KR20100122773A - 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 균주를 이용하여 숙신산이 제조된 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법으로서, 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하여 생성된 숙신산염을 함유하는 침전물에, 염산수용액 및/또는 질산수용액을 첨가하여 결정상태의 순수한 숙신산을 생성하는 단계를 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법에 대한 것이다.
숙신산, 침전, 결정화

Description

발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법{PROCESS FOR SEPARATING AND PURIFYING SUCCINIC ACID FROM FERMENTATION BROTH}
본 발명은 균주를 이용하여 숙신산이 제조된 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
최근 제한된 화석자원에 대한 의존도를 줄이고 재생 가능하며 지속적인 사용이 가능한 생물 자원을 이용한 친환경 화학 제품 개발에 대한 관심이 급증하고 있다. 화석 원료를 대체하는 생물 자원에서 유도될 수 있는 화합물 중 숙신산(succinic acid)은 C4 화합물의 플랫폼(platform)으로서, BDO(1,4-butanediol), THF(tetrahydrofuran), GBL(gamma-butyrolactone), NMP(n-methylpyrrolidone) 등과 같은 범용 제품의 생산을 위한 원료로 이용될 것으로 전망되고 있다. 아울러, 포도당으로부터 숙신산을 제조하는 공정은 이산화탄소 고정 발효로서 온실가스의 배출 감소에 관한 교토 협약에 대한 적극적인 대응 수단이 될 수 있다는 점에서 그 의미가 크다고 할 수 있다.
숙신산은 식품, 의약품 및 화장품 산업의 원료로 광범위하게 이용되어 왔다. 일반적으로 숙신산은 노르말 부탄(n-butane)으로부터 무수말레인산(maleic anhydride)을 거쳐 만들어졌다. 그러나, 숙신산은 이러한 석유화학 공정뿐만 아니라, 생물체의 주 대사 경로 중의 하나인 TCA(TriCarboxylic Acid Cycle) 회로의 대사 산물로서 발효를 통해 제조될 수 있다.
다만, 균주를 이용하여 탄수화물을 발효시켜 형성된 발효액에는 원하는 목적물인 숙신산 이외에, 피부르산, 시트르산, 옥살아세트산, 개미산, 초산, 푸마르산과 같은 기타 유기산, K+, NH4 +, Mg2 +, Na+ 등의 양이온, CO3 2 -, PO4 -, SO4 2 - 등의 음이온, 미반응 탄수화물, 아미노산과 함께 과량의 물이 포함되어 있다. 그러므로, 상기 발효액으로부터 고순도의 숙신산을 얻기 위해서는 상기 발효액으로부터 상술한 물질들을 효율적으로 제거할 필요가 있다.
그러나, 현재까지 당 업계에 알려진 공정에 따라 고순도의 숙신산을 분리·정제할 경우에는 많은 에너지가 필요하며, 전체 생산비용의 약 50 ~ 70 %를 차지하는 이러한 숙신산의 분리·정제 상의 고비용 때문에 생물학적 공정을 통한 숙신산의 제조 단가는 기존 석유화학 공정에 비해 월등히 높다.
현재까지 당 업계에 알려진 발효액으로부터 숙신산을 분리·정제 하는 방법으로 전기투석-결정화법, 이온교환수지-결정화법, 침전-결정화법 및 추출-결정화법 등이 있다.
전기투석-결정화법 또는 이온교환수지-결정화법은 이온교환막 또는 이온교환수지를 이용해서 발효액 중의 숙신산염을 숙신산으로 치환하는 공정; 및 상기 숙신산 수용액에서 물을 증발시켜 상대적으로 용해도가 낮은 숙신산을 선택적으로 분리 하는 공정을 포함하는 방법이다. 이러한 방법은 빠른 처리, 부산물의 비(非)생성 등의 장점을 가지고 있다. 그러나, 이용되는 이온교환막과 이온교환수지의 장비가 고가이고, 장기간 이용 시 이온교환막이나 이온교환수지가 오염되어 실효성이 떨어지며, 상업 생산 규모에 적용하였을 경우 운전상의 효율이 떨어지는 등의 문제를 갖고 있다. 게다가, 전기투석-결정화법 또는 이온교환수지-결정화법은 물 증발 공정에 따른 고에너지 및 고비용 문제로 인해서 상업화되지 못하고 있다.
추출-결정화법은 추출용매를 이용하여 발효액 중에서 기타 유기산을 선택적으로 제거하는 공정; 및 기타 유기산이 제거된 발효액에서 물을 증발시켜 숙신산을 선택적으로 분리하는 공정을 포함하는 방법이다. 이 방법도 물 증발 공정에 따른 고에너지 및 고비용 문제를 갖고 있으며, 또한 추출 용매의 고비용, 유기용매의 재활용 문제, 유기용매의 낮은 선택도 등의 문제를 갖고 있다.
침전-결정화법은 수산화칼슘을 이용하여 발효액 중에 숙신산을 선택적으로 침전시키는 공정; 및 상기 침전물에 황산수용액을 첨가하여 불용성인 황산칼슘을 수용액상의 숙신산과 분리하고, 분리된 수용액상의 숙신산에서 물을 증발시켜 숙신산을 결정화시키는 방법이다. 이 방법도 물 증발 공정에 따른 고에너지 및 고비용 문제를 갖고 있고, 또한 상당량의 고체 폐기물인 황산칼슘이 생성되는 문제를 갖고 있다.
본 발명자들은 균주를 이용하여 숙신산이 제조된 발효액에 염기를 첨가하여 얻은 숙신산염에 황산수용액 대신에 염산수용액 및/또는 질산수용액을 첨가할 경우, 부산물로서 황산칼슘과 같이 용해도가 낮은 염 대신에 염화칼슘이나 질산칼슘 등과 같이 용해도가 높은 염이 생성되기 때문에, 추가적인 정제 공정 없이도 결정상태의 고순도 숙신산을 얻을 수 있다는 것을 알았다. 본 발명은 이에 기초한 것이다.
본 발명은 균주를 이용하여 숙신산이 제조된 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법으로서, 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액에, 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 생성하는 단계; 및 상기 숙신산염을 함유하는 침전물에, 염산수용액, 질산수용액 및 이들의 혼합액 중에서 선택된 산성 수용액을 첨가하여 결정상태의 숙신산을 생성하는 단계를 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법을 제공한다.
본 발명은 발효액으로부터 숙신산을 분리·정제하는 방법으로서, 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하여 생성된 숙신산염을 함유하는 침전물에 염산수용액 및/또는 질산수용액을 첨가시킴으로써, 결정상태의 숙신산과 더불어 용해도가 높은 염이 생성되기 때문에, 저비용의 단순한 여과장치만을 이용하더라도 고순도의 숙신산을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.
본 발명에서 제1 상등액은 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하여 수득되는 숙신산염을 함유하는 침전물 이외의 액체 물질을 의미한다.
또, 본 발명에서 제2 상등액은 숙신산염을 함유하는 침전물에 염산수용액 또는 질산수용액을 첨가하여 수득되는 결정상태의 숙신산 이외의 액체 물질을 의미한다.
본 발명은 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 발효액에 염기를 첨가하여 생성된 숙신산염을 함유하는 침전물에 염산수용액 및/또는 질산수용액을 첨가함으로써, 저비용 및 고효율로 결정상태의 숙신산을 수득하는 것을 특징으로 한다.
일반적으로 균주에 의해 포도당이나 탄수화물 등의 물질이 분해되면, 숙신산 과 더불어, 피부르산, 시트르산, 옥살아세트산, 개미산, 초산, 푸마르산 등과 같은 기타 유기산류, K+, NH4 +, Mg2 +, Na+ 등과 같은 양이온, CO3 2 -, PO4 -, SO4 2 - 등과 같은 음이온, 미반응 포도당이나 탄수화물, 아미노산과 과량의 물을 포함하는 발효액이 형성된다. 이러한 발효액으로부터 원하는 고순도 숙신산을 얻기 위해서는 발효액에서 숙신산만을 선택적으로 분리할 수 있어야 한다.
이에, 종래 침전-결정화법에서는 상기 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정 제하기 위하여, 상기 발효액에 염기(ex. 수산화칼슘)를 첨가하여 숙신산염 침전물(ex. calcium succinate)을 생성한 후 상기 숙신산염 침전물에 묽은 황산수용액을 첨가하였다. 이 때, 숙신산 (상온에서 용해도 74.5 g/l), 황산칼슘 (상온에서 용해도 2.4 g/l) 및 기타 부산물(기타 유기산, 음이온 유도산)이 생성되며 이 중 가장 낮은 용해도를 가진 황산칼슘이 선택적으로 침전되어 비교적 정제된 숙신산 수용액을 얻을 수 있었다. 다만, 상기 방법의 경우, 고체 폐기물인 황산칼슘(CaSO4)은 침전되는 반면, 기타 부산물(기타 유기산, 음이온 유도산) 및 다량의 물은 숙신산과 함께 상등액에 포함되어 있어서 결정상태의 숙신산을 얻기 위해서는 추가적인 분리 공정이 필요한 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 실험을 통해 상기 숙신산염 침전물에 묽은 황산수용액 대신에 고농도의 염산수용액 및/또는 고농도의 질산수용액을 첨가할 경우, 숙신산(상온에서의 용해도: 74.5 g/l), 염화칼슘 및/또는 질산칼슘(상온에서의 용해도: 각각 745 g/l 및 1212 g/l), 및 기타 부산물(기타 유기산, 음이온 유도산)이 생성되어 이 중 가장 용해도가 낮은 숙신산을 선택적으로 침전시킬 수 있기 때문에, 저비용의 단순한 여과장치만을 이용하더라도 결정상태의 숙신산만을 용이하게 얻을 수 있다는 것을 알았다.
예를 들어, 다량의 숙신산이 함유된 발효액에, 수산화칼슘과 같은 염기를 첨가하면, 숙신산 음이온(succinate anion)과 염기의 양이온(ex. Ca2+)으로 이루어진 숙신산염(ex. calcium succinate)이 침전된다. 이후, 분리된 숙신산염 침전물에 염산수용액(및/또는 질산수용액)을 첨가시키면, 숙신산과 더불어 반응 부산물로서 상기 숙신산염을 형성했던 양이온과 상기 염산수용액 내 염산 음이온(및/또는 질산수용액 내 질산 음이온)으로 이루어진 염[ex. CaCl2(및/또는 Ca(NO3)2)]이 생성된다. 이때, 생성된 염화칼슘 및/또는 질산칼슘이 숙신산에 비해서 용해도가 상대적으로 높아 상등액에 함유되기 때문에, 숙신산은 선택적으로 침전될 수 있다. 게다가, 숙신산염 침전물에 함유되어 있던 기타 유기산 유도염(피부르산염, 시트르산염, 옥살아세트산염, 개미산염, 초산염, 푸마르산염)과 음이온 유도염(황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘) 등이 염산수용액(및/또는 질산수용액)과 반응하여 생성된 기타 유기산(피부르산, 시트르산, 옥살아세트산, 개미산, 초산, 푸마르산) 및 음이온 유도산(황산, 인산, 탄산) 등도 숙신산에 비해 용해도가 높기 때문에 염화칼슘(및/또는 질산칼슘)과 마찬가지로 상등액 내에 함유되어 있다. 따라서, 본 발명은 필터 등과 같은 저비용의 단순한 여과 장치를 이용하여 고순도 숙신산 결정을 상등액과 쉽게 분리할 수 있었다.
이와 같이 본 발명은 필터와 같은 저비용의 여과장치를 이용하여 용이하게 결정상태의 숙신산을 얻을 수 있기 때문에, 종래의 숙신산 분리·정제 방법과 달리 결정상태의 숙신산을 얻기 위한 고에너지·고비용의 물 증발 공정을 수행할 필요가 없고, 이로 인해 숙신산을 얻기 위한 전체 공정이 단순해 질 수 있으며, 비용도 절감될 수 있다.
게다가, 종래 황산수용액을 이용하여 숙신산염으로부터 숙신산 결정을 형성 하는 경우에는 부산물로서 불용성의 황산칼슘이 생성되게 되는데, 이때 생성된 황산칼슘은 재생이 어렵고 극히 제한된 용도로만 이용될 수 있다. 반면, 본 발명에서 생성된 반응 부산물, 예컨대 염화칼슘의 경우, 단순한 고온 수화 반응을 통해 염산과 수산화칼슘으로 분리되어 필요로 하는 단계에서 다시 이용될 수 있으며, 또한 염화칼슘 자체로도 범용 제품인 제설제로서 이용될 수 있다.
본 발명은 균주를 이용하여 숙신산이 제조된 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법으로서, 상기 방법은 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하여 생성된 숙신산염을 함유하는 침전물에, 염산수용액 및/또는 질산수용액을 첨가하여 결정상태의 숙신산을 생성하는 단계를 포함한다.
Ⅰ. 숙신산염을 함유하는 침전물 형성
본 발명에서 이용하는 숙신산염을 함유하는 침전물은 하기와 같은 방법에 의해서 제조될 수 있는데, 이에 제한되지 않는다.
Ⅰ-1. 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제1 방법
상기 숙신산염을 함유하는 침전물(60)은 균주(20)를 이용하여 숙신산이 발현된 발효액(30)을 형성하는 단계; 및 상기 숙신산이 발현된 발효액(30)에 염기(40)를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물(60)을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 형성될 수 있다.
(1) 발효액의 준비
본 발명에서 이용되는 발효에 의해 숙신산을 생산하는 균주(20)는 당 업계에서 일반적으로 알려진 숙신산을 발현할 수 있는 균주라면 특별히 제한되지 않고 이용할 수 있다. 상기 균주의 예로는, 언에어로바이오스피릴륨 숙시닉프루듀센스(Anaerobiospirillum succinicproducens), 만헤이미아 숙시닉프루듀센스(Mannheimia succinicproducens), 에스커리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 액티노바실러스 숙시노젠(Actinobacillus succinogens), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 및 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 등이 있는데, 이에 제한되지 않는다.
이러한 균주를 이용하여 탄수화물을 영양분들과 함께 이산화탄소의 존재 하에서 대사시키면 숙신산이 다량 발현된 발효액을 얻을 수 있는데, 상기 발효액에는 해리된 숙신산 뿐만 아니라, 해리된 기타 유기산(ex. 피부르산, 시트르산, 옥살아세트산, 개미산, 초산, 푸마르산 등), 양이온 (K+, NH4+, Mg2 +, Na+), 음이온 (CO3 2 -, PO4 -, SO4 2 -)이 함유된 발효액을 얻을 수 있다. 또, 상기 발효액에는 상기 물질들 이외에, 미반응 탄수화물, 아미노산과 과량의 물이 포함되어 있을 뿐만 아니라, 이용된 균주도 포함되어 있다.
이러한 발효액의 형성 공정은 Batch 형태, Fed-batch 형태, 또는 연 속(Continuous)형태로 수행될 수 있다.
본 발명에서는 상기와 같은 발효액(30)을 숙신산염 형성 영역(Ⅰ-1(b))에 공급하기 전에, 선택적으로 원심분리영역에서 원심분리기를 이용하여 상기 숙신산이 발현된 발효액으로부터 균주를 분리할 수 있다(미도시됨). 이때, 분리된 균주를 회수하여 발효액 형성 영역에서 다시 사용함으로써, 전체 비용을 절감할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 균주가 분리된/분리되지 않은 발효액(30)을 숙신산염 형성 영역(Ⅰ-1(b))으로 이송하기 전에, 선택적으로 불순물인 음이온(CO3 2 -, PO4 -, SO4 2-), 특히 탄산이온(CO3 2-)을 상기 숙신산이 발현된 발효액에서 미리 제거할 수 있다. 왜냐하면, 발효액에 음이온이 포함되어 있을 경우에는, 추후 숙신산염 생성 영역에서 발효액에 첨가되는 염기(ex. Ca(OH)2 등)가 발효액 내 해리된 숙신산과 반응하여 숙신산염이 생성될 때, 발효액 내 음이온도 상기 염기와 반응하여 기타 불순물(ex. CaCO3, Ca(PO4)2, CaSO4 등)이 생성되고, 이때 상기 기타 불순물이 상기 숙신산염과 함께 침전되어, 추후 결정상태의 숙신산의 순도 저하를 초래할 수 있기 때문이다.
상기 음이온의 제거 방법으로는, 숙신산이 발현된 발효액을 가열하여 상기 발효액 내에 함유된 음이온을 제거하는 방법, 또는 폭기(aeration, 曝氣)를 이용하여 상기 숙신산이 발현된 발효액에 공기 또는 질소를 공급함으로써 상기 발효액 내에 함유된 음이온을 제거하는 방법 등이 있는데, 이에 제한되지 않는다. 이러한 방법에 의해서 상기 발효액 내에 함유된 음이온은 기체 상태로 제거될 수 있으며, 특히 숙신산이 발현된 발효액의 준비 시 탄소원(이산화탄소)이어서 다량 함유되어 있는 탄산이온(CO3 2-)은 기체 상태의 이산화탄소로 제거될 수 있다.
상기 발효액의 가열 온도는 약 50 내지 100 ℃ 범위인 것이 바람직하다. 만약, 발효액의 가열 온도가 50 ℃ 미만인 경우에는 탄산이온 제거율이 낮고, 발효액의 가열 온도가 100 ℃ 초과인 경우에는 에너지 소모량이 높다.
다만, 발효액 내 음이온의 함유량이 적을 경우에는 상기 음이온 제거 공정을 수행하지 않더라도 후속하는 공정들을 통해서 음이온이 효과적으로 제거될 수 있기 때문에, 상기 음이온 제거 공정을 반드시 수행할 필요가 없다.
(2) 숙신산염 침전
상기와 같이 준비된 발효액, 즉 균주를 이용하여 숙신산이 함유된 발효액(30)을 숙신산염 형성 영역(Ⅰ-1(b))에 공급하면서 염기(40)를 첨가하면, 상기 염기와 발효액 내 물질들이 반응하여 침전물(60) 및 상등액(이하, '제1 상등액'이라 함)(50)이 생성된다. 여기서, 상기 침전물(60)에는 숙신산염 및 음이온에 의해 유도된 미량의 염이 침전물의 형태로 함유되어 있으며, 상기 제1 상등액(50)은 미반응 탄수화물, 아미노산, 양이온 등이 용해되어 함유되어 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 염기(40)로는 발효액 내 숙신산을 선택적으로 침전시킬 수 있는 물질이라면 특별히 제한되지 않는다. 이러한 물질의 예로는 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 탄산칼슘(CaCO3), 탄산마그네 슘(MgCO3), 및 이들의 혼합물 등이 있는데, 이에 제한되지 않는다. 여기서, 상기 염기가 해리된 숙신산(숙신산 음이온)과 반응하여 형성된 숙신산염 중에서, 칼슘숙신산염(용해도: 약 15 g/l)이 마그네슘숙신산염(용해도: 약 45 g/l)에 비해서 침전이 보다 잘 일어나기 때문에, 수산화칼슘 또는 탄산칼슘을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 염기(40)는 상온하에서 발효액에 첨가될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 실험을 통해 상온보다는 고온하에서 염기를 발효액에 첨가할 경우, 보다 많은 양의 숙신산염이 함유된 침전물을 얻을 수 있다는 것을 알고, 약 100 ℃ 이하, 바람직하게는 약 50 내지 100 ℃ 범위의 고온으로 가열된 또는 가열되고 있는 발효액(30)에 상기 염기(40)를 첨가하였다. 만약, 발효액에 염기의 첨가가 100 ℃ 초과의 온도하에서 수행될 경우에는 물의 증발시 많은 양의 에너지가 소비되기 때문에 비효율적일 수 있다. 예를 들어, 상온에서 상등액 내 칼슘숙신산염의 농도는 약 15 g/l인 반면, 80 ℃에서는 칼슘숙신산염의 농도가 약 11 g/l로 낮아져 보다 많은 양의 칼슘숙신산염을 침전물의 형태로 얻을 수 있었다.
이렇게 염기(40)가 발효액(30)에 첨가되어 생성되는 숙신산염(ex. 칼슘숙신산염, 마그네슘숙신산염 등)(60)은, 발효액 내 미반응 탄수화물, 아미노산, 양이온, 기타 유기산(ex. 피부르산, 시트르산, 옥살아세트산, 개미산, 초산, 푸마르산 등)이 염기와 반응하여 형성된 유도염들에 비해서 물에 대한 용해도가 상대적으로 낮기 때문에, 선택적으로 침전될 수 있다. 이때, 발효액 내 미반응 탄수화물, 아 미노산, 양이온, 기타 유기산에 의해 유도되는 염은 물에 대한 용해도가 높아 제1 상등액(50) 내 함유되어 있다.
다만, 상기와 같이 숙신산염이 침전될 때, 상기 발효액 내 음이온들(CO3 2 -, PO4 -, SO4 2 -)은 다른 물질들과 달리 첨가된 염기와 반응하여 침전되고, 이로 인해 생성되는 침전물에는 숙신산염 이외에 음이온에 의해 유도된 염이 함유되어 있다. 이렇게 침전물에 숙신산염 이외 음이온에 의해 유도된 염이 함유되어 있을 경우, 추후 최종 결정상태의 숙신산의 순도가 저하될 수 있다.
그렇기 때문에, 본 발명에서는 숙신산염의 침전물이 보다 많이 형성되고 음이온에 의해 유도된 염의 침전물은 보다 적게 형성되도록, 상기 염기의 첨가 시 숙신산이 발현된 발효액의 pH를 약 4.5 내지 6.5 이하로 유지되도록 하였다. 왜냐하면, pH가 낮은 상태에서는 숙신산 음이온-염기의 반응이 기타 음이온-염기의 반응에 비해 선택도가 높기 때문이다. 이로써, 음이온에 의해 유도된 염의 형성이 최소화되어 생성되는 숙신산염을 함유하는 침전물의 순도를 향상시킬 수 있고, 결국 최종 결정상태 숙신산의 품질을 향상시킬 수 있다.
이와 같이 형성된 숙신산염을 함유하는 침전물(60)과 제1 상등액(50)은, 경우에 따라 필터와 같은 여과 장치를 이용하는 여과 영역에서 여과 장치를 통해 서로 분리될 수 있다(미도시됨). 이후, 분리된 숙신산염을 함유하는 침전물(60)은 숙신산 결정 형성 영역(Ⅱ)으로 이송되며, 이와 동시에 제1 상등액(50)은 회수되어 발효액 형성 영역(Ⅰ-1(a))에서 재사용될 수 있다.
다만, 분리된 제1 상등액(50)을 회수하여 재사용할 때 상기 제1 상등액 내 불순물의 농도가 균주 발효에 저해되는 수준이 될 경우에는, 퍼지(purge) 공정을 통해 상기 제1 상등액 내 불순물의 농도를 일정 수치 이하로 감소시킨 후에 재사용하는 것이 적절하다.
구체적으로, 분리된 제1 상등액 내 불순물의 농도가 약 1 중량% 초과 범위, 바람직하게는 1 중량% 내지 2 중량% 범위 정도로 균주 발효에 저해되는 수준이 되는 경우에는, 상기 제1 상등액(50)을 발효액 형성 영역(Ⅰ-1(a))으로 바로 이송하여 재사용하기 보다는 퍼지(purge) 영역(Ⅳ)으로 이송하여 상기 제1 상등액의 일부를 버리고 버린 양만큼의 물을 더 첨가하여 제1 상등액 내 불순물의 농도를 1 중량% 이하로 감소시킨 후에, 발효액의 형성시 재사용하는 것이 적절하다.
Ⅰ-2. 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제2 방법
한편, 상기와 같이 생물자원으로부터 숙신산 생산을 상업화하기 위해서는, 발효액의 형성 공정에서 수율이 향상된 숙신산을 제조하는 것과 분리 및 정제 공정에서 저비용으로 품질이 향상된 숙신산을 수득하는 것이 중요하다.
그런데, 전술한 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제1 방법의 경우, 발효가 진행됨에 따라 발효액 내 숙신산의 농도가 높아지면 생성물인 숙신산에 의해 균주의 성장이 저해되는 생성물억제(Product Inhibition) 현상이 발행하여 일정 농도 이상의 숙신산을 얻을 수 없다. 이를 해결하고자, 생성물인 숙신산에 내성이 강한 균주를 이용하거나, 균주의 성장을 저하하지 않도록 생성된 숙신산을 지속적으로 변환 또는 배출시켜서 발효액 내 숙신산의 농도를 낮게 유지시켜 주어야 한다.
이에, 본 발명에서는 균주에 의해 발효가 진행되고 있는 도중에 숙신산이 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성함으로써, 발효액 내 숙신산의 농도가 낮게 유지될 수 있어 최종 숙신산의 수율이 향상될 수 있다. 이러한 방식으로 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 것을, 하기에서는 '숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제2 방법'이라 한다.
구체적으로, 전술한 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제1 방법의 경우, 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 발효액을 형성시킨 후, 즉 발효가 종료된 후에 상기 발효액에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 반면, 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제2 방법의 경우, 균주를 이용하여 숙신산을 발현된 발효액을 형성하되, 발효가 진행되는 도중에 숙신산이 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성한다. 다시 말하면, 상기 제1 방법은 숙신산이 발현된 발효액의 형성과 숙신산염을 함유하는 침전물의 형성이 별도의 공정에서 이루어지는 반면, 제2 방법은 숙신산이 발현된 발효액의 형성과 숙신산염을 함유하는 침전물의 형성이 동시에 하나의 공정에서 이루어지는 것이다.
즉, 숙신산염을 함유하는 침전물(60)은, 도 3에 도시된 바와 같이, 균주(20)를 이용하여 숙신산이 발현된 발효액을 형성하되, 상기 숙신산이 발현되고 있는 발 효액에 염기(40)를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물(60)을 형성하는 단계에 의해서 형성될 수 있다.
본 발명에서 이용 가능한 균주(20)는, 전술한 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제1 방법과 마찬가지로, 당 업계에서 일반적으로 알려진 숙신산을 발현할 수 있는 균주라면 특별히 제한되지 않고 이용할 수 있다. 상기 균주에 의한 발효로 인해서, 숙신산과 더불어, 해리된 기타 유기산(ex. 피부르산, 시트르산, 옥살아세트산, 개미산, 초산, 푸마르산 등), 양이온 (K+, NH4+, Mg2 +, Na+), 음이온 (CO3 2 -, PO4 -, SO4 2 -), 미반응 탄수화물, 아미노산과 과량의 물을 포함하는 발효액(이하, '숙신산이 발현된 발효액'이라 함)이 형성된다.
이렇게 균주에 의해서 발효가 진행되는 도중에, 상기 숙신산이 발현되고 있는 발효액에 염기(40)를 첨가한다. 이때, 첨가되는 염기(40)는 전술한 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 제1 방법과 마찬가지로, 발효액 내 숙신산을 선택적으로 침전시킬 수 있는 것이라면, 특별히 제한되지 않는다. 이러한 물질의 예로는 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 탄산칼슘(CaCO3), 탄산마그네슘(MgCO3), 및 이들의 혼합물 등이 있는데, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 상기 염기가 해리된 숙신산(숙신산 음이온)과 반응하여 형성된 숙신산염 중에서, 칼슘숙신산염(용해도: 약 15 g/l)이 마그네슘숙신산염(용해도: 약 45 g/l)에 비해서 침전이 잘 일어나기 때문에, 수산화칼슘 또는 탄산칼슘을 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 균주를 이용하여 숙신산을 제조하기 위해서는 탄소원으로서 탄산이온이 충분히 공급되어 발효액에 용해되어 있어야 하는데, 이때 기체 상태의 이산화탄소를 발효액 형성 영역에 투입하는 것보다는 탄산칼슘이나 탄산마그네슘을 투입하여 발효액에 용해시키는 것이 공급 효율이 높아 발효에 유리하다. 이와 같이, 탄소이온의 공급원이면서 침전염을 형성할 수 있는 탄산칼슘이나 탄산마그네슘을 이용하는 것이 적절할 수 있다. 보다 바람직하게는, 탄산이온도 공급할 수 있고, 숙신산을 선택적으로 보다 잘 침전시킬 수 있는 탄산칼슘을 이용하는 것이 적절하다.
이와 같은 염기(40)가 숙신산이 발현되고 있는 발효액에 첨가되면, 발효액 내 숙신산이 염기와 산-염기 반응을 일으켜 숙신산염이 형성된다. 예를 들어, 첨가되는 염기가 수산화칼슘일 경우에는, 칼슘숙신산염(Calcium Succinate)이 형성되고, 첨가되는 염기가 수산화마그네슘일 경우에는 마그네슘숙신산염(Magnesium Succinate)이 형성될 수 있다.
이때, 형성되는 숙신산염은 발효액 내 숙신산(용해도: 약 78 g/l)에 비해 상온에서 용해도가 낮기 때문에 침전된다. 예를 들어, 형성되는 숙신산염이 칼슘숙신산염일 경우, 상온에서 상기 칼슘숙신산염의 용해도가 15 g/l 정도로 발효액 내 숙신산보다 낮기 때문에 침전된다. 또, 형성되는 숙신산염이 마그네슘숙신산염일 경우에는, 상온에서 용해도가 약 45 g/l으로 숙신산의 용해도보다 낮기 때문에 침전된다. 이렇게 발효가 진행되는 도중에 생성되는 침전물은 균주의 성장에 영향을 주지 않기 때문에, 생성물 억제 현상 없이 숙신산이 계속적으로 제조될 수 있어, 고농도의 숙신산을 제조할 수 있다.
한편, 균주에 의한 발효는 균주의 종류에 따라 최적 발효를 위한 pH 조건이 상이할 수 있으나, 일반적으로 pH 약 5 내지 7 정도에서 최적 발효가 이루어질 수 있다. 다만, 발효 시 숙신산의 생성으로 인해 발효액의 pH는 약 3 내지 4 정도로 서서히 감소하고, 이로 인해 발효가 적절하게 이루어지지 않을 수 있다. 이러한 발효액에 염기를 분말 형태 또는 슬러리 형태로 적당히 첨가함으로써, 상기 숙신산이 발현되는 발효액의 pH를 약 5 내지 7 정도로 유지할 수 있다.
아울러, 숙신산이 발현되고 있는 발효액에 염기를 첨가하게 되면, 발효액 내 숙신산으로부터 유도된 염, 즉 숙신산염이 선택적으로 침전될 때, 발효액 내 음이온들(CO3 2-, PO4 -, SO4 2-)도 숙신산과 마찬가지로 첨가된 염기와 반응하여 침전될 수 있다. 특히, 균주에 의한 발효시 탄소원으로서 사용되는 탄산이온의 경우, 발효 중에 이산화탄소 가스나 탄산염의 형태로 연속적으로 공급되기 때문에 상기 발효액에 첨가되는 염기와 반응한다. 이러한 탄산이온과 염기의 반응으로 인해, 상당한 양의 탄산칼슘염, 탄산마그네슘염과 같은 침전 탄산염이 생성되어 숙신산염과 함께 침전되고, 결국 숙신산염을 함유하는 침전물의 순도 저하를 초래한다. 또한, 균주의 성장에 있어 필수 성분인 인산이온 또는 황산이온은 발효액 내 미량으로 함유되어 있지만, 이들 이온이 첨가된 염기와 반응하여 침전되게 되면 균주의 발효를 저해할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는 숙신산염의 침전물이 보다 많이 형성되고 음이온에 의해 유도된 염의 침전물은 보다 적게 형성되도록, 상기 염기의 첨가시 숙신산이 발현된 발효액의 pH를 약 4.5 내지 6.5 이하로 유지되도록 하였다. 왜냐하면, pH가 낮은 상태에서는 숙신산 음이온-염기의 반응이 기타 음이온-염기의 반응에 비해 선택도가 높기 때문이다. 이로써, 음이온에 의해 유도된 염의 형성이 최소화되어 생성되는 숙신산염을 함유하는 침전물의 순도가 향상될 수 있다.
상술한 바와 같이 발효 중에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물 형성은 Batch 형태, Fed-batch 형태, 또는 연속(Continuous)형태의 발효공정 중에 수행될 수 있다.
예를 들어, 균주에 의한 발효 중에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 공정이 상기 Batch 형태, Fed-batch 형태로 수행될 경우에는, 숙신산염을 함유하는 침전물의 농도가 약 10 내지 30 중량%가 될 때 발효를 중단한 후에, 디캔터(decanter), 필터, 혹은 원심분리기를 이용하여 생성된 숙신산염을 함유하는 침전물을 제1 상등액과 분리한 후 회수하여 추후 숙신산 결정 형성 영역으로 이송한다. 한편, 균주에 의한 발효 중에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성하는 공정이 연속발효 형태로 수행될 경우에는, 발효조 후단에 디캔터, 필터, 혹은 원심분리기를 이용하여 생성된 숙신산염을 함유하는 침전물을 제1 상등액과 분리한 후 회수하여 추후 숙신산 결정 영역으로 이송한다.
이때, 이용되었던 균주(20)는 제1 상등액(50) 내에는 균주가 부유하고 있어 숙신산염을 함유하는 침전물(60)과 용이하게 분리될 수 있다. 이렇게 균주를 포함하는 제1 상등액(50)은 회수되어 발효액 형성시 재사용될 수 있다.
다만, 분리된 제1 상등액(50)을 회수하여 재사용할 때, 상기 제1 상등액 내 불순물의 농도가 균주 발효에 저해되는 수준이 될 경우에는, 퍼지(purge) 공정을 통해 상기 제1 상등액 내 불순물의 농도를 일정 수치 이하로 감소시킨 후에 재사용하는 것이 적절하다.
구체적으로, 분리된 제1 상등액 내 불순물의 농도가 약 1 중량% 초과 범위, 바람직하게는 1 중량% 내지 2 중량% 범위 정도로 균주 발효에 저해되는 수준이 되는 경우에는, 상기 제1 상등액(50)을 발효액 형성에 바로 이용하기 보다는 퍼지(purge) 영역(Ⅳ)으로 이송하여 상기 제1 상등액의 일부를 버리고 버린 양만큼의 물을 더 첨가하여 제1 상등액 내 불순물의 농도를 1 중량% 이하로 감소시킨 후에, 발효액의 형성 시 재사용하는 것이 적절하다.
Ⅱ. 산성수용액 첨가에 의한 결정상태의 숙신산 형성
상술한 방법들에 의해서 수득된 숙신산염을 함유하는 침전물(60)은, 도 1 내지 3에 도시된 바와 같이, 숙신산 결정 형성 영역(Ⅱ)으로 이송되고, 여기에 염산수용액 및/또는 질산수용액(70)이 공급(첨가)됨으로써, 상기 숙신산염을 함유하는 침전물(60) 내 숙신산염이 염산수용액 및/또는 질산수용액과 반응하여 반응 생성물로서 숙신산을 생성하고, 부산물로서 염화칼슘 및/또는 질산칼슘을 생성한다. 또한, 숙신산염과 함께 침전물에 함유되어 있던 음이온에 의해 유도된 염들과 기타 유기산에 의해 유도되는 염은, 예컨대 황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘, 칼슘유기산염 등이 염산수용액 및/또는 질산수용액과 반응하여 황산, 인산, 탄산, 기타 유기 산 등과 같은 불순물을 생성한다.
다만, 생성되는 숙신산(90)은 상기 부산물(염화칼슘 및/또는 질산칼슘)이나, 상기 불순물에 비해 용해도가 상대적으로 낮기 때문에 침전된다. 반면, 용해도가 상대적으로 높은 부산물 또는 불순물은 상등액(이하, '제2 상등액'이라 함)(80)에 용해되어 제2 상등액 내에 함유된다. 예들 들어, 칼슘숙신산염을 함유하는 침전물(60)에 염산수용액(70)이 첨가되면, 침전물 내 칼슘숙신산염이 염산수용액과 반응하여 반응 생성물인 숙신산과 더불어 부산물인 염화칼슘을 생성하고, 또한 침전물 내 음이온에 의해 유도된 염과 기타 유기산에 의해 유도되는 염이 염산수용액과 반응하여 황산, 인산, 탄산과 기타 유기산 등의 불순물을 생성한다. 이때, 생성되는 숙신산(용해도: 약 78 g/l)은 부산물인 염화칼슘(용해도: 약 745 g/l)이나 불순물에 비해 상대적으로 용해도가 낮기 때문에, 숙신산은 제2 상등액에 용해되지 않고 침전되는 반면, 염화칼슘이나 불순물은 제2 상등액에 용해되어 제2 상등액 내에 존재한다.
이와 같이 숙신산염을 함유하는 침전물(60)에 염산수용액 및/또는 질산수용액(70)을 첨가하게 되면, 종래 황산수용액을 이용하는 경우와 달리, 숙신산과 함께 숙신산에 비해 상대적으로 용해도가 높은 염화칼슘 및/또는 질산칼슘이 형성되기 때문에, 오직 숙신산만을 용이하게 결정상태로 얻을 수 있다. 따라서, 종래 황산수용액을 이용하는 경우와 달리, 숙신산을 분리하기 위해 물 증발을 통해 결정 상태의 숙신산을 수득하는 공정이 추가적으로 필요하지 않고, 단지 필터와 같은 저비용의 여과장치를 이용하여 결정상태의 숙신산을 얻을 수 있다.
본 발명의 경우, 상기 숙신산염을 함유하는 침전물(60)과 상기 염산수용액(및/또는 질산수용액)(70)은 상기 숙신산염 침전물을 숙신산 결정으로 치환시킬 수 있는 비율로 혼합되는 것이 적절하다. 만약, 염산수용액(및/또는 질산수용액)의 사용 비율이 너무 적다면, 숙신산으로의 치환이 완전히 일어나지 않을 수 있고, 염산수용액(및/또는 질산수용액)의 사용 비율이 너무 많다면, 제2 상등액에 염산(및/또는 질산)이 잔류하여 제2 상등액의 재활용에 추가적인 비용이 발생하게 된다. 따라서, 상기 숙신산염을 함유하는 침전물과 염산수용액 및 질산수용액에서 적어도 하나의 산성수용액은 숙신산염을 함유하는 침전물 내 숙신산염(a) : 산성수용액 내 산 (b) = 1 : 1 ~ 1 : 5 몰 당량의 비율로 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는, 추후 제2 상등액에 용해되어 손실되는 숙신산의 양이 최소가 되도록 하면서 또한 숙신산 결정 내 불순물을 최소로 하기 위해서 적절한 농도의 염산수용액 및/또는 질산수용액을 사용하는 것이 중요하다. 예를 들어, 과도하게 묽은 염산 수용액 및/또는 질산 수용액을 사용하게 되면, 상등액에 용해되어 손실되는 숙신산의 양이 늘어나서 분리 수율이 낮아진다. 반면, 과도하게 진한 염산 수용액 및/또는 질산 수용액을 사용하는 경우에는, 불순물(특히, 염화칼슘 및/또는 질산칼슘)이 숙신산 결정 내에 포함되어 최종 숙신산의 품질을 떨어뜨릴 수 있을 수 있을 뿐 아니라 반응물의 유동성을 저해시킬 수도 있다. 그래서, 본 발명에서는 농도가 약 10 내지 40 중량%, 바람직하게는 약 20 내지 35 중량%인 염산 수용액을 사용하고/사용하거나, 농도가 약 20 내지 70 중량%, 바람직하게는 약 30 내지 60 중량%인 질산 수용액을 사용하였다.
이러한 염산 수용액 및 질산 수용액 중 적어도 어느 하나의 산성 수용액(70)은 상온 또는 약 50 ~ 100 ℃의 고온하에서 숙신산염을 함유하는 침전물(60)에 첨가되는 것이 적절하다.
한편, 숙신산염을 함유하는 침전물(60)과 염산수용액 및/또는 질산수용액(70)의 반응 결과, 결정상태의 숙신산(90)과 더불어 생성되는 제2 상등액(80)은 결정상태의 숙신산과 분리된 후에, 선택적으로 고온에서의 수화반응을 통해 산(70) 및 염기(40)를 분리 및 회수하여 재사용할 수 있다. 구체적으로, 수화반응 영역(Ⅴ)에서 결정상태의 숙신산과 분리된 제2 상등액(80)을 약 400 내지 800 ℃ 범위, 바람직하게는 약 400 내지 600 ℃ 범위의 온도 하에서, 제2 상등액 내 함유되어 있는 염, 예컨대 염화칼슘 또는 질산칼슘이 염산 또는 질산(70)과 수산화칼슘과 같은 염기(40)로 전환될 수 있다. 이때, 생성된 염산 또는 질산(70)은 회수되어 결정 상태의 숙신산을 생성하는 공정(Ⅱ)에서 재사용될 수 있고, 한편 생성된 수산화칼슘과 같은 염기(40)는 회수되어 상기 숙신산염을 함유하는 침전물을 생성하는 공정(Ⅰ)에서 재사용될 수 있다. 다만, 분리된 제2 상등액 내 함유된 염화칼슘이나 질산칼슘은 그 자체로 회수하여 사용될 수도 있다.
Ⅲ. 고순도의 숙신산 형성
한편, 본 발명에서는 선택적으로 상기 결정상태의 숙신산(90)을 세척영역(Ⅲ)에서 포화 숙신산 수용액(100) (pH 약 2.5, 7 % 숙신산 수용액)을 이용하여 세 척할 수 있다. 이로써, 결정상태의 숙신산(90)에 묻어있던 미량의 불순물(CaCl2, CaCO3, CaSO4 등)이 제거되어 보다 품질이 향상된 결정상태의 숙신산(120)을 얻을 수 있다. 이후, 선택적으로 결정상태의 숙신산에 묻어있던 불순물이 포함된 포화 숙신산 수용액(110)을 이온교환수지영역(Ⅵ)으로 이송한 후, 이온교환수지를 이용하여 상기 포화 숙신산 수용액을 정제할 수 있다. 또한, 정제된 포화 숙신산 수용액(100)을 회수하여 세척영역(Ⅲ)에서 다시 사용할 수 있다.
전술한 바와 같은 방법에 의해 고효율 및 저비용으로 분리·정제된 숙신산은 현재 이용되고 있는 식품, 의약품 및 화장품 산업뿐만 아니라, BDO (1,4-butanediol), THF (tetrahydrofuran), GBL (gamma-butyrolactone), NMP (n-methylpyrrolidone) 등과 같은 C4 범용 제품의 생산을 위한 원료로서도 이용될 수 있고, 그 외 다양한 분야에서 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
[실시예 1-1] - 숙신산염을 함유하는 침전물의 형성
숙신산이 발현된 발효액(발효액 내 숙신산의 농도: 79.2 g/l)을, 원심분리기(12,000 rpm, 10 분)를 이용하여 균주를 제거하였다. 이후, 균주가 제거된 발효 액 300 ㎖를 교반하면서 80 ℃의 온도로 가열하여 발효액에서 탄산이온을 제거하였다.
탄산이온이 제거된 발효액 300 ㎖에, 발효액의 pH가 약 7.0이 되도록 교반 상태에서 수산화칼슘(Ca(OH)2) 16.24 g을 첨가한 후, 이를 상온에서 냉각시키고, 필터(0.6 ㎛)를 이용하여 여과한 결과, 침전물과 상등액을 얻었다.
여기서, 수득된 상등액 내 칼슘숙신산염의 농도를 HPLC(LC-20AD Prominence Series With Standard Accessories, SHIMADZU)로 분석한 결과, 상등액 내 칼슘숙신산염의 농도가 약 11 g/l이었다. 이는 약 88 중량%의 숙신산이 칼슘숙신산염의 형태로 침전되었다는 것을 의미한다.
[실험예 1]
본 발명에 따라 수득된 숙신산염을 함유하는 침전물의 순도를 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 수득된 침전물과 상등액을 사용하여 하기와 같은 분석을 수행하였다.
1) 유기산 분석
HPLC(LC-20AD Prominence Series With Standard Accessories, SHIMADZU)를 이용하여, 수산화칼슘 첨가 전의 발효액과 수산화칼슘 첨가 후에 얻은 침전물과 상등액 내에 각각 함유되어 있는 유기산을 분석하였다. 이 때, 상등액 1 ml 및 침전물 1 g을 각각 100 배 희석한 후 이를 분석하였으며, 분석 결과를 하기 표 1에 나 타내었다.
성분 수산화칼슘 첨가 전 발효액 (중량%)a 수산화칼슘 첨가 후
상등액 (중량%)a 침전물 (중량%)a
숙신산(염) 99.18 96.00 99.86
피루브산(염) 0.44 3.25 0.03
시트르산(염) 0.35 0.57 0.10
옥살아세트산(염) 0.03 0.18 0.02
(a : 전체 건조중량에 대한 각 성분의 중량%)
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 수산화칼슘을 첨가한 후 생성된 침전물 중 칼슘숙신산염이 차지하는 비율이 상등액 중 칼슘숙신산염이 차지하는 비율에 비해 더 높았다. 따라서, 숙신산이 발현된 발효액에 수산화칼슘과 같은 염기를 첨가하면, 기타 유기산 유도 침전염에 비해 숙신산염을 선택적으로 침전시킬 수 있음을 알 수 있었다.
2) 이온 분석
ICP (720-ES. Varian), 및 AA (AAnalyst 300, PERKIN ELMER)를 이용하여 실시예 1-1에서 얻은 침전물 및 상등액 내에 함유되어 있는 이온을 각각 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이때, 상등액 1 ㎖을 1,000 배 희석하고, 침전물 1 g을 10,000 배 희석한 후 이를 분석하였다.
이온성분 상등액 내 함유율 (%) 침전물 내 함유율 (%)
P 7.8 92.2
S 35.2 64.8
Na 86.1 13.9
K 89.4 10.6
Mg 83.5 16.5
Ca 9.5 90.5
상기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, pH가 7이 되도록 염기량을 조절했을 때, 양이온(K+, Mg+, Na+)은 주로 상등액 상에 존재하는 반면, 음이온(CO3 2 -, PO4 -, SO4 2-)은 수산화칼슘과 반응하여 황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘의 형태로 상당량이 침전물에 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
본 발명에 따라 숙신산이 발현된 발효액에 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 형성할 경우, 염기의 첨가량 변화에 따른 영향을 확인하기 위하여 숙신산염을 함유하는 침전물의 생성 여부를 관찰하였다. 이와 더불어, 생성된 상등액 내 숙신산염의 농도를 HPLC를 이용하여 측정하였고, 침전물과 상등액 내 함유된 각각의 이온 비율을 IPC 및 AA를 이용하여 분석하였다.
이때, 탄산이온이 제거된 발효액 300 ㎖에, 발효액의 pH가 4.1, 5.0, 6.3, 및 7.0이 되도록 수산화칼슘을 첨가하는 것 이외에는 실시예 1-1과 동일하게 수행하여 침전물과 상등액을 얻었다.
1) 관찰 결과, 발효액의 pH가 4.1이 되도록 수산화칼슘을 첨가한 경우에는, 침전물을 관찰할 수 없었다. 반면, 발효액의 pH가 5.0 이상이 되도록 수산화칼슘을 첨가한 경우에는 침전물을 관찰할 수 있었다. 이로써, 본 발명에서는 발효액의 pH가 4.1 초과 ~ 7.0 이하 범위가 되도록, 염기를 숙신산이 발현된 발효액에 첨가하는 것이 적절함을 알 수 있었다.
2) 또, 수득된 각각의 상등액 내 숙신산염의 농도를 HPLC로 분석한 결과, 발효액의 pH가 5.0이 되도록 염기를 첨가하여 얻은 상등액은 숙신산염을 약 30 g/l 의 농도로 함유하고 있었고, 발효액의 pH가 6.3이 되도록 염기를 첨가하여 얻은 상등액은 숙신산염을 약 17 g/l 의 농도로 함유하고 있었으며, 발효액의 pH가 7.0이 되도록 염기를 첨가하여 얻은 상등액은 숙신산염을 약 11 g/l 의 농도로 함유하고 있었다.
3) 또, ICP 및 AA를 이용하여 각각의 침전물 및 상등액 내 함유된 이온 비율을 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
상등액 내에 포함된 이온들의 함량 비율 (%)
pH 5.0 pH 6.3 pH 7.0
P 84.6 20.7 7.8
S 58.2 44.1 35.2
Na 84.0 82.8 86.1
K 84.2 83.4 89.4
Mg 83.8 80.9 83.5
Ca 43.9 25.1 9.5
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 염기의 첨가량에 의해 발효액의 pH를 조절했을 때, 양이온 (K+, Mg+, Na+)은 발효액의 pH에 상관없이 주로 상등액 상에 존재하는 반면, 음이온(CO3 2 -, PO4 -, SO4 2-)은 pH가 증가할수록 황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘의 형태로 침전물에 포함되는 비율이 증가하였다. 이러한 결과로부터, 숙신산이 발현된 발효액에 수산화칼슘과 같은 염기를 첨가하여 숙신산염의 침전물을 형성할 때, 발효액의 pH가 낮을수록 숙신산염 침전물을 음이온에 의해 유도된 염의 침전물에 비해 보다 선택적으로 침전시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 1-2]
상기 실시예 1-1에서 얻은 침전물 12 g에, 35 %의 염산수용액 1 당량(16.0 g)과 증류수 10.4 ㎖를 첨가한 후 교반하여 침전물과 염산수용액을 반응시켰다. 반응 후 얻은 침전물과 상등액을 필터(0.6 ㎛)를 이용하여 침전물과 상등액을 분리하여 얻었다.
이때, 상기에서 얻은 상등액 상의 숙신산 농도를 HPLC로 분석한 결과, 숙신산의 농도가 약 26 g/l이었다. 이는 96 %의 숙신산이 침전물(침전숙신산염)으로부터 수득되었다는 것을 의미한다.
[실시예 2]
상기 실시예 1-1에서 얻은 침전물 12 g에, 35%의 염산수용액 1 당량(16.0 g)과 증류수 10.4 ㎖ 대신에 35 %의 염산수용액 2 당량(32.0 g)을 첨가하는 것 이외에는, 실시예 1-2와 동일하게 수행하여 침전물과 상등액을 얻었다.
이때, 상기에서 얻은 상등액 상의 숙신산 농도를 HPLC로 분석한 결과, 숙신산의 농도가 약 26 g/l이었다. 이는 96 %의 숙신산이 침전물(침전숙신산염)으로부터 수득되었다는 것을 의미한다.
[실시예 3]
상기 실시예 1-1에서 얻은 침전물 12 g에, 35%의 염산수용액 1 당량(16.0 g)과 증류수 10.4 ㎖ 대신에 60 %의 질산수용액 1 당량(16.0 g)과 증류수 14.3 ㎖를 첨가하는 것 이외에는, 실시예 1-2와 동일하게 수행하여 침전물과 상등액을 얻었다.
이때, 상기에서 얻은 상등액 상의 숙신산 농도를 HPLC로 분석한 결과, 숙신산의 농도가 약 31 g/l이었다. 이는 95 %의 숙신산이 침전물(침전숙신산염)으로부터 수득되었다는 것을 의미한다.
[실험예 3]
본 발명에 따라 수득되는 결정상태의 숙신산의 순도를 알아보기 위하여, 실시예 1-2, 2 및 3에서 제조된 침전물과 상등액을 사용하여 하기와 같은 분석을 수행하였다.
1) 유기산 분석
HPLC(LC-20AD Prominence Series With Standard Accessories, SHIMADZU)를 이용하여, 염산수용액 또는 질산수용액 첨가 전의 침전물과, 염산수용액 혹은 질산수용액 첨가 후에 얻은 침전물 및 상등액 내에 각각 함유되어 있는 유기산을 분석하였다. 이 때, 실시예 1-2, 2 및 3에 의해 얻은 각각의 상등액 1 ml 및 침전물 1 g을 각각 100 배 희석한 후 이를 분석하였으며, 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
염산수용액 첨가 전의 침전물
(중량%) a 		실시예 1-2 실시예 2 실시예 3
상등액 침전물 상등액 침전물 상등액 침전물
숙신산 99.86 98.63 99.98 99.17 99.98 99.02 99.97
피루브산 0.03 0.22 0.002 0.16 0.002 0.15 0.005
시트르산 0.10 1.13 0.010 0.65 0.008 0.79 0.011
옥살아세트산 0.02 0.02 0.007 0.02 0.008 0.03 0.009
(a : 전체 건조중량에 대한 각 성분의 중량%)
상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 염산수용액 또는 질산수용액을 첨가하여 얻은 침전물 내 함유된 숙신산의 비율은, 상등액 내 함유된 숙신산의 비율에 비해 더 높았다. 이는 침전물과 염산수용액 혹은 질산수용액의 반응 후 침전물 속의 칼슘숙신염, 기타 유기산 유도염, 음이온 유도염(황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘)으로부터 숙신산, 기타 유기산, 음이온 유도산(황산, 인산, 탄산)이 얻어지는데, 이 중에서 숙신산 이외의 생성물들은 숙신산에 비해서 용해도가 커서 주로 수용액 상에 존재하기 때문이라 생각된다. 또한, 염화칼슘과 질산칼슘의 용해도는 각각 745 g/l와 1212 g/l로써 숙신산 용해도에 비해 매우 높으며, 나아가 숙신산의 이론 용해도가 약 78 g/l인 반면 염산수용액 또는 질산수용액 첨가 후 얻은 숙신산의 용해도는 각각 26 g/l와 31 g/l로 낮았다. 이는 일반적으로 pH가 낮아질 때 유기산이 비해리산 형태로 존재하려고 하며, 또한 단량체 유기산들이 수소결합으로 인해 유기산 단량체들이 서로 결합하면서 결정의 크기가 커지는 성질 때문이라 생각된다.
이로부터, 침전 숙신염에 염산수용액 또는 질산수용액을 첨가하여 침전 숙신산을 형성할 때, 기타 유기산에 비해 숙신산을 선택적으로 침전시킬 수 있음을 알 수 있었다.
2) 이온 분석
ICP(720-ES. Varian) 및 AA(AAnalyst 300, PERKIN ELMER)를 이용하여 실시예 1-2, 2 및 3에서 얻은 각각의 침전물 및 상등액 내에 함유되어 있는 이온을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 이때, 각각의 상등액 1 ㎖을 1,000 배 희석하였고, 각각의 침전물 1 g을 10,000 배 희석한 후, 이를 분석하였다.
상등액 내에 포함된 이온들의 함량 비율 (%)
실시예 1-2(중량%)a 실시예 2(중량%)a 실시예 3(중량%)a
P 82.19 89.03 87.45
S 82.31 84.79 82.05
Na 73.75 78.90 77.92
K 70.79 87.81 80.13
Mg 84.38 97.27 97.20
Ca 87.72 90.11 87.92
(a : 전체 건조중량에 대한 각 성분의 중량%)
분석 결과, 실시예 1-2, 2 및 3에서 얻은 각각의 상등액 내에는 침전물 내 함유되어 있던 음이온에 의해 유도된 염(ex. 황산칼슘, 인산칼슘, 탄산칼슘)이 황산, 인산, 탄산으로 전환되어 다량 함유되어 있음을 알 수 있었다.
이러한 결과로부터, 숙신산염을 함유하는 침전물에 염산수용액 또는 질산수용액을 첨가하여 결정상태의 숙신산을 형성할 때, 음이온에 의한 유도된 염이 전환되는 산들에 비해 숙신산이 선택적으로 침전될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이로써, 본 발명의 숙신산 분리·정제방법은 종래의 숙신산 분리·정제방법과 달리, 필터와 같은 여과장치를 이용하여 숙신산 결정을 용이하게 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
[비교예 1]
상기 실시예 1-1에서 얻은 침전물 12 g에, 98 %의 황산수용액 1 당량(7.5g)과 증류수 20.8 ㎖를 첨가하는 것 이외에는, 실시예 1-2와 동일하게 수행하여 침전물과 상등액을 얻었다.
실시예 1-2, 2 및 3에서 얻은 침전물 및 상등액의 경우, 숙신산이 침전물에 존재하고 염화칼슘이 상등액에 존재하여 숙신산을 분리시킬 수 있었던 것과 달리, 비교예 1에서 얻은 침전물 및 상등액의 경우, 숙신산과 함께 황산칼슘(용해도: 2.4 g/l)이 함께 침전되어 숙신산만을 분리시키기 어려웠다. 이로부터, 고농도의 황산수용액을 이용하는 경우에는 황산칼슘이 숙신산과 함께 침전되기 때문에, 숙신산을 선택적으로 분리하기 어렵다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 4]
상기 실시예 2에서 얻은 침전물 6 g을 20 ㎖의 포화 숙신산 수용액(농도: 7 중량%)을 이용하여 세척하였다.
[실험예 4]
실시예 4에서 얻은 침전물 및 상등액 내 함유되어 있는 숙신산의 함유 정도를 알기 위하여, HPLC(LC-20AD Prominence Series With Standard Accessories, SHIMADZU)를 이용하여, 포화 숙신산 수용액 세척 전의 침전물과, 포화 숙신산 수용액 세척 후에 얻은 침전물 및 상등액 내에 각각 함유되어 있는 유기산을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 이때, 상등액 1 ㎖ 및 침전물 1 g을 각각 100 배 희석한 후, 이를 분석하였다.
성분 세척 전의 침전물(중량%)a 세척 후의 침전물
상등액(중량%)a 침전물(중량%)a
숙신산 99.98 99.966 99.9977
피루브산 0.002 0.003 0.0004
시트르산 0.008 0.001 0.0010
옥살아세트산 0.008 0.029 0.0007
(a : 전체 건조중량에 대한 각 성분의 중량%)
상기 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 포화 숙신산 수용액을 이용하여 침전물을 세척함으로써, 침전물에 존재하던 미량의 유기산 불순물 및 염들이 제거되었음을 알 수 있었으며, 그 결과 99.998 %의 고순도 숙신산을 얻었음을 알 수 있었다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 발효액으로부터 숙신산을 분리·정제하는 공정도이다.
도 2는 본 발명의 다른 구체예에 따라 발효액으로부터 숙신산을 분리·정제하는 공정도이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 구체예에 따라 발효액으로부터 숙신산을 분리·정제하는 공정도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
Ⅰ-1(a): 발효액 생성 영역, 1-1(b): 숙신산염 형성 영역,
Ⅰ-2: 발효액 및 숙신산염 형성 영역,
Ⅱ: 숙신산 결정 형성 영역, Ⅲ: 세척 영역,
Ⅳ: 퍼지 영역, Ⅴ: 수화반응 영역,
Ⅵ: 이온교환수지 영역 10: 탄수화물, CO2, 영양분 등,
20: 균주, 30: 숙신산이 발현된 발효액,
40: 염기, 50: 제1 상등액,
60: 숙신산염을 함유하는 침전물, 70: 염산(질산)수용액,
80: 제2 상등액, 90: 결정상태의 숙신산,
100: 포화숙신산 용액, 110: 불순물 함유 포화숙신산 용액,
120: 고순도의 결정 숙신산

Claims (16)

  1. 균주를 이용하여 숙신산이 제조된 발효액으로부터 숙신산을 분리 및 정제하는 방법으로서,
    균주를 이용하여 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액에, 염기를 첨가하여 숙신산염을 함유하는 침전물을 생성하는 단계; 및
    상기 숙신산염을 함유하는 침전물에, 염산수용액, 질산수용액 및 이들의 혼합액 중에서 선택된 산성 수용액을 첨가하여 결정상태의 숙신산을 생성하는 단계
    를 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염기의 첨가시 숙신산이 발현된 또는 발현되는 발효액의 pH가 4.5 내지 6.5 범위로 유지되는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주를 이용하여 숙신산이 발현된 또는 발현되고 있는 발효액의 형성은 batch 형태, fed-batch 형태, 또는 연속 형태로 수행되는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 염기는 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화마그네슘(Mg(OH)2), 탄산칼슘(CaCO3) 및 탄산마그네슘(MgCO3)으로 이루어진 군에서 선택된 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 숙신산이 발현된 발효액에 염기의 첨가는 상온 또는 50 내지 100 ℃의 온도하에서 수행되는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 숙신산이 발현된 발효액에 염기를 첨가하기 전에,
    상기 숙신산이 발현된 발효액을 가열하거나 공기 또는 질소를 공급하여 상기 발효액 내에 함유된 탄산이온(CO3 2-)을 제거하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 발효액의 가열 온도는 50 내지 100 ℃인 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 숙신산염을 함유하는 침전물의 생성 단계에서 상기 숙신산염을 함유하는 침전물 이외에 수득되는 제1 상등액을 회수하여 상기 숙신산이 발현된 발효액의 형성시 재사용하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 상등액 내 불순물의 농도가 1 중량% 초과 범위인 경우에는, 제1 상등액 내 불순물의 농도를 1 중량% 이하 범위로 유지시키는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 염산 수용액의 농도는 10 내지 40 중량% 범위이고,
    상기 질산 수용액의 농도는 20 내지 70 중량% 범위인 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 숙신산염을 함유하는 첨전물 내 함유된 숙신산염(a)과 산성수용액 내 산(b)은 a : b = 1 : 1 ~ 1 : 5 몰 당량의 비율로 사용되는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 산성 수용액의 첨가는 상온 또는 50 내지 100 ℃의 온도하에서 수행되는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 결정상태의 숙신산 생성 단계에서 상기 결정상태의 숙신산과 더불어 생성되는 제2 상등액을 400 내지 800 ℃ 범위의 온도 하에서 산 및 염기를 생성하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생성된 염기를 회수하여 숙신산염을 함유하는 침전물의 생성시 재사용하고,
    상기 생성된 산을 회수하여 상기 결정상태의 숙신산 생성시 재사용하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 결정상태의 숙신산 생성 단계 후,
    상기 결정상태의 숙신산 생성 단계에서 생성된 결정상태의 숙신산을 포화 숙신산 수용액을 이용하여 세척하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세척 단계에서 이용되었던 포화 숙신산 용액을 회수하여 이온교환수지로 정제한 후 정제된 포화 숙신산 용액을 세척 단계에서 재사용하는 것이 특징인 숙신산 분리 및 정제방법.
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