KR101463952B1 - 활성 성분의 지연 방출용 약학 제제와, 이들의 용도, 특히 치료 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1종 이상의 활성 성분 (AP), 특히 단백질 및 펩티드 활성 성분의 지연 방출용 수용성 콜로이드 현탁액을 기제(基劑)로 하는 신규한 약학 제제와, 이들 제제의 용도, 특히 치료 용도에 관한 것이다.
이 제제는 소수성기 (GH) (알파-토코페롤)과 최소한 부분적으로 이온화되는 소수성기 (GI) (Glu)가 결합되어 있는 수용성, 생분해성, 양친매성 중합체 PO의 미립자를 기제로 하는 저점도 수용성 콜로이드 현탁액을 포함하고, 상기 입자는 pH = 7.0 및 등장 조건하에서 AP와 자발적으로 그리고 비공유적으로 회합할 수 있고, 입도는 0.5 내지 100 ㎛인 것이다. 이 현탁액은 상기 PO의 GI기의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온 (Mg2+)을 함유하고 아래의 식으로 정의되는 비율 r는 0.3 내지 10이다.
r = n × [IM]/[GI]
(상기 식 중에서,
- n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
- [IM]은 상기 다원자가 이온의 몰농도이며,
- [GI]는 상기 이온성기 GI의 몰농도이다.)
지연 방출용 약학 제제, 콜로이드 현탁액

Description

활성 성분의 지연 방출용 약학 제제와, 이들의 용도, 특히 치료 용도 {PHARMACEUTICAL FORMULATIONS FOR THE SUSTAINED RELEASE OF ACTIVE INGREDIENT(S), AS WELL AS THEIR APPLICATIONS, ESPECIALLY THERAPEUTIC}
본 발명은 1종 이상의 활성 성분 (AP), 특히 단백질 및 펩티드 활성 성분의 지연 방출용 수용성 콜로이드 현탁액계의 신규한 약학 제제와, 이들 제제의 용도, 특히 치료 용도에 관한 것이다.
이들 약학 제제는 인간 및 동물 양자의 치료에 적용된다.
약학적 AP, 특히 치료용 단백질의 지연 방출 분야에서는, 대다수의 경우에 가능한 한 환자의 혈장 단백질 또는 펩티드 농도가 건강한 객체에서 관찰되는 값에 근접하도록 가능한 한 보장할 필요가 있다.
이 목적은 혈장 중의 단기 수명의 단백질에 의하여 손상되는데, 이는 상기 치료용 단백질의 반복적인 주입을 요하게 된다. 상기 치료용 단백질의 혈장 농도는 고농도인 최고점과 매우 저농도인 최저점을 특징으로 하는 "톱니형" 프로파일을 나타낸다. 상기 농도 최고점은 건강한 객체 중에서의 기저(基底) 농도보다 훨씬 더 높은데, 상기 농도 피크에는 인터류킨 IL2 등의 치료용 단백질의 높은 독성에 기인하는 매우 현저한 유해 효과가 있다. 더욱이, 상기 농도 최저점은 치료 효과를 갖는 데 필요한 농도 미만이므로 환자는 빈약한 치료 회복을 받게 되고 심각한 장기적인 결과를 겪게 된다.
또한, 환자의 치료용 단백질의 혈장 농도가 그 환자를 치료하는 데 이상적인 값에 근접하는 것을 보장하려면, 관련된 약학 제제의 치료용 단백질이 지연 방출되도록 하여 시간에 대한 혈장 농도의 변화를 제한하여야 한다.
더욱이, 이 활성 제제는 좋기로는 이 기술 분야의 숙련자에게 이미 친숙한 다음의 명세 사항들을 충족시켜야 한다.
1 - 혈장 농도가 치료용 수준에서 유지되도록, 활성 및 비변성의 치료용 단백질, 예컨대 인간 또는 합성 단백질의 지연 방출,
2 - 용이하게 주사할 수 있도록 충분히 낮은 주사 점도,
3 - 생체 적합성이고 생분해성인 형태,
4 - 독성 또는 면역 반응의 어느 것도 나타내지 않는 형태,
5 - 우수한 국부 내성이 있는 형태.
이들 목적을 달성하기 위한 시도를 행함에 있어서, 선행 기술 중에 제안되어 있는 가장 양호한 접근법 중의 한 가지는 치료용 단백질이 들어 있는 나노입자의 저점도 액체 현탁액으로 구성되는 치료용 단백질(들)의 지연 방출용 형태를 개발하는 것이었다. 이들 현탁액은 치료용 천연 단백질의 투여를 용이하게 하였다.
따라서, 플라멜 테크놀로지스사 (Flamel Technologies)는 치료용 단백질을 소수성기와 친수성기를 포함하는 코폴리아미노산 (copolyamino acid)의 나노입자와 결합시키는 방법을 제안한 바 있다.
특허 US-B-5,904,936에는 하나는 중성 및 소수성이고 나머지 하나는 이온성인 2종 이상의 아미노산을 포함하는 양친매성(兩親媒性) 폴리아미노산 공중합체의, 평균 입도가 0.01 내지 0.5 ㎛인 준(準)미립자 (NPV) 및 평균 입도가 0.5 내지 20 ㎛인 미립자 (MPV)가 기재되어 있다. 인슐린 등의 단백질은 수용성 용액 중의 이들 입자 표면에 자발적으로 흡착된다. 상기 폴리아미노산 공중합체는, 예컨대 폴리(L-류신-블록-L-글루탐산나트륨)의 블록 공중합체이다. 상기 특허에는 1가 양이온성염 (황산암모늄) 또는 다가 양이온성염 (Fe2+, Fe3+, Zn2+, Ca2+, Al2+, Al3+ 또는 Cu2+), 산 (HCl) 또는 양이온성 중합체 (폴리리신)를 폴리-Leu/Glu의 콜로이드 현탁액에 첨가함으로써 NPV를 MPV로 응집시키는 것이 기재되어 있다.
특허 출원 WO-A-2005/033181에는 아스파르트산 단위 또는 글루탐산 단위를 포함하고 말단에 탄소 원자가 8 내지 30개인 소수성기가 결합되어 있는 선형의 양친매성ㆍ음이온성 호모폴리아미노산이 개시되어 있다. 특히, "소수성으로 개질된" 텔레킬릭 중합체 (telechelic polymer)는, 예컨대 말단이 PheOC18/C18인 폴리[GluONa) 또는 말단이 PheOC18/알파-토코페롤인 폴리[GluONa]이다. 물 중에서, 이들 "소수성으로 개질된" 텔레킬릭 호모폴리아미노산 (homopolyamino acid)은 pH 7.4의 수용성 현탁액 중에서 1종 이상의 활성 단백질 (인슐린)과 용이하게 결합할 수 있는 나노입자의 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성한다.
US-B-5,904,936 및 WO-A-2005/033181에 따른 현탁액에 의하여 "벡터화 (vectorized)" 활성 단백질(들) (예컨대, 인슐린)의 생체내 방출 시간을 유리하게 증가시킬 수 있다.
방출 시간의 증가는 PCT 출원 WO-A-05/051416에 기재되어 있는 약학 제제에 의하여 일부 달성된 바 있다. 상기 특허 출원에서는, 폴리(L-글루탐산나트륨) 나노입자 (0.001 내지 0.5 ㎛)의 소수성 개질 콜로이드 현탁액이, 피하 주사 후, 내생(內生) 혈청 알부민과의 접촉시 환자내 원위치에 겔이 형성되도록 하는 농도로 주사된다. 이어서, 상기 단백질은 서서히 통상 1 주에 걸쳐 방출된다. 그러나, 인간 성장 호르몬의 경우와 같이, 치료용 단백질의 투여 농도가 비교적 높을 경우, 예컨대 상기 방출 시간은 단지 수 일로 한정된다.
어떠한 경우에도, 소수성으로 개질된 폴리아미노산의 나노입자 또는 미립자의 콜로이드에 관련되어 있는 선행 기술의 어느 것도 다음의 것들을 가능하게 하는 제제를 개시하고 있지 않다.
(Ⅰ) 특히 활성 단백질의 농도가 높을 경우, 비경구 투여, 예컨대 피하 주사 후, 그 활성 단백질의 방출 시간을 증가시키는 것, 또는
(Ⅱ) 활성 단백질을 함유하는 제제의 투여 후, 그 활성 단백질의 혈장 농도 피크를 저하시키는 것.
그러므로, 이들 조건하에서, 본 발명의 목적 중의 한 가지는 선행 기술의 단점을 극복하고, 특히 비경구 (예컨대, 피하) 투여 후, 비변성 AP (예컨대, 치료용 단백질 및 펩티드와 소형 분자), 예를 들면 인간 또는 합성 단백질의 생체내 지연 방출 시간을 얻는 것을 가능하게 하는 AP의 지연 방출용 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 비경구 (예컨대, 피하) 투여 후, 고농축 치료용 단백질 및 펩티드, 예컨대 수 ㎎/㎖를 함유하는 것들에 대한 생체내 지연 방출을 얻는 것을 가능하게 하는 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이화학적 및 생물학적 관점의 두 가지 관점에 있어서 저장시 안정한 AP의 생체내 지연 방출용 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음의 특성, 즉 생체 적합성, 생분해성, 무독성, 양호한 국부 내성 중의 1 가지 이상의 특성을 나타내는 생체내 AP의 지연 방출용 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소수성기 (GH)와 이온성기 (GI)가 결합되어 있고 물 중에서 자발적으로 나노입자의 콜로이드 현탁액을 형성하며, 1종 이상의 AP와 자동 회합(會合)되어 있거나 또는 자동 회합될 수 있는 중합체 PO의 미립자를 포함하는 AP의 생체내 저속 지연 방출용 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 피하 주사 후, 전술한 중합체 PO의 콜로이드 현탁액에 들어 있는 AP의 수용성 매질 중에 혼합되어 있는 치료용 단백질 또는 펩티드의 투여 후에 얻은 방출 시간보다 더 장시간에 걸쳐 동일한 단백질을 방출할 수 있는 상기 중합체 PO의 미립자를 포함하는 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 예컨대 주쇄는 아스파르트산 잔기 및/또는 글루탐산 잔기로 구성되는 폴리아미노산이고, 이들 잔기의 적어도 일부는 상기 주쇄 중 및/또는 주쇄 말단에 있는 1개 이상의 소수성기 GH의 그래프트 (graft)에 의하여 개질되는 것이며, 또한 생분해성, 수용성 및 양친매성인 1종 이상의 AP와 자동 결합되는 것인 중합체 PO의 미립자를 포함하는 생체내 AP의 저속 지연 방출용 약학 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 목적들 중에 언급되어 있는 제제 및/또는 그 제제의 전구체로부터 유도되는 제제를 제안하려는 것이다.
본 발명의 발명자들이 기여하고 있는 바는, WO 05/051416에 따른 제제의 나노입자를 분명하게 정의된 비율로 GI기의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온을 함유하는 미립자로 되도록 응집시키면, 이들 미립자가 회합되는 AP (예컨대, 단백질 또는 펩티드)의 방출 시간을 현저하게 지연시키는 특정 개체군의 미립자를 선택하기에 이른다는 사실을 발견하게 된 점이다.
어떠한 다원자가 이온은 본 발명에 따른 제제가 우수한 내성(耐性)을 갖도록 한다는 사실을 발견하게 된 점도 역시 본 발명의 발명자들이 기여한 바이다.
그러므로, 본 발명은 중합체 (PO)의 미립자를 기제(基劑)로 하는 저점도의 수용성 콜로이드 현탁액을 포함하는 활성 성분 (AP)의 지연 방출용 액체 약학 제제에 있어서,
ⅰ. 상기 중합체 (PO)는
● 소수성기 (GH)와 최소한 부분적으로 이온화하는 이온성 친수성기 (GI)가결합되어 있는 수용성의 생분해성 및 양친매성 공중합체이고,
● pH 7.0 및 등장 조건하에서 나노입자의 수용성 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성하며,
ⅱ. 상기 입자는 pH 7.0 및 등장 조건하에서 1종 이상의 활성 성분 (AP)와 자발적이고 비공유적으로 회합할 수 있고, 이들 PO의 미립자의 T 검정법으로 측정된 입도가 0.5 내지 100 ㎛, 좋기로는 1 내지 70 ㎛, 특히 좋기로는 2 내지 40 ㎛이고, 상기 중합체의 GI기의 극성과 극성이 반대인 원자가가 4 이하인 다원자가 이온, 좋기로는 2 원자가 이온, 3 원자가 이온 또는 이들의 혼합물을 함유하는 것을 특징으로 하며, 상기 다원자가 이온은 M 검정법으로 측정되고 아래의 식에 의하여 정의되는 비율 r가 0.3 내지 10, 좋기로는 0.6 내지 5.0, 특히 좋기로는 0.8 내지 3.0이 되도록 하는 양으로 상기 중합체의 나노입자를 응집하여 미립자로 되도록 하기 위하여 첨가되는 것을 특징으로 하는 활성 성분 (AP)의 지연 방출용 액체 약학 제제에 관한 것이다.
r = n × [IM]/[GI]
상기 식 중,
- n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
- [IM]은 다원자가 이온의 몰농도이며,
- [GI]는 이온성기 GI의 몰농도이다.
본 발명에 따라 선택되는 이들 미립자는 양친매성 공중합체의 다수의 나노입자를 응집시킴으로써 제조된다. 이 응집은 상기 공중합체의 이온성 GI기 (최소한 부분적으로 이온화됨)의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온이 존재함으로써 유리하게 일어난다. 상이한 나노입자에 속하는 중합체 사슬과의 복합체를 형성함으로써, 상기 공중합체의 GI기의 극성과 극성이 반대인 이들 다원자가 이온은 중합체의 나노입자가 응집하여 미립자로 되게 되도록 한다.
상기 AP는 공중합체 PO의 나노입자가 미립자로 응집되기 전에 상기 나노입자와 자발적으로 결합할 수 있고, 또는 응집 도중 및/또는 후에 그 미립자와 자발적으로 결합할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 제제는 무독성이고 양호한 국부 내성을 나타낸다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명에 따른 제제의 입도가 마이크로미터인 미립자와는 달리, "준미립자" 또는 "나노입자"라는 용어는 입도 (이하에 설명되어 있는 T' 검정법으로 측정됨)가 1 nm 이상 500 nm 미만, 좋기로는 5 내지 250 nm인 입자를 나타낸다.
본 발명의 목적상, "단백질"이라는 용어는 단백질 또는 펩티드 중의 어느 한 가지를 가리키는데, 펩티드는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드이다. 이 단백질 또는 펩티드는 예컨대 1종 이상의 폴리옥시에틸렌기를 그래프트하여 개질시켜도 좋고 개질시키지 않아도 좋다.
상기 활성 성분은 본 명세서 전반에 걸쳐 AP라고 나타내는데, AP는 1종 이상의 활성 성분을 나타낸다.
본 발명의 목적상, 본 명세서 전반에 걸쳐 1종 이상의 AP와 중합체 PO (예컨대 폴리아미노산)간의 관계를 한정하기 위하여 사용되는 "회합[會合; association)]" 및 "회합한다"라는 용어는 AP가, 예컨대 정전기적 및/또는 소수성 인력 및/또는 수소 결합 및/또는 입체 장애에 의하여 중합체 PO에 비공유적으로 결합되는 것을 나타낸다.
원심 분리 각속도는 1 rpm = 2π/60 radㆍs-1에 의한 분당 회전수 (r/분)와 동등한 단위인 rpm (분당 회전수)으로 나타낸다.
레이저 산란법에 의하여 미립자의 입도를 측정하기 위한 T 검정법
a - 미립자가 수용성 분산액형인 경우의 T1 검정법
1. 기기 및 조작 조건
레이저 입도 분석기 말번 마스터사이저 (Malvern Mastersizer) 2000
모듈
 히드로 2000에스엠 (Hydro 2000SM) 습식 시료
분산 단위
분산용 캐리어 유체의 부피 150 ㎖
파장 (청색 및 적색) 466 및 632 nm
교반 속도 2400 rpm
분석 범위 0.02 ㎛ 내지 2000 ㎛
광학 모델 (Mie's 이론)
사용되는 굴절 지수 값:
분산 유체 (물)
폴리스티렌 라텍스

mfluid = 1.33 + i.0
mpolystyrene latex = 1.59 + i.0
분석 트리거용 불확실값 5% 내지 20%
수집 시간 10 초
2. 시료의 조제
분석 시료는 시료 400 ㎕를 5 ㎖의 시험관 중에서 탈염수 (脫鹽水) 600 ㎕로 희석한 다음, 그 제제를 보르텍스 (Vortex) 중에서 10 초 (10±5)간 교반시켜서 조제한다.
3. 시료의 분석
휴지(休止) 상태의 습식 시료 분산계에 저장되어 있는 순환 유체를 비워 버리고 금방 조제된 탈염수로 교체한다. 히드로 2000SM 장치의 진탕 속도는 2400 rpm으로 설정한다.
전술한 실험 조건하에서 측정을 개시한다.
1 - 레이저빔의 정렬
2 - 배경 잡음의 기록
이들 단계 후에, 분석 시료를 다음의 방식, 즉 희석된 시료 (파스퇴르 피펫에 의한다)를 불확실값이 5% 내지 20%로 될 때까지 적가(滴加)하고, 수집을 개시하는 방식으로 도입한다.
그 직경 미만에서 피분석 대상의 50%가 발견되는 직경인 D50에 대한 데이터를 얻는다.
3개의 상이한 제제에 대한 세 번의 D50의 측정을 행하고, 그 평균을 취한다.
b - 미립자가 건조형인 경우의 T2 검정법
1. 기기 및 조작 조건
레이저 입도 분석기 말번 마스터사이저 2000
모듈
 히드로 2000에스엠 습식 시료
분산 단위
분산용 캐리어 유체의 부피 150 ㎖
파장 (청색 및 적색) 466 및 632 nm
교반 속도 2000 rpm
분석 범위 0.02 ㎛ 내지 2000 ㎛
광학 모델 (Mie's 이론)
사용되는 굴절 지수:
분산 유체 (물)
폴리스티렌 라텍스

mfluid = 1.39 + i.0
mpolystyrene latex = 1.59 + i.0
분석 트리거용 불확실값 5% 내지 20%
수집 시간 10 초
2. 시료의 조제
- 헵탄에 용해된 스판 (Span) 80의 용액 0.1%를 (분말로 된 스판 80 0.01 g을 20 ㎖의 플라스크 중에 칭량하여 도입한 다음, 최종 중량이 10 g이 되도록 헵탄을 첨가함으로써) 조제한다.
- 분말 약 6 ㎎을 칭량하여 5 ㎖의 시험관 중에 넣는다.
- 스판 80의 0.1%를 포함하는 헵탄 0.7 g을 상기 시험관에 첨가한다.
- 상기 시험관을 초음파 용기 내에 2 분간 두어 상기 분말을 완전히 분산시킨다.
3. 시료의 분석
휴지 상태의 습식 시료 분산계 중에 저장되어 있는 순환 유체를 비워 버리고 헵탄으로 교체한다. 히드로 2000에스엠 장치의 진탕 속도는 2000 rpm으로 설정한다.
전술한 실험 조건하에서 측정을 개시한다.
1 - 레이저빔의 정렬
2 - 배경 잡음의 기록
이들 단계 후에, 분석 시료를 다음의 방식, 즉 희석된 시료 (파스퇴르 피펫에 의한다)를 불확실값이 5% 내지 20%로 될 때까지 적가하고, 수집을 개시하는 방식으로 도입한다.
그 직경 미만에서 피분석 대상의 50%가 발견되는 직경인 D50에 대한 데이터를 얻는다.
3개의 상이한 제제에 대한 세 가지 D50의 측정을 행하여 그 평균 값을 취한다.
준탄성 광산란법에 의하여 나노입자의 입도를 측정하기 위한 T' 검정법
본 발명에 따른 중합체 PO의 평균 수력학적 입경을 아래에 정의되어 있는 Md법에 의하여 측정한다.
PO의 용액을 0.15 M NaCl 매질 중의 1 또는 2 ㎎/㎖의 농도로 조제하고 24 시간 진탕한다. 이어서, 이들 용액을 0.8~0.2 ㎛ 여과기에 통과시킨 다음, 파장이 632.8 nm인 수직 편광 He-Ne 레이저 빔으로 조작되는 말번 콤팩트 측각기(測角器) (Malvern Compact Goniometer system)를 사용하는 역학적 광산란법에 의하여 분석한다. 상기 중합체 PO 나노입자의 수력학적 입경은 문헌 [Surfactant Science Series volume 22, Surfactant Solutions, Ed. R. Zana, chap. 3, M. Dekker, 1984] 중에 기재되어 있는 합산법에 의한 전기장 자기 상관 함수로부터 산출된다.
이온 크로마토그래피에 의하여 다원자가 이온 함량을 측정하기 위한 M 검정법
다원자가 이온 Mg2+의 정량법의 예를 들겠다. 이 방법은 기타의 양이온을 측정하는 경우에도 실질적으로 동일하다 (단지 대조군들만 변화한다).
1. 기기 및 시약
이온 크로마토그래피
전도도 검출기, 양이온 자가 재생 억제기 및 자동 온도 조절 오븐이 장착된 디어넥스 아이씨에스2500 (Dionex ICS2500) 이온 크로마토그래피 장치
컬럼 (디오넥스): 이온 팍 씨에스16 (Ion Pac CS16) 5x25 mm 컬럼
보호 컬럼 (디오넥스): 이온 팍 씨쥐16 (Ion Pac CG16) 5x50 mm 보호 컬럼
양이온 억제기 (디오넥스): 씨에스알에스-울트라 (CSRS-ULTRA) Ⅱ - 4 mm
이온 크로마토그래피용 플라스틱병 (디오넥스)
탈염수 (밀리큐; MilliQ)
0.1 N 염산 (HCl) (리델 드 하엔; Riedel de Haёn)
메탄술폰산 (MSA) (Aldrich)
다원자가 이온의 황산염: 예컨대 MgSO 4 (Aldrich)
2. 용액의 조제
용매: 0.01 N HCl
0.1 N HCl 100 ㎖를 밀리큐 (MilliQ) 물 약 500 ㎖가 들어 있는 1 ℓ 플라스크 중에 도입한다. 밀리큐 물을 사용하여 부피를 1 ℓ로 만들고, 이 용액을 자석식으로 교반한다.
이동상(移動相): 30 mM MSA
눈금이 새겨져 있는 실린더를 사용하여, 밀리큐 물 2 ℓ를 2 ℓ의 이온크로마토그래피용 플라스틱병 중에 도입한다. MSA 3.89 ㎖를 자동 피펫을 사용하여 첨가한다.
상기 플라스크를 상기 장치 내에 두고 상기 이동상을 혼합 및 탈기하기 위하여 헬륨 기포 발생을 개시한다.
3. 대조군 및 시료의 조제
대조군의 조제
Mg2+의 농도가 1 ㎎/ℓ 내지 2.6 ㎎/ℓ인 3개의 대조군을 조제한다.
MgSO4 0.01 N HCl
SM1 100 ㎖ 플라스크 50 ㎎ 100 ㎖까지 채움 자석식 교반
SM2 100 ㎖ 플라스크 80 ㎎ 100 ㎖까지 채움 자석식 교반
SM3 100 ㎖ 플라스크 130 ㎎ 100 ㎖까지 채움 자석식 교반
모액의 희석액을 조제한다.
SMx 0.01 N HCl
T1 100 ㎖ 플라스크 1 ㎖ 100 ㎖까지 채움
T2 100 ㎖ 플라스크 1 ㎖ 100 ㎖까지 채움
T3 100 ㎖ 플라스크 1 ㎖ 100 ㎖까지 채움
시료의 조제
상기 미립자 제제를 시료 채취 직전에 보르텍스로 완전히 진탕하고 자동 피펫으로 혼합한다.
중량과 희석 부피를 조절함으로써 1회 이상 희석을 수행하여, 1 ㎎/ℓ 내지 2.6 ㎎/ℓ 범위의 Mg2+ 예상 농도를 얻는다.
폴리머를 침전시키기 위하여 0.01 N HCl로 희석한다.
필요시 연속 희석을 수행한다.
삭제
상기 용액을 30 분 이상 자석식으로 교반한다.
상기 용액을 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨 다음, 플라스크에 옮긴다.
시료당 2회 조제를 수행한다.
4. 이온 크로마토그래피의 조건
주입 부피 25 ㎕
유량 1 ㎖/분
분석 시간 25 분
검출 전도도 ㎲/분
용리액 30 mM MSA
컬럼 온도 40℃
억제기 양이온
전류 87 ㎃
5. 결과의 처리
보정선의 측정
모든 대조군을 차례대로 고려하여 회귀선을 얻는다. 상관 계수는 >0.99이어야 한다.
상기 회귀선의 방정식은 다음과 같다.
Y = aX + b
상기 식 중, Y = 마그네슘 피크의 면적이고, X = 대조군 용액의 농도 (㎎/ℓ)이다.
시료 중의 마그네슘 이온 함량의 측정
Figure 112009001538853-pct00001
M = Mg2+ 함량 (g/ℓ)
Yassay = 분석 값에 대한 마그네슘 피크의 면적
a = 보정선의 기울기
b = 보정선의 원점에서의 세로 좌표
Vd = 희석 부피 (㎖)
Pc = 시료 중량 (㎎)
최종 결과는 2회 분석 값의 평균 값이다. 이온 크로마토그래피에서 일반적으로 허용되는 편차 계수는 10%이지만, 이는 상기 방법이 실증되면 확인된다.
반경 r의 산출
상기 프로토콜에 있어서, 본 발명의 발명자들은 마그네슘 함량의 측정을 설명하였다. 기타의 다원자가 양이온 (Ca2+, Zn2+, Al3+ 등)의 함량 T를 유사한 방법에 의하여 동일한 방식으로 측정한다.
이 방식으로는 오직 M의 값만이 측정된 바 있는데, 이를 사용하여 다원자가 이온의 몰농도 IM을 추론한다.
[IM] = M/M ion , 여기서 M ion 은 다원자가 이온의 분자량 (g/몰)이다.
이온성 중합체의 구조, 특히 이론적 중합도 DP, 이의 분자량 Mp 및 이의 소수성 그래프팅률 (즉, 소수성 그래프트에 의하여 개질되는 기의 분획 α H)를 알면, 중합체 농도 C (g/ℓ로 나타냄)에 대한 이온성기의 몰농도를 산출할 수 있다.
Figure 112009001538853-pct00002
이를 사용하여 r = n × [IM]/[GI]을 산출하는데, 여기서 n은 다원자가 이온의 원자가이다.
좋기로는, 본 발명에 따른 제제는 후술하는 D 검정법으로 측정한 미립자의 겉보기 중합체 밀도 dapp가 0.05 내지 1.0, 좋기로는 0.07 내지 0.7, 특히 좋기로는 0.1 내지 0.5인 것을 특징으로 한다.
겉보기 밀도 d app 를 측정하기 위한 D 검정법
중합체 PO의 농도가 C (㎎/g)인 미립자 현탁액을 자석식 교반에 의하여 균질화한다. 상기 미립자 현탁액 2 ㎖ 분취량을 미크로피펫으로 취하여 미리 칭량한 원심 분리관 중에 둔다. 이어서, 상기 원심 분리관 중에 넣은 미립자 현탁액을 칭량한다 (g으로 나타낸 질량 m). 상기 원심 분리관을 원심 분리기 중에 배치하고, 30 분간 8,000 rpm으로 회전시킨다. 그 결과 얻은 상청액을 적당한 마이크로피펫을 사용하여 정밀하게 제거한다. 이를 사용하여 침전물 V sed 의 부피 (㎖)를 산출한다.
V sed = V tot - V sur
겉보기 중합체 밀도 d app (g/㎤)는 다음의 식에 의하여 얻는다.
Figure 112009001538853-pct00003
AP가 들어 있는 미립자의 현탁액은, 특히 유익한 상기 AP (예컨대, 단백질 또는 펩티드)의 방출 시간의 지연 및 혈장 농도 피크의 저하를 일으킨다.
특히, 상기 AP의 방출 시간은 선행 기술의 제제, 특히 특허 출원 WO 05/051416에 기재되어 있는 것들의 방출 시간에 비하여 현저하게 증가된다. 본 발명에 따른 제제에 의하여 유도되는 생체내 AP의 방출 시간의 지연은 상기 AP (예컨대 치료용 단백질)가 여전히 완전하게 생활성 및 비변성이기 때문에 더 가치가 있다
따라서, 본 발명에 따른 유익한 기능성은 L 검정법으로 측정되는 소정의 AP의 방출 시간 Tr은 동일한 L 검정법으로 측정되는 다원자가 이온을 함유하지 않는 동일한 제제의 방출 시간 tr에 비하여 증가한 것이고, 이 증가는 Tr이 1.1 x tr 이상, 특히 좋기로는 Tr이 1.5 x tr 이상이 되도록 하는 것이다.
본 발명에 따른 미립자로부터의 AP의 방출을 측정하기 위한 L 검정법
흡수성 폴리프로필렌 재료를 2 x 2 ㎠로 잘라낸다.
물 200 ㎖ 중에 PBS 정제 (Aldrich) 1개를 용해시켜 PBS라고 부르는 인산염 완충액을 조제한다. 이에 의하여 인산염 완충제 0.01 M + 염화칼륨 0.0027 M 및 염화나트륨 0.137 M을 함유하는 용액 200 ㎖를 얻는다.
미리 조제한 PBS 294 g 중에 소 혈청 알부민, 분획 V (SAFC) 6 g을 용해시켜 소 알부민 30 ㎎/g을 함유하는 BSA라고 부르는 완충된 용액을 조제한다.
하나에는 PBS가 들어 있고, 나머지 하나에는 정사각형의 흡수재를 침지시키기 위한 BSA 용액이 들어 있는 2개의 50 ㎖ 팔콘 튜브 (FAlcon tube)를 냉장고에 보관한다.
이들 용액 4 또는 5 ㎖를 용량이 5 ㎖인 밀봉 튜브에 넣는다 (5개의 시료를 상기 각 2개의 매질에 공급한다). 이들을 냉장고에 보관한다.
15 시간의 기간 후, 연속상(連續相)을 함유하는 5 ㎖ 튜브를 먼저 37℃에서 1 시간 둔다.
상기 정사각형 흡수재를 37℃에서 한 시간 동안 PBS 중에서 5회, BSA 중에서 5회 (투여상의 문제가 있는 경우 그 이상) 흡수시킨다.
제제 0.5 ㎖를 27G 바늘 (1 ㎖ 주사기)을 사용하여 먼저 종이 위에서 가볍게 흡수시킨 각 정사각형 흡수재의 중앙부에 (표면에 평행하게) 투여한다.
투여된 쪽을 표시한다.
이 과정을 나중까지 상기 연속상 매질 중에 침지되지 않게 되는 10개의 정사각형 흡수재에 적용하여 모든 동태학(動態學)이 동시에 일어나도록 한다. 주입된 장소가 튜브의 상부 근처에 있도록 상기 정사각형 흡수재를 놓는다.
상기 시료를 홀더에 넣어 진탕하면서 모두 37℃의 오븐에 도입한다.
상기 진탕은 방출 속도에 크게 영향을 주므로 조절되어야 한다. 즉, 2개의 차폐봉 사이를 9 ㎝로 하여 진탕을 40회로 설정한다.
상기 연속상의 100 ㎕ 분취량을 상이한 시간에 취한다.
HPLC에 의한 단백질 분석
2개의 용리상(溶離相)을 사용한다.
- 상 A: 물 1260 ㎖ / 아세토니트릴 680 ㎖ / THF 60 ㎖ / TFA 1.8 ㎖
- 상 B: 아세토니트릴 630 ㎖ / 물 340 ㎖ / THF 30 ㎖ / TFA 0.8 ㎖
상기 HPLC 조건들을 아래의 표에 정렬한다.
기기 다음의 부속품이 장착된 아질렌트 (Agilent) 1100
- 냉각형 자동화 시료 체인저
- UV 및 FLD 검출기
- 자동화 적분기
컬럼 케이스톤 베타베이직 (Keystone BetaBasic)-18
- 4.6 x 150 mm
- 3 ㎛
- 개공 크기 150 Å
기울기 시간 (분) %A %B
0 100 0
15 50 50
35 10 90
36 100 0
40 100 0
분석 시간 40 분 (+ 주입간의 세척 20 분)
유량 1.5 ㎖/분
컬럼 온도 38℃
시료 온도 냉각시킴 (4℃)
투여량 100 ㎕
검출 280 nm에서 UV 흡수도:
- 296 nm (여기(勵起))
- 330 nm (방출)
이어서, 상기 연속상 매질 중의 단백질 농도를 시간에 따른 함수로서 그래프를 작성한다.
상기 후자가 플라토 (plateau)에 도달하는 경우, 방출된 단백질의 총량을 이 곡선으로부터 판독하는데, 시험을 유효하게 하기 위하여 그 값은 상기 개시점에서 도입되는 단백질의 40% 이상을 나타내어야 한다. 그 다음, 도입된 AP의 50% 방출에 필요한 시간 Tr을 이 곡선으로부터 판독한다.
한 가지 양호한 특성에 따르면, 본 발명에 따른 액체 약학 제제는 중합체 PO의 GI기의 극성과 극성이 반대인 염 함유 다원자가 이온, 좋기로는 2 원자가 이온을 중합체 PO의 나노입자 및 필요에 따라 AP로 이루어진 현탁액에 첨가함으로써 현탁액의 미립자를 수용성 액체 중에서 자발적으로 얻을 수 있다.
한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 제제는 PO의 미립자와 회합된 AP를 포함한다.
이 제제는 비경구 투여 가능하며, 상기 투여 조건하에서 액체라는 장점이 있다.
본 발명에 따르면, 설명어들인 "액체", "저점도" 또는 "극저점도"는 20℃에서 1,000 mPa.s 이하의 동력학적 점도에 유리하게 대응한다. 전단(剪斷) 기울기 1,000 s-1에 대하여 20℃에서 측정한 상기 제제의 동력학적 점도는 500 mPa.s 이하, 특히 좋기로는 2 내지 200 mPa.s, 예컨대 1.0 내지 100 mPa.s 또는 1.0 내지 50 mPa.s인 것이 좋다.
동태학적 점도의 측정
상기 동태학적 점도의 기준 측정은, 예컨대 20℃에서 콘 및 플레이트 (cone-and-plate geometry) (4 ㎝, 2°)를 갖춘 에이알1000 (AR1000) 유량계 (TA instruments)를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 점도 v를 1,000 s-1의 전단 응력에 대하여 측정한다.
이 저점도에 의하여 본 발명의 제제를 비경구 투여, 특히 점막, 근육내, 피하, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로에 의하여 또는 그 중에서도 특히 종양 내에 주사하는 것이 용이하게 된다.
본 발명에 따른 제제는 경구, 비강, 폐, 질, 안구 또는 구강 경로에 의하여도 역시 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 제제의 액체 상태 또는 저점도는 상온(常溫)에 대응하는 주사 온도, 예컨대 4 내지 30℃의 온도 및 생리학적 온도의 양온도에서 모두 존재한다.
본 발명에서 유용한 상기 중합체 PO는 소수성기 GH 및 이온성기 GI가 포함되어 있는 수용성의 생분해성 중합체이다. 상기 소수성기는 나머지 사슬에 비하여 그 수효가 감소될 수 있고, 상기 사슬에 측면 부착되거나 또는 상기 사슬 중에 삽입될 수 있으며, 무작위로 분배되거나 (랜덤형 공중합체), 연속형 또는 그래프트형 [블록 공중합체 또는 연쇄 (sequenced) 공중합체]으로 분배될 수 있다.
본 발명의 한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 소수성기 GH는 상기 사슬에 측면 부착된다.
어떤 제한을 두는 일이 없이, 상기 소수성으로 개질된 중합체 PO는 폴리아미노산, (폴리)펩티드, 젤라틴, 단백질, 좋기로는 풀룰란 또는 키토산 또는 무코폴리사카라이드 또는 덱스트란 또는 갈락토만난 또는 폴리히알루론산염으로 이루어지는 하위군으로부터 선택되는 폴리사카라이드 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, PO는 양이온성 (코)폴리아미노산으로부터 선택된다.
본 발명의 목적상, 본 명세서 전반에 걸쳐 상기 "폴리아미노산"이라는 용어는 10개 내지 20개의 "아미노산 잔기"를 포함하는 올리고아미노산 및 20개 이상의 "아미노산" 잔기를 포함하는 폴리아미노산과 결합된 천연 또는 합성 폴리아미노산을 포함한다.
본 발명에 있어서 유용한 폴리아미노산은 글루탐산 또는 아스파르트산 반복 잔기를 포함하는 올리고머 또는 호모폴리머, 또는 이들 두 가지 종류의 "아미노산" 잔기의 혼합물을 포함하는 공중합체가 좋다. 이들 중합체 중의 관련 잔기는 D, L 또는 D/L 배열을 나타내는 아미노산이고, 글루탐산 또는 글루탐산염 잔기의 경우에는 이들의 알파 또는 감마 위치를 통하여, 그리고 아스파르트산 또는 아스파르트산염 잔기의 경우에는 이들의 알파 또는 베타 위치를 통하여 결합된다.
폴리아미노산 주쇄의 양호한 "아미노산" 잔기는 상기 L 배열 및 알파형 결합을 가진 것들이다.
본 발명의 한 가지 특히 양호한 실시 상태에 있어서, PO는 아스파르트산 잔기 및/또는 글루탐산 잔기로 형성되는 폴리아미노산인데, 이들 잔기의 적어도 일부는 1종 이상의 소수성기 GH를 함유하는 그래프트를 수반한다. 이들 폴리아미노산은 특히 PCT 출원 WO-A-00/30618 중에 기재되어 있는 종류이다.
제1의 가능성에 따르면, 상기 제제의 PO는 아래의 화학식 (Ⅰ)에 의하여 정의된다.
[화학식 (Ⅰ)]
Figure 112009001538853-pct00004
상기 식 중에서,
■ R1은 H, 직쇄 C2 내지 C10 또는 분지쇄 C3 내지 C10 알킬, 벤질 라디칼, 아미노산의 말단 잔기, 또는 -R4-[GH]이고,
■ R2는 H, 직쇄 C2 내지 C10 또는 분지쇄 C3 내지 C10 아실기, 피로글루탐산염, 또는 -R4-[GH]이며,
■ R3은 H 또는 다음의 양이온, 즉
- 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 하위군으로부터 유리하게 선택되는 금속 양이온과,
- 다음의 양이온,
● 아민계 양이온과,
● 올리고아민계 양이온과,
● 폴리아민계 양이온 (폴리에틸렌이민이 특히 양호함)과,
● 리신 또는 아르기닌계 양이온류로부터 유리하게 선택되는 아미노산계 양이온
으로 이루어진 하위군으로부터 유리하게 선택되는 유기성 양이온과,
- 폴리리신 및 올리고리신으로 이루어진 하위군으로부터 유리하게 선택되는 양이온성 폴리아미노산
으로 이루어지는 군으로부터 양호하게 선택되는 양이온성 물질이고,
■ R4는 직접 결합 또는 1개 내지 4개의 아미노산 잔기계 "스페이서 (spacer)"이며,
■ A는 독립적으로 -CH2- 라디칼 또는 -CH2-CH2- 라디칼이고,
■ n/(n + m)은 몰 그래프팅률로서 정의되는데, 이 값은 pH = 7 및 25℃의 물에 용해된 PO에 대하여 충분히 낮으므로 PO의 준(準)미립자의 콜로이드 현탁액을 형성하고, n/(n + m)은, 좋기로는 1 내지 25 몰%, 특히 좋기로는 1 내지 15 몰%의 범위이며,
■ (n + m)은 중합도로서 정의되고 10 내지 1,000, 좋기로는 50 내지 300 범위에서 변화하고,
■ GH는 소수성기이다.
본 발명의 한 가지 양호한 실시 상태에 있어서, 상기 제제는 소수성기 GH는 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 토코페롤 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알코올 전구체로부터 유래되고, R4는 직접 결합인 것을 특징으로 한다.
제2의 가능성에 따르면, 상기 제제의 PO는 아래의 화학식 (Ⅱ), (Ⅲ) 및 (Ⅳ) 중의 한 가지로 나타낸다.
[화학식 (Ⅱ)]
Figure 112009001538853-pct00005
[화학식 (Ⅲ)]
Figure 112009001538853-pct00006
[화학식 (Ⅳ)]
Figure 112009001538853-pct00007
상기 각 식 중에서,
■ GH는 소수성기이고,
■ R30은 직쇄 C2 내지 C6 알킬기이며,
■ R3'는 H 또는 다음의 양이온, 즉
- 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어지는 하위군으로부터 유리하게 선택되는 금속 양이온과,
- 다음의 양이온, 즉
● 아민계 양이온과,
● 올리고아민계 양이온과,
● 폴리아민 (폴리에틸렌이민이 특히 양호함)계 양이온과,
● 리신계 또는 아르기닌계 양이온류로부터 유리하게 선택되는 아미노 산계 양이온
으로 이루어지는 하위군으로부터 유리하게 선택되는 유기성 양이온과,
- 폴리리신 및 올리고리신으로 이루어지는 하위군으로부터 유리하게 선택되는 아미노산계 양이온
으로 이루어지는 군으로부터 양호하게 선택되는 양이온성 물질이고,
■ R50은 C2 내지 C6 알킬기, 디알콕시기 또는 디아민기이며,
■ R4는 직접 결합 또는 1개 내지 4개의 아미노산 잔기에 기초한 "스페이서"이고,
■ A는 독립적으로 -CH2- 라디칼 또는 -CH2-CH2- 라디칼이며,
■ (n' + m') 및 n"는 중합도로서 정의되는데, 10 내지 1,000, 좋기로는 50 내지 300 범위에서 변화한다.
상기 PO의 n개의 GH기는 각각 서로 독립적으로 다음의 화학식으로 나타내는 단원자가 라디칼인 것이 유리하다.
[화학식 (GH)]
Figure 112009001538853-pct00008
상기 식 중에서,
- R5는 메틸 (알라닌), 이소프로필 (발린), 이소부틸 (류신), sec-부틸 (이소류신) 또는 벤질 (페닐알라닌) 라디칼이고,
- R6은 6개 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 소수성 라디칼이며,
- l은 0 내지 6의 범위에서 변화한다.
본 발명의 한 가지 현저한 특징에 따르면, 상기 PO의 소수성기 R6의 전부 또는 일부는 다음의 라디칼, 즉
■ 6개 내지 30개의 탄소 원자를 포함하고, 1종 이상의 헤테로 원자 (좋기로는 O, N 또는 S) 또는 1종 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 알콕시 라디칼과,
■ 6개 내지 30개의 탄소 원자를 포함하고, 1개 이상의 융합 탄소환 (carbocyclic) 고리가 결합되어 있으며, 1종 이상의 불포화 단위 또는 1종 이상의 헤테로 원자 (좋기로는 O, N 또는 S)를 임의로 함유하는 알콕시와,
■ 7개 내지 30개의 탄소 원자를 포함하고, 1종 이상의 불포화 단위 또는 1종 이상의 헤테로 원자 (좋기로는 O, N 또는 S)를 함유할 수 있는 알콕시아릴 또는 아릴옥시알킬 라디칼
로 이루어지는 라디칼군으로부터 독립적으로 선택된다.
실제로, 그리고 어떠한 제한을 두는 일이 없이, 상기 PO의 그래프트의 소수성 라디칼 R6은 옥탄올, 도데칸올, 테트라데칸올, 헥사데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 토코페롤 및 콜레스테롤로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알코올 전구체로부터 유도된다.
유리하기로는, 상기 폴리아미노산의 주쇄는,
▶ 알파-L-글루탐산염 또는 알파-L-글루탐산 호모 중합체,
▶ 알파-L-아스파르트산염 또는 알파-L-아스파르트산 호모 중합체, 또는
▶ 알파-L-아스파르트산염/알파-L-글루탐산염 또는 알파-L-아스파르트산/알파-L-글루탐산 공중합체이다.
상기 PO의 폴리아미노산 주쇄의 아스파르트산 및/또는 글루탐산 잔기의 분포는 그 결과 생성되는 중합체가 랜덤형 또는 블록형 또는 멀티블록형 중의 어느 하나가 되도록 한다는 사실이 현저하다.
또 다른 정의에 따르면, 본 발명에 따른 제제 중에 사용되는 PO의 분자량은 2,000 내지 100,000 g/몰 범위, 좋기로는 5,000 내지 40,000 g/몰 범위이다.
한 가지 변형예에 있어서, 본 발명에 따른 제제의 PO는 글루탐산염 및/또는 아스파르트산염 잔기에 결합된 폴리알킬렌 글리콜류의 1종 이상의 그래프트를 포함한다.
상기 폴리알킬렌 글리콜류의 그래프트는 다음의 화학식 (Ⅴ)을 가진 것이 유리하다.
[화학식 (Ⅴ)]
Figure 112009001538853-pct00009
상기 식 중에서,
- R'4는 직접 결합 또는 1 내지 4 아미노산 잔기계 "스페이서"이고,
- X는 산소, 질소 및 황으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자이며,
- R7 및 R8은 독립적으로 H 또는 직쇄 C1 내지 C4 알킬이고,
- n'''은 10 내지 1,000, 좋기로는 50 내지 300 범위에서 변화한다.
실제로, 상기 폴리알킬렌 글리콜은, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜이다.
본 발명에 따르면, 상기 폴리알킬렌 글리콜 그래프팅의 몰백분율은 1 내지 30% 범위에서 변화하는 것이 좋다.
상기 폴리아미노산 PO는 조절 가능한 그래프팅률에 의하여, 이들은 pH 7.4의 물 중에 (예를 들어, 인산 완충액가 들어있는) 분산되어 콜로이드 현탁액을 생성한다는 점에서 역시 매우 가치가 있다.
나아가, 단백질, 펩티드 또는 소형 분자 등의 일부 AP는 이들 아미노산 PO를 포함하고 있는 나노입자와 자발적으로 결합할 수 있다.
상기 PO는 pH 및 조성에 따라, 중성 (예컨대 COOH) 또는 이온형 (예컨대 COO-) 중의 어느 한 가지인 이온성기를 함유한다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 이유 때문에, 수성상 중의 용해도는 이온화기들의 비율의 직접 함수, 따라서 pH의 직접 함수이다. 수용액 중에서, 카르복실기의 경우, 짝이온은 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘 등의 금속 양이온 또는 트리에탄올아민, 트리스-(히드록시메틸)아미노메탄 또는 폴리에틸렌이민과 같은 폴리아민 등의 유기성 양이온일 수 있다.
본 발명의 제제 중에 사용될 수 있는 폴리아미노산류의 PO는, 예컨대 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 방법에 의하여 얻는다. 랜덤형 폴리아미노산은 상기 "스페이서"로 미리 기능성화시킨 소수성 그래프트를 일반적인 커플링 반응에 의하여 상기 중합체 표면에 직접 그래프트시킴으로써 얻을 수 있다. 블록 또는 멀티블록 폴리아미노산 PO는 대응하는 아미노산 N-카르복시 무수물 (NCA)의 순차 중합 반응에 의하여 얻을 수 있다.
예를 들면, 호모폴리글르탐산염 또는 호모폴리아스파르트산염 폴리아미노산 또는 블록, 멀티블록 또는 랜덤형 글루탐산염/아스파르트산염 공중합체는 통상의 일반적인 방법에 의하여 제조할 수 있다.
알파형 폴리아미노산을 얻으려면, 가장 보편적인 기술은, 예컨대 문헌 ["Biopolymers" 1976, 15, 1869] 및 크리첼도르프 (H.R. Kricheldorf)에 의한 문헌 ["Alpha-amino acid N-carboxy anhydride and related heterocycles" Springer Verlag (1987)]에 기재되어 있는 아미노산 N-카르복시 무수물 (NCA)의 중합법에 기초하는 것이다. 상기 NCA 유도체는 NCA-O-Me, NCA-O-Et 또는 NCA-O-Bz 유도체 (Me = 메틸, Et = 에틸 및 Bz = 벤질)인 것이 좋다. 이어서, 상기 중합체를 적절한 조건하에서 가수 분해하여 산 형태의 중합체를 얻는다. 이들 방법은 본 발명의 출원인에게 허여된 특허 FR-A-2 801 226의 명세서에 기초하는 것이다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다수의 중합체, 예컨대 각종 분자량의 폴리(알파-L-아스파르트산), 폴리(알파-L-글루탐산), 폴리(알파-D-글루탐산) 및 폴리(감마-L-글루탐산)은 시판되고 있다. 상기 알파-베타형의 폴리아스파르틱 중합체는 아스파르트산을 축합 반응 (폴리숙신이미드를 얻음)시킨 다음, 염기성 가수 분해를 행하여 얻는다 (Tomida et al., Polymer, 1997, 38, 4733-36 참조).
상기 그래프트의 상기 중합체의 산성기와의 커플링은 커플링제인 카르보디이미드와 필요에 따라 촉매인 4-디메틸아미노피리딘 등의 존재하에 상기 폴리아미노산을 디메틸포름아미드 (DMF), N-메틸피롤리돈 (NMP) 또는 디메틸 술폭시드 (DMSO) 등의 적절한 용매 중에서 반응시킴으로써 용이하게 수행된다. 상기 카르보디이미드는, 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 또는 디이소프로필카르보디이미드이다. 상기 그래프팅률은 구성 성분 및 반응물의 화학 반응량론 또는 반응 시간에 의하여 화학적으로 조절된다. 상기 "스페이서"로 기능화시킨 소수성 그래프트는 일반적인 펩티드 커플링 또는 산촉매하에서의 직접 중합에 의하여 얻는다. 이들 기술은 이 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다.
블록 또는 멀티블록 공중합체는 상기 소수성 그래프트로 미리 합성한 NCA 유도체를 사용하여 합성된다. 예를 들면, 상기 소수성 NCA 유도체는 NCA-O-Bz로 공중합시킨 다음, 가수 분해에 의하여 벤질 라디칼을 선택적으로 제거한다.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따른 1종 이상의 AP를 함유하는 제제는 수용성 액체 매질 중에서 PO 및 1종 이상의 AP를 기제로 하는 나노입자들의 비공유 회합으로부터 얻는다.
상기 제제의 목적상, 상기 PO 또는 AP는 고체형 (좋기로는, 분말) 또는 액체형 (좋기로는, 콜로이드 수용성 현탁액)일 수 있다.
본 발명의 관점에 있어서, AP/PO 회합은 공유 화학 결합 이외의 1종 이상의 회합에 의하여 AP가 중합체 PO (예컨대, 1종 이상의 폴리이미노산)에 회합하는 것을 의미한다.
본 발명에 따라 1종 이상의 AP를 PO와 회합시키기 위한 기술은, 특히 특허 출원 WO-A-00/30618에 기재되어 있다. 이 기술은 1종 이상의 AP를 PO의 나노입자가 함유되어 있는 액체 매질 중에 혼합시켜서 1종 이상의 AP가 함유 또는 회합된 나노입자의 콜로이드 현탁액을 얻는 것으로 구성된다.
본 발명의 목적상, 상기 "다원자가 이온"이라는 용어는 2 원자가 이온, 3 원자가 이온, 4 원자가 이온 및 이들 이온의 혼합물을 나타낸다.
PO가 음이온성 GI기를 함유하는 경우, 상기 다원자가 이온은 다원자가 양이온, 좋기로는 2 원자가 양이온, 특히 좋기로는 Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것 및/또는 3 원자가 양이온, 특히 좋기로는 Al3+, Fe3+ 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
다원자가 이온들과는 달리, 본 발명에 따른 제제는 나노입자가 응집하여 미립자로 되는 경우에 활성일 수 있는 단원자가 이온 (예컨대, 양이온)을 함유할 수 있다.
이들 다원자가 이온은 본 발명의 제제에 (유기 또는 무기) 염 수용액, 예컨대 다원자가 양이온의 황산염, 염화물, 아세트산염, 글루콘산염 또는 글루탐산염 (또는 기타의 음이온성 아미노산)의 용액 형태로 도입되는 것이 좋다.
안정성을 향상시키기 위하여, 상기 제제는,
→ 소수성기 (GH)와 최소한 부분적으로 이온화하는 이온성 친수성기 (GI)가 결합되어 있는 수용성의 생분해성 양이온성 공중합체이고, pH=7 및 등장 조건하에서 나노입자의 수용성 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성하는 1종 이상의 중합체 PO의 나노입자와,
→ 폴리알킬렌 글리콜, 좋기로는 폴리에틸렌 글리콜과,
→ 코폴리알킬렌 글리콜, 좋기로는 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 [폴록사머형, 플루로닉 (Pluronic)형 또는 루트롤 (Lutrol)형의] 공중합체와,
→ 셀룰로오스 중합체와 이들의 유도체, 좋기로는 카르복시알킬 셀룰로오스 (예컨대, 카르복시메틸 셀룰로오스) 또는 알킬 셀룰로오스 (예컨대, 메틸 셀룰로오스)와,
→ 소르비탄과 1종 이상의 지방산의 에스테르, 좋기로는 폴리옥시알킬렌 (예컨대, 폴리옥시에틸렌) 글리콜과 1종 이상의 산 (예컨대, 올레산)의 트윈 (Tween)형 또는 폴리소르브산염형 에스테르와,
→ 인지질계 계면 활성제와 폴리알킬렌 글리콜, 좋기로는 폴리에틸렌 글리콜과,
→ 트레할로스, 소르비톨, 만니톨 또는 수크로스 등의 수소화 또는 비수소화 사카라이드와,
→ 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤 등의 폴리올과,
→ 젤라틴, 좋기로는 가수 분해된 젤라틴과,
→ 좋기로는 폴리아크릴아미드, 폴리-N-비닐아미드, 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 및 폴리-N-비닐락탐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질소 함유 (공)중합체와,
→ 폴리비닐 알코올 (PVA)과,
→ 이들의 혼합물
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 안정화제를 포함하는 것이 좋다.
본 발명에 따른 양호한 안정화제 중의 한 가지는 상기 미립자를 구성하는 중합체와 (좋기로는) 동일하거나 상이한 1종 이상의 중합체 PO의 나노입자로 구성된다.
상기 제제 중에 사용되는 안정화제의 양은, 좋기로는 0.01 내지 10 중량% 범위, 특히 좋기로는 0.1 내지 5 중량% 범위이다.
나노입자를 함유하는 안정화제에 관하여, 이들 안정화제는 상기 제제 중에 1.5 내지 3.5 중량%, 예컨대 2.0 내지 3.0 중량% (≒ 2.5 중량%)의 양으로 유리하게 사용된다.
상기 AP가 관련되어 있는 한, 이는 좋기로는 단백질, 글리코단백질, 1종 이상의 폴리알킬렌 글리콜 사슬 [좋기로는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 사슬: "PEG화 단백질"]에 결합된 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 리포사카라이드, 올리고누클레오티드, 폴리누클레오티드 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군, 특히 좋기로는 에리트로포이에틴, 옥시토신, 바소프레신, 부신 피질 자극 호르몬, 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 조혈 자극 인자와 이들의 혼합물, 인자 Ⅷ과 Ⅸ, 헤모글로빈, 시토크롬, 프로락틴, 알부민, 황체 형성 호르몬 분비 호르몬 (LHRH), LHRH 길항제, LHRH 경합체, 인간, 돼지 또는 소 성장 호르몬 (GH), 성장 호르몬 방출 인자, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터류킨 또는 이들의 혼합물 (IL-2, IL-11, IL-12), α-, β- 또는 γ-인터페론, 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 우로가스트린, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도몰핀류, 안지오텐신류, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 종양 괴사 인자 (TNF), 신경 성장 인자 (NGF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식 세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 대식 세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 헤파린 분해 효소, 골형성 단백질 (BMP), hANP, 글루카곤 유사 펩티드 (GLP-1), VEG-F, B형 간염 표면 항원 (rHBsAg), 레닌, 사이토카인류, 브라디키닌, 바시트라신류, 폴리믹신류, 콜리스틴류, 티로시딘, 그라미시딘류, 시클로스포린류와 합성 유사체 및 효소류, 사이토카인류, 항체류, 항원류와 백신류의 약학적 활성 변형체 및 분획으로 이루어지는 하위군으로부터 선택된다.
한 가지 변형예에 있어서, 상기 AP는 류프롤리드 또는 시클로스포린과 이들의 혼합물 등의, 안트라시클린계, 탁소이드계 또는 캄프토테신계에 속하거나, 또는 펩티드계에 속하는 종류의 "소형"의 소수성, 친수성 또는 양친매성 유기 분자이다.
본 발명의 관점에 있어서, "소형" 분자는, 특히 소형의 비단백질 분자, 예컨대 아미노산이 없는 소형 단백질이다.
또 다른 변형예에 있어서, 상기 AP는 다음의 활성 물질, 즉 알코올 남용 치료제, 알츠하이머 질병 치료제, 마취제, 말단 거대증 치료제, 진통제, 항천식제, 알러지 치료제, 항암제, 소염제, 항응고제와 항혈전제, 항경련제, 항간질제, 당뇨병 치료제, 항구토제, 항녹내장제, 항히스타민제, 항감염제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 항콜린제, 진해제, 탄산 탈수 효소 억제제, 심혈관 제제, 지방혈 저하제, 항부정맥제, 혈관 확장제, 항협심증제, 항고혈압제, 혈관 보호제 (vasoprotector), 콜린에스테라제 억제제, 중추 신경 장애 치료제, 중추 신경계 자극제, 피임제, 가임 촉진제, 분만 유도제와 분만 억제제, 점액성 점착증 치료제, 도파민 수용체 작용제, 자궁 내막증 치료제, 발기 부전증 치료제, 생식 능력 치료제, 위장 장애 치료제, 면역 조절 물질, 면역 억제 물질, 기억 장애 치료제, 항편두통제, 근육 이완제, 뉴클레오시드 유사체, 골다공증 치료제, 부교감 흥분제, 프로스타글란딘, 정신 치료제, 진정제, 수면제와 신경 안정제, 신경 이완제, 항불안제, 정신 자극제, 항우울제, 피부 질환 치료제, 스테로이드와 호르몬, 암페타민, 식욕 억제제, 비마취성 진통제, 항간질제, 바르비튜르산염, 벤조디아제핀, 최면제, 설사제, 향정신제 및 이들 제제의 임의의 조합 중의 한 가지 이상으로부터 유리하게 선택된다.
정량적 관점에서 보면, 미립자와 회합되지 않은 AP [비회합 AP]의 중량 비율 (%)이
- [비회합 AP] ≤ 1,
- 좋기로는, [비회합 AP] ≤ 0.5
인 경우에 특히 가치가 있다.
한 가지 변형예에 있어서, 상기 AP는 투여량이, 예컨대 0.2 내지 2 ㎎/㎏, 좋기로는 0.5 내지 1 ㎎/㎏ 범위인 재조합 인간 성장 호르몬 hGH이어도 좋다.
또 다른 변형예에 있어서, 상기 AP는 투여량이, 예컨대 0.2 내지 2 UI/㎏, 좋기로는 0.5 내지 1 UI/㎏ 범위인 인슐린이어도 좋다.
또 다른 변형예에 있어서, 상기 AP는 투여량이, 예컨대 20 내지 100 ㎍/㎏, 좋기로는 40 내지 80 ㎍/㎏ 범위인 인터페론 α-2b이어도 좋다.
유리하기로는, 본 발명에 따른 제제는, 특히 비경구, 점막, 피하, 근육내, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로 또는 종양내, 또는 경구, 비강, 폐, 질 또는 안구 경로에 의하여 투여하기 위한 약물 제조용으로 사용하려는 것이다.
이의 또 다른 특성에 따르면, 본 발명은 전술한 제제의 제조 방법에 관련되어 있다.
상기 제제의 제조 방법은 다음의 공정, 즉
a. 1종 이상의 PO의 나노입자의 콜로이드 현탁액을 마련하거나 조제하는 공정과,
b. 상기 PO의 나노입자의 콜로이드 현탁액을, 좋기로는 수용액 상태인 1종 이상의 AP와 임의로 혼합하는 공정과,
c. 그 결과 얻은 현탁액을 임의로 여과하는 공정과,
d. 상기 중합체 PO의 GI기의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온 [좋기로는, 염의 형태]을 아래의 식에 의하여 정의되는 비율 r가 0.3 내지 10, 좋기로는 0.6 내지 5.0, 특히 좋기로는 0.80 내지 3.0이 되도록 하는 양으로 첨가하는 공정과,
r = n × [IM]/[GI]
(상기 식 중에서,
- n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
- [IM]은 상기 다원자가 이온의 몰농도이며,
- [GI]는 상기 이온성기 GI의 몰농도이다.)
e. 필요한 경우, pH 또는 오스몰 농도를 (예컨대, 여과 작용에 의하여) 조정하는 공정
으로 본질적으로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 액체 제제는 실온 (예컨대 25℃)에서 제조되는 것이 유리하다.
AP의 미립자와의 상이한 회합 방식을 예상할 수 있다 (전술한 내용 참조). AP는 응집에 의하여 미립자를 형성시키기 위한 나노입자와 회합하는 것이 유리하다. AP를 상기 미립자와 직접 회합시키는 것도 역시 가능하다. 상기 두 가지 회합 방법을 조합시킬 수 있다.
나노입자 또는 미립자와의 회합시키려면, 상기 AP는 PO의 나노입자 또는 미립자의 콜로이드 현탁액과 혼합시키기 위한 수용성 현탁액형 또는 용액형인 것이 유리하다. 한 가지 변형예에 있어서, 상기 AP는 고체형으로 혼합시킨 후에, 나노입자 또는 미립자의 현탁액과 혼합시킬 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 제제 중에 함유되어 있는 PO의 나노입자 및 미립자로부터 유도되는 고체 생성물과 더 관련되어 있다.
실제로, 이들 유도된 생성물은, 그 중에서도 분말, 겔, 임플란트 또는 필름으로 특히 구성될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 제제의 제조 방법에 상관 없이, 그와 같이 행하는 본 발명의 제제로부터 유도되는 유도 생성물에 관한 것이다. 그러므로, 이들 유도된 생성물은 액체형이 아닌 것과 중합체 (PO)의 미립자를 포함하고,
ⅰ. 상기 중합체 (PO)는
● 소수성기 (GH)와 이온성 친수성기 (GI)가 결합되어 있는 수용성의 생분해성 및 양친매성 공중합체이고,
● pH = 7.0 및 등장 조건하에 나노입자의 수용성 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성하며,
ⅱ. 상기 입자는 pH = 7.0 및 등장 조건하에 1종 이상의 AP와 자발적이고 비공유적으로 회합할 수 있고, 이들 PO의 미립자의 T 검정법으로 측정된 입도는 0.5 내지 100 ㎛, 좋기로는 1 내지 70 ㎛, 특히 좋기로는 2 내지 40 ㎛이고, 상기 PO는 그 중합체의 GI기의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온, 좋기로는 2 원자가 이온의 유도체를 함유하며, 아래의 식에 의하여 정의되는 비율 r는 0.3 내지 10, 좋기로는 0.6 내지 5.0, 특히 좋기로는 0.8 내지 3.0의 범위인 것을 특징으로 한다.
r = n × [IM]/[GI]
상기 식 중에서,
- n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
- [IM]은 상기 다원자가 이온의 몰농도이며,
- [GI]는 상기 이온성기 GI의 몰농도이다.
이 유도 생성물은, 예컨대 분말 또는 겔로 구성될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 제제의 제조 결과 얻은 중간체인 본 발명의 제제로부터 유도되는 이들 생성물에도 역시 관련된다. 그러므로, 본 발명은 적어도 1종의 이들 유도 생성물의 제조 방법에도 역시 관련되어 있다. 이 방법은 미립자의 현탁액을 건조시켜 고체형, 좋기로는 저장 또는 투여될 수 있는 미립자의 분말을 얻는 공정을 본질적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
그러한 유도 생성물은 본 발명에 따른 제제의 또 다른 제조 방법에 대한 접근을 제공한다. 이 방법에 따른 공정은 다음의 공정, 즉
◆ 전술한 방법에 의하여 얻은 1종 이상의 유도 생성물을 마련하는 공정과,
◆ 상기 유도 생성물을 재구성수 또는 재구성 수용액 S와 혼합하는 공정
을 본질적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
후자의 경우에 있어서, 상기 액체형 약학 제제는 고체형인 상기 유래된 생성물 (예컨대, 분말)을 주사 전에 재구성수 또는 재구성 수용액 S와 혼합함으로써 사용 직전에 재구성된다.
예를 들면, S는 수용액을 포함할 수 있는데, 단순히 주사제 용수이어도 좋다.
그 밖에, S는 다음의 성분을 임의로 함유한다.
- 상기 용액의 pH 조정을 가능하게 하는, 예컨대 농도가 0.001 M 내지 0.1 M, 좋기로는 0.005 M 내지 0.02 M인 1종 이상의 완충제 또는 1종 이상의 주사용 염 (인산염 완충제, 시트르산염 완충제, 염화나트륨)과,
- 예컨대, 농도가 0.01% 내지 2%, 좋기로는 0.05% 내지 0.5%인, 좋기로는 Tween®20 또는 Tween®80 등의 폴리소르베이트형, 또는 Lutrol®F38, Lutrol®F68 또는 Lutrol®F127 등의 폴록사머형의 1종 이상의 주사형 계면 활성제.
S는 사카라이드, 즉 수크로스, D-만니톨 또는 트레할로스 등의 밀도 증가제도 역시 0.1% 내지 10%, 좋기로는 0.5% 내지 5%의 농도로 함유한다. 상기 재구성 용액은 폴리사카라이드, 합성 중합체 (예컨대, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 주사 가능한 증점 (增粘; viscosifying) 중합체도 역시 함유할 수 있다.
전반적으로, 본 발명에 따른 제제에 첨가될 수 있는 부형제의 예로서는 이 기술 분야의 숙련자에게 알려져 있는 항균제, 완충제, 항산화제 및 등장력 조정제가 있다. 예컨대, 문헌 [Injectable Drug Development, P.K. Gupta et al., Interpharm Press, Denver, Colorado, 1999]을 참고할 수 있다.
본 발명에 따르면, 통공(通孔)이 예컨대 0.2 ㎛인 여과 장치에서 본 발명의 제제의 미립자를 발생시키는 나노입자의 액체 현탁액을 멸균 여과하기 위한 대책을 마련하는 것을 생각해 볼 수 있다. 따라서, 전술한 제조 방식에 따른 멸균 조건하에서의 응집에 의하여 상기 제제를 환자에게 직접 주사하는 것이 가능하게 된다.
본 발명에 따른 제제의 일차적인 특성에는 동일한 pH, 동일한 단백질 농도 및 동일한 중합체 농도로 투여한 동일한 중합체의 나노입자의 콜로이드 현탁액에 의하여 얻은 것보다 더 장기간에 결쳐 AP를 방출시킬 수 있는 능력이 포함된다.
본 발명은, 특히 비경구, 점막, 피하, 근육내, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로 또는 종양내, 또는 경구, 비강, 폐, 질 또는 안구 경로에 의하여 투여하기 위한 약물의 제조 방법에도 역시 관련되고, 전술한 제제를 그 자체로, 또는 전술한 방법에 의하여 얻은 제제, 또는 상기 제제로부터 유도된 임의의 생성물, 또는 상기 제제의 임의의 전구체를 사용하는 것을 본질적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제제는 약학 제제인 것이 좋지만, 이는 전술한 1종 이상의 PO와 1종 이상의 AP를 함유하는 화장품, 식품 또는 식물 검역 제제를 배제하는 것은 아니다.
본 발명은 본 명세서에 기재되어 있는 제제를 비경구, 점막, 피하, 근육내, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로 또는 종양 내에, 또는 경구, 비강, 폐, 질 또는 안구 경로에 의하여 투여하는 것을 본질적으로 포함하는 치료 방법에도 역시 관련된다.
본 발명의 한 가지 특정의 변형예에 있어서, 이 치료 방법은 비경구, 점막, 피하, 근육내, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로 또는 종양내에, 좋기로는 주사 부위에 디포우 (depot)를 형성하도록 하는 방식으로 주사함에 의하여 전술한 제제를 투여하는 것을 포함한다.
이하의 각 실시예에서는 소수성기에 의하여 그래프트된 폴리아미노산으로 형성된 PO의 합성과 이들의 AP, 즉 본 발명에 따른 제제 (안정한 수용성 콜로이드 현탁액)의 지연 방출계로의 전환을 설명하고, 그러한 지연 방출계의 치료용 단백질과의 회합능 뿐만 아니라 특히 생체내에서 매우 지연된 방식으로 상기 치료용 단백질을 방출하기 위한 겔 형성능/가교 결합능을 설명하고 있는데, 이들 실시예로부터 본 발명이 더 분명하게 이해되고, 본 발명의 장점들과 변형들이 명백하게 드러나게 될 것이다.
첨부 도면은 인간 성장 호르몬이 PO의 나노입자 [■ 나노입자 23 ㎎/g]에 포함되어 있는지, 또는 실시예 8에 따라 조제된 PO의 미립자 [◆ 미립자 73 ㎎/g]에 포함되어 있는지에 따라, L 검정법에 있어서의 시간 [분]에 따른 인간 성장 호르몬 [hGH; 총투여 농도에 대한 %]의 방출을 나타내는 곡선이다.
실시예 1: 양친매성 중합체 PO
합성 공급원의 알파-토코페롤에 의하여 그래프트된 폴리글루탐산염의 합성
알파-L-폴리글루탐산 (분자량은 폴리옥시에틸렌 표준품에 대응하여 약 16,900 Da에 동등하고, 특허 출원 FR-A-2 801 226에 기재되어 있는 바와 같이 NCAGluOMe의 중합 반응과 후속되는 가수 분해 반응에 의하여 얻음) 15 g을 상기 중합체가 용해될 때까지 80℃에서 가열하여 디메틸포름아미드 (DMF) 288 ㎖ 중에 용해시킨다. 용액을 15℃로 냉각시키고, DMF 8 ㎖ 중에 미리 용해시킨 D,L-알파-토코페롤 (>98%, 플루카 (Fluka®)로부터 구득 2.5 g), DMF 1 ㎖ 중에 미리 용해시킨 4-디메틸아미노피리딘 280 ㎎ 및 DMF 6 ㎖ 중에 미리 용해시킨 디이소프로필카르보디이미드 1.6 g을 순서대로 가한다. 3 시간 교반 후, 반응 매질을 15% 염화나트륨과 염산 (pH=2)을 함유하는 물 1200 ㎖ 중에 주가한다. 이어서, 침전된 중합체를 여과에 의하여 회수하고, 0.1 N 염산, 물 및 디이소프로필 에테르로 세척한다. 이어서, 상기 중합체를 40℃의 진공 오븐 중에서 건조하여 약 90%의 수율을 얻는다. 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 측정된 분자량은 폴리옥시에틸렌 표준품에 비하여 15,500이다. 양성자 NMR 분광법에 의하여 평가한 그래프트된 토코페롤의 비율은 5.1 몰%이다. 중합체를 물에 용해시키고 pH를 7±1로 조정 (카르복시산염의 중화 반응)하여 중합체의 나노입자의 수용성 현탁액을 얻는다.
실시예 2: hGH가 함유되어 있는 중합체 PO의 나노입자의 콜로이드 현탁액 100 g의 조제
2.1 양친매성 중합체 PO 의 콜로이드 용액의 조제
상기 중합체를 용액 상태로 철야 정치하여 30℃의 일정 온도에 도달하도록 한다.
실시예 1의 중합체 PO 35.3 g을 칭량한다.
주사용 멸균수 26.65 g으로 희석시킨다 (중합체 (PO)의 농도를 28.4 ㎎/g으로 하기 위한 것임) .
상기 중합체 용액을 자석식으로 교반한다.
5.13 M NaCl 수용액 (30% w/w) 1.89 g을 투입하여 상기 용액의 오스몰 농도를 300±20 mOsm으로 조정한다.
1 N NaOH 용액 0.38 g을 가하여 pH를 7.4±0.2로 조정한다.
15.61 ㎎/g을 함유하는 중합체 용액 64.22 g을 얻는다.
2.2 단백질의 중합체와의 회합
hGH라고 부르는 재조합 인간 성장 호르몬의 용액을 25℃에서 90 분간 해동시킨다.
이어서, hGH 용액 (농축시킨 것, 3.9 ㎎/g) 35.92 g을 미리 준비한 중합체의 콜로이드 용액 64.15 g에 교반하면서 가한다.
상기 단백질이 들어 있는 용액을 실온에서 2 시간 숙성시킨다.
이어서, 상기 용액을 0.8~0.2 ㎛ 여과 장치에 통과시키고 철야 숙성시킨다.
hGH 1.4 ㎎/g 및 상기 PO형의 중합체 10 ㎎/g을 함유하는 즉시 주사형 (ready-to-inject) 제제 100 g을 얻는다.
실시예 3: MgCl 2 를 사용하는 미립자 현탁액의 조제
상기 현탁액은, pH와 오스몰 농도가 조정되고 실시예 2에 따라 조제된 PO 10.0 ㎎/g을 함유하는 용액으로부터 조제된다.
a) 전달량이 약 20 ㎖/시간인 작동 제어형 주사기를 사용한 1 M MgCl2 용액의 교반 첨가에 의한 상기 용액의 응집 (설정 번호 9). 이 경우, 양이온 첨가의 특징을 나타내는 비율,
r = 2 × [Mg 2+ ]/[Glu]
는 3.36과 같다. PO 8.51 ㎎/g을 함유하는 용액을 얻는다.
b) 2,500 rpm으로 25 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 646 mOsm이다.
c) 잔사의 멸균수 (부피는 최초 용액의 1/8)에 의한 세척 및 2,500 rpm으로 10 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 350 mOsm이다.
d) 2,500 rpm으로 10 분간 원심 분리.
이 제제의 특징은 다음과 같다.
pH 6.64
오스몰 농도 349 mOsm
[PO] 50.77 ㎎/g
입경 D50 (T1 검정법에 의함) 20 ㎛
실시예 4: CaCl 2 및 pH 저하에 의하여 생성된 미립자 현탁액의 조제
현탁액은 최종 특성이 hGH 1.2 ㎎/g 및 PO 25.9 ㎎/g인 실시예 2에 따라 조제된 용액으로부터 조제된다.
a) 0.1 N HCl의 교반 (600 rpm) 첨가에 의한 전달량이 약 70 ㎖/시간인 작동 제어형 주사기를 사용한 상기 최초 제제의 pH = 5.52로의 조정.
b) 1 M CaCl2 용액의 교반 (600 rpm) 첨가에 의한 전달량이 약 39 ㎖/h인 작동 제어형 주사기를 사용한 상기 용액의 응집. 이 경우, 양이온 첨가의 특징을 나타내는 비율,
r = 2 × [Ca 2+ ]/[Glu]
는 1.68과 같다.
c) 2,500 rpm으로 8 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 pH는 4.73이고, 오스몰 농도는 653 mOsm이다.
d) 잔사의 밀리큐 (MilliQ) 물 (부피는 최초 용액의 1/8)에 의한 세척 및 2,500 rpm으로 4 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 pH는 4.72이고, 오스몰 농도는 378 mOsm이다.
e) 농축 현탁액을 얻기 위한 2,500 rpm, 4 분간의 원심 분리에 의한 상기 잔사의 농축.
얻은 제제의 특징은 다음과 같다.
pH 4.88
오스몰 농도 386 mOsm
[PO] 122.88 ㎎/g
[hGH] 4.9 ㎎/g
입경 D50 (T1 검정법에 의함) 23 ㎛
실시예 5: CaCl 2 에 의하여 생성된 미립자 현탁액의 조제
현탁액은 최종 특성이 hGH 1.2 ㎎/g 및 PO 26.01 ㎎/g인 실시예 2에 따라 조제된 용액으로부터 조제된다.
a) 비율 r가 3.36이 될 때까지 전달량이 약 40.3 ㎖/시간인 작동 제어형 주사기를 사용한 1 M CaCl2 용액의 교반 (600 rpm) 첨가에 의한 최초 제제의 응집. 이에 의하여 hGH 0.93 ㎎/g 및 PO 20.28 ㎎/g을 함유하는 제제를 얻는다.
b) 2,500 rpm으로 4 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 pH는 6.34이고, 오스몰 농도는 832 mOsm이다.
c) 잔사의 밀리큐 물 (부피는 최초 용액의 1/3)에 의한 세척 및 2,500 rpm으로 8 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 pH는 6.56이고, 오스몰 농도는 334 mOsm이다.
d) 농축 현탁액을 얻기 위한 2,500 rpm, 8 분간의 원심 분리에 의한 상기 잔사의 농축.
이 제제의 특징은 다음과 같다.
pH 6.25
오스몰 농도 343 mOsm
[PO] 101.87 ㎎/g
[hGH] 4.7 ㎎/g
입경 D50 (T1 검정법에 의함) 13 ㎛
실시예 6: ZnCl 2 에 의하여 생성된 미립자 현탁액의 조제
현탁액은 최종 특성이 hGH 1.4 ㎎/g 및 PO 10.00 ㎎/g인 실시예 2에 따라 조제된 용액으로부터 조제된다.
a) 비율 r가 1.54로 될 때까지 전달량이 약 20 ㎖/시간인 작동 제어형 주사기를 사용한 1M ZnCl2 용액의 교반 (설정 번호 9) 첨가에 의한 상기 용액의 응집. PO 9.64 ㎎/g을 함유하는 용액을 얻는다.
b) 2,500 rpm으로 4 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 389 mOsm이다.
c) 잔사의 멸균수 (부피는 최초 용액의 1/13)에 의한 세척 및 2,500 rpm으로 8 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 237 mOsm이다.
d) 0.9% NaCl (부피는 최초 용액의 1/8)에 의한 잔사의 세척. 2,500 rpm으로 8 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 253 mOsm이다. 이 때, 산출된 이론적 농도는 64.97 ㎎/㎖이다.
이 제제의 특징은 다음과 같다.
pH 5.86
오스몰 농도 256 mOsm
[PO] 63.51 ㎎/g
입경 D50 (T1 검정법에 의함) 9 ㎛
실시예 7: 조건 1 하에서 MgCl2에 의하여 생성된 미립자 현탁액의 조제
상기 현탁액은 최종 특성이 hGH 0.48 ㎎/g 및 PO 23.05 ㎎/g인 실시예 2에 따라 조제되고 pH 및 오스몰 농도가 조정된 용액으로부터 조제된다.
a) 0.9% NaCl에 의하여 10.0 ㎎/g으로 희석함.
b) 비율 r가 6.93이 될 때까지 전달량이 약 20 ㎖/시간인 작동 제어형 주사기를 사용한 1 M MgCl2, 6H2O 용액의 교반 (설정 번호 10) 첨가에 의한 상기 용액의 응집. 이에 따라 PO 8.59 ㎎/g을 함유하는 제제를 얻는다.
c) 2,500 rpm으로 10 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 654 mOsm이다.
d) 잔사의 멸균수 (부피는 최초 용액의 1/7)에 의한 세척 및 2,500 rpm으로 10 분간 원심 분리. 맑은 상청액의 오스몰 농도는 291 mOsm이다.
이 제제의 특징은 다음과 같다.
pH 6.56
오스몰 농도 323 mOsm
[PO] 75.7 ㎎/g
[hGH] 1.3 ㎎/g
입경 D50 (T1 검정법에 의함) 8.6 ㎛
실시예 8: 조건 2하에서 MgCl2에 의하여 생성된 미립자 현탁액의 조제
현탁액은 최종 특성이 hGH 1.33 ㎎/g 및 PO 10.10 ㎎/g인 실시예 2에 따라 조제되어 pH 및 오스몰 농도가 조정된 용액으로부터 조제된다.
a) 비율 r가 10.01로 될 때까지 전달량이 약 8 ㎖/분인 펌프를 사용한 질소 기포 발생 처리한 2 M MgCl2ㆍ6H2O 용액의 교반 (500 rpm) 첨가에 의한 질소 세정 (nitrogen sweep) 존재하의 상기 용액의 응집. 이에 따라, PO 함량이 8.98 ㎎/g이고, 오스몰 농도가 914 mOsm인 용액을 얻는다.
b) 교반하면서 3 시간 숙성.
c) 비표면적이 0.02 ㎡인 미크로자 모듈 (Microza module; UJP-0047R - Pall)의 사용. 이 모듈은 이미 조절 (수중 흡수에 의한 글리세롤 및 에탄올의 제거), 제열(除熱; depygogenate) (7% NaOH에 이어서 수세) 및 고압 증기 멸균되어 있다.
d) 오스몰 농도가 900 mOsm인 MgCl2 용액에 의한 상기 모듈의 조절.
e) 멸균수 (응집된 제제 부피의 1.04배)에 의한 세척. 이 멸균수는 총부피가 일정하게 유지되도록 8 ㎖/분의 유량으로 첨가된다. 이 순환은 0.3 bar의 압력을 유지하는 일률 (power)이 25%인 펌프에 의하여 보장된다. 이 단계는 3 시간 지속된다. 맑은 여과액의 최종 오스몰 농도는 459 mOsm이다.
f) 일률이 25%인 펌프에 의하여 재순환이 보장되는 미크로자 모듈 (0.02 ㎡)의 사용. 4.4 ㎖/분의 삼투 유량에 의한 농축. 이 단계는 160 분 지속된다. 여과액의 오스몰 농도는 324 mOsm이다.
이 제제는 백색의 액체 현탁액으로서, 특성은 다음과 같다.
오스몰 농도 329 mOsm
[Mg] 6.8 ㎎/g
[미립자] 43.6 ㎎/g
[hGH] 4.56 ㎎/g
r (M 검정법에 의함) 2.30
Tr (L 검정법에 의함) 16 시간
dapp (D 검정법에 의함) 0.15
실시예 9: 조건 3하에서 MgCl 2 에 의하여 생성된 안정한 미립자 현탁액의 조제
a) 이하 초기 제제 hGH 1.4 ㎎/g/PO 10 ㎎/g라고 부르게 되는 실시예 2에 따라 조제된 PO 용액의 조제.
재조합 인간 성장 호르몬의 용액을 25℃에서 2 시간 해동시킨다 ([hGH] = 3.9 ㎎/㎖, pH = 7.2, 330 mOsm).
상기 중합체 PO를 희석시켜 조정한다 (300 mOsm, pH = 7.4, 15.6 ㎎/g).
상기 hGH 용액을 상기 중합체 표면에 주가한 다음, hGH/PO 혼합물 (1.4/10 ㎎/g)을 탈기시킨다.
실온에서 철야 회합 반응을 수행한다.
PO
pH =7.4 - 300 mOsm		 M (PO) 2317.90 g
[PO] 15.61 ㎎/g
hGH
 M (hGH) 1302.30 g
[hGH] 3.9 ㎎/g
초기 제제

 M 3497.00 g
[hGH] 1.35 ㎎/g
[PO] 10.01 ㎎/g
b) 미립자 hGH 5 ㎎/g/Mg 미립자 40 ㎎/g의 조제.
2 M MgCl2를 비율 r = 9.01로 조절 첨가한 다음, 그 전체를 1 시간 방치하여 숙성시켜서 (성숙), 상기 초기 제제를 응집시킨다.
현탁액을 오스몰 농도가 약 300 mOsm으로 될 때까지, 접선 방향 원심 분리 (tangential microfiltration) [(팔사 (Pall)로부터 구득한 비표면적이 0.32 ㎡인 미크로자 모듈)]에 의하여 수세한다. 이어서, 상기 현탁액을 PO 농도가 38 내지 41 ㎎/g으로 될 때까지 농축시킨다.
초기 제제

 M 3458.4 g
[hGH] 1.399 ㎎/g
[PO] 10.01 ㎎/g
응집



 M (MgCl2, 2 M) 457.9 g
유량 8.47 g/분
M (현탁액) 3883.4 g
[PO] 8.84 ㎎/g
오스몰 농도 942 mOsm
세척

 M (H20) 4241 g
유량 42.43 g/분
오스몰 농도 330 mOsm
농축



 M (여과액) 3157 g
유량 39.46 g/분
M (농축된 미립자) 713.8 g
[hGH] 5.28 ㎎/g
[PO] 50.9 ㎎/g
희석


 M (MgCl2, 2 M) 179.9 g
M (농축된 미립자) 893.7 g
[hGH] 4.22 ㎎/g
[PO] 40.65 ㎎/g
c) 혼합 제제 hGH 5 ㎎/g/Mg 미립자 40 ㎎/g/PO 23 ㎎/g의 조제.
이들 미립자를 PO형의 중합체를 동결 건조형으로 하여 첨가함으로써 안정화시킨다.
상기 동결 건조체를 상기 현탁액에 교반, 첨가한다.
그 전체를 다음 날까지 교반하면서 진공 (30 mbar)하에 둔다.
실시예 10: 본 발명에 따른 방법의 제1 실시 상태에 의하여 미립자의 현탁액으로부터 hGH가 들어 있는 건식 미립자의 조제
우선, hGH가 들어 있는 미립자의 현탁액을 실시예 8의 단계 a) 내지 e) (응집, 숙성, 세척)에 기재되어 있는 조건하에 조제한다. 현탁액을 오스몰 농도가 약 280 mOsm으로 될 때까지 세척한다. 이어서, 중합체 약 10 ㎎/g을 함유하는 현탁액을 액체 질소 중에서 76 시간 동결 건조시킨 후 바이오블록 알파 1-4 엘에스씨 (Bioblock ALPHA 1-4 LSC) 장치에서 동결 건조시킨다.
현탁액의 재구성 및 특성화
주사용수 1 ㎖를 분말 40 ㎎에 가한다. 용액을 수 초간 수동 교반하여 상기 분말을 균질하게 습윤시킨다. 용액을 약 10 분간 정치한다. 수동 교반에 의하여 수 초간 균질화시키고, 21G 바늘을 사용하여 인출시켜 즉시 주사형 용액 1 ㎖를 얻는다.
현탁액의 특성은 다음과 같다.
r = 2×[Mg 2+]/[COO -]
(M 검정법에 의함)		 pH 오스몰 농도 dapp (㎎/㎖)
(D 검정법에 의함)
1.4 6.6 338 0.10
실시예 11: 본 발명에 따른 방법의 제2 실시 상태에 의하여 미립자의 현탁액으로부터 hGH가 들어 있는 건식 미립자의 조제
우선, hGH가 들어 있는 미립자의 현탁액을 실시예 8의 단계 a) 내지 e) (응집, 숙성, 세척)에 기재되어 있는 조건하에 조제한다. 현탁액을 오스몰 농도가 약 280 mOsm으로 될 때까지 세척한다. 이어서, 중합체 약 10 ㎎/g을 함유하는 현탁액을 뷔치 비290 (Buechi B290) 미립화 장치에서 건조시킨다. 액체 용액을 5 ㎖/분의 양으로 인출시켜 질소가 들어 있는 분무 노즐을 통하여 분무한다 (7 bar - 500 ℓ/시간). 상기 인출량 (공기 건조)은 40 ㎥/시간이다. 입구 온도는 90℃에서 유지시키는데, 이 경우 이들 조건하에서 출구 온도는 45℃로 유도된다.
이들 조건하에서 (T2 검정법에 의하여) 얻은 입자의 입경 D(0.5)은 5 ㎛ (부피의 50%는 직경이 <5 ㎛인 입자가 차지한다)이다.
현탁액의 재구성 및 특성화
주사용수 1 ㎖를 분말 30 ㎎에 가한다. 용액을 수 초간 수동 교반하여 상기 분말을 균질하게 습윤시킨다. 용액을 약 10 분간 정치한다. 수동 교반에 의하여 수 초간 균질화시키고, 21G 바늘을 사용하여 인출시켜 즉시 주사형 용액 1 ㎖를 얻는다.
현탁액의 특성은 다음과 같다.
r = 2×[Mg 2+]/[COO -]
(M 검정법에 의함)		 pH 오스몰 농도 입도 D(0.5) ㎛
(T1 검정법에 의함)		 dapp (㎎/㎖)
(D 검정법에 의함)
2.3 6.8 598 10.0 0.15
실시예 12: 나노입자형 및 미립자형의 양친매성 폴리아미노산을 기재로 하는 각종 제제의 피하 주사 후의 개에 있어서의 hGH의 약물 동태학
12 마리의 나이브 비글종 (naive beagle) 개 (체중 7 내지 10 ㎏)를 다음의 제제로 처리하였다.
제제 개의 마리 수 [hGH]
(㎎/㎖)		 [PO]
(㎎/㎖)		 투여량
(㎎/㎏)		 투여 부피
(㎖/㎏)
hGH IR 4 4 0 1 0.23
제제 1 4 5 22.6 1 0.22
제제 2 4 5 117.5 1 0.20
상기 hGH IR는 재조합 인간 성장 호르몬 용액([hGH] 4 ㎎/㎖, pH = 7.2, 330 mOsm)에 대응한다.
제제 1은 실시예 2에 따라 조제되고, 제제 2는 실시예 7에 따라 조제된다. 상기 hGH는 엘리사 (ELISA; DSL 10-1900 키트)에 의하여 분석한다.
약물 동태학 데이터를 다음의 표에 정리한다.
제제 Cmax ± SD
(ng/㎖)		 T > 5 ng/㎖ ± SD
(h)		 AUC0 - last ± SD
(ng.h/㎖)		 RBA (%) T50 % auc ± SD (h)
hGH IR 582 ± 155 18 ± 3 3209 ± 276 100 4 ± 1
제제 1 135 ± 37 44 ± 6 2579 ± 516 80 25 ± 5
제제 2 25 ± 5 129 ± 26 1759 ± 246 55 121 ± 33
상기 표에 있어서,
- Cmax는 최대 혈장 hGH 농도이다.
- T > 5 ng/㎖는 상기 최대 혈장 hGH 농도가 5 ng/㎖ 이상일 때의 시간이다.
- AUC는 시간에 따른 혈장 hGH 농도 곡선 아래의 면적을 나타낸다.
- RBA는 즉방성(卽放性) 제제에 대한 생물학적 이용률을 나타낸다.
- T50%auc는 방출되는 총hGH의 50%를 방출하는 데 요하는 시간을 나타낸다.
상기 hGH IR은 2 시간의 중간 시간 (median time) 후에 도달되는 최대 혈장 농도가 582 ± 155 ng/㎖인 신속 방출 프로파일을 나타낸다. 이어서, 상기 hGH는 단일 지수적 (mono-exponential) 감소에 따라 매우 신속하게 (약 2 시간의 겉보기 T1/2) 소거된다. 이 때, 상기 순환 hGH는 24 시간을 초과하여 수량화(數量化)할 수 없다.
제제 1은 24 시간의 중간 시간 후 비교한 가능한 최대 혈장 농도 (각각 44 ± 6 및 37 ± 4 ng/㎖)에 도달하기 전에 저속 흡착상이 있는 hGH 지연 방출 프로파일을 나타낸다. 소거 기울기는 48 시간 후 (혈장 농도는 4.8 ± 3.1 ng/㎖) 수량화할 수 있는 hGH의 부존재를 나타낸다.
이 제제는 그 경우 약 24 시간 집중된 Cmax의 이동에 의하여 설명되는 바와 같이, 혈액 공간으로의 hGH의 저속 방출을 나타낸다. 그러나, 이 현상은 혈장 중의 hGH의 존재를 크게 지연시키는 것으로 보이지는 않으며, 48 시간만에 순환 농도는 0인 것으로 보인다. 상기 제제 1의 AUC는 기준 IR에 비하여 조금 감소되는 것처럼 보인다. 생물학적 이용률은 80%이다.
반면에, 제제 2는 매우 느린 방출에 의한 약물 동태학적 프로파일에 이어 지연 시간이 4 시간인 주변형(主變形)과, 이어서 108 시간의 중간 시간 (범위: 72~168 시간) 후에 도달되는 25 ± 5 ng/㎖의 최대 혈장 농도를 제공한다. 제제 2의 약물 동태학의 일반적인 경향은 유사 주입형의 슈도-플라토 (pseudo-plateau) 형태로 매우 밋밋한 프로파일이다. 순환 hGH의 농도는 168 내지 240 시간 (7 내지 10일) 범위에서 수량화할 수 없는 농도로 복귀된다. 이 제제의 AUC는 매우 작다. 즉, 상대적인 생물학적 이용률의 45% 손실 (RBA = 55%)
실시예 13: 미립자형의 양친매성 폴리아미노산을 기재로 하는 제제의 피하 주사 후 개에 있어서의 hGH의 약물 동태학
12 마리의 나이브 비글종 (naive beagle) 개 (체중 7 내지 10 ㎏)를 다음의 제제로 처리하였다.
제제 개의 마리 수 [hGH]
(㎎/㎖)		 [PO]
(㎎/㎖)		 pH/mOsm 투여량
(㎎/㎏)		 투여 부피
(㎖/㎏)
hGH IR 6 4.1 0 7.4/321 1일
5 x 0.1		 0.024
제제 3 6 4.3 64.2 6.4/409 0.5 0.122
상기 hGH IR은 재조합 인간 성장 호르몬 ([hGH] 4.1 ㎎/㎖, pH = 7.2, 330 mOsm)에 대응한다. 제제 3은 실시예 9에 따라 조제된다.
약물 동태학적 데이터를 다음의 표에 정리한다.
제제 Cmax ± SD
(ng/㎖)		 T > 1 ng/㎖ ± SD
(시간)		 AUC0 - last ± SD
(ng·시간/㎖)		 RBA
(%)		 T50 % auc ± SD
(시간)
hGH IR 90 ± 24 39 258 ± 26 100 2 ± 0.3
제제 3 26 ± 16 108 ± 38 999 ± 294 77 66 ± 14
상기 표에 있어서,
- Cmax는 최대 혈장 hGH 농도이다.
- T > 1 ng/ml는 상기 최대 혈장 hGH 농도가 1 ng/ml 이상일 때의 시간이다.
- AUC는 시간에 따른 혈장 hGH 농도 곡선 아래의 면적을 나타낸다.
- RBA는 즉방성 제제에 대한 생물학적 이용률을 나타낸다.
- T50%auc는 방출되는 총hGH의 50%를 방출하는 데 요하는 시간을 나타낸다.
상기 미립자는 5일 이상에 걸쳐 hGH를 방출하고, 생물학적 이용률의 손실은 23%이다.
비교예 14: 본 발명에 따른 미립자 및 PO의 나노입자로부터의 hGH의 시험관내 방출 (L 검정법)
PO의 나노입자 (실시예 2)와 PO의 미립자 (실시예 8)로부터의 hGH의 방출 비교를 L 검정법으로 수행하였다. 연속상은 30 ㎎/g을 함유하는 알부민의 완충 용액이다.
첨부된 도면에는 상기 제제가 주사 가능한 농도 조건하에서 단백질 (hGH)의 50%를 방출하는 데 요하는 시간이 나타나 있다.
- 23 ㎎/g을 함유하는 나노입자: tr = 40 분, 즉 0.67 시간
- 73 ㎎/g을 함유하는 미립자: tr = 973 분, 즉 16.22 시간
상기 미립자에 함유되어 있는 hGH는 나노입자에 함유되어 있는 것보다 24배 더 느리게 방출된다.
실시예 15: 중합체 PO의 미립자와 인슐린 (100 UI/플라스크)으로 이루어진 동결 건조 분말을 함유하는 개별 플라스크의 조제
500 UI/g (17.5 ㎎/g)으로 농축된 인슐린 용액 350 g의 조제:
재조합 인간 인슐린 (분말) (28.6 UI/g, 수분 함량: 4.5%) 6.4 g을 유리 플라스크에 도입한다. 물 157 g을 가하여 인슐린을 저속 자석식으로 교반하면서 분산시킨다. 0.1 N HCl 46.6 g을 가하여 산 인슐린의 투명한 용액을 얻는다. 이어서, 0.1 N 탄산나트륨 69.8 g을 가하여 pH가 7 내지 8의 범위인 최종의 투명 용액을 얻 는다. 물 70.2 g을 가하여 용액을 목적하는 농도로 희석한다.
중합체 PO의 용액과 혼합:
이와 같이 하여 얻은 농축 인슐린 용액 326 g을 중합체 PO (11 ㎎/g으로 농축)의 용액 3426 g에 (자석식으로 교반하면서) 서서히 주가한다. 혼합물을 0.2 ㎛ 여과 장치에 통과시키고 서서히 교반하면서 철야 정치한다. 모든 후속되는 단계는 무균 조건하에서 수행된다.
응집 - 세척 - 농축:
전술한 제제를 2 M MgCl2 377 g의 조절 첨가 (이 때, 비율 r은 7.2)에 의하여 응집시킨다. 1 시간 숙성시킨 후, 현탁액을 접선 방향 원심 분리 [팔사 (Pall)로부터 구득한 비표면적이 0.32 ㎡인 미크로자 모듈]에 의하여 오스몰 농도가 약 340 mOsm으로 될 때가지 수세하고, 약 27 ㎎/g의 PO 농도로 농축시킨다. 상기 현탁액에 1 N NaOH 용액 (약 6 g)을 가하여 pH를 6.5로 조정한다. 이에 의하여, 인슐린 약 100 UI/g (정확한 값은 C18-그래프트형 실리카 컬럼에서의 HPLC에 의하여 얻을 수 있다)을 함유하는 현탁액을 얻는다.
폴리비닐피롤리돈의 첨가:
약 40 ㎎/g으로 농축시킨 폴리비닐피롤리돈의 모액 200 g을 주사 가능한 폴리피롤리돈 분말 (실시예 K17용)로부터 얻고, 이 모액을 0.2 ㎛ 멸균 여과 장치에 통과시킨다. 이어서, 여과된 용액 120 g을 살균 조건하에서 미리 조제해 둔 상기 현탁액 1200 g에 가하고, 이 혼합물을 약 15분간 교반한다.
이와 같이 하여 얻은 현탁액에는 인슐린이 약 91 UI/g 함유되어 있다.
동결 건조:
상기 현탁액을 플라스크당 100 UI (플라스크당 상기 현탁액 약 1.1 g)로 각 플라스크에 분배하고, 이들 플라스크를 살균 조건하에서 72 시간의 주기로 동결 건조한다. 이어서, 이들을 사용할 때까지 밀봉한다.
실시예 16: 실시예 15에서 얻은 미립자/인슐린의 플라스크의 재구성
상기 현탁액을 다음과 같이 (사용 전에) 즉석 재구성한다.
주사기와 바늘을 사용하여 전술한 실시예에서 얻은 인슐린 100 UI를 함유하는 플라스크에 물 1 ㎖를 투입한다.
상기 플라스크를 수 초간 수동 교반하여 균질한 (우유와 같은) 현탁액을 얻고, 이 현탁액을 주사기 중에 인출하여, 예컨대 30G 바늘로 주사할 준비를 한다.
상기 재구성된 현탁액은 다음의 성분을 함유한다.
- 중합체 PO 23 ㎎/㎖
- 인슐린 100 UI/㎖ (3.5 ㎎/㎖)
- 폴리비닐피롤리돈 4 ㎎/㎖
- Mg2+ 0.18 mmol/㎖ (r = 2.8).
상기 재구성된 현탁액의 특성은 아래와 같다.
r = 2×[Mg 2 +]/[COO -]
(M 검정법에 의함)		 pH 오스몰 농도 입도 D(0.5) ㎛
(T1 검정법에 의함)		 dapp (㎎/㎖)
(D 검정법에 의함)
2.8 6.5 300 15.0 0.13
20℃에서 측정된 동력학적 점도는 5 mPa.s와 같다.
실시예 17: 미립자형의 양친매성 폴리아미노산을 기재로 하는 제제의 피하 주사 후 개에 있어서의 인슐린의 약물 동태학
6 마리의 나이브 비글종 개 (체중 10.4 ± 0.6 ㎏)로 이루어진 2개의 군을 2개 기간으로 하는 교차 시험 도중에 다음의 제제 중의 한 가지로 연속 처리하였다.
제제 개의 마리 수 [인슐린]
(UI/g)		 [PO]
(㎎/g)		 투여량
(UI/㎏)		 투여 부피
(㎕/㎏)
란투스®
(배치 40N300)		 12 100 0 1 10
제제 4 12 100 20 1 10
이 시험의 대조품인 란투스 (Lantus®)는 사노피-아벤티스 (Sanofi-Aventis)에 의하여 공급되는 변형 인슐린 유사체 (인슐린 글라르진)이다. 인간 인슐린의 일차 구조 사에서의 2 개의 아미노산 잔기의 변형은 인 시투 침전 (in situ precipitation)에 기인하는 24 시간의 지연 방출의 일부 특성을 란투스®에 부여한다.
제제 4는 실시예 16에 따라 조제된다.
혈당은 자동식 생화학 분석기 (Advia 1650, Bayer Diagnostics)를 사용하여 효소적 방법 (헥소키나제)에 의하여 측정한다.
약물 동태학적 결과의 분석은 시간에 따른 기저 혈당의 백분율에 기초한다.
약물 동태학 데이터를 다음의 표에 정리한다.
제제 Cmin ± SD
(%)		 APGC0 ~36h ± SD
(%.시간)		 APGC제제 4 /APGC란투스 ± SD
(5)		 T50 % APGC ± SD
(시간)
란투수® 40 ± 6 1250 ± 342 - 13.3 ± 3.1
제제 4 45 ± 4 1389 ± 309 118 ± 37 19.7 ± 3.7
여기서,
- Cmin은 관찰된 기저 혈당의 최소 백분율이고,
- APGC0~36h은 투여 후 0 내지 36 시간 범위의 시간에 따른 기저 혈당 및 기저 혈당의 백분율 사이의 면적이며,
- T50%APGC는 APGC0~36h의 50%를 얻는 데 요하는 시간을 나타낸다.
대조품인 상기 란투스®를 투여하면, 최초 1 시간으로부터 혈당의 신속한 감소가 일어난다. 이어서, 인슐린 글라르진의 저혈당 작용이 18 내지 36 시간 범위의 기간에 걸쳐 유지된다 (혈당은 평균 30 시간 후 기저 농도로 복귀된다).
비교해서 말하자면, 제제 4를 투여하면, 역시 최초 1 시간으로부터 혈당의 신속한 감소가 일어난다. 그 다음, 기저 혈당은 평균 36 시간까지 플라토 (plateau)를 유지한다. 제제 4에 의하여 얻은 Cmin은 대조품인 란투스®에 의하여 얻은 값보다 현저하게 높으므로 (p<0.005, paired and unilateral Student t-test), 당뇨병 환자에 있어서의 심각한 저혈당의 상태를 현저하게 감소시킬 수 있다.
제제 4의 작용 시간은 장기 작용 대조군 란투스의 작용 시간보다 분명히 길다. 이는 제제 4에 대하여 상당히 높은 T50%APGC 값에 의하여 확인된다 (p<0.005, paired and unilateral Student t-test). 대조품 란투스®와 비교시, 제제 4에 대한 APGC0~36h의 손실은 전혀 관찰된 바 없다.
실시예 18: 중합체 PO 의 미립자와 인터페론 α -2b의 동결 건조 분말의 조제
중합체 PO 15 ㎎/g 및 d'IFN 0.19 ㎎/g을 함유하는 용액의 조제
중합체 PO 16.5 ㎎/g의 용액 166 g을 500 ㎖의 플라스크에 투입한다. 0.3 M 메티오닌 용액 2.3 g을 가한다. 동결(凍結) IFNα-2b 용액 (2.4 ㎎/g으로 농축)을 25℃에서 1 시간 해동시키고, 이 동결 용액 13 g을 상기 중합체 용액이 들어 있는 플라스크에 투입한다. 혼합물을 실온에서 14 시간 정치한다. 상기 용액을 0.2 ㎛ 멸균 여과 장치에 통과시킨다. 모든 후속되는 단계는 무균 조건하에서 수행된다.
응집 - 세척 - 농축:
전술한 제제 129.5 g을 2 M MgCl2 148.5 g의 조절 첨가 (비율 r은 7.0)에 의하여 응집시킨다. 이 현탁액을 4개의 플라스크에 분배 (각 플라스크당 약 37 g)하고 3,000 rpm/분으로 15 분간 원심 분리한다. 상청액 30.5 g을 상기 원심 분리 잔사에 접촉되지 않도록 조심하면서 플라스크로부터 제거한다. 이어서, 상기 잔사를 각 플라스크 중에서 멸균수 17 g으로 세척한다. 이 단계에 있어서, 오스몰 농도는 약 300 mOsm이다.
동결 건조:
동결 건조 도중 상기 현탁액을 멸균 상태로 유지시키기 위하여 리오가드® (Lyoguard®)형 (Gore®) 트레이에 분배하고, 이어서 상기 트레이를 실험실용 냉동 건조기를 사용하여 멸균 조건하에서 72 시간의 주기로 동결 건조한다.
실시예 19: 실시예 18에서 얻은 동결 건조 분말로부터의 인터페론 α -2b를 함유하는 미립자 현탁액의 재구성
상기 제제 중의 인터페론을 정확히 0.5 ㎎/g 얻기 위한 분말의 사용량을 알기 위하여, 예비 재구성 시험을 수행하여 인터페론 α-2b를 C18 그래프트형 실리카 컬럼을 가진 HPLC에 의하여 분석한다.
상기 현탁액을 사용 전에 다음과 같이 즉석 재구성한다.
물 13.58 g을 동결 건조 분말 1.22 g에 가하고, 이 현탁액을 자석 막대를 사용하여 1 시간 균질화시킨다.
이와 같이 하여 얻은 현탁액은 균질 (우유질)한데, 이 현탁액을 주사기 중에 인출하여, 예컨대 30G 바늘로 주사할 준비를 한다.
상기 재구성된 현탁액은 다음의 성분을 함유한다.
- 중합체 PO 46 ㎎/㎖
- 인터페론 α-2b 0.5㎎/㎖
- Mg2+ 0.34 mmol/㎖ (r = 2.6).
상기 재구성된 현탁액의 특성은 아래와 같다.
r = 2×[Mg 2 +]/[COO -]
(M 검정법에 의함)		 pH 오스몰 농도
2.6 6.1 705
실시예 20: 미립자형의 양친매성 폴리아미노산을 기재로 하는 제제의 피하 주사 후 개에 있어서의 IFN의 약물 동태학
8 마리의 나이브 비글종 개 (체중 9 ± 0.6 ㎏)를 다음의 제제로 처리하였다.
제제 개의 마리 수 [IFN]
(㎎/㎖)		 [PO]
(㎎/㎖)		 pH/mOsm 투여량
(㎍/㎏)		 투여 부피
(㎖/㎏)
IFN IR 4 0.5 0 6.45/354 60 0.12
제제 5 4 0.5 46 6.1/705 60 0.12
상기 IFN IR은 농도, pH 및 오스몰 농도 ([IFN] = 0.5 ㎎/㎖, pH = 6.45, 354 mOsm)가 조정된 재조합 인간 인터페론 (PCGEn, 용기 IB05.0516)의 용액에 대응한다. 제제 5는 실시예 19에 따라, 인토페론 (PCGen)의 동일한 배치 (batch)로부터 조제된다.
약물 동태학 데이터를 다음의 표에 정리한다.
제제 Cmax ± SD
(ng/㎖)		 T > 50 pg/㎖ ± SD
(시간)		 AUC0 - all ± SD
(ng·시간/㎖)		 RBA
(%)		 T50 % auc ± SD
(시간)
IFN IR 25.2 ± 0.4 22.6 ± 0.6 162.5 ± 27.2 100 5.1 ± 0.7
제제 5 0.9 ± 0.6 219.8 ± 29.8 95.5 ± 47.5 >59 96.7 ± 31.4
상기 표에 있어서,
- Cmax는 최대 혈장 IFN 농도이다.
- T > 50 pg/㎖는 상기 최대 혈장 IFN 농도가 50 pg/㎖ 이상일 때의 시간이다.
- AUC는 시간에 따른 혈장 IFN 농도 곡선 아래의 면적을 나타낸다.
- RBA는 즉방성 제제에 대한 생물학적 이용률을 나타낸다.
- T50%auc는 방출되는 총IFN의 50%를 방출하는 데 요하는 시간을 나타낸다.
상기 IFN IR은 5 시간의 중간 시간 (3 내지 5 시간 범위) 후 도달되는 최대 혈장 농도가 25.2 ± 0.4 ng/㎖인 신속 방출 프로파일을 나타낸다. 순환 IFN은 24 시간 이상 수량화할 수 없다.
제제 1은 매우 느린 방출에 의한 IFN의 약물 동태학적 프로파일의 주변형과, 108 시간의 중간 시간 (범위: 66~144 시간) 후에 도달되는 0.9 ± 0.6 ng/㎖의 최대 혈장 농도 (상기 IR의 농도보다 28배 낮다)를 제공한다. 상기 약물 동태학의 일반적인 경향은 슈도-플라토 (pseudo-plateau) 형태의 편평한 프로파일이다. 순환 IFN의 수준은 168 내지 240 시간 이상 (7 내지 10일 이상)의 범위에서 수량화할 수 없는 농도로 복귀된다.
이 제제는 AUC가 더 작다. 즉, 상대적 생물학적 이용률의 손실은 41%이다 (RBA = 59%)이다. T50%auc는 상기 IFN IR의 T50%auc보다 약 19배 더 크다.

Claims (36)

  1. 중합체(PO) 및 상기 중합체(PO)의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온으로부터 형성되고 T 검정법으로 측정된 입도가 0.5 내지 100 ㎛인 중합체(PO)의 미립자를 기제(基劑)로 하는 저점도 수용성 콜로이드 현탁액을 포함하는 활성 성분(AP)의 지연 방출용 액체 약학 제제에 있어서,
    상기 중합체(PO)는:
    ◆ 다음 화학식 (Ⅰ)에 의하여 정의되고:
    [화학식 (Ⅰ)]
    Figure 712014003226211-pct00016
    상기 식 중에서,
    ■ R1은 H, 직쇄 C2 내지 C10 또는 분지쇄 C3 내지 C10 알킬, 벤질 라디칼, 아미노산의 말단 잔기, 또는 -R4-[GH]이고,
    ■ R2는 H, 직쇄 C2 내지 C10 또는 분지쇄 C3 내지 C10 아실기, 피로글루탐산염, 또는 -R4-[GH]이며,
    ■ R3은 H 또는 다음의 양이온, 즉
    - 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속 양이온과,
    - 다음의 양이온,
    ● 아민계 양이온과,
    ● 올리고아민계 양이온과,
    ● 폴리아민계 양이온과,
    ● 리신 또는 아르기닌계 양이온류로부터 선택되는 아미노산계 양이온
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기성 양이온과,
    - 폴리리신 및 올리고리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 폴리아미노산
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온성 물질이고,
    ■ R4는 직접 결합 또는 1개 내지 4개의 아미노산 잔기계 "스페이서 (spacer)"이며,
    ■ A는 독립적으로 -CH2- 라디칼(아스파르트산 잔기) 또는 -CH2-CH2- 라디칼(글루탐산 잔기)이고,
    ■ n/(n + m)은 몰 그래프팅률로서 정의되는데, 이 값은 1 내지 25 몰%의 범위이며,
    ■ n + m은 10 내지 1,000의 범위에서 변화하고,
    ■ GH는 토코페롤기이며;
    ◆ 중합체(PO)는 pH 7.0 및 등장 조건하에 물에서 나노입자 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성하고;
    상기 나노입자는 pH 7.0 및 등장 조건하에 1종 이상의 활성 성분 (AP)와 자발적이고 비공유적으로 회합(會合)할 수 있고,
    상기 다원자가 이온은:
    - 원자가가 4 이하이고,
    - 상기 중합체의 이온성기 GI기의 극성과 극성이 반대이며,
    - 상기 중합체의 나노입자를 응집하여 미립자로 되도록 하기 위하여, M검정법으로 측정되고 아래의 식에 의하여 정의되는 비율 r가 0.3 내지 10이 되도록 하는 양으로 첨가되고:
    r = n × [IM]/[GI]
    상기 식 중,
    - n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
    - [IM]은 다원자가 이온의 몰농도이며,
    - [GI]는 이온성기 GI의 몰농도이고;
    상기 활성 성분 (AP)는 단백질, 글리코단백질, 1종 이상의 폴리알킬렌 글리콜 사슬에 결합된 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 올리고누클레오티드, 폴리누클레오티드 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인,
    활성 성분(AP)의 지연 방출용 액체 약학 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미립자는 D 검정법으로 측정된 겉보기 중합체 밀도 dapp가 0.05 내지 1.0인 것을 특징으로 하는 제제.
  3. 제1항에 있어서, L 검정법으로 측정된 소정의 AP의 방출 시간 Tr는 동일한 L검정법으로 측정된 다원자가 이온을 함유하지 않는 동일한 주사용 제제의 방출 시간 tr에 비하여 증가하고, 이 증가가 Tr이 1.1 x tr 이상이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PO의 미립자와 회합되어 있는 1종 이상의 AP를 함유하는 것을 특징으로 하는 제제.
  5. 제1항에 있어서, 전단(剪斷) 기울기 1,000 s-1에 대한 20℃에서 측정된 동태학적 점도는 500 mPa.s 이하인 것을 특징으로 하는 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 폴리아미노산의 주쇄는 알파-L-글루탐산염 또는 알파-L-글루탐산 호모 중합체인 것을 특징으로 하는 제제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리아미노산의 주쇄는 알파-L-아스파르트산염 또는 알파-L-아스파르트산 호모 중합체인 것을 특징으로 하는 제제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 폴리아미노산의 주쇄는 알파-L-아스파르트산염/알파-L-글루탐산염 또는 알파-L-아스파르트산/알파-L-글루탐산 공중합체인 것을 특징으로 하는 제제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 PO의 분자량은 2,000 내지 100,000 g/몰 범위인 것을 특징으로 하는 제제.
  10. 제1항에 있어서, 상기 PO는 음이온성기 GI를 함유하고, 상기 다원자가 이온은 Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+ 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는2 원자가 양이온, 또는 Al3+, Fe3+ 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 3 원자가 양이온인 것을 특징으로 하는 제제.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제제는
    → 소수성기 (GH)와 부분적으로 이온화하는 이온성 친수성기 (GI)가 결합되어 있는 수용성, 생분해성, 양이온성 공중합체이고, pH=7 및 등장 조건하에 물에서 나노입자의 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성하는, 1종 이상의 중합체 PO의 나노입자와,
    → 폴리알킬렌 글리콜과,
    → 코폴리알킬렌 글리콜과,
    → 셀룰로오스 중합체와 이들의 유도체와,
    → 소르비탄과 1종 이상의 지방산의 에스테르와,
    → 인지질계 계면 활성제와 폴리알킬렌 글리콜과,
    → 수소화 또는 비수소화 사카라이드와,
    → 폴리올과,
    → 젤라틴과,
    → 질소 함유 중합체 또는 질소 함유 공중합체와,
    → 폴리비닐 알코올 (PVA)과,
    → 이들의 혼합물
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 안정화제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제제.
  12. 제1항에 있어서, 상기 AP는 에리트로포이에틴, 옥시토신, 바소프레신, 부신 피질 자극 호르몬, 표피 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 조혈 자극 인자와 이들의 혼합물, 인자 Ⅷ과 Ⅸ, 헤모글로빈, 시토크롬, 프로락틴, 알부민, 황체 형성 호르몬 분비 호르몬 (LHRH), LHRH 길항제, LHRH 경합체, 인간, 돼지 또는 소 성장 호르몬 (GH), 성장 호르몬 방출 인자, 인슐린, 소마토스타틴, 글루카곤, 인터류킨 또는 이들의 혼합물, α-, β- 또는 γ-인터페론, 가스트린, 테트라가스트린, 펜타가스트린, 우로가스트린, 세크레틴, 칼시토닌, 엔케팔린, 엔도몰핀류, 안지오텐신류, 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬 (TRH), 종양 괴사 인자 (TNF), 신경 성장 인자 (NGF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식 세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 대식 세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 헤파린 분해 효소, 골형성 단백질 (BMP), hANP, 글루카곤 유사 펩티드 (GLP-1), VEG-F, 재조합 B형 간염 표면 항원 (rHBsAg), 레닌, 사이토카인, 브라디키닌, 바시트라신, 폴리믹신, 콜리스틴, 티로시딘, 그라미시딘, 시클로스포린의 약학적 활성 분획으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
  13. 제1항에 있어서, 상기 활성 성분은 다음 종류의 활성 물질, 즉 알코올 남용 치료제, 알츠하이머 질병 치료제, 마취제, 말단 거대증 치료제, 진통제, 항천식제, 알러지 치료제, 항암제, 소염제, 항응고제와 항혈전제, 항경련제, 항간질제, 당뇨병 치료제, 항구토제, 항녹내장제, 항히스타민제, 항감염제, 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 파킨슨병 치료제, 항콜린제, 진해제, 탄산 탈수 효소 억제제, 심혈관 제제, 지방혈 저하제, 항부정맥제, 혈관 확장제, 항협심증제, 항고혈압제, 혈관 보호제 (vasoprotector), 콜린에스테라제 억제제, 중추 신경 장애 치료제, 중추 신경계 자극제, 피임제, 가임 촉진제, 분만 유도제와 분만 억제제, 점액성 점착증 치료제, 도파민 수용체 작용제, 자궁 내막증 치료제, 발기 부전증 치료제, 생식 능력 치료제, 위장 장애 치료제, 면역 조절 물질, 면역 억제 물질, 기억 장애 치료제, 항편두통제, 근육 이완제, 뉴클레오시드, 골다공증 치료제, 부교감 흥분제, 프로스타글란딘, 정신 치료제, 진정제, 수면제와 신경 안정제, 신경 이완제, 항불안제, 정신 자극제, 항우울제, 피부 질환 치료제, 스테로이드와 호르몬, 암페타민, 식욕 억제제, 비마취성 진통제, 항간질제, 바르비튜르산염, 벤조디아제핀, 최면제, 설사제, 향정신제 및 이들 제제의 조합 중의 한 가지 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
  14. 제4항에 있어서, 미립자와 회합되지 않은 AP의 중량 비율은
    - [비회합 AP] ≤ 1%
    가 되도록 하는 것을 특징으로 하는 제제.
  15. 제4항에 있어서, 상기 AP는 재조합 인간 성장 호르몬 hGH인 것을 특징으로 하는 제제.
  16. 제4항에 있어서, 상기 AP는 인슐린인 것을 특징으로 하는 제제.
  17. 제4항에 있어서, 상기 AP는 인터페론 α-2b인 것을 특징으로 하는 제제.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 비경구, 점막, 피하, 근육내, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로 또는 종양내, 또는 경구, 비강, 폐, 질 또는 안구 경로에 의하여 투여하기 위한 약물을 제조하는 데 사용하려는 것을 특징으로 하는 제제.
  19. 다음의 공정, 즉
    a) 1종 이상의 PO의 나노입자의 콜로이드 현탁액을 마련하거나 조제하는 공정과,
    b) 상기 중합체 PO의 GI기의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온을 아래의 식에 의하여 정의되는 비율 r가 0.3 내지 10이 되도록 하는 양으로 첨가하는 공정과,
    r = n × [IM]/[GI]
    (상기 식 중에서,
    - n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
    - [IM]은 상기 다원자가 이온의 몰농도이며,
    - [GI]는 상기 이온성기 GI의 몰농도이다.)
    c. pH 및 오스몰 농도를 조정하는 공정
    으로 본질적으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 제1항에 기재되어 있는 제제의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서, a) 단계에 이어서 PO의 나노입자의 콜로이드 현탁액을 1종 이상의 AP와 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  21. 제19항에 있어서, a) 단계에 이어서 수득된 현탁액을 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 AP는 PO의 나노입자 또는 미립자의 콜로이드 현탁액과 혼합하기 위한 수용성 현탁액 또는 용액 형태인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  23. 제1항에 기재되어 있는 제제로부터 수득되는 생성물의 제조 방법으로서, 미립자의 현탁액을 건조시켜 저장하거나 또는 투여할 수 있는 고체 생성물을 얻는 것으로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  24. ◆ 제23항 기재의 제조 방법에 의하여 얻은 (AP가 들어 있거나 들어 있지 않은) 1종 이상의 고체 생성물을 마련하는 공정,
    ◆ 상기 고체 생성물을 재구성수 또는 재구성 수용액과 혼합하는 공정
    으로 이루어짐을 특징으로 하는, 제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 항에 기재되어 있는 제제의 제조 방법.
  25. 중합체 (PO) 및 상기 중합체 PO의 극성과 극성이 반대인 다원자가 이온으로부터 형성되고 T 검정법으로 측정된 입도가 0.5 내지 100 ㎛인 중합체 (PO)의 미립자를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 제제로부터 수득되는 고체 생성물로서,
    상기 중합체 (PO)는:
    ◆ 다음 화학식 (Ⅰ)에 의하여 정의되고:
    [화학식 (Ⅰ)]
    Figure 712014003226211-pct00017
    상기 식 중에서,
    ■ R1은 H, 직쇄 C2 내지 C10 또는 분지쇄 C3 내지 C10 알킬, 벤질 라디칼, 아미노산의 말단 잔기, 또는 -R4-[GH]이고,
    ■ R2는 H, 직쇄 C2 내지 C10 또는 분지쇄 C3 내지 C10 아실기, 피로글루탐산염, 또는 -R4-[GH]이며,
    ■ R3은 H 또는 다음의 양이온, 즉
    - 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속 양이온과,
    - 다음의 양이온,
    ● 아민계 양이온과,
    ● 올리고아민계 양이온과,
    ● 폴리아민계 양이온과,
    ● 리신 또는 아르기닌계 양이온류로부터 선택되는 아미노산계 양이온
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기성 양이온과,
    - 폴리리신 및 올리고리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 폴리아미노산
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 양이온성 물질이고,
    ■ R4는 직접 결합 또는 1개 내지 4개의 아미노산 잔기계 "스페이서 (spacer)"이며,
    ■ A는 독립적으로 -CH2- 라디칼(아스파르트 잔기) 또는 -CH2-CH2- 라디칼(글루탐 잔기)이고,
    ■ n/(n + m)은 몰 그래프팅률로서 정의되는데, 이 값은 1 내지 25 몰%의 범위이며,
    ■ n + m은 10 내지 1,000의 범위에서 변화하고,
    ■ GH는 토코페롤기이며;
    ◆ 중합체(PO)는 pH 7.0 및 등장 조건하에 물에서 나노입자 콜로이드 현탁액을 자발적으로 형성하고;
    상기 나노입자는 pH 7.0 및 등장 조건하에 1종 이상의 활성 성분 (AP)와 자발적이고 비공유적으로 회합(會合)할 수 있고,
    상기 다원자가 이온은:
    - 원자가가 4 이하이고,
    - 상기 중합체의 이온성기 GI기의 극성과 극성이 반대이며,
    - 상기 중합체의 나노입자를 응집하여 미립자로 되도록 하기 위하여, M검정법으로 측정되고 아래의 식에 의하여 정의되는 비율 r가 0.3 내지 10이 되도록 하는 양으로 첨가되고:
    r = n × [IM]/[GI]
    상기 식 중,
    - n은 상기 다원자가 이온의 원자가이고,
    - [IM]은 다원자가 이온의 몰농도이며,
    - [GI]는 이온성기 GI의 몰농도이고;
    상기 활성 성분 (AP)는 단백질, 글리코단백질, 1종 이상의 폴리알킬렌 글리콜 사슬에 결합된 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 리포폴리사카라이드, 올리고누클레오티드, 폴리누클레오티드 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인,
    고체 생성물.
  26. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항 기재의 1종 이상의 제제 또는 제19항 내지 제23항 중의 어느 하나의 항 기재의 방법에 의하여 얻은 제제 또는 상기 제제로부터 수득된 고체 생성물을 사용하는 것으로 본질적으로 구성되는 것을 특징으로 하는, 비경구, 점막, 피하, 근육내, 진피내, 복막내 또는 뇌내 경로 또는 종양내, 또는 경구, 비강, 폐, 질 또는 안구 경로에 의하여 투여하기 위한 약물의 제조 방법.
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