JP5349579B2 - 微生物の検出および計数 - Google Patents
微生物の検出および計数 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5349579B2 JP5349579B2 JP2011502330A JP2011502330A JP5349579B2 JP 5349579 B2 JP5349579 B2 JP 5349579B2 JP 2011502330 A JP2011502330 A JP 2011502330A JP 2011502330 A JP2011502330 A JP 2011502330A JP 5349579 B2 JP5349579 B2 JP 5349579B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- sample
- microorganisms
- seq
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(1)前記試料を細胞栄養源および細胞増殖阻害物質と接触させる工程、
(2)前記試料を、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズすることができる蛍光標識された少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程、
(3)蛍光シグナルを検出し、定量化する工程を含む方法であって、前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラ種のものであり、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される方法を提供する。
(1)細胞栄養源、
(2)細胞増殖阻害物質、
(3)前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズできる少なくとも1つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、
(4)蛍光シグナルを検出し、定量化するための手段
を含み、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択されるキットも包含する。
106細菌/mlの最終濃度のレジオネラ・ニューモフィラ懸濁液を同じ体積の2つの懸濁液中で処理する。最初の懸濁液(S1)のみを周囲温度(20〜22℃)で30分間、3.7%(v/vl)ホルムアルデヒドで固定する。両懸濁液を次いでPBS(pH7.4)中、遠心分離(6,000×g、20℃で5分)によって3回洗浄する。
結果を図1に示す。図1は、標準法AFNOR(8日)と24時間未満しか必要としない本発明の方法との間の相関関係を示す。結果は、レジオネラ・ニューモフィラの同定の精度の点で、この2つの方法の間の良好な相関関係を示す。
試料(V1)を、直径25mm、細孔径0.2μmの白色ポリカーボネート膜(Millipore,GTTP02500)を通して濾過した。フィルターを10mlの溶液Aで2回すすぎ、1mlの溶液Aを含む滅菌試験管(Eppendorf 2ml)中に入れた。試験管を30Hz(4℃)で1分振とうした。フィルターを除去した後、各懸濁液を次のようにして処理した:
1.500μlの懸濁液を、500μlの溶液Bを含む滅菌試験管中に無菌的に入れる。試験管を次いで撹拌しながら37℃または45℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、直径25mm、細孔径0.2μmの白色ポリカーボネート膜(Millipore,GTTP02500)を通して懸濁液を濾過し、周囲温度(20〜22℃)で30分間、溶液Cを用いて固定した。フィルターをリン酸緩衝食塩水(pH7.4)で2回すすぎ、空気乾燥させた。
緑色蛍光色素で標識したleg705第1プローブおよび赤色蛍光色素で標識したPNE1第2プローブを用いて、実施例1の実験プロトコルを試料に適用する。
ケース1:緑色でも赤色蛍光でもない細菌−細菌はレジオネラ属およびレジオネラ・ニューモフィラ種に属さない;
ケース2−緑色蛍光のみの細菌−この細菌はレジオネラ属に属するか、または天然に蛍光性である;
ケース3−赤色のみの細菌−緑色蛍光性でなく、したがってレジオネラ属に属さないので、赤色蛍光にもかかわらず、細菌はレジオネラ・ニューモフィラに属さない。この細菌は天然に赤色蛍光性である;および
ケース4−緑色及び赤色蛍光性細菌−この細菌はレジオネラ属およびレジオネラ・ニューモフィラ種に属する。
第1の色素を用いて、全ての微生物の核酸を染色する。DAPIを使用して、細菌をUV励起下で青色に染色する。この色素は、オリゴヌクレオチドプローブとカップリングしない。
Claims (8)
- 生存微生物を、前記微生物を含むことが疑われる試料中で検出および計数する方法であって:
(1)前記試料を細胞栄養源および細胞増殖阻害物質と接触させる工程であって、細胞栄養源が、酸化防止剤を含む成長サプリメントを含有する工程、
(2)前記試料を、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズすることができる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程であって、前記試料を少なくとも第1プローブおよび第2プローブと接触させ、前記第1プローブは、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズでき、前記第2プローブは、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも1つの異なる部分を特異的にハイブリダイズできる工程、
(3)蛍光シグナルを検出し、定量化する工程を含み、
前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラ種のものであり、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される、方法。 - 工程1)の前記細胞栄養源が、ピルビン酸(又はその塩)を含有する、請求項1記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプローブが、ATC TGA CCG TCC CAG GTTの5’3’塩基配列を有するプローブ、配列番号22の塩基配列を有するプローブ、および配列番号23の塩基配列を有するプローブからなる群から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 工程(2)において、前記試料を少なくとも第1プローブおよび第2プローブと接触させ、前記第1プローブは、すべてレジオネラ属に属するリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズでき、前記第2プローブは、全てレジオネラ・ニューモフィラ種に属するリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズできる、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1プローブが、配列番号7の塩基配列を有するプローブ、配列番号8の塩基配列を有するプローブ、配列番号9の塩基配列を有するプローブ、配列番号10の塩基配列を有するプローブ、および配列番号11の塩基配列を有するプローブからなる群から選択される、請求項4記載の方法。
- 落射蛍光顕微鏡を用いて工程(3)を自動的に実施する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、工業用冷却水、飲用水、および天然水から選択される群のいずれか由来である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- レジオネラ・ニューモフィラ種の生存微生物を、前記微生物を含むことが疑われる試料においてさらに迅速に検出し、計数するキットであって:
(1)酸化防止剤を含む成長サプリメントを含有する細胞栄養源、
(2)細胞増殖阻害物質、
(3)前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズできる蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、第1プローブは、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズでき、第2プローブは、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも1つの異なる部分を特異的にハイブリダイズできるプローブ、
(4)蛍光シグナルを検出し、定量化するための手段
を含み、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される、キット。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0806136.8A GB0806136D0 (en) | 2008-04-04 | 2008-04-04 | Detection and enumeration of microorganisms |
GB0806136.8 | 2008-04-04 | ||
GB0900848A GB0900848D0 (en) | 2009-01-20 | 2009-01-20 | Detection and enumeration of microorganisms |
GB0900848.3 | 2009-01-20 | ||
PCT/EP2009/053299 WO2009121727A1 (en) | 2008-04-04 | 2009-03-20 | Detection and enumeration of microorganisms |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2011516052A JP2011516052A (ja) | 2011-05-26 |
JP5349579B2 true JP5349579B2 (ja) | 2013-11-20 |
Family
ID=40887000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011502330A Expired - Fee Related JP5349579B2 (ja) | 2008-04-04 | 2009-03-20 | 微生物の検出および計数 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20110076686A1 (ja) |
EP (1) | EP2262910B1 (ja) |
JP (1) | JP5349579B2 (ja) |
KR (1) | KR101265412B1 (ja) |
CN (1) | CN101990579A (ja) |
AU (1) | AU2009231362B2 (ja) |
CA (1) | CA2719863C (ja) |
CY (1) | CY1114785T1 (ja) |
DK (1) | DK2262910T3 (ja) |
ES (1) | ES2389861T3 (ja) |
HR (1) | HRP20120553T1 (ja) |
IL (1) | IL208158A0 (ja) |
MX (1) | MX2010010385A (ja) |
MY (1) | MY149655A (ja) |
PT (1) | PT2262910E (ja) |
RS (1) | RS52445B (ja) |
RU (1) | RU2477319C2 (ja) |
WO (1) | WO2009121727A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011151793A1 (en) * | 2010-06-03 | 2011-12-08 | Basf Se | Detection and enumeration of microorganisms |
CN105524974A (zh) * | 2016-02-24 | 2016-04-27 | 北京世纪阿姆斯生物技术有限公司 | 一种高浓度微生物制剂产品含菌量的检测方法 |
CN107656056B (zh) * | 2017-08-29 | 2019-05-28 | 山东师范大学 | 一种基于细菌增长对细菌快速镜检的方法 |
RU2699983C1 (ru) * | 2018-12-04 | 2019-09-11 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" (ФБУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1F11PAL - продуцент мышиных моноклональных антител, специфичных к пептидогликан-ассоциированному липопротеину (PAL) Legionella pneumophila |
EP3904530A1 (en) * | 2020-04-27 | 2021-11-03 | Universidade de Évora | Method for collection, detection and/or identification of microorganisms from a natural stone and uses thereof |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5834445A (en) * | 1989-08-11 | 1998-11-10 | Sikorski; Christopher | Process for preparing decolorized carotenoid-cyclodextrin complexes |
FR2845097B1 (fr) * | 2002-10-01 | 2006-06-16 | Metis Biotechnologies | Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon |
JP4632839B2 (ja) * | 2005-03-31 | 2011-02-16 | アクアス株式会社 | レジオネラ検査用選択培地、及び、レジオネラ属菌の培養方法 |
US20090239256A1 (en) * | 2005-06-09 | 2009-09-24 | South Australian Water Corporation | Detection of Micro-Organisms |
ATE531818T1 (de) * | 2006-05-02 | 2011-11-15 | Univ Paris Curie | Methode zur bestimmung und auszählung von mikroorganismen |
-
2009
- 2009-03-20 CN CN2009801122963A patent/CN101990579A/zh active Pending
- 2009-03-20 RU RU2010144839/10A patent/RU2477319C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-03-20 CA CA2719863A patent/CA2719863C/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-03-20 AU AU2009231362A patent/AU2009231362B2/en not_active Ceased
- 2009-03-20 JP JP2011502330A patent/JP5349579B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2009-03-20 DK DK09727970.7T patent/DK2262910T3/da active
- 2009-03-20 KR KR1020107024739A patent/KR101265412B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2009-03-20 US US12/934,829 patent/US20110076686A1/en not_active Abandoned
- 2009-03-20 ES ES09727970T patent/ES2389861T3/es active Active
- 2009-03-20 PT PT09727970T patent/PT2262910E/pt unknown
- 2009-03-20 MX MX2010010385A patent/MX2010010385A/es active IP Right Grant
- 2009-03-20 WO PCT/EP2009/053299 patent/WO2009121727A1/en active Application Filing
- 2009-03-20 MY MYPI2010004332A patent/MY149655A/en unknown
- 2009-03-20 RS RS20120365A patent/RS52445B/en unknown
- 2009-03-20 EP EP09727970A patent/EP2262910B1/en active Active
-
2010
- 2010-09-15 IL IL208158A patent/IL208158A0/en unknown
-
2012
- 2012-07-06 HR HRP20120553AT patent/HRP20120553T1/hr unknown
- 2012-07-17 CY CY20121100633T patent/CY1114785T1/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2262910A1 (en) | 2010-12-22 |
AU2009231362B2 (en) | 2012-07-05 |
IL208158A0 (en) | 2010-12-30 |
PT2262910E (pt) | 2012-07-18 |
HRP20120553T1 (hr) | 2012-10-31 |
AU2009231362A1 (en) | 2009-10-08 |
KR101265412B1 (ko) | 2013-05-16 |
MY149655A (en) | 2013-09-30 |
WO2009121727A1 (en) | 2009-10-08 |
RS52445B (en) | 2013-02-28 |
JP2011516052A (ja) | 2011-05-26 |
EP2262910B1 (en) | 2012-06-06 |
CA2719863A1 (en) | 2009-10-08 |
ES2389861T3 (es) | 2012-11-02 |
CA2719863C (en) | 2013-10-08 |
RU2477319C2 (ru) | 2013-03-10 |
CY1114785T1 (el) | 2016-12-14 |
RU2010144839A (ru) | 2012-05-20 |
US20110076686A1 (en) | 2011-03-31 |
DK2262910T3 (da) | 2012-09-17 |
CN101990579A (zh) | 2011-03-23 |
MX2010010385A (es) | 2010-12-15 |
KR20100134093A (ko) | 2010-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Rompre et al. | Detection and enumeration of coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches | |
US20160076085A1 (en) | Methods for detecting and quantifying viable bacterial endo-spores | |
US20140309136A1 (en) | Real-time multiplex detection of three bacterial species responsible for sexually transmitted diseases | |
US20050202518A1 (en) | Method for detecting and counting micro-organisms in a sample | |
JP5349579B2 (ja) | 微生物の検出および計数 | |
JP2016192967A (ja) | 血液試料の微生物特異的フィルタ・インサイチュ分析の方法 | |
AU773559B2 (en) | Method for detecting microorganisms in a sample | |
JP2014502510A5 (ja) | ||
EP1852512B1 (en) | Microorganisms detection and enumeration method | |
CN105567802A (zh) | 肺炎衣原体荧光pcr检测试剂盒 | |
US20090136930A1 (en) | Method for the identification of microorganisms by means of in situ hybridization and flow cytometry | |
JP2001512665A (ja) | 大腸菌種に特異的なオリゴヌクレオチド並びにその種の細菌の検出および視覚化法 | |
EP1490507B1 (de) | Verfahren zum nachweis von mikroorganismen mittels in situ-hybridisierung und durchflusszytometrie | |
EP2553120B1 (en) | Peptide nucleicacid probe, kit and method for detection and/or quantification of salmonella spp. and applications thereof | |
TWI692528B (zh) | 用於檢測大腸桿菌之方法以及使用之分子標記 | |
JP2012187067A (ja) | ラクトバチルス属細菌の定量方法 | |
Fratamico | Detecting pathogens in cattle and meat PM Fratamico, A. Gehring, J. Karns and J. van Kessel, United States Department of Agriculture | |
PT106672B (pt) | Sondas de ácido péptido nucleico, estojo e método para detectar espécies do género lactobacillus spp. e/ou gardnerella spp. e respectivas aplicações |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130514 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130617 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130628 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130722 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130820 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |