後）の血液サンプルの測定後の波形の一例を示す図面代用グラフである。 方法１～３でスケーリングしたＤＢＣＭの結果とＭｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるＡＤＰｔｅｓｔのＡＵＣ（Ｕ）との散布図を示す図面代用グラフである。 活性化残余率ＡＲ３（％）とＭｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるＡＤＰｔｅｓｔのＡＵＣ（Ｕ）との散布図を示す図面代用グラフである。 ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ終濃度と活性化残余率ＡＲ３（％）との関係を示す図面代用グラフである。
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。
以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。

１．血小板凝集能解析システム２０００
２．血小板凝集能解析装置１０００
（１）装置の全体構成
（２）装置の動作の具体例
（３）解析の具体例
（４）その他
３．血小板凝集能解析方法
１．血小板凝集能解析システム２０００
図１は、血小板凝集能解析システム２０００の概念の一例を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る血小板凝集能解析システム２０００は、血小板凝集能解析装置１０００と、表示装置１０１０と、を備える。血小板凝集能解析装置１０００は、血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、を含み、前記血液凝固系解析部において、更に、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする。また、表示装置１０１０は、血小板凝集能解析装置１０００による解析の結果を表示する。
血小板凝集能解析装置１０００は、測定データから血小板凝集能の解析を行うプログラムを備えたコンピュータ等を含む構成であってもよく、表示装置１０１０は、コンピュータに備え付けられたディスプレイ等であってもよい。
また、血小板凝集能解析装置１０００は、血小板含有試料の血小板凝集能だけでなく、他の血液凝固系測定項目も解析できるようにしてもよい。他の血液凝固系測定項目としては、例えば、血液の凝固（凝血）、フィブリン形成、フィブリン塊形成、血餅形成、赤血球の連銭形成、血液の凝集、赤血球の沈降（赤沈）、血餅収縮（退縮）、溶血、フィブリノリジス等が挙げられる。これらの項目の解析の際には、例えば、コンピュータに備えられた血小板凝集能を行うプログラムに代えて、これらの項目解析用プログラムを用いることができる。
表示装置１０１０は、警告部を含んでもよい。警告部は、例えば、各血小板含有試料の状態変化における正常値の範囲を予め設定しておき、試料の分析結果が正常値の範囲外であったときに警告を発するように構成されていてもよい。警告の方法は特に限定されず、例えば、ディスプレイ表示や音声により警告することができる。
２．血小板凝集能解析装置１０００
（１）装置の全体構成
図２は、血小板凝集能解析装置１０００の概念の一例を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る血液凝固系解析装置１０００は、血液凝固系解析部１１と、出力制御部１２と、を少なくとも含む。更に詳細には、血液凝固系解析部１１及び出力制御部１２に加え、主要部として、生体試料保持部１、生体試料供給部２、薬剤供給部３、温度制御部４、時間制御部５、撹拌機構６、駆動機構７、測定部８、測定条件制御部９、精度管理部１０、記憶部１３も含む。また、必要に応じて、更に、薬剤奏功性出力部１４や薬剤投与量出力部１５等を含んでいてもよい。
生体試料保持部１は、生体試料供給部２から供給された各血小板含有試料を保持する。解析対象となる血小板含有試料は特に限定されないが、ヒトや哺乳動物由来の血液（全血）、血漿、及び人工血液、或いはこれらに一定の割合で生理食塩水、緩衝液等を加えて希釈したもの等を用いることができる。また、抗血小板薬が投与された被験者から採取された血小板含有試料であってもよい。また、血小板含有試料の供給方法は特に限定されず、シリンジから供給したり、サンプルカートリッジに血小板含有試料を入れて血小板凝集能解析装置１０００にセットしたり、被験者からチューブを介して直接、血小板凝集能解析装置１０００に供給したりすることができる。
生体試料保持部１は、生体試料供給部２から送られた血小板含有試料を一定の温度、状態に維持するように構成されていてもよい。この場合、生体試料保持部１は、例えば、血小板含有試料の温度を維持する温度制御部４、血小板含有試料の待機時間を制御する時間制御部５を備え、好ましくは撹拌機構６、駆動機構７を更に備える。
より具体的には、生体試料保持部１では、薬剤供給部３から供給された各種薬剤と血小板含有試料との撹拌を行う。ここで、撹拌機構６は、生体試料保持部１に供給された血小板含有試料及び各種薬剤を撹拌するように作動する。撹拌方法は特に限定されず、例えば、電動ピペットによる撹拌、撹拌子による撹拌、撹拌機能内蔵の装置等を用いて行うことができる。なお、撹拌温度は、例えば、３７℃とすることができる。また、撹拌速度や撹拌強度も特に限定されないが、撹拌方法や試薬の種類によって予め検討しておくことが好ましい。撹拌方法も特に限定されないが、例えば、ピペットでの吸引・吐出、撹拌子の使用等が挙げられる。撹拌時間も特に限定されず、例えば、２～５分とすることができる。なお、撹拌方法や試薬の種類によって短縮又は延長する。
薬剤供給部３から供給される各種薬剤は特に限定されないが、例えば、血小板惹起物質、血小板凝集阻害物質、ＮａＣｌ、カルシウム塩等であり、これら２種以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらの試薬の添加濃度は、測定に応じて、適宜設定することができる。
供給する血小板惹起物質は特に限定されないが、例えば、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、カルシウムイオン、トロンビン、トロンボキサンＡ２、トロンビン受容体活性化タンパク質（ＴＲＡＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸（ＡＡ）、セロトニン、アドレナリン、ノルアドレナリン等が挙げられ、本技術では、これら２種以上を組み合わせて用いてもよい。
供給する血小板凝集阻害物質は特に限定されないが、サイトカラシンＤ（ＣｙＤ）、サイトファイシンＣ（ＳｃｙｔｏｐｈｙｃｉｎＣ）、ラトランクリンＡ（ＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＡ）、ケトグロボシンＡ（ＣｈａｅｔｏｇｌｏｂｏｓｉｎＡ）等が挙げられ、本技術では、これら２種以上を組み合わせて用いてもよい。
なお、本技術において、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウム等）は、含まれるカルシウムイオンにより、採血時に血液検体に加えられたクエン酸による抗凝固作用を解くための物質として用いることができる。このカルシウム塩は、他の試薬と同時に血小板含有試料に添加してもよい。
温度制御部４と時間制御部５は、生体試料保持部１内の条件を制御する。例えば、温度制御部４は、血小板含有試料が一定の温度に保たれるように制御し、時間制御部５は、血小板含有試料が生体試料保持部１に保持される時間や撹拌機構６により撹拌される時間等を制御する。なお、駆動機構７は、温度制御部４や撹拌機構６の駆動動作、血小板含有試料の送液等の生体試料保持部１に関わる動作を行う。
測定部８は、各種薬剤が添加され、撹拌した後、各血小板含有試料の凝固過程を測定する。具体的には、測定部８は、例えば、電気的特性を測定する。電気的特性としては、例えば、血小板含有試料に一定の周波数を有する交流電場をかけたインピーダンス、複素誘電率、アドミッタンス、キャパシタンス、コンダクタンス、導電率、位相角等を挙げることができるが、本技術では、これらの中でも特に、インピーダンス又は複素誘電率を用いることが好ましく、複素誘電率を用いることがより好ましい。
また、本技術では、測定部８にはレオメーターを用いてもよい。レオメーターとしては、例えば、ローテーショントロンボエラストメトリー、トロンボエラストグラフィー、レオロックス（ＲｅｏＲｏｘ（登録商標））がある。また、市販の装置として、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））血液凝固分析装置（ヘモネティクス社）、ローテーショントロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））、血液凝固分析装置（ＴＥＭｇｒｏｕｐ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等が挙げられる。
測定条件制御部９は、測定方法に適した温度条件や測定時間条件に設定し調節する。また、測定条件制御部９は、測定部８での誘電率測定の際に、測定に用いる周波数や測定の間隔等をコントロールする。
精度管理部１０は、測定部８における測定間差やバックグラウンドの変動等が生じないようにデータを管理すること、装置の各部の状態を監視すること等を行う。なお、本技術では、測定部８の前に、凝集した血小板を回収するフィルター等を備えた血小板回収部を備えることもできる。
血液凝固系解析部１１は、血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する。具体的には、（ｉ）前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ、及び、(ｉｉ)前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データ、に基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析する。
ここで、従来、血小板の止血能は、主にトロンビン存在下で発揮されるので包括的な血小板機能が重要であると考えられている一方で、病的血栓を予防する上で実施される抗血小板療法の評価には血小板活性化経路別のアッセイが必要であると考えられていた。そのため、抗血小板療法の際のポイントとしては、十分な薬効を確保しつつ出血リスクを抑えることであり、検査に基づく個別化されたコントロールが重要視される。
これに対し、従来は、上記特許文献２の実施例に示すように、血小板含有試料に対して血小板惹起物質（血小板活性化剤）を添加することによって起こる変化を観測することで、血小板凝集能を解析する手法がある。しかし、既存の血小板惹起物質では、完全に血小板を凝集させることができないため、解析精度が低下してしまうという問題があった。例えば、血小板惹起物質の一つであるＴＲＡＰは、トロンビンの機能を完全に模擬することが不可能であり、トロンビンのメインの経路に対してしかシグナルが入らない。また、トロンビンを用いるとなると、血小板の凝集のみならず血液の凝固までも一緒に起きてしまうため、これを試薬として用いることができなかった。
このような問題に対し、本技術では、血小板凝集能阻害物質を添加することによって血小板の機能を完全に阻害した状態を作り出し、この状態のデータ（上記（ｉ）の測定データ）と、上記（ｉｉ）の測定データとをコントロールのデータとして用いることで、血小板凝集能の解析精度を向上させることを実現した。
本技術を用いることで、後述する実施例にも示すように、同一装置において、血液凝固因子に関する測定だけでなく、血小板機能の定量的な測定も行うことができる。また、本技術は、抗血小板療法の必要な患者に対して、薬物血中濃度モニタリングの実現や内服状態の把握、投薬方法等を選択する手段となり得る。
血液凝固系解析部１１は、出力制御部１２に対し、解析結果を出力する。出力制御部１２は、解析結果を表示装置１０１０等に出力し、表示させる。また、血液凝固系解析部１１は、記憶部１３と連絡し、該記憶部１３は、血小板含有試料の連続測定におけるデータや解析結果の経時的変化、或いは、以前に測定したデータや解析結果等を記憶する。
また、本技術では、血液凝固系解析部１１の解析結果に基づいて抗血小板薬の奏功性に関する情報を出力する薬剤奏功性出力部１４を更に有することが好ましい。この場合、前記抗血小板薬の奏功性に関する情報に基づいて前記抗血小板薬の投与量に関する情報を出力する薬剤投与量出力部１５を有することが更に好ましい。
以上の血液凝集能解析装置１０００は、プロセッサがメモリ又は他の記録媒体に記憶されるプログラムを実行することにより、血小板凝集能解析装置１０００の様々な論理的機能を動作させる。
（２）装置の動作の具体例
本技術に係る血小板凝集能解析装置１０００は、例えば、図３に示す測定フローチャートに従って動作する。まず、被験者から採血を行う（S101）。なお、被験者から得られた全血は、必要に応じて、一定の割合で生理食塩水、緩衝液等を加え、希釈してもよい。また、採血を行った被験者には、予め抗血小板薬が投与されていてもよい。被験者から得られた全血に対し、薬剤供給部３が各種試薬を適宜選択して添加し、各血液検体は生体試料保持部１に収容される（S102）。添加後、試薬が添加された全血を加温条件下で撹拌機構６により撹拌する（S103）。撹拌時間は、例えば、３分３０秒とすることができる。
次に、測定部９が血液凝固能測定を行う（S104）。なお、この血液凝固能測定は、非撹拌状態で行うことができる。また、血液凝固能測定は、経時的に測定してもよいし、測定開始からの時間を指定してその時点での凝固能を測定してもよい。その後、血液凝固系解析部１１が得られた測定データを解析する（S105）。
（３）解析の具体例
ここでは、血液凝固系解析部１１で行われる解析について詳細に説明する。この解析は、例えば、図４に示す解析フローチャートに従って実施できる。なお、本具体例は、測定データが複素誘電率である場合の解析例である。まず、血小板凝集能解析装置１０００の測定部９で得られた測定データから、複素誘電率のスペクトル変化における特徴量を抽出する（S201）。抽出した特徴量は、例えば、血小板寄与部（＝血小板機能、特に、凝集能によって反映される部分）とすることができる。
ここで、測定部９による測定データの結果は、周波数、時間、及び誘電率を各座標軸とする三次元の複素誘電率スペクトル（図５）、或いは、周波数、時間、及び誘電率から選択される２つを各座標軸とする二次元の複素誘電スペクトル（図６）として得ることができる。図５中のＺ軸は、各時間及び各周波数における複素誘電率の実数部を示す。
図６は、図５に示す三次元スペクトルを周波数７６０ｋＨｚで切り出した二次元スペクトルに対応する。図６中の符号（Ａ）は赤血球の連銭形成に伴うピークであり、符号（Ｂ）は血液凝固過程に伴うピークである。本願発明者らは、上記特許文献１において、血液試料の誘電率の時間的変化が血小板含有試料の凝固過程を反映することを明らかにしている。したがって、測定部９で得られる複素誘電率のスペクトルは、血小板含有試料の凝固能を定量的に示す指標となるものであり、その変化に基づけば、血液凝固時間、血液凝固速度、血液凝固強度等の血小板含有試料の凝固能に関する情報を得ることが可能である。
また、本技術では、前記特徴量として、血液凝固反応に関連する時間的な指標や、該反応の速度に関連する指標等を採用することができる。図７は、複素誘電率スペクトルから抽出される特徴量の例を説明する図面代用グラフである。図７において、縦軸は複素誘電率、横軸は時間を示し、上側のグラフは周波数１ＭＨｚ付近（１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ未満）での測定結果に基づくものであり、下側のグラフは周波数１０ＭＨｚ付近（３～３０ＭＨｚ）での測定結果に基づくものである。
前記特徴量は、より具体的には、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量及び／又は勾配特徴量とすることがきる。また、前記勾配特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量に基づいて抽出されるものとすることができる。
更に具体的には、前記特徴量としては、例えば、１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ未満の低周波数で複素誘電率の極大値を与える時間ＣＴ０、低周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ１（不図示）、低周波数での最大勾配ＣＦＲ、ＣＴ１以降で傾きの絶対値がＣＦＲの所定割合（好ましくは、５０％）になった際の時間ＣＴ４（不図示）、低周波数での誘電率極大値と誘電率最小値との差又はそれに準じた値を誘電率極大値又は測定開始時の初期値等で除して規格化しこれに定数を乗じることで得られる値ＤＳＣ、３～３０ＭＨｚの高周波数で複素誘電率の極小値を与える時間ＣＴ、ＣＴから任意の時刻までの誘電率増加量、高周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ３、高周波数での最大勾配ＣＦＲ２、ＣＴ以降ＣＴ３以前でＣＴ３からＣＦＲ２の傾きで直線を引いた時に複素誘電率の最小値を与える時間ＣＴ２、及びＣＴ３以降で傾きの絶対値がＣＦＲ２の所定割合（好ましくは、５０％）になった際の時間ＣＴ５（不図示）からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である。また、これらの特徴量同士の演算値や、測定された複素誘電率等との演算値を用いることもできる。
前記ＣＴから任意の時刻までの誘電率増加量は、例えば、ＣＴからｔ秒後（例えば、６００秒後）までの誘電率増加量を用いることができる。また、ＣＴから誘電率増加の傾きが最大になる時刻までの誘電率増加量や、誘電率増加量の傾きが最大になった後に最大値のｘ％になった時刻までの誘電率増加量を用いることができる。ｘ％の値は特に限定されないが、例えば、９０％として定めることができる。また、これら誘電率増加量については、電率初期値（測定開始直後の誘電率）や、誘電率の極小値などを用いて規格化した値を用いることもできる。
本技術では、これらの中でも、前記特徴量として、勾配特徴量（ＣＦＲ、ＣＦＲ２）、ＤＳＣ、又はＣＴから任意の時刻までの誘電率増加量を用いることが好ましく、高周波数での最大勾配ＣＦＲ２を用いることがより好ましい。
次に、各検体の血小板寄与部から、各検体の本アッセイに対応する活性化経路の活性化残余率ＡＲ（％）を算出する（S202）。活性化残余率ＡＲ（％）は、例えば、下記式（１）により算出することができる。
Figure 0007230429000002
 αｄｂｃｍ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍａｘ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍｉｎ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
本技術では、式（１）において、ｍ＝１（すなわち、αｎ＝１）で０＜βｎ＜３であることが好ましい。
また、更に好ましくは、下記式（２）の場合であり、すなわち、上記かつβｎ＝１である場合である。
Figure 0007230429000003
 αｄｂｃｍ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍａｘ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍｉｎ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
前記測定対象となる血小板含有試料には、評価したい特定の血小板活性化経路を刺激することが可能な血小板惹起物質（血小板活性化剤）が添加されている。なお、血小板惹起物質については、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
また、本技術では、前記血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料には、ＮａＣｌ及び／又は塩化カルシウムを添加することが好ましく、塩化カルシウムを添加することがより好ましい。これにより、後述する実施例２に示すように、活性化残余率ＡＲ（％）の算出を精度高く行うことができる。
その後、得られた活性化残余率ＡＲ（％）を、予め定めた基準値と比較する（S203）。基準値範囲内であれば、例えば、血小板含有試料が抗血小板薬を投与された被験者から採取された全血である場合、前記抗血小板薬の奏効性に関する情報、より具体的には、基準値範囲内であることから、当該抗血小板薬が期待通りの効果を発揮しているという情報を薬剤奏効性出力部１４が出力する（S204）。
一方で、基準値範囲外であれば、例えば、前述の例であれば、抗血小板薬が期待値以下の効果であるという情報を薬剤奏効性出力部１４が出力した後（S205）、これに対応するため、前記抗血小板薬の投与量の増減を検討すべく、薬剤投与量出力部１５が前記抗血小板薬の投与量に関する情報を出力する（S206）。ここで、後述する実施例２に示すように、活性化残余率ＡＲ（％）は、抗血小板薬の濃度依存的に変化するため、活性化残余率ＡＲ（％）を算出することで、抗血小板薬の投与量についての情報も得ることができる。
（４）その他
以上の説明は、主に、測定データとして、電気的特性（例えば、血小板含有試料に一定の周波数を有する交流電場をかけたインピーダンスや、血小板含有試料の複素誘電率）を利用した凝固過程の測定方法を利用した技術についてのものであるが、本技術では、その他の方法によっても凝固過程の測定を行うことができる。
その他の方法として、例えば、粘弾性による凝固過程の測定が挙げられる。この粘弾性の測定には、前述したローテーショントロンボエラストメトリー、トロンボエラストグラフィー、レオロックス（ＲｅｏＲｏｘ（登録商標））がある。また、市販の装置として、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ（登録商標））血液凝固分析装置（ヘモネティクス社）、ローテーショントロンボエラストメトリー（ＲＯＴＥＭ（登録商標））、血液凝固分析装置（ＴＥＭｇｒｏｕｐ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等を用いることができる。
トロンボエラストグラフィーでは、測定容器であるカップに全血検体を注入し、検査目的に応じた惹起物質を添加したうえで、容器の上部よりワイヤーで吊るされた棒状のピンを浸漬し、容器に対して定常的な往復角運動（典型的には１０秒間で４．４５°の範囲を往復する運動）を与える。凝固反応の進行に伴い検体の粘弾性が増加し、カップとピンの相対運動は小さくなり、したがってピンの回転変位は増加する。この回転変位を装置内の光学系を用いて経時的に記録することで、トロンボエラストグラムと呼ばれる波形が得られる。
カップではなくピンに対して往復角運動が与えられるという違いはあるものの、ローテーショントロンボエラストメトリーも基本的に同一の原理に基づいている。プロトロンビン時間や活性化部分トロンボプラスチン時間が凝固の終点検出法であるのに対して、トロンボエラストグラフィーやトロンボエラストメトリーは、凝固開始から血栓形成、更にはその後の線溶までの一連のプロセスをひとつの装置で経時的にモニタリングできるという利点がある。
３．血小板凝集能解析方法
本技術に係る血小板凝集能解析方法は、血液凝固系解析工程と、出力制御工程と、を少なくとも含む。また、必要に応じて、その他の工程を含んでいてもよい。
血液凝固系解析工程では、血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する。具体的には、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析する。
出力制御工程では、前記血液凝固系解析工程における解析の結果の出力を制御する。
なお、本技術に係る血小板凝集能解析方法の詳細については、（２）装置の動作の具体例、及び（３）解析の具体例で説明した方法と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。
なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
＜＜実施例１＞＞
［血液検体］
血液サンプルは１６名の患者ボランティアから、血液９容に対して１容の３．２％クエン酸を含む採血管に採取された。同様に、抗血小板薬であるプラスグレル（製品名：エフィエント）を服用予定の患者を対象に、服用前後で採取された血液サンプルを使用した検討を適切な一連の手続きを経て実施した。
［試薬］
本実験に使用した採血管及び試薬とその調製方法、並びに、血小板に対する働きを、下記表１にまとめた。
Figure 0007230429000004
血小板を活性化させる血小板惹起物質（血小板活性化剤）であるＡＤＰは、血小板機能測定装置用の試薬をＣｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ社より購入して使用した。また、トロンビン受容体活性化ペプチド６（ＴＲＡＰ－６）は、トロンビンと同様にＰＡＲ－１を介して強力に血小板を活性化させるが、トロンビンのようなセリンプロテアーゼ活性は有しない。今回使用したアクチン重合阻害剤であるサイトカラシンＤ（ＣｙＤ）は、アクチン重合を阻害することでトロンビン産生下においても血小板凝集を強力に抑制することが知られている。この他にも、同様の効果を持つサイトファイシンＣ（ＳｃｙｔｏｐｈｙｃｉｎＣ）、ラトランクリンＡ（ＬａｔｒｕｎｃｕｌｉｎＡ）、ケトグロボシンＡ（ＣｈａｅｔｏｇｌｏｂｏｓｉｎＡ）等が同様の目的で使用できる。
＜測定方法＞
本実験では、ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｒｙ（本明細書では、単に「ＤＢＣＭ」とも称する）用に開発された誘電コアグレーションアナライザー実験機の動作シーケンスを、血小板アッセイ実現のために一部変更して用いた。
測定を開始すると、クエン酸加血液サンプル２００μＬが予め試薬導入済みのディスポーザブルカートリッジに分注され、吸引量約２００μＬの自動ピペッティングによって混合撹拌される。通常のＤＢＣＭアッセイでは、試薬と血液の混合撹拌は数回のピペッティングで十分であるが、血小板アッセイでは試薬として加える血小板活性化剤によって活性化した血小板が、効率的に凝集するように撹拌回数を増やす必要がある。具体的には、８１回（約３分３０秒間）撹拌を行った。
撹拌終了後、直ちに誘電測定が開始され、血液凝固に伴う血液の誘電率変化を測定周波数は１０ｋＨｚ～１０ＭＨｚ、測定時間６０分、測定時間間隔５秒で記録された。血液凝固反応の進展に伴いトロンビンが生成されると、フィブリン産生に加えて、抗血小板薬による阻害を受けたために試薬による血小板凝集を起こしていない血小板はトロンビン刺激により活性化してフィブリン網に影響を与えることで、誘電率変化に寄与する。そのため、抗血小板薬が効いている血液サンプルでは最終的な誘電応答は高く、逆に、抗血小板薬が効いていない血液サンプルでは誘電応答が低くなることが期待される。
本実験では、クエン酸加血の凝固反応を再開させるため、２００μＬの血液に対して試薬として２１５ｍＭ塩化カルシウム水溶液：１５μＬを加えた他、血小板の各活性化経路の一つであるＡＤＰ経路を評価するために、ＡＤＰ：１５μＬ（終濃度：１３μＭ）を加えた。また、コントロールとして、ＡＤＰの代わりに、ＴＲＡＰ－６：１５μＬ（終濃度６４μＭ）、サイトカラシンＤ：１５μＬ（終濃度：５．４μｇ／ｍＬ）、ＮａＣｌ水溶液：１５μＬ、又は塩化カルシウム水溶液：１５μＬを添加して測定を行った。なお、上記試薬のうち、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅの正規測定項目で使用されている試薬（ＡＤＰ、ＴＲＡＰ）の終濃度は、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅにて専用試薬を用いて測定する際の全血に対する終濃度と同等である。
インピーダンス法による血小板機能測定は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社のＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ ａｎａｌｙｚｅｒ（本明細書では、単に「Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ」とも称する）を用いて行った。この装置は、５つのチャンネル、組み込みコンピュータ、及びガイド付き自動ピペットで構成されており、２つの独立した電極を有するディスポーザブルテストセルが使用される。１つの電極は、長さ３．２ｍｍの２つの銀被覆高導電性銅電極からなる。センサー表面上の血小板の接着および凝集は、２つの電極間の電気抵抗を増加させる。
メーカー指定の試験方法に従い、テストセルに、全血（３００μＬ）と３ｍＭのＣａＣｌ２入りのＮａＣｌ溶液を等容量加えて、３７℃で３分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、ＡＤＰ（終濃度：６．５μＭ）を血小板惹起物質として添加し、血小板の電極への付着によるインピーダンスの増加を測定した。
インピーダンスの増加は各電極で別々に検出され、時間（ＡＵ＊ｍｉｎ）に対してプロットされた凝集単位（ＡＵ）に変換される。約８ＡＵは１オームに対応している。この装置で測定した凝集を、ＡＵ＊ｍｉｎの曲線下面積（ＡＵＣ）としたグラフを測定結果として示した。
＜結果＞
図８は投薬前（抗血小板薬服用なし）の血液サンプルの測定後の波形の一例であり、図９は投薬後（プラスグレル服用後）の血液サンプルの測定後の波形の一例である。図８及び９において、それぞれ、ＡはＤＢＣＭの測定結果、ＢはＭｕｌｔｉｐｌａｔｅの測定結果である。
＜解析方法＞
これまでの検討から、血小板寄与部は１０ＭＨｚの最大勾配値であるＤＣＳ７４又はＤＣＳ７４をヘマトクリット値で補正したＤＣＳ８７が好ましいと考えられる。今回の検討は、これらのうち、ＤＣＳ７４を用いた。
ここで、該当血液検体のＤＢＣＭ－血小板アッセイに対応する活性化経路の活性残余率ＡＲ（％）を得る場合、活性残余率ＡＲ（％）は想定されるＤＢＣＭの下限応答値と上限応答値を測定することで、評価することが可能である。
下限応答値は、理想的にはアゴニストとの反応で全ての血小板が凝集（消費）された場合で、このときのＤＣＳ７４は血小板の活性残余率１００％であり、αｍａｘとする。逆に、上限応答値は、理想的には全ての血小板がアゴニストと全く反応せず、血液凝固反応によるトロンビン生成段階で全ての血小板が血栓強度に寄与する場合であり、このときのＤＣＳ７４は血小板の活性残余率０％であり、αｍｉｎとする。
このような実験的上下限値（αｍａｘ ａｎｄ αｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）を測定し、その血液検体のＤＢＣＭ－血小板アッセイ（αｄｂｃｍ）をスケーリングすることで、測定アッセイに対応する活性化経路の活性残余率ＡＲ（％）を上記式（１）により評価することが可能である。本実験では、特に、上記式（２）を用いて評価した。
本実験では、活性残余率ＡＲ（％）につき、下記の３通りの手法により評価した。
［方法１］
下限応答値は血小板を活性化するための最終共通経路であるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体のアゴニストで、強力な血小板凝集を引き起こすと考えられるＴＲＡＰを添加した場合と見なせる。よって、αｍａｘをこのときのＤＣＳ７４測定値とした。上限応答値は、実験的にはアゴニストを添加せずに測定を行った場合、つまりアゴニストの代わりに生理食塩水（ＮａＣｌ）を加えた場合とみなせる。よって、αｍｉｎをこのときのＤＣＳ７４とした。上記の実験的上下限値で算出された活性化残余率をＡＲ１（％）とした。
［方法２］
方法１では、ある血液検体のＤＢＣＭ－血小板アッセイで想定されるＤＣＳ７４の下限応答値は理想的にはアゴニストとの反応で全ての血小板が凝集（消費）された場合であるため、ＴＲＡＰを添加した場合とみなしたが、ＴＲＡＰをアゴニストとして添加しても全ての血小板を凝集させるのは難しいと考えられる。そこで、十分量のサイトカラシンＤによって血小板凝集を完全に阻害した場合に、全ての血小板が凝集された場合と同等の測定値を得られると考えた。よって、αｍａｘをこのときのＤＣＳ７４とした。上限応答値は、方法１と同様、実験的にはアゴニストを添加せずに測定を行った場合、つまりアゴニストの代わりに生理食塩水（ＮａＣｌ）を加えた場合とみなせる。よって、αｍｉｎをこのときのＤＣＳ７４とした。上記の実験的上下限値で算出された活性化残余率をＡＲ２（％）とした。
［方法３］
方法２と同様、十分量のサイトカラシンＤによって血小板凝集を完全に阻害した場合に、全ての血小板が凝集された場合と同等の測定値を得られると考えた。よって、αｍａｘをこのときのＤＣＳ７４とした。また、上限応答値は、方法１及び２では、実験的にはアゴニストを添加せずに測定を行った場合と見なし、アゴニストの代わりに生理食塩水（ＮａＣｌ）を加えた場合のＤＣＳ７４を血小板活性残余率０％（αｍｉｎ）としたが、アゴニスト添加なしの凍結乾燥した２１５ｍＭ塩化カルシウム試薬を用い、血小板が撹拌によるシェアストレスでその一部が活性化して反応しないように、撹拌回数を最低限の５回に変更して測定を行った場合の測定値がより理想的であると考えた。よって、αｍｉｎをこのときのＤＣＳ７４とした。上記の実験的上下限値で算出された活性化残余率をＡＲ３（％）とした。
＜解析結果＞
図１０に、方法１～３でスケーリングしたＤＢＣＭの結果とＭｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるＡＤＰｔｅｓｔのＡＵＣ（Ｕ）との散布図を示す。図１０のＡは方法１で算出したＡＲ１（％）、図１０のＢは方法２で算出したＡＲ２（％）、図１０のＣは方法３で算出したＡＲ３（％）である。
ＡＲ１（％）との相関係数はｒ＝０．４４７８７、ＡＲ２（％）との相関係数はｒ＝０．６５０３８、ＡＲ３（％）との相関係数はｒ＝０．７６８５であることから、ＤＢＣＭ－血小板アッセイにおいて、方法２及び方法３によって算出した血小板活性化残余率（ＡＲ２及びＡＲ３）が血小板寄与部の指標として好ましく、方法３によって算出した血小板活性化残余率（＝ＡＲ３（％））がより好ましいことが分かった。
＜＜実施例２＞＞
［血液検体］
血液サンプルは健常者ボランティアから同意を得た上で、血液９容に対して１容の３．２％クエン酸を含む採血管に採取された。クエン酸加血サンプルは、採血後、約３０分間室温（約２５℃）で静置した後に使用した。サンプル血液に終濃度が１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭとなるようにｔｉｃａｇｒｅｌｏｒを添加し、抗血小板薬内服様サンプルを人為的に作製した。
［試薬］
実験に使用した採血管及び試薬とその調製方法、及び、血小板に対する働きは上記表１にまとめた通りである。血小板を活性化させる血小板惹起物質の内ＡＤＰは血小板機能測定装置用の試薬をＣｈｒｏｎｏ－ｌｏｇ社より購入して使用した。ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒは血小板機能阻害剤として使用した薬剤であり、Ｐ２Ｙ１２を阻害する。ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒの血漿中最大濃度はＴｅｎｇ等の報告によると２００ｍｇの単回経口投与の場合９２３ｎｇ／ｍＬであり、その前後複数の濃度でその効果を検証した。また、サイトカラシンＤはアクチン重合を阻害することでトロンビン産生下においても血小板凝集を強力に抑制することが知られている。なお、上記表１に示すように血小板機能阻害剤として使用した薬剤（ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ）は調製過程でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いるため、血小板機能阻害剤を用いる実験ではＤＭＳＯも同時に血液に添加されることになる。そこで、本実験では血小板機能阻害剤と比較する実験で、血小板惹起物質のみを添加する項目には、該当箇所で断りを入れる一部の実験を除いて、血小板機能阻害剤を用いる場合と等量のＤＭＳＯを加えることでＤＭＳＯ濃度条件を統一した。また、このときＤＭＳＯは予め生理食塩水で２倍希釈して使用した。
＜実験方法＞
ＤＢＣＭと血小板アッセイは、概ね実施例１の方法と同様に行った。本実験では、クエン酸加血の凝固反応を再開させるために、各Ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ濃度に調製された２００μＬの血液に対して試薬として２１５ｍＭ塩化カルシウム水溶液：１５μＬを加えた他、血小板の各活性化経路の一つであるＡＤＰ経路を評価するために、ＡＤＰ：１５μＬ（終濃度１３：μＭ）を加えた。また、コントロールとして、ＡＤＰの代わりに、サイトカラシンＤ：１５μＬ（終濃度：５．４μｇ／ｍＬ）を添加して測定を行った。
インピーダンス法も、実施例１と同様の方法で行った。
＜解析方法＞
実施例１の方法３を用いた。
＜解析結果＞
図１１に、ＤＢＣＭの活性化残余率ＡＲ３（％）とＭｕｌｔｉｐｌａｔｅにおけるＡＤＰｔｅｓｔのＡＵＣ（Ｕ）との散布図を示す。図１１の結果から、ＡＲ３（％）はＴｉｃａｇｒｅｌｏｒの濃度変化に応じて、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅと同等の測定結果を得られることが示された。このことから、抗血小板薬を内服している患者の血中濃度の把握につながると考えられる。
＜＜実施例３＞＞
ＤＢＣＭによる血小板アッセイ測定の解析結果を用いて、抗血小板薬服用患者の薬物血中濃度モニタリングや内服状態の把握を行う場合に想定される診断手順は、図４で示したフローチャートと同様の手順にて行うことができる。ここで用いられる基準値（＝診断基準値）は、健常者測定結果解析データや、該当患者の臨床症状や血小板数等によって決定することができる。
例えば、図１２に示したように、実施例２で測定を実施した濃度に２００ｎＭ、４００ｎＭ、６００ｎＭ、８００ｎＭでの測定結果を追加し、横軸をｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ終濃度（ｎＭ）として血小板活性化残余率ＡＲ３（％）の変化を確認すると、血中の終濃度が４００ｎＭに達するとそれ以降のＡＲ３（％）は３０％以下になることが分かるので、診断基準値を３０％と設定することができる。
このように、薬効が想定通り発揮されているかの確認の検査として、低濃度領域での薬効評価や術前検査として抗血小板薬の残存効果の確認に用いられることが期待される。
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、
を含み、
前記血液凝固系解析部において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする、血小板凝集能解析装置。
（２）
前記凝固過程の測定データは、電気的特性の測定データである、（１）に記載の血小板凝集能解析装置。
（３）
前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料に一定の周波数を有する交流電場をかけたインピーダンスである、（２）に記載の血小板凝集能解析装置。
（４）
前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料の複素誘電率である、（２）に記載の血小板凝集能解析装置。
（５）
前記血液凝固系解析部において、前記複素誘電率のスペクトル変化における特徴量を用いる、（４）に記載の血小凝集能解析装置。
（６）
前記特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量及び／又は勾配特徴量である、（５）に記載の血小板凝集能解析装置。
（７）
前記勾配特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量に基づいて抽出される、（６）に記載の血小板凝集能解析装置。
（８）
前記特徴量は、１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ未満の低周波数で複素誘電率の極大値を与える時間ＣＴ０、低周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ１、低周波数での最大勾配ＣＦＲ、ＣＴ１以降で傾きの絶対値がＣＦＲの所定割合になった際の時間ＣＴ４、低周波数での誘電率極大値と誘電率最小値との差又はそれに準じた値を誘電率極大値又は測定開始時の初期値で除して規格化しこれに定数を乗じることで得られる値ＤＳＣ、３～３０ＭＨｚの高周波数で複素誘電率の極小値を与える時間ＣＴ、ＣＴから任意の時刻までの誘電率増加量、高周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ３、高周波数での最大勾配ＣＦＲ２、ＣＴ以降ＣＴ３以前でＣＴ３からＣＦＲ２の傾きで直線を引いた時に複素誘電率の最小値を与える時間ＣＴ２、及びＣＴ３以降で傾きの絶対値がＣＦＲ２の所定割合になった際の時間ＣＴ５からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である、（５）から（７）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（９）
各血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量に基づいて、血小板の活性化残余率ＡＲ（％）を算出する、（５）から(８)のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１０）
前記活性化残余率ＡＲ（％）は、下記式(１)により算出される、（９）に記載の血小板凝集能解析装置。
Figure 0007230429000005
αｄｂｃｍ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍａｘ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
αｍｉｎ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
（１１）
前記血小板凝集阻害物質は、サイトカラシンＤ、サイトファイシンＣ、ラトランクリンＡ、及びケトグロボシンＡからなる群より選ばれるいずれか１種以上である、（１）から（１０）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１２）
前記血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料には、ＮａＣｌ及び／又は塩化カルシウムが添加されている、（１）から（１１）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１３）
前記血小板含有試料は、全血である、（１）から（１２）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１４）
前記全血は、抗血小板薬を投与された被験者から採取されたものである、（１３）に記載の血小板凝集能解析装置。
（１５）
前記血液凝固系解析部の解析結果に基づいて抗血小板薬の奏功性に関する情報を出力する薬剤奏功性出力部を更に有する、（１）から（１４）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１６）
前記抗血小板薬の奏功性に関する情報に基づいて前記抗血小板薬の投与量に関する情報を出力する薬剤投与量出力部を更に有する、（１５）に記載の血小板凝集能解析装置。
（１７）
各血小板含有試料を保持する生体試料保持部を更に有する、（１）から（１６）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１８）
各血小板含有試料の凝固過程を測定する測定部を更に有する、（１）から（１７）のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
（１９）
血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析工程と、
前記血液凝固系解析工程における解析の結果の出力を制御する出力制御工程と、
を含み、
前記血液凝固系解析工程において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする、血小板凝集能解析方法。
（２０）
血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、を含み、前記血液凝固系解析部において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とする、血小板凝集能解析装置と、
前記血小板凝集能解析装置による解析の結果を表示する表示装置と、
を備える、血小板凝集能解析システム。
２０００：血小板凝集能解析システム
１０００：血小板凝集能解析装置
１０１０：表示装置
１：生体試料保持部
２：生体試料供給部
３：薬剤供給部
４：温度制御部
５：時間制御部
６：撹拌機構
７：駆動機構
８：測定部
９：測定条件制御部
１０：精度管理部
１１：血液凝固系解析部
１２：出力制御部
１３：記憶部
１４：薬剤奏功性出力部
１５：薬剤投与量出力部

Claims (15)

  1. 血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
    前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、
    を含み、
    前記血液凝固系解析部において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とし、
    前記凝固過程の測定データは、電気的特性の測定データであり、
    前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料の複素誘電率であり、
    前記血液凝固系解析部では、前記複素誘電率のスペクトル変化における特徴量を用い、
    各血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量に基づいて、血小板の活性化残余率Ａ Ｒ （％）を算出し、
    前記活性化残余率Ａ Ｒ （％）は、下記式(１)により算出される、血小板凝集能解析装置。
    Figure 0007230429000006

    α ｄｂｃｍ ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
    α ｍａｘ ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
    α ｍｉｎ ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
  2. 前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料に一定の周波数を有する交流電場をかけたインピーダンスである、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
  3. 前記特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量及び／又は勾配特徴量である、請求項１又は２に記載の血小板凝集能解析装置。
  4. 前記勾配特徴量は、前記複素誘電率のスペクトルから抽出される時間特徴量に基づいて抽出される、請求項３に記載の血小板凝集能解析装置。
  5. 前記特徴量は、１００ｋＨｚ以上３ＭＨｚ未満の低周波数で複素誘電率の極大値を与える時間ＣＴ０、低周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ１、低周波数での最大勾配ＣＦＲ、ＣＴ１以降で傾きの絶対値がＣＦＲの所定割合になった際の時間ＣＴ４、低周波数での誘電率極大値と誘電率最小値との差又はそれに準じた値を誘電率極大値又は測定開始時の初期値で除して規格化しこれに定数を乗じることで得られる値ＤＳＣ、３～３０ＭＨｚの高周波数で複素誘電率の極小値を与える時間ＣＴ、ＣＴから任意の時刻までの誘電率増加量、高周波数で最大勾配を与える時間ＣＴ３、高周波数での最大勾配ＣＦＲ２、ＣＴ以降ＣＴ３以前でＣＴ３からＣＦＲ２の傾きで直線を引いた時に複素誘電率の最小値を与える時間ＣＴ２、及びＣＴ３以降で傾きの絶対値がＣＦＲ２の所定割合になった際の時間ＣＴ５からなる群より選ばれるいずれか１つ以上である、請求項１から４のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  6. 前記血小板凝集阻害物質は、サイトカラシンＤ、サイトファイシンＣ、ラトランクリンＡ、及びケトグロボシンＡからなる群より選ばれるいずれか１種以上である、請求項１から５のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  7. 前記血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料には、ＮａＣｌ及び／又は塩化カルシウムが添加されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  8. 前記血小板含有試料は、全血である、請求項１から７のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  9. 前記全血は、抗血小板薬を投与された被験者から採取されたものである、請求項８に記載の血小板凝集能解析装置。
  10. 前記血液凝固系解析部の解析結果に基づいて抗血小板薬の奏功性に関する情報を出力する薬剤奏功性出力部を更に有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  11. 前記抗血小板薬の奏功性に関する情報に基づいて前記抗血小板薬の投与量に関する情報を出力する薬剤投与量出力部を更に有する、請求項１０に記載の血小板凝集能解析装置。
  12. 各血小板含有試料を保持する生体試料保持部を更に有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  13. 各血小板含有試料の凝固過程を測定する測定部を更に有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載の血小板凝集能解析装置。
  14. 血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析工程と、
    前記血液凝固系解析工程における解析の結果の出力を制御する出力制御工程と、
    を含み、
    前記血液凝固系解析工程において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とし、
    前記凝固過程の測定データは、電気的特性の測定データであり、
    前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料の複素誘電率であり、
    前記血液凝固系解析工程では、前記複素誘電率のスペクトル変化における特徴量を用い、
    各血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量に基づいて、血小板の活性化残余率Ａ Ｒ （％）を算出し、
    前記活性化残余率Ａ Ｒ （％）は、下記式(１)により算出される、血小板凝集能解析方法。
    Figure 0007230429000007

    α ｄｂｃｍ ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
    α ｍａｘ ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
    α ｍｉｎ ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
  15. 血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、前記血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と、を含み、前記血液凝固系解析部において、前記血小板含有試料に血小板凝集阻害物質が添加された凝固過程の測定データ及び前記血小板含有試料に血小板惹起物質及び前記血小板凝集阻害物質が添加されていない凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板含有試料の前記血小板凝集能を解析することを特徴とし、
    前記凝固過程の測定データは、電気的特性の測定データであり、
    前記電気的特性の測定データは、前記血小板含有試料の複素誘電率であり、
    前記血液凝固系解析部では、前記複素誘電率のスペクトル変化における特徴量を用い、
    各血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量に基づいて、血小板の活性化残余率Ａ Ｒ （％）を算出し、
    前記活性化残余率Ａ Ｒ （％）は、下記式(１)により算出される、血小板凝集能解析装置と、
    前記血小板凝集能解析装置による解析の結果を表示する表示装置と、
    を備える、血小板凝集能解析システム。
    Figure 0007230429000008
    α ｄｂｃｍ ：測定対象となる血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
    α ｍａｘ ：血小板凝集阻害物質が添加された血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
    α ｍｉｎ ：血小板惹起物質及び血小板凝集阻害物質が添加されていない血小板含有試料の前記複素誘電率のスペクトルから抽出された前記特徴量
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