KR20100016513A

KR20100016513A - 활성 성분의 조절 방출을 위한 자가 침전 약학 제제

Info

Publication number: KR20100016513A
Application number: KR1020097023698A
Authority: KR
Inventors: 프레데릭 셰꼬; 고네 세실 보네; 요우-핑 챵; 올리비에 브레이느; 르미 메이뤼
Original assignee: 플라멜 테크놀로지스
Priority date: 2007-05-03
Filing date: 2008-05-05
Publication date: 2010-02-12
Also published as: CA2685873A1; MX2009011814A; CN101674809A; WO2008135562A1; EP2155164A1; AU2008248603A1; FR2915683A1; BRPI0809288A2; IL201465A0; US20090011028A1; FR2915683B1; US8236353B2; JP2010526041A

Abstract

본 발명은 수일 또는 심지어 수주에 걸쳐 지속적으로 활성 성분(AP)을 방출하기 위한 신규한 약학 제제에 관한 것이다.

본 발명은, 제1 측면에서, 1 이상의 활성 성분(AP) 및 중합체(PO)의 콜로이드 입자를 베이스로 하는 수성 현탁액을 포함하며 이하의 4가지 조건을 만족시키는 액체 제제에 관한 것이다:

(a) 중합체(PO)는 글루탐산 잔기를 포함하는 폴리아미노산이고

(여기서,

- 일부 글루탐산 잔기는 각각 서로 동일하거나 또는 상이한 양이온성 측쇄기(CG)를 가지며,

- 다른 글루탐산 잔기는 각각 서로 동일하거나 또는 상이한 소수성 측쇄기(GH)를 가짐),

(b) 상기 제제의 pH의 pHf 값은 3.0∼6.5이며;

(c) 상기 pHf에서, 중합체(PO)는 자발적이고 비공유적으로 활성 성분(AP)과 회합하는 콜로이드 용액을 형성하고;

(d) 1 ml의 부피의 테스트 완충 용액(Tp)와 혼합하는 동안 상기 제제 중 1 ml가 침전된다.

본 발명은 또한 이러한 제제의 제조 방법 및 이러한 제제를 포함하는 약제의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

활성 성분의 조절 방출을 위한 자가 침전 약학 제제{SELF-PRECIPITATING PHARMACEUTICAL FORMULATIONS FOR THE MODIFIED RELEASE OF AN ACTIVE PRINCIPLE}

　본 발명은 활성 성분(들)(AP), 특히 단백질 및 펩티드 활성 성분(들)의 지속 방출을 위한 신규한 약학 제제에 관한 것이다. 본 출원은 또한 이들 약학 제제의 적용 또는 사용, 특히 치료적 적용 또는 사용에 관한 것이다. 이들 활성 약학 제제는 인간 치료제 및 수의 치료제 둘다에 관한 것이다.

본 문헌을 통해 사용되는 용어 AP는 1 이상의 활성 성분을 의미한다.

약학 AP, 특히 치료적 펩티드/단백질의 지속 방출 분야에서, 건강한 개체에서 관찰되는 값에 가까운 펩티드 또는 단백질 혈장 농도를 환자에서 가능한 최상으로 재생하는 것이 대개의 목적이다.

이러한 목적은 혈장에서 단백질 수명이 짧은 것과 상충되므로, 치료 단백질의 주입을 반복하게 된다. 따라서, 치료 단백질의 혈장 농도는 고농도 피크 및 매우 저농도 최소값을 특징으로 하는 프로필을 보인다. 건강한 개체에서 발견되는 기저 농도보다 훨씬 더 높은 농도 피크는 특정 시토카인과 같은 치료 단백질의 높은 독성 때문에 유의적인 유해 효과를 가진다. 또한, 농도 최소값은 치료 효과를 얻는 데 필요한 농도보다 낮아 환자의 치료 범위가 빈약하고 심각한 장기 부작용을 초래 한다.

따라서, 환자에서 치료에 이상적인 값에 가까운 치료 단백질의 혈장 농도를 재생하기 위하여, 경시적 혈장 농도 변화가 제한되도록 약학 제제가 지속적으로 치료 단백질을 방출할 수 있는 것이 중요하다.

또한, 바람직하게는 활성 제제는 당업자에게 이미 공지된 이하의 요건을 만족시켜야 한다:

1 - 혈장 농도가 치료 수준으로 유지되도록 활성 및 비변성 치료 단백질, 예컨대 인간 또는 합성 단백질의 지속 방출;

2 - 용이하게 주입될 수 있도록 주입시 충분히 낮은 점도;

3 - 우수한 독성 및 내성 프로필을 보이는 생체적합성 및 생분해성 형태.

이들 목적을 달성하려는 시도에서, 종래 기술에서 제공된 최상의 방법 중 하나는 치료 단백질이 로딩된 나노입자의 비교적 비점성 액체 현탁액으로 구성되는 치료 단백질(들)의 지속 방출 형태를 개발하는 것이었다. 이들 현탁액은 천연 치료 단백질의 용이한 투여를 가능하게 한다.

따라서, Flamel Technologies사는 치료 단백질을 소수성 기 및 친수성 기를 포함하는 코폴리아미노산 나노입자와 회합시키는 경로를 제공하였다.

특허 출원 US 2006/0099264호는 아스파르트산 잔기 및/또는 글루탐산 잔기를 포함하는 양친매성 폴리아미노산을 개시하며, 여기서, 적어도 이들 잔기의 일부는 1 이상의 α-토코페롤 잔기를 포함하는 그래프트, 예컨대 (합성 또는 천연 기원의 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트 또는 폴리아스파르테이트)를 함유한 다. 이들 "소수성 개질된" 호모폴리아미노산은 pH 7.4의 수성 현탁액에서 1 이상의 활성 단백질(인슐린)과 용이하게 회합할 수 있는 나노입자의 콜로이드 현탁액을 자발적으로 수중에 형성한다.

US 2006/0099264호에 개시된 현탁액으로 "벡터화된" 활성 단백질(들)(예컨대, 인슐린)의 생체내 방출 지속 시간은 연장되는 것이 이로울 것이다.

방출 지속 시간 증가는 부분적으로 PCT 출원 WO-A-05/051416호에 개시된 약학 형태를 사용하여 얻어졌다. 이 출원은 피하 주입 후 내생 알부민과 접촉시 환자에서 겔이 계내에서 형성되는 농도로 주입되는 소수성 개질된 폴리(나트륨 L-글루타메이트) 나노입자(0.001∼0.5 ㎛)의 콜로이드 현탁액을 개시한다. 단백질은 이후 1주일의 일반적인 기간에 걸쳐 서서히 방출된다. 그러나, 예컨대 인간 성장 호르몬에 대해서와 같이 투여될 치료 단백질의 농도가 비교적 높은 경우, 방출 지속 시간은 수 일로 제한된다.

이들 형태의 방출 지속 시간은 더 연장되는 것이 이로울 것이다.

피하 주입 후 AP의 생체내 방출 지속 시간을 연장하기 위하여 제안된 또다른 경로는 주입 온도에서는 액체이나 온도가 37℃로 증가될 때 겔을 형성하는 제제를 사용하는 것이다. PCT 출원 WO-A-99/18142호 및 WO-A-00/18821호는 특히 주입에 의하여 온혈 동물에게 투여될 수 있고 생리학적 온도가 겔화 온도보다 높으므로 생체내에서 겔화된 침적물을 형성하는 용해된 형태 또는 콜로이드 형태로 중합체를 포함하는 AP의 수용액에 관한 것이다. 이렇게 형성된 겔은 지속 방식으로 AP를 방출한다. 이들 특정 생분해성 중합체는 ABA 또는 BAB[여기서, A = 폴리락틱-코-글리콜 릭(PLAGA) 또는 폴리락틱(PLA)이고, B = 폴리에틸렌 글리콜임) 삼블록이다. 이들 삼블록 중합체의 액체->겔 전환 온도는 예컨대 36, 34, 30 및 26℃이다. 유사한 중합체(A)가 US-B-6 143 314호에 개시되어 있으며, 생체 내에서 이들 ABA 또는 BAB 삼블록 중합체의 가수분해 결과 국소적으로 잘 허용될 수 없는 산이 얻어진다.

본 출원인에 의한 특허 출원 PCT/FR2006/002443호는 히스티딘 유도체 및 소수성 기로 개질된 폴리글루타메이트 및 이의 적용을 개시한다.

특히, 이 출원은 이들 중합체가 산성 pH에서 가용성이고 중성 pH에서 침전한다고 개시한다. 이것은 치료 단백질과 같은 활성 성분의 방출을 위한 제제의 제조를 가능하게 한다.

이러한 중합체를 사용하는 지속 방출용 자가 침전 수성 액체 제제의 개발에 있어서, 예기치 않게도, 상기 까다로운 요건을 만족시키는 제제가 오직 어떤 특정 조건 하에서 얻어질 수 있다는 것이 발견되었다.

예컨대, 45 mg/ml의 중합체를 포함하고 pH 5.5에서 제조된 PCT/FR2006/002443호 출원에 개시된 중합체 pGluHisOEt α-토코페롤은 기대하는 결과를 이끌지 못한다.

본 출원인은 오랫동안 연구하여 i) 자가 침전 시스템의 요건을 만족시키는 양이온성 중합체(PO)를 포함하는 제제, 및 ii) 이러한 제제를 선택하기 위한 특정 조건을 밝혀내었다. 이들 중합체(PO)는 출원 PCT/FR2006/002443호에 개시된 중합체 또는 양이온성 기를 포함하고 소수성 기를 갖는 신규한 부류의 중합체로부터 선택될 수 있다.

발명의 간단한 설명

본 발명의 목적 중 하나는 활성 성분(AP)이 로딩되고 수일 또는 심지어 수주의 지속 기간에 걸쳐 활성 성분(AP)을 방출하며 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하는 신규한 제제를 제공하는 것이다

본 발명의 또다른 목적은 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하며 활성 성분(AP)이 로딩되는 신규한 액체 제제를 제공하는 것으로, 여기서 상기 제제의 조성 및 농도는 활성 성분의 방출 지속 시간이 피하 투여를 위해 최적화될 수 있게 한다.

본 발명의 또다른 목적은 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하며 활성 성분(AP)이 로딩된 신규한 액체 제제를 제공하는 것으로, 여기서 제제 조성은 가능한 최저 농도의 중합체를 사용하여 수일 또는 심지어 수주에 걸쳐 활성 성분(AP)을 방출시킬 수 있는 조성이다.

본 발명의 또다른 목적은 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하며 활성 성분(AP)이 로딩된 신규한 액체 제제를 제공하는 것으로, 여기서 제제의 조성 및 농도는 작은 크기의 바늘을 통한 용이한 주입을 가능하게 한다.

본 발명의 또다른 목적은 수용액에서 안정한 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하는 신규한 액체 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 동결 건조된 형태로 저장될 수 있는 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하는 신규한 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 동결 건조 후 용이하게 재분산될 수 있는 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하는 신규한 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하며 활성 성분(AP)이 로딩되고 동결 건조된 형태에서 안정한 신규한 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하며 생물학적 활성에 영향을 주지 않고 단백질을 방출하는 신규한 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 고체 약학 제제를, 특히 예컨대 흡입 및 폐내 투여를 위한 무수 분말 형태로 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 제제(특히 상기 개시된 제제 중 하나)의 신규한 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 이들 약학 제제를 사용하는 약제의 신규한 제조 방법을 제공하는 것이다.

오랫동안 광범위하게 연구한 후, 본 출원인은 소수성 측기를 갖는 양이온성 아미노산 유도체에 의하여 개질된 폴리글루타메이트 중합체를 베이스로 하는 제제가 치료 단백질 및 펩티드의 지속 방출을 최적화함을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 우선 예컨대 비경구 경로를 통하여 용이하게 주입될 수 있고 1 이상의 활성 성분(AP) 및 중합체(PO) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 콜로이드 입자를 베이스로 하는 수성 현탁액을 포함하며 이하의 4가지 조건을 만족시키는 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 수성 약학 제제에 관한 것이다:

(여기서,

- 다른 글루탐산 잔기는 각각 서로 동일하거나 또는 상이한 소수성 측쇄기(GH)를 갖고,

- 임의로, 다른 글루탐산 잔기는 각각 서로 동일하거나 또는 상이한 중성 측쇄기(NG)를 가지며,

- 임의로, 또다른 글루탐산 잔기는 개질되지 않음),

(b) 상기 제제의 pH 값(pHf)은 3.0∼6.5이며;

(d) 1 ml 부피의 테스트 완충 용액(Tp)와 혼합하는 동안 상기 제제 1 ml가 침전된다.

바람직하게는, 이러한 제제의 침전 계수(PF)는 200 초과, 바람직하게는 400 초과, 바람직하게는 800 초과, 더 바람직하게는 1500 초과이다.

본 발명은 또한 예컨대 비경구 경로를 통하여 용이하게 주입될 수 있고 1 이상의 활성 성분(AP) 및 중합체(PO) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 콜로이드 입자를 베이스로 하는 수성 현탁액을 포함하며 이하의 4가지 조건을 만족시키는 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 수성 액체 약학 제제에 관한 것이다:

(여기서,

- 임의로, 또다른 글루탐산 잔기는 개질되지 않음),

(b) 상기 제제의 pH 값(pHf)은 3.0∼6.5이며;

(d) 상기 제제의 침전 계수(PF)는 200 초과, 바람직하게는 400 초과, 바람직하게는 800 초과, 더 바람직하게는 1500 초과이다.

또한, 바람직하게는, 이 제제의 보유 계수(RQ)는 5 초과, 바람직하게는 10 초과, 바람직하게는 15 초과, 더 바람직하게는 20 초과이다.

주어진 중합체 농도에서, 활성 성분(AP)의 방출 카이네틱스는 중합체의 조성, 즉 양이온성 기, 소수성 사이드 그래프트 및 임의로 중성기 및 글루타메이트 기의 각 몰분율에 크게 의존하는 것으로 나타났다.

본 발명은 또한 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 제제(특히 상기 개시한 제제)의 제조 방법에 관한 것으로,

1) 3∼6.5의 pH 값에서 글루탐산 잔기를 포함하는 폴리아미노산 중합체(PO)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계

(여기서,

- 임의로, 또다른 글루탐산 잔기는 개질되지 않고,

양이온성 기(CG), 소수성 기(GH), 임의로 중성 기(NG) 및 임의로 글루타메이트의 각 몰분율은 1 ml 부피의 테스트 완충 용액(Tp)와 혼합하는 동안 상기 제제 1 ml가 침전되도록 하는 몰분율임); 및

2) 상기 단계 1에서 얻은 중합체(PO)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계(여기서, 상기 활성 성분은 상기 중합체의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합하고 상기 활성 성분의 첨가 단계는 제제의 최종 치료적 사용 직전(예컨대, 30분전)에 실시할 수 있음)

포함한다.

본 발명은 또한 특히 비경구, 점막, 피하, 근내, 피내, 경피, 복강내 또는 뇌내 투여를 위한 또는 종양내 투여를 위한 또는 심지어 경구, 경비, 폐내, 질내 또는 안내 경로에 의한 투여를 위한 약제의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 실질적으로 본원에 개시된 바와 같은 1 이상의 제제를 사용하는 것으로 이루어진다.

발명의 상세한 설명

정의

본 명세서에서, 용어 "양이온성 기"는 1 이상의 아미노기 및 1 이상의 4급 암모늄을 포함하는 글루탐산 잔기에 공유 결합된 기를 의미하는 것으로 이해된다. 아미노 작용기의 경우, 상기 기는 주로 그 pKa 미만의 임의의 pH에서 이온화되고, 4급 암모늄의 경우, 상기 기는 임의의 pH에서 이온화될 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 알킬 라디칼은 1∼10개의 탄소 원자를 가진다.

본 명세서에서, 용어 "중성 기"는 3 내지 10의 임의의 pH에서 전하를 갖지 않는 기를 의미하는 것으로 이해되며 예컨대 글루탐산 잔기, 에탄올아민, 알킬렌 글리콜 또는 폴리알킬렌 글리콜의 카르복실기에서의 축합에 의하여 얻어지는 기를 포함한다.

용어 본 발명에 따른 중합체의 "약학적으로 허용 가능한 염"은 중합체의 이온화된 작용기와 회합되는 짝이온을 갖는 모든 중합체를 포함하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서, 용어 "용액"은 개개의 사슬 형태의 중합체 및 용매의 균질 용액을 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서, 용어 "콜로이드 용액"은 T' 테스트로 측정한 평균 직경이 0.5 ㎛ 이하인 입자의 현탁액을 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서, 용어 (예컨대 비경구 경로에 의하여) "용이하게 주입 가능한 제제"는 20℃에서의 동적 점도가 1000 mPa.s 이하인 제제를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 제제의 동적 점도는 1000 s^-1의 전단 구배에 대하여 20℃에서 측정하여 바람직하게는 500 mPa.s. 이하, 바람직하게는 2∼200 mPa.s, 예컨대 1.0∼100 mPa.s, 심지어 1.0∼50 mPa.s이다.

본 명세서에서, 용어 "소분자"는 특히 비단백질 분자에서 분자량이 1 kDa 미만인 분자를 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서, 용어 "pHf"는 본 발명에 따른 제제의 pH를 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서, 용어 "pH*"는 P 테스트를 이용하여 측정된 중합체(PO)를 베이스로 하는 제제의 침전 pH를 의미하는 것으로 이해된다.

500 nm에서 흡수율을 측정함으로써 침전 pH*에 대한 pH를 측정하기 위한 P 테스트:

아세트산 또는 1 M 수산화나트륨 용액을 첨가함으로써, 0.15 M의 염화나트륨을 포함하는 1 또는 2 mg/ml의 중합체(PO) 농축 용액의 pH를 4로 하고, 24시간 동안 교반하면서 정치한다. 이후 이 용액을 0.8∼0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한다. 이후 이 용액을 0.1 M 수산화나트륨 용액으로 적정하고, 500 nm에서 중합체(PO) 용액의 흡수율 변화를 Perkin-Elmer Lambda 35 UV 분광계 유형의 장치를 사용하여 상기 용액의 pH의 함수로서 기록한다. 침전 pH(pH*)는 흡수율이 1을 초과하는 값에 이르기까지 급격히 증가하는 pH 값에 상응한다.

본 개시에서, 용어 "테스트 완충 용액(Tp)"은 30 mg/g의 소 알부민 분획 V(Aldrich), 0.01 M의 포스페이트 완충액, 0.0027 M의 염화칼륨, 0.137 M의 염화나트륨(Aldrich사의 PBS) 및 0.015 M의 아세트산암모늄(Aldrich)을 포함하는 수성 매질을 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에서, 용어 "Δn"은 1 mg의 중합체(PO)를 포함하는 0.5 ml의 콜로이드 용액을 pHf에서 pH*로 변화시키는 데 필요한 수산화나트륨의 몰수를 의미하는 것으로 이해되며, 여기서 상기 수는 종래의 산/염기 적정법 TM에 의하여 얻어진다:

0.15 M의 염화나트륨을 포함하는 2 mg/ml의 농축 고분자 전해질 용액의 pH를 아세트산 또는 1M 수산화나트륨 용액을 첨가하여 4로 한다. 이후 이 용액을 0.05 M 수산화나트륨 용액으로 적정하고 pH 변화를 첨가되는 수산화나트륨의 부피의 함수로서 기록한다. Δn의 측정은 단순히 pH를 pHf로부터 pH*로 변화시키는 데 필요한 수산화나트륨의 부피를 판독함으로써 실시한다.

본 명세서에서, 생리학적 pH는 예컨대 7.2±0.4로 정의된다.

본 명세서에서, 용어 "고분자 전해질"은 수중에서 이온화할 수 있어 중합체 상에 전하를 발생시킬 수 있는 기를 갖는 중합체를 의미하는 것으로 이해된다.

보유 계수(RQ)의 측정을 위한 Q 테스트:

투여 준비가 된 본 발명에 따른 제제의 부피 V를 25℃에서 200 ㎕의 래트 혈청 풀에 첨가한다. 나노입자의 침전 후, 상청액 중의 유리 단백질 농도를 ELISA 테스트로 측정한다.

부피 V의 값의 증가에 대하여 동일한 테스트를 반복함으로써, 상청액 중의 유리 단백질 몰분율이 10%를 초과하는 것으로 발견되는 제제 부피의 V* 값을 측정할 수 있다.

보유 계수(RQ)는 200 ㎕의 래트 혈청에 대한 V* 부피의 비로 주어진다.

예컨대, V* = 1 ml에 대하여, RQ = 5이다.

중합체(PO) 콜로이드 용액의 입자 크기를 평가하기 위하여, 사용하기 바람직한 테스트는 T' 테스트이다. T' 테스트의 결과는 평균 수력 직경이다.

준탄성 광산란에 의하여 나노입자의 크기를 측정하기 위한 T' 테스트:

본 발명에 따른 중합체 입자의 평균 수력 직경을 이하에 정의된 Md 절차에 따라 측정한다:

중합체 용액을 0.15 M NaCl 중 1 또는 2 mg/ml의 농도로 제조하고 24시간 동안 교반한다. 이후 이들 용액을 0.8∼0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 다음 632.8 nm의 파장을 갖는 수직 편광 He-Ne 레이저 빔으로 작동하는 맬버른 콤팩트 고니오메터 시스템(Malvern Compact Goniometer System) 유형의 장치를 사용하여 동적 광산란으로 분석한다. 중합체 나노입자의 수력 직경은 문헌["Surfactant Science Series", 22권, Surfactant Solutions, edited by R.Zana, Chap.3, M.Dekker, 1984]에 개시된 바와 같이 누적법으로 전기장의 자동 보정 함수로부터 계산한다.

본 명세서에서, 용어 "나노입자"는 T' 테스트에 따라 2∼500 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 개시한다.

활성 성분의 방출을 측정하기 위한 L 테스트: 　　　

30 mg/g의 소 알부민 분획 V(Aldrich), 0.01 M의 포스페이트 완충액, 0.0027 M의 염화칼륨, 0.137 M의 염화나트륨(Aldrich사의 PBS) 및 0.015 M의 아세트산암모늄(Aldrich)을 포함하는 2.83 ml/h의 유속의 수성 매질로 세정한 측부 길이가 1.5 cm인 폴리우레탄/폴리에테르(PU-PE) 발포체 큐브에 50 ㎕의 제제를 주입한다. 샘플을 연속상으로부터 규칙적으로 배출시키고 이들 샘플의 단백질 함량을 ELISA로 분석한다.

이후 단백질 흐름은 측정된 농도를 부과된 유속으로 나눔으로써 그리고 방출된 단백질의 총중량은 회수된 각 샘플에 대하여 측정한 값을 더함으로써 플롯할 수 있다.

본 발명의 의미 내에서, 용어 "단백질"은 단백질 또는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 불문하고 펩티드를 의미한다. 이러한 단백질 또는 이러한 펩티드는 예컨대 하나 이상의 폴리옥시에틸렌기를 그래프팅함으로써 개질되거나 개질되지 않을 수 있다.

본 발명의 의미 내에서, "가진다"는 표현은 보유되는 기가 측쇄기(또는 현수기)임을 의미한다. 즉 상기 기가 글루탐산 잔기에 대하여 측쇄이고 이것을 갖는 글루탐산 잔기의 γ 위치에서 카르보닐 작용기의 치환기임을 의미한다.

본 발명의 폴리글루타메이트는 또한 양이온성 기를 가진다. 이들 기는 바람직하게는 아미드 또는 에스테르 결합에 의하여 글루탐산기에 그래프팅 또는 결합된다.

바람직하게는, 중합체(PO)는 전체 중합도(DP)가 50∼300, 바람직하게는 100∼250, 더 바람직하게는 150∼250인 pGlu_(x)GH_(y)CG_(z)NG_(1-x-y-z)의 구조를 보인다.

본 발명의 대안적인 형태에 따르면, 양이온성 기(CG)는 반중화(half-neutralization) pH가 7.0 미만인 약염기에서 선택될 수 있다.

이러한 양이온성 기(CG)는 예컨대 히스티딘 에스테르, 바람직하게는 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르, 히스티디놀, 히스타민, 히스티딘아미드, 히스티딘아미드의 N-모노메틸 유도체 및 히스티딘아미드의 N,N'-디메틸 유도체로 구성된 군에서 선택되는 히스티딘 유도체로부터 얻어진다.

이 경우, x, y 및 z의 값은 x가 0∼45%이고, y가 2∼30%이며, z가 40∼98%이고, 1-x-y-z가 0∼50%이도록 하는 값일 수 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 0∼45%이고, y가 2∼30%이며, z가 40∼60%이고, 1-x-y-z가 0∼58%이도록 하는 값일 수도 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 0∼45%이고, y가 15∼30%이며, z가 40∼60%이고, 1-x-y-z가 0∼45%이도록 하는 값일 수도 있다.

중합체(PO)가 중성 기(NG)를 포함하지 않는 경우, x, y 및 z 값은 x가 0∼45%, y가 2∼30%, z가 40∼98%이도록 하는 값일 수 있다.

본 발명의 또다른 대안적 형태에 따르면, 양이온성 기(CG)는 반중화 pH가 8.0을 초과하는 1 이상의 4급 암모늄 또는 1 이상의 강염기를 포함하는 것들에서 선택될 수 있다.

이러한 양이온성 기(CG)는 이하의 전구체 화합물로부터 얻어질 수 있다:

- 2∼6개의 탄소를 포함하는 선형 디아민, 바람직하게는 푸트레신,

- 아그마틴,

- 산소에 의하여 결합된 에탄올아민,

- 산소에 의하여 결합된 콜린,

- 아미노산의 에스테르 또는 아미드 유도체(이의 측쇄는 중성 pH에서 양으로 하전됨, 즉 리신, 아르기닌 또는 오르니틴이 α 위치에서 아민 작용기에 의하여 결합됨).

이 경우, x, y 및 z 값은

- x는 10∼55%이고,

- y는 2∼30%이며,

- z는 10% 이상이고 (x-10)% 내지 (x+15)%이도록 하는 값일 수 있으며,

- 중성기의 수는 100%에 이르도록 추가의 퍼센트에 상응하고 임의로 0일 수 있다.

또한, x, y 및 z 값은

- x는 20∼55%이고,

- y는 2∼7.5%이며,

- z는 20% 이상이고 (x-10)% 내지 (x+15)%이도록 하는 값일 수 있으며,

또한, x가 10∼55%이고, y가 2∼30%이며, z가 10∼55%이고, 1-x-y-z가 0∼60%이도록 x, y 및 z의 값을 선택할 수도 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 10∼20%이고, y가 2∼30%이며, z가 10∼30%이고, 1-x-y-z가 20∼78%이도록 하는 값일 수도 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 10∼20%이고, y가 15∼30%이며, z가 10∼30%이고, 1-x-y-z가 20∼65%이도록 하는 값일 수도 있다.

중합체(PO)가 중성 기(NG)를 포함하지 않는 경우, x, y 및 z 값은 x가 10∼55%, y가 2∼30%, z가 40∼60%이도록 하는 값일 수 있다.

본 발명에 따른 폴리아미노산은 예컨대 α-L-글루타메이트 또는 α-L-글루탐산 단독중합체인 것이 유리하다.

본 발명에서 글루타메이트 잔기를 작용기화하는 데 사용될 수 있는 양이온성 기는 서로 동일하거나 또는 상이하며

* 히스티딘 에스테르, 바람직하게는 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르, 히스티디놀, 히스타민, 히스티딘아미드, 히스티딘아미드의 N-모노메틸 유도체 및 히스티딘아미드의 N,N'-디메틸 유도체로 구성된 군에서 선택되는 히스티딘 유도체

에 상응하거나 또는

* 이하의 화학식을 가진다:

상기 화학식에서,

X = O 또는 NH,

Y = 독립적으로 H 또는 CH₃,

L = 작용성 카르복실기 또는 이의 유도체로 임의 치환된 선형 (C₂-C₆) 알킬렌이다.

따라서, 본 발명에 사용될 수 있는 양이온성 기는 이하의 화학식 중 하나를 가질 수 있다:

- -NH-(CH₂)_w-NH₃ ⁺, Z^-(여기서, w는 2∼6, 바람직하게는 4임),

- -NH-(CH₂)₄-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺, Z^-,

- -O-(CH₂)₂-NH₃ ⁺, Z^-,

- -O-(CH₂)₂-N⁺(CH₃)₃, Z^-, 및

- 하기 화학식의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체:

[상기 화학식에서,

- R¹은 알콕시, 바람직하게는 -OMe 또는 -OEt이거나, 또는 -R¹은 -NH₂, 알킬아미노, 바람직하게는 -NH-CH₃ 또는 -N(CH₃)₂이고;

- R¹³은 -(CH₂)₄-NH₃ ⁺, Z^-, -(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺, Z^-, -(CH₂)₃-NH₃ ⁺, Z^-이며;

여기서, Z^-는 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트, 바람직하게는 클로라이드임].

예컨대, 상기 양이온성 기는 하기 화학식을 가질 수 있다:

상기 화학식에서, -R₁은 알콕시 또는 알킬아미노 기, 바람직하게는 -OMe, -OEt, -NH₂, -NHCH₃ 또는 -N(CH₃)₂이고, -R₂는 수소 또는 -CH₂OH 또는 -C(=O)-R₁이다.

바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 폴리아미노산은 중합체 사슬당 평균 3 이상의 소수성 기(GH)를 포함한다.

적어도 하나의 소수성 기(GH)가 소수성 기(GH)를 폴리글루타메이트쇄(예컨대, 폴리글루타메이트 골격 주쇄)에 연결할 수 있는 1 이상의 이격 연결기(또는 잔기)(스페이서)를 포함하는 소수성 그래프트에 포함되는 것이 유리하다. 이 연결기는 예컨대 1 이상의 직접 공유 결합 및/또는 1 이상의 아미드 결합 및/또는 1 이상의 에스테르 결합을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 연결기는 특히 폴리글루타메이트, 아미노알콜 유도체, 폴리아민(예컨대, 디아민) 유도체, 폴리올(예컨대, 디올) 유도체 및 히드록시산 유도체의 구성성분 공단량체 잔기 이외의 "아미노산" 잔기로 구성된 군에 속하는 유형의 것일 수 있다.

GH를 폴리글루타메이트쇄에 그래프팅하는 것은 폴리글루타메이트쇄에 결합될 수 있는 GH 전구체의 사용을 수반할 수 있다.

GH의 전구체는 실제로 비제한적으로 알콜 및 아민으로 구성된 군에서 선택되며, 이들은 당업자에 의하여 용이하게 작용기화된다.

바람직한 실시양태에 따르면, 소수성 그래프트의 소수성 기(GH)는 8∼30개의 탄소 원자를 포함한다.

이들 소수성 기(GH)는

* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 C₈-C₃₀ 알킬,

* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 C₈-C₃₀ 알킬아릴 또는 아릴알킬, 및

* 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 C₈-C₃₀ (다)환식 화합물

로 구성되는 군에서 주의깊게 그리고 유리하게 선택된다.

GH와 함께 소수성 그래프트를 형성하는 연결기는 2가, 3가 또는 4가 (심지어 5가 이상) 연결기일 수 있다. 2가 연결기의 경우, 소수성 그래프트는 단일의 GH기를 포함하며, 한편 3가 연결기는 소수성 그래프트에 2자리성을 부여한다. 즉 상기 그래프트는 2개의 GH "아암"을 가진다. 3가 연결기의 예에는 "아미노산" 잔기, 예컨대 "글루탐산" 또는 폴리올 잔기, 예컨대 글리세롤이 포함된다. 따라서, 2자리 GH를 포함하는 소수성 그래프트의 유리하지만 비제한적인 두 예는 디알킬글리세롤및 디알킬 글루타메이트이다.

소수성 기(GH)는 예컨대 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알콜, 토코페롤 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 기에서 유도될 수 있다.

상기 정의된 바와 같이, 중성 기(NG)는 히드록시에틸아미노 라디칼, 히드록시알킬옥시 라디칼 또는 폴리옥시알킬렌으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

또다른 대안적 형태에 따르면, 본 발명에 사용되는 폴리글루타메이트는 또한 글루타메이트 잔기에 결합된 폴리알킬렌(바람직하게는 폴리에틸렌) 글리콜 유형의 그래프트를 1 이상 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리글루타메이트의 주쇄는 α-L-글루타메이트 및/또는 α-L-글루탐산 잔기를 포함한다.

더 바람직하게는, 본 발명에 사용되는 폴리글루타메이트는 하기 화학식 I 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

상기 화학식에서,

* A는 독립적으로

- NHR 기(여기서, R은 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 알킬 또는 벤질임),

- 하기 화학식의 말단 아미노산 잔기 또는 말단 아미노산 유도체:

(여기서, R⁷은 OH, OR⁹ 또는 NHR¹⁰이고, R⁸, R⁹ 및 R¹⁰은 독립적으로 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 알킬기 또는 벤질임)이고;

* B는 직접 결합 또는 바람직하게는 -O-, -NH-, -N(C₁-C₅ 알킬)-, 1∼6개의 탄소 원자를 포함하는 아미노산(바람직하게는 천연 아미노산), 디올, 트리올, 디아민, 트리아민, 아미노알콜 또는 히드록시산의 아미노산 잔기의 군에서 선택되는 2가, 3가 또는 4가 결합기이며;

* D는 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 아실기 또는 피로글루타메이트이고;

* 소수성 기(GH)는 각각 서로 독립적으로

ㆍ 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 C₈-C₃₀ 알킬, 또는

ㆍ 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 C₈-C₃₀ 알킬아릴 또는 아릴알킬, 또는

ㆍ 임의로 1 이상의 불포화 및/또는 1 이상의 헤테로원자(바람직하게는 O 및/또는 N 및/또는 S)를 포함할 수 있는 C₈-C₃₀ (다)환식 화합물

에서 선택되는 기이며;

바람직하게는 소수성 기(GH) 중 1 이상은 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알콜, 토코페롤 및 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 전구체로부터 그래프팅에 의하여 얻어지고, B는 직접 결합이며;

* R⁷⁰은

하기 화학식

- -NH-(CH₂)_w-NH₃ ⁺(여기서, w는 2∼6, 바람직하게는 4임),

- -NH-(CH₂)₄-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺,

- -O-(CH₂)₂-NH₃ ⁺,

- -O-(CH₂)₂-N⁺(CH₃)₃,

- 하기 화학식의 라디칼:

[여기서, -R¹¹은 -H, -CO₂H, 알킬 에스테르(바람직하게는 -COOMe 및 -COOEt), -C(=O)-NH₂, -C(=O)-NH-CH₃ 또는 -C(=O)-N(CH₃)₂임];

- 하기 화학식의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체:

[여기서, X는 -O- 또는 -NH-이고, R¹²는 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 알킬 또는 벤질이며, -R¹³은 -(CH₂)₄-NH₃ ⁺, -(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺, -(CH₂)₃-NH₃ ⁺이고, 여기서 짝음이온 R⁷⁰은 특히 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트에서 선택되는 적절한 기, 바람직하게는 클로라이드임]

의 군에서 선택되는 기이고;

* R₉₀은 히드록시에틸아미노-, 히드록시알킬옥시- 또는 폴리옥시알킬렌이며;

* p, q, r 및 s는 양의 정수이고;

* (p)/(p+q+r+s)는 소수성 기(GH)의 몰 그래프팅율로서 정의되며, 2∼30 몰% 범위인데, 단 각 공중합체쇄는 평균 3 이상의 소수성 그래프트를 가지며;

* (q)/(p+q+r+s)는 양이온성 기의 몰 그래프팅율로서 정의되며, 10∼98 몰% 범위이고;

* (p+q+r+s)는 50∼300, 바람직하게는 100∼250으로 달라지며;

* (r)/(p+q+r+s)는 0∼78 몰% 범위이고;

* (s)/(p+q+r+s)는 0∼55 몰% 범위이다.

히스티딘에서 유도되는 화학식 I의 폴리아미노산의 제조 및 합성에 대한 추가의 상세한 사항에 대해서는, 특허 출원 FR 05 53302호를 참조하라.

히스티딘에서 유도되는 것 이외의 화학식 I의 폴리아미노산의 제조 및 합성에 대한 추가의 상세한 사항에 대해서는, 프랑스 특허 출원 FR 07 03185호를 참조하라.

바람직하게는, 소수성 기(GH) 및 양이온성 기는 측쇄(또는 현수)기로서 무작위로 위치된다.

일반적으로, 상기 개시된 화학식 I은 블록 공중합체만을 나타내는 것으로 해석되어서는 안되며 랜덤 공중합체 또는 멀티블록 공중합체도 나타내는 것으로 해석 되어야 한다.

바람직하게는, 특히 활성 성분(AP)이 치료 단백질인 경우, 본 발명에 따른 제제에서 중합체(PO)의 농도는 4∼50 mg/ml일 수 있다. 이 농도 범위 내에서, 상기 제제는 작은 직경의 바늘, 예컨대 게이지 27 및 심지어 29의 바늘로 용이하게 주입될 수 있다. 실시예 2, 3 및 4는 이러한 제제를 상세히 개시한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 제제에서 중합체(PO)의 농도는 5∼30 mg/ml, 더 바람직하게는 바람직하게는 5∼15 mg/ml일 수 있다.

활성 성분(AP)의 농도 대 중합체(PO)의 농도의 비(R)는 0.0001∼1.5일 수 있는 것이 유리하다. 이 비(R)는 또한 0.01∼1.2일 수 있다.

대안적인 형태에 따르면, 본 발명에 따른 제제는 양이온성 기(CG)의 몰농도에 대하여 0.05∼2 몰당량의 비율로 Zn⁺⁺ 2가 양이온을 포함할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 제제는 양이온성 기(CG)의 몰농도에 대하여 0.25∼0.75 몰당량의 비율로, 더 특별히 양이온성 기(CG)가 히스티딘 에스테르, 바람직하게는 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르, 히스티디놀, 히스타민, 히스티딘아미드, 히스티딘아미드의 N-모노메틸 유도체 및 히스티딘아미드의 N,N'-디메틸 유도체로 구성된 군에서 선택된 히스티딘 유도체로부터 얻어지는 경우, 바람직하게는 0.5 당량으로 Zn⁺⁺ 2가 양이온을 포함할 수 있다.

또다른 대안적 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 제제는 추가된 2가 양이온을 포함하지 않는다.

본 발명에 사용되는 중합체의 몰질량은 2,000∼200,000 g/mol, 바람직하게는 5,000∼100,000 g/mol이다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에 따르면, 양이온성 기(CG)가 약염기에서 선택되는 경우, 이의 반중화 pH는 7.0 미만이고, 본 발명에 사용되는 중합체(PO)는 pGlu(x)GH(y)CG(z)NG(1-x-y-z)(여기서, x는 0∼20%, y는 2∼30%, z는 60∼95%, 1-x-y-z는 0∼15%) 구조를 나타낸다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 0∼20%이고, y가 2∼10%이며, z가 75∼95%이고, 1-x-y-z가 0∼15%이도록 하는 값일 수도 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 0∼20%이고, y가 15∼25%이며, z가 60∼80%이고, 1-x-y-z가 0∼15%이도록 하는 값일 수도 있다.

중합체(PO)가 중성 기(NG)를 포함하지 않는 경우, x, y 및 z 값은 x가 0∼20%, y가 2∼30%, z가 60∼95%이도록 하는 값일 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에 따르면, 양이온성 기(CG)가 4급 암모늄 또는 1 이상의 강염기를 포함하는 군에서 선택되는 경우, 이의 반중화 pH는 8.0을 초과하고, x, y 및 z의 값은 x가 15∼50%이고, y가 2∼30%이며, z가 10∼50%이고, 1-x-y-z가 10∼55%이도록 하는 값일 수 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 15∼30%이고, y가 2∼30%이며, z가 15∼25%이고, 1-x-y-z가 40∼55%이도록 하는 값일 수도 있다.

또한, x, y 및 z의 값은 x가 25∼50%이고, y가 2∼30%이며, z가 25∼50%이고, 1-x-y-z가 10∼30%이도록 하는 값일 수도 있다.

과량의 양이온 전하 때문에, 본 발명에 사용된 중합체(PO)는 제제의 pHf 값에서 양이온성이고 가용성이다. 이 전하는 중성 pH에서 부분적으로 또는 완전히 중화되어 중합체가 침전된다. 이론의 제한을 받는 것은 아니나, pH 증가에 의하여 유도되는 이러한 침전 현상은 소수성 측기의 존재 및 제제의 pH 및 생리학적 pH 사이에서 중합체의 전체 전하가 감소된 것에 기인한다고 추정될 수 있다.

개질된 폴리글루타메이트의 카르복실 작용 잔기는 pH 및 조성에 따라 중성이거나(COOH형) 또는 이온화된다(COO^- 음이온)는 것을 이해하여야 한다. 따라서, i) 글루타메이트 잔기 또는 글루탐산 잔기 또는 ii) 폴리글루탐산 또는 폴리글루타메이트의 양 용어는 서로 교환 가능하게 사용될 수 있다.

유사하게, 아미노기는 주로 이것의 pKa 미만의 임의의 pH에서 이온화될 것이며 4급 암모늄은 임의의 pH에서 이온화될 것이다.

수용액에서, 짝양이온은 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘과 같은 금속 양이온 또는 트리에탄올아민, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 또는 폴리에틸렌이민과 같은 폴리아민과 같은 유기 양이온일 수 있다. 이것이 2가일 경우, 짝양이온은 2개의 닫힌 1가 음이온성 기를 염화할 수 있다.

양이온성 기의 짝음이온은 바람직하게는 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트로 구성된 군에서 선택된다.

이것이 2가인 경우, 짝음이온은 2개의 닫힌 1가 양이온성 기를 염화할 수 있다.

본 명세서에서, 본 발명에 따른 중합체의 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 용어는 중합체의 이온화된 작용기와 회합되는 짝이온을 갖는 모든 중합체를 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명에서 사용하기 적당한 폴리아미노산은 예컨대 당업자에게 공지된 방법으로 얻어진다. 무엇보다도, α형 폴리아미노산을 얻기 위하여 가장 널리 사용되는 기술은 예컨대 문헌[논문 "Biopolymers, 1976, 15, 1869" 및 H.R. Kricheldorf의 저서, "alpha-amino acid N-carboxy Anhydride and related Heterocycles", Springer Verlag (1987)]에 개시된 N-카르복시아미노산 무수물(NCA)의 중합을 기초로 함을 기억해야 한다. NCA 유도체는 바람직하게는 NCA-Glu-O-R₃(R₃ = 메틸, 에틸 또는 벤질)이다. 중합체는 추후 중합체를 산 형태로 얻는 데 적절한 조건 하에서 가수분해된다. 이들 방법은 본 출원인의 특허 FR A-2 801 226호에 기재된 개시 내용의 영향을 받은 것이다.

가변 중량을 갖는 폴리(α-L-글루타믹), 폴리(α-D-글루타믹), 폴리(α-D,L-글루타메이트) 및 폴리(α-L-글루타믹) 유형과 같은 본 발명에 따라 사용될 수 있는 몇 가지 중합체는 시판된다.

중합체의 산 기와 GH 그래프트의 커플링은 커플링제로서 카르보디이미드 및 임의로 4-디메틸아미노피리딘과 같은 촉매의 존재 하에 디메틸포름아미드(DMF), N- 메틸피롤리돈(NMP) 또는 디메틸 설폭시드(DMSO)와 같은 적절한 용매 중에서 폴리아미노산의 반응에 의하여 용이하게 실시된다. 카르보디이미드는 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 또는 디이소프로필카르보디이미드이다. 그래프팅율은 반응 시간 또는 구성 성분 및 반응물의 화학양론에 의하여 화학적으로 제어된다. "스페이서"에 의하여 작용기화된 소수성 그래프트는 산 촉매 작용에 의한 직접 축합에 의하여 또는 종래의 펩티드 커플링에 의하여 얻어진다.

중합체의 산 작용기와 양이온성 기 및 임의로 중성 기의 커플링은 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 디메틸 설폭시드(DMSO)와 같은 적절한 용매 중에서 커플링제로서 클로로포르메이트의 존재 하에 제2 단계에서 동시에 실시된다.

양이온성 기가 화학적으로 다르지 않은 2개의 아미노기(예컨대, 선형 디아민)를 포함하는 경우, 이것은 두 작용기 중 하나가 보호되는 형태로 도입될 수 있다. 이후 최종적인 보호기 분리 단계가 추가된다.

상기 기를 커플링하기 위한 중합 화학 및 반응은 종래의 것이며 당업자에게 널리 공지되어 있다(예컨대, 상기 언급한 출원의 특허 또는 특허 출원 참조).

본 발명에 따른 제제의 제조예는 언급될 실시예에서 상세히 개시된다.

상기 언급된 본 발명에 따른 제제의 특징으로 당업자라면 중합체(PO)를 기초로 하여 모든 제제로부터 조건 (a), (b), (c) 및 (d)를 동시에 만족시키며 이러한 이유로 서두에 정의된 요건에 최상으로 상응하는 제제를 선택할 수 있다.

조건(c) 및 (d)는 특히 선택적이다. 상기 제제가 pHf에서 콜로이드 용액을 형성하지 않는 경우, 당업자는 이 pH 값에서 더 많은 수의 이온화된 단량체를 갖는 중합체를 선택할 것이다. 다른 한편 중합체가 침전하는 경우, 이 pH에서 이온화된 단량체의 수를 증가시키는 것이 권장된다.

반직관적으로 pHf에서는 콜로이드 용액을 생성하며 생리학적 pH에서는 침전하는 일부 제제가 조건 (d)를 만족시키지 않는 것으로서 제외되어야 함을 지적하는 것은 중요하다. 따라서, 조건(d)는 본 발명에 따른 제제를 선택하기 위하여 당업자에게 편리한 수단이다.

조건 (d)는 본 발명에 따른 제제가 생리학적 pH 이하의 pH 값에서 침전함을 의미한다고 지적하는 것은 중요하다. 이것은 1 ml의 본 발명에 따른 산 제제 및 1 ml의 완충 용액(Tp)을 혼합한 후, 완충 용액의 pH 이하의 pH 값, 즉 7.2 미만에서 침전이 관찰되어야 하기 때문이다.

본 발명에 따른 제제를 선택하는 제2 방법은 침전 계수 PF를 추정하는 것이다. 이 계수는 이하의 방식으로 평가된다:

a) 침전 pH의 측정, pH*로서 기록됨

산성 pHf 3∼6.5에서, AP가 로딩된 콜로이드 용액은 나노입자를 포함하는 맑은 액체로서 존재하며, T' 테스트에 따라 동적 광 산란으로 측정되는 이것의 평균 수력 직경은 0.5 ㎛ 이하, 바람직하게는 5∼500 nm, 더 바람직하게는 10∼80 nm이다. pH가 증가되는 경우, 본 발명에 따른 용액은 생리학적 pH 이하의 pH 값에서 침전되어야 한다. 용액이 침전되는 pH* 값은 P 테스트에 따라 측정된다.

b) PF의 측정

1 mg의 중합체(PO)를 포함하는 0.5 ml의 콜로이드 용액을 TM 방법에 따라 pHf에서 pH*로 변화시키는 데 필요한 수산화나트륨의 몰수(Δn) 측정

제제 중 중합체(PO)의 농도를 C(mg/g)로 하고 소수성 측부 그래프트를 갖는 중합체(PO)의 단량체 몰분율을 y로 하여, 제제의 침전 계수 PF는 이하의 식으로 계산된다:

침전 계수 PF의 계산예는 실시예에 개시되어 있다.

본 발명의 특정 실시에서, 본 발명에 따른 제제는 침전 계수 PF가 200 초과, 바람직하게는 400 초과, 더 바람직하게는 800 초과, 더욱 바람직하게는 1500 초과인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 제제의 놀라운 측면은 생리학적 pH에서 침전 동안 형성되는 중합체쇄 네트워크로 인하여 활성 성분(AP)의 방출을 느리게 하는 것이 가능하다는 것이나, 입자 코어에 이 동일한 활성 성분(AP)이 포획되지는 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 제제는 활성 성분(AP)의 지속 방출 및 양호한 생체이용율을 모두 얻을 수 있다.

활성 성분(AP)은 바람직하게는 단백질, 당단백질, 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜쇄에 결합된 단백질[바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG): "PEG화 단백질"], 펩티드, 다당류, 지당류, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 혼합물로 구성되는 군, 더 바람직하게는 에리트로포이에틴, 예컨대 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 다르베포에틴, 헤모글로빈 라피머, 이들의 유사체 또는 이들의 유도체; 옥시토신, 바소프레신, 부신 피질 자극 호르몬, 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 조혈 작용을 자극하는 인자 및 이들의 혼합물, 알테플라제, 테넥테플라제, 인자 VII(a) 또는 인자 VII와 같은 혈액 인자; 헤모글로빈, 시토크롬, 알부민, 프로락틴, 룰리베린, 류프롤리드, 고세렐린, 트립토렐린, 부세렐린 또는 나파렐렌과 같은 황체 형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 및 유사체; LHRH 길항제, LHRH 경쟁제, 인간, 돼지 또는 소 성장 호르몬(GHs), 성장 호르몬 방출 인자, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터류킨 또는 이들의 혼합물(IL-2, IL-11, IL-12), 인터페론 알파, 알파-2b, 베타, 베타-1a 또는 감마와 같은 인터페론; 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 우로가스트론, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도모르핀, 앤지오텐신, 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 종양 괴사 인자(TNF), 신경 성장 인자(NGF), 베클라페르민, 트라페르민, 안세스팀과 같은 성장 인자 또는 각질 형성 세포 성장 인자, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF), 헤파리나제, 골 형태형성 단백질(BMP), hANP, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1), VEG-F, 재조합 B형 간염 표면 항원(rHBsAg), 레닌, 시토킨, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 티로시딘, 그라미시딘, 에타네르셉트, 이미글루세라제, 드로트레코긴 알파, 시클로스포린 및 합성 유사체, 효소, 시토킨, 항체, 항원 및 백신의 약학적으로 활성인 변형 및 단편, 및 리툭시맵, 인플릭시맵, 트라스투주맵, 아달리무맵, 오말리주맵, 토시투모맵, 에팔리주맵 및 세툭시맵과 같은 항체로 이루어진 하위 군에서 선택된다.

다른 적당한 활성 성분은 다당류(예컨대, 헤파린) 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, iRNA, 항생제 및 살아있는 세포이다. 또다른 범주의 활성 성분은 중추 신경계에 작용하는 약학 물질, 에컨대 리스페리돈, 주클로펜틱솔, 플루페나진, 페르페나진, 플루펜틱솔, 할로페리돌, 플루스피릴렌, 퀘티아핀, 클로자핀, 아미술프리드, 술피리드, 지프라시돈 등을 포함한다.

대안적인 실시양태에 따르면, 활성 성분은 안트라시클린, 탁소이드 또는 캄포테신류에 속하거나 또는 류프롤리드 또는 시클로스포린과 같은 펩티드류에 속하는 소수성, 친수성 또는 양친매성 유기 소분자 및 이의 혼합물이다.

또다른 대안적인 실시양태에 따르면, 활성 성분은 알콜 남용 치료용 제제, 알츠하이머병 치료용 제제, 마취제, 말단비대증 치료용 제제, 진통제, 항천식제, 알레르기 치료용 제제, 항암제, 항염제, 항응고제 및 항혈전제, 항경련제, 항간질약, 항당뇨병제, 진토제, 항녹내장제, 항히스타민제, 항감염제, 항생제, 항균제, 항바이러스제, 항파킨슨제, 항콜린제, 진해제, 탄산 탈수소효소 억제제, 심혈관제, 저지혈증, 항부정맥약, 혈관확장제, 항협심증제, 항고혈압제, 혈관보호제, 콜린에스테라제 억제제, 중추 신경계 질환 치료용 제제, 중추 신경계 자극제, 피임약, 수정 촉진제, 분만 유도제 및 억제제, 낭포성 섬유증 치료용 제제, 도파민 수용체 작용제, 자궁내막증 치료용 제제, 발기 불능 치료용 제제, 불임 치료를 위한 제제, 위장 장애 치료용 제제, 면역 조절제 및 면역 억제제, 기억 장애 치료용 제제, 편두통 치료제, 근육 이완제, 뉴클레오시드 유사체, 골다공증 치료용 제제, 부교감 신경 흥분제, 프로스타글란딘, 정신병 치료제, 진정제, 수면제 및 안정제, 신경마 비제, 항불안제, 정신자극제, 항우울제, 피부 질환 치료용 제제, 스테로이드 및 호르몬, 암페타민, 식욕 억제제, 비마취 진통제, 바르비투레이트, 벤조디아제핀, 하제, 향정신약물 및 이들 제품의 임의의 조합 중 1 이상으로부터 선택되는 것이 유리하다.

본 발명에 따른 제제는 경구, 비경구, 비강, 질내, 안내, 피하, 정맥내, 근내, 피내, 경피, 복강내, 뇌내 또는 협측으로 투여될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 발명은 1 이상의 활성 성분의 지속 방출을 위하여 중합체(PO)를 베이스로 하는 제제의 제조 방법을 제공하며, 이들 제제는 특히 상기 개시된 제제이며 상기 방법은 이하의 단계를 포함한다:

1) 3∼6.5의 pH값에서 상기 정의된 바와 같은 폴리아미노산 중합체(PO)의 콜로이드 수용액을 제조하는 단계[양이온성 기(CG), 소수성 기(GH), 임의로 중성 기(NG) 및 임의로 글루타메이트의 각 몰분율은 1 ml의 부피의 테스트 완충 용액(Tp)과 혼합하는 동안 상기 제제 중 1 ml가 침전되도록 하는 몰분율임]; 및

2) 상기 단계 1에서 얻은 중합체(PO)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계(여기서, 상기 활성 성분은 상기 중합체(PO)의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합함).

본 발명에 따른 방법의 본질적인 특성은 활성 성분(AP) 및 고분자 전해질 중합체(PO) 입자의 콜로이드 용액을 단순히 혼합함으로써 pHf 3∼6.5에서 활성 성분이 로딩된 입자가 자발적으로 형성된다는 것이다.

단백질, 펩티드 또는 소분자와 같은 활성 성분은 폴리아미노산 유형의 중합 체(PO)와 자발적으로 회합할 수 있다.

본 발명의 특정 실시에서, 활성 성분(AP)에 의한 고분자전해질 중합체(PO) 나노입자의 로딩은 활성 성분(AP) 용액을 고분자전해질 중합체(PO)의 콜로이드 용액과 단순히 혼합함으로써 실시된다. 이러한 회합은 순전히 물리적인 것이며 활성 성분(AP) 및 중합체(PO) 사이의 공유 결합의 형성을 동반하지 않는다. 이론의 제한을 받는 것은 아니나, 이러한 비특이적 회합은 중합체(PO) 및 활성 성분(AP) 간의 소수성 상호작용 및/또는 정전기 상호작용에 의하여 일어난다고 추정될 수 있다. 펩티드성 유형 또는 항체/항원 유형 또는 효소/기질 유형의 특정 수용체에 의하여 AP를 PO 나노입자에 결합시키는 것은 불필요하고 심지어 종종 바람직하지 않음을 유념하여야 한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 얻어지는 입자의 화학적 가교결합 단계를 포함하지 않는다. 따라서, 얻어지는 입자는 화학적으로 가교결합하지 않으며, 그럼에도 불구하고 지속된 기간에 걸쳐 활성 성분(AP)을 방출한다. 이러한 화학적 가교결합 부재는 중요한 이점이다. 이것은 화학적 가교결합이 없어서 활성 성분(AP)을 포함하는 입자의 가교결합 단계 동안 일어날 수 있는 활성 성분(AP)의 화학적 분해가 회피될 수 있기 때문이다. 이것은 이러한 화학적 가교결합이 일반적으로 중합 가능한 성분의 활성화에 의하여 실시되고 UV 방사선 또는 글루타르알데히드와 같은 변성제를 잠재적으로 동반하기 때문이다.

본 발명에 따른 방법은 건조 분말 형태로 제제를 얻기 위하여 예컨대 동결 건조에 의한 액체 제제의 탈수 단계를 포함하는 것이 유리하다.

본 발명은 또한 상기 언급한 수성 현탁액을 포함하는 액체 제제로부터 얻어지는 건조 분말을 포함하는 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 고체 약학 제제에 관한 것이다.

건조 분말은 시험관내 침전을 위하여 본 발명에 따른 액체 제제의 pH를 7로 한 다음 이것을 예컨대 동결 건조에 의하여 탈수시켜 얻을 수 있다.

이러한 고체 약학 제제는 흡인 및 페내 투여를 위해 사용되는 것이 유리하다.

또다른 측면에 따르면, 본 발명의 발명 주제는 특히 비경구, 점막, 피하, 근내, 피내, 경피, 복강내 또는 뇌내 투여를 위한 또는 경구, 경비, 폐내, 질내 또는 안내 경로에 의한 종양내 투여를 위한 약제의 제조 방법이며, 상기 방법은 실질적으로 상기 개시한 제제 중 적어도 하나를 사용하는 것으로 이루어진다.

도면의 간단한 설명

도 1: 실시예 2.1(흑색 삼각형), 실시예 2.3(흑색 다이아몬드), 실시예 3(흑색 사각형) 및 실시예 5(실선)에 개시된 제제로부터의 IFN-α의 시험관내 방출

1) 합성:

a) 비교: 소수성기를 갖는 음이온성 고분자 전해질 중합체(PO)의 합성 (합성 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트

폴리옥시에틸렌 표준에 대하여 약 16,900 Da과 동등한 중량을 갖는 15 g의 α-L-폴리글루탐산을 상기 중합체가 용해될 때까지 80℃에서 가열하면서 288 ml의 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨다. 용액을 15℃로 냉각하고 8 ml의 DMF에 미리 용해시킨 2.5 g의 D,L-α-토코페롤(>98%, Fluka®로부터 얻음), 1 ml의 DMF에 미리 용해시킨 280 mg의 4-디메틸아미노피리딘 및 6 ml의 DMF에 미리 용해시킨 1.6 g의 디이소프로필카르보디이미드를 연속적으로 첨가한다. 3시간 동안 교반 후, 반응 매질을 15%의 염화나트륨 및 염산(pH 2)을 포함하는 1200 ml의 물에 붓는다. 이후 침전된 중합체를 여과로 회수하고 0.1N 염산, 물 및 디이소프로필 에테르로 세정한다. 이후 중합체를 40℃에서 진공 하에 오븐에서 건조시킨다. 90% 정도의 수율이 얻어진다. 입체 배제 크로마토그래피로 측정한 몰질량은 폴리옥시에틸렌 표준에 대하여 15,500이다. 양성자 NMR 분광 분석으로 측정한 그래프팅된 토코페롤의 수준은 5.1 몰%이다.

b) 양이온성 고분자 전해질 중합체 PO-A1의 합성 (히스티딘아미드 및 합성 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트)

5%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 3 g의 폴 리(글루탐산)을 80℃에서 가열하여 38 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 2.74 g의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 2.2 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 온도를 0℃에서 유지하면서 반응 매질을 10분 동안 교반한다. 동시에, 8.65 g의 히스티딘아미드 디히드로클로라이드를 108 ml의 NMP에 현탁시킨다. 이후 10.6 ml의 트리에틸아민을 첨가하고 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분동안 교반한 다음 0℃로 냉각한다. 이후 활성화된 중합체의 용액을 히스티딘아미드 현탁액에 첨가한다. 반응 매질을 0℃에서 2시간 동안 교반한 다음 20℃에서 밤새 교반한다. 이후 0.62 ml의 35% HCl 및 이어서 83 ml의 물을 첨가한다. 이후 pH 3∼4에서 얻어지는 용액을 500 ml의 물에 붓는다. 이후 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9% NaCl) 및 4부피의 물에 대하여 정용 여과한다. 이후 중합체 용액을 300 ml 부피(중합체 농도는 18 mg/g임)로 농축한다. 그래프팅된 히스티딘아미드의 퍼센트는 D₂O에서 ¹H NMR로 측정하여 95%이다.

c) 양이온성 고분자 전해질 중합체 PO-A2의 합성 (히스티딘아미드 및 합성 α-토코페롤이 그래프팅된 폴리글루타메이트)

20%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 10 g의 폴리(글루탐산)을 80℃에서 가열하여 125 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 5.5 g의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 4.4 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 온도를 0℃에서 유지하면서 반응 매질을 10분 동안 교반한다. 동시에, 12.9 g의 히스티딘아미드 디히드로클로라이드를 161 ml의 NMP에 현탁시킨다. 이후 15.8 ml의 트리에틸아민을 첨가하고 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분동안 교반한 다음 0℃로 냉각한다. 이후 활성화된 중합체의 용액을 히스티딘아미드 현탁액에 첨가한다. 반응 매질을 0℃에서 2시간 동안 교반한 다음 20℃에서 밤새 교반한다. 이후 1.46 ml의 35% HCl 및 이어서 200 ml의 물을 첨가한다. 추가로 200 ml의 물을 첨가한 다음 650 ml의 에탄올을 첨가하고 pH 3∼4에서 650 ml의 물에 붓는다. 이후 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9% NaCl) 및 4부피의 물에 대하여 정용 여과한다. 이후 중합체 용액을 최종적으로 250 ml 부피(중합체 농도는 50 mg/g임)로 농 축한다. 그래프팅된 히스티딘아미드의 퍼센트는 D₂O에서 ¹H NMR로 측정하여 70%이다.

d) 양이온성 고분자 전해질 중합체 PO-B의 합성 (합성 α-토코페롤, 에탄올아민 및 아르기닌아미드가 그래프팅된 폴리글루타메이트)

5%의 라세미체 α-토코페롤이 무작위 그래프팅된 220의 DP를 갖는 10 g의 폴리(글루탐산)을 80℃에서 125 ml의 NMP에 용해시킨다. 이 용액을 0℃로 냉각시키고 5.6 ml의 이소부틸 클로로포르메이트 및 이어서 4.8 ml의 N-메틸모르폴린을 첨가한다. 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한다. 동시에, 7.4 g의 아르기닌아미드 디히드로클로라이드를 93 ml의 NMP에 현탁시킨 다음 4.7 ml의 트리에틸아민 및 1.2 ml의 에탄올아민을 첨가한다. 얻어지는 현탁액을 20℃에서 수분 동안 교반하고 이어서 0℃로 냉각한다. 이어서 활성화된 중합체의 유탁액을 이 현탁액에 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 다음 20℃에서 밤새 교반한다. 2.07 ml의 35% HCl 용액 및 이어서 200 ml의 물을 첨가한 후, 1N HCl 용액으로 pH를 대략 3으로 유지하면서 반응 혼합물을 pH = 3으로 산성화된 670 ml의 물에 한방울씩 흘린다. 얻어진 용액을 8 부피의 염수 수용액(0.9 %) 및 이어서 4 부피의 물에 대하여 정용 여과하고 대략 250 ml의 부피로 농축한다. D₂O 중 양성자 NMR로 측정할 때 그래프팅된 아르기닌아미드 및 그래프팅된 에탄올아민의 퍼센트는 각각 40% 및 22%이다.

2) 실시예 1 (비교): 양이온성 유도체를 포함하지 않는 중합체(PO)를 베이스로 하는 제제(합성 a)

상기 합성 a)에 따라 얻어진 중합체(PO)를 사용한다.

2.19 g의 물로 12.64 g의 PO 용액을 희석함으로써 중합체(PO)의 24 mg/g의 콜로이드 용액을 얻는다. 이후 콜로이드 PO 용액의 삼투압 및 pH는 각각 필요한 양의 NaCl 수용액 및 NaOH 용액을 도입함으로써 290 mOsm 및 pH 6.95로 조절한다.

얻어지는 제제의 특성은 이하의 표에 통합되어 있다:

입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.

[PO] (mg/g)	pH	삼투압(mOsm)	크기(nm)
23.14	6.95	290	40

상기 개시된 중합체(PO)를 베이스로 하는 제제는 1 ml의 완충 용액(Tp)에 1 ml의 상기 제제를 첨가하는 동안 침전되지 않는다.

3) 실시예 2: 중합체 PO-A1을 베이스로 하는 제제

3.1) 실시예 2.1: IFN-α를 포함하는, 10 mg/g과 동등한 PO-A1의 농도

a) PO-A1의 콜로이드 용액의 제조

상기 합성 b)에 따라 얻어지는 중합체 PO-A1을 사용한다.

PO-A1을 물에 희석하고 pH를 조절하고(적절한 NaOH 용액) 삼투압을 조절한다(적절한 NaCl 용액).

[PO-A1] (mg/g)	pH	Osmo (mOsm)
12.93	5.98	231

얻어지는 중합체 PO-A1을 베이스로 하는 콜로이드 용액은 1 ml의 상기 콜로이드 용액을 1 ml의 완충 용액(Tp)에 첨가하는 동안 침전하며 침전 계수 PF = 860을 특징으로 한다. 중합체 PO-A1은 pH* 6.5를 특징으로 한다.

b) 단백질과 중합체 PO-A1의 회합

2.4 mg/g 단백질 IFN-α 중 2.18 g을 8 g의 PO-A1 콜로이드 용액에 첨가하고 적절한 NaCl 용액(0.18 g)으로 희석시켜 최종 농도를 조절한다.

c) 25℃에서 밤새 회합

최종 제제의 특성은 이하의 표에 통합되어 있다:

입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.

[중합체] (mg/g)	[IFN-α] (mg/g)	pH	Osmo(mOsm)	크기(nm)
10	0.5	5.9	313	34

3.2) 45 mg/g과 동일한 PO-A1의 농도

상기 합성 b)에 따라 얻어지는 중합체(PO-A1)를 사용한다.

상기 PO-A1을 물에 희석시키고 pH를 조절하고(적절한 NaOH 용액) 삼투압을 조절한다(적절한 NaOH 용액).

[PO-B] (mg/g)	pH	삼투압(mOsm)	크기(nm)
45.3	5.5	299	37

얻어지는 중합체 PO-A1을 베이스로 하는 콜로이드 용액은 이 용액 1 ml를 완충 용액(Tp) 1 ml에 첨가하는 동안 침전하며 침전 계수 PF가 166인 것을 특징으로 한다.

3.3) 실시예 2.3: IFN-α 및 Zn ⁺⁺ 양이온을 포함하는, 10 mg/g과 동등한 PO-A1의 농도

a) 0.5 당량의 Zn⁺⁺을 포함하는 PO-A1의 콜로이드 용액의 제조

상기 합성 b)에 따라 얻어지는 중합체 PO-A1을 사용한다.

[PO-A1] (mg/g)	pH	Osmo (mOsm)
13.11	4.63	210

b) 단백질과 중합체 PO-A1의 회합

2.4 mg/g 단백질 IFN-α 중 2.17 g을 단계 a)에서 제조된 7.96 g의 PO-A1 콜로이드 용액에 첨가하고 적절한 NaCl 용액(0.18 g)으로 희석시켜 최종 농도를 조절 한다.

c) 25℃에서 밤새 회합

d) Zn⁺⁺ 양이온의 첨가

204 mg/g 농축 ZnCl₂ 용액의 필요량을 상기 제제에 첨가하여 용액 중에 존재하는 양이온성 유도체 당 0.5 몰당량의 Zn⁺⁺ 양이온을 얻는다.

최종 제제의 특성은 이하의 표에 통합되어 있다:

입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.

[중합체] (mg/g)	[IFN-α] (mg/g)	[Zn++] (당량)	pH	Osmo(mOsm)	크기(nm)
10.02	0.5	0.51	4.05	337	36

얻어지는 중합체 PO-A1을 베이스로 하는 콜로이드 용액은 이 용액 1 ml를 완충 용액(Tp) 1 ml에 첨가하는 동안 침전하며 침전 계수 PF가 860인 것을 특징으로 한다. 양이온 유도체당 0.5 몰당량의 Zn⁺⁺ 양이온을 포함하는 중합체 PO-A1은 pH* = 4.8을 특징으로 한다.

4) 실시예 3: IFN-α를 포함하는 30 mg/g의 중합체 PO-A2를 베이스로 하는 제제

a) PO-A2의 콜로이드 용액의 제조

상기 합성 c)에 따라 얻어지는 중합체 PO-A2를 사용한다.

상기 PO-A2를 물에 희석시키고 pH를 조절하고(적절한 NaOH 용액) 삼투압을 조절한다(적절한 NaOH 용액).

[PO-A2] (mg/g)	pH	Osmo (mOsm)
38.52	6.04	237

얻어지는 중합체 PO-A2를 베이스로 하는 콜로이드 용액은 이 용액 1 ml를 완충 용액(Tp) 1 ml에 첨가하는 동안 침전하며 침전 계수 PF가 840인 것을 특징으로 한다. 중합체 PO-A2는 pH* = 6.5를 특징으로 한다.

b) 단백질과 중합체 PO-A2의 회합

2.4 mg/g 단백질 IFN-α 중 2.18 g을 8 g의 PO-A2 콜로이드 용액에 첨가하고 적절한 NaCl 용액(0.18 g)으로 희석시켜 최종 농도를 조절한다.

c) 25℃에서 밤새 회합

최종 제제의 특성은 이하의 표에 통합되어 있다:

입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.

[PO](mg/g)	[IFN-α](mg/g)	pH	삼투압(mOsm)	크기(nm)
29.8	0.5	5.8	320	35

5) 실시예 4: IFN-α를 포함하거나 포함하지 않는 중합체 PO-B를 베이스로 하는 제제

5.1) 실시예 4.1: IFN-α를 포함하는 10 mg/g과 동등한 PO-B 농도

a) PO-B의 콜로이드 용액의 제조

상기 합성 d)에 따라 얻어지는 중합체 PO-B를 사용한다.

상기 PO-B를 물에 희석시키고 pH를 조절하고(적절한 NaOH 용액) 삼투압을 조 절한다(적절한 NaOH 용액).

[PO-B] (mg/g)	pH	Osmo (mOsm)
11.2	4.17	275

얻어지는 중합체 PO-B를 베이스로 하는 콜로이드 용액은 이 용액 1 ml를 완충 용액(Tp) 1 ml에 첨가하는 동안 침전하며 침전 계수 PF가 1150인 것을 특징으로 한다. 중합체 PO-B는 pH* = 5를 특징으로 한다.

b) 단백질과 중합체 PO-B의 회합

2.7 mg/g 단백질 IFN-α 중 1.8 g을 8 g의 PO-B 콜로이드 용액에 첨가하고 적절한 NaCl 용액으로 희석시켜 최종 농도를 조절한다.

c) 25℃에서 밤새 회합

입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.

최종 제제의 특성은 이하의 표에 통합되어 있다:

[중합체] (mg/g)	[IFN-α] (mg/g)	pH	삼투압(mOsm)
9.3	0.5	4.2	293

상기 제조된 바와 같은 제제는 Q 테스트에서 보유 계수(RQ)가 5초과인 것을 특징으로 한다(RQ = 5에서 유리 IFN-α 퍼센트에 대한 ELISA 테스트: 8 %).

5.2) 실시예 4.2: 45 mg/g과 동일한 PO-B의 농도

상기 합성 d)에 따라 얻어지는 중합체(PO-B)를 사용한다.

[PO-B] (mg/g)	pH	삼투압(mOsm)	크기(nm)
45	4	294	35

얻어지는 중합체 PO-B를 베이스로 하는 콜로이드 용액은 이 용액 1 ml를 완충 용액(Tp) 1 ml에 첨가하는 동안 침전하며 침전 계수 PF가 256인 것을 특징으로 한다. 중합체 PO-B는 pH* = 5를 특징으로 한다.

6) 실시예 5(비교): IFN-α를 포함하는 PO를 베이스로 하는 입자의 제조

상기 합성 a)에 따라 얻어지는 중합체(PO)를 사용한다.

중합체(PO)의 콜로이드 용액은 이것을 물에 용해시키고 NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.52로 조절함으로써 얻는다. 용액의 삼투압은 필요한 양의 NaCl 수용액을 도입함으로써 108 mOsm로 조절된다. 중합체(PO)의 농도는 29.05 mg/g으로 조절된다.

농축된 2.4 mg/g 단백질 IFN-α를 상기 중합체(PO) 콜로이드 용액에 첨가한다. 25℃에서 밤새 회합시킨다.

얻어지는 입자의 특성은 이하의 표에 통합되어 있다:

입자의 크기는 T' 테스트에 따라 측정한다.

[PO](mg/g)	[IFN-α](mg/g)	pH	삼투압(mOsm)	크기(nm)
23	0.5	7.20	300	40

7) 실시예 2, 3 및 5에 대한 시험관내 결과

이를 위하여, 본 발명에 따른 제제로부터 활성 성분의 방출을 L 테스트를 사용하여 측정한다.

L 테스트에서의 방출은 경시적으로 방출되는 단백질의 퍼센트 형태로 도 1에 도시된다.

23 mg/g의 PO 입자를 포함하는 비교 실시예 5의 제제는 10 시간 이내에 단백질의 95%가 방출되는 것이 특징인 방출 프로필을 보인다.

실시예 2.1 및 3의 제제는 48시간 이내에 주입된 단백질이 각각 67% 및 65% 방출되는 지연 방출 프로필을 보인다.

실시예 2.3의 입자의 경우, 48 시간 이내에 주입된 단백질의 59%가 방출되며 실험 종료시에 0이 아닌 방출 흐름의 생성이 관찰된다.

8) 실시예 2, 3 및 5에 대한 시험관내 결과

44 마리의 래트를 8 또는 12 마리 동물로 이루어진 5개의 군으로 분리하고 속방 IR 제제 또는 비교 실시예 5에 상응하는 서방 제제 또는 본 발명 실시예 2 및 3의 제제 중 하나를 300 ㎍/kg의 용량으로 병용 투여하였다.

약동학적 결과는 이하의 표에 통합되어 있다:

실시예	N	C_max (ng/ml)	Tmax 평균 (간격) (시)	AUC (ng x h/ml)	T50%_AUC (h)	RBA(%)
IFN IR (0.5)	12	100.6	05 (0.25-1)	255.9	1.5	100
실시예 2.1	8	3.6	3 (3-24)	135.4	24.7	57
실시예 2.3	8	1.1	3 (3-24)	28.3	19.4	12
실시예 3	8	26.2	3 (3-6)	264.8	7.1	111
실시예 5	8	3.5	12 (6-24)	95.7	18.4	62

C_max는 모든 동물에 대한 단백질의 평균 최대 혈장 농도를 나타낸다.

T_max 평균은 혈장 농도가 최대값을 지난 시간의 평균을 나타낸다.

AUC는 시간의 함수로서의 혈장 농도 곡선 아래의 평균 면적을 나타낸다.

T50%_AUC는 그 종말점에서 곡선 아래의 면적이 그 전체 값의 50%에 달하는 평균 시간을 나타낸다.

RBA는 IFN IR 제제 곡선 아래의 면적에 대한 고려되는 제제 곡선 아래의 면적의 비를 나타낸다.

모든 제제는 IR에 대하여 C_max 감소가 동반되는 서방 프로필을 나타낸다

비교 실시예 5에 비하여, 본 발명에 따른 모든 제제의 최종 기울기는 더 낮은데, 이것은 지속적인 잉여 흡수를 나타낸다.

실시예 2.1 및 실시예 3의 제제(10 mg/g PO-A1 및 30 mg/g PO-A2)에 대하여, (비교 실시예 5의 제제에 대한 약 3일에 비하여) 5일을 초과하는 기간에 걸친 서방은 각각 57% 및 약 100%의 RBA 값을 보인다.　　　　　

Claims

1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 액체 약학 제제로서, 1 이상의 활성 성분(AP) 및 중합체(PO) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 콜로이드 입자를 베이스로 하는 수성 현탁액을 포함하며 이하의 4가지 조건을 만족시키는 제제:

(여기서,

- 일부 글루탐산 잔기는 각각 서로 동일하거나 또는 상이한 양이온성 측쇄기(pendant group)(CG)를 가지며,

- 임의로, 또다른 글루탐산 잔기는 개질되지 않음),

(b) 상기 제제의 pH의 pHf 값은 3.0∼6.5이며;

(c) 상기 pHf 값에서, 중합체(PO)는 자발적이고 비공유적으로 활성 성분(AP)과 회합하는 콜로이드 용액을 형성하고;

제1항에 있어서, 침전 계수(PF)가 200 초과, 바람직하게는 400 초과, 바람직하게는 800 초과, 더 바람직하게는 1500 초과인 것인 제제.

제2항에 있어서, 보유 계수(RQ)가 5 초과, 바람직하게는 10 초과, 바람직하게는 15 초과, 더 바람직하게는 20 초과인 것인 제제.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 중합체(PO)는 전체 중합도(DP)가 50∼300, 바람직하게는 100∼250인 pGlu_(x)GH_(y)CG_(z)NG_(1-x-y-z)[여기서, (x)는 0∼0.45이고, (y)는 0.02∼0.3이며, (z)는 0.4∼0.98이고, (1-x-y-z)는 0∼0.5임] 구조를 갖는 것인 제제.

제1항에 있어서, 상기 양이온성 기(CG)는 반중화(half-neutralization) pH가 7.0 미만인 약염기로부터 선택되는 것인 제제.

제1항에 있어서, 상기 양이온성 기(CG)는 반중화 pH가 8.0을 초과하는 1 이상의 4급 암모늄 또는 1 이상의 강염기를 포함하는 양이온성 기에서 선택되는 것인 제제.

제6항에 있어서, 상기 양이온성 기(CG)는 이하의 기에서 선택되는 것인 제제:

- -NH-(CH₂)_w-NH₃ ⁺, Z^-(여기서, w는 2∼6, 바람직하게는 4임),

- -NH-(CH₂)₄-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺, Z^-,

- -O-(CH₂)₂-NH₃ ⁺, Z^-,

- -O-(CH₂)₂-N⁺(CH₃)₃, Z^-, 및

- 하기 화학식의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체:

[상기 화학식에서,

- -R¹은 알콕시, 바람직하게는 -OMe 또는 -OEt이거나, 또는 -R¹은 -NH₂, 알킬아미노-, 바람직하게는 -NH-CH₃ 또는 -N(CH₃)₂이고;

- -R¹³은 -(CH₂)₄-NH₃ ⁺, Z^-, -(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺, Z^-, -(CH₂)₃-NH₃ ⁺, Z^-이며;

여기서, Z^-는 클로라이드, 설페이트, 포스페이트 또는 아세테이트, 바람직하 게는 클로라이드임].

제3항, 제6항 또는 제7항에 있어서,

- x가 10∼55%이고,

- y가 2∼30%이며,

- z가 10% 이상이고 (x-10)% 내지 (x+15)%이며,

중성기의 수는 100%에 이르도록 추가의 퍼센트에 상응하고 임의로 0일 수 있는 것인 제제.

제3항, 제6항 또는 제7항에 있어서,

- x가 20∼55%이고,

- y가 2∼7.5%이며,

- z가 20% 이상이고 (x-10)% 내지 (x+15)%이며,

제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 소수성 기(GH)는

로 구성된 군에서 선택되는 것인 제제.

제1항에 있어서, 상기 중성 기(NG)는 히드록시에틸아미노 라디칼, 히드로알킬옥시 라디칼 및 폴리옥시알킬렌으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제제.

제1항에 있어서, 상기 중합체(PO)가 글루타메이트 잔기에 결합된 폴리알킬렌(바람직하게는 폴리에틸렌) 글리콜 유형의 1 이상의 그래프트를 갖는 것인 제제.

제1항에 이어서, 상기 폴리아미노산(PO)은 하기 화학식 I을 갖는 것인 제제:

화학식 I

상기 화학식에서,

* A는 독립적으로

- - NHR 기(여기서, R은 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 알킬 또는 벤질 기임),

(여기서, R⁷은 OH, OR⁹ 또는 NHR¹⁰이고, R⁸, R⁹ 및 R¹⁰은 독립적으로 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 알킬기 또는 벤질기임)이고;

* B는 직접 결합 또는 바람직하게는 라디칼 -O-, -NH-, -N(C₁-C₅ 알킬)-, 1∼6개의 탄소 원자를 포함하는 아미노산(바람직하게는 천연 아미노산), 디올, 트리올, 디아민, 트리아민, 아미노알콜 또는 히드록시산의 잔기에서 선택되는 2가, 3가 또는 4가 결합기이며;

* 소수성 기(GH)는 각각 서로 독립적으로

에서 선택되는 기이며;

* R⁷⁰은

하기 화학식

- -NH-(CH₂)_w-NH₃ ⁺(여기서, w는 2∼6, 바람직하게는 4임),

- -NH-(CH₂)₄-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺,

- -O-(CH₂)₂-NH₃ ⁺,

- -O-(CH₂)₂-N⁺(CH₃)₃,

- 하기 화학식의 기:

- 하기 화학식의 아미노산 잔기 또는 아미노산 유도체:

[여기서, X는 -O- 또는 -NH-이고, R¹²는 H, 선형 C₂-C₁₀ 또는 분지형 C₃-C₁₀ 알킬 또는 벤질이며, R¹³은 -(CH₂)₄-NH₃ ⁺, -(CH₂)₃-NH-C(=NH)-NH₃ ⁺, -(CH₂)₃-NH₃ ⁺이고, 여기서 짝음이온 R⁷⁰은 적절한 기, 바람직하게는 클로라이드임]

로 구성된 군에서 선택되는 기이고;

* R⁹⁰은 히드록시에틸아미노-, 히드록시알킬옥시- 또는 폴리옥시알킬렌이며;

* p, q, r 및 s는 양의 정수이고;

* (p+q+r+s)는 50∼300, 바람직하게는 100∼250으로 달라지며;

* (r)/(p+q+r+s)는 0∼78 몰% 범위이고;

* (s)/(p+q+r+s)는 0∼55 몰% 범위이다.

제1항에 있어서, 제제 중의 중합체(PO) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도는 4∼50 mg/ml인 것인 제제.

제1항에 있어서, 중합체(PO) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 농도에 대한 활성 성분(AP)의 농도의 비(R)는 0.0001∼1.5인 것인 제제.

제1항에 있어서, 양이온성 기(CG)의 몰농도에 대하여 0.05∼2 몰당량의 비율로 Zn⁺⁺ 2가 양이온을 포함하는 것인 제제.

제1항에 있어서, 추가된 2가 양이온을 포함하지 않는 것인 제제.

제1항에 있어서, 상기 활성 성분(AP)은 활성 성분(AP)은 단백질, 당단백질, 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜쇄에 결합된 단백질[바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG): "PEG화 단백질"], 펩티드, 다당류, 지당류, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 이들의 혼합물로 구성되는 군, 더 바람직하게는 에리트로포이에틴, 예컨대 에포에틴 알파, 에포에틴 베타, 다르베포에틴, 헤모글로빈 라피머, 이들의 유사체 또는 이들의 유도체; 옥시토신, 바소프레신, 아드레노코르티코트로픽 호르몬, 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 조혈 작용을 자극하는 인자 및 이들의 혼합물, 알테플라제, 테넥테플라제, 인자 VII(a) 또는 인자 VII와 같은 혈액 인자; 헤모글로빈, 시토크롬, 알부민, 프로락틴, 룰리베린, 류프롤리드, 고세렐린, 트립토렐린, 부세렐린 또는 나파렐렌과 같은 황체 형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 및 유사체; LHRH 길항제, LHRH 경쟁제, 인간, 돼지 또는 소 성장 호르몬(GH), 성장 호르몬 방출 인자, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터류킨 또는 이들의 혼합물(IL-2, IL-11, IL-12), 인터페론 알파, 알파-2b, 베타, 베타-1a 또는 감마와 같은 인터페론; 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 우로가스트론, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도모르핀, 앤지오텐신, 티로트로핀-방출 호르몬(TRH), 종양 괴사 인자(TNF), 신경 성장 인자(NGF), 베클라페르민, 트라페르민, 안세스팀 또는 각질 형성 세포 성장 인자와 같은 성장 인자, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포-콜로니 자극 인자(M-CSF), 헤파리나제, 골 형태형성 단백질(BMP), hANP, 글루카곤 유사 펩티드(GLP-1), VEG-F, 재조합 B형 간염 표면 항원(rHBsAg), 레닌, 시토킨, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 티로시딘, 그라미시딘, 에타네르셉트, 이미 글루세라제, 드로트레코긴 알파, 시클로스포린 및 합성 유사체, 효소, 시토킨, 항체, 항원 및 백신의 약학적으로 활성인 변형 및 단편, 및 리툭시맵, 인플릭시맵, 트라스투주맵, 아달리무맵, 오말리주맵, 토시투모맵, 에팔리주맵 및 세툭시맵과 같은 항체로 이루어진 하위 그룹에서 선택되는 것인 제제.

제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 액체 제제로부터 얻어지는 무수 분말 형태를 포함하는 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 고체 약학 제제.

제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 1 이상의 활성 성분(AP)의 지속 방출을 위한 제제의 제조 방법으로서,

(여기서,

- 임의로, 또다른 글루탐산 잔기는 개질되지 않고,

양이온성 기(CG), 소수성 기(GH), 임의로 중성 기(NG) 및 임의로 글루타메이트의 각 몰분율은 1 ml의 부피의 테스트 완충 용액(Tp)와 혼합하는 동안 상기 제제 중 1 ml가 침전되도록 하는 몰분율임); 및

2) 상기 단계 1에서 얻은 중합체(PO)에 1 이상의 활성 성분(AP)을 첨가하는 단계(여기서, 상기 활성 성분은 상기 중합체의 콜로이드 용액의 입자와 비공유적으로 회합함)

포함하는 제조 방법.