KR20100017574A - 고분자 전해질 및 활성 성분을 베이스로 하는 조절 방출 입자 및 이들 입자를 함유하는 약학 제제 - Google Patents

고분자 전해질 및 활성 성분을 베이스로 하는 조절 방출 입자 및 이들 입자를 함유하는 약학 제제 Download PDF

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프레데릭 셰꼬
요우-핑 챵
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Abstract

본 발명은 활성 성분(들)(AP), 특히 단백질 및 펩티드 활성 성분(들)의 신규한 운반체인 고분자 전해질 중합체를 포함하는 신규한 입자 및 상기 AP 마이크로입자를 포함하는 신규한 조절 방출 약학 제제에 관한 것이다.
AP가 충전된 이들 신규한 입자는 수일, 심지어 수주의 연장된 기간에 걸쳐 AP를 방출한다.
본 발명은 제1 측면에서
a) 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성함];
b) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성함];
c) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합된 1 이상의 활성 입자(AP)
를 포함하는 입자에 관한 것으로, 상기 입자는 pHm과 동일한 pH에서, 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합하여 얻어 진다.
본 발명은 또한 이들 입자의 제조 방법, 이러한 입자를 포함하는 약학 제제 및 약제 제조 방법에 관한 것이다.

Description

고분자 전해질 및 활성 성분을 베이스로 하는 조절 방출 입자 및 이들 입자를 함유하는 약학 제제{MODIFIED-RELEASE PARTICLES BASED ON POLYELECTROLYTES AND ON AN ACTIVE PRINCIPLE AND PHARMACEUTICAL FORMULATIONS CONTAINING THESE PARTICLES}
본 발명은 활성 성분(들)(AP), 특히 단백질 및 펩티드 활성 성분(들)의 신규한 운반체 및 상기 AP 운반체를 포함하는 신규한 조절 방출 약학 제제에 관한 것이다. 본 출원은 또한 이들 약학 제제의 적용, 특히 치료적 적용에 관한 것이다. 이들 활성 약학 제제는 인간 치료제 및 수의 치료제 둘다에 관한 것이다.
본 명세서를 통해 사용되는 용어 AP는 1 이상의 활성 성분을 의미한다.
약학 AP, 특히 치료적 펩티드/단백질의 지속 방출 분야에서, 건강한 개체에서 관찰되는 값에 가까운 혈장 펩티드 또는 단백질 농도를 환자에서 가능한 최상으로 재생하는 것이 대개의 목적이다.
이러한 목적은 혈장에서 단백질 수명이 짧은 것과 상충되므로, 치료 단백질의 주입을 반복하게 된다. 그래서, 치료 단백질의 혈장 농도는 고농도 피크 및 매우 저농도 최소값을 특징으로 하는 "톱니형" 프로필을 보인다. 건강한 개체에서의 기저 농도보다 훨씬 더 높은 농도 피크는 특정 시토카인과 같은 치료 단백질의 높 은 독성 때문에 매우 유의적인 유해 효과를 나타낸다. 또한, 농도 최소값은 치료 효과를 얻는 데 필요한 농도보다 낮아 환자의 치료 범위가 부족하고 심각한 장기 부작용을 초래한다.
따라서, 환자에서 환자의 치료에 이상적인 값에 가까운 치료 단백질의 혈장 농도를 재생하기 위하여, 경시적 혈장 농도 변화가 제한되도록 당해 약학 제제가 장기간에 걸쳐 치료 단백질을 방출시킬 수 있는 것이 중요하다.
또한, 바람직하게는 활성 제제는 당업자에게 이미 공지된 이하의 요건을 만족시켜야 한다:
1 - 혈장 농도가 치료 수준으로 유지되도록 활성 및 비변성 치료 단백질, 예컨대 인간 또는 합성 단백질의 지속 방출;
2 - 용이하게 주입될 수 있도록 주입시 충분히 낮은 점도;
3 - 우수한 독성 및 내성 프로필을 보이는 생체적합성 및 생분해성 형태.
이들 목적을 달성하려는 시도에서, 종래 기술에서 제공된 최상의 방법 중 하나는 치료 단백질을 충전한 나노입자의 비교적 비점성 액체 현탁액을 포함하는 치료 단백질(들)의 지속 방출 형태를 개발하는 것이었다. 이들 현탁액은 천연 치료 단백질의 용이한 투여를 가능하게 하였다.
따라서, Flamel Technologies사는 치료 단백질을 소수성 기 및 친수성 기를 포함하는 코폴리아미노산 나노입자와 회합시키는 경로를 제공하였다.
특허 출원 US 2006/0099264호는 아스파르트산 잔기 및/또는 글루탐산 잔기를 포함하는 양친매성 폴리아미노산을 개시하며, 이들 잔기의 적어도 일부는 1 이상의 α-토코페롤 잔기를 포함하는 그래프트, 예컨대 (합성 또는 천연 기원의 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트 또는 폴리아스파르테이트)를 가진다. 이들 "소수성 개질된" 호모폴리아미노산은 pH 7.4의 수성 현탁액에서 1 이상의 활성 단백질(인슐린)과 용이하게 결합할 수 있는 나노입자의 콜로이드 현탁액을 수중에서 자발적으로 형성한다.
US 2006/0099264호에 따른 현탁액으로 "벡터화된" 활성 단백질(들)(예컨대, 인슐린)의 생체내 방출 지속 시간은 증가되는 것이 이로울 것이다.
방출 지속 시간 증가는 부분적으로 PCT 출원 WO-A-05/051416호에 개시된 약학 형태에 의하여 얻어졌다. 이 출원은 피하 주입 후 내생 알부민과 접촉시 환자에서 겔이 계내 형성되는 농도로 주입되는 소수성 개질된 폴리(나트륨 L-글루타메이트) 나노입자(0.001∼0.5 ㎛)의 콜로이드 현탁액을 개시한다. 단백질은 이후 1주일의 일반적인 기간에 걸쳐 서서히 방출된다. 그러나, 예컨대 인간 성장 호르몬에 대해서와 같이 투여될 치료 단백질의 농도가 비교적 높은 경우, 방출 지속 시간은 수 일로 제한된다.
이들 형태의 방출 지속 시간은 더 증가되는 것이 이로울 것이다.
발명의 개요
본 발명의 목적 중 하나는 수일, 심지어 수주의 장기간에 걸쳐 AP를 방출시키는 AP가 충전된 신규한 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 수용액 중 안정한 현탁액을 형성하는 신규한 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 동결 건조된 형태에서 안정한 AP가 충전된 신규한 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 동결 건조된 형태로 저장될 수 있는 신규한 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 동결 건조 후 용이하게 재분산될 수 있는 신규한 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생물학적 활성을 보유한 단백질을 방출시키는 신규한 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 이들 마이크로입자의 신규한 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 AP의 지속 방출을 위한 고체 약학 제제, 특히 흡인 및 폐내 투여를 위한 건조 분말 형태를 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 특히, 본 발명자들은 오랫동안 예의 연구하여 매우 놀랍고도 예상밖으로 1 이상의 AP(예컨대 코폴리아미노산)과 회합된 1 이상의 소수성 기를 갖는 반대 극성의 두 고분자 전해질 중합체를 특정 조건 하에서 혼합하는 것으로 단백질 또는 펩티드를 시험관내에서 또는 생체내에서 장기간에 걸쳐 방출할 수 있는 1∼100 마이크론 크기의 입자가 얻어짐을 발견하였다.
이로부터 본 발명은 무엇보다도
a) 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성함];
b) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성하며, 단, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 폴리아미노산인 경우, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 폴리리신도 폴리에틸렌이민도 아님];
c) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합된 1 이상의 활성 입자(AP)
를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자에 관한 것으로, 상기 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자는 pHm과 동일한 pH에서 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합함으로써 얻어진다.
본 발명은 또한 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자(특히 상기 개시된 입자임)의 제조 방법에 관한 것으로, 이 방법은
1) pH 3∼8의 pHm 값에서, 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성할 수 있음];
2) 단계 1에서 얻어진 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계[상기 활성 성분은 상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 함께 결합함];
3) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)를 제조하는 단계[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성하며, 단, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 폴리아미노산인 경우, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 폴리리신도 폴리에틸렌이민도 아님];
4) pHm과 동일한 pH에서, 단계 2)에서 얻어진 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를, 단계 3)에서 얻어진 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합시키는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한
a) 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성함];
b) 소수성 측기(GH)를 보유하는, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성함];
c) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합된 1 이상의 활성 입자(AP)
를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자에 관한 것으로, 상기 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자는 pHm과 동일한 pH에서 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합함으로써 얻어진다.
본 발명은 또한
1) pH 3∼8의 pHm 값에서, 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성할 수 있음];
2) 단계 1에서 얻어진 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계[상기 활성 성분은 상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 함께 결합함];
3) 소수성 측기(GH)를 보유하는, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)를 제조하는 단계[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성함];
4) pHm과 동일한 pH에서, 단계 2)에서 얻어진 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를, 단계 3)에서 얻어진 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합시키는 단계
를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자(이들 입자는 특히 상기 개시한 입자임)의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 개시한 바와 같은 입자를 포함하는 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 약학 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 실질적으로 상기 정의된 바와 같은 1 이상의 제제를 사용하는 것으로 이루어지는 특히 비경구, 점막, 피하, 근내, 피내, 복강내 또는 뇌내 투여를 위한 또는 종양내 투여를 위한, 심지어 경구, 경비, 폐내, 질내, 경피 또는 안내 경로에 의한 투여를 위한 약제의 제조 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
정의
본 명세서에서, 용어 "용액"은 개개의 사슬 형태의 중합체 및 용매의 균질한 혼합물을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 용어 "콜로이드 용액"은 T' 테스트로 측정한 평균 직경이 0.5 ㎛ 이하인 입자의 현탁액을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 용어 "반중화(half-neutralization) pH"는 이온화 가능한 기의 절반이 이온화되는 pH를 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 용어 "pHm"은 활성 성분(AP)이 회합되는 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)의 혼합이 이루어지는 pH를 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 생리학적 pH는 예컨대 7.2±0.4인 것으로 정의된다.
본 명세서에서, 용어 "고분자 전해질"은 수중에서 이온화하여 중합체에 전하를 생성시킬 수 있는 기를 보유하는 중합체를 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 용어 "양쪽성 고분자 전해질"은 각각 분해하여 음이온성 기 및 양이온성 기를 생성시키는 적어도 두 유형의 기를 보유하는 고분자 전해질을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, "보유한다"는 표현은 보유되는 기가 측쇄기, 즉 중합체 주쇄에 대하여 측기임을 의미한다. 특히, 중합체가 "아미노산" 잔기를 포함하는 폴리아미노산인 경우, 상기 측쇄기는 "아미노산" 잔기에 대하여 측기이고 카르보닐 작용기를 갖는 "아미노산" 잔기의 γ 위치에서 카르보닐 작용기의 치환기이다.
본 명세서에서, 용어 "고분자 전해질의 극성"은 pH 값의 pHm에서 이 고분자 전해질이 보유하는 전체 전하의 극성을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 용어 "벌크 밀도"는 1 g의 입자가 차지하는 부피를 의미하는 것으로 이해된다. 벌크 밀도는 밀도 구배법과 같은 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 측정된다.
본 명세서에서, 용어 "소분자"는 분자량이 1 kDa 미만인 분자를 의미하는 것으로 이해된다.
T 테스트는 제1 고분자 전해질 중합체(PE1) 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)의 회합에서 유래하는 본 발명에 따른 입자의 크기를 측정하기 위하여 사용된다. T' 테스트는 바람직하게는 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자 크기를 평가하기 위하여 사용된다.
T 테스트의 결과는 샘플 중에 존재하는 입자의 50%가 이 값(D50) 이하의 크기를 갖게 되는 평균 직경(D50)이다.
T' 테스트의 결과는 평균 수력 직경이다.
레이저 회절로 마이크로 입자의 크기를 측정하기 위한 T 테스트:
그 미만에서 분석 대상의 50%가 발견되는 직경인 D50에 관한 데이터가 얻어진다. 본 발명에 따른 입자의 직경은 이하에 정의되는 절차에 따라 측정한다:
5 ml의 시험관에서 분석할 400 ㎕의 샘플을 600 ㎕의 탈염수로 희석한 다음 제제를 10초(10±5) 동안 와동시켜 입자 용액을 제조한다. 이후 이들 용액을 5∼20% 차폐될 때까지 측정 셀로 한방울씩 도입한 다음 466 및 632 nm의 두 파장으로 작동하는 Malvern Mastersizer 2000형 장치를 사용하여 광회절로 분석한다. 입자의 D50은 이하의 굴절 지수를 사용하여 Mie 이론 및 표준 ISO 13320에 개시된 바와 같이 프라운호퍼(Fraunhofer) 개산으로부터 계산한다:
n유체 = 1.33 + i.0,
n중합체 = 1.59 + i.0.
준탄성 광산란에 의하여 나노입자의 크기를 측정하기 위한 T' 테스트:
본 발명에 따른 중합체 입자의 평균 수력 직경을 이하에 정의된 Md 절차에 따라 측정한다:
중합체 용액을 0.15 M NaCl 매질 중 1 또는 2 mg/ml의 농도로 제조하고 24시간 동안 정치하여 교반한다. 이후 이들 용액을 0.8∼0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 다음 632.8 nm의 파장을 갖는 수직 편광 He-Ne 레이저 빔으로 작동하는 맬버른 콤팩트 고니오메터 시스템(Malvern Compact Goniometer System) 유형의 장치를 사용하여 동적 광산란으로 분석한다. 중합체 나노입자의 수력 직경은 문헌["Surfactant Science Series", 22권, Surfactant Solutions, R. Zana 편집, 3장, M. Dekker, 1984]에 개시된 바와 같이 누적법으로 전기장의 자동 보정 함수로부터 계산한다.
활성 성분의 방출을 측정하기 위한 L 테스트: 　　　
30 mg/g의 소 알부민 분획 V(Aldrich), 0.01 M의 포스페이트 완충액, 0.0027 M의 염화칼륨, 0.137 M의 염화나트륨(Aldrich사의 PBS) 및 0.015 M의 아세트산암모늄(Aldrich)을 포함하는 2.83 ml/h 유속의 수성 매질로 세정한 측부 길이가 1.5 cm인 폴리우레탄/폴리에테르(PU-PE) 발포체 큐브에 50 ㎕의 제제를 주입한다. 샘플을 연속상으로부터 규칙적으로 배출시키고 이들 샘플의 단백질 함량을 ELISA로 분석한다(Immunotech IM3193 키트).
이후 방출된 단백질의 총중량을 회수된 샘플 각각에서 측정한 값을 더함으로써 플롯하고 이것을 주입된 총량과 관련지을 수 있다.
본 발명의 의미 내에서, 용어 "단백질"은 단백질 및 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 불문하고 펩티드를 의미한다. 이러한 단백질 또는 이러한 펩티드는 예컨대 하나 이상의 폴리옥시에틸렌기를 그래프팅함으로써 개질되거나 개질되지 않을 수 있다.
제1 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE1) 및 (PE2)는 음이온성 및/또는 양이온성 기, 예컨대 아민 또는 카르복실산 작용기를 보유하는 생체적합성이고 생분해성인 선형 중합체이다. 바람직하게는, 중합체(PE1) 또는 (PE2)는 소정 극성(음이온성 또는 양이온성)의 이온화 가능한 기를 보유한다.
이러한 중합체는 예컨대 폴리아미노산, 음이온계 다당류, 예컨대 덱스트란 설페이트, 카르복시메틸셀룰로오스, 아라비아 검, 히알루론산 및 이의 유도체, 폴리갈락투론 또는 폴리글루쿠론 또는 양이온계 다당류, 예컨대 키토산 또는 콜라겐 및 이의 젤라틴형 유도체이다.
소정 극성의 이온화 가능한 기를 갖는 중합체가 작은 분율, 1∼30 몰%의 반대 극성의 이온화 가능한 기를 더 가질 수 있는 가능성은 배제한다. 이온화 가능한 음이온성 또는 양이온성 기 및 소수성 기 외에, 제1 또는 제2 고분자 전해질 중합체(PE1) 또는 (PE2)는 임의로 히드록시에틸아미노 라디칼, 알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 글리콜에서 선택된 라디칼과 같은 이온화되지 않는 기를 또한 보유할 수 있다.
중합체의 실전하는 중합체의 반중화 pH에 대한 pH 값에 따라 달라진다. 따라서, 음이온계 작용성 카르복실기를 보유하는 고분자 전해질에 대하여, 중합체의 실전하는 반중화 pH보다 두 단위 낮은 pH에서 0의 영역에 있을 것이다. 실제로 모든 음이온성 작용기는 반중화 pH보다 두 단위 높은 pH에서 이온화될 것이다. 다른 한편, 양이온성 작용기를 갖는 중합체에 대하여, pH가 대략 두 단위 만큼 반중화 pH를 초과할 경우 실전하가 0으로 감소된다.
본 발명에서, pH의 pHm 값에서 혼합 조건 하에 제1 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2)가 보유하는 전하의 수는 종래의 산/염기 적정법에 의하여 얻어진다:
1 M 아세트산 또는 1 M 수산화나트륨 용액을 첨가함으로써 0.15 M의 염화나트륨을 포함하는 2 mg/ml의 고분자 전해질 농축 용액의 pH를 3으로 한다. 이후 이 용액을 0.05 M 수산화나트륨 용액으로 적정하고, pH 변화를 첨가된 수산화나트륨의 부피의 함수로서 기록한다. 예컨대 더블 탄젠트법에 의한 당량점(부피 및 pH) 검출은 모든 이온화 가능한 기가 이온화되는 pH, 즉 이온화도가 1이 되는 pH의 검출을 가능하게 한다. 이후 이 지점으로부터 출발하여 임의의 pH 값에 대한 고분자 전해질의 이온화도로 회귀할 수 있다. 이후 반중화 pH, 즉 이온화도가 0.5인 pH를 정의할 수 있다. 또한, pH의 pHm 값에 대하여 고분자 전해질의 이온화도도 정의할 수 있다. 당량점이 pH 3∼9 범위 밖에 있는 특별한 경우, 모든 이온화 가능한 기가 이 pH 범위에 걸쳐 이온화되는 것으로 간주된다. 즉 3∼9의 pH 값에서 이온화도가 1인 것으로 간주된다.
유리하게는, 제1 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2)는 선형 폴리(α-아미노산)일 수 있으며, PE1이 선형 폴리아미노산인 경우 PE2는 폴리리신도 폴리에틸렌이민도 아니다.
본 발명의 의미 내에서, 본 명세서 전체를 통해, 용어 "폴리아미노산"은 천연 폴리아미노산 및 합성 폴리아미노산 및 20개 초과의 "아미노산" 잔기를 포함하는 폴리아미노산과 마찬가지로 2∼20의 "아미노산" 잔기를 포함하는 올리고아미노산을 포괄한다.
바람직하게는, 본 발명에 사용되는 폴리아미노산은 글루탐산 또는 아스파르트산 반복 단위를 포함하는 소중합체 또는 단독중합체 또는 이들 두 유형의 "아미노산" 잔기의 혼합물을 포함하는 공중합체이다. 이들 중합체에서 고려되는 잔기는 D 또는 L 또는 D/L 배열을 갖는 아미노산이며 글루타메이트 또는 글루탐산 잔기의 경우 α 또는 γ 위치 및 아스파르트산 잔기 또는 아스파르테이트 잔기의 경우 α 또는 β 위치를 통하여 결합된다.
폴리아미노산 주쇄의 바람직한 "아미노산" 잔기는 L 배열 및 α형 결합을 갖는 것들이다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 실시양태에 따르면, 제1 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2)는 폴리아미노산 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으며, 이의 주쇄는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 잔기로 형성되고, 이들 단위의 적어도 일부는 적어도 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 대하여 1 이상의 소수성 기(GH)를 그래프팅함으로써 개질된다.
중합체 PE2는 또한 소수성 측기를 보유할 수 있다.
제1 실시양태에 따르면, 이들 폴리아미노산은 PCT 특허 출원 WO-A-00/30618호에 개시된 유형의 것인데, 이에 따르면 소수성 기(GH)는 서로 동일하거나 또는 상이하고 하기로 구성된 군에서 선택된다:
(i) 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C1-C20, 더 바람직하게는 C2-C18, 알킬, 아실 또는 알케닐;
(ii) 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 탄화수소기, 바람직하게는 산소 및/또는 황을 포함하는 것, 더 바람직하게는 하기 화학식의 것:
Figure 112009074471781-PCT00001
(상기 화학식에서,
- R60 라디칼은 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C1-C20, 더 바람직하게는 C2-C18, 알킬, 아실 또는 알케닐 라디칼이고,
- R61 및 R62 라디칼은 서로 동일하거나 상이하고 수소 또는 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C1-C20, 더 바람직하게는 C2-C18, 알킬, 아실 또는 알케닐 라디칼에 상응하며,
- q = 1∼100임);
(iii) 아릴, 아랄킬 또는 알킬아릴, 바람직하게는 아릴;
(iv) 소수성 유도체, 바람직하게는 포스파티딜에탄올아미노 라디칼 또는 옥틸옥시, 도데실옥시, 테트라데실옥시, 헥사데실옥시, 옥타데실옥시, 9-옥타데세닐옥시, 토코페릴옥시 또는 콜레스테릴옥시 라디칼에서 선택되는 라디칼.
용어 "탄화수소 기"는 본 발명의 의미 내에서 특히 수소 및 탄소 원자를 포함하는 기를 의미하는 것으로 이해된다.
바람직하게는, 이 실시양태에서, 소수성 기는 메틸, 에틸, 프로필, 도데실, 헥사데실 및 옥타데실 라디칼의 군에서 선택된다.
특히 바람직하게는, 소수성 기(GH)는
* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 C8-C30 알킬,
* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 C8-C30 알킬아릴 또는 아릴알킬,
* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 C8-C30 (다)환식 화합물
로 구성된 군에서 선택된다.
더 구체적으로, 1 이상의 소수성 기(GH)는 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알콜, 토코페롤 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택되는 전구체에서 출발하여 그래프팅으로 얻어진다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2) 중 하나 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나는 하기 화학식 I에 상응한다:
Figure 112009074471781-PCT00002
상기 화학식에서,
* R1은 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬, 벤질, -R4-[GH]이거나, 또는 R1은 NH와 함께 말단 아미노산 잔기를 형성하고;
* R2는 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 아실기, 피로글루타메이트 또는 -R4-[GH]이며;
* R4는 직접 결합 또는 1∼4개의 아미노산 잔기를 베이스로 하는 "스페이서"이고;
* A1 및 A2는 독립적으로 -CH2-(아스파르트산 잔기) 또는 -CH2-CH2-(글루탐산 잔기)이고;
* n/(n+m)은 몰 그래프팅율로 정의되며 그 값은 중합체가 pH 7 및 25℃에서 수중 용해되어 중합체 입자의 콜로이드 현탁액을 형성하기에 충분히 낮고;
* n + m은 10∼1000, 바람직하게는 50∼300 범위이며;
* GH는 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성 기이거나 또는 상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv) 문단에 정의된 바와 같은 라디칼을 포함하는 군에서 선택된다.
화학식 I의 폴리아미노산의 제조 및 합성에 대한 더 상세한 내용에 대해서는, 특허 출원 FR 02 07008호 및 FR 03 50190호를 참조하면 유용할 것이다.
또다른 가능성에 따르면, 고분자 전해질 중합체 PE2 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나는 하기 화학식 (II), (III) 및 (IV)에 상응한다:
Figure 112009074471781-PCT00003
Figure 112009074471781-PCT00004
Figure 112009074471781-PCT00005
상기 화학식에서,
* GH는 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성 기이고;
* R30은 선형 C2-C6 알킬 기이며;
* R50은 C2-C6 디아미노, 디알콕시 또는 알킬 기이고;
* R4는 직접 결합 또는 1∼4개의 아미노산 잔기를 베이스로 하는 "스페이서"이고;
* A1 및 A2는 독립적으로 -CH2-(아스파르트산 잔기) 또는 -CH2-CH2-(글루탐산 잔기)이며;
* n' + m' 또는 n"는 중합도로서 정의되며 10∼1000, 바람직하게는 50∼300의 범위이다.
화학식 (II), (III) 및 (IV)의 폴리아미노산의 제조 및 합성에 대한 더 상세한 내용에 대해서는 특허 출원 FR 03 50641호를 참조하면 유용할 것이다.
또다른 가능성에 따르면, 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2) 중 하나 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나는 하기 화학식 V에 상응한다:
Figure 112009074471781-PCT00006
상기 화학식에서,
* E는 독립적으로
- - NHR 기(여기서, R은 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬 또는 벤질 임),
- 하기 화학식에 상응하는 말단 아미노산 잔기 또는 말단 아미노산 유도체:
Figure 112009074471781-PCT00007
(여기서, R7은 OH, OR9 또는 NHR10이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬 또는 벤질임)이고;
* B는 직접 결합 또는 바람직하게는 라디칼 -O-, -NH-, -N(C1-C5 알킬)-, 1∼6개의 탄소 원자를 포함하는 아미노산(바람직하게는 천연 아미노산), 디올, 트리올, 디아민, 트리아민, 아미노알콜 또는 히드록시산의 잔기에서 선택되는 2가, 3가 또는 4가 결합기이며;
* D는 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 아실기 또는 피로글루타메이트이고;
* GH는 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성기이며;
* R70은
- -NH-(CH2)w-NH3 +(여기서, w는 2∼6, 바람직하게는 4임),
- -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +,
- -O-(CH2)2-NH3 +,
- -O-(CH2)2-N+(CH3)3,
-
Figure 112009074471781-PCT00008
[여기서, -R11은 -H, -CO2H, 알킬 에스테르(바람직하게는 -COOMe 및 -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 또는 -C(=O)-N(CH3)2임];
- 하기 화학식의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체:
Figure 112009074471781-PCT00009
[여기서, X는 산소 또는 -NH-이고, -R12는 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬 또는 벤질이며, -R13은 -(CH2)4-NH3 +, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, -(CH2)3-NH3 +이고, R70의 짝음이온은 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드임]
로 구성된 군에서 선택되는 라디칼이고;
* R90은 히드록시에틸아미노-, 알킬렌 글리콜 잔기 또는 폴리옥시알킬렌 잔기이며;
* p, q, r 및 s는 양의 정수이고;
* (p)/(p+q+r+s)는 소수성 기(GH)의 몰 그래프팅율로서 정의되며, 2∼99 몰%, 바람직하게는 5∼50 범위인데, 단 각 공중합체쇄는 평균 3 이상의 소수성 그래프트를 가지며;
* (q)/(p+q+r+s)는 양이온성 기의 몰 그래프팅율로서 정의되며, 1∼99 몰% 범위이고;
* (p+q+r+s)는 10∼1000, 바람직하게는 30∼500 범위이며;
* (r)/(p+q+r+s)는 0∼98 몰% 범위이고;
* (s)/(p+q+r+s)는 0∼98 몰% 범위이다.
리신, 오르니틴, 아르기닌 유도체는 예컨대 에틸 및 메틸 에스테르, 아미드 및 메틸화된 아미드일 수 있다.
바람직하게는, 이 대안적인 형태에 따르면, 소수성 기(GH) 및 양이온성 기는 측쇄기로서 무작위로 위치한다.
또한, 폴리글루타메이트와 소수성 단위의 몰 그래프팅율은 2∼99%, 바람직하게는 5∼50%인 것이 바람직한데, 단 각 중합체쇄는 평균 3 이상의 소수성 그래프트를 가진다.
폴리글루타메이트의 (q)/(p+q+r+s)는 비는 이들이 양이온 전하를 포함하는 1 내지 약 97 몰%의 기를 포함할 수 있음을 의미한다.
폴리글루타메이트의 (s)/(p+q+r+s)는 비는 이들이 중성 pH에서 음이온성, 중성 또는 양이온성일 수 있음을 의미한다.
히스티딘에서 유도되는 화학식 V의 폴리아미노산의 제조 및 합성에 대한 더 상세한 내용에 대해서는 특허 출원 FR 05 53302호를 참조하는 것이 유용할 것이다. 히스티딘에서 유도되는 이외의 화학식 V의 폴리아미노산의 제조 및 합성에 대한 더 상세한 내용에 대해서는 프랑스 특허 출원 FR 07 03185호를 참조하는 것이 유용할 것이다.
유리한 실시양태에 따르면, 상기 화학식들에서 R4 또는 B 기는 직접 결합이 다.
또다른 가능성에 따르면, 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2) 중 하나는 히드록시알킬(바람직하게는 에틸)글루타민 잔기 및 서로 동일하거나 또는 상이한 다수의 소수성 측쇄기(GH)를 포함한다. 히드록시알킬글루타민 단위는 또한 히드록시알킬아민 기를 가진다. 이들 히드록시알킬아민 기는 바람직하게는 아미드 결합을 통하여 공중합체에 결합된다. 이들 히드록시알킬글루타민 잔기의 글루타메이트 잔기를 작용기화하는 데 사용될 수 있는 히드록시알킬아민 기는 서로 동일하거나 또는 상이하며, 예컨대 2-히드록시에틸아미노, 3-히드록시프로필아미노, 2,3-디히드록시프로필아미노, 트리스(히드록시메틸)메틸아미노 및 6-히드록시헥실아미노의 군에서 선택된다.
본 발명에 사용되는 소수성 기(GH) 중 적어도 하나는 소수성 기(GH)를 코폴리글루타메이트쇄(예컨대, 코폴리글루타메이트 골격 주쇄)에 연결할 수 있는 1 이상의 이격 연결기(또는 단위)(스페이서)를 포함하는 소수성 그래프트에 포함되는 것이 유리하다. 이 연결기는 예컨대 1 이상의 직접 공유 결합 및/또는 1 이상의 아미드 결합 및/또는 1 이상의 에스테르 결합을 포함할 수 있다. 예컨대, 연결기는 특히 코폴리글루타메이트의 구성 단량체 단위 이외의 "아미노산" 잔기, 아미노알콜의 유도체, 폴리아민(예컨대 디아민)의 유도체, 폴리올(예컨대 디올)의 유도체 및 히드록시산의 유도체로 구성된 군에 속하는 유형의 것일 수 있다. 코폴리글루타메이트 또는 폴리알킬글루타민 쇄에 대한 GH의 그래프팅은 코폴리글루타메이트쇄 또는 히드록시알킬글루타민 잔기에 결합될 수 있는 GH 전구체의 사용을 수반할 수 있 다. GH의 전구체는 실제로 비제한적으로 알콜 및 아민으로 구성된 군에서 선택되며, 이들 화합물은 당업자가 용이하게 작용기화할 수 있다. 이들 히드록시알킬(바람직하게는 에틸)글루타민 잔기에 대한 더 상세한 내용에 대해서는 FR-A-2 881 140호가 참고될 것이다.
유리한 실시양태에 따르면, 특히 목표하는 상기 여러 가능성 중 적어도 하나에 따르면, 본 발명에 사용되는 소수성 기(GH)의 전부 또는 일부는
* 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S) 및/또는 1 이상의 불포화를 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 알콕시,
* 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 하나 이상의 고리상 탄소환을 가지며 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함하는 알콕시,
* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 C7-C30의 알콕시아릴 또는 아릴옥시알킬
로 구성된 라디칼 군에서 독립적으로 선택된다.
또다른 유리한 실시양태에 따르면, 특히 목표하는 상기 여러 가능성 중 적어도 하나에 따르면, 소수성 기(GH)는 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알콜, 토코페롤 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택되는 알콜계 전구체에서 유래하며 R4는 직접 결합이다.
또다른 유리한 실시양태에 따르면, 특히 목표하는 상기 여러 가능성 중 적어도 하나에 따르면, 소수성 기(GH)는 각각 서로 독립적으로 하기 화학식의 1가 라디칼이다:
Figure 112009074471781-PCT00010
상기 화학식에서,
- R5는 메틸(알라닌), 이소프로필(발린), 이소부틸(류신), sec-부틸(이소류신) 또는 벤질(페닐알라닌)이고;
- R6은 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성 라디칼이며;
- l은 0∼6의 범위이다.
본 발명의 두드러진 특징에 따르면, 소수성 기(GH)의 소수성 라디칼 R6의 전부 또는 일부는
* 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S) 및/또는 1 이상의 불포화를 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 알콕시,
* 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 하나 이상의 고리상 탄소환을 가지며 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함하는 알콕시, 및
* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 C7-C30의 알콕시아릴 또는 아릴옥시알킬
로 구성된 라디칼 군에서 독립적으로 선택된다.
실제로, 비제한적으로, 상기 소수성 라디칼 R6은 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알콜, 토코페롤 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택되는 알콜계 전구체에서 유래한다.
유리하게는, 본 발명에 사용되는 고분자 전해질 폴리아미노산(PE1, PE2)의 주쇄는 α-L-글루타메이트 단독중합체, α-L-글루탐산 단독중합체, α-L-아스파르테이트 단독중합체, α-L-아스파르트산 단독중합체, α-L-아스파르테이트/α-L-글루타메이트 공중합체 및 α-L-아스파르트산/α-L-글루탐산 공중합체로 구성된 군에서 선택된다.
특별한 방식에서, 고분자 전해질 중합체(PE1 또는 PE2)의 폴리아미노산 주쇄의 아스파르트산 잔기 및/또는 글루탐산 잔기의 분포는 형성되는 중합체가 무작위형 또는 블록형 또는 멀티블록형인 분포이다.
또다른 정의법에 따르면, 고분자 전해질 중합체 PE1 또는 PE2의 몰질량은 2,000∼100,000 g/mol, 바람직하게는 5,000∼40,000 g/mol이다.
제1 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2)의 중합도는 50∼500, 바람직하게는 70∼300이다.
소수성 기로 치환되는 주쇄 중의 링크의 몰분율은 1∼40 몰%, 바람직하게는 3∼30 몰%이다.
본 발명에 사용되는 중합체는 상기 개시된 여러 부류에서 선택되므로 pHm과 동일한 pH 값에서 전반적으로 양이온성 또는 음이온성이다.
소수성 측기를 보유하는 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 중요한 특징은 수중에서 콜로이드 용액을 자발적으로 형성할 수 있다는 것이다.
이론에 구속되고자 하는 바는 아니나, 소수성 영역을 형성하는 소수성 기의 초분자적 회합으로 나노입자가 형성된다고 가정할 수 있다. 각 나노입자는 그 소수성 영역 주위에 더 많이 또는 더 적게 축합된 하나 이상의 PE1 중합체 쇄를 포함한다. 본 발명에 사용되는 중합체는 pH 및 조성에 따라 중성이거나(예컨대, -COOH, -NH2) 또는 이온화되는(예컨대 -COO-, -NH3 +) 이온화 가능한 작용기를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 이유에서, 수성 상에서의 용해도는 이온화된 작용기의 농도, 따라서 pH에 직접 의존한다. 수용액에서, 카르복실 작용기의 경우, 짝이온은 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘과 같은 금속 양이온 또는 트리에탄올아민, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 또는 폴리에틸렌이민과 같은 폴리아민과 같은 유기 양이온일 수 있다. 양이온성 기의 짝음이온은 바람직하게는 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트로 구성된 군에서 선택된다.
반중화 pH를 알 경우, 당업자라면 중합체의 이온화도가 충분히 높도록 pH를 조절하고 콜로이드 용액의 안정성을 확보할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리아미노산 유형의 고분자 전해질은 예컨대 당 업자에게 공지된 방법으로 얻어진다. 랜덤 폴리아미노산은 "스페이서"에 의하여 미리 작용기화된 소수성 그래프트를 종래의 커플링 반응에 의하여 중합체에 직접 그래프팅함으로써 얻을 수 있다. 블록 또는 멀티블록 폴리아미노산 고분자 전해질은 해당 N-카르복시아미노산 무수물(NCA)의 순차 중합체 의하여 얻을 수 있다.
폴리아미노산, 호모폴리글루타메이트, 호모폴리아스파르테이트 또는 블록, 멀티블록 또는 랜덤 글루타메이트/아스파르테이트 공중합체는 예컨대 종래의 방법에 따라 제조된다.
α형 폴리아미노산을 얻기 위하여 가장 널리 사용되는 기술은 예컨대 문헌[논문 "Biopolymers, 1976, 15, 1869" 및 H.R. Kricheldorf의 저서, "alpha-amino acid N-carboxy Anhydride and related Heterocycles", Springer Verlag (1987)]에 개시된 N-카르복시아미노산 무수물(NCA)의 중합을 기초로 한다. NCA 유도체는 바람직하게는 NCA-O-Me, NCA-O-Et 또는 NCA-O-Bz 유도체(Me = 메틸, Et = 에틸, Bz = 벤질)이다. 중합체는 추후 중합체를 산 형태로 얻는 데 적절한 조건 하에서 가수분해된다. 이들 방법은 본 출원인의 특허 FR-A-2 801 226호에 기재된 개시 내용의 영향을 받은 것이다. 예컨대 가변 중량을 갖는 폴리(α-L-아스파르트산), 폴리(α-L-글루타민산), 폴리(α-D-글루타민산) 및 폴리(γ-L-글루타민산) 유형과 같은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 몇 가지 중합체는 시판된다. α,β형 폴리아스파르트산은 아스파르트산의 축합(폴리숙신이미드를 얻음) 및 이어서 염기성 가수분해(Tomida et al., Polymer, 1997, 38, 4733-36 참조)에 의하여 얻어진다.
중합체의 산 작용기와 소수성 그래프트(GH)의 커플링은 커플링제로서 카르보 디이미드 및 임의로 4-디메틸아미노피리딘과 같은 촉매의 존재 하에 디메틸포름아미드(DMF), N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 디메틸 설폭시드(DMSO)와 같은 적절한 용매 중에서 폴리아미노산의 반응에 의하여 용이하게 실시된다. 카르보디이미드는 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 또는 디이소프로필카르보디이미드이다. 그래프팅율은 반응 시간 또는 구성 성분 및 반응물의 화학양론에 의하여 화학적으로 제어된다. "스페이서"에 의하여 작용기화된 소수성 그래프트는 산 촉매 작용에 의한 직접 축합에 의하여 또는 종래의 펩티드 커플링에 의하여 얻어진다.
중합체의 산 작용기와 양이온성 기 및 임의로 중성 기의 커플링은 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 디메틸 설폭시드(DMSO)와 같은 적절한 용매 중에서 커플링제로서 클로로포르메이트의 존재 하에 제2 단계에서 동시에 실시된다.
양이온성 기가 화학적으로 다르지 않은 2개의 아민 작용기(예컨대, 선형 디아민)를 포함하는 경우, 이것은 두 작용기 중 하나가 보호되는 형태로 도입될 수 있다. 이후 최종적인 보호기 분리 단계가 추가된다.
상기 기를 커플링하기 위한 중합 화학 및 반응은 종래의 것이며 당업자에게 널리 공지되어 있다(예컨대, 상기 언급한 본 출원인의 특허 또는 특허 출원 참조).
미리 소수성 그래프트로 합성된 NCA 유도체는 블록 또는 멀티블록 공중합체의 합성에 사용된다. 예컨대, NCA-소수성 유도체는 NCA-O-벤질과 공중합된 다음 가수분해에 의하여 벤질기가 선택적으로 제거된다.
본 발명에 따른 고분자 전해질 중합체(PE1 및 PE2)의 특히 바람직한 회합 예 는 이하의 실시예에 개시된다.
본 발명에 사용되는 중합체의 중요한 특징은 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 콜로이드 용액의 형태이고 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)가 용액 또는 콜로이드 용액의 형태라는 것이다.
이 조건을 만족시키기 위하여, 양이온성 중합체의 반중화 pH는 충분히 높아, 예컨대 5.5 초과, 바람직하게는 6 초과 또는 심지어 8 초과이고; 음이온성 중합체의 반중화 pH는 충분히 낮아, 예컨대 6.5 미만, 바람직하게는 6.0 미만 또는 심지어 5.5 미만이다.
더 특별히, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 음이온성인 대안적 형태에서, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 이의 반중화 pH가 3∼6.5, 바람직하게는 4.5∼6.5이도록 선택된다. 이 대안적 형태에 따르면, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 pH 6∼8의 pHm 값에서 콜로이드 용액을 형성한다.
이러한 중합체 PE1는 특히 실시예 1a)에 개시된다.
이 경우, 제1 가능성에 따르면, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 양이온성이고 8 미만의 pH에서 콜로이드 용액을 형성한다. 바람직하게는, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 반중화 pH가 8을 초과하도록 선택된다. 이러한 중합체 PE2는 특히 실시예 1d)에 개시된다.
따라서, 이 제1 가능성에 따르면, pH 6∼8의 pHm 값에서 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 콜로이드 용액을 형성하고 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 용액 또는 콜로이드 용액을 형성한다.
이 경우, 본 발명의 중요한 특징에 따르면, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)의 중량에 대한 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 중량 비는 전하비(Z), 음이온성 이온화기의 몰수에 대한 양이온성 이온화기의 몰수의 비가 pHm에서 측정하여 0.25∼3, 바람직하게는 0.25∼1.5이도록 선택된다.
제2 가능성에 따르면, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 양이온성이고 6 미만의 pH에서 콜로이드 용액을 형성하며 6.5를 초과하는 pH에서 침전한다. 바람직하게는, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 반중화 pH가 5.5∼7이도록 선택된다. 이러한 중합체 PE2는 특히 실시예 1c)에 개시된다. 이 경우, 본 발명의 중요한 특성에 따르면, 3∼6의 pH, pHm 값에서 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 콜로이드 용액을 형성하고 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 용액 또는 콜로이드 용액을 형성한다. 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)의 중량에 대한 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 중량 비는 전하비(Z)가 pHm에서 측정하여 3.5∼30, 바람직하게는 5∼15, 더 바람직하게는 8∼12이도록 선택된다.
제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 양이온성인 또다른 대안적 형태에서, 이 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 반중화 pH가 5를 초과하도록 선택된다. 이 경우, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 음이온성이고 반중화 pH가 3∼6.5, 바람직하게는 4.5∼6.5이도록 선택된다.
본 발명에 따른 입자는 생리학적 pH에서 T 테스트로 측정된 크기가 1∼100 마이크론이다.
본 발명에 따른 입자는 화학적으로 가교결합되지 않는 것이 유리하다.
본 발명의 특정한 실시 형태에서, 입자는 생리학적 pH에서 0.15∼1.1, 바람직하게는 0.3∼1.0, 더욱 바람직하게는 0.5∼1.0의 높은 중합체 벌크 밀도를 보인다. 높은 중합체 밀도는 입자 내에 중합체쇄의 치밀한 망상 구조가 존재함을 반영하는 것이다. 이론에 의하여 구속되고자 하는 바는 아니나, 이러한 치밀한 망상 구조가 본 발명에 따른 입자 내에 존재하는 활성 성분(AP)이 외부 매질로 확산되는 것을 늦추므로 그 방출을 늦추는데 기여한다고 추정할 수 있다. 본 발명에 따른 치밀한 입자의 놀라운 측면은 이들을 포함하는 중합체쇄의 망상 구조가 입자 코어에 활성 성분(AP)을 포획하는 일 없이 이 동일한 활성 성분(AP)의 방출을 늦출 수 있다는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 운반체에 의하면, 활성 성분(AP)의 장기 방출 및 양호한 생체이용률을 모두 얻을 수 있다.
일부 경우, 특히 본 발명에 따른 마이크로입자와 강한 친화성을 갖는 펩티드 또는 단백질의 경우, 방출을 가속시키고 및/또는 생체이용률을 개선시키기 위하여 AP 방출 속도를 조절하는 것이 유리할 수 있다. 많은 시험 후, 소정 극성의 PE1 또는 PE2 중합체가 또한 반대 극성의 이온화 가능한 기 및/또는 히드록시에틸아미노 치환된 기와 같은 이온화 불가능한 기를 보유하는 경우 단백질 또는 펩티드의 방출이 촉진될 수 있음이 본 출원인에 의하여 입증되었다.
따라서, 본 발명의 특정한 실시 형태에서는, 두 중합체 PE1 또는 PE2 중 하나가 동시에
- 15∼50 몰%의 글루타메이트 단량체;
- 히드록시에틸아미노로 치환된 기와 같은 20∼55 몰%의 이온화 불가능한 단 량체;
- 반중화 pH가 8을 초과하는 양이온성 기를 보유하는 10∼40 몰%의 단량체;
- 소수성 기로 치환된 3∼15 몰%의 이온화 불가능한 단량체
를 포함한다.
본 발명의 또다른 특정한 실시 형태에서는, PE1 또는 PE2 중합체가 양이온성이고 동시에
- 0∼5 몰%의 글루타메이트 단량체;
- 히드록시에틸아미노로 치환된 기와 같은 50∼85 몰%의 이온화 불가능한 단량체;
- 반중화 pH가 8을 초과하는 양이온성 기를 보유하는 10∼40 몰%의 단량체;
- 소수성 기로 치환된 3∼15 몰%의 이온화 불가능한 단량체
를 포함한다.
본 발명의 특정한 실시 형태에서, 특히 활성 성분(AP)이 치료 단백질인 경우, 제제 중에 존재하는 중합체(PE1 + PE2)의 전체 농도는 4∼15 mg/ml이다. 이 농도 범위에서, 제제는 작은 직경의 바늘, 예컨대 게이지 27, 심지어 29 및 31의 바늘을 통하여 용이하게 주입될 수 있다. 실시예 3 및 4는 이러한 제제를 상세히 개시한다.
활성 성분(AP)은 바람직하게는 단백질, 당단백질, 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜쇄에 결합된 단백질[바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG): "PEG화 단백질"], 펩티드, 다당류, 지당류, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 혼합물로 구성되는 군, 더 바람직하게는 에리트로포이에틴, 예컨대 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 다르베포에틴, 헤모글로빈 라피머, 이들의 유사체 또는 이들의 유도체; 옥시토신, 바소프레신, 부신 피질 자극 호르몬, 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 조혈 작용을 자극하는 인자 및 이들의 혼합물, 알테플라제, 테넥테플라제, 인자 VII(a) 또는 인자 VII와 같은 혈액 인자; 헤모글로빈, 시토크롬, 알부민, 프로락틴, 룰리베린, 류프롤리드, 고세렐린, 트립토렐린, 부세렐린 또는 나파렐렌과 같은 황체 형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 및 유사체; LHRH 길항제, LHRH 경쟁제, 인간, 돼지 또는 소 성장 호르몬(GHs), 성장 호르몬 방출 인자, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터류킨 또는 이들의 혼합물(IL-2, IL-11, IL-12), 인터페론 알파, 알파-2b, 베타, 베타-1a 또는 감마와 같은 인터페론; 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 우로가스트론, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도모르핀, 앤지오텐신, 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 종양 괴사 인자(TNF), 신경 성장 인자(NGF), 베클라페르민, 트라페르민, 안세스팀과 같은 성장 인자 또는 각질 형성 세포 성장 인자, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF), 헤파리나제, 골 형태형성 단백질(BMP), hANP, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1), VEG-F, 재조합 B형 간염 표면 항원(rHBsAg), 레닌, 시토킨, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 티로시딘, 그라미시딘, 에타네르셉트, 이미글루세라제, 드로트레코긴 알파, 시클로스포린 및 합성 유사체, 효소, 시토킨, 항체, 항원 및 백신의 약학적으로 활성인 변형 및 단편, 및 리툭시맵, 인플릭시맵, 트라스투주맵, 아달리무맵, 오말리주맵, 토시 투모맵, 에팔리주맵 및 세툭시맵과 같은 항체로 이루어진 하위 군에서 선택된다.
다른 활성 성분은 다당류(예컨대, 헤파린) 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, iRNA, 항생제 및 살아있는 세포이다. 또다른 범주의 활성 성분은 중추 신경계에 작용하는 약학 물질, 에컨대 리스페리돈, 주클로펜틱솔, 플루페나진, 페르페나진, 플루펜틱솔, 할로페리돌, 플루스피릴렌, 퀘티아핀, 클로자핀, 아미술프리드, 술피리드, 지프라시돈 등을 포함한다.
대안적인 실시양태에 따르면, 활성 성분은 안트라시클린, 탁소이드 또는 캄포테신류에 속하거나 또는 류프롤리드 또는 시클로스포린과 같은 펩티드류에 속하는 유형의 소수성, 친수성 또는 양친매성 유기 소분자 및 이의 혼합물이다.
본 명세서의 의미에서, 소분자는 특히 예컨대 아미노산이 없는 비단백질 소분자이다.
또다른 실시양태에 따르면, 활성 성분은 알콜 남용 치료용 제제, 알츠하이머병 치료용 제제, 마취제, 말단비대증 치료용 제제, 진통제, 항천식제, 알레르기 치료용 제제, 항암제, 항염제, 항응고제 및 항혈전제, 항경련제, 항간질약, 항당뇨병제, 진토제, 항녹내장제, 항히스타민제, 항감염제, 항생제, 항균제, 항바이러스제, 항파킨슨제, 항콜린제, 진해제, 탄산 탈수소효소 억제제, 심혈관제, 저지혈증, 항부정맥약, 혈관확장제, 항협심증제, 항고혈압제, 혈관보호제, 콜린에스테라제 억제제, 중추 신경계 질환 치료용 제제, 중추 신경계 자극제, 피임약, 수정 촉진제, 분만 유도제 및 억제제, 낭포성 섬유증 치료용 제제, 도파민 수용체 작용제, 자궁내막증 치료용 제제, 발기 불능 치료용 제제, 불임 치료를 위한 제제, 위장 장애 치 료용 제제, 면역 조절제 및 면역 억제제, 기억 장애 치료용 제제, 편두통 치료제, 근육 이완제, 뉴클레오시드 유사체, 골다공증 치료용 제제, 부교감 신경 흥분제, 프로스타글란딘, 정신병 치료제, 진정제, 수면제 및 안정제, 신경마비제, 항불안제, 정신자극제, 항우울제, 피부 질환 치료용 제제, 스테로이드 및 호르몬, 암페타민, 식욕 억제제, 비마취 진통제, 바르비투레이트, 벤조디아제핀, 하제, 향정신약물 및 이들 제품의 임의의 조합 중 1 이상으로부터 선택되는 것이 유리하다.
이의 또다른 측면에 따르면, 본 발명의 발명 주제는
1) pH 3∼8의 pHm 값에서, 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성할 수 있음];
2) 단계 1에서 얻어진 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계[상기 활성 성분은 상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 함께 결합함];
3) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)를 제조하는 단계[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성하며, 단, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 폴리아미노산인 경우, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 폴리리신도 폴리에틸렌이민도 아님];
4) pHm과 동일한 pH에서, 단계 2)에서 얻어진 활성 성분(AP)과 회합된 입자 의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를, 단계 3)에서 얻어진 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합시키는 단계
를 포함하는, 1 이상의 활성 성분의 지속 방출을 위한 입자(이들 입자는 특히 상기 개시한 입자임)의 제조 방법이다.
본 발명의 또다른 발명 주제는
1) pH 3∼8의 pHm 값에서, 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성할 수 있음];
2) 단계 1에서 얻어진 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계[상기 활성 성분은 상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 함께 결합함];
3) 소수성 측기(GH)를 보유하는, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)를 제조하는 단계[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성함];
4) pHm과 동일한 pH에서, 단계 2)에서 얻어진 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를, 단계 3)에서 얻어진 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합시키는 단 계
를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자(이들 입자는 특히 상기 개시한 입자임)의 제조 방법이다.
본 발명에 따른 방법의 중요한 특징은 pHm에서 활성 성분(AP)이 로딩된 제1 고분자 전해질 중합체(PE1) 입자의 콜로이드 용액 및 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)의 용액 또는 콜로이드 용액을 단순히 혼합함으로써 입자를 자발적으로 형성하는 것이다.
단백질, 펩티드 또는 소분자와 같은 활성 성분은 폴리아미노산 유형의 제1 중합체(PE1)와 자발적으로 함께 결합할 수 있다. 활성 성분(AP)을 고분자 전해질 중합체(PE1)의 나노입자에 충전하는 것은 활성 성분(AP) 용액을 제1 고분자 전해질 중합체(PE1의 콜로이드 용액과 단순히 혼합함으로써 실시된다. 이러한 회합은 순전히 물리적인 것이며 활성 성분(AP) 및 중합체(PE1) 사이의 공유 결합의 형성을 동반하지 않는다. 이론의 제한을 받는 것은 아니나, 이러한 비특이적 회합은 중합체(PE1) 및 활성 성분(AP) 간의 소수성 상호작용 및/또는 정전기적 상호작용에 의하여 일어난다고 추정될 수 있다. 펩티드성 유형 또는 항체/항원 유형 또는 효소/기질 유형의 특정 수용체에 의하여 AP를 PE1 나노입자에 결합시키는 것은 불필요하고 심지어 종종 바람직하지 않음을 유념하여야 한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 얻어지는 입자의 화학적 가교결합 단계는 제공되지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 입자는 화학적으로 가교결합하지 않으며, 그럼에도 불구하고 연장된 기간에 걸쳐 활성 성분(AP)을 방출한 다. 이러한 화학적 가교결합 부재는 본 발명에 따른 입자의 중요한 이점이다. 이것은 화학적 가교결합이 없어서 활성 성분(AP)을 포함하는 입자의 가교결합 단계 동안 활성 성분(AP)의 화학적 분해가 회피될 수 있기 때문이다. 이것은 이러한 화학적 가교결합이 일반적으로 중합 가능한 성분의 활성화에 의하여 실시되고 UV 방사선 또는 글루타르알데히드와 같은 변성제가 포함될 수 있기 때문이다.
본 발명에 따른 방법은 건조 분말 형태로 제제를 얻기 위하여 (예컨대 동결 건조 또는 분무에 의하여) 얻어지는 입자의 현탁액의 탈수 단계를 포함하는 것이 유리하다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명의 발명 주제는, 상기 개시한 바와 같은 또는 상기 개시한 방법으로 얻어지는 입자의 수성 현탁액을 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 약학 제제이다.
본 발명은 또한
* 1 이상의 활성 성분(AP)를 포함하는 입자(이들 입자는 상기 개시한 입자 또는 상기 개시한 방법으로 얻어지는 입자임)를 베이스로 하거나, 또는
* 상기 언급한 수용액 중 현탁액을 포함하는 제제로부터 얻어지는
건조 분말 형태를 포함한 1 이상의 활성 성분(AP)의 연장 방출을 위한 고체 약학 제제에 관한 것이다.　
이러한 고체 약학 제제는 흡인 및 페내 투여를 위해 사용되는 것이 유리하다.
또다른 측면에 따르면, 본 발명의 발명 주제는 특히 비경구, 점막, 피하, 근 내, 피내, 경피, 복강내 또는 뇌내 투여를 위한 또는 종양내 투여, 경구, 경비, 폐내, 질내 또는 안내 경로에 의한 투여를 위한 약제의 제조 방법이며, 상기 방법은 실질적으로 상기 개시한 제제 중 적어도 하나를 사용하는 것으로 이루어진다.
도 1: 실시예 2(백색 원), 실시예 3.1(흑색 삼각형), 실시예 3.2(흑색 다이아몬드), 실시예 3.3(흑색 사각형), 실시예 4(흑색 원) 및 실시예 5(선)의 입자를 포함하는 개시된 제제로부터의 IFN-α의 시험관내 방출.
1) 합성:
a) 소수성기를 보유하는 음이온성 고분자 전해질 중합체(PE1-A) (합성 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트의 합성
15 g의 폴리(α-L-폴리글루탐산)(폴리옥시에틸렌 표준에 대하여 약 16,900 Da과 동등한 중량을 갖고 특허 출원 FR-A-2 801 226호에 개시된 바와 같이 NCA-GluOMe의 중합, 이어서 가수분해에 의하여 얻어짐)을 상기 중합체가 용해될 때까지 80℃에서 가열하면서 288 ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨다. 용액을 15℃로 냉각하고 8 ml의 DMF에 미리 용해시킨 2.5 g의 D,L-α-토코페롤(>98%, Fluka®로부터 얻음), 1 ml의 DMF에 미리 용해시킨 280 mg의 4-디메틸아미노피리딘 및 6 ml의 DMF에 미리 용해시킨 1.6 g의 디이소프로필카르보디이미드를 연속적으로 첨가한다. 3시간 동안 교반 후, 반응 매질을 15%의 염화나트륨 및 염산(pH 2)을 포함하는 1200 ml의 물에 붓는다. 이후 침전된 중합체를 여과로 회수하고 0.1N 염산, 물 및 디이소프로필 에테르로 세정한다. 이후 중합체를 40℃에서 진공 하에 오븐에서 건조시킨다. 90% 정도의 수율이 얻어진다. 입체 배제 크로마토그래피로 측정한 몰질량은 폴리옥시에틸렌 표준에 대하여 15,500이다. 양성자 NMR 분광 분석으로 측정한 그래프팅된 토코페롤의 수준은 5.1 몰%이다.
b) 음이온성 고분자 전해질 중합체(PE1-B)(나트륨 폴리글루타메이트)의 합성
특허 출원 FR-A-2 801 226호에 개시된 바와 같은 폴리(α-L-폴리글루탐산)의 합성을 채택한다.
입체 배제 크로마토그래피로 측정한 몰질량은 폴리옥시에틸렌 표준을 기준으로 하여 16,900 Da이다.
c) 양이온성 고분자 전해질 중합체(PE2-A) (히스티딘아미드 및 합성 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트)의 합성
Figure 112009074471781-PCT00011
5%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 3 g의 폴리(글루탐산)을 80℃에서 가열하여 38 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉 각시키고 2.74 g의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 2.2 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 온도를 0℃에서 유지하면서 반응 매질을 10분 동안 교반한다. 동시에, 8.65 g의 히스티딘아미드 디히드로클로라이드를 108 ml의 NMP에 현탁시킨다. 이후 10.6 ml의 트리에틸아민을 첨가하고 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분동안 교반한 다음 0℃로 냉각한다. 이후 활성화된 중합체의 용액을 히스티딘아미드 현탁액에 첨가한다. 반응 매질을 0℃에서 2시간 동안 교반한 다음 20℃에서 밤새 교반한다. 이후 0.62 ml의 35% HCl 및 이어서 83 ml의 물을 첨가한다. 이후 pH 3∼4에서 얻어지는 용액을 500 ml의 물에 붓는다. 이후 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9% NaCl) 및 4부피의 물에 대하여 정용 여과한다. 이후 중합체 용액을 300 ml 부피(중합체 농도는 18 mg/g임)로 농축한다. 그래프팅된 히스티딘아미드의 퍼센트는 D2O에서 1H NMR로 측정하여 95%이다.
d) 양이온성 고분자 전해질 중합체 PE2-B (합성 α-토코페롤 및 아르기닌이 그래프팅된 폴리글루타메이트)의 합성
Figure 112009074471781-PCT00012
5%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 10 g의 폴리(글루탐산)을 80℃에서 125 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 8.7 ml의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 7.35 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한다. 동시에, 24.67 g의 아르기닌아미드 디히드로클로라이드를 308 ml의 NMP에 현탁시키고 14.7 ml의 트리에틸아민을 첨가한다. 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분 동안 교반하고 이어서 0℃로 냉각한다. 이어서 활성화된 중합체의 유탁액을 이 현탁액에 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 다음 20℃에서 밤새 교반한다. 2.1 ml의 35% HCl 용액 및 이어서 100 ml의 물을 첨가한 후, 반응 혼합물을 1.6 리터의 물에 한방울씩 흘린다. 얻어진 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9 %) 및 이어서 4 부피의 물에 대하여 정용 여과하고 대략 250 ml의 부피로 농축한다. D2O 중 양성자 NMR로 측정할 때 그래프팅된 아르기닌아미드의 퍼센트는 90%이다.
e) 양이온성 고분자 전해질 중합체 PE2-C (합성 α-토코페롤, 아르기닌 및 에탄올아민이 그래프팅된 폴리글루타메이트)의 합성
Figure 112009074471781-PCT00013
5%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 10 g의 폴리(글루탐산)을 80℃에서 125 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 9.1 ml의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 7.71 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한다. 동시에, 8.2 g의 아르기닌아미드 디히드로클로라이드를 103 ml의 NMP에 현탁시킨 다음 9.31 ml의 트리에틸아민을 첨가한다. 1.6 ml의 에탄올아민을 더 첨가하고 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분 동안 교반한 다음 0℃로 냉각한다. 이어서 활성화된 중합체의 유탁액을 이 현탁액에 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한다. 1.2 ml의 에탄올아민을 첨가한 다음 반응 혼합물을 20℃에서 밤새 교반한다. 2.1 ml의 35% HCl 용액 및 이 어서 200 ml의 물을 첨가한 후, 반응 혼합물을 700 ml의 물에 한방울씩 흘리고 pH를 7.4로 조절한다. 얻어진 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9 %) 및 이어서 4 부피의 물에 대하여 정용 여과하고 대략 250 ml의 부피로 농축한다. D2O 중 양성자 NMR로 측정할 때 그래프팅된 아르기닌아미드 및 그래프팅된 에탄올아민의 퍼센트는 각각 40% 및 45%이다.
f) 양이온성 고분자 전해질 중합체 PE2-D (합성 α-토코페롤, 아르기닌 및 에탄올아민이 그래프팅된 폴리글루타메이트)의 합성
Figure 112009074471781-PCT00014
5%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 10 g의 폴리(글루탐산)을 80℃에서 125 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 8.7 ml의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 7.3 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 이 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한다. 동시에, 4.61 g의 아르기닌아 미드 디히드로클로라이드를 58 ml의 NMP에 현탁시킨 다음 2.9 ml의 트리에틸아민을 첨가한다. 2.8 ml의 에탄올아민을 더 첨가하고 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분 동안 교반한 다음 0℃로 냉각한다. 이어서 활성화된 중합체의 유탁액을 이 현탁액에 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 4시간 동안 교반한다. 1.2 ml의 에탄올아민을 첨가한 다음 반응 혼합물을 20℃에서 밤새 교반한다. 2.1 ml의 35% HCl 용액을 첨가한 후, 반응 혼합물을 730 ml의 물에 한방울씩 흘리고 pH를 7.4로 조절한다. 얻어진 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9 %) 및 이어서 4 부피의 물에 대하여 정용 여과하고 대략 300 ml의 부피로 농축한다. D2O 중 양성자 NMR로 측정할 때 그래프팅된 아르기닌아미드 및 그래프팅된 에탄올아민의 퍼센트는 각각 22% 및 68%이다.
2) 실시예 1 (비교): 소수성 기를 갖지 않는 고분자 전해질로 입자의 제조
(1) 중합체 PE1-B의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 b)에 따라 얻어진 중합체 PE1-B를 사용한다. 이 중합체의 반중화 pH는 5.985이다.
중합체 PE1-B의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.63으로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 100 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1-B의 농도를 8.38 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-B의 회합:
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α(PC GEN)를 상기 중합체 PE1-B의 콜로이드 용 액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-B] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH
4.55 1.1 7.17
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다.
(3) 폴리-L-아르기닌(Aldrich P7637)의 콜로이드 용액의 제조:　　　
이 중합체의 반중화 pH는 9를 초과한다.
폴리-L-아르기닌의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해하고 먼저 HCl 용액으로 pH를 0.92로 조절한 다음 NaOH 용액으로 pH를 6.91로 되돌리고 용액을 45℃에서 15분 동안 가열함으로써 얻는다. 중합체 폴리-L-아르기닌의 농도를 5.13 mg/g으로 조절한다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
1.37 g의 폴리-L-아르기닌 용액을 45℃에서 교반하면서 1.06 g의 IFN-α/PE1-B 용액에 한방울씩 적가한다. 45℃에서 15분 동안 교반한다. 이어서 4℃에서 밤새 교반한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 I에 통합된다.
전하비(Z)는 pHm 6.95에서 측정된 음이온성 이온화기의 몰수에 대한 양이온성 이온화기의 몰수의 비이다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 크기(㎛)
4.8 0.48 1.06 6.95 15.92
(5) 단백질의 캡슐화 정량
현탁액을 8000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상청액 중의 IFN-α를 유럽 약전(UV 흡수율에 의한 비색 분석)에 개시된 방법으로 분석한다.
전체 [IFN-α] (mg/g) 유리 [IFN-α] (mg/g) 수율(%)
0.48 0.15 71
실제로 도입되는 단백질의 3분의 1은 형성된 마이크로입자로 캡슐화되지 않는다. 이 비율은 결과적으로 제어 방출될 수 없다.
3) 실시예 2: 소수성 기를 갖는 단일 고분자 전해질(PE1)로 입자의 제조
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다. 이 중합체의 반중화 pH는 5.445이다.
중합체 PE1-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.53으로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 101 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1-B의 농도를 8.41 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH
4.58 1.1 7.17
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다.
(3) 폴리-L-아르기닌(Aldrich P7637)의 콜로이드 용액의 제조:　　　
이 용액은 실시예 1에 개시된 것과 동일한 방식으로 제조된다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
1.24 g의 폴리-L-아르기닌 용액을 45℃에서 교반하면서 1.07 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 45℃에서 15분 동안 교반한다. 이어서 4℃에서 밤새 교반한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 II에 통합된다.
전하비(Z)는 pHm 6.88에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 크기(㎛)
4.7 0.505 1.00 6.88 18.24
(5) 단백질의 캡슐화 정량
현탁액을 8000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고 상청액 중의 IFN-α를 유럽 약전에 개시된 방법(UV 흡수율에 의한 비색 분석)으로 분석한다.
전체 [IFN-α] (mg/g) 유리 [IFN-α] (mg/g) 수율(%)
0.505 0.01 98
도입된 모든 단백질이 형성된 마이크로입자로 캡슐화된다.
4) 실시예 3: IFN-α를 포함하는, PE1-A 및 PE2-A를 베이스로 하는 입자의 제조
4.1) 실시예 3.1: 중합체의 최종 농도는 대략 10 mg/g, Z는 대략 1
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다. 이 중합체의 반중화 pH는 5.445이다.
중합체 PE1-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.45로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 108 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1의 농도를 23.88 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α 및 89 mOsm NaCl를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm)
13.33 1.01 6.51 322
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다. 이후 상기 회합체의 pH를 5.07로 조절한다.
(3) 중합체 PE2-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 c)에 따라 얻어진 중합체 PE2-A를 사용한다. 이 중합체의 반중화 pH는 6.05이다.
중합체 PE2-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 pH를 5.17로 조절함으로써 얻는다. 용액의 삼투압을 289 mOsm으로 조절하고 중합체 PE2-A의 농도를 5.70 mg/g으로 조절한다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
4.98 g의 PE2-A 용액을 교반하면서 4.61 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 4℃에서 밤새 교반한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 III에 통합된다.
전하비(Z)는 pHm 5.17에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 삼투압 (mOsm) 크기(㎛)
9.1 0.46 0.83 5.17 370 7.7
4.2) 실시예 3.2: 중합체의 최종 농도는 5 mg/g, Z는 대략 10
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다.
중합체 PE1의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.52로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 108 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1의 농도를 20.21 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α 및 89 mOsm NaCl를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm)
1.7 0.1 5.45 324
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다. 이후 상기 회합체의 pH를 4.88로 조절한다.
(3) 중합체 PE2-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 c)에 따라 얻어진 중합체 PE2-A를 사용한다.
중합체 PE2-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 pH를 5.07로 조절함으로써 얻는다. 용액의 삼투압을 287 mOsm으로 조절하고 중합체 PE2-A의 농도를 8.11 mg/g으로 조절한다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
5.19 g의 PE2-A 용액을 교반하면서 5.02 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 4℃에서 밤새 교반한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 IV에 통합된다.
전하비(Z)는 pHm 4.81에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 삼투압 (mOsm) 크기(㎛)
5.0 0.49 13.43 4.81 306 15.1
4.3) 실시예 3.3: 중합체의 최종 농도는 대략 10 mg/g, Z는 대략 10
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다.
중합체 PE1의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.52로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 108 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1의 농도를 20.21 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α 및 89 mOsm NaCl를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm)
3.39 1.01 5.83 347
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다. 이후 상기 회합체의 pH를 5.07로 조절한다.
(3) 중합체 PE2-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 c)에 따라 얻어진 중합체 PE2-A를 사용한다.
중합체 PE2-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 pH를 5.08로 조절함으로써 얻는다. 용액의 삼투압을 288 mOsm으로 조절하고 중합체 PE2-A의 농도를 16.37 mg/g으로 조절한다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
5.25 g의 PE2-A 용액을 교반하면서 5.19 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 4℃에서 밤새 교반한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 V에 통합된다.
전하비(Z)는 pHm 4.95에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 삼투압 (mOsm) 크기(㎛)
9.9 0.5 8.20 4.95 314 10.3
5) 실시예 4: IFN-α를 포함하는, PE1-A 및 PE2-B를 베이스로 하는 입자의 제조, 중합체의 최종 농도는 5 mg/g, Z = 1
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다.
중합체 PE1-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.52로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 108 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1-A의 농도를 20.21 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α 및 89 mOsm NaCl를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm)
3.715 1.01 5.89 335
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다. 이후 상기 회합체의 pH를 6.89로 조절한다.
(3) 중합체 PE2-B의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 d)에 따라 얻어진 중합체 PE2-B를 사용한다. 이 중합체의 중화 pH는 9를 초과한다.
중합체 PE2-B의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 pH를 6.98로 조절함으로써 얻는다. 용액의 삼투압을 288 mOsm으로 조절하고 중합체 PE2-B의 농도를 6.33 mg/g으로 조절한다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
4.06 g의 PE2-B 용액을 교반하면서 4.59 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 4℃에서 밤새 교반한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 VI에 통합된다.
전하비(Z)는 pHm 6.85에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 삼투압 (mOsm) 크기(㎛)
5 0.46 1.01 6.85 360 17.1
6) 실시예 5(비교): IFN-α를 포함하는, PE1-A만을 베이스로 하는 입자의 제조
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다.
중합체 PE1-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.52로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 108 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1-A의 농도를 29.05 mg/g으로 조절한다.
2.4 mg/g의 농축 단백질 IFN-α를 상기 중합체 PE1의 콜로이드 용액에 첨가한다. 25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표 VII에 통합된다.
입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm) 크기(nm)
23 0.5 7.20 300 40
7) 실시예 2, 3, 4 및 5에 대한 시험관내 결과
이를 위하여, 본 발명에 따른 제제로부터 활성 성분의 방출을 L 테스트를 사용하여 측정한다.
L 테스트에서의 방출은 경시적으로 방출되는 단백질의 퍼센트 형태로 도 1에 도시된다.
중합체 중 하나만이 소수성 기를 보유하는 비교 실시예 2의 제제는 23 시간 후 단백질의 1.6%가 방출되는 매우 약한 방출 프로필을 보인다.
23 mg/g의 입자 PE1를 포함하는 비교 실시예 5의 제제는 실시예 3.1의 입자(PE1/PE2-A, Z = 1∼10 mg/g)와 유사한 프로필을 포인다(각각 10시간에 93%, 48 시간에 72%).
실시예 3.2(PE1/PE2-A, Z = 10 및 5 mg/g) 및 3.3(PE1/PE2-A, Z = 10 및 10 mg/g)의 입자의 경우, 실험 종료시에 0이 아닌 일정한 방출 흐름의 생성이 관찰된다(48 시간에 각각 주입된 단백질의 65% 및 19%).
실시예 4(PE1/PE2-B, Z = 1 및 5 mg/g)의 입자의 경우, 실험 종료시에 0이 아닌 일정한 방출 흐름이 관찰된다(48 시간에 주입된 단백질의 7% 방출).
8) 실시예 3, 4 및 5에 대한 시험관내 결과
44 마리의 래트를 8 또는 12 마리 동물로 이루어진 5개의 군으로 분리하고 속방 IR 제제 또는 비교 실시예 5에 상응하는 서방 제제 또는 본 발명 실시예 3 및 4의 제제 중 하나를 300 ㎍/kg의 용량으로 병용 투여하였다.
약동학적 결과는 이하의 표 VIII에 통합되어 있다:
실시예 N Cmax (ng/ml) Tmax 평균 (간격) (시) AUC (ng x h/ml) T50%AUC (h) RBA(%)
IFN IR (0.5) 12 100.6 05 (0.25-1) 255.9 1.5 100
실시예 4 8 1.8 3 (3-6) 13.6 9.0 5
실시예 3.1 8 7.6 3 (3-6) 126.4 11.4 49
실시예 3.2 8 6.1 3 (3-6) 128.4 18.6 50
실시예 3.3 8 1.7 3 (3-12) 74.2 30.7 > 29
실시예 5 8 3.5 12 (6-24) 95.7 18.4 62
Cmax는 모든 동물에 대한 단백질의 평균 최대 혈장 농도를 나타낸다.
Tmax 평균은 혈장 농도가 그 최대값을 지난 시간의 평균을 나타낸다.
AUC는 시간의 함수로서의 혈장 농도 곡선 아래의 평균 면적을 나타낸다.
T50%AUC는 그 종말점에서 곡선 아래의 면적이 그 전체 값의 50%에 달하는 평균 시간을 나타낸다.
RBA는 IFN IR 제제의 곡선 아래의 면적에 대한 고려되는 제제의 곡선 아래의 면적의 비를 나타낸다.
모든 제제는 IR에 대하여 Cmax 감소가 동반되는 서방 프로필을 나타낸다
방출 프로필이 비교 실시예 5의 제제에 가까운 실시예 3.1(PE1/PE2-A, Z = 1 내지 10 mg/g)의 제제를 제외하고, 최종 기울기가 더 낮은데, 이것은 잔여 흡수가 연장되었음을 의미한다.
실시예 3.3(PE1/PE2-A, Z = 10 및 10 mg/g)의 제제의 경우, 최대 1주를 초과하는 방출을 주목하여야 한다.
9) 실시예 6: IFN-α를 포함하는, PE1-A 및 PE2-C를 베이스로 하는 입자의 제조, 중합체의 최종 농도는 5 mg/g, Z = 1
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다.
중합체 PE1-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.15로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 145 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1-A의 농도를 3.10 mg/g으로 조절한다.
(2) 치료 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.7 mg/g의 농축 단백질 IFN-α 및 89 mOsm NaCl를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm)
1.94 1.01 5.6 253
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다. 이후 상기 회합체의 pH를 7.0으로 조절한다.
(3) 중합체 PE2-C의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 e)에 따라 얻어진 중합체 PE2-C를 사용한다. 이 중합체의 중화 pH는 9를 초과한다.
중합체 PE2-C의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 pH를 7.04로, 288 mOsm 및 PBS 140 mOsm에서 7.96 mg/g으로 조절함으로써 얻는다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
15.147 g의 PE2-C 용액을 교반하면서 16.374 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 4℃에서 밤새 교반한다.
전하비(Z)는 pHm 7에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표에 통합된다:
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 삼투압 (mOsm) 크기(㎛)
4.9 0.49 1.0 7.02 277 50.8
10) 실시예 7: IFN-α를 포함하는, PE1-A 및 PE2-D를 베이스로 하는 입자의 제조, 중합체의 최종 농도는 5 mg/g, Z = 1
(1) 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체 PE1-A를 사용한다.
중합체 PE1-A의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.02로 조절함으로써 얻는다. 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 용액의 삼투압을 101 mOsm으로 조절한다. 중합체 PE1-A의 농도를 2.0 mg/g으로 조절한다.
(2) 단백질과 중합체 PE1-A의 회합:
2.7 mg/g의 농축 단백질 IFN-α 및 89 mOsm NaCl를 상기 중합체 PE1-A의 콜로이드 용액에 첨가한다. 이하의 특징을 갖는 회합체가 얻어진다:
[PE1-A] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) pH 삼투압 (mOsm)
1.26 1.0 5.5 234
25℃에서 밤새 교반하여 회합체를 생성한다. 이후 상기 회합체의 pH를 7.0으로 조절한다.
(3) 중합체 PE2-D의 콜로이드 용액의 제조:
상기 합성 f)에 따라 얻어진 중합체 PE2-D를 사용한다. 이 중합체의 중화 pH는 9를 초과한다.
중합체 PE2-D의 콜로이드 용액은 이것을 수중에 용해시키고 HCl 0.1 N 또는 NaOH 0.1 N을 사용하여 pH를 7로 조절함으로써 얻는다. PE2-D 중합체의 농도를 8.82 mg/g으로 조절한다.
(4) 입자를 얻기 위한 혼합
1.2 g의 PE2-C 용액을 교반하면서 1.2 g의 IFN-α/PE1-A 용액에 한방울씩 적가한다. 4℃에서 밤새 교반한다.
전하비(Z)는 pHm 7에서 측정한다.
입자의 크기는 T 테스트에 따라 측정한다.
얻어지는 입자의 특징은 이하의 표에 통합된다:
[중합체] (mg/g) [IFN-α] (mg/g) Z pHm 삼투압 (mOsm) 크기(㎛)
5.0 0.48 1.0 7.1 286 13.6
11) 실시예 8 : (비교) IFN-α를 포함하는, PE1-A/PE2-D 및 PE1-A/PE2-C를 베이스로 하는 입자의 방출 속도
상기 실시예 6 및 7에 개시된 제조에 의하여 얻어지는 입자를 상기 개시한 연속 흐름 셀 방출의 L 테스트에서 비교한다. 얻어진 결과는 이하의 표에 통합된다:
방출 (주입 단백질 %)
시간 1 시간 6 시간 12 시간 18 시간
IFNα/PE1-A/PE2-D Z = 1 5 mg/g 4.0 19.7 31 39
IFNα/PE1-A/PE2-C Z = 1 5 mg/g 0.2 6.6 9.5 11.4
결론적으로, 이 실시예는 특히 중성 및/또는 음이온성 기를 더 많이 또는 더 적게 포함하는 양이온성 중합체를 선택하여 AP 방출 속도를 조절할 수 있음을 보여준다. 따라서, 12시간 후, 방출은 PE2-C로부터 얻어지는 마이크로입자에 대하여 9.5%이고 PE2-D로부터 얻어지는 마이크로입자에 대하여 31%이다.　　　
　　　

Claims (19)

  1. a) 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성함];
    b) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성하며, 단, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 폴리아미노산인 경우, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 폴리리신도 폴리에틸렌이민도 아님];
    c) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합된 1 이상의 활성 입자(AP)
    를 포함하는 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자로서, 상기 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자는 pHm과 동일한 pH에서, 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합하여 얻어지는 것인 입자.
  2. a) 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합 체(PE1), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성함];
    b) 소수성 측기(GH)를 보유하는, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2), 바람직하게는 선형 α-폴리아미노산[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성함];
    c) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합된 1 이상의 활성 입자(AP)
    를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자로서, 상기 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자는 pHm과 동일한 pH에서 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합하여 얻어지는 입자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 및 제2 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2)가 폴리아미노산 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나이고, 이의 주쇄가 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 잔기로 형성되며, 이들 잔기 중 적어도 일부가 적어도 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 대해 1 이상의 소수성 기(GH)를 그래프팅함으로써 개질된 것인 입자.
  4. 제3항에 있어서, 상기 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2) 중 하나 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나는 하기 화학식 I에 상응하는 것인 입자:
    화학식 I
    Figure 112009074471781-PCT00015
    상기 화학식에서,
    * R1은 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬, 벤질, -R4-[GH]이거나, 또는 R1은 NH와 함께 말단 아미노산 잔기를 형성하고;
    * R2는 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 아실기, 피로글루타메이트 또는 -R4-[GH]이며;
    * R4는 직접 결합 또는 1∼4개의 아미노산 잔기를 베이스로 하는 "스페이서"이고;
    * A1 및 A2는 독립적으로 -CH2- 또는 -CH2-CH2-이고;
    * n/(n+m)은 몰 그래프팅율로 정의되며 그 값은 중합체가 pH 7 및 25℃에서 수중 용해되어 중합체 입자의 콜로이드 현탁액을 형성하기에 충분히 낮고;
    * n + m은 10∼1000, 바람직하게는 50∼300 범위이며;
    * GH는 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성 기를 나타내거나 또는
    (i) 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C1-C20, 더 바람직하게는 C2-C18, 알킬, 아실 또는 알케닐;
    (ii) 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 탄화수소기, 바람직하게는 산소 및/또는 황을 포함하는 것, 더 바람직하게는 하기 화학식의 것:
    Figure 112009074471781-PCT00016
    (상기 화학식에서,
    - R60 라디칼은 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C1-C20, 더 바람직하게는 C2-C18, 알킬, 아실 또는 알케닐 라디칼이고,
    - R61 및 R62 라디칼은 서로 동일하거나 상이하고 수소 또는 선형 또는 분지형, 바람직하게는 선형 C1-C20, 더 바람직하게는 C2-C18, 알킬, 아실 또는 알케닐 라디칼에 상응하며,
    - q = 1∼100임);
    (iii) 아릴, 아랄킬 또는 알킬아릴, 바람직하게는 아릴;
    (iv) 소수성 유도체, 바람직하게는 포스파티딜에탄올아미노 라디칼 또는 옥틸옥시, 도데실옥시, 테트라데실옥시, 헥사데실옥시, 옥타데실옥시, 9-옥타데세닐 옥시, 토코페릴옥시 또는 콜레스테릴옥시 라디칼에서 선택되는 라디칼
    로 구성되는 라디칼 군에서 선택된다.
  5. 제3항에 있어서, 상기 고분자 전해질 중합체(PE2) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나는 하기 화학식 II, III 및 IV 중 하나에 상응하는 것인 입자:
    화학식 II
    Figure 112009074471781-PCT00017
    화학식 III
    Figure 112009074471781-PCT00018
    화학식 IV
    Figure 112009074471781-PCT00019
    상기 화학식에서,
    * GH는 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성 기이고;
    * R30은 선형 C2-C6 알킬 기이며;
    * R50은 C2-C6 디아미노, 디알콕시 또는 알킬 기이고;
    * R4는 직접 결합 또는 1∼4개의 아미노산 잔기를 베이스로 하는 "스페이서"이고;
    * A1 및 A2는 독립적으로 -CH2- 또는 -CH2-CH2-이며;
    * n' + m' 또는 n"는 중합도로서 정의되며 10∼1000, 바람직하게는 50∼300의 범위이다.
  6. 제3항에 있어서, 상기 고분자 전해질 중합체(PE1, PE2) 중 하나 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 중 하나는 하기 화학식 V에 상응하는 것인 입자:
    화학식 V
    Figure 112009074471781-PCT00020
    상기 화학식에서,
    * E는 독립적으로
    - - NHR 기(여기서, R은 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬 또는 벤질 임),
    - 하기 화학식에 상응하는 말단 아미노산 잔기 또는 말단 아미노산 유도체:
    Figure 112009074471781-PCT00021
    (여기서, R7은 OH, OR9 또는 NHR10이고, R8, R9 및 R10은 독립적으로 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬 또는 벤질임)이고;
    * B는 직접 결합 또는 바람직하게는 라디칼 -O-, -NH-, -N(C1-C5 알킬)-, 1∼6개의 탄소 원자를 포함하는 아미노산(바람직하게는 천연 아미노산), 디올, 트리올, 디아민, 트리아민, 아미노알콜 또는 히드록시산의 잔기에서 선택되는 2가, 3가 또는 4가 결합기이며;
    * D는 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 아실기 또는 피로글루타메이트이고;
    * GH는 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성기이며;
    * R70은
    - -NH-(CH2)w-NH3 +(여기서, w는 2∼6, 바람직하게는 4임),
    - -NH-(CH2)4-NH-C(=NH)-NH3 +,
    - -O-(CH2)2-NH3 +,
    - -O-(CH2)2-N+(CH3)3,
    -
    Figure 112009074471781-PCT00022
    [여기서, -R11은 -H, -CO2H, 알킬 에스테르(바람직하게는 -COOMe 및 -COOEt), -CH2OH, -C(=O)-NH2, -C(=O)-NH-CH3 또는 -C(=O)-N(CH3)2임];
    - 하기 화학식의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체:
    Figure 112009074471781-PCT00023
    [여기서, X는 산소 또는 -NH-이고, -R12는 H, 선형 C2-C10 또는 분지형 C3-C10 알킬 또는 벤질이며, -R13은 -(CH2)4-NH3 +, -(CH2)3-NH-C(=NH)-NH3 +, -(CH2)3-NH3 +이고, R70 기의 짝음이온은 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드임]
    로 구성된 군에서 선택되는 라디칼이고;
    * R90은 히드록시에틸아미노-, 알킬렌 글리콜 잔기 또는 폴리옥시알킬렌 잔기이며;
    * p, q, r 및 s는 양의 정수이고;
    * (p)/(p+q+r+s)는 소수성 기(GH)의 몰 그래프팅율로서 정의되며, 2∼99 몰%, 바람직하게는 5∼50 몰% 범위인데, 단 각 공중합체쇄는 평균 3 이상의 소수성 그래프트를 가지며;
    * (q)/(p+q+r+s)는 양이온성 기의 몰 그래프팅율로서 정의되며, 1∼99 몰% 범위이고;
    * (p+q+r+s)는 10∼1000, 바람직하게는 30∼500 범위이며;
    * (r)/(p+q+r+s)는 0∼98 몰% 범위이고;
    * (s)/(p+q+r+s)는 0∼98 몰% 범위이다.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R4 또는 B 기는 직접 결합인 것인 입자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 기(GH)의 전부 또는 일부가
    * 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S) 및/또는 1 이상의 불포화를 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 알콕시,
    * 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 하나 이상의 고리상 탄소환을 가지며 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함하는 알콕시,
    * 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 C7-C30의 알콕시아릴 또는 아릴옥시알킬
    로 구성된 라디칼 군에서 독립적으로 선택되는 것인 입자.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 기(GH)는 각각 서로 독립적으로 하기 화학식의 1가 라디칼인 것인 입자:
    Figure 112009074471781-PCT00024
    상기 화학식에서,
    - R5는 메틸(알라닌), 이소프로필(발린), 이소부틸(류신), sec-부틸(이소류신) 또는 벤질(페닐알라닌)이고;
    - R6은 6∼30개의 탄소 원자를 포함하는 소수성 라디칼이며;
    - l은 0∼6의 범위이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 소수성 기(GH)의 소수성 라디칼 R6의 전부 또는 일부가
    * 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S) 및/또는 1 이상의 불포화를 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 알콕시,
    * 6∼30개의 탄소 원자를 포함하고 하나 이상의 고리상 탄소환을 가지며 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함하는 알콕시,
    * 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 C7-C30의 알콕시아릴 또는 아릴옥시알킬
    로 구성된 라디칼 군에서 독립적으로 선택되는 것인 입자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 두 중합체 PE1 또는 PE2 중 하나가 동시에
    - 15∼50 몰%의 글루타메이트 단량체;
    - 히드록시에틸아미노로 치환된 기와 같은 20∼55 몰%의 이온화 불가능한 단량체;
    - 반중화 pH가 8을 초과하는 양이온성 기를 보유하는 10∼40 몰%의 단량체;
    - 소수성 기로 치환된 3∼15 몰%의 이온화 불가능한 단량체
    를 포함하는 것인 입자.
  12. 제11항에 있어서, 두 중합체 PE1 또는 PE2 중 하나가 양이온성이고 동시에
    - 0∼5 몰%의 글루타메이트 단량체;
    - 히드록시에틸아미노로 치환된 기와 같은 50∼85 몰%의 이온화 불가능한 단량체;
    - 반중화 pH가 8을 초과하는 양이온성 기를 보유하는 10∼40 몰%의 단량체;
    - 소수성 기로 치환된 3∼15 몰%의 이온화 불가능한 단량체
    를 포함하는 것인 입자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 생리학적 pH에서 T 테스트로 측정된 크기가 1∼100 마이크론인 것인 입자.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생리학적 pH에서 벌크 밀도가 0.15∼1.1인 것인 입자.
  15. 1) pH 3∼8의 pHm 값에서, 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성할 수 있음];
    2) 단계 1에서 얻어진 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계[상기 활성 성분은 상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 함께 결합함];
    3) 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)를 제조하는 단계[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성하며, 단, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)가 폴리아미노산인 경우, 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 폴리리신도 폴리에틸렌이민도 아님];
    4) pHm과 동일한 pH에서, 단계 2)에서 얻어진 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를, 단계 3)에서 얻어진 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합시키는 단계
    를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자, 특히 제1항, 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항의 입자의 제조 방법.
  16. 1) pH 3∼8의 pHm 값에서, 소수성 측기(GH)를 보유하는 하전된 상태의 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)는 자발적으로 수중에서 pH 3∼8의 1 이상의 pHm 값에서 입자의 콜로이드 용액을 형성할 수 있음];
    2) 단계 1에서 얻어진 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)에 1 이상의 활성 성 분(AP)을 첨가하는 단계[상기 활성 성분은 상기 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 함께 결합함];
    3) 소수성 측기(GH)를 보유하는, 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)와 반대 극성의 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)를 제조하는 단계[상기 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)는 수중에서 적어도 상기 pH의 pHm 값에서 용액 또는 콜로이드 용액을 형성함];
    4) pHm과 동일한 pH에서, 단계 2)에서 얻어진 활성 성분(AP)과 회합된 입자의 콜로이드 용액 형태인 제1 고분자 전해질 중합체(PE1)를, 단계 3)에서 얻어진 용액 또는 콜로이드 용액 형태인 제2 고분자 전해질 중합체(PE2)와 혼합시키는 단계
    를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 입자, 특히 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항의 입자의 제조 방법.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 입자 또는 제15항 또는 제16항의 방법으로 얻어지는 입자의 수성 현탁액을 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 약학 제제.
  18. * 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 입자인 1 이상의 활성 성분(AP)을 포함하는 입자 또는 제15항 또는 제16항의 방법으로 얻어지는 입자를 베이스로 하거나, 또는
    * 제17항의 제제로부터 얻어지는
    건조 분말 형태를 포함하는, 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 고체 약학 제제.
  19. 실질적으로 제17항 또는 제18항의 1 이상의 제제를 사용하는 것으로 이루어지는 특히 비경구, 점막, 피하, 근내, 피내, 경피, 복강내 또는 뇌내 투여를 위한 또는 종양내 투여를 위한, 심지어 경구, 경비, 폐내, 질내 또는 안내 경로에 의한 투여를 위한 약제의 제조 방법.
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