MX2010010385A - Deteccion y enumeracion de microorganismos. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos que comprende: (1) poner en contacto la muestra con un recurso nutritivo de célula y un inhibidor de proliferación celular, (2) poner en contacto la muestra con cuando menos una sonda oligonucleótidica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (3) detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que los microorganismos están presentes son de la especia legionella pneumophila y en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste de ciprofloxacina y ceflexina. La invención también incluye un equipo que comprende: (1) un recurso nutritivo de célula, (2) un inhibidor de proliferación celular, (3) cuando menos una sonda oligonucleótidica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (4) un medio para detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacina y cefalexina.

Description

DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS La presente invención se relaciona con un método para detectar y enumerar microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra. La invención también incluye un equipo apropiado para uso en dicho método. Este método y equipo permiten que microorganismos viables sean cuantificados más rápidamente.

Las bacterias de Legionella son ubicuas en ambientes mojados o húmedos tales como tierra y hábitats acuáticos no marinos. También se pueden encontrar en instalaciones de agua caliente y fría, torres de enfriamiento de sistemas de acondicionamiento de aire y humidificadores de agua .

La Laegionella, especialmente Legionella pneumophila, son patógenos que pueden ocasionar una neumonia bacterial aguda, generalmente como "enfermedad de legionario" que frecuentemente es letal para individuos infectados.

La detección y enumeración de Legionella pneumophila se logran tradicionalmente mediante cultivo de célula. Este método se puede lograr midiendo bacterias cultivables usando cuenta de placa o midiendo micro colonias empleando un método de membrana de filtro. Estas técnicas evalúan bacterias viables y su capacidad de formar una colonia o micro-colonia. Desafortunadamente, estos métodos usualmente requieren entre 3 y 10 dias a fin de permitir que las colonias o micro-colonias se formen. Cuando las instalaciones de agua están todavía en operación, existe un riesgo inaceptable de infección humana durante este tiempo.

Otros métodos para detectar microorganismos de Legionella totales incluyen técnicas de PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) . La PCR emplea ADN de polimerasa para amplificar una pieza de ADN mediante replicación enzimática in Vitro. Durante la progresión de la técnica el ADN generado se usa como una plantilla para replicación que ocasiona una reacción en cadena en la que la plantilla de ADN se amplifica exponencialmente . La PCR permite que una sola o copias copias de una pieza de ÁDN se amplifica generando millones o más copias de la pieza de ADN. Típicamente dicho método se describe por Diederen y col., J Med Microbiol. Enero de 2007; 56 (t 1} :94-101.

Sin embargo, una desventaja de PCR es que las muestras tienden a contener inhibidores de reacción de polimerización y, por lo tanto, no proporcionan consistentemente resultados cuantitativos. Además, la técnica se basa en un paso de purificación de ADN anterior que puede resultar en pérdida de ADN con la baja estimación consecuente de la Legionella presente. Hasta cierto grado estas desventajas se superan mediante PCR de tiempo real que es cuantitativa. Sin embargo, la técnica no puede distinguir entre células viables y células no viables.

Otra técnica es hibridización fluorescente in situ (FISH) en la que una sonda oligonucleotídica etiquetada por una substancia fluorescente penetra en las células de bacterias. Cuando los ácidos nucleicos ribosomales (rRNA) tienen la secuencia correcta de la sonda conocida como la meta, la sonda se fijará a su meta y no se removerá por ningún paso de lavado subsecuente. La bacteria en la que la sonda se fija entonces emitirá una señal fluorescente. Esta señal fluorescente puede entonces cuantificarse mediante tales como citometria de flujo, citometria de fase sólida, o microscopía epifluorescente . Una técnica FISH típica se describe por Dutil S y col J Appl Micriobio. Mayo de 2006; 100 (5) : 955-63. Sin embargo, usando la técnica FISH sola el número total de Legionella pneumophila viable podría detectarse, pero desafortunadamente el método no pudo identificar exclusivamente sólo aquellas bacterias de Legionella pneumophila capaces de dividirse y por consecuencia hacer una colonia.

Un método adicional para enumerar Legionella peneumophila viable involucra ChemChrome V6 y se describe por Delgado-Viscogliosi y col Appl Environ Microbiol. Julio de 2005; 71 (7) : 086-96. Este método permite la cuantificación de Legionella neumophila asi como discriminación entre bacterias viables y no viables. Combina detección especifica de células de Legionella usando anticuerpos y un marcador de viabilidad bacterial (ChemChrome V6) y empleando microscopía epifluorescente para la enumeración. Sin embargo, aún cuando esta técnica distingue entre células viables y no viables no es capaz de identificar separadamente aquellas bacterias que forman colonia.

A la fecha los únicos métodos que permiten la detección de bacterias Legionell pneumophila capaces de dividirse se ha basado en el método de micro colonia (Scan-VIT) . Sin embargo, este método requiere alrededor de 72 horas .

Arana y col. "Detección y enumeración de transconjugantes viables pero no cultivables de Escherichia coli durante la supervivencia de células recipientes en agua de río" pág. 340-346, J. App. Microbiol Vol 83, 1997 describe el uso de cuenta de viabilidad directa (DVC) usando marcadores específicos.

Piqueres y col. "Una combinación de cuenta viable directa e hibridización in situ fluorescente para calcular viabilidad de célula de Helicobacter pylori" pág. 345-349 Res. arcrobiol. Vol 157, 2006, Jjemba y col. " En Enumeración in situ y sondeo de pireno que degrada bacterias de tierra" pág. 287-298 FEMS Microbiol. Ecol. Vol. 55, 2006 ambas se refieren a DVC-FISH pero para microorganismos no relacionados con Legionella pneumophila.

EP-A-1852512 describe un método para identificación y enumeración de varios microorganismos patógenos que incluyen Legionella penumophila. El método incorpora la cuenta de viabilidad directa (DVC) y la hidridización in situ de fluorescencia (FISH) pero también emplea una sonda de ayuda a fin de amplificar la señal. Las sondas de ayuda son oligonucleótidos no etiquetados que enlazan a regiones adyacentes a aquella marcada por la sonda etiquetada especifica. Esto mejora la accesibilidad in situ y por lo tanto la señal conferida de sonda.

El método descrito en EP-A-1852512 se dice que emplea un inhibidor de girasa de ADN tal como ácido nalidixico, que detiene la división de célula, aumenta el contenido de rRNA intracelular y la longitud celular de células sensibles. Sin embargo, en la práctica el ácido nalidíxico no es un inhibidor de girasa de ADN confiablemente efectivo para Legionella penumophila. Además, este documento no menciona problemas de enumeración imprecisa que puede ocurrir debido a la presencia de microorganismos naturalmente fluorescentes.

Seria deseable proporcionar un método para cuantificar de manera segura Legionella pneumophila viable capaz de formar colonias en una muestra rás rápidamente que las técnicas conocidas. Además, seria preferible lograr esto de manera más precisa.

De conformidad con la presente invención, proporcionamos un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos que comprende: (1) poner en contacto la muestra con un recurso nutritivo de célula y un inhibidor de proliferación celular, (2) poner en contacto la muestra con cuando menos una sonda oligonuleotica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (3) detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que los microorganismos son de la especia Legionella penumophila y en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste de ciprofloxacina y cefalexina.

Generalmente cada uno de estos pasos se lleva a cabo secuencialmente en el que el paso (2) se realiza en la muestra asi tratada en el paso (1) y luego el paso (3) se conduce siguiendo al paso (2) .

El paso 1 del método inventivo es conocido como Cuenta Viable Directa (DVC) que se basa en incubar una bacteria en presencia de un antibiótico o inhibidor de girasa de ADN que bloquea la división celular sin deteriorar el metabolismo celular. Por lo tanto, la bacteria viva tenderá a alargarse pero no dividirse y asi se puede distinguir de la bacteria muerta que no cambia en tamaño. Por lo tanto, es posible identificar bacteria viva mediante microscopía. Antes de llevar a cabo el paso de DVC puede ser deseable concentrar la muestra y tratarla previamente por ejemplo mediante ácido y/o tratamiento térmico de conformidad con el método convencional T 90-432 (ISSN 0335-3931), editado y distribuido por la Asociación Francesa de Normalización (AFNOR) 11, Avenue Francis de Pressensé-93571 St Denis La Plaine Cedex, Francia.

Hemos encontrado inseperadamente que la ciprofloxacina y cefalexina son inhibidores de girasa de ADN mjy efectivos. Ambas de ciprofloxacina y cefalexina permiten que las células de Legionella penumophila se alarguen en preparación para división de célula para en realidad bloquean a estas células alargadas de dividirse. En contraste el ácido nalidixico no proporciona suficiente alargamiento de las células de Legionella pneumophila que es efectiva para el presente método. Ventajosamente encontramos que el método de la presente invención permite que la Legionella penumophila se identifique y cuantifique de manera segura y dentro de una escala de tiempo normalmente de menos de 24 horas. Esto proporciona mejoras significativas en control sanitario de agua .

La ciprofloxacina o cefalexina se puede usar en cualquier cantidad efectiva. Típicamente esto sería en concentraciones de hasta 20 mg/L o superior dentro del medio contenido en el recurso nutritivo de célula. De preferencia las concentraciones son entre 1 y 10 mg/L. De preferencia el inhibidor de proliferación celular es ciprofloxacina. Hemos encontrado que el mayor alargamiento celular se puede lograr cuando la concentración de ciprofloxacina es entre 2 y 6 mg/L después de una duración de 12 horas, especialmente entre 3 y 5 mg/L: El recurso nutritivo de célula debe contener cualquier composición de medio de crecimiento apropiado aplicable al método DVC y apropiado para Legionella pneumophila. Una composición de medio apropiada puede comprender un medio, suplemento selectivo, inhibidor de proliferación celular (ciprofloxacina o cefalexina) y suplemento de crecimiento.

El medio proporciona la nutrición mínima para permitir el crecimiento de Legionell pneumophila. Puede ser cualquier medio apropiado como se describe en la literatura, por ejemplo de conformidad con la prescripción de método convencional T 90-431 (como se proporciona arriba) sin agar y carbón.

El suplemento selectivo f ecuentemente se requiere a fin de limitar el desarrollo de microorganismos de interferencia. La selección de antibiótico puede ser cualquier suplemento conocido apropiado para el método DVC, por ejemplo como se describe en el método convencional T 90-431 (como se proporciona arriba. Sin embargo, la concentración de cada antibiótico en general se debe adaptar para el medio líquido particular. Sin embargo, no sería necesariamente perjudicial en casos en donde estos otros microorganismos no están completamente eliminados puesto que el paso 2 usualmente será suficientemente específico para superar el efecto de bacterias que interfieren.

Aún cuando el suplemento de crecimiento no es esencial para permitir el crecimiento de la bacteria Legioenlla pneumophila, puede optimizar su crecimiento. La Legionella pneumophila se caracteriza duplicando en 120 min (bajo condiciones óptimas) . Sin embargo, hemos encontrado que en algunos casos las bacterias Legionella pneumophila viable que son capaces de formar colonias pueden no necesariamente formar colonias inmediatamente y en su lugar someterse a un retraso o fase de retardo antes de que comience el crecimiento. Esta fase de retardo puede ser entre 8 a más de 20 horas en la función de estado fisiológico inicial.

En una forma preferida de la presente invención, la fase de retardo para Legionella pneumophila se puede reducir incluyendo como el suplemente de crecimiento y reactivo antioxidante hacia el recurso nutritivo de célula. El reactivo antioxidante puede actuar directamente sobre la especie de oxigeno reactivo (ROS) o por otro medio de modo que ocasionar un efecto sobre el metabolismo del microorganismo, directa o indirectamente, que ocasiona una reducción en ROS. Los reactivos antioxidantes apropiados incluyen catalasa, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, sulfóxido de dimetilo, TDPA (ácido 3, 3' -tiodipropiónico) y piruvato, etc. De preferencia el reactivo antioxidante es piruvato. Las dosis preferidas de reactivo antioxidante, especialmente para piruvato, es entre 0.5 a 1.5 g/L, especialmente alrededor de 1 g/L: El recurso nutritivo de célula puede incluir cuando menos un compuesto que inhibe indirectamente la formación de y/o degrada la Especie de Oxigeno Reactivo (ROS), el compuesto puede ocasionar niveles reducidos de ROS interfiriendo con el metabolismo del microorganismo. Típicamente dichos compuestos incluirán aminoácidos o sus sales. Un compuesto particularmente preferido es ácido glutámico o sal de glutamato.

En una forma preferida todavía adicional de la invención, el recurso nutritivo de célula incluiría ácido glutámico o sal de glutamato, especialmente la sal de sodio. En general la cantidad de ácido glutámico o glutamato será entre 0.01 y 5% en peso calculado como la sal de sodio.

Es particularmente preferido que el recurso nutritivo de célula incluye tanto ácido pirúvico o piruvato (especialmente la sal de sodio) junto con ácido glutámico o glutamato (espacialmente como la sal de sodio) . Esta combinación de ácido pirúvico o piruvato con ácido glutámico o glutamato parece inducir un efecto sinergístico en que permite un cálculo superior (y por lo tanto estimación más precisa) de Legionella cultivable que cualquier compuesto respectivamente usado solo. Además, hemos encontrado que esta combinación ocasiona una reducción adicional de fase de retardo durante el desarrollo de Legionella pneumophila, en particular en medio liquido. Dicha reducción de fase de retardo en medio liquido resulta en una reducción del tiempo requerido para obtener una colonia visible sobre placa de agar .

Deseablemente, la cantidad de piruvato y glutamato será como se manifestó anteriormente. Es particularmente preferido que la relación de glutamato a piruvato sea de la escala entre 1:1 y 50:1, especialmente entre 5:1 y 20:1 y más especialmente entre 7:1 y 15:1.

El glutamato no se sabe que sea un antioxidante. Sin embargo, parece que el glutamato indirectamente puede reducir la producción endógena de ROS naturalmente formada durante el crecimiento o sus consecuencias en macromoléculas (oxidación) .

Sin estar limitados a la teoría, se piensa que el ácido glutámico cambia el metabolismo de Legionella para aumentar el efecto de piruvato y que esta interferencia con el metabolismo de Legionalle inhibe indirectamente la formación de y/o degrada la ROS intracelular .

El método de la presente invención puede permitir que se emplee un periodo de incubación más corto, deseablemente no más de alrededor de 24 horas. De preferencia esto se puede reducir a 12 horas, especialmente cuando hay baja ocurrencia de interferencia bacterial y/o ocurrencia elevada de bacteria de Legionella pneumophila.

La muestra se puede recoger de cualquier ubicación apropiada. Esta puede ser por ejemplo una muestra de agua de agua de recirculación en un sistema de enfriamiento. Sin embargo, deseablemente la muestra se puede obtener de agua en la forma de un aerosol. Típicamente un aerosol puede estar colocado en una torre de enfriamiento o acondicionador de aire. Deseablemente el agua condensada del aerosol antes de probar de conformidad con el método de la presente invención.

El modo de incubación puede ser como se define en la literatura que describe el procedimiento de DVC. Dicho método puede incluir filtración de muestra y luego incubación de filtro sobre almohadillas empapadas con el medio. De preferencia de conformidad con la presente invención, la muestra, o muestra concentrada, se incube directamente con el medio y luego se filtra. De esta forma podemos reducir el riesgo de perder bacterias durante el proceso de incubación y proporcionar mejores condiciones durante la incubación, por ejemplo transferencia de oxigeno o agitación de la muestra.

El paso 2 del método inventivo puede emplear un protocolo FISH convencional.

En la primera parte del procedimiento FISH las células se pueden fijar tratando la membrana externa o envolvente de la célula para hacerla permeable a las sondas oligonucleotidicas . Generalmente esto se logrará usando soluciones de fijación que son soluciones acuosas de alcoholes o aldehidos incluyendo formaldehido, paraformaldehido, etanol y/o metanol. Típicamente las soluciones de formaldehído o paraformarladehído pueden ser hasta 10% en peso y de preferencia entre 1 y 5%. Usualmente los alcoholes serán cuando menos 50% en peso y generalmente entre 60 y 90% en peso. De preferencia este tratamiento se puede lograr mediante tratamiento secuencial con una o más de estas soluciones. De preferencia el tratamiento puede comprender una solución de entre 1 y 5% de formaldehído o paraformaldehido seguido por dos o tres soluciones de etanol o metanol de resistencia incrementante entre 50% y 90%.

El procedimiento FISH luego emplea un procedimiento de hibridización empleando un tampón de hibridización que contiene cuando menos una sonda oligonucleotídica etiquetada de fluorescencia que comprende un oligonucleotido con marcador fluorescente fijado en el que el oligonucleotido es capaz de dirigir una secuencia especifica dentro de la célula. Las sondas oligonucleotidicas penetran la membrana externa de las células y se enlazan a la secuencia de meta correspondiente al oligonucleótido. El enlace se entenderá que significa la formación de enlaces de hidrógeno entre piezas de ácido nucleico complementarias. En la técnica FISH las sondas oligonucleotidicas son complementarias y capaces de enlazarse a una cierta región de la secuencia de meta ribosomal dentro del microorganismo. Típicamente las sonadas comprenden entre 15 y 30 bases en longitud como piezas de ácido desoxiribonucleico de una sola hebra y se dirigen a una región de meta especifica al microorganismo.

La sonda oligonucleotídica deseablemente debe ser una sonda ARN 16S ribosomal específica de Legionella pneumophila. Cualquiera sondas oligonucleotidicas que se dirijan específicamente a microorganismos de la especia Legionella penumophila se puede emplear. De preferencia la sonda se selecciona del grupo que consiste de sonda PNE 1 descrita por Grimm y col 1998 con una secuencia de base 5' 3' de ATC TGA CCG TCC CAG GTT, sonda LEGPNE 1 (SEC ID No. 22) descrita por Grimm y col 1988 y Declerck y col 2003 que tiene una secuencia de base 5' 3' de ATCTG ACCGHT CCAG GTT, y sonda LPE2 (SEC ID No. 23) descrita por Yamamoto y col 19983 que tiene una secuencia de base 5' 3' de AGCTT TCATC CAAAG ATA.

También puede ser deseable emplear alternativamente sondas con secuencias que tienen cuando menos 70%, de preferencia cuando menos 80% y más preferentemente cuando menos 90% de identidad con cualquiera de las tres sondas, sonda PEN 1, sonda LEGPNE 1 o sonda LP2.

A fin de superar el riesgo de identificar falsamente microorganismos que son naturalmente fluorescentes, una forma preferida de la invención emplea dos sondas nucletidicas . Una sonda se dirige a todos los microorganismos del género Legionella y la segunda sonda está diseñada para hibridizar específicamente microorganismos de especies de Legionella pneumophila. Cada sonda está etiquetada con diferentes tintes fluorescentes. Los microorganismos que son naturalmente fluorescentes será fluorescentes en solamente una longitud de onda especifica o banda estrecha de longitudes de onda y consecuentemente usando las dos sondas con diferentes tintes esa fluorescencia a diferentes longitudes de onda permiten que los microorganismos naturalmente fluorescentes que no son específicamente Legionella pneumophila se eliminen.

En esta forma preferida de la invención, la primera sonda hibridizará microorganismos pertenecientes al género Legionella, que incluye pero no está limitada a Legionella longbeachae, Legionella jordanis, Legionella anisa, Legionella pneumophila. Esta primera sonda puede comprender un nucleótido que puede enlazarse con una secuencia ribosomal de meta de cualquiera de las bacterias dentro del género Legionella. Típicamente la primera sonda puede ser cualquiera de las sondas seleccionadas del grupo que consiste de la sonda LEG705 (SEC ID No. 7) descrita en Manz y col. (Manz y col. 1995) con una secuencia de base 5' 3 * de CTGGT GTTCC TTCCG ATC, la sonda LEG226 (SEC ID No. 8) describe en Manz y col. (Manz y col. 1995), con una secuencia de base 5' 3' de CCTCFC TCCCC ACTGA AAGT, la sonda Legall22 (SEC ID No. 10) descrito en Leskela y col. (Leskela y col. 205) con una secuencia de base 5' 3' de ACTG TATGT CAGG GTAGG, la sonda Legl20v (SEC ID No. 11) descrita en Buchbinder y col. (Bu7shbinder y cool. 2002) con una secuencia de base 5' 3' de AAGGC ATATT CDCTAC GCGT .

También puede ser deseable emplear alternativamente sondas con secuencias que tienen cuando menos 70%, de preferencia cuando menos 80% y más preferentemente cuando menos 90% de identidad con cualquiera de las tres sondas, sonda LEG705, sonda LEG226, sonda Legallll, sonda Legall22, y sonda Legl20v.

La segunda sonda puede hibridizar solamente la especie especifica de Legionella pneumophila y puede ser cualquiera de las sondas nucleotidicas antes mencionadas con este característica, v. gr., cualquiera de ls tres sondas, sonda PNE 1, sonda LEGPNE 1 o sonda LP2.

Cualquiera de los tintes fluorescentes conocidos por ser compatibles con los espectros de emisión /excitación apropiados de FITC (por ejemplo Syto9, Alexa 488 etc) o Cy3 (por ejemplo R odamine, Alexa 583 etc) se puede usar.

El paso 3 involucra cuantificar bacterias relevantes usando un microscopio. Esto se puede lograr manual o automáticamente, por ejemplo usando un microscopio epifluorescente. De preferencia la detección y cuenta de bacterias etiquetadas por ibridización in situ y fijado en un filtro necesario para uso de microscopio equipado con un sistema de epifluorescencia.

Los dispositivos de detección apropiados incluyen ChemScan RDI y ScanVIT-Legionella TM (Vermicon AG, Munich, Alemania) . Es posible usar chemscan (citometria sólida desarrollada por AESChemunex) para detectar y contar bacterias etiquetadas. Sin embargo, este sistema puede usar solamente 1 juego de espejo de emisión /excitación (488 nm) y de esta manera limitar nuestro protocolo a usar solamente una sonda etiquetada.

ScanVIT-Legionella TM se prefiere especialmente de conformidad con el aspecto preferido antes mencionado de la invención que emplea cuando menos dos sondas, puesto que esta técnica permite el uso de dos señales fluorescentes diferentes a fin de eliminar naturalmente los microorganismos fluorescentes que no son Legionella pneumophila.

El método de conformidad con la presente invención facilita la determinación cuantitativa precisa y rápida para la existencia de Legionella pneumophila. El método apropiado para detectar Legionella pneumophila en muestras derivados de cualquiera del grupo seleccionado de aguas de enfriamiento industriales, aguas para beber y aguas naturales.

La presente invención también incorpora un equipo para detectar y enumerar más rápidamente microorganismos viables de la especia Legionella pneumophila en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos que comprende: (1) un recurso nutritivo de célula, (2) un inhibidor de proliferación celular, (3) cuando menos una sonda oligonucleotidica etiquetada con fluorscencia, capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos robosomales de los microorganismos, (4) un medio para detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacina y cefalexina .

En una forma preferida un equipo puede comprender las siguientes soluciones: una composición de medio (como se define arriba) que se pude deshidratar para almacenamiento prolongado; una solución para fijar la membrana externa de bacterias, por ejemplo formaldehído; una solución de hibridización, por ejemplo como se describe arriba, que debe hacerse poco antes del uso, una solución de lavado, por ejemplo como se describe arriba, que debe hacerse porco antes del uso; tinte de fluorescencia de ácido nucleico, por ejemplo DAPI que podría deshidratarse para almacenamiento prolongado; un reactivo de montaje contra desvanecimiento. De preferencia el equipo puede comprender filtros. Más preferentemente, el equipo puede comprender adicionalmente un tampón fisiológico; soluciones de etanol de resistencia que varía entre 50 y 90 '5 y agua estéril. El equipo también puede contener Eppendorf, por ejemplo 2 mi.

El equipo también puede contener cualquiera de las modalidades descritas con respecto al primer aspecto de la invención.

El equipo es apropiado para uso con el método de la presente invención y permite la enumeración rápidamente y de manera confiable de Legionella penumophila.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1 Una suspensión de Legionella pneumophila a concentración final de 10e bacteria/ml se despacha en 2 suspensiones del mismo volumen. Solamente la primera suspensión (SI) está fijada con 3.7% (v/vl) de formaldehido a temperatura ambiente (20 a 22°C) durante 30 min. Ambas suspensiones luego se lavan tres veces mediante centrifugación (6,000 x g. 5 min a 20°C) , en PBS pH 7.4 Ambas suspensiones se mezclan finalmente de conformidad con el cuadro 1.

Cuadro 1 % de Célula Viable SI [mi] S2 [mi] 100 0 2 50 1 1 10 1.8 0.2 1 1.98 0.02 Cada mezcla se trata de conformidad con el protocolo experimental abajo.

Resultados Los resultados se representan en la figura 1. La figura 1 muestra la correlación entre el método convencional AFNOR (8 días) y el método de la presente invención que requiere menos de 24 horas. Los resultados indican una buena correlación entre los dos métodos en términos de precisión de identificación de Legionella pneumophila.

Protocolo experimental Las muestras (Vi) se filtran a través de membrana de policarbonato blanca de 0.2 um de tamaño de poro, 25 mm de diámetro (Millipore, GTTP02500) . Los filtros se enjuagaron dos veces con 10 mi de Solución A y se dispusieron en un tubo estéril (Eppendorf 2ml) que contiene 1 mi de solución A. Los tubos se agitaron 1 min a 30Hz (4°C) . Después de remover los filtros, cada suspensión se despacho como sigue: 1 500 ul de suspensión se disponen asépticamente en un tubo estéril que contiene 500 ul de solución B.

Los tubos luego se incubaron 24 horas a 371C o 45°C con agitación. Después de la incubación, las suspensiones se filtraron a través de membrana de policarbonato blanca de 25 mm de diámetro 0.2 um de tamaño de poro (Millipore GTTP02500) y se fijaron con solución C a temperatura ambiente (20 a 22°C) durante 30 min. Los filtros se enjuagaron dos veces con salina tamponada con fosfato (pH 7.4) y se secaron en aire. 2. 500 ul de suspensiones se filtraron directamente a través de membrana de policarbonato blanco de 25 mm de diámetro, 0.2 um de tamaño de poro (Millipore, GTTP02500) y se fijaron con solución C a temperatura ambiente (20 a 22°C) durante 30 min. Los filtros se enjuagaron dos veces son salina tamponada con fosfato (pH 7.4) y se secaron al aire.

Los filtros se deshidrataron mediante lavados secuenciales en Solución D, Solución E y Solución F (2 min cada uno) y luego se secaron mediante incubación 30 min a 37°C. Los filtros se dispusieron en platina y 50 ul de Solución G se aplicó al filtro. Una cubierta deslizante se dispuso en el filtro para evitar la deshidratación. La hibridización se realizó durante 2 horas a 46 + 1°C en una cámara húmeda. Luego los filtros se lavaron tres veces en 5 mi de solución H precalentada a 46°C y luego se enjuagaron dos veces con agua estéril. Los filtros se incubaron 15 min con 1 mi de Solución I y se enjuagaron dos veces con agua estéril. Después de secarse al aire, los filtros se montaron finalmente en la platina con 20 ul de solución J. Las células hibridizadas se visualizaron mediante microscopía de epifluorescencia con un lente de objetivo de xlOO de inmersión y dos filtros de emisión /excitación: uno de 510 a 550 nm de filtro de excitación y uno a 590 nm de filtro de barrera.

Soluciones Cuadro 2 Solución Detalles Descripción General A Salina de Tampón de Tampón fisiológico fosfato pH 7.4 (PBS) B Medio Ver el Cuadro 3 C Formaldehído [3.7%] (Sigma, F-1635) D Etanol 50% E Etanol 80% F Etanol 90% G Solución de Hibridización Ver Cuadro 4 H Solución de Lavado Ver Cuadro 5 I DAPI [0.5ug/ml] (Sigma, D- Tinte Fluorescente de 94521) Ácido Nucleico J Citiflúor (Ted Pella, Reactivo de Montaje INC. , 19 76-A) contra desvacenimiento Medio 2X Cuadro 3 Compuestos Concentración CAS Medio Extracto de Levadura 20 g/L Pirofosfato Férrico 0.5 g/L L-Cisteina 0.8 g/L (clorhidrato) a-cetoglutarato 2 g/L Tampón 2 g/L ACES/Hidróxido de Potasio SupleGlicina 6 mg/L mento Selectivo Vancomicina 2 ug/L Polimixina 160 ÜI/L Cicloheximida 160 ug/L Antibió- Ciprofloxacina 8 mg/L 85721- tico de 33-1 División de Célula SuplemenPiruvato 2 g/L to de Crecimiento Todos los reactivos se esterilizaron mediante filtración a través de membrana de nitrocelulosa de 0.2 um de tamaño de poro (Millipore, SLGS025 OS) . Para detalles de cada juego ver el reactivo abajo.

Solución de hibrxdización Cuadro 4 Todos los reactivos se esterilizaron mediante filtración a través de membrana de nitrocelulosa de 0.2-um de tamaño de poro (Millipore, SLGS025 OS) .

La sonda usada para detección FISH fue: LEG705 (Eurogentec 5' -CTGGTGTTCCTTGCCGATC-3' ) , especifica de Legionellaceae y etiquetada con FITC (Isotiocinato de fluoresceína) PNE1 (Eurogentec: 5' -CTGGTGTTCCTCCGATC-3' ) específica de género Leogionella pneumophila y etiquetada con Cy3.

Las sondas se añadieron a solución de hibridizacióhn a concentración final de 1 ng/ul.

Solución de lavado Cuadro 5 Todos los reactivos se esterilizaron mediante filtración a través de membrana de nitrocelulosa 0.2 um de tamaño de poro (Millipore, SLGS025 OS) .

Ejemplo 2 Se aplica el protocolo experimental del Ejemplo 1 a una muestra empleando leg705 de primera sonda etiquetada con un tinte fluorescente verde y segunda sonde PNE1 etiquetada con un tinte fluorescente rojo.

La figura 2 muestra cuatro casos que permiten que Legionella pneumophila se distinga de bacterias naturalmente fluorescentes. Haciendo referencia a la figura 2: Caso 1 -Ningunas bacterias fluorescentes ni verde ni roja - la bacteria no pertenece al género Legionella y a la especie Legionella pneumophila.

Caso 2 - solamente bacteria fluorescente verde - la bacteria pertenece al género Legionella 0 es naturalmente fluorescente .

Caso 3 - Solamente bacteria Roja. A pesar de la fluorescencia roja, la bacteria no pertenece a la especie Legionella pneumophila debido a que no es fluorescente verde y asi no pertenece al género Legionella. Esta bacteria es naturalmente fluorescente roja; y Caso 4 - Bacteria fluorescente Verde Y Roja - la bacteria pertenece a género legionella Y especia Legionella pneumophila .

Usando este método podemos detectar de manera precisa Legionella pneumophila limitando la detección a bacterias naturalmente fluorescentes que de otra manera indicarían falsamente esta bacteria.

La sonda PNE1 primero se describe en Grimm y col. (Grimm y col., 1998). La secuencia especifica es: 5'-ATC TGA CCG TCC CAG GTT-3' .

La sonda Leg705 primero se describe en Manz y col (Manz y col., 1995). La secuencia especifica es: 5' CTGGTGTTCCTTCCGATC-3' .

Se usaron tres tintes en esta prueba como sigue: El primer tinte se usó para manchar ácido nucleico de todos los microorganismos. DAPI se usa para manchar bacterias en azul bajo excitación de UV. Este tinte no se acopla con una sonda oligonucleotídica.

Los segundos dos tintes se acoplan con sonda oligonucleotidico para permitir detección específica. Estos dos tintes se deben caracterizar por dos espectros diferentes de excitación/emisión. En la prueba FITC y Cy3 se usan, que son los tintes más comúmente usados para detección FISH, pero muchos tintes con respectivamente los mismos espectros están disponibles .

Tintes usados ? Excitación ? Emisión [nm] Tintes disponm] nibles DAPI 350 461 FITC 494 521 Alexa 488, k Hylite 488, Dylight 488 Cy3 550 58' Rhodamine, Alexa 555, Hylite 555, 5 10 15

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. - Un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos, que comprende: (1) poner en contacto la muestra con un recurso nutritivo de célula y un inhibidor de proliferación celular; (2) poner en contacto la muestra con cuando menos una sonda oligonucleotídica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (3) detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que los microorganismos son de la especia Legionella pneumophila y en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacina y cefalexina.

2. - Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el recurso nutritivo de célula del paso 1) contiene un suplemento de crecimiento que comprende un antioxidante, de preferencia ácido pirúvico (o sal del mismo) .

3. - Un método de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el recurso nutritivo de célula del paso 1) contiene ácido glutámico (o sal del mismo)

4.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el recurso nutritivo de célula del paso 1) contiene ácido glutámico (o sal del mismo) y ácido pirúvico (o sal del mismo) .

5.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la sonda oligonucleotidica se selecciona del grupo que consiste en sonda PNE 1; sonda LEPNE 1; y sonda LP2.

6. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que en el paso (2) la muestra se pone en contacto con cuando menos una primera sonda y una segunda sonda en la que la primera sonda es capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos y la segunda sonda es capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción diferente de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos.

7. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que en el paso (2) la muestra se pone en contacto con cuando menos una primera sonda y una segunda sonda en donde la primera sonda es capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales todos pertenecientes el género Legionella y en el que la segunda sonda es capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de los ácidos nucleicos ribosomales todos pertenecientes a la especie Legionella pneumophila.

8. - Un método de conformidad con la reivindicación 7, en el que la primera sonda se selecciona del grupo que consiste de sonda LEG705,; la sonda LEG2226 la sonda Legallll; la sonda Legall22; y la sonda Legl20v.

9. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el paso (3) se realiza automáticamente usando un microscopio epifluorescente .

10. - Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra se deriva de cualquiera del grupo seleccionado de aguas de enfriamiento industriales, aguas para beber, y aguas naturales .

11. - Equipo para detectar y enumerar más rápidamente microorganismos viables de la especie Legionella pneumophila en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos que comprende: (1) una recurso nutritivo de célula, (2) un inhibidor de proliferación celular; (3) cuando menos una sonda oligonucleotídica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (4) un medio para detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacina y cefalexina. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un método para detectar y enumerar microorganismos viables en una muestra sospechada de contener dichos microorganismos que comprende: (1) poner en contacto la muestra con un recurso nutritivo de célula y un inhibidor de proliferación celular, (2) poner en contacto la muestra con cuando menos una sonda oligonucleotidica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (3) detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que los microorganismos están presentes son de la especia legionella pneumophila y en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste de ciprofloxacina y ceflexina. La invención también incluye un equipo que comprende : (1) un recurso nutritivo de célula, (2) un inhibidor de proliferación celular, (3) cuando menos una sonda oligonucleótidica etiquetada con fluorescencia capaz de hibridizar específicamente cuando menos una porción de ácidos nucleicos ribosomales de los microorganismos, (4) un medio para detectar y cuantificar la señal fluorescente, en el que el inhibidor de proliferación celular se selecciona del grupo que consiste en ciprofloxacina y cefalexina .