KR20110048592A

KR20110048592A - 항바이러스제로 유용한 텐덤 비스헤테로사이클 화합물, 이의 용도 및 상기 화합물을 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20110048592A
Application number: KR1020117008738A
Authority: KR
Inventors: 난파준; 주지안핑; 왕웬롱; 왕구이펭; 첸하이준; 헤페이란
Original assignee: 상하이 인스티튜트 오브 마테리아 메디카 차이니즈 아카데미 오브 싸이언시즈
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2011-05-11
Also published as: EP2223921A1; EP2223921B1; JP2011148833A; EP2218720A1; CN1834095B; EP2223921B8; CN1834095A; US20080306121A1; JP4939527B2; SG172716A1; JP2008533057A; JP5314730B2; EP1889843A4; KR101177692B1; US7741348B2; SG172715A1; KR20070121778A; EP2218720B1; WO2006097030A1; EP1889843A1

Abstract

본 발명은 P1-P2 구조식을 갖는 텐덤 비스헤테로사이클의 소 분자 화합물, 상기 화합물을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 이것의 용도를 제공하며, P1 및 P2 각각은 하나 또는 두 개의 헤테로원자를 갖는 불포화 5-멤버 헤테로사이클 고리이다. 이 화합물은 인플루엔자 바이러스의 복제, B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 복제, 및 HBsAg 및 HBeAg의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다. 이 화합물들은 바이러스병에 대한 의약의 제조에 이용될 수 있으며, 세포독성, 장기간의 투여로 유발된 약 내성 바이러스 변종에 대한 다른 구조의 약물 투여필요성을 포함하여 알려진 뉴클레오시드 약들의 한계를 극복할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 구조는 상대적으로 단순하고 제조하기 쉽다.

Description

항바이러스제로 유용한 텐덤 비스헤테로사이클 화합물, 이의 용도 및 상기 화합물을 포함하는 조성물{BISHETEROCYCLE TANDEM COMPOUNDS USEFUL AS ANTIVIRAL AGENTS, THE USES THEREOF AND THE COMPOSITIONS COMPRISING SUCH COMPOUNDS}

본 발명은 일종의 항바이러스 억제제, 특히 비-뉴클레오시드(non-nucleoside) 항바이러스 억제제로 이용될 수 있는 텐덤 비스헤테로사이클(bisheterocycle in tandem) 구조의 소 분자 유기화합물에 관한 것이다. 이 화합물은 인플루엔자, B형 간염, 헤르페스(herpes) 및 에이즈 등과 같은 병의 치료제로 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 상기 화합물을 포함하는 화합물 및 조성물의 용도에 관한 것이다.

사람 병원성 바이러스들은 매우 단순한 구조를 갖는 일종의 핵산 입자이다. 이들 대부분은 효소체계가 없으며, 이들의 핵산 및 단백질을 복제하고, 바이러스 입자로 조립하기 위해서는 숙주세포에 의존하여야 하며, 이렇게 함으로써 바이러스가 복제된다. 바이러스 감염은 다양한 질병을 야기하고, 사람의 건강 및 생명을 심각하게 위협한다. 현재 높은 이환률(morbidity) 및 큰 위해성을 갖는 바이러스들은 주로 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 에이즈 바이러스, 시토메갈로 바이러스(cytomegalovirus) 및 헤르페스 바이러스 등을 포함한다.

현재 바이러스 질병의 치료에 있어서 여전히 높은 특이성을 갖는 약들이 부족하며, 임상적으로 사용되는 일반적인 약들은 주로 다음의 유형으로 분류된다: 바이러스 복제를 억제하는 항바이러스 약; 신체의 면역기능을 향상시키는 면역조절물질; 임상적 증상에 대한 진해제(antitussive), 진통제(anodyne), 해열제(antipyretic) 및 화상치료제(antipyrotic) 등; 2차 감염을 막기 위한 항감염제; 바이러스 감염을 막기 위한 백신 및 바이러스의 전파를 차단하는 소독제 등.

현재 바이러스 병의 치료를 위한 신약 연구는 항바이러스 약에 집중되어 있다. 널리 사용되는 항-인플루엔자 바이러스 약은 아다만타나민(adamantanamine) 약, 인플루엔자 바이러스의 뉴라미다아제(neuramidinase) 억제제, 인플루엔자 바이러스의 수용체 차단물질 및 인플루엔자 바이러스에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함한다. 임상적으로 주로 쓰이는 것은 아다만타나민 약 및 뉴라미다아제 억제제이다. 하지만, 간염 바이러스(hepatitis virus)의 감염은 지금까지 국제적인 치료 문제로 인식되고 있다.

1980년대에는 비다라빈(vidarabine), 비다라빈 인산염, 아시크로비어(acyclovir), 지도부딘(zidovudine)이 연구되었다. 하지만, 이것들의 나쁜 치료효과 및 강한 중독반응 때문에 현재에는 간염을 치료하는데 사용되지 않는다. 최근에는 B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스에 대한 약들을 확립된 간암 암종 세포주, 간염 바이러스 감염 세포주 또는 유전자변형 세포주, 및 유전자변형 마우스 간염 동물모델로 스크리닝함으로써 라미부딘(lamivudine), 팜시크로비어(famciclovir), 로부카비어(lobucavir), 아데포비어 디피보시일(adefovir dipivoxiil), FTC (dideoxyfluorinethiocytosine), FMAU (fluoro-methylarabinosyluracil), FDDC (fluoro-dideoxycytosine), BMS 200475 (epoxyhydroxylcarbodeoxy guanosine) 와 같은 많은 뉴클레오시드 약들이 개발되었다. 그것들은 HBV에 대해 명백한 억제활성을 갖는다. 1998년에서 2002년까지 30종류 이상의 약들에 대한 전임상 연구가 연구자들에 의해 수행되었다. 그 중 21개의 약들이 최근에 임상 2-3단계에 들어갔다. 이 시험 약들 중에 항 B형 간염 바이러스에 대한 것은 대개 항 HIV 리버타아제(revertase) 억제제 및 항-헤르페스 바이러스 DNA 중합효소 억제제이다. 다른 것들 중에서, 엔티카비어(enticavir)는 임상시험 3단계에 들어갔고, 시장에 곧 출시될 것이다. 항 C형 간염 바이러스에 대한 시험 약들은 대개 광범위한 항바이러스 약 또는 RNA 바이러스 억제제, 및 항바이러스 활성을 갖는 면역조절물질이다.

현재 대부분의 승인된 항바이러스 약들은 뉴클레오시드 화합물들이다. 임상적인 사용을 통하여 그것들은 다음과 같은 단점들이 있는 것으로 드러났다. 1) 세포독성; 2) 장기간의 투여로 유발된, 다른 구조를 갖는 다른 약들이 필요한 약에 내성을 갖는 바이러스 변이의 출현. 따라서 비-뉴클레오시드 항바이러스 약이 상당한 주목을 받게 되었다.

본 발명자들은 항바이러스 억제제, 특히 비-뉴클레오시드(non-nucleoside) 항바이러스 억제제로 이용될 수 있는 소분자 유기화합물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 텐덤 비스헤테로사이클(bisheterocycle in tandem) 구조의 소 분자 유기화합물이 인플루엔자 바이러스의 복제, B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 복제, 및 HBsAg 및 HBeAg 의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 비-뉴클레오시드 항바이러스 억제제로 사용되는 텐덤 비스헤테로사이클(bisheterocycle in tandem) 구조의 소 분자 유기화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물들을 포함하는 의약 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명은 비-뉴클레오시드 항바이러스 억제제로 사용되는 텐덤 비스헤테로사이클(bisheterocycle in tandem) 구조의 소 분자 유기화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물들을 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 화합물의 의약적 용도를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명은 다음 구조식 I에 의해 대표되는 구조를 갖는 화합물들을 제공한다:

P1-P2 (구조식 1)

여기에서,

P1 및 P2 각각은 불포화 5-멤버 헤테로사이클 고리이며, 불포화 5-멤버 헤테로사이클 고리 P1 및 P2 각각은 N, O 또는 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 두 개의 헤테로원자를 포함하고, 및/또는 불포화 5-멤버 헤테로사이클 고리 P1 및 P2 각각은 하나 또는 두 개의 치환기 R에 의해 선택적으로 치환되며,

상기 치환기 R은 수소; 할로겐 원소들; 페닐 또는 할로페닐; 벤질; 할로겐 원자에 의해 치환된 C1-C13 알킬, C1-C6 알콕실 또는 하이드록실; 티아조릴(thiazolyl), C2-C6 알켄일; C3-C6 사이클로알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, 산소에 의해 치환된 페닐 및 벤질; C1-C2 알콕시카보닐; 카복실;

또는

의 구조식을 갖는 카바모일(carbamoyl); 나이트릴 그룹으로 치환된 아세틸;

의 구조를 갖는 치환된 아미노알킬이며,

여기에서,

R₉은 수소, 아이소프로필 또는 벤질이며,

R₁₀ 은 수소; C2-C8 알켄일아실(alkenylacyl); C2-C6 알카노일(alkanoyl); 알콕실로 치환된 C1-C6 알카노일; C3-C6 사이클로알카노일; 치환되지 않거나 C1-C6 알콕실, C1-C6 알킬아미노, 할로겐 원자 및 하이드록실로부터 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 그룹에 의해 선택적으로 치환된 벤조일; 벤질아실; 티에닐 포름아실(thienyl formacyl); 피리딜 포름아실(pyridyl formacyl); 아실아미노; tert-뷰톡시 카보닐;

의 구조를 갖는 2-브로모-티아조릴-4-포름아실(2-bromo-thiazolyl-4-formacyl);

의 구조를 갖는 2,5-디브로모-티아조릴-4-포름아실(2,5-dibromo-thiazolyl-4-formacyl);

의 구조를 갖는 2-메틸-티아조릴-4-포름아실(2-methyl-thiazolyl-4-formacyl);

의 구조를 갖는 3-tert-뷰톡시카보닐아미노에 의해 치환된 피리딜 포름아실(pyridyl formacyl);

의 구조를 갖는 2-치환된 알킬아미노-4-티아조릴 포름아실(2-substituted alkylamino-4-thiazolyl formacyl)이다.

본 발명에 따른 화합물은 다음 구조식 II로 대표된다:

(구조식 II)

여기에서,

R₂는 수소 또는

의 구조를 갖는 치환된 아미노에 의해 치환된 알킬이며, 여기에서 R₉ 및 R₁₀은 상기에서 정의된 바와 같으며;

R₄ 는 수소, C1-C6 알킬 또는 벤질이며;

R₆ 은 수소 또는 C1-C6 알킬이며;

R₇ 은 카복실, C1-C2 알콕시카보닐,

의 구조를 갖는 카바모일, 또는

의 구조를 갖고 n=1부터 5까지인 카바모일이다.

더 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물은 구조식 III에 의해 대표되며,

(구조식 III)

여기에서

R₇ 은 카복실,

R₉ 는 아이소프로필 또는 수소이며,

R₁₀은 사이클로펜틸 포름아실, o-메톡실 벤조일,

의 구조를 갖는 사이클로펜틸-1-엔-아세틸, o-플루오로 벤조일, 또는 티에닐 포름아실(thienyl formacyl)이거나;

또는

R₇ 은 메톡실카보닐;

R₉ 는 아이소프로필, 벤질 또는 수소이며;

R₁₀은 수소; C2-C8 알켄일아실(alkenylacyl); C2-C6 알카노일(alkanoyl); 벤질옥시(benzyloxy)에 의해 치환된 아세틸; C3-C6 사이클로알카노일; 치환되지 않거나 메톡실, 플루오린 원자, 아미노 또는 하이드록실로부터 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 그룹에 의해 선택적으로 치환된 벤조일; 벤질아실; 티에닐 포름아실(thienyl formacyl); 피리딜 포름아실(pyridyl formacyl);

의 구조를 갖는 3-tert-뷰톡실카보닐아미노(3-tert-butoxylcarbonylamino)에 의해 치환된 피리딜 포름아실;

의 구조를 갖는 2-치환된 알킬아미노-4-티아조릴 포름아실(2-substituted alkylamino-4-thiazolyl formacyl);

의 구조를 갖는 2-브로모-티아조릴-4-포름아실 (2-bromo-thiazolyl-4-formacyl);

의 구조를 갖는 2,5-디브로모-티아조릴-4-포름아실(2,5-dibromo-thiazolyl-4-formacyl); 또는

의 구조를 갖는 2-메틸-티아조릴-4-포름아실이거나;

또는,

R₇은

의 구조를 갖는 카바모일,

R₉는 아이소프로필,

R₁₀은 수소, 벤질옥시에 의해 치환된 아세틸, 치환되지 않거나 단일 플루오린 원자에 의해 선택적으로 치환된 벤조일, 벤질아실, 피리딜 포름아실,

의 구조를 갖는 3-tert-뷰톡실카보닐 아미노에 의해 치환된 피리딜 포름아실 또는

의 구조를 갖는 2-치환된 알킬아미노-4-티아조릴 포름아실(2-substituted alkylamino-4-thiazolyl formacyl) 이다.

특히, 본 발명에 따른 화합물은 다음 구조식 IV에 의해 대표되는 구조를 갖는다:

(구조식 IV)

여기에서,

R₂, R₃, R₆ 및 R₇ 은 독립적으로 수소; 할로겐 원자; 페닐 또는 할로페닐; 벤질; 할로겐원자에 의해 치환된 C1-C13 알킬, C1-C6 알콕실 또는 하이드록실; C2-C6 알켄일(alkenyl); C3-C6 사이클로알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, 산소원자에 의해 치환된 페닐 또는 벤질; 아미도; C1-C2 알콕시카보닐; 또는 카복실이며;

X₄ 는 O, S, NH 또는 N;

X₁ 은 N, NH 또는 CH₂;

Y₁ 은 O, S 또는 NH이며;

Y₄ 는 N 또는 CH₂ 이다.

추가로, 상술한 화합물에 대하여, R₂ 가 H 이고 Y₄ 가 N일 때, R₃ 는 C1-C6 알킬이며;

R₆ 는 C1-C13 알킬; 페닐 또는 할로페닐; 벤질; 할로겐 원자들을 포함하는 치환된 알킬, 알콕실 또는 하이드록실; C2-C6 알켄일; C3-C6 사이클로알킬; 또는 할로겐 원자들이며;

R₇ 은 수소; 페닐 또는 할로페닐; 벤질; C1-C13 알킬; 할로겐 원자들에 의해 치환된 C1-C13 알킬, C1-C6 알콕실 또는 하이드록실; C2-C6 알켄일; C3-C6 사이클로알킬; 산소에 의해 치환된 C1-C6 알킬; C1-C2 알콕시카보닐; 또는 카복실이며;

X₄ 는 O, S 또는 NH;

X₁ 은 N 또는 CH₂이며;

Y₁ 은 O, S 또는 NH이다.

그리고, 상기 화합물에 대하여, R₃ 가 H, R₂ 가 H 및 Y₄ 가 N일 때,

R₆ 은 C1-C13 알킬, 페닐 또는 할로페닐, 벤질, 알콕실로 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C3-C6 사이클로알킬 또는 할로겐 원자들이며;

R₇ 은 수소; 페닐 또는 할로페닐, 벤질, C1-C13 알킬, 알콕실로 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, C3-C6 사이클로알킬, C1-C2 알콕시카보닐 또는 카복실이며;

X₄ 는 O, S 또는 NH;

X₁ 은 N 또는 CH₂이며;

Y₁ 은 O, S 또는 NH이다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명에 따른 화합물은 구조식 V에 의해 대표되는 구조를 가질 수 있다;

(구조식 V)

여기에서,

R₁ 은 벤질, C1-C6 알킬, 또는 C2-C6 알켄일이며;

R₆ 는 C1-C6 알콕실이며;

R₃ 는 티아조릴(thiazolyl), 티에닐(thienyl), 페닐(phenyl), 벤질, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, 또는 C3-C6 사이클로알킬이며;

X₄ 는 O 또는 S이며;

Y₁ 은 O 또는 S이다.

본 발명에 따른 화합물은 다음 공정에 의해 제조할 수 있다

1) 화합물 3 은 화합물 1과 화합물 2의 축합반응에 의해 수득된다;

2) 화합물 4 는 화합물 3을 고리화함으로써 수득된다.

여기에서,

R₆ 및 R₇ 은 독립적으로 페닐 또는 할로페닐; 벤질; 할로겐 원자들에 의해 치환된 C1-C13 알킬, C1-C6 알콕실 또는 하이드록실; C2-C6 알켄일; C3-C6 사이클로알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, 산소에 의해 치환된 페닐 또는 벤질; 아미도; C1-C2 알콕시카보닐; 또는 카복실이며;

X₁ 은 N, NH, O, S 또는 CR₁이며;

X₂ 은 N, NH, O, S 또는 CR₂이며;

X₃ 은 N, NH, O, S 또는 CR₃이며;

X₄ 는 N, NH, O, S 또는 CR₄이며;

Y₁ 은 O, S 또는 NH이며;

R₁, R₂, R₃ 및 R₄ 는 상기에 기술한 것과 같이 정의된다.

라웨슨 시약(Lawesson＇s reagent) 의 구조는

이다.

특히 본 발명에 따른 바람직한 화합물은 다음 화학반응에 의해 제조할 수 있다.

화합물 7은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

R₆ 및 R₇ 은 독립적으로 페닐 또는 할로페닐; 벤질; 할로겐 원자에 의해 치환된 C1-C13 알킬, C1-C6 알콕실 또는 하이드록실; C2-C6 알켄일; C3-C6 사이클로알킬; C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일, 산소로 치환된 페닐 또는 벤질; 아미도(amido); C1-C2 알콕시카보닐(alkoxycarbonyl); 또는 카복실이며;

X₄ 는 O 또는 S 이다.

화합물 11은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₇ 은 페닐, 벤질 또는 n-뷰틸(n-butyl)이며; 및 X₁ 은 N 또는 CH₂이다.

화합물 13은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₆ 은 H, 아이소뷰틸(isobutyl), 벤질 또는 n-뷰틸이다.

화합물 15는 다음 화학반응에 의해 제조하였다:

여기에서, R₁₀ 은 C2-C8 알켄일아실; C2-C6 알카노일(alkanoyl); 벤질옥시에 의해 치환된 아세틸; C3-C6 사이클로알카노일; 치환되지 않거나, 메톡실(methoxyl), 플루오린 원자 또는 하이드록실로부터 선택된 하나, 둘 또는 세 개의 그룹으로부터 선택적으로 치환된 벤조일; 벤질아실; 또는 포름아실이다.

화합물 16 은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₁₁ 은 C2-C8 알켄일아실이다.

화합물 17은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₁₂ 는 피리딜 포름아실(pyridyl formacyl), 3-tert-뷰톡실카보닐 아미노(

) 에 의해 치환된 피리딜 포름아실, 2-치환된 알킬아미노-4-티아조릴 포름아실(2-substituted alkylamino-4-thiazolyl formacyl) (

), 2-브로모-티아조릴-4-포름아실 (

), 2,5-디브로모-티아조릴-4-포름아실(

), 2-메틸-티아조릴-4-포름아실 (

), 피리딜 포름아실, o-아미노 벤조일, o-메톡실 벤조일, o-하이드록시 벤조일, 또는 티에닐 포름아실이다.

화합물 19는 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₁₀ 은 사이클로펜틸 포름아실(cyclopentyl formacyl), o-메톡실 벤조일, 사이클로펜틸-1-엔-아세틸(cyclopentyl-1-ene-acetyl), 티에닐 포름아실(thienyl formacyl), o-플루오로 벤조일(o-fluoro benzoyl)이며; R₉ 는 벤질 또는 아이소뷰틸이다.

화합물 21은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₁₀ 은 C2-C8 알켄일아실, C2-C6 알카노일(alkanoyl), 벤질옥시에 의해 치환된 아세틸, C3-C6 사이클로알카노일, 치환되지 않거나, 단일 플루오린 원자, 벤질아실 또는 포름아실로부터 선택적으로 치환된 벤조일이다.

화합물 22는 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₁₁ 은 C2-C8 알켄일아실이다.

화합물 23은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서 R₁₂ 는 피리딜 포름아실, 3-tert-뷰톡실카보닐 아미노 (3-tert-butoxylcarbonyl amino) (

)에 의해 치환된 피리딜 포름아실 또는 2-치환된 알킬아미노-4-티아조릴 포름아실(2-substituted alkylamino-4-thiazolyl formacyl) (

)이다;

화합물 25는 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

화합물 27은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

화합물 30은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₆ 는 H 또는 메틸이다.

화합물 36은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

a: TFA (trifluoroacetic acid), 피리딘, CH₂Cl₂; b: THF, EDCI, DMAP, DMF;

c :

의 구조를 갖는 IBX, toluene/DMSO; d: POCl₃

여기에서, R₆ 는 C1-C2 알콕시; R₃ 은 티아조릴(thiazolyl), 티에닐(thienyl), 페닐, 벤질, C1-C6 알킬, C2-C6 알켄일 또는 C3-C6 사이클로알킬; R₁ 은 벤질, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알켄일이며; X₄ 는 O 또는 S이며； Y₁ 은 O 또는 S이다.

화합물 38은 다음 화학반응에 따라 제조하였다:

여기에서, R₆ 은 아이소뷰틸(isobutyl)이며; R 및 R＇은 독립적으로 페닐, 벤질, H 또는 C1-C6 알킬이며; X 는 N 또는 O이다.

상기 반응은 N,N-디메틸 포름아마이드(N,N-dimethyl formamide, DMF), 아세토나이트릴(acetonitrile, CH₃CN), 메탄올, 디클로로메테인(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran, THF), 디클로로에테인(dichloroethane), 톨루엔, 벤젠, 다이옥세인(dioxane), 물 또는 이들의 혼합물과 같은 용매에서 수행할 수 있다. 경우에 따라서, 피리딘, N-메틸모르포린(N-methylmorpholine), 아이소뷰틸 클로로포름산 (isobutyl chloroformate), 트라이에틸아민(triethylamine), 다이아이소프로필에틸아민 (diisopropylethylamine), DMAP 등과 같은 활성제를 특정 반응에 추가하는 것이 필요하다. 반응온도는 전형적으로 특정 화합물(예를 들어 화합물 Wang413.49 등)의 반응상태에 따라 -78℃~140℃ 사이이다. 반응시간은 특정 반응물질에 달려 있다. 반응완성도는 전형적으로 TLC에 의해 추적되고 측정된다. 반응 후에 일반적으로 사용되는 후-처리(after-treatment) 방법은 여과(filtration), 용매제거를 위한 반응용액의 농축(concentration), 추출(extraction) 및 칼럼크로마토그래피(column chromatography separation) 등을 포함한다. 최종산물은 NMR로 동정한다.

본 발명의 텐덤 비스헤테로사이클 소 분자 유기화합물을 합성하는 방법은 다음 문헌에서 찾을 수 있다: 1. J. Org . Chem . 1973; 38; 3571. 2. WO9831687, 1997. 3. Org . Process Res . Dev. 2003; 7; 696. 4. Org . Lett . 2004; 6; 929. 5. Chem. Pharm . Bull .1983; 31; 4549. 6. J. Org . Chem . 2003; 68; 1636. 7. Org . Lett. 2000; 2; 2769 등.

본 발명은 또한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 의약 조성물을 제공하며, 이 조성물은 전형적인 보조약제(pharmaceutic adjuvant)를 포함할 수도 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 화합물은 항바이러스 억제제로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 바이러스병에 대한 약제를 제조하는데 사용될 수 있다.

추가로, 본 발명에 따른 화합물 및 그 화합물을 포함하는 조성물은 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 AIDS 바이러스에 의해 유발된 바이러스병을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 비-뉴클레오시드 항바이러스 억제제로 사용되는 텐덤 비스헤테로사이클의 소 분자 유기화합물을 제공한다. 이 화합물은 인플루엔자 바이러스의 복제, B형 간염 바이러스(HBV)의 DNA 복제, 및 HBsAg 및 HBeAg 의 형성을 효과적으로 억제할 수 있다. 이 화합물은 바이러스병에 대한 약의 제조에 사용될 수 있고, 세포독성, 장기간의 투여로 유발된 약 내성 바이러스 변종에 대한 다른 구조의 약물 투여필요성을 포함하여 지금까지 알려진 뉴클레오시드 약의 한계를 극복할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 구조는 상대적으로 단순하고 합성하기 쉽다.

제조예

본 발명을 보다 구체적으로 이해할 수 있도록 실시예를 들어 설명한다. 그러나 다음의 실시예로써 본 발명의 취지를 제한하는 것은 아니다.

다음의 제조예에서, NMR은 Varian 에서 생산된 Mercury-Vx 300M을 이용하여 측정하였고, NMR 스케일링은: δH/C 7.26/77.0 ppm(CDCl₃) 이다. 시약은 주로 Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd 에서 구했다. 생성물의 정제는 주로 실리카겔(200-300 mesh)의 칼럼크로마토그래피로 수행하였다. 칼럼크로마토그래피에 사용된 실리카겔의 유형은 coarse hollow (ZLX－II) 이고, The Branch of Qingdao Haiyang Chemical Plant 에서 생산되었다.

예 1

화합물 1 (3 mmol), 화합물 2 (3 mmol), N-에틸- N＇-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드 (N-ethyl-N＇-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC) (3.3 mmol) 및 N,N-디메틸 피리딘 (N,N-dimethyl pyridine, DMAP) (0.3 mmol) 이 분자체(molecular sieve)로 혼합되었고, 결과물은 아이스 배스(ice bath) (0℃) 안에서 냉각되었다. 그리고 나서 DMF 와 피리딘 (4.5 mmol) 을 차례로 추가하였다. 반응의 진행은 TLC로 추적되었다. 반응이 완료된 후에 반응물을 물로 희석하였고, EtOAc로 추출하였다. 용매는 농축(concentration)으로 완전히 제거하였다. 그 후 화합물 3을 칼럼크로마토그래피로 얻었다(수율 60%). 이어서, 화합물 3 (0.3 mmol) 을 아세트산 암모늄 (NH₄OAc) (15 mmol) 및 아세트산 나트륨 (NaOAc) (30 mmol) 과 혼합하고, 130℃로 가열하였으며, 반응의 진행은 TLC로 추적하였다. 그 후 반응물을 실온으로 냉각시키고, 물로 희석시켰으며, 아세트산 에틸로 추출하였다. 용매는 농축으로 완전히 제거하였다. 그 후, 화합물 4i (Wang279-1) 를 페트롤륨 에테르/아세트산 에틸(petroleum ether/ ethyl acetate) (부피비 1:1) 과 함께 칼럼 크로마토그래피로 분리함으로써 얻었다(수율 31%). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-1

예 2

화합물 3 (0.3 mmol) 을 라웨슨시약(Lawesson＇s reagent) (0.45 mmol)과 혼합한 후, 거기에 THF (5 mL)를 첨가하였다. 결과물을 환류시키고, 반응의 진행을 TLC로 추적하였다. 이어서 반응 용액을 실온으로 냉각하고 난 후, 용매를 완전히 제거하기 위해 농축하고 추출하였다. 화합물 4ii 를 페트롤륨 에테르/아세트산 에틸(petroleum ether/ ethyl acetate) (부피비 3:1) 과 함께 칼럼 크로마토그래피로 분리함으로써 얻었다(수율 50%). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-2

예 3

화합물 3 (0.3 mmol)을 POCl₃ (3 mL)와 혼합하고, 80℃로 가열하였다. 반응의 진행을 TLC로 추적하였다. 이어서 반응용액을 0℃의 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 용액에 부었고, POCl₃를 제거하였다. 그 후 반응물을 아세트산 에틸(ethyl acetate)로 추출하였고, 용매를 농축으로 완전히 제거하였다. 화합물 4iii 을 페트롤륨 에테르/아세트산 에틸(petroleum ether/ ethyl acetate) (부피비 4:1) 과 함께 칼럼 크로마토그래피로 분리함으로써 얻었다(수율 80%). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-3

예 4

화합물 5 (1.6 mmol)를 벤젠(10 mL)에 녹인 후, 그것에 THF 속의 화합물 6 (3.2 mmol) 용액(4 mL) 및 테트라키스팔라듐(tetrakis(triphenylphosphine)palladium, Pd(PPh₃)₄) (10 mg)을 차례로 추가하였고, 100℃ 로 가열하였다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응 용액을 농축하였고, 화합물 7 (Wang282-1)을 페트롤륨 에테르/아세트산 에틸(petroleum ether/ethyl acetate) (부피비 3:1)과 함께 칼럼 크로마토그래피 로 분리함으로써 얻었다(수율 25). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-4

예 5

벤조익 알데히드(25 mmol)를 시안화칼륨(KCN)(30 mmol) 및 염화암모늄(37.5 mmol)을 포함하는 25% 암모니아수 용액(20 mL)에 첨가하였다. 결과물을 56 시간 동안 휘젓고, 반응을 TLC로 추적하였다. 반응물은 디클로로메테인(dichloromethane)으로 추출하였다. 그 후 추출물을 황산마그네슘(MgSO₄)으로 건조시키고, 화합물 9를 얻기 위해 용매를 농축시켰다(2.9 g, 수율 90%). 화합물 9 (6 mmol)를 EDC (7.8 mmol), DMAP (0.6 mmol) 및 티아졸-2-폼산(thiazole-2-formic acid) (6 mmol)와 혼합하였다. 결과물을 아이스 배스(ice bath)에서 냉각시키고(0℃), 이어서 거기에 DMF를 첨가하였다(15 mL). 반응의 진행은 TLC로 추적하였다. 반응이 완성된 후에, 반응물을 물로 희석하였고, 아세트산 에틸(ethyl acetate)로 추출하였다. 용매를 농축으로 완전히 제거하였고, 화합물10을 칼럼 크로마토그래피로 분리함으로써 얻었다(0.76 g, 수율 50). 화합물 10 (3.1 mmol) 을 트라이페닐포스핀(triphenylphosphine, Ph₃P) (7.75 mmol) 및 사염화탄소(CCl₄) (7.75 mmol)와 혼합하고, 결과물을 아세토나이트릴(acetonitrile) (20 mL)에 녹였다. 반응은 45℃에서 수행하였고, TLC에 의해 추적하였다. 반응이 끝난 후에, 용매를 농축으로 제거하였고, 화합물11 (Wang261) (수율 60%)을 페트롤륨 에테르/아세트산 에틸(petroleum ether/ ethyl acetate) (부피비 5:1) 과 함께 칼럼 크로마토그래피로 분리함으로써 얻었다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-5

예 6：

화합물 12 (1 mmol)를 리튬 하이드록사이드 (LiOH) (4 mmol)와 혼합하고, 거기에 MeOH과 물의 혼합용매를 첨가하였다. 반응은 실온에서 수행하였고, TLC로 추적하였다. 반응을 완결한 뒤에, 용매를 농축시켰고, 1 mol/L 염산(hydrochloric acid)으로 산성화하였으며, 아세트산 에틸로 추출하였다. 농축으로 용매를 완전히 제거하고, 화합물 13 (Wang268)을 얻었다(수율 98%). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-6

예 7：

화합물 14 (0.1 mmol)를 NaHCO₃ (1 mmol)와 혼합하고, H₂0/EtOAc (0.2 mL/0.8 mL) 를 첨가한 후, 염화 아실(acyl chloride)을 서서히 첨가하였다. 반응은 한 시간 후 멈추었다. 반응용액을 EtOAc로 희석시켰고, 수용액층을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 화합시키고, 포화 NaCl 용액으로 세 번 씻고, MgSO₄로 건조시킨 후, 용매를 완전히 제거하기 위해 농축시켰다. 생산물 15(Wang363.43-1)를 얻기 위해 칼럼 크로마토그래피를 통해 혼합물을 정제하였다. 수율은 83%였다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표1-7

예 8：

산 (0.12 mmol)을 CH₂Cl₂ (2 mL)에 녹였고, 아이스 염 배스(ice salt bath)에서 냉각시켰다(0^oC). 10분 후에, N-메틸-모르포린(N-methyl-morpholine, NMM) (0.15 mmol) 및 아이소뷰틸 클로로포름산(isobutyl chloroformate)(ClCOOⁱBu) (0.13 mmol) 을 차례로 첨가하였다. 그 후, 30분간 휘젓고, 화합물 14 (0.1 mmol)를 첨가하였다. 계속해서 휘저었고, 그 시스템을 실온까지 서서히 가열시켰다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응이 완료된 후 반응을 물로 멈추었다. 반응물은 EtOAc로 추출하였다. EtOAc 층을 포화 염 용액으로 3번 씻었고, MgSO₄로 건조시켰으며, 용매는 농축시켰다. 생성물 16(Wang363.43-2)을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 2:1)). 수율은 55%였다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-8

예 9：

화합물 14 (0.04 mmol)를 분자체(100 mg) 및 HOBt (0.04 mmol)와 혼합시켰다. 결과물에 2 mL 처리된 DMF를 첨가하고, 아이스 염 배스(ice salt bath) 에서 냉각시키고(-18^oC) 10분간 휘저었다. 거기에 산(0.045 mmol)을 첨가하였다. 30분간 휘저은 뒤, N-에틸- N＇-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드(N-ethyl-N＇-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDCI) (0.045 mmol)를 첨가하였다. 반응은 아이스 염 배스(bath) 에서 30분간 진행되었고, 그 시스템을 실온까지 가열하였다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응이 완결된 후, 시스템을 50 mL EtOAc로 희석하였다. EtOAc 층을 100 mL 물 및 포화 NaCl 용액으로 각각 3번씩 씻었고, MgSO₄로 건조시켰으며, 용매를 농축시켰다. 생성물 17 (Wang405.49)을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 =2:1 (부피비)). 수율은 96% 이다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-9

예 10:

화합물 18 (0.063 mmol)을 MeOH／H₂O (0.8 mL/ 0.2 mL)에 녹였다. 생성된 용액을 아이스 배스에서 10분간 냉각시킨 뒤, LiOH (0.25 mmol) 를 첨가하였다. 시스템을 실온까지 서서히 가열하였고, 반응을 TLC로 추적하였다. 메틸 에스터 반응이 완료된 후, 반응용액을 농축시킨 후, 희석을 위해 물을 첨가하고, 산성이 될 때까지 HCl로 산성화시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 포화된 NaCl로 3번 씻었고, MgSO₄로 건조시킨 후, 생성물 19(Wang415.46)를 얻기 위해 용매를 농축시켰다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다.

표 1-10

예 11：

화합물 20 (0.05 mmol)을 NaHCO₃ (0.5 mmol)과 혼합시켰다. H₂O／EtOAc (0.2 mL/0.8 mL) 를 생성된 혼합물에 첨가하였고, 거기에 염화아실(0.075 mmol)을 서서히 첨가하였다. 반응은 1시간 후에 멈췄다. 반응용액은 EtOAc로 희석시켰고, 수용액층을 EtOAc로 두 번 추출하였다. EtOAc 층을 화합하고, 포화 NaCl 용액으로 3번 씻고, MgSO₄로 건조시켰고, 용매를 농축시켰다. 생성물 21(Wang537.59)을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 1:1)). 수율은 75%였다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-11

예 12：

산 (0.06 mmol) 을 CH₂Cl₂ (5 mL)에 녹였고, 아이스 염 배스(ice salt bath) 에서 냉각시켰다(-18^oC). 10분 후에, N-메틸-모르폴린(NMM) (0.075 mmol) 및 아이소뷰틸 클로로포름산 (ClCOOⁱBu) (0.065 mmol)을 차례로 추가하였다. 그 후 30분간 휘저었고, 화합물 20 (0.05 mmol)을 추가하였다. 계속해서 저어주었고, 시스템은 실온까지 서서히 가열되었다. 반응은 TLC로 추적하였다. 반응이 완료된 후 반응을 물로 정지시켰다. 반응물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 포화 염 용액으로 씻었고, MgSO₄ 로 건조시키고 농축시켰다. 생성물 22(Wang529.61-2)를 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 1:1)). 수율은 50%였다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-12

예 13：

화합물 20 (0.023 mmol) 을 분자체(100 mg) 및 HOBt (0.023 mmol)와 혼합시켰다. 생성된 혼합물을 1 mL 처리된 DMF에 첨가한 후, 아이스 염 배스에서 냉각시켰고(-18^oC), 10 분 동안 저었다. 이어서, 화합물 37 (0.023 mmol) 을 거기에 첨가하였다. 30분간 저은 뒤에, N-에틸- N＇-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 (EDCI) (0.025 mmol) 을 첨가하였다. 반응은 아이스 염 배스에서 30분간 진행하였고, 시스템은 서서히 실온까지 가열되었다. 반응이 완결된 후, 시스템을 EtOAc로 희석시켰다. 유기층을 물 및 포화 NaCl 용액으로 각각 3번 씻었고, MgSO₄로 건조시켰으며, 용매를 농축시켰다. 생성물 23(Wang715.84) 을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 1:1)). 수율은 97%였다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-13

예 14:

화합물 24 (0.023 mmol) 를 분자체 (100 mg) 및 HOBt (0.023 mmol)와 혼합시켰다. 생성된 혼합물을 1 mL 처리된 DMF 첨가하였고, 아이스 염 배스에서 냉각시켰고 (-18^oC) 10 분간 저었다. 이어서, 글리신(glycine) 메테인 에스터 (0.023 mmol) 를 첨가하였다. 30분간 계속 저은 후, N-에틸- N＇-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드 (EDCI) (0.025 mmol) 를 첨가하였다. 반응은 아이스 염 배스에서 30분간 진행되었고, 시스템은 실온까지 서서히 가열되었다. 반응이 완료된 후, 시스템을 EtOAc로 희석하였다. 유기층을 물 및 포화 NaCl 용액으로 각각 3번 씻었고, MgSO₄로 건조시켰으며, 용매를 농축시켰다. 생성물 25 (Wang715.84)를 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/ 아세트산 에틸 (부피비 1:1)). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-14

예 15:

아세토나이트릴(Acetonitrile) (0.08 mmol)을 THF (2 mL)에 녹인 후, -78→ 로 냉각시키고 뷰틸리튬 (0.1 mmol)을 첨가하였다. 반응은 10분간 수행하였다. 화합물 26 (0.08 mmol) 을 시스템에 추가하였고 반응은 -78→에서 수행하였다. 반응은 포화 NH₄Cl로 한 시간 후에 멈추었다. 반응물은 EtOAc로 추출했고, MgSO₄로 건조시킨 후 농축시켰다. 생성물 27 을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/ 아세트산 에틸 (부피비 1:1)). 수율은 56%였다. ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ1.04 (d, 3H), 1.07 (d, 3H), 2.58 (m, 1H), 2.74 (s, 3H), 4.18 (s, 2H), 5.47 (dd, 1H), 6.93 (d, 1H), 7.44-7.55 (3H), 7.83-7.86 (2H), 7.94 (s, 1H)。

예 16 :

화합물 28 (1eq)을 K₂CO₃ (10eq)와 혼합시켰다. 생성된 혼합물을 50 mL CH₂Cl₂ 에 녹였고, 화합물 29 (1.1eq)를 거기에 추가하였다. 반응의 진행은 TLC로 추적하였다. 반응용액을 농축시킨 후, 생성물 30을 얻기 위해 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 5:1)) (수율 60%). 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-15

예 17 :

a: TFA(trifluoroacetic acid), pyridine, CH₂Cl₂; b: 4N HCl/dioxane, thiophine-2-formic acid, EDCI, DMAP, DMF; c: IBX, toluene/DMSO; d: POCl₃

화합물 31(1.24g), 화합물 32 (0.82 mL), 피리딘(pyridine) (1.61 mL) 및 100 mL CH₂Cl₂ 를 혼합시킨 뒤, 거기에 TFA (0.75 mL) 를 -10^oC에서 첨가하였다. 이 온도를 유지하며 2시간 동안 반응을 수행한 후, 반응을 위해 시스템을 실온으로 가열하였다. 반응의 진행은 TLC로 추적하였다. 반응용액을 농축하고, 150 mL EtOAc에 녹였으며, 거기에 물을 첨가한 후, 1N 염산(30 mL)으로 산성화하였다. EtOAc 층을 분리하였다. 유기층을 50 mL 포화 NaCl 용액으로 3번 씻었고, MgSO₄로 건조시켰으며 유기층을 농축시켰다. 생성물 33 을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 3:1)) (1.25 g, 수율 66%). 화합물 33 (650 mg) 을 0℃ 염산에서4N 다이옥세인(dioxane) 용액(7 mL)과 혼합하였다. 반응의 진행을 TLC로 추적하였다. 반응이 완료된 후, 중간체를 얻기 위해 반응용액을 농축하였다. 중간체를 티오펜-2-폼산(thiophene-2-fromic acid )(241 mg), EDC I(392 mg), DMAP (42 mg) 및 피리딘(pyridine) (0.3mL)과 혼합하고, 거기에 DMF (7 mL) 를 첨가하였다. 반응은 실온에서 수행하였고, TLC로 추적하였다. 반응이 완료된 후, 시스템을 100 mL EtOAc로 희석하였다. 유기층을 100 mL 물 및 50mL 포화 NaCl 용액으로 각각 세 번씩 씻었고, MgSO₄로 건조시켰으며, 유기층을 농축시켰다. 화합물 34를 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/아세트산 에틸 (부피비 1:1)) (220 mg). 화합물 34 (90 mg)를 IBX (77.5 mg)와 혼합시켰고, 거기에 톨루엔/DMSO ( 1 mL/0.5 mL)의 혼합용매를 첨가하였다. 반응은 50℃에서 두 시간 동안 수행하였고, 고체를 진공 여과로 제거하였다. 여과물을 100mL 에틸 에테르로 희석시켰고, 50mL 포화 NaHCO₃ 용액으로 세 번 씻고, MgSO₄로 말렸다. 화합물 35를 얻기 위해 유기층을 농축시켰다 (80 mg). 화합물 35 (25 mg)를 POCl₃ (0.5 mL)와 혼합시키고 80℃로 가열하였다. 반응의 진행은TLC로 추적되었다. 이어서 반응용액을 0℃의 50 mL 포화 중탄산염나트륨 (NaHCO₃) 용액에 부었다. POCl₃ 를 제거하였다. 그 후, 반응물을 50 mL 아세트산 에틸로 추출하였고, 50 mL 포화 NaCl 용액으로 세 번 씻고, MgSO₄로 건조시키고, 유기층을 농축시켰다. 화합물 36을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다(페트롤륨 에테르/ 아세트산 에틸 (부피비 2:1)) (8 mg).

표 1-16

예 18:

화합물 37 (1 mmol)을 디클로로메테인에 녹이고, 1.2 Eq 염화 옥살릴(oxalyl) 을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 섞었다. 반응용액이 마른 후, 디클로로메테인을 거기에 첨가한 후, 1.5 Eq 아미노벤젠을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 몇 시간 동안 저은 후, 물을 첨가하고, 디클로로메테인으로 두 번 추출했다. 유기층을 1N 염산으로 두 번, 포화된 소금물로 한 번 씻은 후, MgSO₄로 건조시키고 유기층을 농축시켰다. 생성물 38(C343)을 얻기 위해 혼합물을 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 다음 화합물들을 같은 방법으로 합성하였다:

표 1-17

실험예

실험예 1: 항 B형 간염 바이러스( HBV ) 활성 시험

1. 실험목적:

본 발명의 합성 화합물을 항 B형 간염 바이러스(HBV) 활성에 대해 스크리닝하였다. 실험은 시험 화합물의 세포독성, B형 간염 바이러스의 표면항원 및 핵심항원의 분비와 바이러스-세포 레벨 실험에서 바이러스 핵산(DNA)의 복제 수준에 미치는 시험 화합물의 영향에 관한 실험을 포함한다.

2. 실험의 원리:

B 형 간염 바이러스(HBV) 유전자변형 사람 간암세포, HepG2.2.15 세포주, 는 배양될 때 B형 간염 바이러스 입자(항원과DNA를 포함)를 상층액에 분비할 수 있다.

항 바이러스 약의 작용 하에, 세포로부터 상층액으로 분비된 HBsAg, HBeAg 및 바이러스 DNA의 함량을 탐지하고 약이 없는 대조구의 함량과 비교하여, 본 발명 화합물의 세포독성 효과뿐만 아니라 항바이러스 활성을 측정할 수 있었다. MTT 방법으로 측정하고 50%의 세포를 죽게 하는 본 발명 화합물의 밸류 농도(value concentration)은 CC₅₀이며; ELISA 방법으로 탐지할 때 HBsAg 및 HBeAg 의 분비를 억제하고, 형광 정량(fluorescent quantification) PCR 방법으로 탐지할 때 50% 의 바이러스 DNA 복제를 억제하는 본 발명 화합물의 밸류 농도은 IC₅₀ 이다.

3. 시료:

시험 화합물 용액을 사용하기 전에 준비하였다. 각각의 화합물을 7개의 희석 농도에서 시험하였고, 각각의 경우 시험반응이 일반적인지 아닌지를 알아보기 위해 람미부딘(lamivudine) 등과 같은 항바이러스 약들을 양성 대조구로 사용하였다.

4. 방법:

a) 실험방법 및 배양 상층액의 수집

HepG2.2.15 세포들을 96-웰 플레이트에 주입하고, 다음 날 본 발명 화합물을 첨가하였다. 같은 농도의 배지 및 화합물 용액을 주기적으로 교체하였다. 배양 상층액을 탐지될 8일째에 수집하였다. MTT 를 96-웰 플레이트 상에서 세포에 첨가하였고, MTT 가 녹은 용액을 4시간 후에 첨가하여 밤새 반응시켰다. 다음날 OD₅₇₀ 을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. 그리고 HepG2.2.15 세포에 대한 본 발명 화합물의 세포독성, 본 발명 화합물이 세포 성장에 미치는 영향, 및 50% 의 세포를 죽게 하는 본 발명 화합물의 농도를 OD 값에 따라 측정하였다.

b) 배양 상층액에서 HBsAg 및 HBeAg 함량의 탐지 (ELISA 방법):

HBsAg 및 HBeAg 를 검정키트(Sino-American biotechnological company로부터 구매)로 탐지하였다. 시료를 코팅된 스트립 플레이트(coated strip plate)에 첨가하고, 같은 양의 효소 레이블된 컨쥬게이트(enzyme labeled conjugate)를 첨가하였고, 37℃ 이하에서 1 시간 동안 반응한 후에, 플레이트를 5번 씻었다. 색소 용액 A 및 B를 첨가하였고, 반응은 15분 후에 멈췄으며, OD₄₅₀ _/630 을 측정하였다. HBV 항원에 대한 시료의 반억제율(half inhibition rate) IC₅₀ 을 OD 값에 따라 측정하였다.

c) 형광 정량 PCR 에 의한 배양 상층액에서의 HBV-DNA 함량 탐지:

적정양의 배양 상층액을 같은 부피의 바이러스 추출 용액에 첨가하고, 균일하게 섞은 후 끓였다. 그 후, 10000 rpm 으로 5 분간 실온에서 원심분리하였다. 적정양의 상층액을 PCR 증폭을 위해 수집하였다. 표준곡선(standard curve)을 만들기 위해 5개의 HBV-DNA 표준시료들을 사용하였다. 수집된 바이러스 DNA 복제 값에 따라, 본 발명 화합물의 다른 농도에서의 HBV-DNA 복제 억제율을 계산하였고, 그 후 IC₅₀을 얻기 위해 반억제율(half inhibition rate)을 계산하였다. IC₅₀ 을 계산할 수 없는 시료들에 대해서는, IC_X 로 표시하고 대응하는 농도 값을 주었다.

실험에 사용한 PCR 프라이머들은 다음과 같다:

P1: 5＇ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3＇

P2: 5＇ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3＇

실험에 사용한 PCR 프로브(probe)들은 다음과 같다:

5＇TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3＇

5. 실험결과:

표 2-1

표 2-2

표 2-3

Note: CC₅₀ 은 본 발명 화합물이 HepG2.2.15 세포 성장에 미치는 영향인, 50％ 사멸 농도이다. IC₅₀ 은 본 발명 화합물이 50% 의 항원 또는 DNA 복제를 억제하는 농도이다. SI 는 본 발명 화합물의 생물학적 활성의 선별계수(selection coefficient)이다. SI 값>2 은 효율적이며, 더 클수록 더 좋은 것이다. NC 는 뚜렷한 생물학적 활성을 보이지 않거나 측정할 수 없는 경우를 의미한다. NT 는 시험되지 않은 경우를 나타낸다.

실험예 2: 항 인플루엔자 바이러스, 헤르페스 바이러스, HIV -1 리버타아제 , HIV 인티그라제의 활성 시험

생물학적 활성 시험:

1. 항 HIV-1 리버타아제 활성에 대한 화합물의 스크리닝:

HIV-1 리버타아제 반응하는 주형을 플레이트 위에 코팅하였고, 적정화된 효소 반응조건 및 반응시스템에서 HIV-1 RT 는 바이오틴-dUTP 를 함유한 기질을 반응 주형에 추가할 수 있다. 효소 반응 결과물에서 바이오틴-dUTP 투입양은 효소 활성을 반영하기 위해 스트렙타비딘 표지 호스 라디쉬 퍼옥시다아제에 의해 탐지되었다. 반응 시스템에서 본 발명 화합물의 첨가는 효소 억제제(inhibitor)를 스크리닝하는데 사용할 수 있다.

2. 항 HIV-1 인티그라제 활성에 대한 화합물의 스크리닝:

합성된 30 올리고뉴클레오티드 (5＇P-ACC CTT TTA GTC AGT GTG GAA AAT CTC TAG CAGT -3＇, 3＇-GAA AAT CAG TCA CAC CTT TTA GAG ATC GTCA-5＇)를 제공 기질(donor substrate)로 사용하였고, 합성된 20 올리고뉴클레오시드 (5＇-TGA CCA AGG GCT AAT TCA CT-3＇-biotin, biotin-3＇-ACT GGT TCC CGA TTA AGT GA-5＇)를 표적 기질(target substrate)로 사용하였다. 96-웰 플레이트 상에서, ELISA 반응을 수행하기 위해 제공 기질을 정제된 HIV-1 인티그라제와 함께 첨가하였다. 바이오틴 표지된 알칼라인 포스파타아제시스템에서, 표적 DNA의 사슬전달(chain transfer) 산물을 탐지하고, OD 값을 마이트로플레이트 리더로 측정하였다. 반응 시스템에서 본 발명 화합물의 추가는 효소의 억제제를 스크리닝하는데 사용할 수 있다.

3. 항-헤르페스 바이러스 I 및 II 활성에 대한 화합물의 스크리닝:

헤르페스 바이러스 I 및 II에 의해 유발된 Vero(African green monkey 신장) 세포의 세포병변효과(cytopathic effect)에 본 발명 화합물이 미치는 억제효과를 시험하기 위해 Vero 세포를 바이러스 숙주로 사용하였다.

4. 항-인플루엔자 바이러스 A 및 B 활성에 대한 시료의 스크리닝:

항-인플루엔자 바이러스 A 및 B 에 의해 유발된 MDCK (canine 신장) 세포의 세포병변효과(cytopathic effect)에 본 발명 화합물이 미치는 억제효과를 시험하기 위해 MDCK 세포를 바이러스 숙주로 사용하였다.

화합물의 일부 실험결과: IC₅₀, TC₅₀ (unit: mg/ml)。

표 3-1

Note: (1) 표에서 “-” 은 시료를 최대 비독성 투여량(maximal nontoxic dose) 으로 처리했을 때 항 헤르페스 바이러스 활성이 없는 것을 나타낸다. (2) TC₅₀: 50% 독성 농도; IC₅₀: 바이러스의 50% 억제 농도; SI＝TC₅₀／IC₅₀.

표 3-2

Note: TC₅₀: 50% 독성 농도; IC₅₀: 바이러스의 50% 억제 농도; SI＝TC₅₀／IC₅₀.

표 3-3

Note: (1) “-” 은 초기 농도에서 시료가 항 HIV-1프로테아제 및 HIV-1인테그라제 억제 활성을 갖지 않는 것을 나타낸다. 넬피나이비어(Nelfinaivir) 및 아키린테스 비덴타타 폴리사카라이드(Achyrnthes bidentata polysaccharides; ABPS-y) 는 각각 HIV-1프로테아제 및 HIV인테그라제의 억제활성 측정을 위한 양성 대조구이다.

Claims

하기 구조식으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 바이러스 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:

상기 구조식에서,
R₂ 및 R₃는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
R₂ 및 R₃는 서로 결합하여 벤젠고리를 형성할 수 있으며;
R₆는 수소, 할로겐 원자, 페닐, 할로페닐, C2-C6 알켄일, C3-C6 사이클로알킬, C1-C2 알콕시카보닐, C1-C13 알킬 또는 스티릴이고;
R₇은 수소, 할로겐 원자, 페닐, 할로페닐, C2-C6 알켄일, C3-C6 사이클로알킬, C1-C2 알콕시카보닐 또는 C1-C13 알킬이며;
X₁은 CH이고;
X₄는 S이며;
Y₁은 O, S 또는 NH이고;
Y₄는 N이다.
제 1 항에 있어서, 상기 R₆는 수소, 할로겐 원자, 페닐, 할로페닐, C2-C6 알켄일, C3-C6 사이클로알킬, C1-C13 알킬 또는 스티릴이고; R₇은 수소, 페닐 또는 C1-C2 알콕시카보닐인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화합물은
(Wang278),
(Wang292),
(Wang264-1),
(Wang222-1),
(Wang278-1),
(Wang404),
(Wang276),
(Wang350),
(Wang264),
(Wang298),
(C226),
(C262),
(C324),
(C304),
(C292),
(C328),
(C321-2),
(C223),
(C337),
(C243),
(C295-1),
(C309),
(C345),
(C279-3),
(C263-2),
(C325),
(C305-1),
(C321-1),
(C321-3),
(Wang260),
(C227),
(C307),
(C279-2),
(C293) 및
(C329)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 바이러스 질환은 인플루엔자 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 AIDS 바이러스로부터 유발된 바이러스 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.