KR20100134093A

KR20100134093A - 미생물의 검출 및 계수

Info

Publication number: KR20100134093A
Application number: KR1020107024739A
Authority: KR
Inventors: 야니끄 포베; 샘 뒤캉; 아드리안 듀크레
Original assignee: 바스프 에스이; 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄 (쎄엔알에스)
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2010-12-22
Also published as: EP2262910A1; AU2009231362B2; IL208158A0; PT2262910E; HRP20120553T1; AU2009231362A1; KR101265412B1; MY149655A; WO2009121727A1; RS52445B; JP2011516052A; EP2262910B1; CA2719863A1; ES2389861T3; CA2719863C; RU2477319C2; CY1114785T1; RU2010144839A; US20110076686A1; DK2262910T3

Abstract

본 발명은 (1) 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 세포 영양소 공급원 및 세포 증식 억제제와 접촉시키는 단계, (2) 상기 샘플을 생육성 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계, (3) 형광 신호를 검출 및 정량하는 단계를 포함하고, 이때 미생물이 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종의 미생물이고, 세포 증식 억제제가 시프로플록사신 및 세팔렉신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내의 생육성 미생물을 검출 및 계수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 (1) 세포 영양소 공급원, (2) 세포 증식 억제제, (3) 상기 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브, (4) 형광 신호를 검출 및 정량하기 위한 수단을 포함하고, 이때 세포 증식 억제제가 시프로플록사신 및 세팔렉신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 키트를 또한 포함한다.

Description

미생물의 검출 및 계수{DETECTION AND ENUMERATION OF MICROORGANISMS}

본 발명은 샘플 내의 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종의 생육성 미생물을 검출 및 계수하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 방법에서 사용하기에 적절한 키트를 포함한다. 이러한 방법 및 키트는 생육성 미생물을 더욱 신속하게 정량할 수 있도록 한다.

레지오넬라(Legionella) 박테리아는 습식 또는 습윤 환경, 예컨대 토양 및 비-해양 수생 서식지에서 편재성이다. 이는 온수 및 냉수 수리 시설, 에어 컨디셔닝 시스템의 냉각탑 및 가습기에서 또한 발견될 수 있다.

레지오넬라, 특히 레지오넬라 뉴모필라는 "재향군인병"으로 일반적으로 알려진 급성 세균성 페렴을 야기할 수 있는 병원체이고, 상기 질환은 종종 감염 개체에게 치명적이다.

전통적으로, 레지오넬라 뉴모필라의 검출 및 계수는 세포 배양에 의해 달성된다. 이러한 방법은 배양가능한 박테리아를 플레이트 카운트를 사용하여 측정함으로써 또는 필터 막 방법을 이용하여 마이크로콜로니를 측정함으로써 달성될 수 있다. 이러한 기술들은 생육성 박테리아를 콜로니 또는 마이크로콜로니를 형성하는 이의 능력에 의해 평가한다. 불행하게도, 일반적으로 이러한 방법은 콜로니 또는 마이크로콜로니가 형성되도록 하기 위해 3일 내지 10일을 필요로 한다. 수리 시설이 여전히 조업 중인 경우에, 이러한 시간 동안 허용불가능한 인간 감염 위험이 있다.

전체 레지오넬라 미생물을 검출하기 위한 또다른 방법에는 PCR (중합효소 연쇄 반응) 기술이 포함된다. PCR은 DNA 중합효소를 사용하여 효소에 의한 시험관내 복제에 의해 DNA 조각을 증폭시킨다. 이러한 기술이 진행되는 동안, 생성된 DNA가 복제를 위한 주형으로 사용되고, 이는 DNA 주형이 기하급수적으로 증폭되는 연쇄 반응을 초래한다. PCR은 DNA 조각의 단일 카피 또는 소수의 카피를, 이러한 DNA 조각의 수백만 개 이상의 카피를 생성시킴으로써, 증폭되도록 할 수 있다. 전형적으로, 이러한 방법이 문헌[Diederen et al., J Med Microbiol. 2007 Jan; 56 (Pt 1):94-101]에 기술되어 있다.

그러나, PCR의 단점은 샘플이 중합 반응 억제제를 함유하는 경향이 있고, 따라서 정량적인 결과를 일관되게 제공하지 않는다는 것이다. 또한, 이러한 기술은 선행하는 DNA 정제 단계에 의존하고, 이는 DNA의 손실과 이에 따른 존재하는 레지오넬라의 과소평가를 초래할 수 있다. 어느 정도까지는, 정량적인 실시간 PCR에 의해 이러한 불이익이 극복된다. 그러나, 이러한 기술은 생육성 세포와 비-생육성 세포를 구별할 수 없다.

또다른 기술은 형광 물질로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브가 박테리아 세포 내로 침투하는 형광 원위치 혼성화 (FISH)이다. 표적으로 공지된, 프로브에 대한 정확한 서열이 리보솜 핵산 (rRNA)에 있는 경우, 프로브는 자신을 자신의 표적에 부착시킬 것이고, 어떠한 후속 세정 단계에 의해서도 제거되지 않을 것이다. 그후, 프로브가 내부에 고정된 박테리아는 형광 신호를 방출할 것이다. 그후, 이러한 형광 신호를 유동 세포측정법, 고체 상 세포측정법, 또는 에피형광(epifluorescent) 현미경검사법과 같은 기술에 의해 정량할 수 있다. 전형적인 FISH 기술이 문헌[Dutil S et al J Appl Microbiol. 2006 May;100(5):955-63]에 기술되어 있다. 그러나, FISH 기술을 단독으로 사용하여, 생육성 레지오넬라 뉴모필라의 총 개수를 검출할 수 있지만, 불행하게도 이러한 방법은 분열할 수 있고, 결과적으로 콜로니를 제조할 수 있는 레지오넬라 뉴모필라 박테리아만을 배타적으로 확인할 수 없다.

생육성 레지오넬라 뉴모필라를 계수하기 위한 추가적인 방법은 켐크롬(ChemChrome) V6을 포함하고, 문헌[Delgado-Viscogliosi et al Appl Environ Microbiol. 2005 Jul;71(7):4086-96]에 기술되어 있다. 이러한 방법은 레지오넬라 뉴모필라의 정량, 뿐만 아니라 생육성 박테리아와 비-생육성 박테리아 간의 구별을 허용한다. 이는 항체 및 박테리아 생육성 마커 (켐크롬 V6)를 사용하여 레지오넬라 세포를 특이적으로 검출하는 것과 계수를 위해 에피형광 현미경검사법을 이용하는 것을 조합한다. 그러나, 이러한 기술이 생육성 세포와 비-생육성 세포를 구별하지만, 이는 콜로니-형성 박테리아를 별도로 확인할 수 없다.

현재까지, 분열할 수 있는 레지오넬라 뉴모필라 박테리아의 검출을 가능케 하는 유일한 방법은 마이크로콜로니 방법 (Scan-VIT)을 기초로 하였다. 그러나, 이러한 방법은 약 72시간을 필요로 한다.

문헌[Arana et al. "Detection and enumeration of viable but non-culturable transconjugants of Escherichia coli during the survival of recipient cells in river water" pp 340-346, J. App. Microbiol. Vol 83, 1997]에는 특이적 마커를 사용하는 직접 생균수 카운트 (DVC)의 사용이 기술되어 있다.

문헌[Piqueres et al. "A combination of direct viable count and fluorescent in situ hybridisation for estimating Helicobacter pylori cell viability" pp 345-349 Res. Macrobiol. Vol 157, 2006] 및 문헌[Jjemba et al. "In situ enumeration and probing of pyrene degrading soil bacteria" pp 287-298 FEMS Microbiol. Ecol. Vol. 55, 2006] 둘다에 DVC-FISH가 언급되어 있지만, 레지오넬라 뉴모필라와 관련되지 않은 미생물에 관한 것이다.

EP-A-1852512에 레지오넬라 뉴모필라가 포함되는 여러 병원성 미생물의 확인 및 계수를 위한 방법이 기술되어 있다. 직접 생균수 카운트 (DVC) 및 형광 원위치 혼성화 (FISH)가 이러한 방법에 혼입되지만, 신호를 증폭시키기 위해 헬퍼(helper) 프로브가 또한 사용된다. 헬퍼 프로브는 표지된 특이적 프로브가 표적으로 하는 영역에 인접한 영역에 결합하는 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드이다. 이는 원위치 접근성을 강화하고, 따라서 프로브가 부여하는 신호를 강화한다.

EP-A-1852512에 기술된 방법은 날리딕스산과 같은 DNA 자이레이스(gyrase) 억제제를 사용하는 것으로 언급되고, 이는 세포 분열을 정지시키고, 민감성 세포의 세포 길이 및 세포내 rRNA 함량을 증가시킨다. 그러나, 실제로는, 날리딕스산은 레지오넬라 뉴모필라에 대한 신뢰할 수 있게 효과적인 DNA 자이레이스 억제제가 아니다. 또한, 이러한 문헌에는 본래 형광성인 미생물의 존재로 인해 발생할 수 있는 부정확한 계수의 문제점이 언급되어 있지 않다.

공지된 기술보다 더욱 신속하게 샘플 내의 콜로니를 형성할 수 있는 생육성 레지오넬라 뉴모필라를 신뢰할 수 있게 정량하는 방법이 바람직할 것이다. 또한, 이를 더욱 정확하게 달성하는 것이 바람직할 것이다.

본 발명에 따라, 본 발명자들은

(1) 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 세포 영양소 공급원 및 세포 증식 억제제와 접촉시키는 단계,

(2) 상기 샘플을 생육성 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계,

(3) 형광 신호를 검출 및 정량하는 단계

를 포함하고, 이때 미생물이 레지오넬라 뉴모필라 종의 미생물이고, 세포 증식 억제제가 시프로플록사신 및 세팔렉신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내의 생육성 미생물을 검출 및 계수하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 단계 (1)에서 처리된 샘플 상에서 단계 (2)가 수행된 후, 단계 (2)에 이어서 단계 (3)이 수행되어, 각각의 단계가 순차적으로 수행된다.

본 발명의 방법의 단계 1은 세포 대사를 악화시키지 않으면서 세포 분열을 차단하는 항생제 또는 DNA 자이레이스 억제제의 존재 하에 박테리아를 인큐베이션하는 것을 기초로 하는 직접 생균수 카운트 (DVC: Direct Viable Count)로 공지되어 있다. 따라서, 살아 있는 박테리아는 생장하지만 분열하지는 않는 경향이 있을 것이어서, 크기가 변하지 않는 죽은 박테리아와 구별될 수 있다. 따라서, 살아 있는 박테리아를 현미경검사법에 의해 확인하는 것이 가능하다. DVC 단계를 수행하기 전에, 샘플을 농축하고 이를 예를 들어 프랑스 표준 협회 (French Association of Normalization (AFNOR))(11, Avenue Francis de Pressense-93571 St Denis La Plaine Cedex, France)가 편집 & 배포한 표준 방법 T 90-431 (ISSN 0335-3931)에 따라 산 및/또는 열 처리로 예비-처리하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명자들은 시프로플록사신 및 세팔렉신이 매우 효과적인 DNA 자이레이스 억제제임을 뜻밖에 발견하였다. 시프로플록사신 및 세팔렉신 양쪽 모두 레지오넬라 뉴모필라 세포가 세포 분열에 대비하여 생장하도록 허용하지만, 실제로는 이러한 생장된 세포가 분열하는 것을 차단한다. 대조적으로, 날리딕스산은 본 발명의 방법에 효과적이도록 레지오넬라 뉴모필라 세포의 충분한 생장을 제공하지 않는다. 유리하게, 본 발명자들은 본 발명의 방법이 레지오넬라 뉴모필라가 신뢰할 수 있게, 그리고 보통 24시간 미만의 기간 이내에 확인 및 정량될 수 있도록 한다는 것을 발견하였다. 이는 수질 위생 제어에서 상당한 개선을 제공한다.

시프로플록사신 또는 세팔렉신은 임의의 유효량으로 사용될 수 있다. 전형적으로, 이는 세포 영양소 공급원 내에 함유된 배지에서 20 ㎎/ℓ 이하 또는 그 초과의 농도일 것이다. 바람직하게는, 농도는 1 ㎎/ℓ 내지 10 ㎎/ℓ이다. 바람직하게는, 세포 증식 억제제는 시프로플록사신이다. 본 발명자들은 시프로플록사신의 농도가 12시간의 기간 후에 2 ㎎/ℓ 내지 6 ㎎/ℓ, 특히 3 ㎎/ℓ 내지 5 ㎎/ℓ일 때 최대 세포 생장이 달성될 수 있음을 발견하였다.

세포 영양소 공급원은 DVC 방법에 적용가능하고 레지오넬라 뉴모필라에 적절한 임의의 적절한 성장 배지 조성물을 함유하여야 한다. 적절한 배지 조성물은 배지, 선택적 보충물, 세포 증식 억제제 (시프로플록사신 또는 세팔렉신), 및 성장 보충물을 포함할 수 있다.

배지는 레지오넬라 뉴모필라의 성장을 허용하는데 필요한 최소 영양물을 제공한다. 이는 문헌에 기술된 바와 같은, 예를 들어, 표준 방법 처방전 T 90-431 (상기 제공된 바와 같음)에 따른, 한천 및 숯이 없는 임의의 적절한 배지일 수 있다.

선택적 보충물은 방해 미생물의 발달을 제한하기 위해 종종 요구된다. 항생제의 선택은 DVC 방법에 적절한 임의의 공지된 보충물일 수 있고, 예를 들어, 표준 방법 T 90-431 (상기 제공된 바와 같음)에 기술되어 있다. 그렇지만, 일반적으로 각각의 항생제의 농도는 특정 액체 배지에 대해 개조되어야 한다. 그러나, 일반적으로 단계 2가 방해 박테리아의 효과를 극복하도록 충분히 특이적일 것이기 때문에 이러한 다른 미생물들이 완전히 제거되지 않는 경우에 반드시 해롭지는 않을 것이다.

성장 보충물이 레지오넬라 뉴모필라 박테리아의 성장을 허용하는데 필수적이지는 않지만, 이는 상기 박테리아의 성장을 최적화할 수 있다. 레지오넬라 뉴모필라는 120분 이내의 배가 (최적의 조건 하에)를 특징으로 한다. 그러나, 본 발명자들은 콜로니를 형성할 수 있는 생육성 레지오넬라 뉴모필라 박테리아가 일부 경우에는 반드시 즉각적으로 콜로니를 형성하지는 않을 수 있고, 대신 성장 개시 전에 지연기 또는 지체기를 겪을 수 있음을 발견하였다. 이러한 지체기는 초기 생리학적 상태와 관련되어 8시간 내지 20시간 초과일 수 있다.

본 발명의 바람직한 형태에서, 성장 보충물 및 항산화제 시약을 세포 영양소 공급원 내에 포함시킴으로써 레지오넬라 뉴모필라에 대한 지체기가 감소될 수 있다. 항산화제 시약은 활성 산소 종 (ROS) 상에 직접적으로, 또는 ROS에서의 감소를 초래하는 미생물의 대사에 대한 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 야기하는 것과 같은 또다른 수단에 의해 작용할 수 있다. 적절한 항산화제 시약에는 카탈레이스(catalase), 아스코르브산, 메타중아황산나트륨, 디메틸 술폭시드, TDPA (3,3'-티오디프로피온산) 및 피루베이트 등이 포함된다. 바람직하게는, 항산화제 시약은 피루베이트이다. 항산화제 시약의 바람직한 용량, 특히 피루베이트에 대한 용량은 0.5 g/ℓ 내지 1.5 g/ℓ, 특히 약 1 g/ℓ이다.

세포 영양소 공급원은 간접적으로 활성 산소 종 (ROS)의 형성을 억제하고/하거나 이를 분해하는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있고, 상기 화합물은 미생물의 대사를 방해함으로써 ROS의 수준 감소를 초래할 수 있다. 전형적으로, 이러한 화합물은 아미노산 또는 이의 염을 포함할 것이다. 특히 바람직한 화합물은 글루탐산 또는 글루타메이트 염이다.

본 발명의 추가로 바람직한 형태에서, 세포 영양소 공급원은 글루탐산 또는 글루타메이트 염, 특히 나트륨 염을 포함할 것이다. 일반적으로, 글루탐산 또는 글루타메이트의 양은 0.01 중량％ 내지 5 중량％일 것이다 (나트륨 염으로 계산됨).

세포 영양소 공급원이 피루브산 또는 피루베이트 (특히, 나트륨 염)을 글루탐산 또는 글루타메이트 (특히, 나트륨 염)과 함께 모두 포함하는 것이 특히 바람직하다. 피루브산 또는 피루베이트와 글루탐산 또는 글루타메이트의 이러한 조합은 각각 단독으로 사용된 어느 한쪽 화합물보다 배양가능한 레지오넬라의 더 높은 추정치 (그리고 따라서 더 정확한 추정치)를 허용한다는 점에서 상승작용성 효과를 유도하는 것으로 보인다. 또한, 본 발명자들은 이러한 조합이 레지오넬라 뉴모필라의 발달, 특히 액체 배지에서의 발달 동안 지체기의 추가적인 감소를 초래한다는 것을 발견하였다. 액체 배지에서의 이러한 지체기 감소는 한천 플레이트 상에서 가시적인 콜로니를 수득하기 위해 필요한 시간을 감소시킨다.

바람직하게는, 피루베이트 및 글루타메이트의 양은 기존에 언급된 바와 같을 것이다. 글루타메이트 대 피루베이트의 비율이 1:1 내지 50:1, 특히 5:1 내지 20:1, 더욱 특히 7:1 내지 15:1의 범위인 것이 특히 바람직하다.

글루타메이트는 항산화제인 것으로 공지되어 있지 않다. 그러나, 간접적으로 글루타메이트가 성장 동안 자연적으로 형성된 ROS의 내인성 생산 또는 거대분자에 대한 이의 결과 (산화)를 감소시킬 수 있다는 것이 명백하다.

이론에 제한되지 않으면서, 피루베이트의 효과를 증가시키도록 글루탐산이 레지오넬라의 대사를 변화시키고, 레지오넬라 대사의 이러한 방해가 간접적으로 세포내 ROS의 형성을 억제하고/하거나 이를 분해하는 것으로 생각된다.

본 발명의 방법은 더 짧은 인큐베이션 기간, 바람직하게는 약 24시간 이하를 사용할 수 있도록 한다. 바람직하게는, 특히 박테리아 방해 발생이 낮고/낮거나 레지오넬라 뉴모필라 박테리아 발생이 높은 경우에, 이러한 기간이 12시간으로 감소될 수 있다.

임의의 적절한 장소에서 샘플을 수집할 수 있다. 예를 들어, 이는 냉각 시스템 내의 재순환수로부터의 물의 샘플일 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 에어로졸 형태의 물로부터 샘플이 수득될 수 있다. 전형적으로, 에어로졸은 냉각탑 또는 에어 컨디셔너 내에 위치할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 따른 테스트 전에 에어로졸로부터 물이 응축된다.

인큐베이션 방식은 DVC 절차가 기술된 문헌에 정의된 대로일 수 있다. 이러한 방법은 샘플 여과, 및 그후의 배지에 적신 패드 상에서의 필터 인큐베이션을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따르면, 샘플 또는 농축된 샘플이 배지와 함께 직접 인큐베이션된 후 여과된다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 인큐베이션 프로세스 동안 박테리아가 손실되는 위험을 감소시킬 수 있고, 인큐베이션 동안 더 양호한 조건, 예를 들어, 산소 전달 또는 샘플의 교반을 제공할 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 2는 표준 FISH 프로토콜을 사용할 수 있다.

FISH 절차의 첫번째 부분에서, 세포의 외막 또는 외피를 처리하여 이를 올리고뉴클레오티드 프로브에 대해 투과성이게 함으로써 세포를 고정할 수 있다. 일반적으로, 이는 25℃에서 물과 혼화성인 알코올 또는 알데하이드의 수용액인 고정액을 사용함으로써 달성될 것이다. 적절한 알코올 또는 알데하이드에는 포름알데하이드, 파라포름알데하이드, 에탄올 및/또는 메탄올이 포함된다. 전형적으로, 포름알데하이드 또는 파라포름알데하이드의 용액은 10 중량％ 이하, 바람직하게는 1 중량％ 내지 5 중량％일 수 있다. 보통, 알코올은 50 중량％ 이상, 일반적으로는 60 중량％ 내지 90 중량％일 것이다. 바람직하게는, 이러한 용액들 중 하나 이상으로의 순차적인 처리에 의해 이러한 처리가 달성될 수 있다. 바람직하게는, 처리는 1％ 내지 5％의 포름알데하이드 또는 파라포름알데하이드의 용액에 이어지는 50％ 내지 90％의 증가되는 농도의 에탄올 또는 메탄올의 2가지 또는 3가지 용액을 포함할 수 있다.

그후, 형광 마커가 부착된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 혼성화 완충제를 사용하는 것에 의한 혼성화 절차가 FISH 절차에서 사용되고, 이때 상기 올리고뉴클레오티드는 세포 내의 특이적 서열을 표적화할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 세포의 외막을 투과하고, 올리고뉴클레오티드에 상응하는 표적 서열에 결합한다. 결합은 상보적 핵산 조각들 간의 수소 결합의 형성을 의미하는 것으로 이해될 것이다. FISH 기술에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 미생물 내의 리보솜 표적 서열의 특정 영역에 대해 상보적이고 이에 결합할 수 있다. 전형적으로, 프로브는 단일 가닥 데옥시리보핵산 조각으로서 길이 면에서 15개 내지 30개의 염기를 포함하고, 미생물에 대해 특이적인 특이적 표적 영역에 대해 지시된다.

바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 프로브는 레지오넬라 뉴모필라의 특이적 리보솜 ARN 16S 프로브여야 한다. 레지오넬라 뉴모필라 종의 미생물을 특이적으로 표적화하는 임의의 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 5' 3' 염기 서열이 ATC TGA CCG TCC CAG GTT인 문헌[Grimm et al 1998]에 기술된 PNE 1 프로브, 5' 3' 염기 서열이 ATCTG ACCGT CCCAG GTT인 문헌[Grimm et al 1998] 및 문헌[Declerck et al 2003]에 기술된 LEGPNE 1 프로브 (서열 22), 및 5' 3' 염기 서열이 AGCTT TCATC CAAAG ATA인 문헌[Yamamoto et al 1993]에 기술된 LP2 프로브 (서열 23)로 구성된 군으로부터 선택될 것이다.

PNE 1 프로브, LEGPNE 1 프로브 또는 LP2 프로브의 3가지 프로브 중 임의의 것과의 동일성이 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상인 서열의 프로브를 별법적으로 사용하는 것이 또한 바람직할 수 있다.

본래 형광성인 잘못 확인된 미생물의 위험을 극복하기 위해, 본 발명의 바람직한 형태는 2개의 뉴클레오티드 프로브를 사용한다. 1개의 프로브는 레지오넬라 속으로부터의 모든 미생물을 표적으로 하고, 제2 프로브는 레지오넬라 뉴모필라 종의 미생물에 특이적으로 혼성화되도록 고안된다. 각각의 프로브는 상이한 형광 염료로 표지된다. 본래 형광성인 미생물은 특정 파장 또는 좁은 대역의 파장에서만 형광성일 것이고, 따라서 상이한 파장에서 형광을 내는 상이한 염료와 함께 2개의 프로브를 사용하는 것은 명확하게 레지오넬라 뉴모필라가 아닌 본래 형광성인 미생물이 제거되도록 한다.

본 발명의 이러한 바람직한 형태에서, 제1 프로브는 레지오넬라 롱베아카에(Legionella longbeachae), 레지오넬라 조르다니스(Legionella jordanis), 레지오넬라 아니사(Legionella anisa), 레지오넬라 뉴모필라를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 레지오넬라 속에 속하는 미생물에 혼성화될 것이다. 이러한 제1 프로브는 레지오넬라 속 내의 임의의 박테리아로부터의 표적 리보솜 서열과 결합할 수 있는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 제1 프로브는 5' 3' 염기 서열이 CTGGT GTTCC TTCCG ATC인 만츠 등의 문헌[Manz et al. 1995]에 기술된 LEG705 프로브 (서열 7), 5' 3' 염기 서열이 TCGGA CGCAG GCTAA TCT인 만츠 등의 문헌[Manz et al. 1995]에 기술된 LEG226 프로브 (서열 8), 5' 3' 염기 서열이 CCTCC TCCCC ACTGA AAGT인 레스켈라 등의 문헌[Leskela et al. 2005]에 기술된 Legall11 프로브 (서열 9), 5' 3' 염기 서열이 CACTG TATGT CAAGG GTAGG인 레스켈라 등의 문헌[Leskela et al. 2005]에 기술된 Legall22 프로브 (서열 10), 5' 3' 염기 서열이 AAGGC ATATT CCTAC GCG인 부흐바인더 등의 문헌[Buchbinder et al. 2002]에 기술된 Leg120v 프로브 (서열 11)로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 프로브일 수 있다.

LEG705 프로브, LEG226 프로브, Legall11 프로브, Legall22 프로브, 및 Leg120v 프로브의 5가지 프로브 중 임의의 것과의 동일성이 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상인 서열의 프로브를 별법적으로 사용하는 것이 또한 바람직할 수 있다.

제2 프로브는 특정 종인 레지오넬라 뉴모필라에만 혼성화될 수 있고, 이러한 특징이 있는 상기 언급된 뉴클레오티드 프로브들 중 임의의 것, 예를 들어, PNE 1 프로브, LEGPNE 1 프로브 또는 LP2 프로브의 3가지 프로브 중 임의의 것일 수 있다.

FITC의 적합한 방출/여기 스펙트럼과 상용성인 것으로 공지된 형광 염료들 (예를 들어, 사이토(Syto) 9, 알렉사(Alexa) 488 등) 또는 Cy3 (예를 들어, 로다민(Rhodamine), 알렉사 583 등) 중 임의의 것을 사용할 수 있다.

단계 3은 관련된 박테리아를 현미경을 사용하여 정량하는 것을 수반한다. 이는 수동으로 또는 자동으로, 예를 들어, 에피형광 현미경을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 원위치 혼성화에 의해 표지되고 필터 상에 고정된 박테리아의 검출 및 카운팅은 에피형광 시스템이 장착된 현미경의 사용을 필요로 한다.

적절한 검출 기구에는 켐스캔(ChemScan) RDI 및 ScanVIT-레지오넬라 TM (Vernicon AG (Munich, Germany))이 포함된다. 표지된 박테리아를 켐스캔 (AESChemunex에서 개발된 고체 세포측정법)을 사용하여 검출 및 카운팅할 수 있다. 그러나, 이러한 시스템은 1 셋트의 방출/여기 거울 (488 nm)만을 사용할 수 있고, 따라서 오직 1개의 표지된 프로브만을 사용하도록 본 발명의 프로토콜을 제한한다.

2개 이상의 프로브를 사용하는 본 발명의 상기 언급된 바람직한 양상에 따르면 ScanVIT-레지오넬라 TM이 특히 바람직한데, 이는 이러한 기술이 레지오넬라 뉴모필라가 아닌 본래 형광성인 미생물을 제거하기 위해 2개의 상이한 형광 신호를 사용하는 것을 허용하기 때문이다.

본 발명에 따른 방법은 레지오넬라 뉴모필라의 존재에 대한 정확하고 신속한 정량적 결정을 용이하게 한다. 이러한 방법은 산업용 냉각수, 식수 및 천연수의 군으로부터 선택된 임의의 것으로부터 유래된 샘플 내의 레지오넬라 뉴모필라를 검출하는데 적절하다.

본 발명에는

(1) 세포 영양소 공급원,

(2) 세포 증식 억제제,

(3) 레지오넬라 뉴모필라 종의 생육성 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브,

(4) 형광 신호를 검출 및 정량하기 위한 수단

을 포함하고, 이때 세포 증식 억제제가 시프로플록사신 및 세팔렉신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 레지오넬라 뉴모필라 종의 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내의 레지오넬라 뉴모필라 종의 생육성 미생물을 더욱 신속하게 검출 및 계수하기 위한 키트가 또한 포함된다.

바람직한 형태에서, 키트는 하기의 용액들을 포함할 수 있다: 장기 보관을 위해 탈수될 수 있는 배지 조성물 (상기 정의된 바와 같음); 박테리아의 외막을 고정하기 위한 용액, 예를 들어 포름알데하이드; 사용 직전에 제조되어야 하는 혼성화 용액, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 용액; 사용 직전에 제조되어야 하는 세정액, 예를 들어 상기 기술된 바와 같은 용액; 장기 보관을 위해 탈수될 수 있는 핵산 형광 염료, 예를 들어 DAPI; 퇴색 방지 마운팅(mounting) 시약. 바람직하게는, 키트는 필터를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 키트는 생리학적 완충제; 50％ 내지 90％의 다양한 농도의 에탄올 용액; 및 무균수를 추가적으로 포함할 수 있다. 키트는 에펜도르프(Eppendorf), 예를 들어 2 ㎖를 또한 함유할 수 있다.

키트는 본 발명의 첫번째 양상과 관련하여 기술된 실시양태들 중 임의의 것을 또한 함유할 수 있다.

이러한 키트는 본 발명의 방법과 함께 사용하기에 적절하고, 레지오넬라 뉴모필라의 신속하고 신뢰할 수 있는 계수를 가능하게 한다.

하기의 예들은 본 발명을 예증한다.

실시예 1

최종 농도가 10⁶개의 박테리아/㎖인 레지오넬라 뉴모필라 현탁액을 동일한 부피의 2개의 현탁액으로 신속하게 나누었다. 제1 현탁액 (S1)만 주위 온도 (20℃ 내지 22℃)에서 30분 동안 3.7％ (v/v) 포름알데하이드로 고정시켰다. 그후, 양쪽 현탁액을 PBS pH 7.4에서의 원심분리 (6,000×g, 5분, 20℃)에 의해 3회 세정하였다.

양쪽 현탁액을 표 1에 따라 최종적으로 혼합하였다.

각각의 혼합물을 하기의 실험 프로토콜에 따라 처리하였다.

결과

결과가 도 1에서 제시된다. 도 1은 표준 방법 AFNOR (8일)과 24시간 미만을 필요로 하는 본 발명의 방법 간의 상관관계를 나타낸다. 결과는 레지오넬라 뉴모필라 확인의 정확성의 관점에서 2가지 방법 간의 양호한 상관관계를 가리킨다.

실험 프로토콜

샘플 (V₁)을 직경 25 mm, 구멍 크기 0.2 ㎛의 백색 폴리카르보네이트 막 (Millipore, GTTP02500)을 통해 여과하였다. 필터를 10 ㎖의 용액 A로 2회 헹구고, 1 ㎖의 용액 A를 함유하는 무균성 튜브 (에펜도르프 2 ㎖) 내에 놓았다. 튜브를 1분 동안 30 Hz (4℃)에서 진탕시켰다. 필터를 제거한 후, 각각의 현탁액을 하기와 같이 신속히 처리하였다:

1. 500 ㎕의 현탁액을 무균실에서 500 ㎕의 용액 B를 함유하는 무균성 튜브 내에 배치하였다. 그후, 튜브를 교반하면서 24시간 동안 37℃ 또는 45℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 현탁액을 직경 25 mm, 구멍 크기 0.2 ㎛의 백색 폴리카르보네이트 막 (Millipore, GTTP02500)을 통해 여과하고, 주위 온도 (20℃ 내지 22℃)에서 30분 동안 용액 C로 고정시켰다. 필터를 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 2회 헹구고, 공기 건조시켰다.

2. 500 ㎕의 현탁액을 직경 25 mm, 구멍 크기 0.2 ㎛의 백색 폴리카르보네이트 막 (Millipore, GTTP02500)을 통해 직접 여과하고, 주위 온도 (20℃ 내지 22℃)에서 30분 동안 용액 C로 고정시켰다. 필터를 포스페이트 완충 염수 (pH 7.4)로 2회 헹구고, 공기 건조시켰다.

필터를 용액 D, 용액 E 및 용액 F (각각 2분)에서의 순차적인 세정에 의해 탈수시킨 후, 30분 동안 37℃에서의 인큐베이션에 의해 건조시켰다. 필터를 슬라이드 상에 놓고, 50 ㎕의 용액 G를 필터에 적용하였다. 커버슬립을 필터 상에 놓아 탈수를 방지하였다. 습식 챔버 내에서 2시간 동안 46±1℃에서 혼성화를 수행하였다. 그후, 필터를 46℃로 미리 가열된 5 ㎖의 용액 H로 3회 세정한 후, 무균수로 2회 헹궜다. 필터를 15분 동안 1 ㎖의 용액 I와 함께 인큐베이션하고, 무균수로 2회 헹궜다. 공기 건조 후, 최종적으로 필터를 20 ㎕의 용액 J와 함께 슬라이드 상에 마운팅하였다. 혼성화된 세포를 ×100 수침 대물 렌즈 및 2개의 방출/여기 필터로 에피형광 현미경검사법에 의해 가시화하였다: 510 - 550 nm 여기 필터 및 590 nm 배리어(barrier) 필터.

용액

배지 2×

구멍 크기 0.2 ㎛의 니트로셀룰로스 막 (Millipore, SLGS025 0S)을 통한 여과에 의해 모든 반응물을 살균하였다. 각각의 시약 셋트에 대한 상세사항에 대해서 하기를 참조한다.

혼성화 용액

구멍 크기 0.2 ㎛의 니트로셀룰로스 막 (Millipore, SLGS025 0S)을 통한 여과에 의해 모든 반응물을 살균하였다.

FISH 검출에 사용된 프로브는 하기와 같았다: 레지오넬라(Legionellaceae)에 대해 특이적이고 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트)로 표지된 LEG705 (Eurogentec: 5'-CTGGTGTTCCTTCCGATC-3'), 및 레지오넬라 뉴모필라 속에 대해 특이적이고 Cy3으로 표지된 PNE1 (Eurogentec: 5'-CTGGTGTTCCTTCCGATC-3').

프로브를 1 ng/㎕의 최종 농도로 혼성화 용액에 첨가하였다.

세정액

실시예 2

녹색 형광 염료로 표지된 LEG705 제1 프로브 및 적색 형광 염료로 표지된 PNE1 제2 프로브를 사용하여 실시예 1의 실험 프로토콜을 샘플에 적용하였다.

도 2는 본래 형광성인 박테리아로부터 레지오넬라 뉴모필라가 구별되도록 하는 4가지 사례를 나타낸다. 도 2에서의 사례들은 하기와 같다:

사례 1 - 녹색 또는 적색 형광 박테리아가 없음 - 박테리아가 레지오넬라 속 및 레지오넬라 뉴모필라 종에 속하지 않는다;

사례 2 - 녹색 형광 박테리아만 있음 - 박테리아가 레지오넬라 속에 속하거나 또는 본래 형광성이다;

사례 3 - 적색 형광 박테리아만 있음 - 적색 형광에도 불구하고, 박테리아가 레지오넬라 뉴모필라 종에 속하지 않는데, 이는 박테리아가 녹색 형광성이지 않고 따라서 레지오넬라 속에 속하지 않기 때문이다. 이러한 박테리아는 본래 적색 형광성이다;

사례 4 - 녹색 및 적색 형광 박테리아 - 박테리아가 레지오넬라 속 및 레지오넬라 뉴모필라 종에 속한다.

이러한 방법을 사용하여, 다른 방식으로는 레지오넬라 뉴모필라를 잘못 지시할 본래 형광성인 박테리아의 검출을 제한함으로써 본 발명자들은 레지오넬라 뉴모필라를 정확하게 검출할 수 있었다.

PNE1 프로브는 그림 등의 문헌[Grimm et al., 1998]에서 최초로 기술되었다. 구체적인 서열은 하기와 같다: 5'-ATC TGA CCG TCC CAG GTT-3'

LEG705 프로브는 만츠 등의 문헌[Manz et al., 1995]에서 최초로 기술되었다. 구체적인 서열은 하기와 같다: 5'-CTGGTGTTCCTTCCGATC-3'

이러한 테스트에서 사용된 3가지 염료는 하기와 같이 사용되었다:

제1 염료는 모든 미생물의 핵산을 염색하도록 사용되었다. DAPI가 UV 여기 하에 청색으로 박테리아를 염색하도록 사용되었다. 이러한 염료는 올리고뉴클레오티드 프로브와 커플링되지 않는다.

2개의 제2 염료는 올리고뉴클레오티드 프로브와 커플링되어 특이적 검출을 허용한다. 이러한 2개의 염료는 2개의 상이한 여기/방출 스펙트럼을 특징으로 하여야 한다. 테스트에서, FISH 검출에 가장 통상적으로 사용되는 염료인 FITC 및 Cy3이 사용되었지만, 각각 동일한 스펙트럼의 다수의 염료가 이용가능하다.

Claims

(1) 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 세포 영양소 공급원 및 세포 증식 억제제와 접촉시키는 단계,
(2) 상기 샘플을 생육성 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계,
(3) 형광 신호를 검출 및 정량하는 단계
를 포함하고, 이때 미생물이 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종의 미생물이고, 세포 증식 억제제가 시프로플록사신 및 세팔렉신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내의 생육성 미생물을 검출 및 계수하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 1)의 세포 영양소 공급원이 항산화제, 바람직하게는 피루브산 (또는 이의 염)을 포함하는 성장 보충물을 함유하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 1)의 세포 영양소 공급원이 글루탐산 (또는 이의 염)을 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 1)의 세포 영양소 공급원이 글루탐산 (또는 이의 염) 및 피루브산 (또는 이의 염)을 함유하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 프로브가 PNE 1 프로브; LEGPNE 1 프로브; 및 LP2 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서, 상기 샘플이 적어도 제1 프로브 및 제2 프로브와 접촉되고, 이때 제1 프로브는 상기 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있고, 제2 프로브는 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 상이한 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서, 상기 샘플이 적어도 제1 프로브 및 제2 프로브와 접촉되고, 이때 제1 프로브는 모두 레지오넬라 속에 속하는 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있고, 제2 프로브는 모두 레지오넬라 뉴모필라 종에 속하는 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 방법.
제7항에 있어서, 제1 프로브가 LEG705 프로브; LEG226 프로브; Legall11 프로브; Legall22 프로브; 및 Leg120v 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (3)이 에피형광(epifluorescent) 현미경을 사용하여 자동적으로 수행되는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 산업용 냉각수, 식수 및 천연수의 군으로부터 선택된 임의의 것으로부터 유래되는 것인 방법.
(1) 세포 영양소 공급원,
(2) 세포 증식 억제제,
(3) 레지오넬라 뉴모필라 종의 생육성 미생물의 리보솜 핵산의 하나 이상의 부분에 특이적으로 혼성화될 수 있는 하나 이상의 형광-표지 올리고뉴클레오티드 프로브,
(4) 형광 신호를 검출 및 정량하기 위한 수단
을 포함하고, 이때 세포 증식 억제제가 시프로플록사신 및 세팔렉신으로 구성된 군으로부터 선택되는, 레지오넬라 뉴모필라 종의 생육성 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플 내의 레지오넬라 뉴모필라 종의 생육성 미생물을 더욱 신속하게 검출 및 계수하기 위한 키트.