JP2018004622A - 血液凝固検査方法 - Google Patents

Abstract

【課題】装置を大型化することなく、検体の状態に関わらずにより正確に血液や血漿の凝固能が検査できるようにする。
【解決手段】第２工程Ｓ１０２で、流路の途中に設けられた停止箇所に凝固活性剤と検体との接触領域の先端部が到達した時点で凝固活性剤および検体の流れを停止する。次に、第３工程Ｓ１０３で、測定箇所で測定される血液の成分濃度が、停止した時点より設定値に到達するまでの時間を測定する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、血液や血漿の凝固能を測定する血液凝固検査方法に関するものである。

血液凝固活性は、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや肝機能の異常、さらに経口投与による抗凝血薬療法のモニタリングに用いられる指標などを得るための重要な項目である。このような血液凝固検査には、ＰＴ（プロトロンビン時間：Prothrombin Time）測定法、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間：Activated Partial Thromboplastin Time）測定法、およびフィブリノゲンテストなどが主に用いられている。これらの測定・テストは、病院内の大型分析装置を用いて実施されている。

また、検体血漿と凝固試薬（凝固活性剤）を混合してからマイクロ流路に導入し、凝固反応により不溶化が進み、マイクロ流路における検体血漿および凝固試薬の進行が停止した位置から、血液凝固能を測定する技術も開発されている(特許文献１参照)。

また、発明者らにより、マイクロ流路を備えるチップを用い、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法で流速を測定することにより凝固活性を検査する方法が提案されている。この検査では、まず、凝固活性剤（トロンビン）を混合することによって完全に活性化した血漿試料を測定直前に調製する。次いで、予め緩衝液を満たしてある流路内に調整した血漿試料を導入することで、血漿試料が流路内を進む流速および屈折率変化値を凝固時間に変換して求めている（特許文献２，特許文献３，特許文献４参照）。

特開２０１４−０３８１０９号公報 特開２０１１−２３２１３７号公報 特開２０１３−０５３９５９号公報 ＷＯ２０１４／１８９０６７ 特開２００７−２６３９１２号公報 ＷＯ２０１１／０６８０４９ ＷＯ２０１５／１１９０７２

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ところで、実際の臨床検査現場では、患者の多種多様な病態に応じて異常な組成へと変わった様々な状態の血液を検査しなくてはならない。例えば、高脂血症患者の場合は、脂質が多く含まれた高粘性状態の血液となる。また例えば、低タンパク血症、肝機能不全あるいは投薬によってタンパク質産生が抑制される患者の場合は、健常者平均と比較して血中タンパク質濃度が低く低粘度状態の血液が採取される。また、乳びの多い検体の場合、採取した検体が未反応状態で白濁しているため、検体に照射した透過光が散乱し、また吸収されるため、本来の正しい検査数値と誤差が生じることがある。このように試料中の共存物質を含む成分濃度の違いが、検体ごとに大なり小なり存在する。

また、温度、湿度、光、ｐＨなどの環境要因、それらの元におかれる時間などの検体の保管条件によっても成分変化が生じ、採血の際に溶血するとヘモグロビンの吸収波長帯を用いる検査項目では異常値を示す（非特許文献２参照）。

多様な検体試料を同一凝固測定装置で測定する場合、凝固活性に無関係な試料組成依存の検体差が凝固測定値に反映すると誤検出となる。従来凝固測定の一般的な方法として用いられている光散乱法では、白濁して生成されるフィブリン網の断片を観察するため、特に乳びの影響を受けやすく、これらの影響をいかに排除するかの努力がなされている。

例えば、複数の波長の光を照射し、被測定検体に応じて干渉物質の影響の少ない波長のデータを選択し、これを凝固時間の算出に用いることで影響排除を行う技術が提案されている（特許文献５参照）。また、検体ごとの散乱光の強度に応じて適切な検出角度を選択することで、血液凝固分析におけるダイナミックレンジ確保と高感度性を担保する技術もある（特許文献６参照）。

しかしながら、複数の波長を用いる技術では、複数の波長光を用意する必要があるため装置全体の機構が複雑となるという問題がある。検体ごとの散乱光の強度に応じて適切な検出角度を選択する技術では、装置を小型化することが難しい。

本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、装置を大型化することなく、検体の状態に関わらずにより正確に血液や血漿の凝固能が検査できるようにすることを目的とする。

本発明に係る血液凝固検査方法は、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、血液の成分を含む検体および凝固活性剤を、凝固活性剤を先にして流路に導入する第１工程と、流路の途中に設けられた停止箇所に凝固活性剤と検体との接触領域の先端部が到達した時点で凝固活性剤および検体の流れを停止する第２工程と、測定箇所で測定される血液の成分濃度が、停止した時点より設定値に到達するまでの時間を測定する第３工程と、第３工程で測定された時間より接触領域に形成されたものと想定されるフィブリン網の状態を推定する第４工程と、推定されたフィブリン網の状態より検体の血液凝固能を判定する第５工程とを備え、測定箇所は、接触領域の先端部が停止箇所に到達した段階における接触領域の後端部より下流側に配置する。

上記血液凝固検査方法において、第３工程では、測定箇所における表面プラズモン共鳴測定により測定される表面プラズモン共鳴角度により血液の成分濃度を測定すればよい。

以上説明したことにより、本発明によれば、装置を大型化することなく、検体の状態に関わらずにより正確に血液や血漿の凝固能が検査できるという優れた効果が得られる。

図１は、本発明の実施の形態における血液凝固検査方法を説明するためのフローチャートである。 図２Ａは、測定チップ２００およびＳＰＲ装置２２０の構成を示す斜視図である。 図２Ｂは、測定チップ２００の構成を示す断面図である。 図３は、ＳＰＲ測定による血液凝固検査方法を説明する説明図である。 図４は、トロンビン試薬と実験検体との接触領域が流路中央に到達した状態で送液を止めた時の蛍光観察結果を示す写真である。 図５は、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２との接触領域に形成されるフィブリン網３１４の周囲における状態を説明するための説明図である。 図６は、分子量９０キロダルトン相当の高分子がフィブリン網を透過して拡散する状態をシミュレーションした結果を示す特性図である。 図７は、流路と測定箇所との位置関係を説明するための説明図である。 図８Ａは、フィブリン網を透過した高分子が所定箇所に到達する時間を屈折率変化で測定する方法について説明するための説明図である。 図８Ｂは、フィブリン網を透過した高分子が所定箇所に到達する時間を屈折率変化で測定する方法について説明するための説明図である。 図９は、血漿サンプル成分がＳＰＲ測定領域到達する前の状態から、血漿成分がＳＰＲ観測領域に到達して分子濃度成分に増減が見られない安定した状態となるまでのＳＰＲ測定結果の変化を示す説明図である。 図１０は、４０％および６０％の凝固活性に希釈調製した様々な組成の人工調製血漿に、グルコース、リン酸緩衝生理食塩水、アルブミンを添加した検体を測定した結果を示す特性図である。 図１１は、血漿活性の異なる血漿を用いて測定した結果を示す特性図である。 図１２は、第２の解析方法による指標値算出によって得られる検量線である。

以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における血液凝固検査方法を説明するためのフローチャートである。この検査方法は、第１工程Ｓ１０１で、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、血液の成分を含む検体および凝固活性剤を、凝固活性剤を先にして流路に導入する。凝固活性剤は、トロンボモジュリン，エラグ酸，カオリン，セライトなどの接触因子を活性化する化学物質およびカルシウムイオンを含む。また、流路は、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの材料から構成された測定チップに形成されているマイクロ流路である。

次に、第２工程Ｓ１０２で、流路の途中に設けられた停止箇所に凝固活性剤と検体との接触領域の先端部が到達した時点で凝固活性剤および検体の流れを停止する。次に、第３工程Ｓ１０３で、測定箇所で測定される血液の成分濃度が、停止した時点より設定値に到達するまでの時間を測定する。例えば、測定箇所における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定により測定される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）角度により判定されるアルブミンなどの血液の成分濃度変化を測定すればよい。ここで、測定箇所は、接触領域の先端部が停止箇所に到達した段階における接触領域の後端部より下流側に配置する。

次に、第４工程Ｓ１０４で、測定された時間より接触領域に形成されたものと想定されるフィブリン網の状態を推定する。次に、第５工程Ｓ１０５で、推定されたフィブリン網の状態より検体の血液凝固能を判定する。

なお、測定の後、流路内の検体および凝固活性剤などは、ポンプ圧を高めるなどにより速やかに流路内から排出させ、また、流路内を洗浄することなどにより、流路内へのフィブリンなどの不溶化タンパク質の固着を防ぐようにするとよい。測定終了後に行う洗浄は、洗浄液を流路に通過させることにより可能である。例えば、１％次亜塩素酸ナトリウムおよび０．１％のオクチルフェノールエトキシレート（オクトキシノール）を洗浄液として流路に通過させた後に、水を３回導入して流路内部をリンス処理すればよい。

上述したＳＰＲ測定は、例えば、図２Ａ，図２Ｂに示す測定チップ２００およびＳＰＲ装置２２０を用いることで実施できる。測定チップ２００は、ＢＫ７ガラスからなる基板２０１と、膜厚５０ｎｍ程度のＡｕ層２０２と、流路基板２０３とから構成されている。Ａｕ層２０２は、例えば、スパッタリング法などのよく知られた堆積技術により形成すればよい。

また、流路基板２０３は、マイクロ流路２０４となる溝部，導入口２０５，および排出口２０６を備える。例えば、ＰＤＭＳから流路基板２０３を形成すればよい。溝部は、幅１ｍｍ、深さ（高さ）７５μｍ程度とすればよい。また、導入口２０５の口径は、３ｍｍとし、排出口２０６の口径は、１．５ｍｍとした。これらは、例えば、よく知られた生検トレパンにより形成すればよい。また、基板２０１と流路基板２０３とは個別に作製し、最後に、マイクロ流路２０４が測定領域に重なるように測定チップ２００を組み立てた。

Ａｕ層２０２を形成した基板２０１および流路溝を形成した流路基板２０３の各々の貼り合わせ面を、酸素ガスのプラズマ（反応イオン）の照射により活性化させた後、各々の貼り合わせ面を当接させて貼り合わせることで、両者を一体とした。プラズマの照射は、プラズマ処理装置の処理室内で実施する。プラズマは、出力７０Ｗのマイクロ波により生成し、また、処理室内には酸素を１００ｓｃｃｍで供給し、処理室内における酸素分圧は１０Ｐａとした。なお、ｓｃｃｍは流量の単位であり、０℃・１０１３ｈＰａの流体が１分間に１ｃｍ³流れることを示す。また、プラズマの照射は、５秒程度実施した。

また、排出口２０６には、負圧機構２０７が接続され、マイクロ流路２０４内の液体を、排出口２０６を介して牽引（吸引）可能としている。負圧機構２０７は、例えば、ステンレスパイプで接続された廃液タンクおよび負圧ポンプ（ＭＦＣＳ−ＶＡＣ，Ｆｌｕｉｇｅｎｔ社製）などから構成されている。なお、流路断面の寸法は、排出口２０６に取り付けたポンプとマイクロ流路２０４の導入口２０５の毛細管力のバランス、および検体３１２の導入速度によって決定すればよい（特許文献７参照）。

測定においては、ＳＰＲ装置２２０の測定プリズム２２２に形成されている測定面２２３上に、屈折率がＢＫ７ガラスと等しいマッチングオイル（不図示）を塗布し、この上に測定チップ２００の基板２０１裏面を配置する。また、ＳＰＲ装置２２０の光源２２１から出射される光の光軸上に、測定チップ２００の測定領域が重なる状態に配置する。ＳＰＲ装置２２０は、例えば、エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株式会社製の「Ｓｍａｒｔ ＳＰＲ ＳＳ−１００」である。

光源２２１から出射された光を、シリンドリカルレンズ（不図示）などにより長さ４．８ｍｍのライン状に集光して測定プリズム２２２に入射させ、測定プリズム２２２の測定面２２３に密着させている測定チップ２００の測定領域に照射する。測定チップ２００の測定領域となるマイクロ流路２０４にはＡｕ層２０２が形成されており、Ａｕ層２０２の裏面に、測定チップ２００を透過してきた集光光が照射される。

このようにして照射された集光光は、流速測定対象の流体が接触したＡｕ層２０２の裏面で反射し、いわゆるＣＣＤイメージセンサーなどの撮像素子よりなるセンサー２２４で光電変換されて強度（光強度）が得られる。このようにして得られた光強度の変化により屈折率の変化が求められる。センサー２２４は、例えば、４８０ピクセルの受光部を備えるライン型の撮像素子であり、多点屈折率測定を可能としている。

次に、測定チップ２００を用いた測定について図３を用いて説明する。マイクロ流路２０４に、まず、３７℃で１分間加熱したトロンビン凝固活性剤３１１（１０マイクロリットル）を供給して満たす。例えば、図３の（ａ）に示すように、マイクロシリンジ３２１により、トロンビン凝固活性剤３１１を導入口２０５に供給し、図３の（ｂ）に示すように、マイクロ流路２０４内が、トロンビン凝固活性剤３１１で満たされ、導入口２０５が空になった状態とする。

次に、導入口２０５が空になったことを確認した後、図３の（ｃ）に示すように、自動分注装置３２２などを用い、３７℃で１分加熱した１マイクロリットルの検体３１２を導入口２０５に連続的に滴下し、マイクロ流路２０４の他端の排出口２０６より、負圧機構２０７により一定の圧力（負圧）でトロンビン凝固活性剤３１１を牽引する。

これらのことにより、図３の（ｄ）に示すように、マイクロ流路２０４内に、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２とが接触する接触領域３１３を形成する。接触領域３１３は、導入口２０５に検体３１２が滴下されると、マイクロ流路２０４の導入口２０５側の開口端で形成される。形成された接触領域３１３は、負圧機構２０７による牽引で、トロンビン凝固活性剤３１１および検体３１２ともに、マイクロ流路２０４内を他端の方向に輸送される。この牽引を途中で停止し、マイクロ流路２０４内の液体の輸送を停止させることで、接触領域３１３の移動を停止させ、マイクロ流路２０４内の停止箇所に、接触領域３１３の先端部３１３ａを配置する。牽引を停止して液体の輸送を停止すれば、接触領域３１３の移動も停止することは確認している。

ここで、接触している接触領域３１３では、検体３１２にトロンビン凝固活性剤３１１が添加されることになり、接触領域３１３では、凝固反応が起こり得る状態となっている。このため、上述したように、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２が接触して接触領域３１３が形成された時点より、接触領域３１３では、凝固反応が開始される。また、この凝固反応は、マイクロ流路２０４内の停止箇所に接触領域３１３の先端部３１３ａを配置された後も継続し、結果として、接触領域３１３には、フィブリン網が形成されていくことになる。

上述したように、接触領域３１３の先端部３１３ａが図３の（ｄ）に示すようにマイクロ流路２０４内の停止箇所に配置されている状態で、マイクロ流路２０４内の接触領域３１３の後端部３１３ｂより下流側に設けられている測定箇所２３１における、屈折率（ＳＰＲ角度）の時間変化を測定する。測定箇所２３１に、センサー２２４の検出領域を対応させればよい。センサー２２４の検出領域には、複数（例えば４８０個）のフォトダイオード素子が、マイクロ流路２０４の延在方向に１０μｍ間隔で並んで配置されている。測定箇所２３１では、各フォトダイオード素子の位置（ピクセル位置）毎に、光強度の変化（ＳＰＲ角度）が測定され、多点屈折率測定を可能としている。

なお、基板２０１の屈折率をｎ、Ａｕ層２０２の誘電率をεｍ、試料の誘電率をεｓ、基板２０１とＡｕ層２０２との界面に入射する光の入射角度をθとすると、「ｎ（ω/ｃ）ｓｉｎθ＝（ω/ｃ）［εｍ×εｓ/（εｍ＋εｓ）］^1/2」が成り立つ条件の時に、入射角度と、基板２０１とＡｕ層２０２との界面に誘起されるプラズモンの共鳴が起こる（非特許文献４参照）。この角度θが、ＳＰＲ角度である。

また、プラズモンの共鳴が起きると反射する光が減衰するため、この状態がセンサー２２４のいずれかのフォトダイオード素子の検出値の変化として現れる。従って、検出光強度が低下したフォトダイオード素子のピクセル位置（ピクセル値）により、ＳＰＲ角度が求められる。また、上記ピクセル値より、例えば、「屈折率値＝ピクセル値×１．２７３９×１０^-4＋１．３１８８（光源波長７７０ｎｍ）」などの換算式により、屈折率値が得られる。

ここで、フィブリン網について説明する。血漿などの血液成分を含む検体と凝固活性剤との接触領域では、接触領域を挟み凝固活性剤の溶液と検体の溶液との間で様々な分子が拡散する中で、検体中に含まれるプロトロンビンがトロンビンに変換され、産生されたトロンビンがフィブリノゲンを不溶性タンパク質であるフィブリンに変換する。このようにして生成されるフィブリンは、接触領域（界面）に網状のフィブリン網を形成する。また、生成されるフィブリンの量は、検体に含まれていたフィブリノゲンの量により変化し、形成されるフィブリン網の状態も、検体に含まれていたフィブリノゲンの量により異なるものとなる。

一方、検体中に溶解状態を継続して拡散しているアルブミンなどの血液成分は、接触領域に形成されるフィブリン網を透過していく。この透過の状態は、形成されるフィブリン網の状態により異なる。フィブリン網が形成される接触領域より下流側に移動していく血液成分の移動度を測定することで、フィブリン網の状態が推定可能であり、推定したフィブリン網の状態から、フィブリノゲンの量が把握でき、血液凝固活性が判定可能となる。

上述したフィブリン網の形成、およびアルブミンがフィブリン網を透過する状態を実験により観察した結果について説明する。実験では、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate；フルオレセインイソチオシアネート）で標識したフィブリノゲン、およびＲｈｏｄａｍｉｎｅ（ローダミン）で標識したアルブミンを混合した血漿を実験検体として用いた。また、血漿活性度６７％の血漿を用いた実験検体１と、血漿活性度２５％の血漿を用いた実験検体２とを用意した。また、凝固活性剤としてトロンビン試薬を用いた。

上述した実験検体とトロンビン試薬とを、流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して流路を流れる状態に、トロンビン試薬を先にしてマイクロ流路に導入した。トロンビン試薬と実験検体との接触領域が流路中央に到達した状態で送液を止めた時の蛍光観察結果を図４に示す。図４において、（ａ）および（ｂ）は、実験検体１の結果を示し、（ｃ）および（ｄ）は、実験検体２の結果を示す。また、（ａ）および（ｃ）は、ＦＩＴＣの蛍光を観察し、（ｂ）および（ｄ）は、ローダミンの蛍光を観察している。

図４の（ａ）および（ｃ）に示すように、ＦＩＴＣ蛍光は、境界が明確な形状を示し、この形状は、流路進行方向（図面右側）に凸の滑らかな凸錐形状となっている。この状態は、２液の接触領域の形状を反映しており、接触領域にフィブリンが形成されていることが分かる。また、よく知られているように、トロンビンなどの凝固試薬により生産されたフィブリンは、網状に形成される（非特許文献１参照）。従って、接触領域には、フィブリン網が形成されることが分かる。

一方、図４の（ｂ）および（ｄ）に示すように、ローダミン蛍光は、境界がなく、明度が徐々に変化している。また、ローダミン蛍光は、接触領域より下流側（図面右側）にまで広がっている。このことより、アルブミンは、接触領域に形成されているフィブリン網を透過して下流側に拡散することが確認できる。

また、実験検体１と実験検体２との結果を比較すると、ローダミン蛍光は実験検体２の方［（図４の（ｄ）］が、下流側により拡散している。

以上の測定結果は、凝固活性度に依存して形成されるフィブリン網の性質（網のサイズ、網の表面で生じる分子間力、帯電性）によって、血漿中分子（血液の成分）が接触領域に形成されたフィブリン網を通過する移動度に影響を与え、この結果、分子がフィブリン網を透過する時間に差が生じるためと考えられる。

検体中のフィブリノゲン濃度を反映して形成されるフィブリン網の形状が異なることが報告されており（非特許文献１参照）、血液（血漿）中の分子がフィブリン網を通過して移動する状態を捉えることで、フィブリン網が形状されている状態が測定でき、結果として、検体の凝固活性度を測定することが可能になるものと考えられる。

また、フィブリン網を透過する血液成分の分子の移動度を測定する際に、分子が移動した距離ではなく、分子がある一定の場所に到達するまでの時間を指標値として用いることで、血漿中分子の濃度に依存することなくフィブリン網の状態が測定（推定）可能となる。

測定する方法としては、前述したようにＳＰＲ測定による屈折率測定が挙げられる。図５に示すように、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２との接触領域に形成されるフィブリン網３１４の直下に、マイクロ流路２０４内の多点屈折率測定が可能な測定箇所２３１を配置する。この状態で、血液成分の高分子３１５、低分子３１６、もしくはこれらの分子群がフィブリン網３１４を透過して測定箇所２３１に到達する時間を、屈折率変化によって把握する。

次に、分子量９０キロダルトン相当の高分子がフィブリン網を透過して拡散する状態をシミュレーションした結果について図６に示す。前述したように、下流側に滑らかな凸錐形状となっているフィブリン網の、流路壁から見て傾斜している測定箇所側の部分より、測定箇所の流路壁に向かって高分子が拡散する状態をシミュレーションした。グレースケールは、濃度を示す。このように、測定箇所では、測定点によって分子が到着する時間が変化するため、観測位置に対する到達時間の変化を捉えることで、フィブリン網、つまりは凝固活性状態を捉えることが可能であると考えられる。

対象とする分子到達時間の測定においては、フィブリン網の影響変化を受けやすい高分子の移動度を主に捉えるとよい。この場合、流路と測定箇所との位置関係は、図７の（ｃ）に示すように、高分子の透過が支配的となっている段階で、接触領域３１３の先端部３１３ａが、測定箇所２３１内に配置されている状態とする。図７の（ａ）に示すように、検体３１２をマイクロ流路２０４に導入すると、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２との間に接触領域３１３が形成される。これらがマイクロ流路２０４中を進行していくと、図７の（ｂ）に示すように、接触領域３１３は、流路進行方向に滑らかな凸錐形となる。

初期の段階では、図７の（ｂ）に示すように、より分子量の小さい低分子が接触領域３１３に形成されているフィブリン網を透過拡散する。この後、 接触領域３１３が形成された後所定の時間が経過すると、図７の（ｃ）に示すように、高分子が接触領域３１３に形成されるフィブリン網を透過し始めるようになる。従って、高分子の透過状態を主に観察しようとする場合、図７の（ｃ）に示す時点で後端部３１３ｂが測定箇所２３１の開始側近傍に配置されている状態とし、高分子の測定を開始すればよい。

なお、低分子の移動度を捉えるようにしてもよく、また、フィブリン網を透過してくる全ての分子を対象として移動度を捉えるようにしてもよい。フィブリン網を透過してくる測定可能な分子を対象として移動度を捉えるようにすればよい。

フィブリン網を透過した高分子が所定箇所に到達する時間を屈折率変化で測定する方法について、図８Ａ、図８Ｂを用いて説明する。前述したように、測定箇所２３１には、流路進行方向に例えば４８０個の測定点が等間隔で並んでいる。移動時間は、各測定点において任意の屈折率に達する時間を算出する。

ここで、実際の測定においては、後端部３１３ｂより上流側に、測定箇所２３１の開始点に測定点（第１測定点）が配置されるようにする。まず、マイクロ流路２０４にトロンビン凝固活性剤３１１を供給して満たす。次に、導入口２０５が空になったことを確認した後、検体３１２を導入口２０５に連続的に滴下し、マイクロ流路２０４の他端の排出口２０６より、負圧機構２０７により一定の圧力でトロンビン凝固活性剤３１１を牽引する。

これらのことにより、マイクロ流路２０４内に接触領域３１３を形成させ、負圧機構２０７による牽引で、トロンビン凝固活性剤３１１および検体３１２ともに、マイクロ流路２０４内を下流の方向に輸送する。この牽引を時刻ｔで停止し、接触領域３１３の移動を停止させ、マイクロ流路２０４内の停止箇所に、接触領域３１３の先端部３１３ａを配置する。

上述した接触領域３１３の形成時点から、停止させた時刻ｔを経て、所定の時間が経過するまで、測定箇所２３１の４８０カ所の測定点で測定される各々の屈折率変化を記録する。

第１測定点の測定は、図８Ａの（ａ）に示すように、測定開始より停止時刻ｔに達する前までは、トロンビン凝固活性剤３１１の部分を測定し、次いで接触領域の部分を測定し、停止時刻ｔからは、検体３１２の部分を測定することになる。このため、停止時刻ｔを過ぎると、検体３１２における屈折率測定となり、時間の経過と共に測定される屈折率は大きくなり、最大屈折率ｎ_mazが測定された後、徐々に屈折率が低下する。後端部３１３ｂより上流側の第１測定点で測定される最大値（最大屈折率ｎ_maz）は、検体３１２における血液成分の濃度を反映しているものと考えることができる。

以下、上述した測定データを利用した解析方法（指標値の求め方）について説明する。まず、第１の解析方法について説明する。上記最大値の例えば２５％を設定値として決定し、後端部３１３ｂより下流側の測定点で観測された結果において、設定値が測定された停止時刻ｔからの時間情報を取り出す。この割合は、透過した血液成分が測定点に到達した時刻の屈折率を下限として、測定ノイズによって生じる算出時間の誤差が小さい範囲で定めるとよい。

図８Ｂに示すように、測定点毎に取り出した時間をプロットし、プロット点より近似直線８０１を決定する。決定した近似直線８０１の傾きが、検体３１２の血液凝固能の指標値となる。第１の解析方法では、流路の流れの方向に配列された複数の測定点で屈折率（検体３１２の成分濃度）の変化を時系列に測定し、各測定点で屈折率が閾値に到達する時間を求め、求めた時間より得られる近似直線８０１の傾きを指標値とする。

近似直線８０１の傾きが大きいほど、測定箇所で測定される血液の成分濃度が、停止した時点より設定値に到達するまでに、より多くの時間がかかっていることを示している。このように、成分濃度が設定値に達するまでの時間がより大きい状態は、接触領域に形成されるフィブリン網を透過する成分がより少ないことを示している。これは、フィブリン網がより厚く、またはより緻密に形成されたことを示しており、より凝固能が高いものと判断できる。

次に、第２の解析方法を説明する。第２の解析方法では、前述したＳＰＲ測定により得られる２次元データの合算値を利用する。前述したように、測定箇所２３１には、流路進行方向に例えば４８０個の測定点が等間隔で並んでいる。各測定点毎に、時間とともに測定される屈折率の値が変化する。これらの、測定点毎に測定される屈折率の時間変化が、２次元データとなる。この２次元データの中で、所定の時間範囲における所定の濃度範囲の面積の大小により、成分濃度が設定値に達するまでの時間の大小が分かる。

第２の解析方法では、流路の流れの方向に配列された複数の測定点で屈折率（検体の成分濃度）の変化を時系列に測定し、得られた測定点毎の屈折率の変化よる時間と複数の測定点における屈折率変化による２次元データより、所定の時間範囲における所定の濃度範囲の面積を求めて指標値とする。

このように２次元データを用いることで、複数の測定点の経時的な分子移動度変化を捉えることができるため、より高感度に界面で形成されるフィブリン網形成の状態変化、つまり凝固活性状態を捉えることができる。

ここで、上述した２次元データは、図９に示すように、横軸を測定時間とし、縦軸を観測位置（測定点）とした分布を示すものとなる。例えば、ポンプ送液によって血漿サンプルが運ばれ始めるところから測定を開始すると、図９の（ａ）に示すように、各測定位置毎に、時間とともに屈折率が変化する。図９の（ａ）において、時刻ｔ０が、ポンプ送液によって血漿サンプルが運ばれ後、送液が停止される時刻である。また、測定位置ｐ０は、接触領域の位置である。また、測定位置ｐ１は、適宜に設定した測定箇所の終点である。

上述した時刻ｔ０と時刻ｔ１の間の、測定位置ｐ０から測定位置ｐ１までの領域を、判定の対象領域とする。図９の（ａ）において、点線の四角で囲われた領域が測定の対象領域であり、図９の（ｂ）は、測定の対象領域のみを示している。

上述したように取り出した図９の（ｂ）に示す測定の対象領域における屈折率を、前述した最大屈折率ｎ_mazで除することによって、測定サンプル毎の血漿サンプル内の組成を規格化する。

規格化した値のうち、最大値の２５％以下の数値を示す領域は、血漿中の低分子の移動が主として含む領域となっており、凝固産生物であるフィブリン網の影響を受けづらい領域となっている。また、規格化した値のうち、最大値の５０％以上の数値を示す領域は、分子移動のノイズが大きく精度を落とす要因となる。したがって、凝固指標値算出のためには、高感度および低ノイズを図り、図９の（ｂ）に示す取り出した領域内のうち、前述した最大屈折率ｎ_mazの２５％〜５０％の値となる成分のみを残し、これらの総和（面積）をとることによって指標値とする。

この第２の解析方法の場合、図９に示した測定結果の中で、凝固活性剤と検体とが接触する接触領域の位置（測定位置ｐ０）を、より正確に把握することが重要となる。ここで、接触領域で生じる凝固産生物の発生分布が測定毎に異なることがあり、接触領域の位置がＳＰＲ測定領域上で５０−１００μｍ程度前後することがある。このため、決められた測定位置での固定点観測では大きく誤差が生じる可能性がある。従って、毎測定、接触領域位置の補正を行うとよい。

補正方法としては、まず各測定点での前述した最大屈折率ｎ_mazの値によって規格化した値（２５％、５０％、７５％）の到達する時間をプロットして分散値を計算する。次に、凝固反応を伴わない血清（オートノルム）を血漿サンプルの代わりに使用した際の最大分散値を参照し、この値を超える位置を、解析開始点（測定位置ｐ０）とする。これにより、測定毎の微量な接触領域位置のズレを補正することができる。

上述した判断では、フィブリン網に対する血液成分の透過時間を指標値とするため、検体中に含まれる血液成分の組成濃度に依存しない。これは、透過時間が分子の移動度に起因するためであり、分子の移動度は拡散およびフィブリン網および透過分子の物性にのみ依存しているため、血中組成物の濃度が変化しても、判断指標には影響がでない。

次に、実施例を用いてより詳細に説明する。前述した測定チップ２００の導入口２０５が、ＳＰＲ装置２２０の観測領域に０．５ｍｍ以内の範囲で重なる状態に配置した。
血液成分中の高分子を対象とする場合は、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２との接触領域３１３が形成されてから３秒以降に高分子のフィブリン網の透過が支配的となるので、これに合わせて観測領域を配置するとよい。

また、本発明では、液相を停止した状態から、トロンビン凝固活性剤３１１の側にフィブリン網を透過してきた成分が、流路下流側に拡散していく状態を測定する。このため、導入する検体３１２がマイクロ流路２０４に入りきって送液を停止するまでの時間と、停止するまでの時間中における血液成分の移動度によって、マイクロ流路２０４の長さを決定し、測定箇所を決定すればよい。

例えば、検体３１２の量が１．８マイクロリットル、流路断面の幅が１ｍｍ、高さ７５μｍ、牽引圧７ｍｂａｒの場合、送液は検体３１２を投入してから約３．４秒後に停止する。この間に、アルブミンや抗体等の血液成分は、接触領域３１３の形成が開始されるマイクロ流路２０４の入口から３．８ｍｍ離れた場所まで移動する。よってマイクロ流路入口から３．８ｍｍ離れた場所に、ＳＰＲ装置２２０における測定領域の最上流側の第１測定点が配置される状態とすればよい。

測定においては、まず、３７℃で１分間加熱したトロンビン凝固活性剤３１１（１０マイクロリットル）を供給して満たし、導入口２０５が空になった状態とする。次に、導入口２０５が空になったことを確認した後、自動分注装置３２２を用い、３７℃で１分加熱した１．８マイクロリットルの検体３１２を導入口２０５に連続的に滴下し、マイクロ流路２０４の他端の排出口２０６より、負圧機構２０７により一定の圧力でトロンビン凝固活性剤３１１を牽引する。

これらのことにより、マイクロ流路２０４内に、トロンビン凝固活性剤３１１と検体３１２とが接触する接触領域３１３を形成する。接触領域３１３は、導入口２０５に検体３１２が滴下されると、マイクロ流路２０４の導入口２０５側の開口端で形成される。形成された接触領域３１３は、負圧機構２０７による牽引で、トロンビン凝固活性剤３１１および検体３１２ともに、マイクロ流路２０４内を他端の方向に輸送される。この牽引を途中で停止し、マイクロ流路２０４内の液体の輸送を停止させることで、接触領域３１３の移動を停止させ、マイクロ流路２０４内の停止箇所に、接触領域３１３の先端部３１３ａを配置する。

以上のように送液を操作している状態で、ＳＰＲ装置２２０で測定された結果について説明する。測定により、毎時間における４８０個の測定点毎のＳＰＲ角度が、行列データとして得られる。隣り合う測定点の間隔は１０μｍである。

最上流側の第１測定点において得られる屈折率の変化より、検体３１２中の小さな分子が観測領域（測定箇所２３１）に到達した時間を求めることができる。この時に観測した各ＳＰＲ測定点の屈折率を初期値とし、その値から変化する屈折率変化量を測定結果として用いる。

得られた測定結果より、まず、第１測定点の測定結果より、測定の終わりに近い時刻で観測された最大屈折率を求め、この２５％を設定値として決定する。次に、各測定点の測定結果において、停止時刻から設定値の屈折率変化値に達するまでの時間を求め、求めた結果を測定点の位置に対してプロットする。

グルコース、リン酸緩衝生理食塩水、アルブミンを用い、９０％の標準血漿原液（コアグピア用キャリブレータ、積水メディカル株式会社製）を、４０％および６０％の凝固活性に希釈調製した様々な組成の人工調製血漿を用意し、検体とした。これら検体に対し、上述した測定を実施した。凝固活性剤（凝固開始剤）として、６０％に水で希釈したトロンビン溶液（コアグピアＦｂｇ，積水メディカル株式会社製）を使用した。測定の結果を図１０に示す。

４０％凝固活性人工調製血漿に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて第１検体とし、４０％凝固活性人工調製血漿に、５％のグルコース（glucose）を加えて第２検体とし、４０％凝固活性人工調製血漿に、５％のアルブミン（albumin）を加えて第３検体とした。これらの測定結果を図１０の（ａ）に示す。

また、６０％凝固活性人工調製血漿に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加えて第４検体とし、６０％凝固活性人工調製血漿に、５％のグルコース（glucose）を加えて第５検体とし、６０％凝固活性人工調製血漿に、５％のアルブミン（albumin）を加えて第６検体とした。これらの測定結果を図１０の（ｂ）に示す。図１０の（ｂ）に示すように、いずれの結果も同様の傾きとなっており、様々な血液成分を混合した検体においても、凝固活性度が等しい場合は、血液成分が移動する時間を指標値とする本発明の測定方法の測定で同じ結果を示すことが分かった。

次に、血漿活性の異なる血漿を用いて測定した結果を図１１に示す。凝固開始剤として、６０％に水で希釈したトロンビン溶液（コアグピアＦｂｇ，積水メディカル株式会社製）を使用した。図１１に示す数字は、人口調整血漿の希釈の割合を示している。図１１に示すように、検体部分の屈折率変化測定結果より得られる、検体における血液成分の濃度を反映していると考えられる最大屈折率より決定した設定値に到達する時間を複数の測定点で測定した結果得られるプロット軌跡（近似直線）の傾きが、測定に使用した検体（血漿）の凝固活性と相関性をもっている。上記傾きを用いて凝固能を評価できることが分かる。

次に、前述した第２の解析方法による指標値算出によって得られる検量線を、図１２に示す。この検量線作成に使用した血漿サンプルは、市販のトロンビン溶液（コアグピアＦｂｇ，積水メディカル株式会社製）を用いて調製（希釈）を行った。ＳＰＲ測定により得られた２次元データ、つまり複数の測定点の経時的な分子移動度（検体の成分濃度）変化を利用する算出法においても、同様に凝固能を評価できることが分かる。

以上に説明したように、本発明では、流路の途中に設けられた測定箇所に凝固活性剤と検体との接触領域が到達した時点で凝固活性剤および検体の流れを停止し、この後で、接触領域より下流側の測定箇所で測定される血液の成分濃度が設定値に到達するまでの時間を測定するようにした。この結果、本発明によれば、装置を大型化することなく、検体の状態に関わらずにより正確に血液や血漿の凝固能が検査できるようになる。

流路内で血漿検体と凝固試薬を直列に配置し、凝固反応の場を流路断面積方向に小さく設けることで、不溶化成分であるフィブリンによる汚染を流路内部に大きく拡散させずに最小限の駆動力で凝固能を調べることができ、汚染を小さくとどめることができる。このため、流路内に洗剤を導入するだけで洗浄を完了させることができるなど、洗浄がより容易となり、チップの繰り返し使用がより実現的になる。

なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、本発明は、主要凝固測定項目（ＰＴ測定，ＡＰＴＴ測定，Ｆｉｂ測定）において適応可能である。

２０１…基板、２０２…Ａｕ層、２０３…流路基板、２０４…マイクロ流路、２０５…導入口、２０６…排出口、２０７…負圧機構、２２１…光源、２２２…測定プリズム、２２３…測定面、２２４…センサー、２３１…測定箇所。

Claims (2)

1. 流路の延在方向に直列に配列して隣り合う部分が接触して前記流路を流れる状態に、血液の成分を含む検体および凝固活性剤を、前記凝固活性剤を先にして前記流路に導入する第１工程と、
   前記流路の途中に設けられた停止箇所に前記凝固活性剤と前記検体との接触領域の先端部が到達した時点で前記凝固活性剤および前記検体の流れを停止する第２工程と、
   測定箇所で測定される前記血液の成分濃度が、停止した時点より設定値に到達するまでの時間を測定する第３工程と、
   前記第３工程で測定された時間より前記接触領域に形成されたものと想定されるフィブリン網の状態を推定する第４工程と、
   推定されたフィブリン網の状態より前記検体の血液凝固能を判定する第５工程と
   を備え、
   前記測定箇所は、前記接触領域の先端部が前記停止箇所に到達した段階における前記接触領域の後端部より下流側に配置することを特徴とする血液凝固検査方法。
2. 請求項１記載の血液凝固検査方法において、
   前記第３工程では、前記測定箇所における表面プラズモン共鳴測定により測定される表面プラズモン共鳴角度により前記血液の成分濃度を測定することを特徴とする血液凝固検査方法。