KR20100015750A - 가용성 ｉｌ-17ｒａ/ｒｃ 융합 단백질 및 관련방법 - Google Patents

가용성 ｉｌ-17ｒａ/ｒｃ 융합 단백질 및 관련방법 Download PDF

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마크 더블류. 릭손
제렌 가오
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Abstract

본 발명은 IL-17A 및 IL-17F의 길항제에 관한 것이다. 본 발명의 길항제는 IL-17RC와 IL-17RA("IL-17RC/IL-17RA") 모두를 포함하는 하이브리드 가용성 수용체를 포함하는, 가용성 IL-17RA 및 IL-17RC 융합 단백질에 기초한다. 이러한 길항제는 IL-17F, IL-17A, 또는 IL-17A와 IL-17F 둘 다의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있다. 또한, 본 발명은 적어도 부분적으로는 IL-17A 및/또는 IL-17에 의해 매개되는 질환, 특히 염증 질환에 대한 길항제를 이용하는 방법에 관한 것이다.
IL-17A, IL-17F, IL-17RC, IL-17RA, 길항제, 염증, 사이토카인, 수용체

Description

가용성 ＩＬ-17ＲＡ/ＲＣ 융합 단백질 및 관련방법{SOLUBLE IL-17RA/RC FUSION PROTEINS AND RELATED METHODS}
사이토카인은, 많은 세포 타입의 성장 및 분화의 조절을 포함하여, 다양한 생물학적 효과를 매개하는 가용성 소형 단백질이다(예를 들어, Arai et al, Annu. Rev. Biochem. 5P:783 (1990); Mosmarm, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul and Seder, Cell 76:241 (1994) 참조). 사이토카인 그룹을 구성하는 단백질은, 인터류킨, 인터페론, 콜로니자극인자, 종양괴사인자, 및 다른 조절성 분자들을 포함한다. 예를 들어, 인간 인터류킨-17은 인터류킨-6, 세포내 부착분자 1, 인터류킨-8, 과립구 대식세포 콜로니자극인자, 및 프로스타글란딘 E2의 발현을 자극하는 사이토카인으로서, CD34+ 조혈 전구세포를 호중구로 우선 성숙시키는 역할을 한다(Yao et al., J. Immunol. 155:5483(1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996) 참조).
사이토카인에 결합하는 수용체는 일반적으로 하나 이상의 내재성 막 단백질로 이루어지며, 이 막 단백질이 사이토카인에 높은 친화성으로 결합하고, 이 결합사건을 어떤 수용체 서브유닛의 세포질 부분을 통해 세포내로 도입한다. 세포외 리간드 결합 도메인의 유사성에 기초하여 사이토카인 수용체들이 몇몇 부류로 분류되었다.
사이토카인 및 그 수용체에 대한 증명된 생체내 활성은 다른 사이토카인, 사이토카인 수용체, 사이토카인 작용제, 및 사이토카인 길항제에 대한 임상적인 잠재력과 이들의 필요성을 예시한다. 예를 들어, 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 패밀리의 증명된 생체내 활성은 전-염증성 분자들의 길항제의 상당한 임상적 잠재력과 이들의 필요성을 예시한다.
도 1A 및 1B는 인간 IL-17RCx1(SEQ ID NO:2)의 엑손 구조의 도해이다. 코돈이 엑손/인트론 접합부에 의해 절단된 이들 아미노산에 있어서, 접합부는 전체 코돈을 포함하도록 이동되었다.
도 2A 및 2B는 인간 IL-17RCx4(SEQ ID NO:166)의 엑손 구조의 도해이다.
도 3은 인간 IL-17RA(SEQ ID NO:21)의 엑손 구조의 도해이다.
도 4A 및 4B는 본원에 설명된 그리고 SEQ ID NO:157 및 158에 있는 본 발명의 바람직한 가용성 폴리펩티드의 엑손 구조의 도해이다. 이 가용성 폴리펩티드는 인간 IL-17RA(SEQ ID NO:21) 및 인간 IL-17RCx1(SEQ ID NO:2)의 엑손을 모두 포함한다.
도 5는 실시예 34에 개략된 프로토콜을 이용한 전형적인 분석 결과의 도해이다. 이 그래프는 프리즘 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생성되었다. Y 값은 리간드 단독에 기초하고, 무 리간드/무 가용성 수용체 대조군 웰에 기초하여 최대 및 최소(100% 및 0%)에 맞춰 정규화된 MFI를 나타내며, 리간드와 세포의 결합 퍼센트를 나타낸다. 상기 소프트웨어는 각 곡선에 대한 IC50을 계산한다.
도 6은 마우스 모델에서 이식편대숙주병(graft-versus-host disease (GVHD))에 대한 mIL-17RA-Fc의 치료 효과를 보여준다. 수용체 마우스(C57BL/6 x DBA/2 F1)는 치료군들을 PBS 또는 mIL-17RA-Fc로 나뉘었다. 쥐의 IL-17RA-Fc 치료는, -1일 시작해서 15일째까지 계속해서 이틀에 한번 복강내 주사(주사당 150μg)로 투여되었다. 0일째에, B6 마우스 유래의 공여체 비장 림프구 8천만개가 수용체 마우스(C57BL/6 x DBA/2 F1 (BDF1); n=10 / 그룹)로 정맥내 주사되었다. 마우스는 이 모델에서 병이 악화되는 것을 검증하기 위해, 일주일에 3번 체중 변화를 모니터하였다. IL-17RA-Fc 치료군(열린 삼각형 표시)에서 체중감소는 심각하지 않았고, PBS 대조군(닫힌 다이아몬드 표시)에서 보다 체중감소가 상당히 덜하였다(p<0.05).
본 발명은 전-염증성 사이토카인 IL-17A 및 IL-17F에 대한 길항제를 제공함으로써 이들 요구를 해결하게 된다. 특히, 전-염증성 사이토카인 IL-17A 및 IL-17F는 높은 정도의 서열 유사성을 가지고, 많은 생물학적 특성을 공유하며, 모두 활성화된 T 세포에 의해 생성된다. 이것들은 모두 류마티스 관절염 및 천식을 포함하는 여러 자가면역질환 및 염증성 질환의 진행에 기여하는 인자들로서 관련되었다. 사실상, IL-17A 기능을 무효화하는 시약은 인간 질환의 몇몇 마우스 모델에서 질환 발생 및 중증도를 상당히 개선한다. IL-17A는 동족 수용체인 IL-17 수용체(IL-17R)와의 상호작용을 통해 그 효과를 매개하며, IL-17F에 대한 수용체는 아직 확인되지 않았다. 이전에 우리는 IL-17RC가 IL-17A와 IL-17F 모두에 대한 수용체이며 유사한 높은 친화성으로 이들 모두에 결합함을 보고했었다. 한편, IL-17R은 IL-17A와는 높은 친화성으로 결합하지만, IL-17F와는 매우 낮은 친화성으로 결합한다. 이와 일치하여, 가용성 형태의 IL-17R은 어느 한 수용체를 발현하는 세포에서 IL-17A 결합 및 신호화를 차단하지만, IL-17F와 IL-17RC의 결합이나 IL-17F의 기능을 방해하지는 않는다는 것이 밝혀졌다.
IL-17A의 개입이 몇몇 자가면역질환의 효과적인 치료법으로서 제안되었기 때문에, 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 수용체를 포함하여, IL-17A, IL-17F, 또는 IL-17A와 IL-17F 양쪽 모두의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화할 수 있는 본 발명의 길항제를 사용하여, 이들 두 사이토카인 중 단지 하나만을 표적으로 하는 치료법을 능가하는 이점을 가질 것이다. 더 나아가, 본 발명은 염증성 질환에서의 이것들의 용도, 및 관련된 조성물 및 방법을 제공한다.
A) 개요
면역 관련 및 염증성 질환은 정상 생리학에서 상해 또는 손상에 반응하고, 상해 또는 손상으로부터 회복을 개시하며, 외래 생물에 대한 선천성 및 후천성 방어를 준비하는 데 결정적인 다소 복잡하고, 종종 복합 상호연결된 생물학적 경로의 발현 또는 결과이다. 질환 또는 병리는 이들 정상 생리학적 경로가 반응의 강도에 직접적으로 관련되고, 비정상 조절 또는 과도한 자극의 결과이며, 자신에 대한 반응 또는 이들의 조합으로서, 추가 상해 또는 손상을 야기할 때 발생한다.
이들 질환의 발생이 종종 다단계 경로 및 종종 복합적인 상이한 생물 시스템/경로와 관련되지만, 이들 하나 이상의 경로 중의 결정적인 시점에서의 개입은 개선적 또는 치료적 효과를 가질 수 있다. 치료적 개입은 유해한 과정/경로의 길항작용 또는 유익한 과정/경로의 자극에 의하여 이루어질 수 있다.
많은 면역 관련 질환은 공지되어 있으며 광범위하게 연구되었다. 이러한 질환으로는 면역 매개 염증성 질환(예를 들면, 류마티스 관절염, 면역매개성 신장 질환, 간담도 질환, 염증성 장 질환(IBD), 건선, 및 천식), 비-면역-매개 염증성 질환, 감염성 질환, 면역결핍성 질환, 종양형성(neoplasia) 등이 있다.
T 림프구(T 세포)는 포유동물 면역 반응의 중요한 구성요소이다. T 세포는 주 조직적합성 복합체(MHC) 내의 유전자에 의하여 코딩되는 자기 분자와 결합되는 항원을 인식한다. 항원은 항원 제시 세포, 바이러스 감염된 세포, 암 세포, 이식체의 표면상의 MHC 분자와 함께 디스플레이될 수 있다. T 세포 시스템은 숙주 포유동물의 건강을 위협하는 이들 변형된 세포들을 제거한다. T 세포는 보조 T 세포 및 세포독성 T 세포를 포함한다. 보조 T 세포는 항원 제시 세포 상의 항원-MHC 복합체의 광범위하게 이어지는 인식을 증가시킨다. 보조 T 세포는 또한 다양한 사이토카인, 즉 B 세포, 세포 독성 T 세포, 및 면역반응에 관여하는 다양한 다른 세포들의 활성화에 핵심적 역할을 하는 림포카인을 분비한다.
체액성 및 세포 매개성 면역반응 모두에서의 중심 반응은 보조 T 세포의 활성화 및 클론의 증식이다. 보조 T 세포 활성화는 T 세포 수용체(TCR)-CD3 복합체와 항원 제시 세포의 표면 상의 항원-MHC의 상호작용에 의하여 개시된다. 이 상호작용은 휴지기의 보조 T 세포가 세포 주기로 들어가도록(G0에서 G1으로 전이) 유도하는 생화학적 반응의 캐스케이드를 매개하고, 그 결과 IL-2 그리고 때로는 IL-4에 대한 고친화력 수용체의 발현을 야기한다. 활성화된 T 세포는 기억 세포(memory cell) 또는 작용 세포(effector cell)를 증식시키고 분화시키는 사이클을 통하여 진행된다.
TCR을 통하여 매개된 신호뿐만 아니라, T 세포의 활성화는 항원 제시 세포에 의하여 분비된 사이토카인 또는 항원 제시 세포 및 T 세포 상의 막 결합 분자와의 상호작용을 통하여 유도된 추가적 공동자극과 관련된다. 사이토카인 IL-1 및 IL-6은 공동자극 신호를 제공하는 것으로 나타났다. 또한, 항원 제시 세포의 표면상에 발현된 B7 분자와 T 세포 표면상에 발현된 CD28 및 CTLA-4 분자 간의 상호작용은 T 세포 활성화에 영향을 미친다. 활성화된 T 세포는 ICAM-1, 인테그린, VLA-4, LFA-1, CD56 등과 같은 세포 부착 분자의 발현을 증가시킨다.
혼합된 림프구 배양 또는 혼합된 림프구 반응(MLR)에서의 T 세포 증식은 면역 시스템을 자극하는 화합물의 능력의 확립된 지표이다. 많은 면역 반응에서, 염증성 세포는 손상 또는 감염의 부위를 침투한다. 이동성 세포는 호중구, 호산구, 단핵구 또는 림프구일 수 있으며, 이들은 영향을 받은 조직의 조직학적 검사에 의하여 결정될 수 있다. Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.
면역 관련 질환은 면역반응을 억제함으로써 치료될 수 있다. 면역 자극 활성을 가진 분자를 억제하는 가용성 수용체 및/또는 중화 항체를 사용하는 것은 면역 매개 및 염증성 질환의 치료에 유리하다. 면역반응을 억제하는 분자는 면역반응을 억제함으로써 면역 관련 질환을 개선하기 위하여 (직접 또는 항체 작용제의 사용을 통해 단백질을) 사용할 수 있다.
인터류킨-17(IL-17A)이 T 림프구 호성 헤르페스 바이러스 사이미리(HSV)에 의해서 암호화된 단백질의 세포성 상동체(ortholog)로 확인되었다[Rouvier et al., J. Immunol., 150(12): 5445-5456 (19993); Yao et al., J. Immunol., 122(12):5483-5486 (1995) 및 Yao et al, Immunity, 3(6):811-821 (1995) 참조]. 계속해서 이 단백질이 광범위한 말초조직에서 전-염증성 반응을 유도하는 작용을 하는 강력한 사이토카인이라는 특징이 밝혀졌다. IL-17A는 약 32 kDa의 이황화-연결 호모다이머 사이토카인으로서, CD4+ 활성화 기억 T 세포에 의해서만 합성되고 분비된다(Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16:541-551 [1998] 참조). 구체적으로, IL-17은 19-23개 잔기의 N-말단 신호 서열을 갖는 155개 아미노산의 전구물질 폴리펩티드로서 합성되며, 이황화-연결된 호모다이머 당단백질로서 분비된다. IL-17A은 미국특허 제6,06 3,372호와 WO9518826 (1995), WO9715320 (1997) 및 WO9704097 (1997)에 개시된다.
제한된 조직분포에도 불구하고, IL-17A은 다양한 타입의 세포에 대해 다면적인 생물학적 활성을 나타낸다. IL-17A는 많은 사이토카인의 생산을 자극하는 것으로 판명되었다. 그것은 섬유아세포, 각질세포, 상피세포 및 내피세포와 같은 유착세포에 의해 IL-6, IL-8, IL-12, 백혈병 억제인자(LIF), 프로스타글란딘 E2, MCP-1 및 G-CSF의 분비를 유도한다. 또한, IL-17A는 ICAM-1 표면 발현, T 세포의 증식, CD34+ 인간 선조세포의 호중구로의 성장 및 분화를 유도하는 능력을 가진다. 또한, IL-17A는 뼈 대사에 연루되었으며, 류마티스 관절염 및 뼈 이식물이 느슨해지는 것과 같은, 활성화 T 세포의 존재 및 TNF-α 생산을 특징으로 하는 병리학적 상태에서 중요한 역할을 한다고 제안되었다(Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14:1513-1521 [1999]). 류마티스 관절염 환자로부터 유래한 윤활조직의 활성화 T 세포는 정상 개체 또는 골관절염 환자로부터 유래한 것보다 더 많은 양의 IL-17A를 분비하는 것으로 판명되었다(Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 [1999]). 이런 전-염증성 사이토카인은 류마티스 관절염의 윤활 염증에 활발히 기여한다고 제안되었다. 전-염증성 역할과는 별도로, IL-17A는 또 다른 메커니즘에 의해 류마티스 관절염의 병리학에 기여하는 것 같다. 예를 들어, IL-17A는 골모세포에서 파골세포 분화인자(ODF) mRNA의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Kotake et al., J. Clin. Invest., 103:1345-1352 [1999]). ODF는 선조세포의 파골세포로의 분화를 자극하며, 파골세포는 뼈흡수에 연루된다.
류마티스 관절염 환자의 윤활액에서는 IL-17A의 수준이 현저히 증가하기 때문에, IL-17A 유도 파골세포 형성은 류마티스 관절염의 뼈흡수에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 또한, IL-17A는 다발성 경화증과 같은 어떤 다른 자가면역 장애에서도 중요한 역할을 한다고 생각된다(Matusevicius et al., Mult. Scler., 5:101-104 [1999]). 더 나아가, IL-17A는 인간 대식세포에서 세포내 신호화에 의해 Ca2+ 유입 및 cAMP의 감소를 자극하는 것으로 밝혀졌다(Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 [1998]). IL-17A로 처리된 섬유아세포는 NF-κB의 활성화를 유도하며[Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., supra], IL-17A로 처리된 대식세포는 NF-κB와 미토겐-활성화 단백질 키나제를 활성화한다 (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273:27467 [1998]).
추가하여, IL-17A는 또한 뼈 및 연골 성장에 연루되는 포유동물 사이토카인-형 인자 7과 서열 유사성을 공유한다. IL-17A 폴리펩티드와 서열 유사성을 공유하는 다른 단백질은 인간 배아-유래 인터류킨-관련 인자(EDIRF) 및 인터류킨-20이다.
IL-17A의 광범위한 효과와 일치하여, IL-17A의 세포 표면 수용체는 많은 조직 및 세포 타입에서 광범하게 발현되는 것으로 판명되었다(Yao et al., Cytokine, 9:794 [1997]). 인간 IL-17A 수용체(IL-17R)의 아미노산 서열(866개 아미노산)은 단일 트랜스멤브레인 도메인과 긴 525개 아미노산의 세포내 도메인을 가진 단백질로 예상되며, 이 수용체 서열은 독특해서, 사이토카인/성장인자 수용체 패밀리로부터의 수용체 중 어느 것의 서열과도 유사하지 않다. 이것은 IL-17A 자체와 다른 공지된 단백질들과의 유사성이 결핍한 것으로 보아, IL-17A와 그 수용체가 신호화 단백질 및 수용체의 신규한 패밀리의 일부일 수 있음을 시사한다. IL-17A 활성이 그것의 독특한 세포 표면 수용체와의 결합을 통해 매개된다는 것이 증명되었으며, 선행 연구들에서는 T 세포와 IL-17A 수용체 폴리펩티드의 가용성 형태의 접촉이 PHA, 콘카나발린 A 및 항-TCR 모노클로날 항체에 의해 유도된 T 세포 증식 및 IL-2 생산을 억제했다는 것이 밝혀졌었다(Yao et al., J. Immunol., 155:5483-5486 [1995]). 이와 같이, 공지된 사이토카인 수용체, 구체적으로는 IL-17A 수용체에 대해 상동성을 가진 신규한 폴리펩티드를 확인하고 특성화하는데 상당한 관심이 있다.
IL-17F의 발현 패턴은 IL-17A와 유사한 것으로 드러났으며, 이것은 단지 활성화된 CD4+ T 세포 및 단핵세포만을 포함한다(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). IL-17F는 섬유아세포에서 G-CSF, IL-6 및 IL-8을(Hymowitz et al, EMBO J. 20:5322-5341 [2001]), 그리고 내피세포에서 TGF-β를(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]) 유도하는 것이 증명되었다. 최근에는, 수지상세포에 의해 생산된 사이토카인인 IL-23이 기억 T 세포에서 주로 IL-17A와 IL-17F 모두의 생산을 매개할 수 있음이 보고되었다(Aggarwal et al. J. Biol. Chem. 278:1910-1914 [2003]).
더욱이, 관절염 및 천식을 앓는 개체에서는 IL-17A와 IL-17F 모두의 과발현 또는 상향조절이 밝혀졌다(Moseley et al. Cytokine Growth Factor Rev 14:155-174 [2003] 참조). 관절염과 관련하여, 이들 사이토카인은 류마티스- 및 골-관절염과 관련되는 연골 및 관절 파괴에 특징적인 방식으로 작용한다. 예를 들어, IL-17A 및 IL-17F는 연골 프로테오글리칸 글리코사미노글리칸 및 콜라겐 단편의 방출을 통해 관절 연골 외부이식물에서 매트릭스의 분해를 증진시키며, 동시에 새로운 프로테오글리칸 및 콜라겐의 합성을 억제하는 것으로 증명되었다(Cai et al. Cytokine 16:10-21 [2001]; Attur et al Arthritis Rheum 44:2078-2083 [2001]).
IL-17A와 유사하게, 마우스에서 IL-17F의 과발현이 또한 폐의 호중구 집결을 증가시키고, 그 결과 폐에서 IL-6, TNF-γ, IP-10 및 MIG를 포함하는 Th1-관련 사이토카인의 발현이 증가되는 것으로 밝혀졌다(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). 또한, IL-17F은 알레르겐-시험감염된 천식환자의 T 세포에서 상향조절되었으며(Kawaguchi et al J. Immunol 167:4430-4435 [2001]), NHBE에서 IL-6 및 IL-8 생산을 유도하는 것으로 판명되었다. IL-17A과는 달리, IL-17F은 시험관내에서 맥관형성을 억제하는 것으로 드러났다(Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]).
IL-17F mRNA는 여러 인체 조직에서 노던블롯에 의해서는 검출되지 않았지만, CD4+ T 세포와 단핵세포의 활성화에 의해 극적으로 유도되었다. (Id.) 마우스에서는 Th2 세포 및 마스트 세포(mast cell)가 활성화시에 IL-17F를 발현하는 것으로 판명되었다(Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003) 참조). IL-17A과 마찬가지로, IL-17F의 발현이 또한 마우스에서 IL-23에 의해 상향조절되는 것으로 판명되었다.
IL-17 사이토카인/수용체 패밀리는 사이토카인 네트워크 내에서 독특한 신호화 시스템을 나타내는 것으로 드러났는데, 이것은 면역 및 염증 반응의 조절에 대한 혁신적인 접근법을 제공할 것이다. 따라서, 본 발명은 새로운 IL-17 패밀리 수용체인 IL-17RC, 및 IL-17A와 IL-17F 모두에 결합하는 이것의 능력의 발견에 기초한다.
IL-17RC는 초기에는 IL-17RA에 관련된 단백질을 조사하기 위한 생물정보학적 접근법을 이용하여 확인되었으며, IL-17 수용체-관련 단백질인 IL-17RC를 암호화하는 cDNA를 통해서 확인되었다. IL-17 패밀리의 원조 구성원인 IL-17A에 결합하는 IL-17 수용체(IL-17RA)와의 명백한 유사성, 및 IL-17 사이토카인 패밀리의 5개의 다른 구성원의 확인에도 불구하고, IL-17RC에 대한 특이적 리간드는 이전에 보고되지 않았었다. 그러나, 2005년 6월 10일자 제출된 미국특허 출원 제11/150,533호에 설명되고 미국특허 공개 제20060002925호에 공개된 IL-17RC에 대한 특이적 리간드로서 IL-17A 및 IL-17F가 확인되었다. 구체적으로, 이들 리간드는 인간 IL-17RA (hIL-17RA) 또는 IL-17RC(hIL-17RC)를 암호화하는 구성물로 안정하게 트랜스펙션된 아기 햄스터 신장세포(BHK)를 사용하여 확인되었다. 표면에서의 수용체의 발현은 hIL-17RA에 대한 모노클로날 항체 또는 hIL-17RC에 대한 폴리클로날 항혈청을 이용한 FACS 분석에 의해 확인되었다. 사이토카인 결합을 평가하기 위해서, 인간 IL-17A, C, D, E, 및 F의 바이오틴화 형태 및 형광단-콘쥬게이트 스트렙타비딘을 사용하여 유세포분석법에 의해 트랜스펙션된 세포에 대한 사이토카인 결합을 검출하였다. 이 결과는 hIL-17RA를 발현하는 안정하게 트랜스펙션된 BHK 세포는 예상된 대로 인간 IL-17A(hIL-17A)에 결합했지만, 빈 발현 벡터로 트랜스펙션된 것들은 시험된 IL-17 패밀리 중 어떤 구성원과도 결합하지 못했음을 분명히 나타냈다. 또한, 인간 IL-17F(hIL-17F)와 hIL-17RA-트랜스펙션 세포의 상대적으로 약한 결합이 관찰되었지만, 시험된 IL-17 패밀리 중 다른 구성원들의 유의한 결합은 관찰되지 않았다. 다른 IL-17 패밀리 구성원들을 hIL-17RC-트랜스펙션 세포와의 결합에 대해 시험하였으며, 이들 세포가 hIL-17F와 유의한 결합을 나타냈음에 유념한다. 추가하여, hIL-17A와 이들 세포의 유의한 결합이 보였지만, hIL-17C, D 또는 E의 결합은 보이지 않았다. 이 데이터는 hIL-17RC가 hIL-17F 및 hIL-17A 모두에 대한 수용체임을 증명한다.
추가하여, hIL-17RA 및 hIL-17RC에 대한 hIL-17A 및 F의 상대적 친화성을 측정하기 위해 어떤 범위의 사이토카인 농도에 걸쳐 형광의 수준을 시험하였다. 각 트랜스펙션체에 대한 각 사이토카인의 평균 형광 강도를 비교함으로써, hIL-17A는 hIL-17F보다 hIL-17RA에 훨씬 잘 결합했지만, 두 사이토카인 모두 hIL-17RC-트랜스펙션 세포에는 동등하게 잘 결합하는 것처럼 보였음에 유념한다. 흥미롭게도, 두 수용체를 모두 발현했던 세포에 대한 사이토카인 결합은 부가적인 것으로 보이며, 협동작용에 대한 증거는 없었다.
다음에, 비표지 사이토카인과의 결합을 경합시키려 시도함으로써 이 결합의 특이성을 조사하였다. 트랜스펙션된 BHK 세포를 고정된 농도의 바이오틴화 사이토카인 및 증가된 농도의 비표지 사이토카인과 함께 인큐베이션하였고, 결합된 바이오틴화 물질의 양을 FACS에 의해 정량하였다. 증가된 농도의 비표지 사이토카인이 바이오틴화 물질의 결합을 방해했으므로, hIL-17RC에 대한 hIL-17A 및 F 모두의 결합은 특이적인 것으로 밝혀졌다. 사실상, 비표지 hIL-17A 및 F는 hIL-17RC-트랜스펙션 세포에 대한 양 사이토카인의 바이오틴화 형태의 결합에 대해 효과적으로 상호 경합하였으며, 이는 두 사이토카인이 hIL-17RC와 유사한 친화성으로 결합했으며, 이것들이 동일하지는 않지만 중첩된 부위에서 결합했음을 시사한다. 비표지 hIL-17A가 또한 hIL-17RA-트랜스펙션 세포에 대한 바이오틴화 hIL-17A 및 F 모두의 결합에 대해 효과적으로 경합했으며, 비표지 hIL-17F는 hIL-17RA와의 hIL-17A 결합에 대해 경합하는 능력을 본질적으로 나타내지 않았다. 이것은 hIL-17F가 hIL-17RA에 대해서는 특이적 결합을 나타냈지만, 이러한 상호작용의 요구가 hIL-17A와 hIL-17RA의 상호작용에 대한 것보다는 상당히 낮은 것으로 나타났음을 시사하는 것이다.
hIL-17RC 및 hIL-17RA에 대한 hIL-17A 및 hIL-17F 결합의 친화성을 측정하기 위해 포화 결합 연구를 수행하였다. 각 수용체에 대한 각 사이토카인의 친화성 상수를 측정하기 위해 hIL-17RA 또는 hIL-17RC를 안정하게 발현하는 BHK 셀라인을 포화 결합 조건에서 요오드화 hIL-17A 또는 hIL-17F와 함께 인큐베이션하였다. hIL-17A는 hIL-17RA 및 hIL-17RC 모두에 비슷한 친화성으로 결합하였다(표 1). 구체적으로, 적시된 수용체로 트랜스펙션된 BHK 세포를 사용하여 방법에 설명된 대로 hIL-17A 및 hIL-17F에 대한 Kd 값을 확립하였다. 나타낸 결과는 3회 측정으로부터 유래한 평균 Kd 값이다.
hIL-17A hIL-17F
hIL-17RC(x1)1 0.6nM 1.0nM
hIL-17RA 1.9nM 1.5μM
1은 hIL-17RC의 x1 스플라이스 변이체를 나타낸다.
또한, hIL-17RC에 대한 hIL-17F의 친화성은 이 수용체에 대한 hIL-17A의 친화성과 매우 유사했다(상기 표 1 참조). 그러나, 바이오틴화 사이토카인을 이용하여 얻어진 결과와 마찬가지로, hIL-17RA에 대한 hIL-17F의 친화성은 측정된 다른 친화성과 비교하여 거의 1000배 더 낮았다(Id.). 이것은 hIL-17A 및 F가 hIL-17RC와는 유사한 친화성으로 결합하지만, IL-17RA에 대한 친화성은 극히 차이가 남을 시사한다.
hIL-17RC가 hIL-17A 및 F 모두와 높은 친화성으로 결합했다는 관찰은 hIL-17RC를 발현하는 세포가 hIL-17A 및 F와 동등하게 반응할 수 있어야 한다는 것을 시사한다. 한편, hIL-17RA는 높은 친화성으로 hIL-17A와 결합했지만, hIL-17F는 역시 약 1000배 더 낮았기 때문에, 이것은 hIL-17RA를 발현하는 세포가 생리학적 조건에서 hIL-17A에만 반응한다는 것을 암시한다. 이전에 hIL-17RA는 어디에서나 발현된다고 밝혀졌지만, 그것의 발현은 조혈세포에서 더 높으며 다른 조직에서는 낮다고 보고되었다. 따라서, 발현 패턴의 중첩 정도를 측정하기 위해 hIL-17RC의 발현을 시험하였다. 노던블롯 분석은 hIL-17RC가 부신, 전립선, 간, 및 갑상선과 같은 선(glandular) 조직에서는 높은 수준으로 발현되며, 조혈조직에서는 발현이 검출되지 않았음을 나타냈다.
조혈세포에서 이들 수용체의 발현을 더 조사하기 위해서, 다중파라미터 FACS 분석에 의해 바이오틴화 hIL-17A 및 F와 말초혈 단핵세포(PBMC)의 결합을 시험하였다. 결과는 hIL-17A는 실질적으로 모든 시험된 PBMC 하위집단에 결합했지만, hIL-17F는 이들 집단 중 어느 것과도 검출가능한 결합을 나타내지 못했던 것으로 나타났다. 이것은 높은 친화성으로 hIL-17A에 결합하지만 hIL-17F에는 결합하지 않는hIL-17RA의 능력과 일치하며, PBMC에서 hIL-17RC mRNA이 검출되지 않은 것과 일치한다. 총괄하자면, 이들 데이터는 IL-17RC는 비-조혈조직에서 우선적으로 발현되고, IL-17RA는 조혈세포에서 우선적으로 발현된다는 것을 시사한다.
hIL-17A 및 F와 hIL-17RC-트랜스펙션 세포의 고 친화성 결합은 가용성 형태의 hIL-17RC가 효과적인 치료제가 될 수 있음을 시사한다. 이러한 분자는 이들 두 사이토카인의 효과적인 길항제일 것이다. 이것을 직접 시험하기 위해서, Fc-융합 단백질로서 가용성 형태의 인간 hIL-17RC를 생산하고, hIL-17A와 F 모두의 결합을 억제하는 능력을 시험하였다. 다음에, 이들 효과를 가용성 형태의 hIL-17RA를 사용하여 얻어진 결과와 비교하였다. 증가된 농도의 hIL-17RC-Ig 또는 hIL-17RA-Ig를 결합 반응에 포함시켰고, FACS 분석을 이용하여 바이오틴화 사이토카인과 안정하게 트랜스펙션된 BHK 세포의 결합에 대한 가용성 수용체의 효과를 평가하였다. 가용성 hIL-17RC는 hIL-17A와 F 모두의 결합을 유사한 정도로 억제하였지만, IL-17R 패밀리의 다른 구성원의 Fc-융합 단백질인 hIL-17RD는 영향을 미치지 않았다. 한편, 가용성 hIL-17RA는 hIL-17A의 결합을 효과적으로 차단했지만, hIL-17F의 결합에는 본질적으로 영향을 미치지 않았다. hIL-17A와 조혈세포의 결합을 시험한 바, 유사한 결과가 얻어졌다. 이 결합은 hIL-17RA-Ig와 hIL-17RC-Ig에 의해 효과적으로 차단되었지만, hIL-17RD-Ig에 의해서는 차단되지 않았다. 이들 데이터는 친화성 측정으로부터 얻어진 결과와 일치하며, 가용성 수용체가 이들의 멤브레인-고정 형태와 동일하게 거동하고 있음을 시사한다.
hIL-17A 및 F와 결합하는 인간 hIL-17RC-Ig의 능력을 추가로 평가하기 위해, 이들 사이토카인의 가용성 수용체의 친화성을 Biacore 분석을 이용하여 평가하였다. 가용성 hIL-17RC는 hIL-17A 및 F 모두와 높은 친화성으로 결합했으며(표 2), 이는 이 시약을 생체내에서 hIL-17A 및 F 모두의 작용에 대한 길항제로서 이용할 수 있다는 것을 추가로 뒷받침한다. 구체적으로, 가용성 수용체는 칩 상에서 포착되었으며, 결합 실험은 하기 설명된 대로 수행되었다. ND = 검출가능한 결합 없음.
Figure 112009064297438-PCT00001
인간에서 스플라이스 변이체의 수는 훨씬 더 많으며, 따라서 본 출원인은 초기 실험을 이들 분자의 하위집단에 대해서만 수행했다. 이 분석을 위해 선택된 것들은 또한 엑손 7이 포함되느냐 제외되느냐의 차이가 있었지만, 마우스와는 달리, 모든 스플라이스 변이체는 모든 엑손 8을 포함했다. 마우스 엑손 8 서열의 중앙에서 발견되는 잠복 스플라이스 어셉터는 인간 엑손 8에는 존재하지 않는다. 그러나, 시험된 나머지 스플라이스 변이체들에는 hIL-17RC 엑손 12가 포함되거나 제외되었다. 이들 변이체는 hIL-17RCx1(상기 마우스 x1와 엑손 조성이 동일), hIL-17RCx4(상기 마우스 x4와 엑손 조성이 동일), hIL-17RCx2, 및 hIL-17RCx7로 명명되었다. 다시, 이들 스플라이스 변이체들을 293F 세포에서 일시적으로 발현시켰고, 바이오틴화 마우스 및 인간 IL-17A 및 F와 결합하는 능력에 대해 시험하였으며, 그 결과를 표 3에 요약한다.
Figure 112009064297438-PCT00002
앞서 나타낸 실험들과 일치하여, hIL-17RCxlsms hIL-17A 및 F 모두와 결합했지만, 마우스 사이토카인과는 결합하지 않았다. 또한, hIL-17RCx4도 인간 사이토카인 모두와 결합했고, 마우스 대응물과 마찬가지로, mIL-17F에는 결합했지만 mIL-17A에는 결합하지 않았다. hIL-17RCx2 및 x7은 시험된 4개의 사이토카인 중 어느 것과도 결합하지 않았지만, 이들은 hIL-17RC에 대한 폴리클로날 항혈청이 CD8+ 세포를 염색시켰으므로, 트랜스펙션된 세포의 표면에서 발현되었음이 분명하다(데이터는 나타내지 않음). 이들 결합 결과는 또한 안정하게 트랜스펙션된 BHK 세포에서도 충실히 반복되었다. 총괄하면, 이들 데이터는 인간 사이토카인과 결합하는데 필요한 IL-17RC 단백질의 필수적인 부분에 관한 결론을 뒷받침한다.
마우스 콜라겐-유도 관절염(CIA) 및 인간 류마티스 관절염에서 질환 진행 및 심각도에 기여하는바, 수많은 간행물이 IL-17A를 다루고 있으며, 정도는 덜하지만, IL-7F도 다루고 있다. CIA를 유도할 수 있는 콜라겐으로 면역화된 마우스의 관절 또는 배출 림프절(DLN)에서 mIL-17A 및 F 모두의 발현이 시험되었다. 실시간 PCR에 의한 분석은 양 사이토카인이 면역화되지 않은 대조군에 비해 질환에 걸린 마우스의 두 조직에서 모두 상향조절되었음을 분명히 증명했으며, 이것은 발현과 질환이 상호관련됨을 분명히 시사한다. 추가하여, 동일한 조직에서 mIL-17RA 및 mIL-17RC의 상대적인 발현을 또한 시험하였다. 그러나, 이 경우, 질환과 어느 한 수용체의 발현의 재현가능한 상호관련성은 없었다. 더욱이, DLN과 비-조혈조직(뒷발)을 비교한 발현에서는 분명한 모순이 있었다. 인간 수용체의 발현을 추적한 이전 결과와 일치하여, mIL-17RA는 조혈조직에서 더욱 많이 발현되고, mIL-17RC는 비-조혈조직에서 더욱 많이 발현되는 것으로 판명되었다. 이 데이터는 mIL-17A 및 mIL-17F 발현과 질환의 상호관련되며, 필요한 수용체 모두가 질환 조직 및 정상 조직에 존재한다는 것을 시사하며, 이들 사이토카인의 중화가 질환 진행을 예방하기 위한 효과적인 치료법일 수 있음을 시사한다.
따라서, IL-17RC는 IL-17A 및 F의 동족 수용체인 것으로 밝혀졌다. 주목할 점은, hIL-17RC가 hIL-17A 및 F와 유사한 친화성으로 결합한다는 것이다. IL-17 패밀리의 이들 두 구성원은 55%의 서열 동일성을 공유하므로, 이들이 수용체를 공유한다는 것도 아마 놀라운 일은 아니다. 그러나, hIL-17RA는 hIL-17A와는 높은 친화성으로 결합하지만, hIL-17F와는 거의 1000배 더 낮은 친화성으로 결합하는데, 이는 생리학적 조건에서 hIL-17RA가 hIL-17F와는 결합하지 않을 수도 있다는 것을 시사한다. 이것은 hIL-17RC를 발현하는 세포는 hIL-17A와 F에 모두 반응하지만, hIL-17RA만을 발현하는 세포는 IL-17A에만 반응할 것임을 내포하는 것이다. 이런 차이는 이들 사이토카인이 상이한 조직들에 영향을 미치는 방식에 영향력을 미칠 가능성을 가진다. 발현 분석을 통해서, IL-17RA는 어디에서나 발현되지만, 조혈세포에서 더 많이 발현되며, IL-17RC는 비-조혈조직에서 발현되려는 경향이 있고, 조혈세포에서는 발현되지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이것과 일치하여, 인간 말초혈 단핵세포의 모든 하위집단은 hIL-17A와 결합하지만, hIL-17F와는 결합하지 않는다. 더욱이, 이는 비-조혈조직은 IL-17A 및 F 모두에 반응해야 하지만, 조혈세포는 IL-17A에만 반응해야 한다는 것을 시사한다.
상이한 IL-17RC 스플라이스 변이체와 결합하는 사이토카인에 대한 이 시험에 의해 수용체의 두 부분이 사이토카인 결합에 필수적이며, 마우스와 인간의 사이토카인의 결합 특징에는 미묘한 차이가 있다는 것이 드러났다. 더욱이, 이런 특징들은 시험된 수용체의 종을 불문하고 사이토카인에 대해 일치한다. 표 3에 제시된 데이터로부터 밝혀진 대로, 이들 사이토카인이 인간 x1 변이체 및 인간 x4 변이체에만 결합하기 때문에, 엑손 12 및 모든 엑손 8이 hIL-17A 및 F가 IL-17RC와 결합하는데 필요하다. 이들 동형(isoform)은 각각 모든 엑손 8과 엑손 12를 포함하지만, 이들은 엑손 7이 포함되느냐 아니냐에 따라서 차이가 있다. 이것은 엑손 7이 인간 사이토카인의 결합에 없어도 된다는 것을 내포한다.
IL-17A 및 IL-17F 기능 모두에 대한 길항제를 생성하는 것은, IL-17A 및 F 발현과 많은 자가면역 질환 및 염증성 질환의 진행 사이의 강한 상호관련성을 나타낸 이용가능한 정보로부터 분명히 중요하다. 이들 두 사이토카인은 자가면역 관절염에서 콜라겐 및 뼈 파괴에 기여하는 메탈로프로테아제 뿐만 아니라, 다른 염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도한다. 이 시약은 류마티스 관절염 및 hL-17A 및 F가 역할을 하는 다른 염증성 질환에 대한 효과적인 치료제로서 사용되어야 한다.
따라서, 인간 IL-17RC의 가용성 형태가 IL-17A 및 IL-17F 모두에 대한 길항제로서 사용할 수 있도록 개발되었다. 치료학적으로 이들 가용성 IL-17RC 폴리펩티드는 효과적이었다. 그러나, 많은 요인들로 인해, 가용성 IL-17RC는 분 분야에서 이용가능한 수많은 가변적인 생산 시스템에서 쉽게 분비되지 않는다. 더욱이, 이것은 제조 목적에 필요한 충분한 양으로도 분비되지 않는다. 따라서, 본 분야에서는 제조에 알맞은 규모로 증가될 수 있는 양으로 발현 및 분비될 수 있는 IL-17A 및 IL-17F에 대한 길항제를 개발하는 것이 필요하다.
따라서, 본 발명은 발현 및 분비될 수 있는 IL-17A 및 IL-17F 길항제를 제공함으로써 이 필요성을 해결한다. 구체적으로, 본 발명은 IL-17A 및 IL-17F와 결합하고, IL-17A 및 IL-17F와 이들의 동족 수용체(들)의 결합을 길항 및/또는 차단하는 많은 비-천연 발생 가용성 분자 또는 가용성 폴리펩티드의 개발 및 발견에 기초한다. 이들 가용성 폴리펩티드는 IL-17RC의 일부분을 포함한다. 이들 가용성 폴리펩티드는 또한 IL-17RC 및 IL-17RA("IL-17RC/IL-17RA") 모두의 일부분을 포함할 수 있다.
한 이러한 바람직한 구체예가 도 4A 및 4B와 SEQ ID NO:157 및 158에 설명된다. 이 가용성 폴리펩티드는 인간 IL-17RA(SEQ ID NO:21)의 엑손 1-6과 인간 IL-17RCx1(SEQ ID NO:2)의 엑손 8-16을 포함한다. 더 구체적으로, 이 가용성 폴리펩티드는, SEQ ID NO:157 및 158에 함유된 Fc5와 같은 Fc 분자와 융합된다. 그러나, 당업자는 어떤 Fc 분자라도 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 이량체화를 가져오는 어떤 다른 분자들도 이용될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
이와 같이, IL-17F 및 IL-17A 활성에 대한 길항제, 예를 들어 본 발명의 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 가용성 수용체는 염증성 질환의 치료학적 치료제로서, 특히 이들 분자가 관련 질환의 치료에서 단독으로 또는 함께 IL-17F와 IL-17A 모두에 대한 길항제로서 유용하다. 더욱이, IL-17A 및 IL-17F 활성에 대한 길항제, 예를 들어 본 발명의 가용성 수용체는 다른 염증성 질환의 치료학적 치료에 유용한데, 예를 들면 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 다발성 경화증, 전신성 경화증, 신증후군, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, 신혈관생성 및 가와사키병의 치료에서 IL-17F 및 IL-17A(개별적으로 또는 함께)와 결합하거나, 이들을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화한다.
사이토카인 수용체 서브유닛(subunit)은 전형적으로 신호전달에 관련된 리간드-결합 도메인 및 작용자 도메인을 포함한 다중 도메인 구조를 특징으로 한다. 멀티머 사이토카인 수용체는 모노머, 호모다이머(예를 들면, PDGF 수용체 αα 및 ββ 이소형태, 에리트리포이에틴 수용체, MPL[트롬보포이에틴 수용체], 및 G-CSF 수용체), 각 서브유닛이 리간드-결합 및 작용자 도메인을 가진 헤테로다이머(예를 들면, PDGF 수용체 αβ 이소형태), 및 다른 기능을 갖는 구성 서브유닛을 가진 멀티머(예를 들면, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 및 GM-CSF 수용체)를 포함한다. 일부 수용체 서브유닛은 복수의 수용체에 대하여 공통이다. 예를 들면, 그 자체로는 리간드와 결합할 수 없지만, 세포내 신호전달 도메인을 포함한 AIC2B 서브유닛은 IL-3 및 GM-CSF 수용체의 구성요소이다. 많은 사이토카인 수용체는 그것들의 구조 및 기능에 기초하여 4개의 관련된 패밀리 중 하나에 속할 수 있다. 예를 들면, 제 I 부류(class I) 조혈 수용체는 보존된 시스테인 잔기 및 WSXWS 모티프를 함유한 도메인의 존재를 특징으로 한다. 어떤 조혈 수용체에서는, 단백질 키나제 도메인; 피브로넥틴 III형 도메인; 및 이황화 결합된 루프를 특징으로 하는 면역글로불린 도메인을 포함한 다른 도메인이 존재한다. 사이토카인 수용체 구조는 문헌(Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991 and Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993)에서 검토되었다. 일반적으로 개체가 새로운 생물학적 기능을 획득하는 선택적 압력 하에서, 새로운 수용체 패밀리 구성원은 다유전자 패밀리의 존재를 야기하는 기존의 수용체 유전자의 복제로부터 발생한 것으로 믿어진다. 따라서 패밀리 구성원은 조상 유전자의 흔적을 갖기 때문에, 이들의 특징적인 성질은 추가 패밀리 구성원의 분리 및 확인에 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 각각의 리간드가 상응하는 수용체 또는 수용체들을 통해 결합 및/또는 신호화하는 것을 차단하는 IL-17A 및 IL-17F 길항제에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 이러한 길항제는 도 1-4에 묘사된 IL-17RC 폴리펩티드 구조에 기초한다. IL-17RC 수용체는 특이적 엑손의 포함 또는 배제에 기초하여 많은 수의 스플라이스 변이체들을 가진다. 하기 설명된 대로, 이들 엑손 중 일부는 리간드(IL-17A 및/또는 IL-17F) 결합에 필요하다.
본 발명은 IL-17RC와 IL-17 패밀리의 다른 구성원들, 예를 들어 IL-17RA(SEQ ID NO:21) 사이의 구조적인 유사성("도메인")의 발견에 일부 기초한다. 구체적으로, 3개의 도메인이 확인되었다:
1) 도메인 1(SEQ ID NO:159 및 160)은 IL-17RC의 엑손 8-10을 포함한다. 이것은 (SEQ ID NO:2)의 IL-17RCx1의 아미노산 잔기 193-276 및 (SEQ ID NO:166)의 IL-17RCx4의 아미노산 잔기 208-291에 상응한다.
2) 도메인 2(SEQ ID NO:161 및 162)는 IL-17RC의 엑손 11-13을 포함한다. 이것은 (SEQ ID NO:2)의 IL-17RCx1의 아미노산 잔기 277-370 및 (SEQ ID NO:166)의 IL-17RCx4의 아미노산 잔기 292-385에 상응한다.
3) 도메인 3(SEQ ID NO:163 및 164)은 IL-17RC의 엑손 14-16을 포함한다. 이것은 (SEQ ID NO:2)의 IL-17RCx1의 아미노산 잔기 371-447 및 (SEQ ID NO:166)의 IL-17RCx4의 아미노산 잔기 386-462에 상응한다.
따라서, 본 발명은 도 1에 묘사된 엑손들의 상이한 조합들에 기초한 가용성 IL-17RC 폴리펩티드에 관한 것이다. 구체적으로, 이들 가용성 폴리펩티드의 예는 다음을 포함한다:
1) 변이체 1210(SEQ ID NO:67 및 68), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-6 및 8-16을 포함하고, 링커(SEQ ID NO:176 및 177)에 의해 Fc10(SEQ ID NO:174 및 175)와 융합된다. 또한, 변이체 1210은 otPA(SEQ ID NO:178에 나타낸 폴리펩티드 서열)로부터의 프레-프로(pre-pro) 신호 펩티드를 가진다. 또한, Fc5 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc10을 대신하여 사용될 수 있다.
2) 변이체 1390(SEQ ID NO:69 및 70), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-6 및 8-16을 포함하고, Fc1O(SEQ ID NO:174 및 175)와 융합된다. 또한, 변이체 1390은 자생(native) 신호 서열을 가진다. 또한, Fc5 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc10을 대신하여 사용될 수 있다.
3) 변이체 1341(SEQ ID NO:71 및 72), 이것은 뮤린 IL-17RA의 엑손 1-6 및 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-16을 포함하고, 링커(SEQ ID NO:176 및 177)에 의해 Fc1O (SEQ ID NO:174 및 175)와 융합된다. 또한, 변이체 1341은 뮤린 IL-17RA(SEQ ID NO:181)로부터의 신호 펩티드를 가진다. 또한, Fc5 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc10을 대신하여 사용될 수 있다.
4) 변이체 1342(SEQ ID NO:73 및 74), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-16을 포함하고, 링커(SEQ ID NO:176 및 177)에 의해 Fc1O (SEQ ID NO:174 및 175)와 융합된다. 또한, 변이체 1342는 otPA(SEQ ID NO:178에 나타낸 폴리펩티드 서열)로부터의 프레-프로 신호 펩티드를 가진다. 또한, Fc5 또는 본 분야에 공지된 어떤 동등물이 Fc10을 대신하여 사용될 수 있다.
5) 변이체 S1(SEQ ID NO:77 및 78), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-7을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S1은 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc10 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
6) 변이체 S2(SEQ ID NO:81 및 82), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-8을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S2는 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc10 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
7) 변이체 S3(SEQ ID NO:85 및 86), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-9를 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S3은 자생 신호 서열을 가진다. Fc10 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
8) 변이체 S4(SEQ ID NO:89 및 90), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-10을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S4는 자생 신호 서열을 가진다. Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
9) 변이체 S5(SEQ ID NO:93 및 94), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-11을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S5는 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
*10) 변이체 S6(SEQ ID NO:97 및 98), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 14-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S6은 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc10 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
11) 변이체 S7(SEQ ID NO:101 및 102), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 11-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S7은 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
12) 변이체 S1O(SEQ ID NO:105 및 106), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 7-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S1O은 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
13) 변이체 S11(SEQ ID NO:109 및 110), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-7 및 14-16를 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S11은 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
14) 변이체 S12(SEQ ID NO:113 및 114), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-7 및 11-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S12는 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
15) 변이체 S13(SEQ ID NO:117 및 118), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-13 및 인간 IL-17RA의 엑손 7-9를 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S13은 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
16) 변이체 S14(SEQ ID NO:121 및 122), 이것은 뮤린 IL-17RA의 엑손 1-6, 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-13 및 뮤린 IL-17RA의 엑손 7-9를 포함하고, Fc5(SEQ ID NO: 179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 S13은 자생 신호 서열을 포함한다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 다른 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
17) 변이체 1407(SEQ ID NO:139 및 140), 이것은 인간 IL-17RA의 엑손 1-10 및 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 1407은 인간 IL-17RA로부터의 자생 신호 펩티드를 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
18) 변이체 1459(SEQ ID NO:151 및 152), 이것은 인간 IL-17RCx1의 엑손 1-6 및 8-16을 포함하고, (IL-17RCx1와 비교하여) Leu21Ala 치환된 Fc5(SEQ ID NO: 179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 1459는 otPA(SEQ ID NO:178에 나타낸 폴리펩티드 서열)로부터의 프레-프로 신호 펩티드를 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
19) 변이체 1454(SEQ ID NO:157 및 158), 이것은 인간 IL-17RA의 엑손 1-6 및 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)와 융합된다. 또한, 변이체 1454는 인간 IL-17RA로부터의 자생 신호 펩티드를 가진다. 또한, Fc1O 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다. 변이체 1454 폴리펩티드의 성숙형은 서열 SEQ ID NO: 183로 나타내고, SEQ ID NO: 182의 핵산 분자에 의해 인코딩된다. 진핵세포에서의 발현을 위해, 인간 IL-17RA 신호서열 대신 다른 분비 신호서열, 예를 들면 IL-17RC 신호서열(SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 1-20), otPA 프레-프로 신호서열(SEQ ID NO: 178), 인간성장호르몬 신호서열(SEQ ID NOs: 168 및 169), 및 인간 CD33 신호서열(SEQ ID NOs: 172 및 173) 등이 이용될 수 있다. 선택적으로는, 변이체 1454로부터 C-말단 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 183의 잔기 658(Lys))가 절단 또는 제거된다.
상기 설명된 변이체들은 본 발명의 구체예들 중 단지 제한된 수만을 나타낸 것이다. 당업자는 쉽게 과도한 실험 없이 본 출원의 교시 및 특히 본원에 포함된 도 1-4에 기초하여 다른 IL-17RC 및/또는 IL-17RC/IL-17RA 변이체들을 설계하고 시험할 수 있을 것이다. 예를 들어, 상기 개시된 것들을 대신하여 사용될 수 있는 다른 신호 펩티드들은 인간 성장 호르몬 신호 펩티드(SEQ ID NO:168 및 169), 뮤린 면역글로불린 중쇄 가변영역(VH 26-10)(SEQ ID NO:170 및 171), 또는 CD33(SEQ ID NO:172 및 173)을 포함한다.
다른 발명 중에서도, 특히 본 발명은 본 발명의 가용성 수용체의 신규한 용도를 제공한다. 이들 가용성 수용체는 IL-17RC만을 기초로 할 수도 있으며("IL-17RC" 또는 "가용성 IL-17RC" 또는 "sIL-17RC"라고 명명됨, 이것 모두는 상호교환하여 본원에서 사용될 수 있음), 또는 IL-17RA의 일부분을 IL-17RC와 조합한 것에 기초할 수도 있다("IL-17RC/IL-17RA", "하이브리드 RC/RA" "RC/RA", "IL-17RA/RC" 또는 이들의 어떤 변형, 예를 들면 변이체 1454, 이것 모두는 상호교환하여 본원에서 사용될 수 있음). 또한, 본 발명은 인간의 염증성 질환 및 자가면역질환에서 사용하기 위한 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 단편 및 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 가용성 수용체는 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 내독소증, IBD, IBS, 대장염, 천식, 동종이식 거부, 면역 매개 신질환, 간담즙 질환, 다발성 경화증, 죽상경화증, 종양 성장의 촉진, 또는 퇴행성 관절 질환 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태들의 치료에서 IL-17F 또는 IL-17A 중 어느 하나, 또는 IL-17A와 IL-17F 모두의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 사용될 수 있다.
인간 IL-17RC("IL-17RCx1")을 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:1에 제공되고, 암호화된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2에 나타낸다. IL-17RC는 IL-17A(SEQ ID NO:13 및 14)와 IL-17F(SEQ ID NO:15 및 16) 모두의 수용체로서 기능한다. IL-17RC는 모노머, 호모다이머, 또는 헤테로다이머로서 작용할 수 있다. 바람직하게, IL-17RC는 IL-17A 및/또는 IL-17F에 대한 호모다이머 수용체로서 작용한다. 본 출원에 설명된 대로, 모노머 또는 호모다이머 수용체는 IL-17RC를 단독으로 포함할 수도 있고, 또는 IL-17RA와 같은 기타 IL-17 패밀리 수용체의 일부를 포함할 수도 있다("IL-17RC/IL-17RA"). 이와 같이, 본 발명은 IL-17RA, IL-17RE 또는 어떤 다른 IL-17 패밀리 수용체와 조합하여 IL-17RC의 일부분을 포함하는 가용성 수용체들을 포함한다. 또한, IL-17RC는 IL-17-관련 사이토카인의 헤테로다이머 수용체 서브유닛으로서 작용할 수도 있다. 예를 들어, IL-17RC는 IL-17RA 또는 다른 IL-17-형 수용체와 헤테로다이머를 형성할 수 있다. IL-17RC는 공동 소유의 미국특허 출원 제10/458,647호 및 공동 소유의 WIPO 공개 제WO 01/04304호에 개시되며, 이것들은 모두 참고자료로서 그 전문이 본원에 포함된다. IL-17RC(SEQ ID NO:1)을 암호화하는 인간 cDNA 클론의 분석에 의해 약 20개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1에서 20)의 잠정적 신호 서열, 약 431개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 21-452; SEQ ID NO:3)의 세포외 리간드-결합 도메인, 약 20개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 453-473)의 트랜스멤브레인 도메인, 및 약 203개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 474에서 677)의 세포내 도메인을 포함하는 692개 아미노산(SEQ ID NO:2)를 암호화하는 오픈 리딩 프레임이 밝혀졌다. 또한, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO:22로 표시된다.
"IL-17RCx4"로 명명된 변이체 인간 IL-17RC를 암호화하는 또 다른 예시적인 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:165에 의해 제공되며, 암호화된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:166에 나타낸다. 예상된 신호 펩티드는 SEQ ID NO:165의 잔기 1-60 및 SEQ ID NO:166의 잔기 1-20으로부터, 세포외 도메인은 SEQ ID NO:165의 잔기 61-1401 및 SEQ ID NO:166의 잔기 21-467로부터, 트랜스멤브레인 도메인은 SEQ ID NO:165의 잔기 1402-1464 및 SEQ ID NO:166의 잔기 468-488로부터, 그리고 세포내 도메인은 SEQ ID NO:165의 잔기 1465-2121 및 SEQ ID NO:166의 잔기 489-707로부터 유래한다.
"IL-17RC-1"로 명명된 변이체 인간 IL-17RC를 암호화하는 또 다른 예시적인 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:4에 의해 제공되며, 암호화된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5에 나타낸다. IL-17RC-1은 공동 소유의 미국특허 출원 제10/458,647호 및 공동 소유의 WIPO 공개 제WO 01/04304호에 개시되며, 이것들은 모두 본원에 참고자료로서 그 전문이 포함된다. 서열 분석에 의해 IL-17RC-1가 수용체 폴리펩티드의 절단된 형태임이 드러났다. 즉, IL-17RC-1는 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1-113을 결여한다. SEQ ID NO:10은 IL-17RC의 N-말단 부분을 포함하는 IL-17RC-1 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
또한, IL-17RC와 IL-17RC-1의 아미노산 서열의 비교결과는, 이 두 폴리펩티드가 다른 방식의 스플라이스 변이체를 나타낸다는 것을 시사한다. IL-17RC의 아미노산 서열은 IL-17RC-1이 결여하고 있는 17개 아미노산 세그먼트(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 339에서 355)를 포함하지만, IL-17RC는 아미노산 479 이후에 IL-17RC-1에서 발견되는 13개의 아미노산 세그먼트(SEQ ID NO:5의 아미노산 잔기 350에서 362)를 결여한다. 두 아미노산 세그먼트를 모두 함유하는 폴리펩티드가 SEQ ID NO:11에 의해 제공되며, SEQ ID NO:12는 13개 및 17개 아미노산 세그먼트를 모두 결여하고 있는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
"IL-17RC-6"로 명명된 변이체 인간 IL-17RC를 암호화하는 또 다른 예시적인 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:23에 의해 제공되며, 암호화된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:24에 나타낸다. IL-17RC-6은, SEQ ID NO:2로 표시되는 IL-17RC와 비교하여 25개의 아미노산 잔기가 결실되어 있다. 구체적으로, IL-17RC-6은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 94에서 118을 함유하지 않는다. IL-17RC-6(SEQ ID NO: 23)을 암호화하는 인간 cDNA 클론의 분석에 의해, 약 427개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:24의 아미노산 잔기 1-427)의 세포외 리간드-결합 도메인, 약 20개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:24의 아미노산 잔기 428-448)의 트랜스멤브레인 도메인, 및 약 218개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:24의 아미노산 잔기 449-667)의 세포내 도메인이 밝혀졌다.
변이체 뮤린 IL-17RC를 암호화하는 예시적인 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:25에 의헤 제공되며, 암호화된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:26에 나타낸다. 뮤린 IL-17RC는 뮤린 IL-17A(SEQ ID NO:17 및 18)과 뮤린 IL-17F(SEQ ID NO:19 및 20) 모두에 대한 수용체로서 기능한다. IL-17RC(SEQ ID NO:25)를 암호화하는 뮤린 cDNA 클론의 분석에 의해 약 449개 아미노산 잔기(SEQ ID NO:27)의 세포외 리간드-결합 도메인이 밝혀졌다. 또한, 리간드 결합 도메인은 SEQ ID NO:28로 표시된다.
변이체 뮤린 IL-17RC를 암호화하는 또 다른 예시적인 뉴클레오티드 서열이 SEQ ID NO:29에 의해 제공되며, 암호화된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:30에 나타낸다.
IL-17RC 유전자는 염색체 3p25 - 3p24에 존재한다. 하기와 같이, 이 영역은 다양한 장애 및 질환과 관련된다.
노던 분석결과는, 갑상선, 부신, 전립선 및 간 조직에서 IL-17RC 유전자의 강한 발현이 있고, 심장, 소장, 위 및 기관 조직에서는 약한 발현이 있음을 시사한다. 반면에, 뇌, 태반, 폐, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 결장, 말초혈액 백혈구, 척수, 림프절 및 골수에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않는다. 이는 IL-17RC 서열이 다양한 조직 사이에서 차별하여 사용될 수 있음을 나타낸다.
하기 설명된 대로, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 21-692의 기준 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 95% 이상, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 또는 그 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합한다. 또한, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 21에서 452, (b) SEQ ID NO:10의 아미노산 잔기 21에서 435, (c) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 21에서 677, 및 (d) SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1에서 692로 구성되는 군으로부터 선택된 기준 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 분리된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 특이적으로 결합한다. 예시적인 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포외 도메인을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 세포외 도메인은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 21에서 452, 또는 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 21에서 435를 포함한다. 더 나아가, 이러한 폴리펩티드는 세포외 도메인에 비하여 카르복실-말단 위치에 존재하는 트랜스멤브레인 도메인을 포함하며, 상기 트랜스멤브레인 도메인은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 453에서 473을 포함한다. 또한, 이들 폴리펩티드는 트랜스멤브레인 도메인에 비하여 카르복실-말단 위치에 존재하는 세포내 도메인, 및 선택적으로 세포외 도메인에 비하여 아미노-말단 위치에 존재하는 신호 분비 서열을 포함하는데, 상기 세포내 도메인은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 474에서 677, 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 잔기 457에서 673을 포함하고, 상기 신호 분비 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1에서 20을 포함한다.
또한, 본 발명은 변이체 IL-17RC 폴리펩티드를 포함하며, 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열과 적어도 70% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 95% 이상 동일성을 공유하고, 이때 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열과 SEQ ID NO:2의 아미노산 서열의 차이는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환으로 인한 것이다.
더욱이, 본 발명은 또한 IL-17F(예를 들어, SEQ ID NO:16에 나타낸 인간 IL-17F 폴리펩티드 서열)에 결합하는 상기 개시된 바와 같은 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 인간 IL-17F 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:15에 나타낸다. 마우스 IL-17F 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:19에 나타내고, 상응하는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:20에 나타낸다. 또한, 본 발명은 IL-17A(예를 들어, SEQ ID NO:14에 나타낸 인간 IL-17A 폴리펩티드 서열)과 결합하는 상기 개시된 바와 같은 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 인간 IL-17A 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:13에 나타낸다. 마우스 IL-17A 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:17에 나타내고, 상응하는 폴리펩티드는 SEQ ED NO:18에 나타낸다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 3의 적어도 15개 연속 아미노산 잔기를 포함하는 분리된 폴리펩티드 및 에피토프를 제공한다. 예시적인 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 3, 이것의 항원성 에피토프, 또는 이것의 기능적 IL-17A 또는 IL-17F 결합 단편을 포함하거나 또는 구성되는 폴리펩티드를 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-17F 또는 IL-17A와 결합하거나, IL-17F 또는 IL-17A의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 상기 개시된 바와 같은 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 변이체 IL-17RC 폴리펩티드를 포함하며, 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기와 적어도 70% 동일성, 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 95% 이상 동일성, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 또는 그 이상의 동일성을 공유하고, 이때 변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열과 SEQ ID NO:2의 상응하는 아미노산 서열의 차이는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환으로 인한 것이다. 이러한 보존성 아미노산 치환은 본원에 설명된다. 더욱이, 본 발명은 또한 IL-17F 또는 IL-17A와 결합하거나, IL-17F 또는 IL-17A의 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 상기 개시된 바와 같은 분리된 폴리펩티드를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 제약학상 허용되는 담체 및 이러한 발현 벡터 또는 이러한 발현 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 중 적어도 하나를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 더 나아가, 본 발명은 제약학상 허용되는 담체 및 본원에 설명된 폴리펩티드 또는 항체를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
또한, 본 발명은 IL-17RC 폴리펩티드와 면역글로불린 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 이러한 융합 단백질에서, 면역글로불린 부분은 면역글로불린 중쇄 불변영역, 예를 들어 인간 Fc 단편일 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 이러한 융합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기 상세한 설명을 참조하면 명백해질 것이다. 뿐만 아니라, 다양한 참고문헌이 하기에 확인되었고 전부 참고문헌으로 포함된다.
B) 정의
이어지는 설명에서, 많은 용어들이 광범위하게 사용된다. 하기 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공된다.
본원에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 디옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의하여 생성된 단편, 및 연결, 절단, 엔도뉴클레아제 작용 및 엑소뉴클레아제 작용 중 어떤 것에 의하여 발생된 단편을 말한다. 핵산 분자는 자연적으로 발생한 뉴클레오티드(예를 들면 DNA 및 RNA)인 모노머, 또는 자연적으로 발생한 뉴클레오티드의 유사체(예를 들면, 자연적으로 발생한 뉴클레오티드의 α-거울상이성질체 형태), 또는 두 개의 조합으로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 부분 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 부분에 변형을 가질 수 있다. 예를 들면, 당 변형은 하나 이상의 히드록실기를 할로겐, 알킬기, 아민, 및 아지도기로 치환하는 것을 포함하거나, 또는 당은 에테르 또는 에스테르로 기능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 부분은 아자-당 및 카르보사이클릭 당 유사체와 같이 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조로 치환될 수 있다. 염기 부분에서의 변형의 예는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 주지된 헤테로사이클릭 치환기를 포함한다. 핵산 모노머는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 결합의 유사체에 의하여 결합될 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐리데이트, 포스포라미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 백본에 부착된 자연적으로 발생한 또는 변형된 핵산 염기를 포함한 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
용어 "핵산 분자의 상보체"는 기준 뉴클레오티드 서열와 비교되는 상보적 뉴클레오티드 서열 및 역방향을 가진 핵산 분자를 말한다. 예를 들면, 서열 5'- ATGCACGGG-3'은 5'-CCCGTGCAT-3'에 상보적이다.
용어 "축퇴성(degenerate) 핵산 서열"은 폴리펩티드를 코딩하는 기준 핵산 분자에 비해서 하나 이상의 축퇴성 코돈을 포함한 뉴클레오티드의 서열을 말한다. 축퇴성 코돈은 뉴클레오티드의 다른 트리플렛을 함유하지만, 동일한 아미노산 잔기를 코딩한다(즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 각각 Asp를 코딩한다).
용어 "구조 유전자"는 메신저 RNA(mRNA)로 전사되고, 그 후 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열로 번역되는 핵산 분자를 말한다.
"분리된 핵산 분자"는 개체의 게놈 DNA에 통합되지 않은 핵산 분자이다. 예를 들면, 세포의 게놈 DNA로부터 분리된, 성장 인자를 코딩하는 DNA 분자는 분리된 DNA 분자이다. 분리된 핵산 분자의 다른 예는 개체의 게놈에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 핵산 분자이다. 특정 종에서 분리된 핵산 분자는 그 종의 염색체의 완전한 DNA 분자보다 더 작다.
"핵산 분자 구성체"는 자연에 존재하지 않은 배열로 결합되고 병치된 핵산의단편을 함유하도록, 인위적으로 변형된 단일 또는 이중 가닥의 핵산 분자이다.
"선형 DNA"는 자유 5' 및 3' 말단을 가진 비-고리형 DNA 분자를 나타낸다. 선형 DNA는 효소적 분해 또는 물리적 파괴에 의하여 플라스미드와 같은 폐쇄 고리형 DNA 분자로부터 제조될 수 있다.
"상보적 DNA(cDNA)"는 효소 역전사효소에 의하여 mRNA 주형으로부터 형성된 단일 가닥 DNA 분자이다. 전형적으로, 역전사의 개시를 위하여 mRNA의 일부에 상보적인 프라이머를 도입한다. 당해 기술분야의 숙련자들은 용어 "cDNA"를 이러한 단일 가닥 DNA 분자 및 그것의 상보적 DNA 가닥으로 구성된 이중 가닥 DNA 분자를 말하는 것으로 사용한다. 용어 "cDNA"는 또한 RNA 주형으로부터 합성된 cDNA 분자의 클론을 말한다.
"프로모터"는 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 부위에 인접한 유전자의 5' 비-코딩 영역에 위치한다. 전사 개시시 기능하는 포로모터 내의 서열 요소는 흔히 공통의 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 이들 프로모터 인자는 RNA 폴리머라제 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 인자(DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), 고리형 AMP 반응 인자 (CRE), 혈청 반응 인자 (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), 글루코코르티코이드 반응 인자 (GRE), 및 CRE/ATF와 같은 다른 전사 인자의 결합 부위 (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem. 269:25728 (1994)), SP1, cAMP 반응 인자 결합 단백질 (CREB; Loeken, Gene Expr. 3:253 (1993)) 및 옥타머 인자 (일반적으로, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), 및 Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303:1 (1994) 참조)를 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사의 속도는 유도 인자에 반응하여 증가한다. 대조적으로, 전사의 속도는 프로모터가 항시발현(constitutive) 프로모터인 경우 유도 인자에 의하여 조절되지 않는다. 억제성(repressible) 프로모터는 또한 공지되어 있다.
"코어 프로모터"는, TATA 박스 및 전사 개시점을 포함하는, 프로모터 기능에 필수적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 이 정의에 의하면, 코어 프로모터는 활성을 증대시키거나 또는 조직 특이적 활성을 부여할 수 있는 특이적 서열의 부재시에 검출가능한 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있다.
"조절 인자(regulatory element)"는 코어 프로모터의 활성을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들면, 조절 인자는 배타적으로 또는 바람직하게는 특정 세포, 조직, 또는 세포기관에서 전사를 가능케 하는 세포 인자와 결합하는 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이들 형태의 조절 인자는 보통 "세포-특이적", "조직-특이적", 또는 "세포기관-특이적" 방식으로 발현되는 유전자와 관련있다.
"인핸서"는 전사 개시점에 대한 인핸서의 거리 또는 방향에 상관없이 전사의 효율성을 증가시킬 수 있는 조절 인자의 형태이다.
"이종 DNA"는 주어진 숙주 세포 내에 자연적으로 존재하지 않는 DNA 분자, 또는 DNA 분자의 집단을 말한다. 특정 숙주 세포에 이종인 DNA 분자는 숙주 DNA가 비-숙주 DNA(즉, 외인성 DNA)와 조합되는 한, 숙주 세포 종에서 유래된 DNA(즉, 내인성 DNA)를 함유할 수 있다. 예를 들면, 전사 프로모터를 포함한 숙주 DNA 단편에 작동가능하게 결합된 폴리펩티드를 코딩하는 비-숙주 DNA 단편을 함유한 DNA 분자는 이종 DNA 단편인 것으로 된다. 반대로, 이종 DNA 분자는 외인성 프로모터와 작동가능하게 결합된 내인성 유전자를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 야생형 세포로부터 유래된 유전자를 포함한 그 DNA 분자는, 야생형 유전자가 결핍된 돌연변이체 세포 내로 도입된다면 이종 DNA인 것으로 된다.
"폴리펩티드"는 자연적으로 생성되든지 합성되든지 펩티드 결합에 의하여 결합된 아미노산 잔기의 폴리머이다. 약 10 아미노산 잔기 미만의 폴리펩티드는 보통 "펩티드"로 언급된다.
"단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한 거대분자이다. 단백질은 또한 탄수화물기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환기는 단백질이 생성된 세포에 의하여 단백질에 첨가될 수 있고 세포의 유형에 따라 다양할 것이다. 단백질은 본원에서 그것들의 아미노산 백본 구조로 정의되며, 탄수화물기와 같은 치환기는 일반적으로 일일이 열거되지 않더라도 존재할 수 있다.
비-숙주 DNA 분자에 의하여 코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 "이종" 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
"클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자동적으로 복제할 수 있는 능력을 가진 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파지와 같은 핵산 분자이다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 동정 및 선별에 사용하기에 적합한 마커 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 벡터의 필수적 생물학적 기능의 손실없이 결정가능한 방식으로 핵산 분자를 삽입할 수 있는 하나 또는 적은 수의 제한효소 인식부위를 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라마이신 내성 또는 앰피실린 내성을 제공하는 유전자를 함유한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에 발현되는 유전자를 코딩하는 핵산 분자이다. 전형적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 유전자 및 전사 종결자를 포함한다. 유전자 발현은 대개 프로모터의 제어 하에 배치되는데, 이러한 유전자를 프로모터에 "작동가능하게 결합되다"라고 부른다. 유사하게, 조절 인자 및 코어 프로모터는 조절 인자가 코어 프로모터의 활성을 조절한다면 작동가능하게 결합된 것이다.
"재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터와 같은 이종 핵산 분자를 함유한 세포이다. 본 명세서에서는, 재조합 숙주의 예는 발현 벡터로부터 IL-17RC를 생성하는 세포이다. 반대로, IL-17RC는, IL-17RC의 "자연 공급원"이자 발현 벡터가 결핍된 세포에 의하여 생성될 수 있다.
"통합 형질전환체(integrative transformant)"는 이종 DNA가 세포의 게놈 DNA 내로 통합된 재조합 숙주 세포이다.
"융합 단백질"은 적어도 두 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자에 의하여 발현된 하이브리드 단백질이다. 예를 들면, 융합 단백질은 친화성 매트릭스에 결합하는 폴리펩티드와 융합된 IL-17RC 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피를 이용하여 IL-17RC의 많은 양을 분리하기 위한 수단을 제공한다.
용어 "수용체"는 "리간드"라고 불리는 생활성(bioactive) 분자에 결합하는 세포-관련 단백질을 나타낸다. 이 상호작용은 세포에 대한 리간드의 효과를 매개한다. 수용체는 막 결합성 수용체, 세포질성 수용체 또는 핵 수용체; 모노머(예를 들면, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린 수용체) 또는 멀티머(예를 들면, PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다. 막 결합성 수용체는 전형적으로 신호전달에 관련된 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 작용자 도메인을 포함한 멀티 도메인을 특징으로 한다. 어떤 막 결합성 수용체에서, 세포외 리간드-결합 도메인 및 세포내 작용자 도메인은, 완전한 기능성 수용체를 포함하는 별도의 폴리펩티드에 위치한다.
대체로, 리간드와 수용체의 결합은 효과자(effector) 도메인과 다른 분자(들) 간의 상호작용을 야기하는 수용체에 형태적 변화를 가져오고, 이는 차례로 세포의 대사에 변경을 초래한다. 수용체-리간드 상호작용과 흔히 연관된 대사 사건들은 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 고리형 AMP 생성의 증가, 세포의 칼슘의 이동, 막 지질의 이동, 세포 부착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해를 포함한다.
"가용성 수용체"는 세포막에 결합되지 않은 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 대부분 트랜스멤브레인 도메인과 세포질 도메인, 및 예를 들면 글리코포스포이노시톨(gpi)과 같은 세포막으로의 다른 결합이 결핍된 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는, 폴리펩티드의 정제나 기질에 대한 폴리펩티드의 부착부위를 위한 친화성 태그, 또는 면역글로불린 불변 영역 서열과 같은 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 많은 세포 표면 수용체는 단백질분해에 의하여 생성되거나 교대로 스플라이싱된 mRNA로부터 번역된 자연적으로 발생한, 가용성 수용체 대응물을 가진다. 가용성 수용체는 일반적으로 9개 이상의 서브유닛을 포함하지 않고, 바람직하게는 6개 이상의 서브유닛을 포함하지 않으며, 가장 바람직하게는 3 이상의 서브유닛을 포함하지 않는 멀티머 수용체를 포함하여, 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머일 수 있다. 수용체 폴리펩티드는 그것들이 각각 막 고정 또는 신호전달을 제공하기 위한 이들 단편의 충분한 부분이 결핍될 때, 트랜스맴브레인 및 세포내 폴리펩티드 단편이 실질적으로 없다고 말하여진다. 사이토카인 수용체의 가용성 수용체는 일반적으로 트랜스맴브레인 도메인 및 세포내 도메인이 없는 세포외 사이토카인 결합 도메인을 포함한다. 예를 들면, 대표적 가용성 수용체는 SEQ ID NO:167(폴리뉴클레오티드) 및 SEQ ID NO:21(폴리펩티드)에 나타낸 바와 같이 IL-17RA의 가용성 수용체를 포함한다. 공지된 사이토카인 수용체 서열 중 어떤 서열이 트랜스맴브레인 도메인 및 세포내 도메인이 없는 세포외 사이토카인 결합 도메인을 포함하는지를 서술하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 또한, 당업자는 유전자 암호를 사용하여 이러한 가용성 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 용이하게 결정할 수 있다.
용어 "분비성 신호 서열"은 더 큰 폴리펩티드의 일성분으로서, 그것이 합성된 세포의 분비 경로를 통하여 더 큰 폴리펩티드를 인도하는 펩티드("분비성 펩티드")를 코딩하는 DNA 서열을 나타낸다. 큰 폴리펩티드는 통상적으로 절단되어 분비성 경로를 통하여 이동하는 동안 분비성 펩티드를 제거한다.
"분리된 폴리펩티드"는 탄수화물, 지질 또는 자연 상태에서 폴리펩티드와 결합된 다른 단백질성 불순물과 같은 오염된 세포 성분이 필수적으로 제거된 폴리펩티드이다. 전형적으로, 분리된 폴리펩티드의 제제는 고도로 정제된 형태, 즉 80% 이상의 순도, 약 90% 이상의 순도, 약 95% 이상의 순도, 95% 보다 큰 순도, 예를 들면, 96%, 97% 또는 98% 또는 그 이상의 순도, 또는 99% 이상의 순도로 폴리펩티드를 함유한다. 특정 단백질 제제가 분리된 폴리펩티드를 함유한다는 것을 보여주는 한 가지 방법은, 단백질 제제의 소듐 도데실 설페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 겔의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색에 의한 단일 밴드 검출이다. 그러나, 용어 "분리된"은 다이머와 같은 다른 물리적 형태 또는 글리코실화된 또는 유도체화된 형태의 동일한 폴리펩티드의 존재도 포함하는 의미이다.
용어 "아미노-말단" 및 "카르복실-말단"은 폴리펩티드 내의 위치를 나타내는 것으로 본원에서 사용된다. 때로는, 이들 용어는 근접성 또는 상대적 위치를 나타내는 특정 서열 또는 폴리펩티드의 부분과 관련하여 사용된다. 예를 들면, 폴리펩티드 내의 기준 서열에 대한 어떤 위치의 카르복실-말단은 기준서열의 카르복실 말단에 인접하게 위치하지만, 반드시 폴리펩티드 전체의 카르복실 말단에 있는 것은 아니다.
용어 "발현"은 유전자 생성물의 생합성을 말한다. 예를 들면, 구조 유전자의 경우에, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다.
용어 "스플라이스 변이체"는 유전자로부터 전사된 RNA의 다른 형태를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 스플라이스 변이체는 전사된 RNA 분자 내에, 또는 덜 통상적으로는 별개로 전사된 RNA들 사이의 스플라이싱 부위를 이용하여 자연적으로 발생하고, 동일한 유전자로부터 전사된 몇몇 mRNA를 생성할 수 있다. 스플라이스 변이체는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 스플라이스 변이체는 또한 유전자로부터 전사된 mRNA의 스플라이스 변이체에 의하여 코딩된 폴리펩티드를 나타내는 것으로 본원에 사용된다.
본원에 사용된 용어 "면역조절자(immunomodulator)"는 사이토카인, 줄기세포 성장인자, 림포독소, 공동자극 분자, 조혈 인자 등 및 이들 분자들의 합성 유사체를 포함한다.
용어 "보체/항-보체 쌍"은 적합한 조건 하에서 비공유 결합된, 안정된 쌍을 형성하는 동일하지 않은 부분을 나타낸다. 예를 들어, 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙토비딘)은 보체/항-보체 쌍의 전형적인 구성원이다. 다른 예시적 보체/항-보체 쌍은 수용체/리간드 쌍, 항체/항원(또는 헵텐 또는 에피토프) 쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍 등을 포함한다. 이후에, 보체/항-보체 쌍의 분리가 필요한 경우, 보체/항-보체 쌍은 바람직하게는 109 M-1 미만의 결합 친화력을 가진다.
"항-유전형 항체(anti-idiotype antibody)"는 면역글로불린의 가변 영역 도메인과 결합하는 항체이다. 본 명세서에서, 항-유전형 항체는 항-IL-17RC 항체의 가변 영역과 결합하고, 따라서 항-유전형 항체는 IL-17RC의 에피토프를 모방한 것이다.
"항체 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab 등과 같은 항체의 일부이다. 구조와 관계없이, 항체 단편은 완전한 항체에 의하여 인식되는 항원과 동일한 것과 결합한다. 예를 들어, 항-IL-17RC 모노클로날 항체 단편은 IL-17RC의 에피토프와 결합한다.
용어 "항체 단편"은 또한 특정 항원, 예를 들면 경쇄 가변 영역으로 구성된 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 초가변 영역을 모방한 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위체에 결합된 합성의 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드를 포함한다.
"키메라 항체"는 가변 영역 및 상보적 결정 영역은 쥐 항체로부터 유래되고, 항체 분자의 나머지 부분은 사람 항체로부터 유래한 재조합 단백질이다.
"사람화 항체"는 모노클로날 항체의 쥐과(murine) 상보성 결정 영역이 쥐과 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변 부위에서 사람 가변 도메인에 전달된 재조합 단백질이다. 사람 단백질에 결합하거나 사람 단백질을 중화시키는 것들과 같은 쥐과 항체로부터 유래되고, 사람에서 치료적으로 사용하기 위한 사람화 항체의 구성은 당업계의 기술 범주 내에 있다.
본원에 사용된 "치료제"는 치료에 유용한 콘쥬게이트를 생성하기 위하여 항체 부분에 콘쥬게이트된 분자 또는 원자이다. 치료제의 예로는 약물, 독소, 면역조절자, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 또는 염료, 및 방사선 동위원소가 있다.
"검출가능한 표지"는 진단에 유용한 분자를 생성하기 위하여 항체 부분에 콘쥬게이트될 수 있는 분자 또는 원자이다. 검출가능한 표지의 예로는 킬레이터, 광활성제, 방사선 동위원소, 형광제, 상자성 이온, 또는 다른 마커 부분이 있다.
용어 "친화성 태그"는 두 번째 폴리펩티드의 정제 또는 검출을 제공하거나 기질에 두 번째 폴리펩티드의 부착을 위한 부위를 제공하기 위해서 두 번째 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 조각을 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 원칙적으로, 항체 또는 다른 특이적 결합제가 이용가능한 어떤 펩티드 또는 단백질도 친화성 태그로 사용될 수 있다. 친화성 태그로는 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), 글루타티온 S 전이효소 (Smith and Johnson, Gene 67:31 (1988)), Glu-Glu 친화성 태그 (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952 (1985)), 기질 P, FLAG 펩티드 (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), 스트렙타비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인이 있다. 문헌(Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991))을 참조. DNA 분자 인코딩 친화성 태그는 시판품으로 구입가능하다(예를 들면, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
"네이키드 항체"는 항체 단편에 반대되는 전체 항체로서, 치료제와 콘쥬게이트되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "항체 성분"은 전체 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다.
"면역콘쥬게이트"는 항체 성분과 치료제 또는 항체 성분과 검출가능한 표지의 콘쥬게이트이다.
본원에 사용된 용어 "항체 융합 단백질"은 항체 성분 및 IL-17RC 폴리펩티드 성분을 포함한 재조합 분자를 말한다. 항체 융합 단백질의 예는 IL-17RC의 세포외 도메인, 및 Fc 도메인 또는 항원-결합 영역을 포함하는 단백질을 포함한다.
"표적 폴리펩티드" 또는 "표적 펩티드"는 적어도 하나의 에피토프를 포함하고, 종양 세포, 또는 감염성 인자 항원을 운반하는 세포와 같은 표적 상에 발현된 아미노산 서열이다. T 세포는 주조직 적합성 복합체(MHC)에 의하여 표적 폴리펩티드 또는 표적 펩티드에 제시된 펩티드 에피토프를 인식하여, 일반적으로 표적 세포를 용해하거나 다른 면역 세포를 표적 세포 부위에 모아 표적 세포를 죽인다.
"항원성 펩티드"는 T 세포에 의하여 인식된 MHC-펩티드 복합체를 형성하는 주조직 적합성 복합체 분자에 결합하여, T 세포에 제시될 때 세포독성 림프구 반응을 유도하는 펩티드이다. 따라서, 항원성 펩티드는 적합한 주조직 적합성 복합체 분자에 결합할 수 있고 세포 용해 또는 항원에 결합하거나 항원을 발현시키는 표적 세포에 대한 특정 사이토카인의 분비와 같은 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 항원성 펩티드는 항원 제시 세포 또는 표적 세포 상의 제 I 형 또는 제 II 형 주조직 세포독성 복합체 분자에 결합될 수 있다.
진핵세포에서, RNA 폴리머라제 II는 구조 유전자의 전사를 촉매하여 mRNA를 생성한다. 핵산 분자는 RNA 전사체가 특정 mRNA의 서열에 상보적인 서열을 가진 RNA 폴리머라제 II 주형을 함유하도록 설계될 수 있다. RNA 전사체는 "안티센스 RNA"라고 불리고, 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산 분자는 "안티센스 유전자"라고 불린다. 안티센스 RNA 분자는 mRNA 분자에 결합하여 mRNA 번역을 억제할 수 있다.
"IL-17RC에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "IL-17RC 안티센스 올리고뉴클레오티드"는 (a) IL-17RC 유전자의 부분과 안정된 트리플렉스를 형성할 수 있거나, (b) IL-17RC 유전자의 mRNA 전사체의 부분과 안정된 듀플렉스를 형성할 수 있는 서열을 가진 올리고뉴크레오티드이다.
"리보자임"은 촉매 중심(catalytic center)을 함유한 핵산 분자이다. 이 용어는 촉매 기능을 수행하는 RNA 효소, 셀프-스플라이싱 RNA, 셀프-절단 RNA 및 핵산 분자를 포함한다. 리보자임을 인코딩하는 핵산 분자를 "리보자임 유전자"라고 한다.
"외부 안내 서열(external guide sequence)"은 내인성 리보자임, RNase P를 특정 종의 세포내 mRNA에 인도하여 RNase P로 mRNA를 절단하도록 하는 핵산 분자이다. 외부 안내 서열을 코딩하는 핵산 분자를 "외부 안내 서열 유전자"라고 한다.
용어 "변이체 IL-17RC 유전자"는 SEQ ID NO:2의 변형 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 말한다. 이러한 변이체는 SEQ ID NO:2의 보존적 아미노산 치환을 갖는 합성 유전자 뿐만 아니라, IL-17RC 유전자의 자연 발생 다형체(polymorphism)를 포함한다. IL-17RC 유전자의 추가 변이체 형태는 본원에 설명된 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 결실을 함유한 핵산 분자이다. 변이체 IL-17RC 유전자는 예를 들면 유전자가 엄격한 조건 하에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 핵산 서열 또는 그것의 상보체 핵산 분자와 혼성화하는지를 결정함으로써 확인될 수 있다.
또는, 변이체 IL-17RC 유전자는 서열 비교에 의해 확인될 수 있다. 최대한 상응하도록 정렬될 때 두 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 동일하면 두 아미노산 서열은 "100% 아미노산 서열 동일성"을 가진다. 마찬가지로, 최대한 상응하도록 정렬될 때 두 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 잔기가 동일하면 두 뉴클레오티드 서열은 "100% 뉴클레오티드 서열 동일성"을 가진다. 서열 비교는 DNASTAR(위스콘신 매디슨)에 의해 제조된 LASERGENE 바이오인포메틱스 컴퓨팅 스위트에 포함된 것들과 같은 표준 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. 선택적 정렬을 결정함으로써 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하기 위한 다른 방법은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들면, Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997), Wu et al. (eds.), "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins" in Methods in Gene Biotechnology, 페이지 123-151 (CRC Press, Inc. 1997), 및 Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, 2판 (Academic Press, Inc. 1998) 참조). 서열 동일성을 결정하기 위한 구체적 방법은 하기에 설명된다.
변이체 IL-17RC 유전자 또는 변이체 IL-17RC 폴리펩티드를 확인하는 데 사용된 특정 방법과 상관없이, 변이체 유전자 또는 변이체 유전자에 의하여 코딩된 폴리펩티드는 항-IL-17RC 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 기능적으로 특성분석할 수 있다. 변이체 IL-17RC 유전자 또는 변이체 IL-17RC 폴리펩티드는 또한 본원에 설명된 생물학적 또는 생화학적 분석을 사용하여 그것의 리간드, 예를 들면 IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합하는 능력으로 기능적으로 특성화될 수 있다.
용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 두 개 이상의 선택적 형태 중 어떤 것을 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통하여 자연적으로 발생하고, 집단 내에서 표현형의 다형성을 야기할 수 있다. 유전자 돌연변이는 싸일런트(silent)하거나(또는 코딩된 폴리펩티드에 아무런 변화 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 용어 대립형질 변이체는 또한 유전자의 대립형질 변이체에 의하여 코딩된 단백질을 나타내는 것으로 본원에 사용된다.
용어 "오토로그(ortholog)"는 상이한 종 유래의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 대응물인, 한 종으로부터 얻어진 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오토로그 간의 서열 차이는 종분화의 결과이다.
"파라로그(paralog)"는 개체가 만들어낸 구별되지만 구조적으로 연관된 단백질이다. 파라로그는 유전자 복제를 통하여 발생하는 것으로 생각된다. 예를 들면, α-글로빈, β-글로빈, 및 미오글로빈은 서로의 파라로그이다.
본 발명은 IL-17RC 유전자의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명 내에서, IL-17RC 유전자의 "기능적 단편"은 본원에 설명된 도메인이거나, 항-IL-17RC 항체와 적어도 특이적으로 결합하는 IL-17RC 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 핵산 분자를 말한다.
표준 분석 방법이 부정확하기 때문에, 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 수치로 이해되어야 한다. 이러한 수치가 "약" X로 표현될 때, X의 값은 ±10% 정확성을 갖는 것으로 이해될 것이다.
C) IL-17RA 및 IL-17RC 폴리뉴클레오티드 또는 유전자의 생성
사람 IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자를 코딩하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1, 4에 기초한 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 사람 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 이들 기술은 스탠다드로서 잘 확립되어 있으며, 시판되는 클로닝 키트를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3판, John Wiley & Sons 1995; Wu et al., Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. 1997; Aviv and Leder, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:1408 (1972); Huynh et al., "Constructing and Screening cDNA Libraries in λgt10 and λgt11" in DNA Cloning: A Practical Approach Vol. 1, Glover (ed.), 페이지 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) 페이지 47-52)을 참조할 수 있다.
또한, 사람 IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자를 코딩하는 핵산 분자는, IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자 또는 cDNA의 뉴클레오티드 서열에 기초한 뉴클레오티드 서열을 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 얻을 수 있다. PCR로 라이브러리를 스크리닝하기 위한 일반적 방법은 예를 들면 문헌(Yu et al., Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries, in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993)에 제공된다. 더욱이, 관련 유전자를 분리하는 PCR 기술은 예를 들면 문헌 (Preston, Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993)에 설명된다. 또는, IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자는 본원에 설명된 바와 같이 서로 프라이밍하는 긴 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열을 사용하여 핵산 분자를 합성함으로써 얻어질 수 있다(예를 들면, Ausubel (1995) 참조). 중합효소 연쇄반응을 사용하는 확립된 기술은 DNA 분자를 적어도 2kb 길이를 합성하는 능력을 제공한다(Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993), Dillon et al., Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes", in Methods in Molecular Biology, Vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), 페이지 263-268, (Humana Press, Inc. 1993), 및 Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)). 폴리뉴클레오티드 합성에 대한 검토를 위해서는, 예를 들면 문헌(Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984), 및 Climie et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:633 (1990))을 참조.
D) IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자 변이체의 생성
본 발명은 본원에 개시된 IL-17RA 또는 IL-17RC 폴리펩티드를 코딩하는, DNA 및 RNA 분자를 포함한 다양한 핵산 분자를 제공한다. 당업자는 유전암호의 축퇴성의 관점에서, 이들 폴리뉴클레오티드 분자 간에 상당한 서열 변이가 가능하다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 더욱이, 본 발명은 SEQ ID NO:2의 수용체 폴리펩티드에 대하여 실질적으로 상동인 IL-17RC의 적어도 일부를 포함하는 분리된 가용성 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 및 멀티머 수용체 폴리펩티드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4 및 이들의 RNA 등가물을 포함한 IL-17RA 또는 IL-17RC 폴리펩티드-코딩 핵산 분자도 제공한다.
당업자는 유전암호의 축퇴성의 관점에서 이들 폴리뉴클레오티드 분자 간에 상당한 서열 변이가 가능하다는 것을 용이하게 인식할 것이다. SEQ ID NO:7은 SEQ ID NO:2의 IL-17RC 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 분자를 포함한 축퇴성 뉴클레오티드 서열이다. 당업자는 SEQ ID NO:7의 축퇴성 서열이 T 대신 U로 치환함으로써 SEQ ID NO:2를 코딩하는 모든 RNA 서열을 제공한다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 154 내지 2229 및 그것들의 RNA 등가물을 포함한 IL-17RC 폴리펩티드-코딩 핵산 분자를 고려한다. 유사하게, SEQ ID NO:6의 IL-17RC-1 축퇴성 서열은 T 대신 U로 치환함으로써 SEQ ID NO:5를 코딩하는 모든 RNA 서열을 제공한다.
표 4는 축퇴성 뉴클레오티드 위치를 나타내는 한 문자 코드를 제시한다. "resolution"은 코드 문자에 의하여 나타낸 뉴클레오티드이다. "상보체"는 상보적 뉴클레오티드(들)에 대한 코드를 나타낸다. 예를 들면, 코드 Y는 C 또는 T를 나타내고, 그것의 상보체 R은 A 또는 G를 나타내며, A는 T에 상보적이고, G는 C에 상보적이다.
Figure 112009064297438-PCT00003
주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함한 축퇴성 코돈을 표 5에 나타낸다.
Figure 112009064297438-PCT00004
당업자는 아미노산을 코딩하는 모든 가능한 코돈을 대표하는 축퇴성 코돈을 결정하는 데 어떤 모호함이 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 어떤 상황에서, 세린의 축퇴성 코돈(WSN)은 아르기닌(AGR)을 코딩할 수 있고, 아르기닌의 축퇴성 코돈(MGN)은 일부 상황에서 세린(AGY)을 코딩할 수 있다. 페닐알라닌 및 류신을 코딩하는 코돈 간에는 유사한 관련성이 존재한다. 따라서, 축퇴성 서열에 포함된 일부 폴리뉴크레오티드는 변이체 아미노산 서열을 코딩할 수 있지만, 당업자는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열에 관한 이러한 변이체 서열을 용이하게 확인할 수 있다. 변이체 서열은 본원에 설명된 바와 같이 기능에 대해서 용이하게 시험될 수 있다.
다른 종들은 "우선적 코돈 사용"을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 문헌(Grantham et al., Nucl. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al. Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995), 및 Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996))을 참조. 본원에 사용된 용어 "우선적 코돈 사용" 또는 "우선적 코돈"은 특정한 종의 세포에서 가장 빈번하게 사용되고, 따라서 각 아미노산 서열을 코딩하는 가능한 코돈의 하나 또는 몇몇 대표적인 것을 선호하는 단백질 번역 코돈을 말하는 당업계의 용어이다(표 5 참조). 예를 들면, 아미노산 트레오닌(Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의하여 코딩될 수 있지만, 포유동물 세포에서, ACC는 가장 흔하게 사용된 코돈이고, 다른 종, 예를 들면 곤충 세포, 효모, 바이러스, 또는 박테리아에서는, 다른 Thr 코돈이 우선적일 수 있다. 특정한 종에 대한 우선적 코돈은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다. 우선적 코돈 서열을 재조합 DNA에 도입하는 것은, 예를 들면, 특정한 세포 유형 또는 종 내에서 단백질 번역을 더 효율적이게 함으로써 단백질의 생성을 증대시킬 수 있다. 따라서, 본원에 설명된 축퇴성 코돈 서열은 당업계에 흔히 사용되고 본원에 개시된 다양한 세포 유형 및 종에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로 작용한다. 우선적 코돈을 함유한 서열은 다양한 종에서 발현시키기 위하여 시험 및 최적화할 수 있으며, 본원에 개시된 대로 기능에 대해서 시험할 수 있다.
IL-17RA 또는 IL-17RC-코딩 cDNA는 다양한 방법, 예를 들면 완전한 또는 부분적인 사람 cDNA 또는 개시된 서열에 기초한 축퇴성 프로브의 하나 이상의 세트로 프로빙(probing)함으로써 분리될 수 있다. 또한 본원에 설명된 대표적 사람 IL-17RA 또는 IL-17RC 서열로부터 설계된 프라이머를 통한 중합효소 연쇄반응을 사용하여 cDNA를 클로닝할 수 있다. 또한, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데 사용될 수 있으며, 원하는 cDNA의 발현은 IL-17RA 또는 IL-17RC 폴리펩티드에 대한 항체로 검출될 수 있다.
당업자는 SEQ ID NO:1에 개시된 서열이 사람 IL-17RC의 단일 대립유전자를 나타내고, 대립형질 변이 및 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)이 일어날 수 있음을 인식할 것이다. 이 서열의 대립형질 변이체는 표준 과정에 따라서 다른 개체로부터 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다. 침묵(silent) 돌연변이를 함유한 것들 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 야기하는 것들을 포함한, 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열의 대립형질 변이체는 본 발명의 범주 내에 있으며, 본원에 개시된 아미노산 서열의 대립유전자 변이체인 단백질도 마찬가지이다. IL-17RC 폴리펩티드의 특성을 보유하는 얼터너티브 스플라이싱된 mRNA로부터 발생된 cDNA 분자는 본 발명의 범주 내에 포함되며, 이러한 cDNA 및 mRNA에 의하여 코딩된 폴리펩티드도 마찬가지이다. 이들 서열의 대립형질 변이체 및 스플라이스 변이체는 당업계에 공지된 표준 과정에 따라서 다른 개체 또는 조직으로부터 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙함으로써 클로닝될 수 있다.
상기에 논의된 방법을 사용하여, 당업자는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4에 실질적으로 상동성인 IL-17RC 수용체 서브유닛의 일부분을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:5의 전부 또는 단편을 코딩하는 가용성 수용체를 코딩하는 여러 폴리펩티드, 또는 그것의 대립형질 변이체를 제조할 수 있으며, 이것들은 야생형 IL-17RC 수용체의 리간드-결합 특성을 보유할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 또한 본원에 일반적으로 개시된 추가의 폴리펩티드 조각을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예 내에서, 분리된 핵산 분자는 엄격한 조건(stringent condition) 하에서 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 예를 들면, 이러한 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자, 또는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자, 또는 그것의 단편과 혼성화할 수 있다.
일반적으로, 엄격한 조건은 특정 이온강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 녹는점(Tm) 보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완전히 매치된 프로브에 혼성화되는 온도이다(특정 이온강도 및 pH 하에). 혼성화 후, 핵산 분자는 엄격한 조건 하에서 또는 고도로 엄격한 조건 하에서, 비혼성화된 핵산 분자를 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판 (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger and Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); 및 Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990))을 참조. 인터넷 상의 사이트뿐만 아니라 OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) 및 Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA)은 주어진 서열을 분석하고 사용자 정의된 기준에 기초하여 Tm 계산을 위해 이용가능하다. 혼성화 및 특정 폴리뉴클레오티드 하이브리드로 사용하기 위한 세척 조건을 적합화하는 것은 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2(IL-17RC) 및 SEQ ID NO:21(IL-17RA)의 폴리펩티드, 또는 이들의 오토로그(ortholog)에 대하여 실질적으로 유사한 서열 동일성을 가진 분리된 IL-17RA 또는 IL-17RC 폴리펩티드를 제공한다. 용어 "실질적으로 유사한 서열 동일성"은 SEQ ID NO:2에 나타낸 서열, 또는 그것의 오토로그에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 나타내는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들면, 변이체 및 오토로그 IL-17RA 또는 IL-17RC 수용체는 면역 반응을 발생시키고 사람 IL-17RA 또는 IL-17RC에 대한 교차반응성 항체를 유도하는 데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 사람화되고 본원에 설명된 바와 같이 변형될 수 있고, 본원에 설명된 다른 치료적 응용뿐만 아니라 건선, 건선 관절염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증을 치료하기 위하여 치료적으로 사용될 수 있다.
*본 발명은 또한 두 기준, SEQ ID NO:2(IL-17RC), SEQ ID NO:21(IL-17RA) 또는 SEQ ID NO:158 및 183(IL-17RC/IL-17RA)의 아미노산 서열과 같이, 여기서 설명된 아미노산 서열을 갖는 코딩된 폴리펩티드 간의 유사성의 결정, 및 혼성화 분석을 사용하여 확인될 수 있는 IL-17RA 또는 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 변이체 핵산 분자를 제공한다. 이러한 변이체는 (1) 세척 엄격성(stringency)이 55-65℃에서 0.1% SDS의 0.5x - 2x SSC와 동등한 엄격한 세척 조건 하에서, IL-17RC에 대해 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 전장 상보체), 또는 IL-17RC/IL-17RA에 대해 SEQ ID NO:157의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 전장 상보체)과 같이, 여기서 설명된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자와 혼성화되고, (2) SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:158의 아미노산 서열과 같이, 여기서 설명된 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 또는, IL-17RC 변이체는 (1) 세척 엄격성이 50-65 ℃에서 0.1% SDS의 0.1x - 2x SSC와 동등한 고도로 엄격한 세척 조건 하에서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 전장 상보체) 또는 SEQ ID NO:157의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 전장 상보체)과 같이, 여기서 설명된 핵산 분자와 혼성화되고, (2) SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:158의 아미노산 서열과 같이 여기서 설명된 아미노산 서열에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서 특성화될 수 있다.
본 발명은, 예를 들면, (IL-17RC의 엑손 8-16을 포함하는)SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 200-458, 또는 (IL-17A의 엑손 1-6 및 IL-17RC의 엑손 8-16을 포함하는)SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 32-458, SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 1-458, 또는 SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 32-690, 또는 SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 1-690과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 적어도 99.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-690 또는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-458을 포함하는 폴리펩티드가 아니다. 몇몇 구체예에서, 이 폴리펩티드는 (a) 작동가능하게 연결된 인자로서 전사 프로모터, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-690 또는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-458을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 및 전사 종결자(terminator)를 포함하는 발현벡터가 도입된 세포를 배양하고; (b) 발현된 폴리펩티드를 회수하므로써 생성되는 폴리펩티드가 아니다. 이 폴리펩티드는, 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 제1형 당뇨병, 관상동맥질환, 뇌졸증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 신증후군, 패혈증, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 골다공증, 신경염, 간질성 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, (난소암, 자궁경부암, 전립선 암과 같은)암 신혈관생성, B림프종, T림프종, 낭성 섬유증, 재발협착증 및 가와사키병의 치료에서, IL-17A 및/또는 IL-17F와 결합하거나, 이들을 차단, 감소, 길항 또는 중화하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은, (IL-17RC의 엑손 8-16을 포함하는)SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 200-458, 또는 (IL-17A의 엑손 1-6 및 IL-17RC의 엑손 8-16을 포함하는)SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 32-458, SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 1-458, 또는 SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 32-690, 또는 SEQ ID NO:158의 아미노산 잔기 1-690과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 및 적어도 99.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 어떤 구체예에서, 이 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-690 또는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-458을 포함하는 폴리펩티드가 아니다. 몇몇 구체예에서, 이 폴리펩티드는 (a) 작동가능하게 연결된 인자로서 전사 프로모터, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-690 또는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 1-458을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 및 전사 종결자(terminator)를 포함하는 발현벡터가 도입된 세포를 배양하고; (b) 발현된 폴리펩티드를 회수하므로써 생성되는 폴리펩티드가 아니다. 이 폴리펩티드는, 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 제1형 당뇨병, 관상동맥질환, 뇌졸증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 신증후군, 패혈증, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 골다공증, 신경염, 간질성 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, (난소암, 자궁경부암, 전립선 암과 같은)암 신혈관생성, B림프종, T림프종, 낭성 섬유증, 재발협착증 및 가와사키병의 치료에서, IL-17A 및/또는 IL-17F와 결합하거나, 이들을 차단, 감소, 길항 또는 중화하는 데 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은, IL-17A 및/또는 IL-17F와 결합하거나, 이들을 차단, 감소, 길항 또는 중화하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 핵산 분자는, 혼성화 용액(5xSSC (1xSSC는 0.15M 염화나트륨 및 0.015M 시트르산나트륨), 0.02% 소듐도데실설페이트(SDS), 0.1% N-라우로일사르코신, 1% Blocking Reagent)으로 62℃에서 1시간동안 프리혼성화의 혼성화 조건에서, SEQ ID NO:157(또는 이것의 전장 상보체)의 뉴클레오티드 598-1374, SEQ ID NO:157(또는 이것의 전장 상보체)의 뉴클레오티드 94-1374, SEQ ID NO:157(또는 이것의 전장 상보체)의 뉴클레오티드 1-1374, SEQ ID NO:157(또는 이것의 전장 상보체)의 뉴클레오티드 94-2070, 또는 SEQ ID NO:157(또는 이것의 전장 상보체)의 뉴클레오티드 1-2070에 혼성화한 후, 2xSSC, 0.1% SDS로 실온에서 5분간 2회 엄격히 세척하고, 0.5xSSC, 0.1% SDS로 62℃에서 15분간 1회 세척한다. 이 폴리펩티드는, 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 제1형 당뇨병, 관상동맥질환, 뇌졸증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 신증후군, 패혈증, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 골다공증, 신경염, 간질성 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, (난소암, 자궁경부암, 전립선 암과 같은)암 신혈관생성, B림프종, T림프종, 낭성 섬유증, 재발협착증 및 가와사키병을 치료하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은, SEQ ID NO:183의 아미노산 잔기 1-426, SEQ ID NO:183의 아미노산 잔기 1-657 또는 SEQ ID NO:183의 아미노산 잔기 1-658을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 또는, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 불변영역과 같은 면역글로불린 부분을 더욱 포함한다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE 또는 이들의 유도체에서 유래될 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity : ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(Complement Dependent Cytotoxicity : CDC)이거나 이것을 가질 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 예를 들면 Fc5, Fc1O, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657 및 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658일 수 있다. 이 폴리펩티드는, 선택적으로 인간 IL-17RA (예, SEQ ID NOs: 184 및 185), 인간 IL-17RC (예, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1-20), otPA 프레-프로 신호 펩티드(SEQ ID NO: 178), 인간 성장호르몬(SEQ ID NOs: 168 및 169) 및 인간 CD33(SEQ ID NOs: 172 및 173)와 같은 분비 신호서열을 더 포함할 수 있다. 이 폴리펩티드는 원핵세포(예, E.coli) 및 유핵세포(예, 차이니즈 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포, 및 Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia pastoris와 같은 효모세포)와 같은 배양된 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO:183의 아미노산 잔기 1-426을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 또는, 상기 핵산 분자는 예를 들면 SEQ ID NO:182의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 또는, 상기 암호화된 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 불변영역과 같은 면역글로불린 부분을 더욱 포함할 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE 또는 이들의 유도체에서 유래될 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이거나 이것을 가질 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 예를 들면 Fc5, Fc1O, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657 및 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658일 수 있다. 이 폴리펩티드는, 선택적으로 인간 IL-17RA (예, SEQ ID NOs: 184 및 185), 인간 IL-17RC (예, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1-20), otPA 프레-프로 신호 펩티드(SEQ ID NO: 178), 인간 성장호르몬(SEQ ID NOs: 168 및 169) 및 인간 CD33(SEQ ID NOs: 172 및 173)와 같은 분비 신호서열을 더 포함할 수 있다. 이 폴리펩티드는 원핵세포(예, E.coli) 및 유핵세포(예, 차이니즈 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포, 및 Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia pastoris와 같은 효모세포)와 같은 배양된 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다.
또한, 본 발명은, 다음의 작동가능하게 연결된 인자들을 포함하는 발현벡터를 제공한다: a) 전사 프로모터, b) SEQ ID NO:183의 아미노산 잔기 1-426을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 세그먼트, 및 c) 전사 종결자. 상기 암호화된 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 불변영역과 같은 면역글로불린 부분을 더욱 포함할 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE 또는 이들의 유도체에서 유래될 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이거나 이것을 가질 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 예를 들면 Fc5, Fc1O, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657 및 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658일 수 있다. 이 폴리펩티드는, 선택적으로 인간 IL-17RA (예, SEQ ID NOs: 184 및 185), 인간 IL-17RC (예, SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 1-20), otPA 프레-프로 신호 펩티드(SEQ ID NO: 178), 인간 성장호르몬(SEQ ID NOs: 168 및 169) 및 인간 CD33(SEQ ID NOs: 172 및 173)와 같은 분비 신호서열을 더 포함할 수 있다. 이 폴리펩티드는 원핵세포(예, E.coli) 및 유핵세포(예, 차이니즈 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포, 및 Saccharomyces cerevisiae 및 Pichia pastoris와 같은 효모세포)와 같은 배양된 세포에서 재조합적으로 발현될 수 있다. 또한, 본 발명은, 여기서 설명된 발현백터가 도입되고, DNA 세그먼트에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-426를 포함하는 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 선택적으로, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 불변영역과 같은 면역글로불린 부분을 더욱 포함할 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE 또는 이들의 유도체에서 유래될 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이거나 이것을 가질 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 예를 들면 Fc5, Fc1O, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657 및 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658일 수 있다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-426을 포함하고, IL-17A 및/또는 IL-17F와 결합하거나, 이들을 차단, 감소, 길항 또는 중화하는 폴리펩티드를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병에 걸린 대상의 치료방법을 제공하며, 여기서 상기 질병은 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 제1형 당뇨병, 관상동맥질환, 뇌졸증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 신증후군, 패혈증, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 골다공증, 신경염, 간질성 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, (난소암, 자궁경부암, 전립선 암과 같은)암 신혈관생성, B림프종, T림프종, 낭성 섬유증, 재발협착증 및 가와사키병으로 이루어진 군에서 선택된다. 선택적으로, 이 폴리펩티드는, 면역글로불린 중쇄 불변영역과 같은 면역글로불린 부분을 더욱 포함할 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE 또는 이들의 유도체에서 유래될 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이거나 이것을 가질 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 예를 들면 Fc5, Fc1O, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657 및 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658일 수 있다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-426을 포함하고, IL-17A 및/또는 IL-17F와 결합하거나, 이들을 차단, 감소, 길항 또는 중화하는 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 질병에 걸린 대상의 치료방법을 제공하며, 여기서 상기 질병은 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 제1형 당뇨병, 관상동맥질환, 뇌졸증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 신증후군, 패혈증, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 골다공증, 신경염, 간질성 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, (난소암, 자궁경부암, 전립선 암과 같은)암 신혈관생성, B림프종, T림프종, 낭성 섬유증, 재발협착증 및 가와사키병으로 이루어진 군에서 선택된다. 선택적으로, 이 폴리펩티드는, 면역글로불린 중쇄 불변영역과 같은 면역글로불린 부분을 더욱 포함할 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IgM, IgE 또는 이들의 유도체에서 유래될 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)이거나 이것을 가질 수 있다. 이 면역글로불린 중쇄 불변영역은 예를 들면 Fc5, Fc1O, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657 및 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658일 수 있다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-426, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-657, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-658을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 이 항체는, 폴리클로날 항체, 쥐과(murine)의 모노클로날 항체, 쥐과의 모노클로날 항체 유래의 인간화된 항체, 항체 단편, 중화 항체 및 인간 모노클로날 항체로 이루어진 군에서 선택된 항체일 수 있다. 또는, 상기 항체 단편은, F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인식 단위(minimal recognition unit)로 이루어진 군에서 선택된 단편일 수 있다. 또한, 본 발명은, 여기서 설명된 항체 또는 항체 단편에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입 항체(anti-idiotype antibody)를 제공한다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-426 및 면역글로불린 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 또는, 상기 면역글로불린 부분은 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-657, SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 427-658와 같은 면역글로불린 중쇄 불변영역일 수 있다. 또한, 본 발명은, 여기서 설명된 융합 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자, 예를 들면 SEQ ID NO: 182의 뉴클레오티드1-1971 및 SEQ ID NO: 182의 뉴클레오티드 1-1974를 제공한다. 또한, 본 발명은, 여기서 설명된 융합 단백질과 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이들 조성물은, 여기서 설명된 다양한 하나 이상의 질병 치료에 이용될 수 있다.
백분율 서열 동일성은 종래의 방법에 의하여 결정된다. 예를 들면, 문헌(Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), 및 Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))을 참조. 간단히 말하면, 두 아미노산 서열은 표 6에 나타낸 바와 같이 10의 갭 개방 벌점, 1의 갭 연장 벌점, 및 Henikoff and Henicoff(동일한 문헌)의 "BLOSUM62" 점수매김 매트릭스를 사용하여 정렬 점수를 최적화하도록 배열된다(아미노산은 표준 1 문자 코드로 나타난다). 그 다음 백분율 동일성은 다음과 같이 계산된다: ([동일한 일치의 전체 수]/[더 긴 서열의 길이 + 두 서열을 정렬하기 위하여 더 긴 서열에 도입된 갭의 수])(100).
Figure 112009064297438-PCT00005
당업자는 두 아미노산 서열을 정렬하는 데 이용가능한 많은 확립된 알고리즘이 있다는 것을 이해한다. Pearson 및 Lipman의 "FASTA" 유사성 검색 알고리즘은 본원에 개시된 아미노산 서열 및 후보 IL-17RC 변이체의 아미노산 서열에 의하여 공유된 동일성의 수준을 조사하기 위한 적합한 단백질 정렬 방법이다. FASTA 알고리즘은 문헌(Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), 및 Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990))에서 설명된다. 간단히 말하면, FASTA는 먼저 의문의 서열(예를 들면, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3) 및 보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 고려하지 않고 동일성의 가장 높은 밀도(ktup 변수가 1인 경우) 또는 동일성의 쌍(ktup=2인 경우)을 가진 시험 서열에 의하여 공유된 영역을 확인함으로써 서열을 특성화한다. 그 후 아미노산 치환 매트릭스를 이용하여 모든 쌍을 이룬 아미노산의 유사성을 비교함으로써 가장 높은 밀도를 가진 10 영역을 재채점하고, 영역의 말단을 가장 높은 점수에 기여한 잔기들만을 포함하도록 "손질"한다. 그 후 (서열의 길이 및 ktup 값에 기초하여 사전 결정된 공식으로 계산된) "컷오프" 값보다 큰 수치를 가진 일부 영역이 있는 경우, 손질된 시작 영역은 그 영역이 갭과 대략적인 정렬을 이루도록 결합될 수 있는지를 결정하기 위하여 조사된다. 마지막으로, 두 아미노산 서열의 가장 높은 점수 영역은 아미노산 삽입 및 결실을 고려한, Needleman-Wunsch-Sellers 알고리즘(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))의 변형을 사용하여 정렬된다. FASTA 분석의 예시적 매개변수는 다음과 같다: ktup=1, 갭 공개 벌점=10, 갭 연장 벌점=1, 및 치환 매트릭스=BLOSUM62. 이들 매개변수는 문헌(Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990))의 부록 2에 설명된 채점 매트릭스 파일("SMATRIX")을 수정함으로써 FASTA 프로그램에 도입될 수 있다.
FASTA는 또한 상기에 개시된 비율을 사용하여 핵산 분자의 서열 동일성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열 비교를 위하여, ktup 값은 전술한 다른 매개변수 세트와 함께 1 내지 6, 바람직하게는 3 내지 6, 가장 바람직하게는 3일 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열과 비교하여 보존적 아미노산 변화를 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 예를 들면, SEQ ID NO:2 또는 21의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유한 변이체를 얻을 수 있고, 여기서 IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 알킬 아미노산을 알킬 아미노산으로 치환하고, IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 방향족 아미노산을 방향족 아미노산으로 치환하며, IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 황 함유 아미노산을 황 함유 아미노산으로 치환하고, IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 히드록시 함유 아미노산을 히드록시 함유 아미노산으로 치환하며, IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 산성 아미노산을 산성 함유 아미노산으로 치환하고, IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 염기성 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환하며, 또는 IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 서열에 있는 2염기성 모노카르복실 아미노산을 2염기성 모노카르복실 아미노산으로 치환한다. 공통된 아미노산 중에서, 예를 들면 "보존적 아미노산 치환"은 다음 그룹 각각에 있는 아미노산 간의 치환에 의하여 설명된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르트산 및 글루탐산, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘. BLOSUM62 표는 관련 단백질의 500 그룹 이상의 고도로 보존된 영역을 나타내는, 단백질 서열 조각의 약 2,000 국부 다중 정렬에서 유래된 아미노산 치환 매트릭스이다(Henikoff and Henikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)). 따라서, BLOSUM62 치환 빈도는 본 발명의 아미노산 서열 내에 도입될 수 있는 보존적 아미노산 치환을 정의하는 데 사용될 수 있다. 그것이 오로지 (전술한 바와 같은) 화학적 특성에 기초한 아미노산 치환을 설계하는 것이 가능하지만, 용어 "보존적 아미노산 치환"은 바람직하게는 -1 보다 큰 BLOSUM62 값으로 나타낸 치환을 말한다. 예를 들면, 아미노산 치환은 그 치환이 0, 1, 2, 또는 3의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 경우 보존적이다. 이 시스템에 의하면, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 적어도 1(예를 들면, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하고, 더 바람직한 아미노산 치환은 적어도 2(예를 들면, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다. IL-17RC의 특정 변이체는 대응되는 아미노산 서열(예를 들면, SEQ ID NO:2 또는 21)에 대하여 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 것을 특징으로 하며, 아미노산 서열의 변이는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에서 기인한다.
IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자에서의 보존적 아미노산 변화는 예를 들면 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4에 열거된 뉴클레오티드 대신 뉴클레오티드를 치환함으로써 도입될 수 있다. 이러한 "보존적 아미노산" 변이체는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이생성, 링커-스캐닝 돌연변이생성, 중합효소 연쇄반응 등을 사용한 돌연변이생성에 의하여 얻어질 수 있다(Ausubel (1995); 및 McPherson (ed.), Directed Mutagenesis: A Practical Approach (IRL Press 1991)). 변이체 IL-17RC 폴리펩티드는 항-IL-17RC 항체에 특이적으로 결합하는 능력에 의하여 확인될 수 있다.
본 발명의 단백질은 또한 비자연적으로 발생한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 비자연적으로 발생한 아미노산은, 한정된 것은 아니지만, trans-3-메틸프롤린, 2,4-메타노프롤린, cis-4-히드록시프롤린, trans-4-히드록시프롤린, N-메틸글리신, allo-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시에틸시스테인, 히드록시에틸호모시스테인, 니트로글루타민, 호모글루타민, 피페코린산, 티아졸리딘 카르복시산, 디히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린, 3,3-디메틸프롤린, tert-류신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌 및 4-플루오로페닐알라닌을 포함한다. 비자연적으로 발생한 아미노산 잔기를 단백질에 혼입하기 위한 일부 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 넌센스 돌연변이가 화학적으로 아미노아실화된 억제자(suppressor) tRNA를 사용하여 억제되는 시험관내 시스템이 도입될 수 있다. 아미노산을 합성하고 tRNA를 아미노아실화하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 넌센스 돌연변이를 함유한 플라스미드의 전사 및 번역은 전형적으로 대장균 S30 추출물 및 상업적으로 이용가능한 효소 및 다른 시약을 포함한 무세포 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피로 정제한다. 예를 들면, 문헌(Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al., Science 259:806 (1993), 및 Chung et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:10145 (1993))을 참조.
두 번째 방법에서, 번역은 Xenopus 난모세포에서 돌연변이된 mRNA와 화학적으로 아미노아실화된 억제자 tRNA를 미세주입함으로써 수행된다(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). 세 번째 방법에서, 대장균 세포는 치환된 자연적 아미노산(예를 들면, 페닐알라닌)의 부재 하에 그리고 원하는 비자연적으로 발생하는 아미노산(들)(예를 들면, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재 하에 배양된다. 비자연적으로 발생하는 아미노산은 그것의 자연적인 대응물 대신에 단백질에 혼입된다. 문헌(Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994))을 참조. 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기는 시험관내 화학적 변형에 의하여 비자연적으로 발생하는 종으로 변환될 수 있다. 화학적 변형은 위치지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)과 조합되어 치환의 범위를 더 확장할 수 있다(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395 (1993)).
IL-17RA 또는 IL-17RC 아미노산 잔기를 한정된 수의 비보존적 아미노산, 유전 암호에 의하여 코딩되지 않는 아미노산, 비자연적으로 발생하는 아미노산, 및 비자연적인 아미노산으로 치환할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 중의 필수적 아미노산은 당업계에 공지된 과정, 예를 들면 위치지정 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발에 따라 확인될 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs and Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", in Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), 페이지 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). 후자의 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자의 모든 잔기에 도입되고, 생성된 돌연변이 분자는 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 확인하기 위하여 생물학적 활성에 대하여 시험할 수 있다. 또한 문헌(Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996))을 참조.
*서열 분석이 IL-17RA 또는 IL-17RC 리간드 결합 영역을 더 규명하는 데 사용될 수 있지만, IL-17RA 또는 IL-17RC 결합 활성(예를 들면, IL-17A 또는 IL-17F 중 어느 하나와 IL-17RC의 결합, 및 IL-17RA와 IL-17A의 결합)에 중요한 역할을 하는 아미노산은 또한 후보 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 핵 자기 공명, 전자 회절 또는 광친화 표지(photoaffinity labeling)와 같은 기술로 결정되는 구조의 물리적 분석에 의하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 문헌(de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), 및 Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992))을 참조. 구체적으로, 3개의 도메인이 확인되었다:
1) 도메인 1(SEQ ID NO:159 및 160)은 IL-17RC의 엑손 8-10을 포함한다. 이것은 (SEQ ID NO:2)의 IL-17RCx1의 아미노산 잔기 193-276 및 (SEQ ID NO:166)의 IL-17RCx4의 아미노산 잔기 208-291에 상응한다.
2) 도메인 2(SEQ ID NO:161 및 162)는 IL-17RC의 엑손 11-13을 포함한다. 이것은 (SEQ ID NO:2)의 IL-17RCx1의 아미노산 잔기 277-370 및 (SEQ ID NO:166)의 IL-17RCx4의 아미노산 잔기 292-385에 상응한다.
3) 도메인 3(SEQ ID NO:163 및 164)은 IL-17RC의 엑손 14-16을 포함한다. 이것은 (SEQ ID NO:2)의 IL-17RCx1의 아미노산 잔기 371-447 및 (SEQ ID NO:166)의 IL-17RCx4의 아미노산 잔기 386-462에 상응한다.
다중 아미노산 치환은 Reidhaar-Olson 및 Sauer (Science 241:53 (1988)) 또는 Bowie 및 Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989))에 의하여 개시된 것들과 같은, 돌연변이유발 및 스크리닝과 같은 공지된 방법을 사용하여 수행되고 시험될 수 있다. 간단히 말하면, 이들 저자들은 폴리펩티드 중의 두 개 이상의 위치를 동시에 무작위로 고르고, 기능성 폴리펩티드에 대하여 선택한 후, 돌연변이화된 폴리펩티드를 시퀀싱하여 각 위치에서 허용되는 치환의 스펙트럼을 결정한다. 사용될 수 있는 다른 방법은 파지 디스플레이(예를 들면, Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al., 미국 특허 제5,223,409호, Huse, 국제 공보 WO 92/06204), 및 영역지정(region-directed) 돌연변이유발(Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986), 및 Ner et al., DNA 7:127, (1988))을 포함한다. 더욱이, 비오틴 또는 FITC로 표지된 IL-17RC 또는 IL-17RA는 IL-17RC 리간드의 발현 클로닝에 사용될 수 있다.
개시된 IL-17RC 또는 IL-17RA 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 변이체는 문헌(Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:10747 (1994), 및 국제공보 WO 97/20078에 개시된 DNA 셔플링을 통하여 발생될 수 있다. 간단히 말하면, 변이체 DNA 분자는 모 DNA의 무작위 졀편화에 의한 시험관내 상동 재조합, 이어서 무작위로 도입된 점 돌연변이를 야기하는 PCR을 사용한 재조립에 의하여 발생된다. 이 기술은 그 과정에 추가 변이성을 도입하기 위하여 다른 종으로부터의 대립형질 변이체 또는 DNA 분자와 같은 모 DNA 분자의 패밀리를 사용함으로써 변형될 수 있다. 원하는 활성을 선택 또는 스크리닝, 이어서 돌연변이유발 및 분석을 추가로 반복하면, 불리한 변화에 대하여 선택하는 동시에 바람직한 돌연변이에 대하여 선택함으로써 서열의 빠른 "진화"를 제공한다.
본원에 개시된 돌연변이유발 방법은 숙주 세포에서 클로닝된, 돌연변이화된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위하여 대용량처리, 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다. 생물학적으로 활성의 폴리펩티드, 또는 항-IL-17RC 또는 항-IL-17RA 항체와 결합하는 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이화된 DNA 분자를 숙주 세포로부터 회수할 수 있고, 현대적 장치를 사용하여 신속하게 시퀀싱할 수 있다. 이들 방법은 관심대상의 폴리펩티드에 있는 각각의 아미노산 잔기의 중요성을 신속하게 결정하게 해주고, 미지의 구조의 폴리펩티드에 적용할 수 있다.
본 발명은 또한 IL-17RC 또는 IL-17RA 폴리펩티드의 "기능성 단편" 및 이러한 기능성 단편을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 이들 기능성 단편은 리간드 또는 리간드들(즉, IL-17A 및 IL-17F 모두)에 단독으로 또는 함께 결합할 수 있다. 핵산 분자의 일반적인 분석은 IL-17RC 또는 IL-17RA 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 기능성 단편을 얻기 위하여 수행될 수 있다. 실례로서, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA 분자를 Bal31 뉴클레아제로 분해하여 일련의 네스티드 결실(nested deletion)을 얻을 수 있다. 그 후 단편을 적합한 리딩프레임으로 발현 벡터에 삽입하고, 발현된 폴리펩티드를 분리하여 항-IL-17RC 항체와 결합하는 능력에 대하여 시험하였다. 엑소뉴클레아제 분해에 대한 하나의 대안적 방법은 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이유발법으로 결실 또는 종결 코돈을 도입하여 원하는 단편의 생성을 지정하는 것이다. 대안적으로, IL-17RC 또는 IL-17RA 유전자의 특정 단편은 중합효소 연쇄반응을 사용하여 합성될 수 있다.
이 일반적인 접근법으로는 문헌(Horisberger and Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995))에 요약되어 있는 인터페론의 한쪽 말단 또는 두 말단에서의 절단에 관한 연구가 좋은 예가 된다. 더욱이, 단백질의 기능적 분석에 대한 표준기술은 예를 들면 문헌(Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993), Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", in Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), 페이지 65-72 (Nijhoff 1987), Herschman, "The EGF Receptor", in Control of Animal Cell Proliferation, Vol. 1, Boynton et al., (eds.) 페이지 169-199 (Academic Press 1985), Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995), 및 Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996))에 설명된다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 아미노산 서열과 비교하여 아미노산 변화를 가진 IL-17RC 또는 IL-17RA 유전자의 기능성 단편을 고려한다. 변이체 IL-17RC 또는 IL-17RA 유전자는 상기에 논의된 바와 같이 개시된 뉴클레오티드 및 아미노산과의 동일성의 수준을 결정함으로써 구조에 기초하여 확인될 수 있다. 구조에 기초하여 변이체 유전자를 확인하는 대안적 접근법은 잠재적 변이체 IL-17RC 또는 IL-17RA 유전자를 코딩하는 핵산 분자가 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:4와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함한 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 지를 결정하는 것이다.
본 발명은 또한 IL-17RC 또는 IL-17RA 폴리펩티드의 기능성 단편, 항원성 에피토프, IL-17RC 및/또는 IL-17RA 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분 또는 리간드-결합 부분, 및 이러한 기능성 단편, 항원성 에피토프, IL-17RC 및/또는 IL-17RA 폴리펩티드의 에피토프-보유 부분 또는 리간드-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 사용하는 것을 포함한다. 이들 단편은 IL-17A 또는 IL-17F 또는 IL-17A와 IL-17F 모두의 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 가용성 수용체 또는 결합 분자를 생성하는데 사용하기 위한 폴리펩티드를 생성하는데 사용된다. 본원에 정의된 "기능성" IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 IL-17A 및/또는 IL-17F 염증성, 증식성 또는 분화 활성을 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시키는 능력, 특수화된 세포 기능을 유도 또는 억제하는 능력, 또는 IL-17A 및/또는 IL-17F에 특이적으로 결합하는 능력을 특징으로 한다. 본원에 이미 설명한 바와 같이, IL-17RA와 IL-17RC는 모두 본원에 설명된 유일한 사이토카인 수용체 구조 및 도메인을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 (a) 전술한 하나 이상의 도메인을 포함한 폴리펩티드 분자; 및 (b) 하나 이상의 이들 도메인을 포함한 기능성 단편을 포함한 융합 단백질을 사용하는 것을 더 고려한다. 융합 단백질의 다른 폴리펩티드 부분은 IL-17-형 수용체, IL-17RA, IL-17RE, IL-17RD와 같은 다른 사이토카인 수용체, 또는 융합 단백질의 분비를 촉진하는 비-천연 및/또는 연관되지 않은 분비성 신호 펩티드이 될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 설명된 IL-17RC 또는 IL-17RA 폴리펩티드의 리간드-결합 부분을 포함한 폴리펩티드 단편 또는 펩티드를 제공한다. 이러한 단편 또는 펩티드는 그것의 각 리간드(IL-17A 및/또는 IL-17F)와 결합하는 IL-17RC 또는 IL-17RA의 부분을 포함할 수 있다.
변이체 및 융합 단백질을 포함한, 어떤 IL-17RC 또는 IL-17RA 폴리펩티드의 경우, 당업자는 상기 표 1 및 2에 나타낸 정보를 사용하여 그 변이체를 코딩하는 완전히 변성된 폴리뉴클레외티드 서열을 용이하게 발생시킬 수 있다. 더욱이, 당업자는 표준 소프트웨어를 사용하여 본원에 설명된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 기초한 IL-17RC 또는 IL-17RA 변이체를 고안해 낼 수 있다.
E) IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 생성
전체길이 폴리펩티드; 가용성 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체; 전체길이 수용체; 수용체 단편(예를 들면, 리간드-결합 단편 및 항원성 에피토프), 기능성 단편, 및 융합 단백질을 포함한 본 발명의 폴리펩티드는 종래의 기술을 사용하여 재조합 숙주 세포에서 생성될 수 있다. IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 유전자를 발현시키기 위하여, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 결합되고, 그 다음 숙주 세포 내로 도입되어야 한다. 프로모터 및 인핸서와 같은 전사 조절 서열뿐만 아니라, 발현 벡터는 발현 벡터를 운반하는 세포의 선택에 적합한 번역 조절 서열 및 마커 유전자를 포함할 수 있다.
진핵세포에서 외래 단백질의 생산에 적합한 발현 벡터는 전형적으로 (1) 박테리아 숙주에서 발현 벡터의 성장 및 선택을 제공하는 박테리아 복제 기점 및 항생제 내성 마커를 코딩하는 원핵 DNA 인자; (2) 프로모터와 같은 전사의 개시를 제어하는 진핵 DNA 인자; 및 (3) 전사 종결/폴리아데닐화 서열과 같은 전사체의 가공을 제어하는 DNA 인자를 함유한다. 상기에 논의된 바와 같이, 발현 벡터는 또한 이종 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 안내하는 분비성 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, IL-17RC 발현 벡터는 IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 유전자 및 어떤 분비된 유전자로부터 유래된 분비성 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 단백질은 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포의 예는 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(Vero; ATCC CRL 1587), 사람 배아 신장세포(293-HEK; ATCC CRL 1573), 새끼 햄스터 신장세포(BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), 개 신장세포(MDCK; ATCC CCL 34), 중국 햄스터 난소세포(CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), 레트 뇌하수체 세포(GH1; ATCC CCL82), HeLa S3 세포(ATCC CCL2.2), 레트 간세포(H-4-II-E; ATCC CRL 1548), SV40-형질전환된 원숭이 신장세포(COS-1; ATCC CRL 1650) 및 쥐과 배아세포(NIH-3T3; ATCC CRL 1658)를 포함한다.
포유동물 숙주의 경우, 전사 및 번역 조절 신호는 포유동물 바이러스 공급원, 예를 들면 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 유인원 바이러스 등에서 유래할 수 있고, 이 조절 신호는 고 수준의 발현을 하는 특정 유전자와 연결된다. 또한, 적합한 전사 및 번역 조절 신호는 포유동물 유전자, 예를 들면 액틴, 콜라겐, 미오신, 및 메탈로티오네인(metallothionein) 유전자에서 얻을 수 있다.
전사 조절 서열은 RNA 합성의 개시를 지시하기에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 적합한 진핵 프로모터는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(Hamer et al., J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31:355 (1982)), SV40 초기 프로모터(Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), Rous 육종 바이러스 프로모터(Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), 사이토메갈로바이러스 프로모터(Foecking et al., Gene 45:101 (1980)), 및 마우스 유선 종양 바이러스 프로모터(일반적으로 문헌(Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), 페이지 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) 참조)를 포함한다.
또는, 원핵 프로모터, 예를 들면 박테리오파지 T3 RNA 폴리머라제 프로모터는, 이 원핵 프로모터가 진핵 프로모터에 의하여 조절된다면 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다(Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990), 및 Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).
어떤 구체예에서, IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 가용성 수용체 폴리펩티드 또는 IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 DNA 서열은 일반적으로 발현 벡터 내에 전사 프로모터 및 종결자를 포함하는, 그것의 발현에 필요한 다른 유전 인자에 작동가능하게 연결된다. 당업자는 어떤 시스템 내에서 선택가능한 마커가 별개의 벡터에 제공될 수 있고, 외인성 DNA의 복제가 숙주 세포 게놈 내에 통합됨으로써 제공될 수 있다는 것을 인식하겠지만, 벡터는 또한 공통적으로 하나 이상의 선택가능한 마커 및 하나 이상의 복제 기점을 함유할 것이다. 프로모터, 종결자, 선택가능한 마커, 벡터 및 다른 인자의 선택은 당업자 수준 내에서 일반적인 설계의 문제이다. 이러한 많은 인자들은 시판품으로 구입할 수 있다. 가용성 수용체 복합체의 다중 성분은 각각의 발현 벡터에 공동-트랜스팩션되거나 단일 발현 벡터에 함유될 수 있다. 단백질 복합체의 다중 성분을 발현시키는 이러한 기술들은 당업계에 주지되어 있다.
발현 벡터는 인산칼슘 트랜스팩션, 리포솜-매개된 트랜스팩션, 마이크로프로젝타일-매개 전달, 일렉트로포레이션 등을 포함한 다양한 표준 기술을 사용하여 숙주 세포에 도입될 수 있다. 숙주 세포 게놈에 안정되게 통합된 발현 벡터를 포함한 재조합 숙주 세포를 제공하는 트랜스팩션된 세포를 선택하고 증식할 수 있다. 벡터를 진핵 세포에 도입하기 위한 기술 및 우성의 선택가능한 마커를 사용하여 이러한 안정한 형질전환체를 선택하기 위한 기술은 예를 들면 문헌(Ausubel (1995) and by Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991))에 설명된다.
예를 들면, 적합한 선택가능한 마커는 항생제 네오마이신에 내성을 제공하는 유전자이다. 이 경우에, 선택은 G-418 등과 같은 네오마이신 형 약물의 존재에서 수행된다. 선택 시스템은 "증식"이라 불리는 과정으로서 관심있는 유전자의 발현 수준을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 증식은 저 수준의 선택제의 존재 하에 트랜스팩턴트를 배양하고, 그 후 도입된 유전자의 고 수준의 생성물을 생산하는 세포를 선택하기 위하여 선택제의 양을 증가시킴으로써 수행된다. 적합한 증식가능한 마커는 메토트렉세이트(methotrexate)에 내성을 부여하는 디히드로폴산 환원효소(DHFR)이다. 또한 다른 약물 내성 유전자(예를 들면, 히그로마이신 내성, 다중 약물 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스페라제)를 사용할 수 있다. 대안적으로, 변경된 표현형, 예를 들면 녹색 형광 단백질, 또는 세포 표면 단백질, 예를 들면 CD4, CD8, MHC 제 I 형, 태반 알카라인 포스파타제를 도입하는 마커는 FACS 분류 또는 자성 비드 분리 기술과 같은 수단에 의하여 트랜스팩션되지 않은 세포로부터 트랜스팩션된 세포를 분류하는 데 사용될 수 있다.
*본 발명의 폴리펩티드는 또한 바이러스 전달 시스템을 사용하여 배양된 포유동물 세포에 의하여 생성될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-연관된 바이러스(AAV)를 포함한다. 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 이종 핵산의 전달을 위하여 최근 가장 잘 연구된 유전자 전달 벡터이다(검토를 위해서, 문헌(Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994), 및 Douglas and Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997))을 참조하라). 아데노바이러스의 장점은 비교적 큰 DNA 삽입체의 수용, 높은 역가로 성장하는 능력, 넓은 범위의 포유동물 세포 유형을 감염시키는 능력, 및 상이한 프로모터를 함유한 많은 수의 이용가능한 벡터와 사용할 수 있는 유연성을 포함한다.
아데노바이러스 게놈을 일부 결실함으로써, 이종 DNA의 더 큰 삽입체(7kb 까지)를 수용할 수 있다. 직접 리게이션에 의하여 또는 공동-트랜스팩션된 플라스미드와 상동 재조합에 의하여 바이러스 DNA에 이들 삽입체를 혼입할 수 있다. 한가지 방법은 바이러스 벡터에서 필수 E1 유전자를 결실하는 것이며, E1 유전자가 숙주 세포에 의하여 제공되지 않는다면 복제 불능을 초래한다. 아데노바이러스 벡터-감염된 사람 293 세포(ATCC No. CRL-1573, 45504, 45505)는 예를 들면 충분한 양의 단백질을 생성하기 위하여 비교적 높은 세포 밀도로 부착 세포로 또는 현탁 배양물에서 성장할 수 있다(예를 들면, 문헌(Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)) 참조).
본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 상위 진핵 세포, 예를 들면 조류, 균류, 곤충, 효모, 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 배큘로바이러스 시스템은 클로닝된 유전자를 곤충 세포에 도입하는 효율적인 수단을 제공한다. 적합한 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 다중 핵다각체병 바이러스(AcMNPV)에 기초하고, 초파리(Drosophila) 열 쇼크 단백질(hsp) 70 프로모터, 오토그라파 캘리포니카 핵다각체병 바이러스 immediate-early 유전자 프로모터(ie-1) 및 delayed-early 39K 프로모터, 배큘로바이러스 p10 프로모터 및 초파리 메탈로티오네인 프로모터와 같은 주지된 프로모터를 함유한다. 재조합 배큘로바이러스를 제조하기 위한 두 번째 방법은 Luckow에 의하여 설명된 트랜스포존 시스템을 이용한다(Luckow, et al., J. Virol. 67:4566 (1993)). 전달 벡터를 이용하는 이 시스템은 BAC-to-BAC 키트로 시판된다(Life Technologies, Rockville, MD). 이 시스템은 "백미드(bacmid)"라고 불리는 큰 플라스미드로서 대장균(E. coli)에 보존된 배큘로바이러스 게놈으로 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 이동시키는 Tn7 트랜스포존을 함유한 전달벡터 PFASTBAC(Life Technologies)을 이용한다. 문헌(Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), 및 Chazenbalk, and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995))을 참조. 또한, 전달 벡터는 발현된 폴리펩티드의 C- 또는 N-말단의 에피토프 태그, 예를 들면 Glu-Glu 에피토프 태그를 코딩하는 DNA와의 인프레임 융합을 포함할 수 있다(Grussenmeyer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 82:7952 (1985)). 당업계에 공지된 기술을 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 함유한 전달 벡터를 대장균에 형질전환시켜 재조합 배큘로바이러스를 나타내는 방해된 lacZ 유전자를 함유한 백미드에 대하여 스크리닝한다. 그 후 일반 기술을 사용하여 재조합 배큘로바이러스 게놈을 함유한 bacmid DNA을 분리한다.
상기 PFASTBAC 벡터는 상당한 정도로 변형될 수 있다. 예를 들어, 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 제거되어 배큘로바이러스 감염시 초기에 발현되는 배큘로바이러스 단백질 프로모터(Pcor, p6.9 또는 MP 프로모터라고도 함)로 치환될 수 있고, 분비성 단백질을 발현시키는데 이로운 것으로 나타났다(예를 들면, 문헌(Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994), 및 Chazenbalk and Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995)) 참조). 이러한 전달 벡터 구성체에서, 기본 단백질 프로모터는 짧거나 긴 버전을 사용할 수 있다. 또한, 천연 분비 신호 서열을 곤충 단백질에서 유래된 분비 신호 서열로 대체하는 전달 벡터를 구성할 수 있다. 예를 들면, 엑디스테로이드 글루코실전이효소(EGT)의 분비신호 서열, 꿀벌 멜리틴(Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA), 또는 배큘로바이러스 gp67 (PharMingen: San Diego, CA)는 천연 IL-17RC 분비성 신호 서열을 대체하는 구성체에서 사용될 수 있다.
재조합 바이러스 또는 백미드는 숙주 세포를 트랜스팩션하는 데 사용될 수 있다. 적합한 곤충 숙주 세포는 초파리 슈나이더-2 세포, 및 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)에서 유래된 HIGH FIVEO 세포주 (Invitrogen) (U.S. Patent No. 5,300,435)뿐만 아니라 IPLB-Sf-21에서 유래된 세포주, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 번데기 난소 세포주, 예를 들면 Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE, 및 Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA)을 포함한다. 상업적으로 구입가능한 무혈청 배지는 세포를 성장시키고 유지하는 데 사용될 수 있다. 적합한 배지는 Sf9 세포의 경우 Sf900 IITM(Life Technologies) 또는 ESF 921TM (Expression Systems); 그리고 T. ni 세포의 경우 Ex-cellO405TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveOTM(Life Technologies)이다. 재조합 바이러스가 사용될 때, 세포는 전형적으로 약 2-5 x 105 세포의 접종 밀도 내지 1-2 x 106 세포의 밀도로 성장하고, 각 시점에 재조합 바이러스 원액은 0.1 내지 10, 더 일반적으로는 거의 3의 MOI(multiplicity of infection)로 첨가된다.
배큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 생성하기 위한 확립된 기술은 문헌(Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors", in Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), 페이지 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991), Patel et al., "The baculovirus expression system", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2판, Glover et al. (eds.), 페이지 205-244 (Oxford University Press 1995), by Ausubel (1995), 페이지 16-37 내지 16-57, Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995), 및 Lucknow, "Insect Cell Expression Technology", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), 페이지 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996))에 제공된다.
또한 효모 세포를 포함한 곰팡이 세포는 본원에 설명된 유전자를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 이와 관련하여 특정 관심대상의 효모 종은 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 및 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)를 포함한다. 효모에서 발현을 위한 적합한 프로모터는 GAL1 (갈락토스), PGK (포스포글리세르산 키나제), ADH (알코올 탈수소효소), AOX1 (알코올 산화효소), HIS4 (히스티디놀 탈수소효소) 등의 프로모터를 포함한다. 많은 효모 클로닝 벡터가 설계되었으며 용이하게 이용가능하다. 이들 벡터는 YIp5와 같은 YIp 벡터, YRp17와 같은 YRp 벡터, YEp13와 같은 YEp 벡터, 및 YCp19와 같은 YCp 벡터를 포함한다. 사카로미세스 세레비시아 세포를 외인성 DNA로 형질전환하고 그것들로부터 재조합 폴리펩티드를 생성하는 방법은 예를 들면 문헌(Kawasaki, U.S. Patent No. 4,599,311, Kawasaki et al., U.S. Patent No. 4,931,373, Brake, U.S. Patent No. 4,870,008, Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,743, 및 Murray et al., U.S. Patent No. 4,845,075)에 개시된다. 형질전환된 세포를 선택가능한 마커로 결정된 표현형, 통상적인 약물 내성 또는 특정 영양분(예를 들면, 류신)의 부재시에 성장하는 능력으로 선택한다. 사카로미세스 세레비시아에 사용하기 위한 적합한 벡터 시스템은 형질전환된 세포가 글루코스-함유 배지에서 성장함으로써 선택되게 하는, Kawasaki et al. (U.S. Patent No. 4,931,373)에 개시된 POT1 벡터 시스템이다. 효모에 사용하기 위한 추가적 적합한 프로모터 및 종결자는 해당 효소 유전자(예를 들면, Kawasaki, U.S. Patent No. 4,599,311, Kingsman et al., U.S. Patent No. 4,615,974, 및 Bitter, U.S. Patent No. 4,977,092 참조) 및 알코올 탈수소효소 유전자의 것들을 포함한다. 또한 U.S. Patents No. 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936, 및 4,661,454을 참조.
*한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로미세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피카아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 길레르몬디(Pichia guillermondii) 및 캔디다 말토사(Candida maltosa)는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 문헌(Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986), 및 Cregg, U.S. Patent No. 4,882,279)을 참조. 아스페르길루스(Aspergillus) 세포는 McKnight et al., U.S. Patent No. 4,935,349의 방법에 의해서 사용될 수 있다. 아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)을 형질전환하기 위한 방법은 Sumino et al., U.S. Patent No. 5,162,228에 개시된다. 뉴로스포라(Neurospora)를 형질전환하기 위한 방법은 Lambowitz, U.S. Patent No. 4,486,533에 개시된다.
예를 들면, 재조합 단백질의 생성을 위한 숙주로서 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica)를 사용하는 것은 Raymond, U.S. Patent No. 5,716,808, Raymond, U.S. Patent No. 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998), 및 국제공보 No. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, 및 WO 98/02565에 개시된다. 피키아 메타놀리카를 형질전환하는 데 사용하기 위한 DNA 분자는 통상적으로 바람직하게는 형질전환 전에 선형화되는 이중 가닥, 고리형 플라스미드로 제조될 될 것이다. 피키아 메타놀리카에서의 폴리펩티드 생성을 위하여, 플라스미드의 프로모터 및 종결자는 피키아 메타놀리카 알코올 이용 유전자(AUG1 또는 AUG2)와 같은 피키아 메타놀리카 유전자의 그것일 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 디히드로아세톤 합성효소(DHAS), 포름산 탈수소효소 (FMD), 및 카탈라제(CAT) 유전자의 것들을 포함한다. DNA가 숙주 염색체에 통합되는 것을 촉진하기 위하여, 숙주 DNA 서열의 양쪽 말단에 인접해 있는 플라스미드의 전체 발현 조각을 갖는 것이 바람직하다. 피키아 메토놀리카에 사용하기에 적합한 선택가능한 마커는 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC; EC 4.1.1.2.1)를 코딩하고, 아데닌의 부재시에 ade2 숙주 세포가 성장할 수 있게 하는 피키아 메타놀리카 ADE2 유전자이다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대용량, 산업 공정의 경우, 두 메탄올 이용 유전자(AUG1 및 AUG2)가 결실된 숙주 세포가 사용될 수 있다. 분비성 단백질의 생성을 위하여, 숙주 세포는 베큘러 단백질분해효소 유전자(PEP4 및 PRB1)가 결핍될 수 있다. 일렉트로포레이션은 피키아 메타놀리카 세포 내에 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 함유한 플라스미드을 도입하는 것을 촉진하는 데 사용된다. 피키아 메타놀리카 세포는 2.5 내지 4.5 kV/cm, 바람직하게는 약 3.75 kV/cm의 전계 강도, 그리고 1 내지 40 밀리초, 가장 바람직하게는 약 20 밀리초의 시간 상수(t)를 가진 급격히 감쇠하는 펄스 전기장을 이용한 일렉트로포레이션에 의하여 형질전환될 수 있다.
발현 벡터는 또한 식물 원형질체, 원형 식물 조직, 또는 분리된 식물 세포에 도입될 수 있다. 발현 벡터를 식물 조직에 도입하기 위한 방법은 뿌리혹박테리아(Agrobacterium tumefaciens), 마이크로프로젝타일-매개 전달, DNA 주입, 일렉트로포레이션 등을 통한 식물 조직의 직접적 감염 또는 공동-배양을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Horsch et al., Science 227:1229(1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992), 및 Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), 페이지 67-88 (CRC Press, 1993))을 참조.
대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 원핵 숙주 세포에서 발현될 수 있다. IL-17RC 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 당업자에게 주지되어 있으며 T4, T3, Sp6 및 T7 폴리머라제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, 대장균의 trp, recA, 열 쇼크, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA 및 lacZ 프로모터, 바실루스 서브틸리스(B. subtilis)의 프로모터, 바실루스(Bacillus)의 박테리오파지의 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, 스트렙토미세스 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 bla 프로모터, 클로람페니콜 아세틸 전이효소 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터는 문헌(Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed. (Benjamin Cummins 1987), 및 Ausubel et al. (1995))에서 검토되었다.
적합한 원핵 숙주는 대장균 및 바실루스 서브틸루스를 포함한다. 대장균의 적합한 균주는 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, 및 ER1647을 포함한다(예를 들면, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) 참조). 바실루스 서브틸루스의 적합한 균주는 BR151, YB886, MI119, MI120, 및 B170을 포함한다(예를 들면, Hardy, "Bacillus Cloning Methods", in DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)) 참조).
대장균과 같은 박테리아에서 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 때, 폴리펩티드는 세포질, 전형적으로는 불용성 과립으로서 보유될 수 있거나, 박테리아 분비 서열에 의하여 원형질막 공간으로 인도될 수 있다. 전자의 경우에, 세포를 용해시키고, 과립을 회수하고, 예를 들면 구아니딘 이소티오시안산 또는 우레아를 사용하여 변성시킨다. 그 다음 변성된 폴리펩티드를 다시 폴딩시켜 변성제의 희석에 의하여, 예를 들면 우레아 용액 및 환원되고 산화된 글루타티온의 조합에 대한 투석, 이어서 완충된 식염수 용액에 대한 투석에 의하여 다이머를 형성할 수 있다. 후자의 경우에, 폴리펩티드는 원형질막 공간의 내용물을 분비하도록 세포를 파괴하고, 단백질을 회수하여 변성 및 재폴딩의 필요를 미연에 방지함으로써 가용성 및 기능성 형태로 원형질막 공간에서 회수될 수 있다.
원핵 숙주에서 단백질을 발현시키기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들면, 문헌(Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), 페이지 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, 페이지 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 및 Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), 페이지 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)) 참조).
발현 벡터를 박테리아, 효모, 곤충, 및 식물 세포에 도입하기 위한 표준 방법은 예를 들면 Ausubel (1995)에 의하여 제공된다.
포유동물 세포 시스템에 의하여 생성된 외래 단백질을 발현시키고 회수하기 위한 일반적 방법은 예를 들면 문헌(Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), 페이지 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996))에 제공된다. 박테리아 시스템에 의하여 생성된 단백질을 회수하기 위한 표준 기술은 예를 들면 문헌(Grisshammer et al., "Purification of over-produced proteins from E. coli cells", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), 페이지 59-92 (Oxford University Press 1995))에 제공된다. 배큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질을 분리하기 위한 확립된 방법은 문헌(Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995))에 설명된다.
대안으로서, 본 발명의 폴리펩티드는 배타적 고체상(exclusive solid phase) 합성, 부분적 고체상 방법, 단편 축합반응 또는 고전적인 용액 합성에 의하여 합성될 수 있다. 이들 합성 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", (2판), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields and Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis", Methods in Enzymology Volume 289 (Academic Press 1997), 및 Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)) 참조). 또한, "천연 화학적 리게이션" 및 "발현된 단백질 리게이션"과 같은 전체 화학 합성 전략에서의 변이는 표준법이다(예를 들면, 문헌(Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir et al, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998), 및 Severinov and Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)) 참조).
본 발명의 펩티드 및 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 5 또는 21의 적어도 6, 적어도 9, 또는 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기를 포함한다. 한 예시로서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 5, 및/또는 21의 적어도 6, 적어도 9, 또는 적어도 15개의 연속 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 이들 아미노산 잔기의 20, 30, 40, 50, 100개, 또는 그 이상의 잔기를 포함한다. 이러한 펩티드 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 중합효소 연쇄반응 프라이머 및 프로브로서 유용하다.
더욱이, 본 발명의 폴리펩티드 및 그것의 단편은 고등 진핵세포 내에 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머로 발현될 수 있다. 이러한 세포들은 적어도 하나의 IL-17RC 폴리펩티드의 적어도 일부분을 포함한 IL-17RC 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 폴리펩티드("IL-17RC-포함 수용체" 또는 "IL-17RC-포함 수용체 폴리펩티드")를 생성하는 데 사용될 수 있거나, IL-17RC 및 IL-17RA의 일부분이 함께(모노머, 호모다이머 또는 헤테로다이머로서) 스크리닝 시스템에서 분석 세포들로 사용될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, IL-17RC 또는 IL-17RC 세포외 도메인의 적어도 리간드-결합 부분을 포함한 본 발명의 폴리펩티드는 배양된 세포에 의하여 생성되고, 그 세포는 천연 리간드, IL-17F, 뿐만 아니라 IL-17A, 또는 심지어 천연 리간드의 작용제 및 길항제를 포함한 수용체의 리간드를 스크린하는 데 사용된다. 이 접근법을 요약하면, cDNA 또는 수용체를 코딩하는 유전자는 그것의 발현에 필요한 다른 유전 요소(예를 들면, 전사 프로모터)와 조합되고, 생성된 발현 벡터는 숙주 세포 내에 삽입된다. DNA를 발현하고 기능성 수용체를 생성하는 세포를 선택하여 다양한 스크리닝 시스템에서 사용된다. 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 복합체의 각 성분은 동일한 세포에서 발현될 수 있다. 더욱이, 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머 수용체 복합체의 성분은 막통과 도메인 또는 다른 막 융합 부분과 융합되어 전술한 복합체 조립 및 트랜스팩턴트의 스크리닝을 가능케 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 분석하기 위하여, IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 수용체 또는 IL-17A 또는 IL-17F와 결합하는 공지된 다른 수용체를 발현시키고 수용체-매개 신호를 전달하는 데 적합한 포유동물 세포(예를 들어, IL-17R을 발현하는 세포)는 IL-17RC와 기능성 복합체를 형성할 수 있는 다른 수용체 서브유닛을 발현시키는 세포를 포함한다. 또한 발현된 수용체와 동일한 종의 세포를 이용한 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 세포는 그것의 증식을 위해서 외생적으로 공급된 조혈 성장 인자에 의존한다. 이 유형의 바람직한 세포주는 사람 TF-1 세포주 (ATCC 번호 CRL-2003) 및 AML-193 세포주 (ATCC 번호 CRL-9589)이며, 이것들은 GM-CSF-의존 사람 백혈병 세포주 및 IL-3 의존 쥐과 전구-B 세포주인 BaF3(Palacios 및 Steinmetz, Cell 41: 727-734, (1985))이다. 다른 세포주는 BHK, COS-1 및 CHO 세포를 포함한다. 적합한 숙주 세포는 필요한 수용체 서브유닛 또는 원하는 세포 반응에 필요한 다른 세포 성분을 생성하도록 조작될 수 있다. 이 접근법은 세포주가 어떤 종의 수용체 서브유닛을 발현하도록 조작되어, 종 특이성으로부터 발생한 잠재적 한계를 극복할 수 있기 때문에 유리하다. 사람 수용체 cDNA의 종 오토로그를 클로닝하여 동일한 종의 세포주에서 BaF3 세포주에 있는 마우스 cDNA와 같이 사용할 수 있다. 따라서 GM-CSF 또는 IL-3과 같은 하나의 조혈 성장 인자에 의존하는 세포주는 IL-17F 또는 IL-17A와 같이 IL-17RC 또는 IL-17RA 수용체를 통하여 작용하는 다른 사이토카인에 의존하도록 조작될 수 있다.
기능성 수용체를 발현하는 세포는 스크리닝 분석에 사용된다. 다양한 적합한 분석이 당업계에 공지되어 있다. 이들 분석은 표적 세포에서의 생물학적 반응의 검출에 기초한다. 이러한 분석중 하나는 세포 증식 분석이다. 세포는 시험 화합물의 존재 또는 부재시에 배양되고 세포 증식은 예를 들면 삼중 티미딘(tritiated thymidine)의 혼입을 측정하거나, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT)의 대사적 분해작용에 기초한 비색계 분석에 의하여 검출될 수 있다(Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983)). 대안적 분석 포맷은 리포터 유전자를 발현하도록 더 조작된 세포를 사용한다. 리포터 유전자는 수용체 결합된 경로에 반응하는 프로모터 요소와 결합되며, 그 분석은 리포터 유전자의 전사의 활성화를 검출한다. 이와 관련된 바람직한 프로모터 인자는 혈청 반응 인자, 또는 SRE이다. 예를 들면, 문헌(Shaw et al., Cell 56:563-572, (1989))을 참조. 이러한 바람직한 리포터 유전자는 루시페라제 유전자이다(de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, (1987)). 루시페라제 유전자의 발현은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 발광에 의하여 검출된다(예를 들면, Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-29101 (1994); Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). 루시페라제 활성 분석 키트는 예를 들면 Promega Corp.(Madison, WI)에서 상업적으로 구입가능하다. 이 유형의 표적 세포주는 화학물질, 세포-조절된 배양 배지, 곰팡이 액체배지, 토양 샘플, 물 샘플 등의 라이브러리를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포-조절된 배지 샘플의 한 뱅크는 리간드를 생성하는 세포를 확인하기 위하여 표적 세포에서 분석될 수 있다. 그 다음 양성 세포를 포유동물 발현 벡터에서 cDNA 라이브러리를 생성하는 데 사용하는데, 이것은 풀(pool)로 나누고, 숙주 세포에 트랜스팩션하여 발현시킨다. 그 다음 리간드를 코딩하는 클로닝된 cDNA를 분리하기 위하여 트랜스팩션된 세포의 배지 샘플을 그 후의 풀의 분열, 재-트랜스팩션, 2차 배양, 및 양성 세포의 재분석으로 분석한다.
본 발명에 의하여 제공된 추가 스크리닝 접근법은 하이브리드 수용체 폴리펩티드의 사용을 포함한다. 이들 하이브리드 폴리펩티드는 두 가지 일반 부류로 나뉜다. 제 1 류에서, IL-17RC의 세포내 도메인은 두 번째 수용체의 리간드 결합 도메인에 결합된다. 하이브리드 수용체 폴리펩티드의 제 2 류는 두 번째 수용체의 세포내 도메인, 바람직하게는 조혈 사이토카인 수용체, 및 막통과 도메인이 있는 IL-17RC(SEQ ID NO:3) 및 IL-17RA(SEQ ID NO:21)의 세포외(리간드-결합) 도메인을 포함한다. 이러한 하이브리드 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 및 멀티머는 두 번째 수용체에 의하여 전달된 신호에 반응할 수 있는 것으로 알려진 세포에서 발현된다. 종합하면, 하이브리드 수용체의 이들 두 부류는 IL-17F 또는 IL-17A를 검출하기 위한 분석의 개발을 위한 반응성 세포 유형의 확인을 가능하게 한다. 더욱이, 이러한 세포는 경쟁 유형 분석에서 본 발명의 가용성 수용체 길항제를 분석하기 위하여 IL-17F 또는 IL-17A의 존재 하에 사용될 수 있다. 이러한 분석에서, 본 발명의 가용성 수용체의 존재 하에 IL-17F 또는 IL-17A의 증식 또는 신호 전달 활성의 감소는 상반된 활성을 나타낸다. 더욱이, IL-17RC-가용성 수용체 결합 분석, 및 세포 기초 분석은 또한 가용성 수용체가 IL-17F 또는 IL-17A 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 상쇄 또는 중화하는 지를 분석하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 다음의 작동가능하게 연결된 인자를 포함하는 발현벡터를 제공한다: a) 전사 프로모터, b) IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 32-458과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 세그먼트(segment), 및 c) 전사 종결인자(terminator). 상기 DNA 세그먼트는 분비 신호서열을 더욱 인코딩할 수 있다. 상기 DNA 세그먼트는 면역글로불린, 예로서 면역글로불린 중쇄 불변영역, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 459-690을 더욱 인코딩할 수 있다. 상기 발현벡터는 E. coli, 차이니즈 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovary cell)와 같은 배양세포내로 도입될 수 있고, 이들 세포는 상기 DNA 세그먼트에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현한다. 본 발명의 또 다른 구체예는, 청구항 14의 발현벡터가 도입되어 DNA 세그먼트에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 단계, 및 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 생산방법이다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 33-458과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 이 폴리펩티드는 면역글로불린 부분(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 이들의 변이체 및 돌연변이체 유래의 Fc 영역과 같은 면역글로불린 중쇄 불변영역; SEQ ID NO: 175의 아미노산 잔기 1-232; 및 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 459-690)을 더욱 포함한다.
또한, 본 발명은, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 33-458과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, IL-17A 및/또는 IL-17F 활성에 의해 야기되거나 유지되거나 증폭되는 질환을 갖는 개체의 치료방법을 제공하며, 상기 폴리펩티드는 IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합하거나 이들을 차단, 감소, 길항 또는 중화시키며, 상기 질환은 건선, 아토피 및 접촉 피부염, IBD, IBS, 대장염, 내독소혈증, 관절염, 류마티스 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 성인 호흡기 질환(ARD), 패혈성 쇼크, 다장기 부전, 염증성 폐 손상, 예를 들면 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기도 과민성, 만성 기관지염, 알레르기성 천식, 박테리아성 폐렴, 건선, 습진, 및 염증성 장 질환, 예를 들면 궤양성 대장암 및 크론병, 헬리코박터 파일로리 감염, 복막염의 결과로서(즉, 감염, 손상 등으로부터) 복강내 유착 및/또는 농양, 전신성 호안성 낭창(SLE), 낭창성 신염, 제1형 당뇨병, 관상동맥질환, 뇌졸증, 다발성 경화증, 전신성 경화증, 피부경화증, 신증후군, 패혈증, 장기 동종이식 거부, 이식편대숙주병(GVHD), 신장, 폐, 심장 등 이식 거부, 연쇄상구균 세포벽(SCW)-유도된 관절염, 골관절염, 치은염/치근막염, 포진성 기질 각막염, 골다공증, 신경염, 간질성 각막염, 전립선암, 신장암, 결장암, 난소암, 자궁경부암을 포함한 암, 백혈병, (난소암, 자궁경부암, 전립선 암과 같은)암 신혈관생성, B림프종, T림프종, 낭성 섬유증, 재발협착증 및 가와사키병으로 이루어진 군에서 선택된다.
F) IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 융합 단백질 및 콘쥬게이트의 생성
*IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 유사체의 일반적인 부류는 본원에 설명된 아미노산 서열의 돌연변이인 아미노산 서열을 가진 변이체이다. IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 유사체의 다른 일반 부류는 아래에서 설명하는 항-이디오타입 항체, 및 그것의 단편으로 제공된다. 더욱이, 항-이디오타입 가변 도메인을 포함한 재조합 항체는 유사체로 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Monfardini et al., Proc. Assoc. Am. Physicians 108:420(1996)) 참조). 항-이디오타입 IL-17RC 항체의 가변 도메인은 IL-17RC를 모방한 것이기 때문에, 이들 도메인은 IL-17RC 결합 활성을 제공할 수 있다. 항-이디오타입 촉매 항체를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Joron et al., Ann. N Y Acad. Sci. 672:216 (1992), Friboulet et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 47:229 (1994), 및 Avalle et al., Ann. N Y Acad. Sci. 864:118 (1998)).
IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 유사체를 확인하는 다른 접근법으로서, 라이브러리 조합을 사용할 수 있다. 파지 디스플레이 및 다른 조합의 라이브러리를 구성하고 스크리닝하기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press 1996), Verdine, U.S. Patent No. 5,783,384, Kay, et. al., U.S. Patent No. 5,747,334, 및 Kauffman et al., U.S. Patent No. 5,723,323)에 제공된다.
*IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 생체내 및 시험관내 모두에서 사용될 수 있다. 예시로서, IL-17RC의 가용성 형태는 세포 배양 배지에 첨가되어 배양된 세포에 의하여 생성된 IL-17RC 리간드(즉, IL-17F, IL-17A 또는 둘 다)의 효과를 억제할 수 있다.
IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA의 융합 단백질은 상응하는 폴리펩티드를 발현하고 분리하는데 사용될 수 있다. 하기에 설명하는 바와 같이, 특정 IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA 융합 단백질은 또한 진단 및 치료에 사용될 수 있다. 융합 단백질의 한 유형은 재조합 숙주 세포로부터 IL-17RC 폴리펩티드를 안내하는 펩티드를 포함한다. IL-17RC 폴리펩티드를 진핵 숙주 세포의 분비 경로로 안내하기 위하여, 분비성 신호 서열(신호 펩티드, 리더 서열, 전프로 서열, 전 서열이라고도 함)이 IL-17RC 발현 벡터에 제공된다. 분비성 신호 서열은 IL-17RC에서 유래할 수 있는 한편, 적합한 신호 서열은 다른 분비된 단백질에서 유래되거나 새롭게 합성될 수 있다. 분비성 신호 서열은 IL-17RC의 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 두 서열은 정확한 리딩 프레임으로 연결되고, 새롭게 합성된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 안내하도록 위치가 정해진다. 어떤 분비성 신호 서열이든지 관심있는 뉴클레오티드 서열의 어디에도 위치할 수 있지만, 분비성 신호 서열은 통상적으로 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 쪽에 위치한다(예를 들면, 문헌(Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830) 참조).
포유동물 세포에 의해 생성되는 IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA의 분비성 신호 서열(예를 들면, U.S. Patent No. 5,641,655에 설명된 조직-유형 플라스미노겐 활성자 신호 서열)은 재조합 포유동물 숙주에서 상응하는 폴리펩티드의 발현에 유용하지만, 효모 신호 서열은 효모 세포에서의 발현에 바람직하다. 적합한 효모 신호 서열의 예는 (MFα1 유전자에 의하여 코딩된)효모 교배 호르몬 α-인자, (SUC2 유전자에 의하여 코딩된)인버타제, 또는 (PHO5 유전자에 의하여 코딩된)산 포스파타제에서 유래된 것이다. 예를 들면, 문헌(Romanos et al., "Expression of Cloned Genes in Yeast," in DNA Cloning 2:A Practical Approach, 2nd Edition, Glover and Hames (eds.), 페이지 123-167 (Oxford University Press 1995))을 참조.
본 발명의 가용성 수용체 폴리펩티드는 세포외 도메인, 예를 들면 SEQ ID NO:3의 전부 또는 일부, 또는 비-사람 수용체의 대응되는 영역을 함유한 폴리펩티드를 코딩하는 절단된 DNA를 발현시킴으로써 제조될 수 있다. 세포외 도메인 폴리펩티드는 막통과 및 세포내 폴리펩티드 조각이 실질적으로 없는 형태로 제조되는 것이 바람직하다. 숙주 세포로부터 수용체 도메인의 방출을 지시하기 위하여, 수용체 DNA는 t-PA 분비성 펩티드와 같은 분비성 펩티드를 코딩하는 두 번째 DNA 조각에 연결된다. 분비된 수용체 도메인의 정제를 촉진하기 위하여, C-말단 연장, 예를 들면 폴리히스티딘 태그, P 물질, FlagTM 펩티드(Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, (1988); Eastman Kodak Co.(New Haven, CT)에서 구입가능) 또는 다른 폴리펩티드 또는 단백질(예, 항체 또는 다른 특정 결합제)이 수용체 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
다른 접근법으로서, IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/IL-17RA의 수용체 세포외 도메인 또는 그것의 일부는 함께 두 불변 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만 가변 영역이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 전형적으로는 FC 단편과의 융합으로 발현될 수 있다(Sledziewski, AZ et al., US Patent No. 6,018,026 및 5,750,375 참조). 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 이러한 융합을 포함한다. 이러한 융합은 SEQ ID NO:64에 나타난다. 이러한 융합은 전형적으로 Fc 부분이 서로 이황화 결합으로 결합되고 두 수용체 폴리펩티드는 서로에게 매우 근접하게 배열되는 멀티머 분자로 분비된다. 이 유형의 융합체들은, 시험관내 분석 도구로서, 용액으로부터 동족 리간드를 친화력 정제하는 데 사용될 수 있고, 리간드를 특이적으로 적정함으로써 시험관내에서 신호를 차단, 억제 또는 감소시키는 데 사용될 수 있고, 또한 순환하는 리간드와 결합하여 그것을 순환으로부터 제거하기 위해 그것들을 비경구로 투여함으로써 생체내의 길항제로서 사용될 수 있다. 리간드를 정제하기 위하여, IL-17RC, IL-17RA 및 IL-17RC/IL-17RA-Ig 키메라는 수용체-리간드 결합(전형적으로 거의 생리적 온도, pH, 및 이온의 세기)을 촉진하는 조건 하에서 리간드(예를 들면, 세포-조절된 배양 배지 또는 조직 추출물)를 함유한 샘플에 첨가된다. 그 다음 키메라-리간드 복합체는 고체 지지체(예를 들면, 불용성 수지 비드) 상에 고정된 단백질 A를 사용한 혼합물에 의하여 분리된다. 그 다음 리간드를 종래의 화학 기술, 예를 들면 염 또는 pH 구배를 사용하여 용출한다. 대안적으로, 키메라 자체는 상기 결합 및 용출로 고체 지지체에 결합될 수 있다. 키메라는 혈청 아밀로이드 A(SAA), C-반응성 단백질(CRP) 등과 같은 급성기 반응을 포함한 염증성 반응을 조절하기 위하여 생체내에서 사용될 수 있다. 고 결합 친화력을 가진 키메라는 비경구로 투여된다(예를 들면, 근육내, 피하 또는 정맥내 주사). 순환하는 분자는 리간드와 결합하고 정상적인 생리학적 과정에 의하여 순환물로부터 제거된다. 분석에 사용하기 위하여, 키메라는 Fc 영역을 통하여 지지체에 결합되고 ELISA 포맷에 사용된다.
본 발명의 폴리펩티드의 분리를 돕기 위하여, 리간드-결합 수용체(또는 항체, 보체/항-보체 쌍의 한 구성원) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 구입가능한 바이오센서 기구(BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)를 이용한 분석 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 수용체, 항체, 보체/항-보체 쌍의 구성원 또는 단편은 수용체 칩의 표면에 고정된다. 이 기구의 사용은 문헌(Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 및 Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993)에 개시되어 있다. 수용체, 항체, 구성원 또는 단편은, 아민 또는 설프히드릴 화학을 사용하여, 유동 세포 내의 금 필름에 부착된 덱스트란 섬유에 공유결합된다. 시험 샘플은 세포를 통하여 통과된다. 리간드, 에피토프, 또는 보체/항-보체 쌍의 반대 구성원이 샘플에 존재한다면, 배지의 굴절률에 변화를 야기하는 고정된 수용체, 또는 항체 또는 구성원 각각에 결합될 것이며, 이는 금 필름의 표면 플라즈몬 공명의 변화로 검출된다. 이 시스템을 통하여 이로부터 결합 친화력이 계산될 수 있는 on 속도 및 off 속도를 결정하고, 결합의 화학량론을 평가할 수 있다. 대안적으로, 리간드/수용체 결합은 SELDI(TM) 기술(Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA)을 사용하여 분석될 수 있다.
리간드-결합 수용체 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다른 분석 시스템에 사용될 수 있다. 이런 시스템은 결합 친화력의 결정을 위한 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949 참조) 및 열량측정 검사(Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991)를 포함한다.
본 발명은 다양한 다른 폴리펩티드 융합 및 하나 이상의 폴리펩티드 융합을 포함한 관련된 멀티머 단백질을 더 제공한다. 예를 들면, 가용성 IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/IL-17RA 수용체 폴리펩티드는 미국특허 5,155,027 및 5,567,584에 개시된 다이머를 이루는 단백질에 대한 융합으로 제조될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 다이머를 이루는 단백질은 면역글로불린 불변 영역 도메인, 예를 들면 IgGγ1 및 사람 κ경쇄를 포함한다. 본 발명의 면역글로불린-가용성 융합은 유전학적으로 조작된 세포에서 발현되어 다양한 멀티머 IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/IL-17RA 수용체 유사체를 생성할 수 있다. 보조 도메인들은 본 발명의 가용성 폴리펩티드에 융합되어 그것들을 특정 세포, 조직, 또는 거대분자(예를 들면, 콜라겐, 또는 IL-17F 또는 IL-17A를 발현시키는 세포)에 표적화할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인과 같은 두 개 이상의 부분에 융합될 수 있다. 또한 폴리펩티드 융합은 특히 도메인 사이에 하나 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. 문헌(Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996)을 참조하라.
박테리아 세포에서, 독성을 감소시키고, 안정성을 증가시키며, 발현된 단백질의 회수를 증대시키는 융합 단백질로서 이종 단백질을 발현시키는 것이 바람직하다. 예를 들면, IL-17RC(또는 본 발명의 어떤 폴리펩티드)는 글루타티온 S-전이효소 폴리펩티드를 포함한 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 글루타티온 S-전이효소 융합 단백질은 전형적으로 가용성이 있으며, 고정된 글루타티온 칼럼 상에서 대장균 용해물로부터 용이하게 정제가능하다. 유사한 접근법으로서, 말토스 결합 단백질 폴리펩티드를 포함한 IL-17RC 융합 단백질은 아밀로스 수지 칼럼으로 분리될 수 있는 한편, 절단된 단백질 A 유전자의 C-말단 끝을 포함한 융합 단백질은 IgG-세파로스를 사용하여 정제될 수 있다. 박테리아 세포에서 융합 단백질인 이종 폴리펩티드를 발현시키기 위한 확립된 기술은 예를 들면 문헌(Williams et al., "Expression of Foreign Proteins in E. coli Using Plasmid Vectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies", in DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2판, Glover and Hames (Eds.), 페이지 15-58 (Oxford University Press 1995))에 설명된다. 뿐만 아니라, 상업적으로 구입가능한 발현 시스템을 이용할 수 있다. 예를 들어, PINPOINT Xa 단백질 정제 시스템(Promega Corporation; Madison, WI)은, 발현하는 동안 아비딘을 포함한 수지로 비오틴화된 폴리펩티드를 포함한 융합 단백질을 분리하기 위한 방법을 제공한다.
원핵 또는 진핵 세포에 의하여 발현된 이종 폴리펩티드를 분리하는 데 유용한 펩티드 태그는 폴리히스티딘 태그(니켈-킬레이팅 수지에 대하여 치환성을 가진), c-myc 태그, 칼모듈린 결합 단백질(칼모듈린 친화성 크로마토그래피로 분리된), P 물질, RYIRS 태그(항-RYIRS 항체와 결합하는), Glu-Glu 태그, 및 FLAG 태그(항-FLAG 항체와 결합하는)를 포함한다. 예를 들면, 문헌(Luo et al., Arch. Biochem. Biophys. 329:215 (1996), Morganti et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 23:67 (1996), 및 Zheng et al., Gene 186:55 (1997))을 참조. 이러한 펩티드 태그를 코딩하는 핵산 분자는 예를 들면 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)에서 구입가능하다.
다른 형태의 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드 및 두 개 이상의 불변 영역 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만, 가변 영역이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 전형적으로 Fc 단편을 포함한다. 한 예시로서, Chang et al., U.S. Patent No. 5,723,125는 사람 인터페론 및 사람 면역글로불린 Fc 단편을 포함한 융합 단백질을 설명한다. 인터페론의 C-말단은 펩티드 링커 부분에 의하여 Fc 단편의 -말단에 연결된다. 펩티드 링커의 예는 주로 면역학적으로 활성이 없는 T 세포 비활성 서열을 포함한 펩티드이다. 예시되는 펩티드 링커는 아미노산 서열: GGSGG SGGGG SGGGG S (SEQ ID NO:9)을 가진다. 이 융합 단백질에서, 예시적 Fc 부분은 용액에서 안정하고 보체 활성화 활성이 약간 있거나 없는 사람 γ4 사슬이다. 따라서, 본 발명은 IL-17RC 또는 IL-17RC 및 IL-17RA 부분과 사람 Fc 단편을 포함한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 융합 단백질을 고려하는 데, IL-17RC 부분의 C-말단은 SEQ ID NO:2, 5 또는 21의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함한 펩티드와 같이, 펩티드 링커를 통하여 Fc 단편의 N-말단에 부착된다. IL-17RC와 IL-17RA 부분은 모두 세포외 도메인 또는 그것의 어떤 단편일 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 SEQ ID NO:3 및 Fc 단편 (예를 들면, 사람 Fc 단편)(SEQ ID NO:64)를 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질의 다른 예는 변이체 1454(SEQ ID NO:157 및 158)이며, 이것은 인간 IL-17RA의 엑손 1-6 및 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)에 융합된다. 또한, 변이체 1454는 인간 IL-17RA 유래의 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc10, 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
다른 변형에서, 본 발명의 융합 단백질은 IgG 서열, IgG 서열의 아미노말단 끝에 공유 결합된 IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/IL-17RA 부분, 및 IL-17RC 또는 IL-17RA 부분의 아미노말단에 공유결합된 신호 펩티드를 포함하며, IgG 서열은 다음 순서로 구성된다: 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인. 따라서, IgG 서열은 CH1 도메인이 결핍되어 있다. 이들 부분은 IL-17A 및/또는 IL-17F와 결합하는 능력과 같은, 본원에 설명된 생물학적 활성을 나타낸다. 이 항체와 비항체 부분 모두를 포함한 융합 단백질을 생성하는 이 일반 접근법은 문헌(LaRochelle et al., EP 742830 (WO 95/21258))에 설명되었다.
IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 부분 및 Fc 부분을 포함한 융합 단백질은 예를 들면 시험관내 분석 도구로 사용될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 샘플에서 IL-F의 존재는 IL-17RC-면역글로불린 융합 단백질을 사용하여 검출될 수 있고, 여기서 IL-17RC 부분은 리간드와 결합하는 데 사용되고, 단백질 A 또는 항-Fc 항체와 같은 거대분자는 융합 단백질을 고체 지지체에 결합시키는 데 사용된다. 이러한 시스템은 작용제 및 IL-17 패밀리 리간드, 예를 들어 IL-17F 또는 IL-17A와 IL-17F 모두와 이들의 수용체의 결합을 방해하는 길항제를 확인하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 다른 폴리펩티드 융합을 더 제공한다. 예를 들면, 원하는 생물학적 기능(예를 들어, IL-17A와의 결합)을 부여하는 도메인(들)의 일부 또는 전부가 사이토카인 수용체 패밀리(즉, IL-17RA)의 다른 구성원으로부터의 기능적으로 동등한 도메인(들)을 가진 IL-17RC의 일부분에 첨가되어 상이한 분자(즉, IL-17RC/IL-17RA)를 만들어낼 수 있다. 폴리펩티드 융합체는 다양한 이들 융합 유사체를 생성하는 재조합 숙주 세포에서 발현될 수 있다. IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/ IL-17RA 폴리펩티드는 정제를 위한 친화성 태그 및 표적화 도메인과 같은 두 개 이상의 부분 또는 도메인에 융합될 수 있다. 폴리펩티드 융합은 또한 특히 도메인 간에 하나 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. 예를 들면, 문헌(Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1 (1996))을 참조.
융합 단백질은 융합 단백질의 각 성분을 제조하고 그것들을 화학적으로 콘쥬게이션함으로써 당업자에게 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 대안적으로, 적합한 리딩프레임으로 존재하는 융합 단백질의 두 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 공지된 기술을 사용하여 생성되며 본원에 설명된 방법에 의하여 발현될 수 있다. 융합 단백질의 효소적 및 화학적 절단을 위한 일반적 방법은 예를 들면 문헌(Ausubel (1995), 페이지 16-19 내지 16-25)에 설명된다.
IL-17RC 및/또는 IL-17RA 결합 도메인은 리간드 작용제의 후보 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 핵 자기 공명, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성표지와 같은 기술에 의하여 결정된 구조의 물리적 분석으로 더 특성화될 수 있다. 예를 들면, 문헌(de Vos et al., Science 255:306 (1992), Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899 (1992), 및 Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59 (1992))을 참조하라.
본 발명은 또한 화학적 변형된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 조성물을 고려하는데, 여기서 폴리펩티드는 폴리머와 연결된다. 예시적 IL-17RC 또는 IL-17RC/ IL-17RA 폴리펩티드는 기능적 막통과 도메인이 결핍된 가용성 폴리펩티드, 예를 들면 SEQ ID NO:3 또는 21의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드이다. 전형적으로, 폴리머는 수용성이기 때문에, 콘쥬게이트가 생리적 환경과 같은 수용성 환경에서 침전하지 않도록 한다. 적합한 폴리머의 예는 아실화를 위한 활성 에스테르, 또는 알킬화를 위한 알데히드와 같은 단일 반응기를 가지도록 변형된 것이다. 이 방식으로, 중합화의 정도가 제어될 수 있다. 반응성 알데히드의 예는 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 또는 모노(C1-C10) 알콕시, 또는 그것의 아릴옥시 유도체이다(예를 들면, Harris, et al., U.S. Patent No. 5,252,714 참조). 폴리머는 가지가 있을 수 있거나 없을 수 있다. 더욱이 폴리머의 혼합물은 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 콘쥬게이트를 생성하는 데 사용될 수 있다.
치료에 사용된 본 발명의 콘쥬게이트는 약학적으로 허용되는 수용성 폴리머 부분을 포함할 수 있다. 적합한 수용성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 모노메톡시-PEG, 모노-(C1-C10)알콕시-PEG, 아릴옥시-PEG, 폴리-(N-비닐피롤리돈)PEG, 트레실 모노메톡시 PEG, PEG 프로피온알데히드, bis-숙신이미딜 카보네이트 PEG, 프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 코폴리머, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤), 폴리비닐 알코올, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 탄수화물 폴리머를 포함한다. 적합한 PEG는 예를 들면, 5,000, 12,000, 20,000 및 25,000을 포함한 약 600 내지 약 60,000의 분자량을 가질 수 있다. IL-17RC 콘쥬게이트는 또한 이러한 수용성 폴리머의 혼합물을 포함할 수 있다.
IL-17RC 콘쥬게이트의 한 예는 IL-17RC 부분(또는 IL-17RC/IL-17RA 부분) 및 IL-17RC 부분의 N-말단에 부착된 폴리알킬 옥시드 부분을 포함한다. PEG는 적합한 폴리알킬 옥시드이다. 예시로서, IL-17RC(또는 IL-17RC/IL-17RA)는 "PEG화"라고 알려진 과정에 의하여 PEG로 변형될 수 있다. IL-17RC의 PEG화는 당업계에 공지된 PEG화 반응 중 어떤 것에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, EP 0 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan and Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), 및 Francis et al., Int J Hematol 68:1 (1998) 참조). 예를 들면, PEG화는 아실화 반응 또는 반응성 폴리에틸렌 글리콜 분자와의 알킬화 반응에 의하여 수행될 수 있다. 대안적 접근법에서, IL-17RC 콘쥬게이트는 활성화된 PEG를 농축시킴으로서 형성되며, PEG의 말단 히드록시 또는 아미노기는 활성화 링커에 의해 대체되었다(예를 들면, Karasiewicz et al., U.S. Patent No. 5,382,657 참조).
아실화에 의한 PEG화는 전형적으로 PEG의 활성 에스테르 유도체를 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드와 반응시키는 것을 필요로 한다. 활성화된 PEG 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드에 PEG 에스테르화된다. 본원에 설명된 바와 같이, 용어 "아실화"는 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA와 수용성 폴리머 간에 다음 유형의 결합을 포함한다: 아미드, 카바메이트, 우레탄 등. 아실화에 의하여 PEG화된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA를 제조하는 방법은 전형적으로 (a) 하나 이상의 PEG기가 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA에 부착하는 조건 하에 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드를 PEG(예를 들면 PEG의 알데히드 유도체의 반응성 에스테르)와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 것이다. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적의 반응 조건은 공지된 매개변수 및 원하는 결과에 기초하여 결정될 것이다. 예를 들면, PEG:IL-17RC(또는 PEG:IL-17RC/IL-17RA)의 비율이 클 수록, 폴리PEG화된 IL-17RC(또는 IL-17RC/IL-17RA) 생성물의 비율이 더 커진다.
아실화에 의한 PEG화의 생성물은 전형적으로 폴리PEG화된 생성물이고, 리신 ε-아미노기는 아실 연결기를 통하여 PEG화된다. 연결하는 결합의 예는 아미드이다. 일반적으로, 반응 조건에 따라서 더 높은 정도의 PEG화를 가진 일부 종이 형성될 수 있지만, 생성된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA는 적어도 95% 모노-, 디-, 또는 트리-PEG화될 것이다. PEG화된 종은 투석, 초여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 표준 정제 방법을 사용하여 콘쥬게이트되지 않은 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드로부터 분리될 수 있다.
알킬화에 의한 PEG화는 일반적으로 환원제의 존재 하에서 PEG의 말단 알데히드 유도체를 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA와 반응시키는 단계를 포함한다. PEG기는 -CH2-NH기를 통하여 폴리펩티드에 부착될 수 있다.
모노PEG화된 생성물을 생성하기 위해 환원적 알킬화를 이용해 유도체화할 수 있는데, 이는 상이한 유형의 1차 아미노기의 차별적 반응성을 이용한다. 전형적으로, 반응은 리신 잔기의 ε-아미노기와 단백질의 N-말단 잔기의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 이용할 수 있는 pH에서 수행된다. 이러한 선택적 유도체화에 의하여, 단백질에 알데히드와 같은 반응기를 함유한 수용성 폴리머의 부착이 제어된다. 폴리머와의 콘쥬게이션은 리신 측쇄 아미노기와 같은 다른 반응기의 현저한 변형없이 단백질의 N-말단에서 우세하게 발생한다. 본 발명은 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 모노폴리머 콘쥬게이트의 실질적으로 동종인 제제를 제공한다.
모노폴리머 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 콘쥬게이트의 실질적으로 동종인 집단을 생성하는 환원성 알킬화는 (a) IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 아미노 말단에서 α-아미노기의 선택적 변형을 허용하기에 적합한 pH에서 환원성 알킬화 조건 하에 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드를 반응성 PEG와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응성 생성물(들)을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 환원성 알킬화에 사용된 환원제는 수용액에서 안정해야 하고 환원성 알킬화의 초기 과정에서 형성된 Schiff 염기만을 환원시킬 수 있다. 예시적 환원제는 소듐 보로하이드리드, 소듐 시아노보로하이드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란, 및 피리딘 보란을 포함한다.
모노폴리머 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 콘쥬게이트의 실질적 동종 집단의 경우, 환원성 알킬화 반응 조건은 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 N-말단에 수용성 폴리머 부분의 선택적 부착을 허용하는 것이다. 이러한 반응 조건은 일반적으로 리신 아미노기와 N-말단의 α-아미노기 간의 pKa 차이를 제공한다. 대체로, pH가 더 낮은 경우, N-말단 α기의 반응성이 낮을수록, 최적의 조건을 달성하기 위하여 더 많은 폴리머가 필요하기 때문에, 단백질에 대하여 더 초과하는 양의 폴리머가 바람직할 것이다. pH가 더 높은 경우, 많은 반응기가 이용가능하기 때문에 폴리머:IL-17RC(또는 폴리머:IL-17RC/IL-17RA)는 클 필요가 없다. 전형적으로, pH는 3 내지 9, 또는 3 내지 6의 범위 내에 있을 것이다. 이 방법은 IL-17RC 또는 IL-17RC /IL-17RA-포함 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 가용성 수용체 콘쥬게이트를 제조하기 위하여 사용될 수 있다.
고려할 다른 요소는 수용성 폴리머의 분자량이다. 일반적으로, 폴리머의 분자량이 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 폴리머 분자의 수는 적다. PEG화 반응의 경우, 전형적인 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa, 약 5 kDa 내지 약 50 kDa, 또는 12 kDa 내지 약 25 kDa이다. 수용성 폴리머 대 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 몰비는 일반적으로 1:1 내지 100:1의 범위에 있을 것이다. 전형적으로, 수용성 폴리머 대 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 몰비는 폴리PEG화의 경우 1:1 내지 20:1, 그리고 모노PEG화의 경우 1:1 내지 5:1일 것이다.
폴리펩티드 및 수용성 폴리머 부분을 포함한 콘쥬게이트를 생성하기 위한 일반적 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Karasiewicz et al., U.S. Patent No. 5,382,657, Greenwald et al., U.S. Patent No. 5,738, 846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247:434 (1997))을 참조. 이 방법은 IL-17RC-포함 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 가용성 수용체 콘쥬게이트를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 설명된 가용성 수용체 또는 항체와 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한 조성물을 고려한다. 이러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예로는 물, 완충액, 알코올, 프로필렌 글리콜, 마크로골, 참기름, 옥수수 기름 등이 있다.
G) IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 분리
본 발명의 폴리펩티드는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산을 오염시키는 것과 관련하여, 적어도 약 80% 순도, 적어도 약 90% 순도, 적어도 약 95% 순도, 또는 95% 이상, 예를 들면 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도로 정제될 수 있으며, 감염성 물질이나 발열성 물질이 없다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 99.9% 이상의 순도인 약학적으로 순수한 상태로 정제될 수 있다. 어떤 제조에서, 정제된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 특히 동물 기원의 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없다.
분별법 및/또는 종래의 정제 방법은, 천연 공급원(예를 들면, 사람 조직 공급원)으로부터 정제된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 제제, 합성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드, 및 재조합 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 및 재조합 숙주 세포로부터 정제된 융합 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드를 얻는 데 사용될 수 있다. 대체로, 황산암모늄 침전 및 산 또는 카오트로프(chaotrope) 추출이 샘플의 분별에 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기 배제(size exclusion), FPLC 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적합한 크로마토그래피 매질은 유도체화된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 특수 실리카 등을 포함한다. PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 적합하다. 예시적으로, 크로마토그래피 매질은 페닐, 부틸, 또는 옥틸기, 예를 들면 페닐-세파로스 FF(Pharmacia), 토요펄 부틸 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), 옥틸-세파로스 (Pharmacia) 등; 또는 폴리아크릴 수지, 예를 들면 Amberchrom CG 71 (Toso Haas) 등을 포함한다. 적합한 고체 지지체로는 유리 비드, 실리카-기재 수지, 셀룰로스 수지, 아가로스 비드, 교차결합된 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 교차결합된 폴리아크릴아미드 수지 등이 있는데, 이것들이 사용되는 조건 하에서 불용성이다. 이들 지지체는 아미노기, 카르복실기, 설프히드릴기, 히드록실기 및/또는 탄수화물 부분에 의한 단백질의 부착을 허용하는 반응기로 변형될 수 있다.
결합 화학의 예는 시아노겐 브로마이드 활성화, N-히드록시숙신이미드 활성화, 에폭시드 활성화, 설프히드릴 활성화, 히드라지드 활성화, 및 카르보디이미드 결합 화학의 카르복실 및 아미노산 유도체를 포함한다. 이들 및 다른 고체 매질은 주지되어 있고 당업계에서 널리 사용되며 시판품을 구입가능하다. 폴리펩티드 분리 및 정제를 위한 특정 방법의 선택은 일반적인 설계의 문제이고 선택된 지지체의 특성에 의하여 부분적으로 결정된다. 예를 들면, 문헌(Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988), 및 Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press 1996))을 참조.
당업자는 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 분리 및 정제를 추가로 변경할 수 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드는 어떤 특성을 이용함으로써 분리될 수 있다. 예를 들면, 고정된 금속 이온 흡수(IMAC) 크로마토그래피는 폴리히스티딘 태그를 포함한, 히스티딘-풍부 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 겔은 처음에 2가 금속 이온으로 하전되어 킬레이트를 형성한다(Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). 히스티딘-풍부 단백질은 사용된 금속 이온에 따라서 다른 친화성을 가진 이 매트릭스에 흡수될 것이며, 경쟁 용출, pH 낮춤, 또는 강한 킬레이트제의 사용에 의하여 용출될 것이다. 정제의 다른 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 글리코실화된 단백질의 정제를 포함한다(M. Deutscher, (ed.), Meth. Enzymol. 182:529 (1990)). 본 발명의 추가 구체예에서, 정제를 촉진하기 위해, 관심있는 폴리펩티드와 치환성 태그(예를 들면, 말토스-결합 단백질, 면역글로불린 도메인)가 융합하도록 구성될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 리간드-결합 특성은 예를 들면 IL-17F 리간드가 칼럼에 결합되고 IL-17RC-포함 수용체가 결합되며 이어서 표준 크로마토그래피 방법을 사용하여 용출되는 친화성 크로마토그래피를 사용함으로써, 예를 들면 IL-17RC-포함 가용성 수용체의 정제를 위하여 이용될 수 있다.
IL-17RC, IL-17RA 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 또한 전술한 바와 같이 화학 합성을 통하여 제조될 수 있다. 이들 폴리펩티드는 모노머 또는 멀티머일 수 있고, 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있으며, PEG화되거나 PEG화되지 않을 수 있고, 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
*H) IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 단백질에 대한 항체의 생성
예를 들면, IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 발현 벡터의 생성물 또는 항원으로서 천연 공급원으로부터 분리된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA를 사용하여 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA에 대한 항체를 얻을 수 있다. 특히 유용한 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체는 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA과 "특이적으로 결합한다". 항체가 다음 두 가지 특성 중 적어도 하나를 나타내는 경우 항체는 특이적으로 결합하는 것으로 고려된다: (1) 항체가 결합 활성의 역치 수준으로 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA에 결합한다, 그리고 (2) 항체가 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA에 관련된 폴리펩티드와 유의하게 교차반응하지 않는다.
첫 번째 특성과 관련하여, 항체는 이들이 106 M-1 이상, 바람직하게는 107 M-1 이상, 더 바람직하게는 108 M-1 이상, 그리고 가장 바람직하게는 109 M-1 이상의 결합 친화성(Ka)을 가진 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 결합한다면 특이적으로 결합하는 것이다. 항체의 결합 친화성은 예를 들면 Scatchard 분석으로 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660 (1949)). 두 번째 특성과 관련하여, 항체는 그것들이 표준 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 현재 공지된 폴리펩티드를 검출하지 않고 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA을 검출한다면 관련된 폴리펩티드 분자와 유의하게 교차반응하지 않는 것이다. 공지된 관련 폴리펩티드의 예는 공지된 사이토카인 수용체를 포함한다.
항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체는 항원성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 또는 본원에 개시된 다른 아미노산 서열에 함유된 적어도 9, 또는 15 내지 약 30개의 아미노산의 서열 또는 본원에 개시된 다른 아미노산 서열을 함유한다. 그러나, 30 내지 50개의 아미노산 또는 임의의 길이를 함유한 본 발명의 아미노산 서열의 큰 부분 및 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열을 포함한 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA와 결합하는 항체를 유도하는 데 유용하다. 에피토프-보유 펩티드의 아미노산 서열이 수용성 용매에서 실질적 용해도를 제공하도록 선택되는 것이 바람직하다(즉, 서열은 상대적으로 친수성 잔기를 포함하고, 소수성 잔기는 전형적으로 회피하게 된다). 더욱이, 프롤린 잔기를 함유한 아미노산 잔기는 또한 항체 생성에 바람직할 수 있다.
한 예시로서, IL-17RC에서 잠재적 항원성 부위는 LASERGENE의 PROTEAN 프로그램(버젼 3.14)(DNASTAR; Madison, WI)에 의해 실행된 Jameson-Wolf 방법(Jameson and Wolf, CABIOS 4:181, (1988))을 사용하여 확인될 수 있다. 디폴트 매개변수를 이 분석에 사용하였다.
Jameson-Wolf 방법은 단백질 구조 예상을 위하여 6개의 주요 서브루틴을 조합하여 잠재적 항원성 결정기를 예상한다. 간단히 말하면, Hopp-Woods 방법(Hopp et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824 (1981))은 처음에 가장 큰 국부 친수성의 영역을 나타내는 아미노산 서열을 확인하는 데 사용되었다(매개변수: 7 잔기의 평균을 냄). 두 번째 단계에서, Emini의 방법(Emini et al., J. Virology 55:836 (1985))은 표면 확률을 계산하는 데 사용되었다(매개변수: 표면 결정 역치 (0.6)=1). 세번째, Karplus-Schultz 법(Karplus and Schultz, Naturwissenschaften 72:212 (1985))은 백본 사슬 가요성을 예측하는 데 사용되었다(매개변수: 가요성 역치 (0.2) = 1). 분석의 네 번째 및 다섯 번째 단계에서, 2차 구조 예상은 Chou-Fasman의 방법(Chou, "Prediction of Protein Structural Classes from Amino Acid Composition", in Prediction of Protein Structure and the Principles of Protein Conformation, Fasman (ed.), 페이지 549-586 (Plenum Press 1990), 및 Garnier-Robson, Garnier et al., J. Mol. Biol. 120:97 (1978) (Chou-Fasman 매개변수: 형태 표 = 64 단백질; α 영역 역치 = 103; β 영역 역치 = 105; Garnier-Robson 매개변수: α 및 β 결정 상수 = 0))을 사용하여 데이터에 적용되었다. 여섯번째 서브루틴에서, 가요성 파라미터 및 수치요법/용매 접근가능성 인자는 "항원성 지수"라고 지시된 표면 윤곽 값을 결정하기 위하여 조합될 수 있다. 마지막으로, 피크 확대 기능을 항원성 지수에 적용하였는데, 이것은 내부 영역에 관한 표면 영역의 이동성에서 유래된 추가 자유 에너지를 설명하는 각 피크 값의 20, 40, 60, 또는 80%을 추가함으로써 주요 표면 피크를 확대한다. 그러나, 이 계산은 나선 영역이 덜 유연한 경향이 있기 때문에 나선 영역에 있는 어떤 주요 피크에도 적용되지 않았다. Hopp/Woods 친수성 프로파일은 SEQ ID NO:3 내에 가장 큰 항원성 포텐셜을 가진 영역을 결정하는 데 사용될 수 있다(Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci.78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 및 Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). 프로파일은 슬라이딩 6 잔기 윈도우에 기초한다. 감춰진 G, S, 및 T 잔기와 노출된 H, Y, 및 W 잔기는 무시되었다. 더욱이, 예를 들면, DNASTAR Protean 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 Jameson-Wolf 플롯에 의하여 예측된 SEQ ID NO:3 내의 IL-17RC 항원성 에피토프는 바람직한 항원성 에피토프로 작용하며 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 이러한 항원성 에피토프는 (1) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 73에서 아미노산 잔기 82; (2) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 95에서 아미노산 잔기 104; (3) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 111에서 아미노산 잔기 119; (4) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 179에서 아미노산 잔기 186; (5) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 200에서 아미노산 잔기 205; (6) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 229에서 아미노산 잔기 236; (7) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 264에서 아미노산 잔기 268; 및 (8) SEQ ID NO:3의 아미노산 잔기 275에서 아미노산 잔기 281을 포함한다. 본 발명은 IL-17RC에 대한 항체를 생성할 수 있는 항원성 펩티드 X 내지 Y 중 어느 하나의 사용 또는 본 발명의 중화 모노클로날 항체를 스크리닝 또는 확인하기 위한 도구로서의 사용을 고려한다. 또한, 본 발명은 항원성 펩티드 X 내지 Y 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩티드를 고려한다. 본 발명은 IL-17RC에 대한 항체를 생성기 위한 것뿐만 아니라, IL-17F 및 IL-17A(개별적으로 또는 함께)의 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는 항-IL-17RC 단클론성 항체를 확인 및 스크리닝하기 위한 본원에 설명된 어떤 항원성 펩티드 또는 에피토프의 사용을 고려한다.
더욱이, 적합한 항원은 또한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 사이토카인 결합을 포함한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드, 또는 다른 사이토카인 세포외 도메인과 조합된 상기에 개시된 세포외 도메인, 예를 들면 제 I 또는 제 II 사이토카인 수용체 도메인, 예를 들면 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 헤테로다이머 또는 멀티머 폴리펩티드를 형성할 수 있는 것들 등을 포함한다.
재조합 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 단백질 또는 천연 공급원으로부터 분리된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA에 대한 폴리클로날 항체는 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), 페이지 1-5 (Humana Press 1992), 및 Williams et al., Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), 페이지 15(Oxford University Press 1995). IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 면역원성은 명반(수산화알루미늄) 또는 프로인드(Freund) 완전 또는 불완전 보조제와 같은 보조제의 사용을 통하여 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 또는 그것의 부분과 면역글로불린 폴리펩티드 또는 말토스 결합 단백질의 융합과 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 전체길이 분자 또는 그것의 부분일 수 있다. 폴리펩티드 부분이 "합텐-유사"인 경우, 이러한 부분은 면역화를 위하여 거대분자 담체(예를 들면, keyhole limpet hemocyanin(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 파상풍 톡소이드)에 연결되거나 결합될 수 있다.
폴리클로날 항체는 말, 소, 개, 닭, 레트, 마우스, 토끼, 기니 돼지, 염소, 또는 양과 같은 동물에서 생성되지만, 본 발명의 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체는 또한 유인 영장류 항체에서 유래될 수 있다. 개코원숭이에서 진단학적으로 및 치료학적으로 유용한 항체를 생성하기 위한 일반 기술은 예를 들면 문헌 (Goldenberg et al., 국제특허공보 WO91/11465, 및 Losman et al., Int. J. Cancer 46:310 (1990))에서 확인될 수 있다.
대안적으로, 모노클로날 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체를 생성할 수 있다. 특정 항원에 대한 쥐과 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의하여 얻어질 수 있다(예를 들면, Kohler et al., Nature 256:495 (1975), Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, 페이지 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) ["Coligan", Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli", in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), 페이지 93 (Oxford University Press 1995) 참조).
간단히 말하면, 마우스에 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 유전자 생성물을 포함한 조성물을 주사하는 단계, 혈청을 샘플링함으로써 항체의 존재를 입증하는 단계, B 림프구를 얻기 위하여 비장을 얻는 단계, 하이브리도마를 생산하기 위하여 B 림프구를 골수종 세포와 융합하는 단계, 하이브리도마를 클로닝하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하는 단계, 및 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리하는 단계에 의하여 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체는 사람 모노클로날 항체에서 유래될 수 있다. 사람 모노클로날 항체는 항원성 자극에 반응하여 특정 사람 항체를 생성하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 얻어진다. 이 기술에서, 사람 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소는, 내생성 중쇄 및 경쇄 유전자좌가 표적 파괴된 배아 줄기세포주 유래의 마우스 세포주에 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 사람 항원에 특이적인 사람 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 사람 항체-분비 하이브리도마를 생성하는 데 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스에서 사람 항체를 얻기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), 및 Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994))에 설명된다.
다양한 잘 확립된 기술에 의하여 하이브리도마 배양물에서 모노클로날 항체를 분리하고 정제할 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로스 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다(예를 들면, Coligan, 페이지 2.7.1-2.7.12 및 페이지 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, 페이지 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조).
특정한 사용의 경우, 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체의 단편을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체 단편은 예를 들면 항체의 단백질 가수분해에 의하여 얻을 수 있다. 항체 단편은 종래의 방법에 의하여 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의하여 얻을 수 있다. 한 예시로서, 항체 단편은 F(ab')2라고 나타낸 5S 단편을 제공하기 위하여 펩신을 통한 항체의 효소적 절단에 의하여 생성될 수 있다. 이 단편은 3.5SFab' 1가 단편을 생성하는 티올 환원제를 사용하여 더 절단될 수 있다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단으로부터 발생한 설프히드릴기의 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 한 예시로서, 펩신을 이용한 효소적 절단은 두 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다. 이들 방법은 예를 들면 문헌(Goldenberg, U.S. patent No. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230 (1960), Porter, Biochem. J. 73:119 (1959), Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, 페이지 422 (Academic Press 1967), 및 Coligan, 페이지 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4)에 설명된다.
또한, 단편이 무결 항체에 의하여 인식된 항원에 결합하는 한, 1가 경쇄-중쇄 단편을 형성하기 위해 중쇄를 분리, 단편의 추가 절단, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전학적 기술과 같이, 항체를 절단하는 다른 방법이 이용될 수 있다.
예를 들면, Fv 단편은 VH와 VL 사슬의 결합을 포함한다. 이 결합은 문헌(Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659 (1972))에 설명된 바와 같이 비공유 결합일 수 있다. 대안적으로, 가변 사슬은 분자내 이황화 결합에 의하여 결합되거나 글루타르알데히드와 같은 화학물질에 의하여 교차결합될 수 있다(예를 들면, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992)).
Fv 단편은 펩티드 링커에 의하여 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함할 수 있다. 이들 단쇄 항원 결합 단백질(scFv)은 올리고뉴클레오티드에 의하여 연결된 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함한 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터에 삽입되고 이어서 대장균과 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 V 도메인을 가교하는 링커 펩티드를 가진 단일 폴리펩티드를 합성한다. svFv를 생성하기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991) (또한, Bird et al., Science 242:423 (1988), Ladner et al., U.S. Patent No. 4,946,778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993), 및 Sandhu, 상기) 참조))에 설명된다.
한 예시로서, 림프구를 시험관내에서 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드에 노출시키고, 파지 또는 유사한 벡터에서 항체 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써(예를 들면, 고정된 또는 표지된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 단백질 또는 펩티드의 사용을 통하여) scFV를 얻을 수 있다. 잠재적 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 결합 도메인을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 파지(파지 디스플레이) 또는 대장균과 같은 박테리아에 디스플레이된 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 많은 방식으로, 예를 들면, 무작위 돌연변이유발 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성을 통하여 얻을 수 있다. 이들 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들면 리간드 또는 수용체, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 공지된 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크린하는 데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있고(Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409, Ladner et al., U.S. Patent No. 4,946,778, Ladner et al., U.S. Patent No. 5,403,484, Ladner et al., U.S. Patent No. 5,571,698, 및 Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리 및 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 키트는 예를 들면 Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)로부터 구입가능하다. 무작위 펩티드 디스플레이 라이브러리는 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 본원에 개시된 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 서열을 사용하여 스크린될수 있다.
다른 형태의 항체 단편은 단일 상보성-결정 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR 펩티드("최소 인식 단위체")는 관심있는 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 구성함으로써 얻을 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들면 항체-생산 세포의 RNA으로부터 가변 영역을 합성하기 위하여 중합효소 연쇄반응을 이용하여 제조된다(예를 들면, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106 (1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), 페이지 166 (Cambridge University Press 1995), and Ward et al., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), 페이지 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) 참조).
대안적으로, 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체는 "사람화" 모노클로날 항체로부터 유래할 수 있다. 마우스 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변부의 마우스 상보적 결정 영역을 사람 가변 도메인으로 옮김으로써 사람화 모노클로날 항체를 생성한다. 그 다음 사람 항체의 전형적인 잔기는 쥐과 대응물의 골격 영역에서 치환된다. 사람화된 모노클로날 항체에서 유래된 항체 성분의 사용은 쥐과 불변 영역의 면역원성과 연관된 잠재적 문제를 제거한다. 쥐과 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝하기 위한 일반 기술은 예를 들면 문헌(Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989))에 설명된다. 사람화 모노클로날 항체를 생산하기 위한 기술은 예를 들면 문헌(Jones et al., Nature 321:522 (1986), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437 (1992), Singer et al., J. Immun. 150:2844 (1993), Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies", in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), 페이지 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 및 Queen et al., U.S. Patent No. 5,693,762 (1997))에 설명된다.
더욱이, 본 발명의 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체 또는 항체 단편은 당업계의 방법 및 본원에 설명된 방법을 사용하여 PEG화될 수 있다.
폴리클로날 항-이디오타입 항체는 표준 기술을 사용하여 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체 또는 항체 단편을 가진 동물을 면역화함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), 페이지 1-12 (Humana Press 1992)을 참조. 또한, Coligan(페이지 2.4.1-2.4.7)을 참조. 대안적으로, 모노클로날 항-이디오타입 항체는 전술한 기술들을 통하여 면역원인 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체 또는 항체 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 대안으로서, 사람화 항-이디오타입 항체 또는 유인 영장류 항-이디오타입 항체는 전술한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 항-이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법은 예를 들면 문헌(Irie, U.S. Patent No. 5,208,146, Greene, et. al., U.S. Patent No. 5,637,677, 및 Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875 (1996))에 설명된다.
항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체는 검출가능한 표지와 콘쥬게이트되어 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 면역콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 적합한 검출가능한 표지는, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생물발광, 콜로이드 골드를 포함한다. 이러한 검출가능하게 표지된 면역콘쥬게이트의 제조 및 검출 방법은 당업자에게 주지되어 있으며, 하기에 더 상세하게 설명된다.
검출가능한 표지는 자가방사법에 의하여 검출된 방사성동위원소일 수 있다. 본 발명의 목적에 특히 유용한 동위원소는 3H, 125I, 131I, 35S 및 14C이다.
항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 면역콘쥬게이트는 또한 형광 화합물로 표지될 수 있다. 형광으로 표지된 항체의 존재는 면역콘쥬게이트를 적합한 파장에 노출시키고 생성된 형광을 검출함으로써 결정된다. 형광 표지 화합물은 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민을 포함한다.
대안적으로, 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 면역콘쥬게이트는 항체 성분을 화학발광 화합물에 결합시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-태그가 있는 면역콘쥬게이트의 존재는 화학반응의 과정 동안 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 화학발광 표지 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.
유사하게, 생물발광 화합물은 본 발명의 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 면역콘쥬게이트를 표지하는 데 사용될 수 있다. 화학발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율성을 증가시키는 생물학적 시스템에서 확인된 화학발광의 유형이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 표지에 유용한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페라제 및 에쿼린을 포함한다.
대안적으로, 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 면역콘쥬게이트는 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체 성분을 효소에 연결시킴으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 효소 콘쥬게이트가 적합한 기질의 존재 하에 인큐베이션될 때, 효소 부분은 기질과 반응하여 예를 들면 분광광도계, 형광계 또는 시각적 수단에 의하여 검출될 수 있다. 다중특이적 면역콘쥬게이트를 검출가능하게 표지하는 데 사용될 수 있는 효소의 예는 β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 페록시다제 및 알칼린 포스파타제를 포함한다.
당업자라면 본 발명에 따라서 사용될 수 있는 다른 적합한 표지를 알 것이다. 마커 부분을 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체에 결합시키는 것은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이와 관련한 전형적인 방법론은 문헌(Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976), Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977), Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990), Stein et al., Cancer Res. 50:1330 (1990), 및 Coligan, 상기 참조)에 설명된다.
더욱이, 면역화학적 검출의 편리성 및 다용도성은 아비딘, 스트렙토비딘, 및 비오틴과 콘쥬게이트된 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체를 사용함으로써 향상될 수 있다(예를 들면, 문헌(Wilchek et al.(eds.) "Avidin-Biotin Technology", Methods In Enzymology, Vol. 184 (Academic Press 1990), and Bayer et al., "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology", in Methods In Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), 페이지 149-162 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조).
면역분석을 수행하기 위한 방법은 잘 확립되어 있다. 예를 들면, 문헌(Cook and Self, "Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays", in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter and Ladyman (eds.), 페이지 180-208, (Cambridge University Press, 1995), Perry, "The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology", in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch and Lennox (eds.), 페이지 107-120 (Wiley-Liss, Inc. 1995), 및 Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996))을 참조.
본 발명은 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 유전자 발현을 위한 면역학적 진단 분석을 수행하기 위한 키트를 고려한다. 이러한 키트는 항-IL-17RC 또는 IL-17RC/ IL-17RA 항체, 또는 항체 단편을 포함한 적어도 한 용기를 포함한다. 키트는 또한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체 또는 항체 단편의 존재를 지시할 수 있는 하나 이상의 시약을 포함한 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 이러한 지시 시약의 예는 방사성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 효소 표지, 생물발광 표지, 콜로이드 골드 등과 같은 검출가능한 표지를 포함한다. 키트는 또한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 단백질을 검출하기 위하여 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 항체 또는 항체 단편이 사용되는 사용자에게 운반하기 위한 수단을 포함한다. 예를 들면, 명시된 설명서는 동봉된 항체 또는 항체 단편이 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA을 검출하는 데 사용될 수 있다는 것을 진술할 수 있다. 명시된 재료는 직접 용기에 사용될 수 있고, 또는 명시된 재료는 포장된 삽입물의 형태로 제공될 수 있다.
I) 본 발명의 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 치료적 사용
가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 활성을 가진 아미노산 서열은 리간드 IL-17A 및 IL-17F(단독으로 또는 함께)에 결합하여, 이들 리간드와 내인성 IL-17RC 및/또는 IL-17RA 수용체의 결합을 방지함으로써 면역계를 조절하는데 사용될 수 있다. 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA와 같은 이러한 길항제는 또한 IL-17A 및/또는 IL-17F와 내인성 IL-17RC 및/또는 IL-17RA 수용체의 결합을 억제함으로써 면역계를 조절하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이 폴리펩티드의 적합한 양이 결핍되거나, IL-17A 및/또는 IL-17F를 과다하게 생산하는 피험체에게 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 활성을 가진 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드(예를 들면, 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드, IL-17RC 또는 IL-17RA 폴리펩티드 단편, IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 유사체, 및 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 융합 단백질)를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, 가용성 IL-17RC 및/또는 IL-17RC/IL-17RA)는 IL-17A, IL-17F, IL-17RA 또는 IL-17RC를 과다하게 생산하는 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다. 적합한 피험체는 사람과 같은 포유동물을 포함한다. 예를 들면, 이러한 가용성 폴리펩티드는 염증 및 염증성 질환, 예를 들면 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 내독소혈증, IBD, IBS, 대장염, 천식, 동종이식 거부, 면역 매개 신장 질환, 간담도 질환, 다발성 경화증, 아테롬성동맥경화증, 종양 성장의 촉진, 또는 퇴행성 관절 질환 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태의 치료에 있어서, IL-17A 및 IL-17F(단독으로 또는 함께)를 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화하는데 유용하다.
바람직한 구체예에서, 가용성 수용체는 IL-17RC(SEQ ID NO:3)를 포함하며, 생체내에서 IL-17F 및 IL-17A(개별적으로 또는 함께)에 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 및 중화하는 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머이다. 또한 이러한 IL-17RC 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머, 또는 멀티머에 대한 항체 및 결합 폴리펩티드는 IL-17RC 활성의 길항제, 예를 들어 본원에 설명된 IL-17A 및 IL-17F 길항제(단독으로 또는 함께)로 작용한다.
다른 바람직한 구체예에서, 가용성 수용체는 IL-17RC 및 IL-17RA 모두의 일부분을 포함한다. 한 이러한 바람직한 구체예는 IL-17 변이체 1454(SEQ ID NO:157 및 158)이며, 이것은 인간 IL-17RA의 엑손 1-6 및 인간 IL-17RCx1의 엑손 8-16을 포함하고, Fc5(SEQ ID NO:179 및 180)에 융합된다. 또한, 변이체 1454는 인간 IL-17RA로부터 자생 신호 서열을 가진다. 또한, Fc10, 또는 본 분야에 공지된 어떤 등가물이 Fc5를 대신하여 사용될 수 있다.
게다가, 폴리클로날 및 모노클로날 중화 항-IL-17F 항체가 모두 세포 기반 중화 분석에서 IL-17F 및 IL-17A 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화한다는 것은 본원에서 설명되었다. IL-17RC cDNA에 상응하는 mRNA의 조직분포 분석은 mRMA IL-17RC 유전자가 갑상선, 부신, 전립선 및 간 조직에서 강하게 발현되고, 심장, 소장, 위 및 기관 조직에서는 덜 발현되는 것으로 나타났다. 특히, IL-17RC는 단핵세포, B-세포 및 골수양(myeloid) 계통 세포를 포함하는 비-T 세포 말초혈액 셀라인에서 일정하게 발현된다. 또한, IL-17RC mRNA는 피부로부터 유래한 셀라인에서 확실히 발현된다. IL-17RC를 발현하는 다른 셀라인은 어레이에 존재했던 5개의 대장 셀라인 전부이다. 반면에, 뇌, 태반, 폐, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 결장, 말초혈액 백혈구, 척수, 림프절, 및 골수에서는 거의 발현되지 않는다. IL-17RC가 결합하는 리간드(IL-17F 및/또는 IL-17A)는 주로 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 포함하는 염증성 매개인자뿐만 아니라 호중구의 증식, 성숙 및 화학주성에 연루되는 매개인자의 생산을 증진시키는 능력에 기초하여, 염증 반응을 유도하는데 관련되며, 염증 질환에 기여한다.
따라서, 본 발명의 특정 구체예는 염증 및 염증성 질환 또는 상태, 예를 들면 건선, 건선성 관절염, 아토피성 피부염, 염증성 피부상태, 류마티스 관절염, IBD, IBS, 크론씨병, 다발성게실증, 천식, 췌장염, 제1형 당뇨병(IDDM), 췌장암, 그레이브스병, 결장암 및 장암, 자가면역 질환, 패혈증, 기관 또는 골수 이식; 내독소혈증으로 인한 염증, 외상, 수술 또는 감염; 아밀로이드증; 비종; 이식편대숙주병에서; 그리고 염증, 면역 억제, 조혈, 면역, 염증성 또는 림프양 세포, 대식세포, T-세포(Th1 및 Th2 세포를 포함)의 증식의 감소, 병원 또는 항원에 대한 면역반응의 억제의 경우에, 또는 IL-17F 및/또는 IL-17A의 억제가 바람직한 다른 예에서 길항제로서 가용성 IL-17RC 및 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 사용에 관한 것이다.
더욱이, 본원에 설명된 가용성 IL-17RC 및 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 다음에 유용하다:
(1) 급성 염증, 외상의 결과인 염증, 조직 손상, 수술, 패혈증 또는 감염, 및 천식과 같은 만성 염증성 질환, 염증성 장 질환(IBD), IBS, 만성 대장염, 비종, 류마티스 관절염, 재발성 급성 염증성 발장(예를 들면, 결핵), 및 아밀로이드증의 치료, 및 아테롬성 동맥경화증, 거대임파절증식증, 천식, 및 급성 시기 반응의 유도와 연관된 다른 질환의 치료에서 IL-17RA 또는 IL-17RC를 통하여 신호전달을 차단, 억제, 감소, 상쇄 또는 중화시키고,
(2) 면역세포(예를 들면, 림프구, 단핵구, 백혈구)에서 신호전달을 방지 또는 억제하기 위하여 IDDM과 같은 자가면역질환, 다발성경화증(MS), 전신성홍반성루프스(SLE), 중증근무력증, 류마티스 관절염, IBS, 및 IBD의 치료에서 IL-17RA 또는 IL-17RC의 신호화를 차단, 억제, 가소, 상쇄 또는 중화시키는 데 유용하다. 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여, IL-17RC 및/또는 IL-17RA를 통해 신호화를 차단, 억제, 감소 또는 길항하는 것은 또한 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환치료에 도움을 줄 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장암종에 유리할 수 있다. IL-17RC 및/또는 IL-17RA는 본 발명의 길항제가 암 성장을 억제하고 면역-매개된 사멸을 표적으로 하는 암의 MAb 치료를 위한 표적으로 작용할 수 있다(Holliger P, and Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). 또한, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 SLE, IDDM, 제2형 당뇨병(NIDDM), 신종양 및 다른 질환과 연관된 신부전뿐만 아니라 신장병증, 예를 들면 사구체경화증, 막성 신경병증, 아밀로이드증(또한 다른 조직들 중에서 신장에 영향을 미친다), 신장 동맥경화증, 다양한 기원의 사구체신염, 신장의 섬유증식성 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.
(3) IDDM, MS, SLE, 중증근무력증, 류마티스관절염, IBS 및 IBD과 같은 자가면역 질환의 치료에서 IL-17RA 또는 IL-17RC를 통한 신호전달을 어렵게 하고, 향상시키고, 증가시키고, 또는 개시하는데 유용하다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 림프구 또는 다른 면역세포가 분화하고, 증식을 변경하거나, 사이토카인 또는 자가면역을 개선하는 세포 표면 단백질의 생성을 변화시키도록 신호전달할 수 있다. 구체적으로, 사이토카인 분비의 양식을 변경하는 T-헬퍼 세포 반응의 조절은 자가면역 반응을 벗어나게 하여 질환을 개선할 수 있다(Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). 유사하게, 작용성 가용성 폴리펩티드는 천식, 알레르기 및 아토피성 질환과 관련된 면역세포에 신호전달하고, 그것을 고갈시키며, 그것에서 벗어나도록 하는 데 사용될 수 있다. 또한, IL-17RC 및/또는 IL-17RA를 통한 신호전달은 췌장, 신장, 뇌하수체 및 신경 세포의 질환에 이로움을 줄 수 있다. IDDM, NIDDM, 췌장염, 및 췌장 암종은 유익을 얻을 수 있다.
본원에 설명된 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 전술한 자가면역질환, 아토피성 질환, NIDDM, 췌장염 및 신부전의 치료에서 IL-17F 또는 IL-17A의 활성을 단독으로 또는 함께 결합, 차단, 억제, 감소, 상쇄 또는 중화시키는데 사용될 수 있다. IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 가용성 형태는 Th 세포에 의하여 매개된 항체 반응을 촉진하고/하거나 림프구 또는 다른 면역 세포에 의하여 IL-4 또는 다른 사이토카인의 생성을 촉진하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 IL-17A 및/또는 IL-17F의 길항제로서 유용하다. 이러한 길항제 효과는 IL-17A 또는 IL-17F의 직접적 중화 또는 결합에 의하여 달성될 수 있다. 길항제 용도뿐만 아니라, 본 발명의 가용성 수용체는 리간드를 체내의 다른 조직, 기관 및 세포에 운반하기 위하여 IL-17F 또는 IL-17A에 결합하고, 리간드의 담체 단백질로 작용할 수 있다. 그러한 것으로서, 본 발명의 가용성 수용체는 가용성-수용체-리간드 복합체를 조직, 특정 면역세포, 또는 종양과 같은 특정 부위로 인도하는 분자, 폴리펩티드 또는 화학부분에 융합되거나 결합될 수 있다. 예를 들면, 급성 감염 또는 일부 암에서, 이로운 점은 IL-17F의 작용에 의하여 염증 및 국부 급성 시기 반응 단백질의 유도에서 비롯될 수 있다. 따라서, 본 발명의 가용성 수용체는 IL-17A 또는 IL-17F의 작용을 특이적으로 지시하는 데 사용될 수 있다. 문헌(Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; 및 Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000)을 참조.
염증은 칩입자에 저항하는 개체에 의한 방어적 반응이다. 염증은 많은 세포성 및 체액성 매개자가 관련된 단계적인 반응이다. 한편, 염증성 반응의 억제는 숙주를 면역약화시킬 수 있지만, 확인되지 않는 경우, 염증은 만성 염증성 질환(예를 들면, 건선, 관절염, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 등), 패혈성 쇼크 및 복합장기부전을 포함한 중증 합병증을 초래할 수 있다. 중요하게는, 이들 다양한 질환 상태는 공통된 염증성 매개자를 공유한다. 염증을 특징으로 하는 집단적 질환은 사람 치사율 및 사망률에 큰 충격을 줄 수 있다. 따라서, 본 발명의 가용성 수용체와 같은 항-염증성 단백질은 천식 및 알레르기로부터 자가면역 및 패혈성 쇼크에 이르는 광범위한 수의 사람 및 동물 질환의 중대한 치료적 잠재력을 가질 수 있다.
1. 관절염
골관절염, 류마티스 관절염, 상해의 결과인 관절염성 관절 등을 포함한 관절염은 본 발명의 가용성 폴리펩티드와 같은 항-염증성 단백질의 치료적 사용으로부터 이득을 얻는 공통된 염증성 상태이다. 예를 들면, 류마티스 관절염(RA)은 전체 몸에 영향을 미치는 전신성 질환이며 관절염의 가장 흔한 형태 중 하나이다. 이것은 관절을 채우는 막의 염증을 특징으로 하는 데, 이는 통증, 경직, 흥분, 열상 및 종기를 야기한다. 류마티스 관절염의 결과로서, 염증을 일으킨 관절 내용물인 활막은 다른 생리학적 효과 중에서도 관절 퇴화 및 심각한 통증을 야기하면서 뼈와 연골을 공격하고 손상을 줄 수 있다. 관련된 관절은 그 모양과 정렬을 잃을 수 있고 통증 및 움직임의 감소를 야기한다.
류마티스 관절염(RA)은 염증 및 계속된 조직 손상을 특징으로 하는 면역-매개 질환이며, 중증 장애 및 사망률 증가를 야기한다. 다양한 사이토카인이 류마티스 관절에서 국부적으로 생성된다. IL-1 및 TNF-α, 이 두 원형 염증촉진성 사이토카인이 활액 염증 및 진행성 관절 파괴와 관련된 메커니즘에서 중요한 역할을 한다는 것을 많은 연구들이 증명하였다. 실제로, RA가 있는 환자에서 TNF-α 및 IL-1 억제제의 투여는 염증의 임상적 및 생물학적 신호의 급격한 개선과 골침식 및 연골 파괴의 방사성물질에 의한 신호의 감소를 가져왔다. 그러나, 이러한 고무적인 결과에도 불구하고, 상당한 퍼센트의 환자들이 이들 인자에 대하여 반응하지 않는데, 이는 다른 매개자가 또한 관절염의 병리생리학에 관여한다는 것을 시사한다(Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002). 그러한 매개자들 중 하나는 IL-17A 또는 IL-17F일 수 있고, IL-17F 또는 IL-17A 활성을 결합 또는 억제하는 이러한 분자로서, 예를 들면 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 류마티스 관절염 및 다른 관절염 질환에서 염증을 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.
당업계에 공지된 류마티스 관절염에 대한 몇몇 동물 모델이 있다. 예를 들면, 콜라겐-유도된 관절염(CIA) 모델에서, 마우스는 사람 류마티즘성 관절염을 닮은 만성 염증성 관절염을 진행시킨다. CIA는 RA와 유사한 면역학적 및 병리학적 특징을 공유하기 때문에 잠재적 사람 항-염증성 화합물을 스크리닝하기 위한 이상적인 모델이 된다. CIA 모델은 면역 반응 및 염증성 반응에 의존하는 마우스에서 주지된 모델이다. 면역 반응은, 항원으로서 제공되고 항-콜라겐 항체의 생산을 야기하는 콜라겐에 반응한 B 세포와 CD4+ T-세포의 상호작용을 포함한다. 염증 단계는 마우스 천연 콜라겐에 교차반응하고 보체 캐스케이드를 활성화하는 이들 항체들 중 일부의 결과로서, 염증의 매개자로부터의 조직 반응의 결과이다. CIA 모델을 사용하는 장점은 발병의 기본 메커니즘이 공지되어 있다는 점이다. II형 콜라겐에 관련된 T 세포 및 B 세포 에피토프는 동정되었고, 면역 매개 관절염에 관한 다양한 면역학적(예를 들면, 지연형 과민성 및 항-콜라겐 항체) 및 염증성(예를 들면, 사이토카인, 케모카인, 및 매트릭스-분해 효소) 매개변수가 결정되었으며, 따라서 CIA 모델에서 시험 화합물 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다(Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997; 및 Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995).
하나의 그룹은, 항-마우스 IL-17 항체가 대조군 마우스에 비하여 마우스 CIA-모델에서 증상을 감소시키는 것으로 나타났으며, 따라서 본 발명의 가용성 폴리펩티드가 인간의 질환을 치료하는데 유리할 수 있다는 사실을 개념적으로 나타낸다. 마우스-IL-17-특이적 래트 항혈청을 1회 예방적으로 또는 관절염의 증상이 모델에 이미 존재한 후에 투여하였을 때, 동물에서 관절염의 증상을 감소시켰다 (Lubberts et al, Arthritis Rheum. 50:650-9, 2004). 따라서, IL-17RC-Fc 또는 IL-17RC/IL-17RA-Fc는 관절염, 건선, 건선성 관절염, 내독소증, 염증성 장 질환(IBD), IBS, 대장염, 및 본원에 개시된 다른 염증성 상태와 같은 특정한 인간 질환의 치료에서 IL-17A 및/또는 IL-17F를 중화할 수 있다.
이들 CIA 모델에 본 발명의 가용성 폴리펩티드, 예를 들어 IL-17RC-Fc 또는 다른 IL-17RC/IL-17RA의 가용성 및 융합 단백질의 투여는, 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하기 위한 IL-17F 및 IL-17A에 대한 길항제로서의 사용을 평가하는데 사용된다. 더욱이, 본 발명의 가용성 폴리펩티드에 의한 IL-17F 및/또는 IL-17A의 억제 또는 중화를 나타내는 결과는 다른 IL-17A 또는 IL-17F 길항제가 또한 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는데 사용될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. 더욱이, 류마티스 관절염의 병인 및 진행에 연루되는 IL-17A 및/또는 IL-17F가 IL-1β 및 TNF-α의 생산을 유도하므로, 이들 가용성 폴리펩티드의 전신 또는 국소 투여는 RA에서 염증 반응을 잠재적으로 억제할 수 있다. 한정하는 것은 아니지만, 예에 의하면, 마우스당 IL-17RC-Fc의 10-200 μg의 주사(피하, ip 또는 im 경로를 통하여 1주 내지 한정하는 것은 아니지만 4주에 1 내지 7회 투여)는 질환 기록(발 기록, 염증 또는 질환의 발병)을 현저히 감소시킬 수 있다. IL-17RC-Fc 투여의 개시(예를 들면, 콜라겐 면역화의 시기 또는 그 전, 질환이 이미 진행된 시점들을 포함한, 두 번째 콜라겐 면역화를 수반한 임의의 시점)에 따라서, IL-17RC는 그것의 진행을 예방할 뿐만 아니라 류마티스 관절염을 예방하는 데 효과적일 수 있다. 다른 잠재적 치료제는 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 등을 포함한다.
2. 내독소혈증
내독소혈증은 박테리아와 같은 감염성 인자 및 다른 감염성 질환 인자, 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 또는 기회감염에 노출된 면역약화된 환자 등에서 흔히 유래되는 중증 상태이다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드와 같은 치료적으로 유용한 항-염증성 단백질은 사람과 동물에서 내독소혈증을 예방하고 치료하는데 도움을 줄 수 있다. 이들 가용성 폴리펩티드는 내독소혈증에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 유용한 치료제로 작용할 수 있다.
지질다당체(LPS) 유도된 내독소혈증은 감염성 질환에서 병리학적 효과를 발생시키는 많은 염증촉진성 매개자와 연관되고, 쥐과에서 LPS 유도된 내독소혈증은 잠재적 염증촉진제 또는 면역조절제의 약리학적 효과를 연구하기 위하여 널리 사용되며 허용가능한 모델이다. 그람-음성 박테리아에서 생성된 LPS는 패혈성 쇼크의 발병에서 주요 원인 인자이다(Glausner et al., Lancet 338:732, 1991). 실제로 쇼크 유사 상태는 동물에 LPS의 단독 주사에 의하여 실험적으로 유도될 수 있다. LPS에 반응하여 세포에 의하여 생성된 분자는 직접 또는 간접으로 병원균을 표적으로 할 수 있다. 이들 생물학적 반응은 침입하는 병원균에 대항하여 숙주를 보호하지만, 또한 해로움을 야기할 수 있다. 따라서, 중증 그람-음성 박테리아 감염의 결과로서 발생하는 선천성 면역이 대량 자극되면, 사이토카인 및 다른 분자의 초과 생성과 열, 저혈압, 파종성혈관내응고병증, 및 복합장기부전을 특징으로 하는 치명 증후군, 패혈성 쇼크 증후군의 진행을 유도한다(Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000).
LPS의 이들 독성 효과는 대체로 다중 염증성 매개자의 분비를 유도하는 대식세포 활성화와 관련된다. 중화시키는 항-TNF 항체의 투여에 의한 LPS 독성의 예방으로 나타난 바와 같이, 이들 매개자들 중에서 TNF가 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). 대장균 LPS의 1 μg을 C57B1/6 마우스에 주사하면 주사 후 약 2시간내에 순환하는 IL-6, TNF-α, IL-1, 및 급성기 단백질(예를 들면, SAA)이 현저히 증가한다는 것이 잘 확립되어 있다. 이들 매개자에 대한 수동 면역화가 사망률을 감소시킬 수 있으므로, LPS의 독성은 이들 사이토카인에 의하여 매개되는 것처럼 보인다(Beutler et al., Science 229:869, 1985). 패혈성 쇼크의 예방 및/또는 치료를 위한 잠재적 면역개입 전략은 항-TNF mAb, IL-1 수용체 길항제, LIF, IL-10, 및 G-CSF를 포함한다.
이들 LPS-유도 모델에 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 투여는 증상을 개선하고, LPS-유도된 질환의 과정을 변경하기 위한 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA의 사용을 평가하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 이들 가용성 폴리펩티드에 의한 IL-17F 및 IL-17A의 억제결과는, 다른 이러한 길항제가 또한 LPS-유도된 모델에서 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는데 사용될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다. 상기 모델은 LPS 주사에 의한 IL-17F의 유도 및 가용성 폴리펩티드에 의한 질환의 잠재적 치료를 나타낼 것이다. LPS가 내독소혈증의 병리에 기여하는 염증촉진 인자의 생산을 유도하므로, 길항제 가용성 폴리펩티드에 의한 IL-17F 활성 또는 다른 염증촉진 인자의 중화는 내독소성 쇼크에서 나타난 바와 같이 내독소혈증의 증상을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
3. 염증성 장 질환(IBD)
미국에서는 약 500,000명의 사람들이 결장 및 직장(궤양성대장염) 또는 소장 및 대장(크론씨병)에 영향을 미칠 수 있는 염증성 장 질환(IBD)으로 고생한다. 이들 질환의 발병은 명확하지 않지만, 영향을 받은 조직의 만성 염증과 관련된다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 IBD, UC, 및 관련 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.
*궤양성 대장염(UC)은 결장의 점막 또는 최내측의 염증 및 궤양을 특징으로 하는, 흔히 결장으로 불리는 대장의 염증성 질환이다. 이 염증은 결장이 자주 비게 하여 설사를 야기한다. 증상은 대변의 이완 및 연관된 복부 장경련, 열 및 체중 감소를 포함한다. UC의 정확한 원인은 알려지지 않았지만, 최근 연구는 몸의 자연 방어가 몸이 외래물질이라고 생각하는 체내의 단백질에 대하여 작동한다는 것을 제시한다("자가면역 반응"). 아마도 이것들은 장에서의 박테리아 단백질을 닮고 있기 때문에, 이들 단백질은 결장의 안쪽을 파괴하기 시작하는 염증성 과정을 유발하거나 자극할 수 있다. 결장의 안쪽이 파괴될 때, 궤양은 분비성 점액, 고름 및 피를 형성한다. 상기 질환은 대개 직장 영역에서 시작해서 결국 대장 전체에 걸쳐 퍼질 수 있다. 염증의 반복된 발병은 상처 조직을 가진 장과 직장의 벽을 두껍게 한다. 결장 조직의 괴사 또는 패혈증은 중증 질환과 동반하여 발생할 수 있다. 궤양성 대장염의 증상은 심각성이 다양하고 그것의 발병은 점진적이거나 갑작스러울 수 있다. 발병은 호흡기 감염 또는 스트레스를 포함한 많은 인자에 의하여 유발될 수 있다.
현재 사용가능한 UC의 치료제가 없지만, 치료는 결장 내막에서 복부 염증성 과정을 억제하는 것에 초점이 맞추어져 있다. 코르티코스테로이드 면역억제(예를 들면, 아자티오프린, 머캅토퓨린 및 메토트랙세이트) 및 아미노살리시테이트를 포함한 치료는 질환을 치료하는 데 사용가능하다. 그러나, 코르티코스테로이드 및 아자티오프린과 같은 면역억제제를 장기적으로 사용하면, 뼈의 약화, 백내장, 감염, 및 간 및 골수 영향을 포함한 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 당해 치료법이 성공적이지 않은 환자에게는, 수술이 한 선택이다. 수술은 전체 결장 및 직장의 제거를 포함한다.
만성 궤양성 대장염을 부분적으로 모방할 수 있는 몇몇 동물 모델이 있다. 가장 널리 사용되는 모델은 2,4,6-트리니트로벤술폰산/에탄올(TNBS) 유도된 대장염 모델인데, 이들은 결장에서 만성 염증 및 궤양을 유도한다. TNBS가 직장내 점적주입을 통하여 감염되기 쉬운 마우스의 결장에 도입될 때, 그것은 결장 점막에서 T 세포 매개 면역반응을 유도하고, 이 경우에 대장의 전체 벽에 걸쳐서 T 세포 및 대식세포의 밀집 침윤을 특징으로 하는 대량 점막 염증을 야기한다. 더욱이, 이 조직의 병리학적 상황은 진행성 체중 감소(소모성), 피섞인 설사, 직장 탈수, 및 대장벽 비대의 임상학적 상황을 수반한다(Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).
다른 대장염 모델은, 피섞인 설사, 체중감소, 결장의 축소 및 중성구 침윤을 통한 점막 궤양에 의하여 나타난 급성 대장염을 유도하는 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 사용한다. DSS-유도된 대장염은 조직학적으로 림프구 과형성, 병소 잠복 손상, 및 상피 궤양이 있는 고유층(lamina propria)에 염증성 세포를 침투시키는 것을 특징으로 한다. 이들 변화는 DSS가 상피에 미치는 독성 효과, 고유층 세포의 식세포작용 및 TNF-α 및 TNF-γ의 생성에 기인하여 발생하는 것으로 생각된다. 그것의 통상적인 사용에도 불구하고, 사람 질환에 관한 DSS의 메커니즘과 관련된 몇 가지 이슈는 해결되지 않은 채로 남아있다. DSS는 그것이 SCID 마우스와 같은 T 세포-결핍 동물에서 관찰되기 때문에 T 세포-의존적 모델로 간주된다.
이들 TNBS 또는 DSS 모델에 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 투여는, 증상을 개선하고 위장 질환의 과정을 변경하기 위한 이들의 사용을 평가하는데 사용될 수 있다. 더욱이, 이들 가용성 폴리펩티드에 의한 IL-17F 및 IL-17A의 억제 또는 중화를 나타낸 결과는 이들(또는 유사 분자)이 대장염/IBD 모델에서 증상을 개선하고 질환의 과정을 변경하는데 사용될 수 있다는 개념의 증거를 제공한다.
4. 건선
건선은 7 백만 이상의 미국인들에게 영향을 미치는 만성 피부 이상(conditon)이다. 건선은 새 피부 세포가 비정상적으로 자랄 때 발생하는 데, 이것은 오래된 피부가 충분히 빨리 떨어지지 않는 경우 염증이 생기고, 붓고, 비늘 모양의 피부 조각을 야기하게 된다. 가장 흔한 형태인 판상(plaque) 건선은 은백색 비늘로 덮인 염증이 생긴 피부 조각("병터")을 특징으로 한다. 건선은 일부 판상에 한정될 수 있고, 또는 두피, 무릎, 팔꿈치 및 몸통에 가장 흔하게 나타나는, 피부의 보통 내지 광범위한 영역을 포함할 수 있다. 건선은 눈에 잘 띄지만, 전염성 질환은 아니다. 질환의 발병은 영향받은 조직의 만성 염증을 포함한다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 건선, 다른 염증성 피부 질환, 피부 및 점막 알레르기, 및 관련된 질환에서 염증 및 병리학적 효과를 감소시키는 가치있는 치료제로 작용할 수 있다.
건선은 상당한 불편을 야기할 수 있는 피부의 T 세포 매개된 염증성 장애이다. 이것은 치료제가 없고 모든 연령층의 사람들에게 영향을 미치는 질환이다. 건선은 유럽인과 북미 인구의 약 2%에 영향을 미친다. 약한 건선이 있는 개인은 흔히 국소 치료제로 이들 질환을 통제할 수 있지만, 세계 백만 이상의 환자들은 자외선 또는 전신성 면역억제 치료를 필요로 한다. 불행히도, 자외선 방사선의 불편 및 위험성 그리고 많은 치료법의 독성은, 이것들의 장기 사용을 제한한다. 더욱이, 환자들은 대개 건선이 재발하며, 일부 경우에는 면역억제 치료를 멈춘 직후 재발한다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 또한 IL-17F 또는 IL-17A의 순환하는 수준의 검출을 위한 진단 시스템 및 급성기 염증 반응과 연관된 IL-17F 또는 IL-17A의 검출에 사용될 수 있다. 관련된 구체예에서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 순환하는 또는 국소적으로 작용하는 IL-17F 또는 IL-17A 폴리펩티드를 검출하는데 사용될 수 있다. 리간드 또는 수용체 폴리펩티드의 상승된 또는 감소된 수준은, 염증 또는 암을 포함한 병리학적 상태의 지표가 될 수 있다. IL-17F는 관련된 급성기 염증 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 더욱이, IL-17A 또는 IL-17F와 같은 급성기 단백질 또는 분자의 검출은 어떤 질환 상태(예를 들면, 천식, 건선, 류마티스 관절염, 대장염, IBD, IBS)에서 만성 염증성 상태의 지표가 될 수 있다. 이러한 상태의 검출은, 적합한 치료의 선택시 의사를 도와줄 뿐 아니라 질병 진단을 보조해주는 역할을 한다.
본원에 설명된 다른 질환 모델뿐만 아니라, 사람 건선 손상에서 유래된 염증 조직에 대한 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 활성은 중증 합병 면역결핍(SCID) 마우스 모델을 사용하여 생체내에서 측정할 수 있다. 사람 세포가 면역결핍 마우스에 이식된 일부 마우스 모델이 개발되었다(전체적으로 이종이식 모델이라고 언급됨); 예를 들면, 문헌(Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 and Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996)을 참조. 건선에 대한 생체내 이종이식 모델로서, 사람 건선 피부를 SCID 마우스 모델에 이식하고, 적합한 길항제로 시험한다. 더욱이, 당업계에서의 다른 건선 동물 모델을 AGR129 마우스 모델에 이식된 사람 건선 피부 이식체와 같이 IL-17A 및 IL-17F 길항제를 평가하는데 사용할 수 있고, 적합한 길항제로 시험할 수 있다(예를 들면, 본원에 참고문헌으로 포함된 Boyman, O. et al., J. Exp. Med. 온라인 공보 #20031482, 2004 참조). IL-17F 또는 IL-17A 및 IL-17F 모두의 활성을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화시키는 본 발명의 가용성 폴리펩티드가 바람직한 길항제이며, 다른 IL-17A 및 IL-17F 길항제도 이 모델에서 사용될 수 있다. 유사하게, 사람 대장염, IBD, IBS, 관절염, 또는 다른 염증성 손상에서 유래된 조직 또는 세포는, 본원에 설명된 IL-17A 및 IL-17F 길항제의 항-염증성 특성을 평가하기 위하여 SCID 모델에서 사용될 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 사용하여 염증을 제거, 지연, 또는 감소시키도록 고안된 치료법은, 사람 염증 조직(예를 들면, 건선 손상 등)을 보유한 SCID 마우스 또는 본원에 설명된 다른 모델에 투여함으로써 시험할 수 있다. 치료의 효능은 당업계에 주지된 방법을 사용하여 시간에 따라 치료받은 집단 내에서의 증가된 항-염증 효과로 측정되고 통계적으로 평가될 수 있다. 일부 예시적 방법은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 건선 모델에서, 표피 비대, 상부 진피의 염증 세포의 수, 및 부전각화증을 측정하는 것을 포함한다. 이러한 모델은 당업계에 공지되어 있으면 본원에 설명된다. 예를 들어, 문헌(Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M. et al. J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbio.l Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. et al. Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H et al. Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H et al.. J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H et al. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998; 및 Villadsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003)을 참조. 염증은 샘플에 존재하는 염증 또는 손상 세포의 수, IBD의 스코어(체중 감소, 설사, 직장 출혈, 결장 길이), 발 질환 스코어 및 CIA RA 모델에 대한 염증 스코어를 정량하기 위하여 유체세포측정법과 같은 주지된 방법을 사용하여 시간에 따라 모니터될 수 있다. 예를 들면, 이러한 모델에서 시험하기 위한 적합한 치료 전략은, 가용성 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA, 또는 다른 IL-17A 및 IL-17F 길항제(단독으로 또는 함께), 또는 IL-17RC 및/또는 IL-17RA와 상응하는 리간드의 상호작용을 파괴하는 관련된 콘쥬게이트 또는 길항제를 사용한 직접 치료를 포함한다.
건선은 CD4+ 기억 T 세포, 중성구 및 대식세포를 포함한, 과증식 표피 케라틴세포 및 침투성 단핵구 세포와 연관된 만성 염증성 피부 질환이다(Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). 현재 주변의 항원은 질환의 병리를 개시하고 그것에 기여하는 데 중대한 역할을 하는 것으로 믿어진다. 그러나, 건선의 병리를 매개하는 것으로 생각되는 것은, 자기 항원에 대한 내성 상실이다. 수지상 세포 및 CD4+ T 세포는, 병리를 야기하는 면역반응을 매개하는 항원을 제시하고 인식하는데 중요한 역할을 한다고 생각된다. 본 발명자들은 최근에 CD4+CD45RB 전달 모델에 기초한 건선 모델을 개발했다(Davenport et al Internat. Immunopharmacol. 2:653-672). 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 마우스에 투여된다. 질병 스코어(피부손상, 염증성 사이토카인)의 억제는 건선에서 이들 가용성 폴리펩티드의 유효성을 나타낸다.
5. 아토피성 피부염
아토피성 피부염(이하, AD)은 헬퍼 T 세포 서브세트 2(Th2)의 과다활성화된 사이토카인을 특징으로 하는 통상적인 만성 염증성 질환이다. AD의 정확한 병인은 알려지지 않았지만, 과민한 Th2 면역반응, 자가면역, 감염, 알레르겐, 및 유전적 경향을 포함한 복합 인자가 관련되어 있다. 이 질환의 핵심 특징은 건조증(피부의 건조), 소양증(피부의 가려움), 결막염, 염증성 피부 손상, 포도상구균(Staphylococcus aureus) 감염, 상승된 혈액 호산구증다증, 혈청 IgE 및 IgG1의 증가, 및 T 세포, 비만세포, 대식세포 및 호산구 침윤을 통한 만성 피부염을 포함한다. 포도상구균을 통한 콜로니화 또는 감염은 AD를 악화시키고 이 피부 질환의 만성을 지속시키는 것으로 인식되었다.
AD는 천식 및 알레르기성 비염이 있는 환자에게서 종종 발견되며 흔히 알레르기성 질환의 초기 발현이다. 서양 국가의 인구 중 약 20%는 이들 알레르기성 질환으로 고생하며, 선진국에서의 AD의 발병은 알려지지 않은 이유로 발생하고 있다. AD는 전형적으로 유아기에 시작되고 종종 청소년기를 거쳐 성인기에 이르기까지 지속될 수 있다. 현재 AD에 대한 치료는 국부 코르티코스테로이드, 경구 사이클로스포린 A, 비-코르티코스테로이드 면역억제제, 예를 들면 타크로리무스(tacrolimus)(연고 형태의 FK506), 및 인터페론-감마를 포함한다. AD에 대한 다양한 치료에도 불구하고, 많은 환자의 증상은 개선되지 않거나, 그것들은 다른 보다 효과적인 치료제에 대한 검색을 필요로 하는 등 의약에 대한 부작용을 가진다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 아토피성 피부염, 염증성 피부이상, 및 본원에 개시된 다른 염증 이상과 같은 특정 사람 질환의 치료에서 IL-17F 및 IL-17A를 중화시키는 데 사용될 수 있다.
6. 천식
IL-17은 기도에서의 알레르겐-유도 T 세포 활성화 및 호중구 유입에 중요한 역할을 한다. IL-17의 수용체가 기도에서 발현되고(Yao, et al Immunity 3:811 (1995)), 알레르기성 천식에서 IL-17 매개로 호중구가 모이는 현상은, IL-17 자극된 인간 기관지 상피세포(HBEC) 및 인간 기관지 섬유아세포에 의해 생성되는 화학유인물질 IL-8, GRO-α 및 마크로파지 염증성 단백질-2(MIP-2)에 의해 상당히 유도된다(Yao, et al. J Immunol 155:5483 (1995)); Molet, et al. J Allergy CHn Immunol 108:430 (2001)). 또한, IL-17은 HBEC을 자극하여 호중구-활성화 인자인 IL-6을 방출하며 (Fossiez, et al, J Exp Med 183:2593 (1996), and Linden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001)), TNF-α와 상승작용하여 시험관내에서 인간 호중구의 생존을 연장하는 것으로 나타났다(Laan, et al. Eur Respir J 21:387(2003)). 더욱이, IL-17은 전섬유성(profibrotic) 사이토카인, IL-6 및 IL-11과 같은 기도 리모델링과 관련된 사이토카인 및 염증 매개인자 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)의 분비를 증진하는 능력에 의해, 천식에서 염증 반응을 증폭할 수 있다(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)).
임상적 증거는 천식의 급성 중증 악화가 기도에서 호중구의 모집 및 활성화와 관련된다는 것을 나타내며, 따라서 IL-17이 천식에서 상당한 역할을 하는 것 같다. 경증의 천식을 앓는 환자는, 자유로운 가용성 IL-17A 단백질의 국소 농도의 검출가능한 증가를 나타내고(Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430(2001)), 한편 돈사에 노출되어 심한 기도 염증이 유발된 건강한 사람 지원자는, 기관지폐포 공간에서 자유로운 가용성 IL-17A 단백질 농도의 도드라진 증가를 나타낸다(Fossiez, et al, J Exp Med 183:2593 (1996), and Linden, et al. tnt Arch Allergy Immunol 126:179 (2001)). 더욱이, 가래에서 IL-17 수준은 기도 과민성이 증가한 개체와 상관관계가 있었다. Barczyk, et al. Respir Med 97:726 (2003).
기도 과민성 동물 모델에서, 민감화된 마우스에 의해 오브알부민을 만성 흡입시키면, 기관지 호중구와 함께, 기관지 호산구 염증 및 염증이 있는 폐 조직에서의 IL-17 mRNA 발현이 초기 유도되었다. Hellings, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003). 항-IL-17 모노클로날 항체는 기관지 호중구 유입을 강하게 감소시켰지만, 기관지폐포 세척액 및 혈청에서는 IL-5 수준이 상당히 증가했으며, 알레르겐-유도 기관지 호산구 유입이 악화하였는데, 이는 IL-17A가 항원 손상 후 호중구와 호산구 축적의 균형을 결정하는데 관련될 수 있음을 시사한다(Id.).
IL-17 패밀리 구성원 중에서 IL-17F가 IL-17A와 가장 밀접히 관련된다. IL-17F에 의해 매개되는 생물학적 활성은 IL-17A의 것들과 유사하며, IL-17F는 IL-6, IL-8 및 G-CSF의 생성을 자극한다. Hurst, et al. J Immunol 169:443 (2002). IL-17F는 또한 내피세포에서 IL-2, 변형 성장인자(TGF)-β, 및 단핵세포 화학유인물질 단백질(MCP)을 유도한다. Starnes, et al. J Immunol 167:4137(2001). 유사하게, 알레르겐 시험감염은 알레르기성 천식 환자에서 국소 IL-17F를 증가시킬 수 있다. Kawaguchi, et al. J Immunol 167:4430 (2001). 쥐과의 폐에서 IL-17F 유전자를 전달하면 기관기폐포 공간에서 호중구를 증가시키고, 점막에 IL-17F 유전자를 전달하면 Ag-유도 폐 호중구 및 메타콜린에 대한 기도 반응성을 증진시킨다. Oda, et al. Am J Respir Crit Care Med 171:12 (2005).
천식과는 별도로, 몇 가지 만성 염증성 기도질환은, 기도에 호중구가 모이는 것을 특징으로 하며, IL-17이 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 세균성 폐렴 및 낭성섬유종과 같은 호흡기 이상의 병리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Linden, et al. Eur Respir J 15:973 (2000), Ye, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25: 335 (2001), Rahman, et al. Clin Immunol 115:268 (2005)). 항-IL-17A 및/또는 항-IL-17F 치료 분자는 시험관내 염증 모델에서 만성 염증성 기도질환에 효과적인 것으로 증명되었다. 배양된 HBEC 또는 기관지 섬유아세포로부터 IL-17A 및/또는 IL-17F-유도 사이토카인 및 케모케인의 생산을 억제하기 위해, 본 발명의 IL-17RC 가용성 수용체 및 항-인간-IL-17RC 모노클로날 항체 및 중화 항체를 포함하는 이 수용체에 대한 항체와 같은, IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 대한 길항제의 능력은, IL-17A 및/또는 F 자극으로 인한 염증성 매개인자의 생성을 예방하는 데 이러한 길항제의 유효성의 척도로서 사용될 수 있다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드와 같은 길항제를 IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 추가하여 염증성 매개인자의 생성 및 발현을 현저히 감소시킨다면, 만성 기도 염증과 관련된 염증 양태에 효과적일 것으로 예상될 것이다.
7. 자극과민성 장 증후군("IBS")
자극과민성 장 증후군은 비정상적인 통증 또는 불편함 및 변덕스러운 장 습관을 특징으로 하는 질환이다. IBS 환자는 장 습관에 기초하여 세 개의 주요 그룹으로 특징지어질 수 있다: 주로 설사 또는 빈번한 변통 그룹, 주로 단단한 변 또는 드문 변통 그룹, 및 가변적인 또는 정상적인 변통 그룹(Talley et al., 2002). 변화된 장 운동성, 상피기능의 비정상성, 변통 및 가스의 비정상적인 수송, 및 스트레스가 증상에 기여할 수 있으며, 대부분의 환자에서 내장 과민성이 중요한 특징이다. 구심성 신호의 중추 과정에서 통증-신호 및 교란에 영향을 미치는 유전적 요인들이 특이적 환경에 노출 후 IBS에 대해 개체에 소인을 만드는 것이 자명하다. 또한, 연구들은 결장에서의 염증 반응이 평활근 및 장 신경의 민감성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 장 내의 감각-발동 기능을 혼란시킬 수 있다는 것을 증명했다(Collins et al., 2001). IBS(irritable Bowel Syndrome)와 IBD(inflammatory bowel disease)는 임상적으로 중복되는데, IBS-유사 증상이 IBD의 진단 전에 환자에게 자주 보고되며, IBD가 완화된 상태의 환자에서 예상에 비해 더 많이 IBS 증상이 발견된다. 따라서, 이들 상태는 예상된 빈도에 비해 더 많이 공존할 수 있으며, 또는 연속하여 존재할 수도 있고, 이 경우에는 IBS와 IBD가 동일한 스펙트럼의 상이한 종말을 가진다. 그러나, 대부분의 IBS 환자에서 결장 생검 견본은 정상인 것으로 나타남에 유의해야 한다. 그렇지만, IBS는 매우 많은 수의 사람들이 앓고 있다(미국에서는 2000년에 약 1600만 명의 사람에서 유발했으며, 그 결과 17억 달러(2000년)의 총 비용부담이 있었다. 따라서, 가장 유행성이며 비용이 드는 위장관 질환 및 장애 중에서 IBS는 위식도역류병(GERD)에 이어서 두번째이다. 그러나, GERD와는 달리, IBS의 치료는 아직 만족스럽지 않은 상태이며(Talley et al., 2002; Farhadi et al., 21001; Collins et al., 2001), 따라서 IBS는 충분한 의료적 해결책이 필요함은 자명하다.
정상적인 항상성의 중추(심리적) 또는 말초(조직자극, 염증, 감염)적 교란을 위해, 중추신경계(CNS) 또는 소화관에서의 신경, 면역 또는 신경면역 회로의 반응성이 증진된 수렴성 질환 모델이 제안되었다(Talley et al, 2002). 이런 증진된 반응성은 위 운동성, 상피기능(면역, 투과성), 및 내장 과민성의 불규칙성을 가져오며, 이것은 차례로 IBS 증상을 가져온다.
신경세포를 자극하는 분자 및 염증 과정 개시에 연루되는 것들의 역할을 포함하여, 많은 상이한 분자들이 IBS의 병리학에서 역할을 할 수 있다. IL-17D, IL-17B 및 IL-31을 포함하여, 많은 분자들이 신경세포에 의해 직접 발현 또는 신경세포 상의 수용체의 발현으로 인해 신경세포에 대한 가능한 활성과 관련된다고 알려져 있다. 더욱이, IL-17A, IL-17F, IL-23 및 IL-31을 포함하여, IL-17 패밀리의 많은 구성원 및 관련된 분자들이 소화관에서의 염증과 관련되었다.
동물 질환 모델에서 이들 분자의 억제제의 효과를 생체내 시험할 수 있다. IBS의 중요한 특징을 의태하고 중추 표적 자극(스트레스) 또는 주변 표적 자극(감염, 염증)을 수반하는 몇몇 동물 모델이 제안되었다. IBS의 치료에서 억제제의 유효성을 측정하는데 사용될 수 있는 생체내 동물 모델의 두 예로서 (i) IBS(스트레스 모델)의 1차 CNS-관련 병리학에 초점을 맞춘 모델, 및 (ii) 스트레스(즉, 소화관 염증, 감염 또는 물리적 스트레스)의 소화관-관련 유도인자에 초점을 맞춘 모델이 있다. 그러나, CNS 또는 위장(GI)관에서의 사건이 분리되어 일어날 수 있으며, IBS의 증상이 대부분 GI상의 CNS로부터 신호들이 복합적인 상호작용을 하는 것에 기인하는 것일 수 있으며, 그 반대의 경우도 성립할 수 있다.
J) 제약 제제
약학적 사용을 위하여, 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 종래의 방법에 따라서 비경구, 특히 정맥내 또는 피하 전달용으로 제조된다. 정맥내 투여는 예를 들면 미니-펌프 또는 다른 적합한 기술을 사용하여 볼루스 주사, 제어 방출, 또는 한 시간 내지 몇 시간의 일반적인 기간 동안에 걸친 주입에 의하여 이루어질 것이다. 대체로, 약학적 제형은 식염수, 완충 식염수, 수중의 5% 덱스트로스 등과 같은 약학적으로 허용되는 비히클과 조합하여 조혈 단백질을 포함할 것이다. 제형은 바이알 표면 등에 단백질 손실을 방지하기 위하여 하나 이상의 첨가제, 보존제, 용해제, 완충제, 알부민을 더 포함할 수 있다. 이러한 조합 치료를 이용할 때, 사이토카인은 단일 제형으로 조합되거나 별개의 제형으로 투여될 수 있다. 제형의 방법은 예를 들면 본원에 참고문헌으로 포함된 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990)에 공지되어 있다. 치료적 투여량은 일반적으로 치료받는 상태의 성질 및 중증상태, 환자의 특징 등을 고려하여 허용되는 표준에 따라서 의사에 의하여 결정된 정확한 투여량으로 하루에 환자 체중 kg당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 하루에 0.5-20 mg의 범위가 될 것이다. 투여량의 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 단백질은 통상적으로 화학치료 또는 골수 이식 후 28일의 기간 동안, 또는 >20,000/mm3, 바람직하게는 >50,000/mm3 의 혈소판 수가 얻어질 때까지 투여될 것이다. 더 통상적으로는, 단백질은 1 주일 미만으로, 종종 1 내지 3일의 기간 동안 투여될 것이다. 대체로, 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 치료적 유효량은 림프구 또는 골수 전구 세포의 증식 및/또는 분화가 임상학적으로 현저히 증가하는데 충분한 양이며, 이는 성숙한 세포(예를 들면, 혈소판 또는 중성구)의 순환하는 수준의 증가로 발현될 것이다. 따라서 혈소판 장애의 치료는 적어도 20,000/mm3, 바람직하게는 50,000/mm3의 혈소판 수에 도달할 때까지 계속될 것이다. 또한 본 발명의 가용성 폴리펩티드는 IL-3, IL-6 및 IL-11; 줄기세포 인자; 에리트로포이에틴; G-CSF 및 GM-CSF와 같은 다른 사이토카인과 조합하여 투여될 수 있다. 조합 치료의 양생법 내에서, 다른 사이토카인의 일일 투여량은 일반적으로: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 1g/kg; IL-3, 1-5 1g/kg; 및 G-CSF, 1-25 1g/kg이 될 것이다. 예를 들면, EPO의 조합 치료는 저 EPO 수준을 가진 빈혈 환자에서 제안된다.
일반적으로, 투여되는 가용성 폴리펩티드의 투여량은 환자의 연령, 체중, 키, 성, 일반적 의료 상태 및 이전 의료기록과 같은 인자에 따라서 다양할 것이다. 또한 상황에 따라서 더 낮거나 더 높은 투여량이 투여될 수는 있지만, 일반적으로 약 1 pg/kg 내지 10 mg/kg(제제의 양/환자의 체중)의 범위에서 이러한 가용성 폴리펩티드의 투여량을 수용자에게 제공하는 것이 바람직하다.
피험체에게 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 투여하는 것은, 국소적 카테터를 통한 관류에 의하여, 또는 직접적 병변내 주입에 의하여 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흉막내, 수막강내일 수 있다. 주사에 의하여 치료 단백질을 투여할 때, 투여는 연속적 관류에 의하거나 단일 또는 다중 볼루스에 의할 수 있다.
투여의 추가적 경로는 경구, 점막, 폐 및 경피를 포함한다. 경구 전달은 폴리에스테르 미소구체, 제인(zein) 미소구체, 프로티노이드 미소구체, 폴리시아노아크릴레이트 미소구체, 및 지질-기재 시스템에 적합하다(예를 들면, DiBase and Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 255-288 (Plenum Press 1997)) 참조). 비강내 전달의 실행가능성은 인슐린 투여의 형식에 의하여 예시된다(예를 들면, Hinchcliffe and Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). 가용성 IL-17RC 또는 항-IL-17RC 항체를 포함한 건조한 입자 또는 액체 입자는 제조되어 건조-분말 분산제, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기의 도움으로 흡입될 수 있다(예를 들면, Pettit and Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). 이 접근법으로서, 에어로졸화된 인슐린을 폐에 전달하는 휴대용 전자흡입기인 AERX 당뇨병 관리시스템을 예시할 수 있다. 연구들은 48,000 kDa의 단백질이 저진동수 초음파의 도움으로 치료 농도로 피부를 통하여 전달되었으며, 이는 경피 투여의 실행가능성을 설명해준다는 것을 보여주었다(Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). 일렉트로포레이션을 사용한 경피 전달은 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 투여하는 다른 수단을 제공한다(Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지된 방법에 따라서 제조될 수 있으며, 치료 단백질은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합되어 조합된다. 조성물은 수용 환자가 그것의 투여를 견딜 수 있다면 "약제학적으로 허용되는 담체"라고 불린다. 멸균 인산염-완충된 식염수는 약제학적으로 허용되는 담체의 한 예이다. 다른 적합한 담체는 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995))을 참조.
치료 목적을 위해서, 본 발명의 가용성 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체는 치료적 유효량으로 환자에게 투여된다. 본 발명의 치료 분자와 약학적으로 허용되는 담체의 조합은 투여되는 양이 생리학적으로 유의하다면 "치료적 유효량"으로 투여된다고 말한다. 제제는 그것의 존재가 수용 환자의 생리상태의 검출가능한 변화를 가져온다면 생리학적으로 유의하다. 예를 들면, 염증을 치료하기 위하여 사용된 제제는 그것의 존재가 염증성 반응을 경감시킨다면 생리학적으로 유의하다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함한 약학적 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 액체 형태는 주사가능한 용액 및 경구 현탁액으로 설명된다. 예시적 고체 형태는 캡슐, 정제 및 제어된 방출 형태를 포함한다. 후자 형태로서, 미니삼투압 펌프 및 이식을 예로 들 수 있다(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 93-117 (Plenum Press 1997)).
리포좀은 정맥내, 복강내, 수막강내, 근육내, 피하 또는 경구 투여, 흡입 또는 비강내 투여를 통하여 피험체에게 치료 폴리펩티드를 전달하는 한 수단을 제공한다. 리포좀은 수용성 구획을 둘러싼 하나 이상의 지질이중막으로 구성된 초소형 비히클이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), and Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 3-24 (CRC Press 1995) 참조). 리포좀은 조성면에서 세포막과 유사하여 결과적으로 리포좀은 안전하게 투여될 수 있고 생분해성이 있다. 제조 방법에 따라서, 리포좀은 단일층 또는 다층일 수 있으며, 리포좀은 직경 크기 0.02 um부터 10 um이상까지의 범위로 다양할 수 있다. 다양한 제제가 리포좀에 캡슐화되는데, 소수성 제제는 이중층에 분배되고 친수성 제제는 내부 수용성 공간(들) 내에 분배된다(예를 들면, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), and Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989) 참조). 더욱이, 리포좀의 전하 및 표면 특성뿐만 아니라 리포좀 크기, 이중층의 수, 지질 조성을 다양하게 함으로써 캡슐에 싸인 제제의 치료적 이용가능성을 조절하는 것이 가능하다.
리포좀은 실질적으로 어떤 유형의 세포라도 흡수할 수 있고, 그 다음 캡슐화된 제제를 천천히 방출할 수 있다. 또는, 흡수된 리포좀은 탐식성(phagocytic) 세포에 의하여 엔도시토시스(endocytosis)될 수 있다. 엔도시토시스는 리포좀 지질의 리소좀내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출을 수반한다(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 전형적으로 소 리포좀(0.1 내지 1.0 um)은 원칙적으로 간과 비장에 위치한 세망내피계(reticuloendothelial system)의 세포에 의하여 흡수되는 반면, 3.0 um 보다 큰 리포좀은 폐에 위치한다.
세망내피계는 리포좀 입자의 큰 투여량으로의 포화, 또는 약리학적 수단에 의한 선택적 대식세포 비활성화를 포함한 몇 가지 방법에 의하여 포위될 수 있다(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). 뿐만 아니라, 당지질- 또는 폴리에텔렌 글리콜-유도체화된 인지질을 리포좀막에 혼입하면, 세망내피계에 의한 흡수가 현저히 감소하는 것으로 나타났다(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
리포좀은 또한 인지질 성분을 다양하게 함으로써 또는 수용체 또는 리간드를 리포좀에 삽입함으로써 특정 세포 또는 기관을 표적으로 하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 고 함량의 비이온성 계면활성제로 제조된 리포좀은 간을 표적으로 하는 데 사용되었다(Hayakawa et al., 일본특허 04-244,018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). 이들 제형은 메탄올에 콩 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화된 수소화 캐스터 오일(HCO-60)을 혼합하고, 진공 하에서 혼합물을 농축시키고, 그 후 혼합물을 물과 재구성함으로써 제조되었다. 콩-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG) 및 콜레스테롤(Ch)을 가진 디팔리토일포스파티딜콜린(DPPC)의 리포좀 제형은 또한 간을 표적으로 하는 것으로 나타났다(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
대안적으로, 다양한 표적화 리간드는 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 운송 단백질과 같은 리포좀의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 간 세포의 표면상에 배타적으로 발현되는 아시알로당단백질(갈락토스)을 표적으로 하는 분지형 갈락토실지질로 변형될 수 있다(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). 유사하게, 문헌(Wu et al., Hepatology 27:772 (1998))은, 리포좀을 아시알로페투인(asialofetuin)으로 표지하는 것은 리포좀 혈장 수명을 단축시키고 간세포에 의한 아시알로페투인-표지된 리포좀의 흡수를 크게 향상시켰다는 것을 나타냈다. 한편, 분지형 갈락토실지질 유도체를 포함한 리포좀의 간 축적은 아시알로페투인의 사전주사에 의하여 억제될 수 있다(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). 폴리아코니틸화된 사람 혈청 알부민 리포좀은 간 세포에 리포좀을 표적화하기 위한 다른 접근법을 제공한다(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). 더욱이, Geho, et al. U.S. Patent No. 4,603,044는 간의 특성화된 대사 세포와 연관된 간담도(hepatobiliary) 수용체에 대한 특이성을 가진 간세포-유도 리포좀 비히클 전달 시스템을 설명한다.
조직 표적화에 대한 더 일반적인 접근법에서, 표적 세포는 표적 세포에 의하여 발현된 리간드에 특이적인 비오틴화된 항체로 사전표지된다(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). 자유 항체를 혈장에서 제거 후, 스트렙타비딘-콘쥬게이트된 리포좀을 투여한다. 다른 접근법에서, 표적화 항체는 리포좀에 직접 부착된다(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
폴리펩티드 및 항체는 단백질 마이크로캐슐화의 표준 기술을 사용하여 리포좀 내에 캐슐로 싸일 수 있다(를 들면, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990), 및 Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", in Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), 페이지 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987) 참조). 상기에 기록한 바와 같이, 치료적으로 유용한 리포좀은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
분해가능한 폴리머 미소구체는 치료 단백질의 고 전신 수준을 유지하도록 고안되었다. 미소구체는 분해가능한 폴리머, 예를 들면 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 생분해불가능한 에틸비닐 아세테이트 폴리머로부터 제조되는데, 이들 단백질은 폴리머에 트랩된다(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅된 나노스피어는 또한 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공할 수 있다(예를 들면, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997) 참조).
본 발명은 또한 IL-17A 및/또는 IL-17F 결합 활성을 갖는 화학적으로 변형된 폴리펩티드, 예를 들어 IL-17RC 또는 IL-17RC/IL-17RA 모노머, 호모다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 가용성 수용체를 고려하며, 이 폴리펩티드는 상기 논의된 대로 폴리머와 링크된다.
다른 투여 형태는 예를 들면 문헌(Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5판 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판 (Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996))에 나타난 바와 같이 당업자에 의하여 고안될 수 있다.
한 예시로서, 약학적 조성물은 본 발명의 가용성 폴리펩티드 중 하나를 포함하는 용기를 포함하는 키트로 제공될 수 있다. 치료 폴리펩티드는 단일 또는 다중 투여를 위한 주사가능한 용액의 형태로, 또는 주사하기 전에 재구성될 멸균 분말로 제공될 수 있다. 대안적으로, 이러한 키트는 치료 폴리펩티드의 투여를 위한 건조-분말 분산제, 액체 에어로졸 발생기, 또는 분무기를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 약학적 조성물의 지시사항 및 사용에 관한 명시된 정보를 더 포함할 수 있다. 또한, 이러한 정보는 조성물이 IL-17RC 또는 IL-17RA에 대하여 알려진 과민성이 있는 환자에게 금지된다는 선언을 포함할 수 있다.
본 발명의 가용성 폴리펩티드를 포함한 약학적 조성물은 액체 형태, 에어로졸, 또는 고체 형태로 제공될 수 있다. 액체 형태는 주사가능한 용액, 에어로졸, 액적, 위상 용액(topological solution) 및 경구 현탁액으로 예시된다. 예시적 고체 형태는 캡슐, 정제, 및 제어된 방출 형태를 포함한다. 후자는 미니삼투 펌프 및 이식에 의하여 설명된다(Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 93-117 (Plenum Press 1997)) 다른 고체 형태는 크림, 연고, 다른 위상 외용약 등을 포함한다.
리포좀은 치료 폴리펩티드를 피험체에 정맥내, 복강내, 수막강내, 근육내, 피하로, 또는 경구 투여, 흡입, 또는 비강내 투여를 통하여 전달하는 수단을 제공한다. 리포좀은 수용성 구획을 둘러싼 하나 이상의 지질 이중층으로 구성된 초소형 소포이다(일반적으로, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), and Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 3-24 (CRC Press 1995) 참조). 리포좀은 조성면에서 세포막과 유사하여 결과적으로 안전하게 투여될 수 있고 생분해가능하다. 제조방법에 따라서, 리포좀은 단일층 또는 다층일 수 있으며, 리포좀은 직경 크기 0.02 um부터 10 um이상까지의 범위로 다양할 수 있다. 다양한 제제가 리포좀에 캡슐화되는데, 소수성 제제는 이중층에 분배되고 친수성 제제는 내부 수용성 공간(들) 내에 분배된다(예를 들면, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), 및 Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989) 참조). 더욱이, 리포좀의 전하 및 표면 특성뿐만 아니라 리포좀 크기, 이중층의 수, 지질 조성을 다양하게 함으로써 캡슐에 싸인 제제의 치료적 이용가능성을 조절하는 것이 가능하다.
리포좀은 실질적으로 어떤 유형의 세포라도 흡수할 수 있고 그 다음 캡슐화된 제제를 천천히 방출할 수 있다. 대안적으로, 흡수된 리포좀은 탐식성 세포에 의하여 흡수될 수 있다. 엔도시토시스는 리포좀 지질의 리소좀내 분해 및 캡슐화된 제제의 방출을 수반한다(Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446:368 (1985)). 정맥내 투여 후, 전형적으로 소 리포좀(0.1 내지 1.0 um)은 원칙적으로 간과 비장에 위치한 세망내피계의 세포에 의하여 흡수되는 반면, 3.0 um 보다 큰 리포좀은 폐에 위치한다. 세망내피계의 세포에 의한 더 작은 리포좀의 이러한 우선적 흡수는 화학치료제를 대식세포 및 간의 종양에 전달하는 데 사용되었다.
세망내피계는 리포좀 입자의 큰 투여량으로의 포화, 또는 약리학적 수단에 의한 선택적 대식세포 비활성화를 포함한 몇 가지 방법에 의하여 포위될 수 있다(Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). 뿐만 아니라, 당지질- 또는 폴리에텔렌 글리콜-유도체화된 인지질을 리포좀막에 혼입하면, 세망내피계에 의한 흡수가 현저히 감소되는 것으로 나타났다(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
리포좀은 또한 인지질 성분을 다양하게 함으로써 또는 수용체 또는 리간드를 리포좀에 삽입함으로써 특정 세포 또는 기관을 표적으로 하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 고 함량의 비이온성 계면활성제로 제조된 리포좀은 간을 표적으로 하는 데 사용되었다(Hayakawa et al., 일본특허 04-244,018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). 이들 제형은 메탄올에 콩 포스파티딜콜린, α-토코페롤, 및 에톡실화된 수소화 캐스터 오일(HCO-60)을 혼합하고, 진공 하에서 혼합물을 농축시키고, 그 후 혼합물을 물과 재구성함으로써 제조되었다. 콩-유래 스테릴글루코시드 혼합물(SG) 및 콜레스테롤(Ch)을 가진 디팔리토일포스파티딜콜린(DPPC)의 리포좀 제형은 또한 간을 표적으로 하는 것으로 나타났다(Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).
대안적으로, 다양한 표적화 리간드는 항체, 항체 단편, 탄수화물, 비타민, 및 운송 단백질과 같은 리포좀의 표면에 결합될 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 간 세포의 표면상에 배타적으로 발현되는 아시알로당단백질(갈락토스)을 표적으로 하는 분지형 갈락토실지질로 변형될 수 있다(Kato and Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). 유사하게, 문헌(Wu et al., Hepatology 27:772 (1998))은 리포좀을 아시알로페투인으로 표지하는 것은 리포좀 혈장 수명을 단축시키고 간세포에 의한 아시알로페투인-표지된 리포좀의 흡수를 크게 향상시켰다는 것을 나타냈다. 한편, 분지형 갈락토실지질 유도체를 포함한 리포좀의 간 축적은 아시알로페투인의 사전주사에 의하여 억제될 수 있다(Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). 폴리아코니틸화된 사람 혈청 알부민 리포좀은 간 세포에 리포좀을 표적화하기 위한 다른 접근법을 제공한다(Kamps et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). 더욱이, Geho, et al. U.S. Patent No. 4,603,044는 간의 특성화된 대사 세포와 연관된 간담도 수용체에 대한 특이성을 가진 간세포-유도 리포좀 비히클 전달 시스템을 설명한다.
조직 표적화에 대한 더 일반적인 접근법에서, 표적 세포는 표적 세포에 의하여 발현된 리간드에 특이적인 비오틴화된 항체로 사전표지된다(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). 자유 항체를 혈장에서 제거 후, 스트렙타비딘-콘쥬게이트된 리포좀을 투여한다. 다른 접근법에서, 표적화 항체는 리포좀에 직접 부착된다(Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)).
본 발명의 가용성 폴리펩티드는 단백질 마이크로캐슐화의 표준 기술을 사용하여 리포좀 내에 캐슐로 싸일 수 있다(예를 들면, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990), 및 Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies", in Liposome Technology, 2판, Vol. III, Gregoriadis (ed.), 페이지 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987) 참조). 상기에 기록한 바와 같이, 치료적으로 유용한 리포좀은 다양한 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 리포좀은 폴리(에틸렌 글리콜)의 지질 유도체를 포함할 수 있다(Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).
분해가능한 폴리머 미소구체는 치료 단백질의 고 전신수준을 유지하도록 고안되었다. 미소구체는 분해가능한 폴리머, 예를 들면 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG), 폴리무수물, 폴리(오르토 에스테르), 생분해불가능한 에틸비닐 아세테이트 폴리머로부터 제조되는데, 이들 단백질은 폴리머에 트랩된다(Gombotz and Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery", in Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), 페이지 51-93 (CRC Press 1995); Roskos and Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery", in Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), 페이지 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney and Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-코팅된 나노스피어는 또한 치료 단백질의 정맥내 투여를 위한 담체를 제공할 수 있다(예를 들면, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997) 참조).
다른 투여 형태는 예를 들면 문헌(Ansel and Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5판 (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19판 (Mack Publishing Company 1995), 및 Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996))에 나타난 바와 같이 당업자에 의하여 고안될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 조성물, 및 본원에 설명된 동일한 폴리펩티드를 포함하는 방법 및 약학적 사용을 고려한다. 이러한 조성물은 담체를 더 포함할 수 있다. 담체는 종래의 유기 또는 무기 담체일 수 있다. 담체의 예는 물, 완충액, 알코올, 프로필렌 글리콜, 마크로골(macrogol), 참기름, 옥수수 기름 등을 포함한다.
K) 형질전환 마우스의 생산
형질전환 마우스는 모든 조직에서 또는 조직-특이적 또는 조직-선호성 조절 인자의 통제 하에 IL-17F, IL-17A, IL-17RA 또는 IL-17RC 유전자를 과다발현하도록 조작될 수 있다. 이들 과다생성물은 과달발현으로부터 유래된 표현형을 특성화하는 데 사용될 수 있으며, 형질전환 동물은 초과 IL-17F, IL-17A, IL-17RA 또는 IL-17RC에 의하여 야기된 사람 질환의 모델로 작용할 있다. 또한 이들 중 어떤 것을 과다발현하는 형질전환 동물은, 더 큰 동물의 젖 또는 혈액에서 본 발명의 가용성 폴리펩티드 중 어느 것과 같이, IL-17RA 또는 IL-17RC의 생산을 위한 모델 생반응기를 제공한다. 형질전환 마우스를 생산하기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다(예를 들면, Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), 페이지 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), Monastersky and Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press 1995), 및 Abbud and Nilson, "Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice", in Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez and Hoeffler (eds.), 페이지 367-397 (Academic Press, Inc. 1999) 참조).
예를 들면, IL-17RC 유전자를 발현하는 형질전환 마우스를 생산하기 위한 방법은 성체 가임성 수컷(studs)(B6C3f1, 2-8 개월의 연령 (Taconic Farms, Germantown, NY)), 정관절제한 수컷(duds)(B6D2f1, 2-8 개월, (Taconic Farms)), 사춘기전 번식용 암컷(공여체)(B6C3f1, 4-5 주, (Taconic Farms)) 및 성체 번식용 암컷(수용체)(B6D2f1, 2-4 개월, (Taconic Farms))로 시작할 수 있다. 공여체를 1 주일 동안 순응시키고, 그 다음 약 8 IU/마우스의 임마 혈청성 성선자극호르몬(Sigma Chemical Company; St. Louis, MO)으로 I.P. 주사하고, 46-47 시간 후, 과배란을 유도하기 위하여 8 IU/마우스의 사람 융모성 성선자극호르몬(hCG (Sigma))으로 I.P. 주사하였다. 호르몬 주사에 이어서 공여체를 번식용 마우스와 교배한다. 배란은 일반적으로 hCG 주사후 13 시간 내에 일어난다. 교미는 교배 후 아침에 질전의 존재로 확인된다.
수정된 에그를 수술용 스코프 아래서 수집한다. 수란관을 수집하고, 히알루로니다제(Sigma)를 함유한 뇨분석 슬라이드로 에그를 방출한다. 에그를 히알루로니다제에서 1 회, 37℃에서 5% CO2, 5% O2, 및 90% N2로 인큐베이션된 Whitten's W640 배지(예를 들면, 문헌(Menino and O'Claray, Biol. Reprod. 77:159 (1986), 및 Dienhart and Downs, Zygote 4:129 (1996))에 설명)에서 2회 세척한다. 그 다음 미량주사할 때까지 에그를 37℃/5% CO2 인큐베이터에 보관한다.
IL-17RC 코딩 서열을 함유한 플라스미드 DNA의 10 내지 20 마이크로그램을 선형화하고, 겔-정제하여, 미세주사를 위해 ul당 5-10 ng의 최종 농도로 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.25 mM EDTA (pH 8.0)에서 재현탁하였다. 예를 들면, IL-17RC 코딩 서열은 SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 21에서 452를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
플라스미드 DNA를, 따뜻하고 CO2-평형된 미네랄 오일로 덮여진 W640 배지의 액적(drop)에 함유된 에그에 미세주사한다. DNA를 주사 바늘에 취하여(0.75mm ID, 1mm OD 붕규산염 유리 모세관으로부터 빨아들임) 각 에그에 주사한다. 각 에그를 주사 바늘로 반수체 전핵(haploid pronuclei)의 하나 또는 두 개에 꽂는다.
피코리터의 DNA를 전핵에 주사하고, 주사 바늘을 인(nucleoid)과 접촉하지 않도록 뺀다. 이 과정을 모든 에그에 주사될 때까지 반복한다. 성공적으로 미세주사된 에그를 37℃/5% CO2 인큐베이터에 밤새 보관하기 위하여 사전에 기체로 채워진 W640 배지가 있는 기관 조직-배양 접시에 옮긴다.
그 다음날, 2 세포 배아를 가임신 수용체에 전달한다. 수용체를 정관절제수술한 더드(dud)와 교미시킨 후 질전(copulation plug)의 존재로 확인한다. 수용체를 마취시키고 등 좌측면을 면도하여 수술 현미경에 옮긴다. 피부에 그리고 근육벽을 통하여 흉곽, 등살 및 다리와 비장의 중간인 뒷다리로 윤곽이 그려진 복부의 중간에 작은 절개를 한다. 생식기관을 작은 수술 드레이프에 내놓는다. 지방체를 수술 드레이프에 펼치고, 아기 세레핀(Roboz, Rockville, MD)을 지방체에 부착시켜 마우스의 등에 달려있도록 남겨놓아 기관이 뒤로 미끄러지는 것을 방지한다.
W640과 기체 방울을 교환한 후 미네랄 오일을 함유한 미세 전달 피펫으로, 전일 주사로부터의 12-17개의 건강한 2 세포 배아를 수용체에 전달한다. 부풀어오른 직장팽대를 위치시키고, 직장팽대와 포낭 사이의 수란관을 잡고 수란관에 직장팽대 또는 포낭을 찢지 않도록 조심하면서 포낭 가까이에 28g 주사로 수란관에 틈을 만든다.
피펫을 수란관의 틈새로 옮기고, 배아를 불어 첫 번째 공기 방울이 피펫을 빠져나가게 한다. 지방체를 복막에 부드럽게 밀어 넣고 생식기관이 안에 미끄러져 들어가게 한다. 복막벽을 봉합하고 피부를 상처 클립으로 차단한다. 마우스를 최소한 4 시간 동안 37℃ 슬라이드 온열기에서 회복시킨다.
수용체를 쌍으로 우리에 되돌려와 19-21일 회태기간을 가진다. 출산 후, 위닝하기 전에 산후 19-21일을 허용한다. 젖뗀 새끼를 성적으로 흥분시켜 분리된 교배 우리에 넣고, 0.5 cm 생검(유전자형판단을 위해 사용됨)을 청결한 가위로 꼬리에서 잘라낸다.
예를 들면 제조업체의 지시에 따라 Qiagen Dneasy 키트를 사용하여 잘라낸 꼬리 조각에서 유전체 DNA를 준비한다. IL-17RC 유전자 또는 동일한 플라스미드에 도입된 선택가능한 마커 유전자를 증폭하기 위하여 설계된 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 유전체 DNA를 분석한다. 동물이 형질전환되었음을 확인한 후에, 그것들을 형질전환 암컷을 야생형 수컷과 또는 형질전환 수컷을 하나 이상의 야생형 암컷(들)과 놓음으로써 내교배주와 역교배시킨다. 새끼를 출산하고 젖 땐 후, 성별을 구별하고, 유전자형판단을 위해 그것들의 꼬리를 자른다.
*살아있는 동물에서 형질전환유전자의 발현을 확인하기 위하여, 부분적 간절제를 수행한다. 지포이드 프로세스 아래 상부 복부를 직접 수술 프렙한다. 멸균 기술을 사용하여, 흉골 아래에서 작은 1.5-2cm 절개를 하고, 간의 좌측엽을 몸밖으로 내놓는다. 4-0 실크를 사용하여, 체강 바깥에 그것을 보호하는 아래쪽 엽 주변에 끈을 만든다. 흡수가능한 Dexon(American Cyanamid; Wayne, N.J.)의 두 번째 루프를 첫 번째 끈 가까이에 위치하는 동안 비외상성 클램프를 끈을 붙잡는 데 사용한다. Dexon 끈에서 말단을 잘라내어 절제된 간 조직을 멸균 페트리디쉬에 놓는다. 절제된 간 조각을 14 ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브에 옮겨 액체 질소에 즉시 동결시키고, 그 다음 드라이 아이스에 저장한다. 수술 부위를 봉합 및 상처 클립으로 차단하고, 동물 우리를 수술 후 24 시간 동안 37℃ 가열 패드에 놓는다. 동물을 수술 후 매일 확인하고, 수술 후 7-10일에 상처 클립을 제거한다. IL-17RC mRNA의 발현 수준을 RNA 용액 혼성화 또는 중합효소 연쇄반응을 사용하여 각 형질전환 마우스에 대하여 조사한다
IL-17F, IL-17A, IL-17RA 또는 IL-17RC를 과발현하는 형질전환 마우스를 생산하는 것뿐만 아니라, 이들 유전자 중 어떤 것을 비정상적으로 낮게 발현하거나 발현하지 않는 형질전환 마우스를 조작하는 것이 유용하다. 이러한 형질전환 마우스는 IL-17F, IL-17A, IL-17RA 또는 IL-17RA의 결핍과 연관된 질환을 위한 유용한 모델을 제공한다. 상기에 논의한 바와 같이, IL-17RC 유전자 발현은 안티센스 유전자, 리보자임 유전자, 또는 외부 안내 서열 유전자를 사용하여 억제될 수 있다. IL-17C 유전자를 하향 발현시키는 형질전환 마우스를 생산하기 위하여, 이러한 억제성 서열은 IL-17RC mRNA를 표적으로 한다. 특정 유전자의 비정상적으로 낮은 발현을 가진 형질전환 마우스를 생산하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, Wu et al., "Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies", in Methods in Gene Biotechnology, 페이지 205-224 (CRC Press 1997)).
IL-17RC 유전자를 약간 발현하거나 아무것도 발현하지 않는 형질전환 마우스를 생산하는 대안적 접근법은, 비기능성 IL-17RC 유전자에 의하여 대체된 하나 이상의 정상적인 IL-17RC 대립유전자를 가진 마우스를 생산하는 것이다. 비기능성 IL-17RC 유전자를 설계하는 한 가지 방법은, IL-17RC을 코딩하는 핵산 분자 내에 선택가능한 마커 유전자와 같은 다른 유전자를 삽입하는 것이다. 소위 이러한 "넉아웃 마우스"를 생산하기 위한 표준 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Jacob, "Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice", in Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), 페이지 111-124 (Academic Press, Ltd. 1994), 및 Wu et al., "New Strategies for Gene Knockout", in Methods in Gene Biotechnology, 페이지 339-365 (CRC Press 1997) 참조).
본 발명을 하기 비제한적인 실시예에 의하여 더 설명한다.
실시예 1
IL-17RC 유전자의 발현
인간 다중 조직 블롯(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA)을 사용하여 노던 분석을 수행했다. 겔 정제된 PCR 산물로부터 2개의 프로브를 생성하였다. ZC21798(5' CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3'; SEQ ID NO:8) 및 ZC21808(5' TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3'; SEQ ID NO:31)을 프라이머로 사용하여 제 1 프로브를 만들었다. Amersham(Arlington Heights, IL)의 Multiprime 표지화 키트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 프로브를 방사성 표지했다. NucTrap 푸시 칼럼(Stratagene, La Jolla, CA)을 사용하여 프로프를 정제했다. 노던 블롯을 위한 예비-혼성화 및 혼성화 용액으로서 ExpressHyb(Clontech) 용액을 사용하였다. 65℃에서 하룻밤 동안 혼성화를 일으켰다. 혼성화 후, 블롯들을 0.1% SDS 및 SSC를 함유한 용액 중에서 다음과 같이 각각 30분간 세척했다: 실온에서 2×SSC 중에서 2회, 50℃에서 0.1×SSC 중에서 3회, 55℃에서 0.1×SSC 중에서 1회, 그리고 65℃에서 0.1×SSC에서 1회. 그 결과, 갑상선, 부신, 전립선, 및 간 조직에서는 IL-17RC 유전자가 강하게 발현되고, 심장, 소장, 위, 및 기관 조직에서는 약하게 발현됨이 증명되었다. 반면에, 뇌, 태반, 폐, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 고환, 난소, 결장, 말초혈액 백혈구, 척수, 림프절 및 골수에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않았다.
실시예 2
PCR을 이용한 셀라인 패널에서의 mRNA 분포
제조자의 사용법에 따라 Qiagen(Valencia, CA) RNeasy 키트를 사용하여, 또는 산-페놀 정제 프로토콜(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 1987, 162:156-9)에 따라, 자체 성장시킨 휴지기 셀라인 및 자극시킨 셀라인으로부터전체 RNA를 정제했다. Agilent Bioanalyzer에 알리쿼트(aliquot)를 러닝시켜 RNA의 질을 평가했다. RNA가 상당히 분해된 경우에는 제 1 가닥 cDNA를 만드는데 사용 하지 않았다. 유전자간 게놈 DNA의 단일 부위를 증폭하는 프라이머인
zc41011 (5' CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3'; SEQ ID NO:32) 및
zc41012 (5' CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3'; SEQ ID NO:33)
를 가지고 RNA의 알리쿼트를 PCR 분석하여, 오염된 게놈 DNA가 존재하는지 평가했다. 오염된 게놈 DNA 분석을 위한 PCR 조건은 다음과 같았다: 2.5㎕ 1O× 버퍼 및 0.5㎕ Advantage 2 cDNA 중합효소 믹스(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2ul 2.5mM dNTP 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA), 2.5㎕ 1O× Rediload(Invitrogen, Carlsbad, CA), 및 0.5㎕ 2OuM zc41011 및 zc41012, 최종 부피 25ul. 순환주기 파라미터는 94℃ 20", 94℃ 20"의 40 사이클, 60℃ 1'2O" 및 72℃ 7'의 1 사이클이었다. 각 반응물 10ul을 아가로스 겔 전기영동하고, 오염된 게놈 DNA로부터의 PCR 산물이 존재하는지에 대해 겔을 시험했다. 만일 오염된 게놈 DNA가 관찰되었다면, DNA-프리 시약(Ambion, Inc, Austin, TX)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 전체 RNA를 DNase 처리한 다음, 상기 설명된 대로 다시 시험하였다. 오염된 게놈 DNA가 없는 것으로 나타난 RNA만을 제 1 가닥 cDNA를 만드는데 사용하였다.
82개 인간 셀라인 유래의 전체 RNA 20㎍을 각각 물로 98㎕로 만든 다음, 각각 전체 RNA 10㎍을 함유하는 2개의 49㎕ 알리쿼트로 나누어 2개의 96-웰 PCR 플레이트에 놓았다. 각 알리쿼트에 제 1 가닥 cDNA 합성을 위한 시약(Invitrogen 제 1 가닥 cDNA 합성 시스템, Carlsbad, CA)으로서, 20㎕ 25mM MgCl2, 1Oul 1O× RT 버 퍼, 1Oul 0.1M DTT, 2㎕ 올리고 dT, 2ul RNAseOut을 첨가했다. 다음에, 각 셀라인으로부터의 1개의 알리쿼트에 2㎕ Superscript II 역전사효소를 첨가하고, 대응 셀라인 알리쿼트에는 2㎕ 물을 첨가하여 마이너스 역전사효소 음성 대조표준을 만들었다. 모든 시료를 다음과 같이 인큐베이션했다: 25℃ 10', 42℃ 50', 70℃ 15'. 시료를 딥웰 플레이트에 배치하고 물로 1.7ml로 희석했다. Multipette(Saigan) 로봇을 이용하여 여러 번 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 16.5㎕ 알리쿼트씩을 나누어 넣어 셀라인의 다수의 1회용 PCR 패널을 만든 후, 이것을 밀봉하고 -20℃에 저장했다. 이들 패널에서 각 웰은 대략 100ng 전체 RNA로부터의 제 1 가닥 cDNA를 나타낸다. 82개 셀라인은 2개의 패널에 산포되며, 어레이 #118A 및 #118B이다. 폭넓게 발현되나 발현량이 중간정도인 2개의 유전자 CLTC(클라트린, clathrin) 및 TFRC(트랜스페린 수용체 C)에 대한 프라이머를 사용하여 한 세트의 패널에 대해 멀티플렉스 PCR 분석을 함으로써, 패널 상의 제 1 가닥 cDNA의 질을 평가했다.
클라트린(clathrin) 프라이머
zc42901(5' CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG 3'; SEQ ID NO:34),
zc42902(5' TAGAAGCCACCTGAACACAAATCTG 3'; SEQ ID NO:35), 및
TFRC 프라이머
zc42599(5' ATCTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT 3'; SEQ ID NO:36),
zc42600(5' TTCTCCACCAGGTAAACAAGTCTAC 3'; SEQ ID NO:37) 각각 0.5ul씩을 2.5㎕ 1O× 버퍼 및 0.5㎕ Advantage 2 cDNA 중합효소 믹스(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2㎕ 2.5mM dNTP 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA), 2.5㎕ 1O× Rediload (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 혼합하고, 어레이 #118A 및 어레이 #118B의 패널의 각 웰에 첨가했다. 순환주기 파라미터는 다음과 같았다: 94℃ 20", 94℃ 20"의 35사이클, 67℃ 80", 그리고 72℃ 7'의 1사이클. 각 반응물 10㎕를 아가로스 겔 전기영동하고, 각 셀라인에 대해 +RT 웰에 특이적인 각 유전자에 대한 확실한 PCR 산물이 존재하는지에 대해 겔을 점수화했다.
IL-17RC에 대해 인간 제 1 가닥 cDNA 패널에서 mRNA의 발현을,
센스 올리고 ZC42756(5' ctctccaggcccaagtcgtgctct 3'; SEQ ID NO:38) 및
안티센스 올리고 ZC42757(5' ttgtcctgggggcctcgtgtctcc 3'; SEQ ID NO:39)
를 가지고 다음의 샘플당 PCR 조건하에서 PCR에 의해 분석하였다: 2.5㎕ 1O× 버퍼 및 0.5㎕ Advantage 2 cDNA 중합효소 믹스(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2㎕ 2.5mM dNTP 믹스(Applied Biosystems, Foster City, CA), 2.5ul 1O× Rediload(Invitrogen, Carlsbad, CA), 및 0.5㎕ 2OuM의 각 센스 및 안티센스 프라이머. 순환주기 조건은 94℃ 2', 94℃ 1' 35 사이클, 66℃ 30", 72℃ 1.5', 그리고 72℃ 7' 1 사이클. 각 반응물 10㎕를 아가로스 겔 전기영동하고, IL-17RC의 양성 또는 음성 발현에 대해 겔을 점수화하였다.
IL-17RC mRNA는 광범위한 조직 및 세포 타입의 많은 셀라인들에서 광범하게 발현된다. 특히, IL-17RC은 단핵세포, B-세포 및 골수양 계통 세포를 포함하는 비-T 세포 말초혈액 셀라인에서 상시 발현된다. 또한, IL-17RC mRNA는 피부로부터 유래한 셀라인에서 확실히 발현된다. IL-17RC를 발현하는 다른 셀라인은 어레이 상에 존재했던 대장 셀라인 5개 전부였다.
실시예 3
RT PCT을 이용한 마우스 셀라인 패널에서의 mRNA 분포
제조자의 사용법에 따라 Qiagen(Valencia, CA) RNeasy 키트를 사용하거나, 산-페놀 정제 프로토콜(Chomczynski and Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:156-9, 1987)을 사용하거나, 또는 트리아졸 시약 프로토콜(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여, 자체 성장시킨 60개의 휴지기 셀라인 및 자극시킨 셀라인으로부터 전체 RNA를 정제했다.
각 셀라인으로부터의 전체 RNA 5㎍을 딥웰 96-웰 플레이트에 배치하고, 125㎕ 3M NaOAc와 1OO㎕ Pellet Paint(Novagen, Madison, WI)를 각 웰에 첨가한 다음, 물로 최종 부피를 1.25ml로 조정했다. Multipette(Saigan) 로봇을 사용하여 여러 번 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 RNA 혼합물 25㎕ 알리쿼트와 EtOH 75ul를 차례로 나누어 넣어 셀라인의 다수의 1회용 RT PCR 패널을 만든 후, 이것을 밀봉하고 -20℃에 저장했다. 먼저 Qiagen(Valencia, CA) 96-웰 원심분리기에서 10' 동안 6000 rpm으로 패널을 원심분리하여 RT PCT 스크리닝을 수행했다. 흡수지 위에서 플레이트를 뒤집어서 상청액을 제거했다. RNA 펠릿을 100㎕ 70% EtOH로 세척한 다음, 5' 동안 6000rpm에서 더 원심분리했다. 상청액을 다시 제거하고, 남은 EtOH가 증발될 때까지 플레이트를 공기 건조시켰다. RNA 펠릿을 15㎕ 물에 다시 현탁했다.
마우스 셀라인 RNA 패널에서 IL-17RC mRNA의 발현을
zc38910(5' acgaagcccaggtaccagaaagag 3'; SEQ ED NO:40) 및
zc38679(5' aaaagcgccgcagccaagagtagg 3'; SEQ ID NO:41)
를 가지고 다음의 샘플당 RT PCR 조건하에서 RT PCR에 의해 분석하였다: 백금 택 키트를 사용한 Superscript 1-단계 PCR, Invitrogen, Carlsbad, CA. 순환주기 조건은 48℃ 30분, 94℃ 2분 1 사이클, 이어서 94℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 1.5분 35 사이클, 이어서 72℃ 7분 1 사이클. 각 반응물 10㎕를 아가로스 겔 전기영동하고, IL-17RC의 양성 또는 음성 발현에 대해 겔을 점수화했다.
뮤린 IL-17RC mRNA는 몇몇 마우스 셀라인에서 발현되며, 골모세포를 포함하는 골수, 지방세포, 및 췌관세포 셀라인으로부터 유래한 셀라인에서 두드러지게 발현된다. 또한, 마우스 IL-17RC mRNA는 췌장 기질 셀라인, 췌장 섬 셀라인, 및 시상하부와 같은 내분비 시스템, 침샘, 및 고환 셀라인으로부터의 몇몇 샘플에서 나타난다.
실시예 4
E. coli 에서 생산된 pIL-17F의 리폴딩(refolding) 및 정제
A) pIL-17F의 함입체(inclusion body) 분리 및 추출
배치 발효기 또는 쉐이커 플라스크 배양기에서 단백질 발현을 유도한 후, E. coli 육즙을 1 리터 병에 담아 Sorvall 진동 버킷 회전자에서 3000rpm으로 원심분리한다. 상청액이 투명해질 때까지 200mM NaCl 및 5mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스 pH 8.0으로 세포 페이스트를 세척하여 육즙 오염물을 제거한다.
다음에, 세포 펠릿을 얼음 냉각한 용해 버퍼(50mM 트리스 pH 8.0; 5mM EDTA; 200mM NaCl, 10% 수크로오스(w/v); 5mM DTT; 5mM 벤자미딘) 중에 600nm에서 10-20 옵티컬 밀도(OD) 단위까지 현탁한다. 다음에, 이 슬러리를 냉장된 APV 2000 Lab 균질화기에서 8500-9000 psi로 3회 통과시켜 세포 용해물을 파쇄한다. 4℃에서 1시간 동안 20,000×G로 세포 용해물을 원심분리하여 불용성 분획(함입체)를 회수한다.
20,000×G 스핀으로 인해 생긴 함입체 펠릿을 칭량한 다음, 함입체 그램당 10ml 세척 버퍼로 세척 버퍼(200mM NaCl, 5mM EDTA, 5mM DTT, 5mM 벤자미딘을 함유하는 50mM 트리스 pH 8) 중에 다시 현탁한다. OMNI 국제규격 회전자 고정자 발전기를 사용하여 균질화하여 완전 분산물을 얻는다. 이 현탁액을 4℃에서 30분 동안 20,000×G로 원심분리한다. 상청액이 투명해질 때까지 세척 사이클을 3-5회 반복한다.
최종 세척된 펠릿을 0.1M 아황산나트륨 및 0.02M 나트륨 테트라티오네이트를 함유하는 40mM 트리스 버퍼 pH 8 중의 7M 구아니딘 HCl 중에 용해한다. 하룻밤 동안 4℃에서 부드럽게 교반하여 추출 및 술피톨리시스(sulfitolysis) 반응을 진행시킨다. 얻어진 연분홍색 용액을 4℃에서 1시간 동안 35,000×g로 원심분리하고, 가용성 pIL-17F를 함유하는 투명한 상청액을 0.45um 필터로 여과한다.
B) pIL-17F 리폴딩 과정
55mM MES, 10.56mM NaCl, 0.44mM KCl, 0.055% PEG(3400K), 1.1mM EDTA, 20% 글리세롤, 0.5M 구아니딘 HCl, 0.75M 아르기닌 및 1:1 비율의 글루타티온 산화환원 쌍(1mM GSH:1mM GSSG)을 함유하는 얼음 냉각된 리폴딩 버퍼에 적하 방식으로 희석하여 용해되어 술피톨리시스 반응이 진행된 pIL-17F를 다시 폴딩시킨다. 리폴딩 버퍼의 pH는 HCl로 6.5로 조정하고, pIL-17F는 100ug/ml의 최종 농도로 첨가한다. 일단 희석되면, 혼합물을 콜드룸에서 72시간 동안 서서히 교반한다.
C) 산물 회수 및 정제
리폴딩된 pIL-17F를 실험실 규모 TFF 시스템 상에서 10kDa 컷오프 멤브레인으로 10배 농축한다. 다음에, 0.45 마이크론 멤브레인을 사용하여 여과하고, 아세트산을 가하여 pH를 5.1로 조정한다. pH 조정된 물질을 50mM 아세테이트 버퍼 pH 5.1로 평형화된 Pharmacia SP 패스트 플로우 칼럼의 양이온 교환 크로마토그래피로 포착한다. pIL-17F를 190cm/hr의 유속으로 평형화 버퍼와 1:5로 인라인 비율화하여 로딩한다. 이 희석은 이온강도를 저하시켜 표적과 매트릭스의 효과적인 결합을 가능하게 한다. 샘플 로딩이 완료된 후, 칼럼을 평형화 버퍼로 베이스라인 흡광도까지 세척한다. 칼럼을 0.4M NaCl이 용해되어 있는 50mM 아세테이트 버퍼 pH 5.1로 세척한 다음, 결합된 단백질을 50mM 아세테이트 버퍼 pH 5.1 중에서 0.4M에서 1.5M NaCl의 5CV 구배로 용출한다. 단백질은 약 1M NaCl에서 용출되며, 용출물 분획의 SDS PAGE 분석에 의하면 약 85% 다이머이다. pIL-17F를 함유하는 분획들을 모아서, 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피에 의한 최종 정제 및 버퍼 교환을 위한 준비로서 Amicon 교반 셀을 사용하여 10kDa 컷오프 한외여과 멤브레인으로 농축한다.
D) 크기 배제 버퍼 교환 및 제제
농축된 양이온 풀(CV의 3-4%의 부피)을 109mM NaCl을 함유하는 50mM 나트륨 포스페이트 버퍼 pH 7.2로 평형화된 Pharmacia Superdex 75 크기 배제 칼럼 위에 30cm/hr의 유속으로 주입한다. 산물을 함유하는 대칭의 용출물 피크를 109mM NaCl 을 함유하는 50mM 나트륨 포스페이트 버퍼 pH 7.2 중에 1mg/ml의 농도로 희석한다. 마지막으로, pIL-17F을 0.2 마이크론 필터로 멸균 여과하고, 알리쿼트로 나누어 -80℃에 저장한다. 최종 과정 수율은 20%이다.
실시예 5
포유동물 가용성 IL-17RC 발현 구조물의 구성
IL-17RC 폴리펩티드(SEQ ID NO:43)코딩하는 DNA 단편(SEQ ID NO:42), mFc1를 코딩하는 DNA 단편(SEQ ID NO:44), 및 발현 벡터 pZMP20을 사용하여 오버랩 PCR 및 상동성 재조합을 통해 인간 IL-17RC[L21-K451]-mFc1(마우스 BALB/c μ2a Fc)를 함유하는 발현 구조물을 구성한다. 단편들은 PCR 증폭에 의해 발생된다.
IL-17RC[L21-K451]을 코딩하는 PCR 단편은, 최적화된 조직 플라스미노겐 활성인자 프레-프로 분비 리더 서열 코딩 영역에서 pZMP20 벡터 서열과 5'이 오버랩되고, [L21-K451]를 코딩하는 IL-17RC 세포외 도메인을 포함하고, mFc1 코딩 영역과 3'이 오버랩된다. PCR 증폭 반응은
5' 올리고뉴클레오티드로서
[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT; SEQ ID NO:46],
3' 올리고뉴클레오티드로서
[TGTGGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:47], 및
주형으로서 미리 생성된 IL-17RC의 DNA 클론을 사용한다.
mFc1을 코딩하는 PCR 단편은 IL-17RC 서열과 5'이 오버랩되고, mFc1 코딩 영 역을 포함하고, 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입부위 영역에서 pZMP20 벡터와 3'이 오버랩된다. PCR 증폭 반응은
5' 올리고뉴클레오티드로서
[GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGGCCCACA; SEQ ID NO:48],
3' 올리고뉴클레오티드로서
[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA;SEQ ID NO:49], 및 주형으로서 미리 생성된 mFc1의 DNA 클론을 사용한다.
PCR 증폭 반응 조건은 다음과 같다: 1 사이클, 94℃ 5분; 35 사이클, 94℃ 1분, 이어서 55℃ 2분, 이어서 72℃ 3분; 1 사이클, 72℃ 10분. PCR 반응 혼합물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시키고, 예상된 크기에 해당하는 DNA 단편을 QIAquick™ 겔 추출 키트(Qiagen, Cat. No. 28704)를 사용하여 겔로부터 추출한다.
2개의 PCR 단편을 오버랩 PCR에 의해 연결한다. 각각 약 1㎕의 2개의 겔 추출 단편을 혼합하고, 이때 PCR 증폭 반응은
5' 올리고뉴클레오티드로서
[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT; SEQ ID NO: 46] 및
3' 올리고뉴클레오티드로서
[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGA; SEQ ID NO:49]를 사용한다. 사용된 PCR 조건은 다음과 같다: 1 사이클, 94℃ 5분; 35 사이클, 94℃ 1분, 이어서 55℃ 2분, 이어서 72℃ 3분; 1 사이클, 72℃ 10분. PCR 반응 혼 합물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시키고, 삽입체의 크기에 해당하는 PCR 단편을 QIAquick™ 겔 추출 키트(Qiagen, Cat. No. 28704)를 사용하여 겔로부터 추출한다.
플라스미드 pZMP20은 MPSV 프로모터, 효모 재조합 전의 선형화를 위한 BglII 부위, OtPA 신호 펩티드 서열, 폴리오바이러스 유래의 내부 리보솜 진입 엘리먼트, 트랜스멤브레인 도메인의 C-말단 단부에서 절단된 CD8의 세포외 도메인을 갖는 발현 카세트; E. coli 복제 기원; SV40 프로모터, 인핸서 및 복제 기원, DHFR 유전자, 및 SV40 터미네이터를 포함하는 포유동물 선택성 마커 발현 유닛; 및 S. cerevisiae에서의 선택 및 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열을 함유하는 발현 벡터이다.
겔 추출된 IL-17RC[L21-K451]-mFc1 PCR 단편으로 효모에서 재조합하기 전에, 플라스미드 pZMP20를 BglII로 효소절단한다. 컴페턴트 효모(S. cerevisiae) 세포 100㎕를 IL-17RC[L21-K451]-mFc1 삽입체 DNA 10㎕ 및 BglII 효소절단된 pZMP20 벡터 100ng과 혼합하고, 이 혼합물을 0.2cm 전기천공 큐벳으로 옮긴다. 효모/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), ∞(무한대) ohm, 및 25μF로 설정한 파워 서플라이(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 전기 자극한다. 1.2M 소르비톨 600㎕를 큐벳에 첨가하고, 효모를 2개의 URA-D 플레이트 위에 100㎕ 및 300㎕ 알리쿼트씩 평판한 다음, 30℃에서 인큐베이션한다. 약 72시간 후에, 한 플레이트로부터의 Ura+ 효모 형질전환체를 물 1ml에 재현탁하고, 간단히 회전시켜 효모 세포의 펠릿을 만든다. 세포 펠릿을 세포용해 버퍼(2% 트리톤 엑스-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA) 0.5ml에 재현탁한다. 세포용해 혼합물 500㎕를 250㎕ 산-세정한 유리 비즈와 300㎕ 페놀-클로로포름을 함유하고 있는 에펜드로프 튜브에 넣고, 3분 동안 휘저은 다음, 에펜드로프 원심분리기에서 최대 속도로 5분간 회전시킨다. 수성상 300㎕를 새 튜브로 옮기고, 에탄올 600㎕를 사용하여 DNA를 침전시킨 다음, 최대 속도에서 30분간 원심분리한다. 튜브의 상청액을 가만히 따라 내고, 펠릿을 70% 에탄올 1ml로 세척한다. 튜브의 상청액을 가만히 따라 내고, DNA 펠릿을 30㎕ 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA에 재현탁한다.
효모 DNA 제조물 5㎕와 E. coli 세포 50㎕를 사용하여 일렉트로컴페턴트 E. coli 숙주세포(DH12S)의 형질전환을 수행한다. 세포를 2.0kV, 25μF 및 400ohm로 전기 자극한다. 전기천공 후에, 1ml SOC(2% Bacto™ 트립톤(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 글루코오스)를 첨가한 다음, 세포를 2개의 LB AMP 플레이트(LB 육즙(Lennox), 1.8% Bacto™ 아가(Difco), 및 100mg/L 암피실린) 위에 50㎕ 및 200㎕ 알리쿼트씩 평판한다.
구조물에 대해 3개 DNA 클론 삽입체를 서열 분석하고, 정확한 서열을 함유하는 1개의 클론을 선별한다. 상업적으로 이용가능한 키트(QIAGEN 플라스미드 메가 키트, Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조자의 사용법에 따라 대규모로 플라스미드 DNA를 분리한다.
실시예 6
IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, 및 IL-17RC-CFLAG를 발현하는 포유동물 가용성 IL-17RC 발현 구조물의 구성
C-말단 태그로서 Glu-Glu(CEE), 6개의 His(CHIS), 또는 FLAG(CFLAG)를 갖는 인간 IL-17RC[L21-K451]을 함유하는 발현 구조물을, IL-17RC[L21-K451]을 코딩하는 DNA 단편(SEQ ID NO:42) 및 발현 벡터 pZMP20을 사용하여 PCR 및 상동성 재조합을 통해 구성한다.
IL-17RC-CEE를 코딩하는 PCR 단편은, 최적화된 조직 플라스미노겐 활성인자 프레-프로 분비 리더 서열 코딩 영역에서 pZMP20 벡터 서열과 5'이 오버랩되고, [L21-K451]을 코딩하는 IL-17RC 세포외 도메인과 Glu-Glu 태그 서열(Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu; SEQ ID NO:53)을 포함하고, 폴리오바이러스 내부 리보솜 진입 부위 영역에서 pZMP20과 3'이 오버랩된다. PCR 증폭 반응은
5' 올리고뉴클레오티드로서
[GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGGAGAGGCTTGTGGGGCCT; SEQ ID NO:46],
3' 올리고뉴클레오티드로서
[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGCATGTATTCTTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:50], 및
주형으로서 미리 생성된 IL-17RC의 DNA 클론을 이용한다.
PCR 증폭 반응 조건은 다음과 같다: 1 사이클, 94℃ 5분; 35 사이클, 94℃ 1분, 이어서 55℃ 2분, 이어서 72℃ 3분; 1 사이클, 72℃ 10분. PCR 반응 혼합물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시키고, 예상된 크기에 상응하는 DNA 단편을 QIAquick ™ 겔 추출 키트(Qiagen, Cat. No. 28704)를 사용하여 겔로부터 추출한다.
겔 추출된 IL-17RC-CEE PCR 단편을 사용하여 효모에서 재조합하기 전에, 플라스미드 pZMP20을 BglII로 효소분해한다. 컴페턴트 효모(S. cerevisiae) 세포 100㎕를 IL-17RC-CEE 삽입체 DNA 10㎕, BglII 효소분해된 pZMP20 벡터 100ng과 합하고, 혼합물을 0.2cm 전기천공 큐벳으로 옮긴다. 효모/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), ∞(무한대) ohm, 및 25μF로 설정한 파워 서플라이(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 전기 자극한다. 1.2M 소르비톨 600㎕를 큐벳에 첨가하고, 효모를 2개의 URA-D 플레이트 위에 100㎕ 및 300㎕ 알리쿼트씩 평판한 다음, 30℃에서 인큐베이션한다. 약 72시간 후에, 하나의 플레이트로부터의 Ura+ 효모 형질전환체를 물 1ml에 재현탁하고, 간단히 회전시켜 효모 세포의 펠릿을 만든다. 세포 펠릿을 세포용해 버퍼(2% 트리톤 엑스-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA) 0.5ml에 재현탁한다. 세포용해 혼합물 500㎕를 250㎕ 산-세정 유리 비즈와 300㎕ 페놀-클로로포름을 함유하고 있는 에펜드로프 튜브에 넣고, 3분간 휘저은 다음, 에펜드로프 원심분리기에서 최대 속도로 5분간 회전시킨다. 수성상 300㎕를 새 튜브로 옮기고, 600㎕ 에탄올을 사용하여 DNA를 침전시킨 다음, 최대 속도에서 30분간 원심분리한다. 튜브의 상청액을 가만히 따라 내고, 펠릿을 70% 에탄올 1ml로 세척한다. 튜브의 상청액을 가만히 따라 내고, DNA 펠릿을 30㎕ 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA에 재현탁한다.
효모 DNA 제조물 5㎕와 E. coli 세포 50㎕를 사용하여 일렉트로컴페턴트 E. coli 숙주세포(DH12S)의 형질전환을 수행한다. 세포를 2.0kV, 25μF 및 400ohm로 전기 자극한다. 전기천공 후에, 1ml SOC(2% Bacto™ 트립톤(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 글루코오스)를 첨가한 다음, 세포를 2개의 LB AMP 플레이트(LB 육즙(Lennox), 1.8% Bacto™ 아가(Difco), 및 100mg/L 암피실린) 위에 50㎕ 및 200㎕ 알리쿼트씩 평판한다.
구조물에 대해 3개의 DNA 클론 삽입체를 서열 분석하고, 정확한 서열을 함유하는 1개의 클론을 선별한다. 상업적으로 이용가능한 키트(QIAGEN 플라스미드 메가 키트, Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조자의 사용법에 따라 대규모로 플라스미드 DNA를 분리한다.
동일한 과정을 사용하여 Gly Ser Gly Gly His His His His His His(IL-17RCCHIS; SEQ ID NO:51)로 이루어진 C-말단 his 태그, 또는 Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(IL-17RCCFLAG; SEQ ID NO:52)로 이루어진 C-말단 FLAG 태그를 가진 IL-17RC를 제조한다. 이들 구조물을 제조하기 위해서, SEQ ID NO:50의 3' 올리고뉴클레오티드 대신에, 3' 올리고뉴클레오티드
[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCCACCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:54]를 사용하여 IL-17RCCHIS를 생성하거나, 또는 3' 올리고뉴클레오티드
[CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTTATAATCGGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEQ ID NO:55]를 사용하여 IL-17RCCFLAG를 생성한다.
실시예 7
IL-17RC-mFc1 융합 단백질, 및 IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS 및 IL-17RC-CFLAG C-말단 태그 단백질을 발현하는 가용성 IL-17RC 수용체 발현 구조물의 트랜스펙션 및 발현
각 가용성 IL-17RC 융합 또는 태그 발현 구조물 200㎍씩의 세 세트를 개별적으로 37℃에서 3시간 동안 200 유닛의 PvuI로 효소분해하고, 이소프로필 알코올로 침전시킨 다음, 1.5ml 마이크로퓨즈 튜브에 넣어 원심분리한다. 상청액을 가만히 따라 낸 다음, 펠릿을 70% 에탄올 1ml로 세척하고 실온에서 5분간 인큐베이션한다. 튜브를 마이크로퓨즈에서 14,000rpm에서 10분간 회전시키고, 상청액을 가만히 따라 낸다. 다음에, 펠릿을 멸균 환경에서 CHO 세포조직 배양배지 750㎕에 재현탁하고, 60℃에서 30분간 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시킨다. 3개 튜브 각각에서 약 5 × 106 CHO 세포가 펠릿으로 되며, 이것을 DNA-배지 용액을 사용하여 재현탁한다. DNA/세포 혼합물을 0.4cm 갭 큐벳에 넣고 다음 파라미터를 사용하여 전기천공한다: 950μF, 고 커패시턴스, 300V. 다음에, 큐벳의 내용물을 꺼내어 모아서 CHO 세포조직 배양 배지로 25ml까지 희석하여 125ml 쉐이크 플라스크에 넣는다. 플라스크를 37℃, 6% 이산화탄소 조건의 쉐이커의 인큐베이터에 넣고 120rpm에서 쉐이킹한다.
CHO 세포에 대해 영양물 선별한 다음, 200nM 메토트렉세이트(MTX)로 증폭한 후, 1μM MTX로 단계적으로 증폭한다. 웨스턴 블롯으로 융합 및 태그 단백질의 발현을 확인하고, CHO 세포 풀을 스케일-업하여 단백질 정제를 위한 채취물을 얻는 다.
실시예 8
가용성 IL-17RC의 발현
IL-17RC-Tbx-C(Fc9)(SEQ ID NO:64)를 함유하는 발현 플라스미드를 IL-17RC_ Tbx의 DNA 단편과 발현 벡터 pZMP40을 사용하여 상동성 재조합을 통해 구성하였다. 상기 단편은 프라이머 zc44531과 zc44545를 사용하여 PCR 증폭에 의해 생성하였다.
PCR 단편 IL-17RC_Tbx은 부분적 IL-17RC 세포외 도메인 코딩 영역을 함유하며, 이것은 주형으로서 미리 생성된 IL-17RC의 클론을 사용하여 만들었다. 이 단편은 otPA 코딩 영역에서 pZMP40 벡터 서열과 5'이 오버랩되고, IL-17RC 세그먼트(SEQ ID NO:2의 아미노산 잔기 21에서 451), 링커 서열 및 트롬빈 절단 부위를 함유하고, Fc9 코딩 영역에서 pZMP40과 3'이 오버랩된다. 사용된 PCR 조건은 다음과 같다: 1 사이클, 94℃ 5분; 35 사이클, 94℃ 1분, 이어서 55℃ 2분, 이어서 72℃ 3분; 1 사이클, 72℃ 10분.
PCR 반응 혼합물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시키고, 삽입체의 크기에 해당하는 밴드를 QIAquick™ 겔 추출 키트(Qiagen, Cat.No. 28704)를 사용하여 겔 추출하였다.
플라스미드 pZMP40은 MPSV 프로모터, 코딩 서열의 삽입을 위한 다수의 제한 부위, otPA 신호 펩티드 서열, 및 Fc9의 서열을 갖는 발현 카세트; 폴리오바이러스유래의 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 트랜스멤브레인 도메인의 C-말단 단부에서 절단된 세포외 도메인; E. coli 복제 기원; SV40 프로모터, 인핸서 및 복제기 원, DHFR 유전자, 및 SV40 터미네이터를 포함하는 포유동물 선택성 마커 발현 유닛; 및 S. cerevisiae에서의 선택 및 복제에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열을 함유하는 포유동물 발현 벡터이다. 이것은 pZMP21(특허공개 No. US 2003/0232414 A1; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁, 기탁명 ATCC# PTA-5266)로부터 구성하였다.
PCR 단편을 가지고 효모에서 재조합하기에 앞서, 플라스미드 pZMP40를 BglII로 절단한다. 컴페턴트 효모(S. cerevisiae) 세포 100㎕를 독립적으로 삽입체 DNA(SEQ ID NO:66) 10㎕ 및 pZMP40 벡터 100ng과 합하고, 이 혼합물을 0.2cm 전기천공 큐벳으로 옮긴다. 효모/DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), ∞(무한대) ohm, 및 25μF로 설정한 파워 서플라이(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 전기 자극한다. 1.2M 소르비톨을 600㎕를 큐벳에 첨가하고, 효모를 2개의 URA-D 플레이트 위에 100㎕ 및 300㎕ 알리쿼트씩 평판한 다음, 30℃에서 인큐베이션한다. 약 72시간 후에, 한 플레이트로부터의 Ura+ 효모 형질전환체를 물 1ml에 재현탁하고, 간단히 회전시켜 효모 세포의 펠릿을 만든다. 세포 펠릿을 세포용해 버퍼(2% 트리톤 엑스-100, 1% SDS, 100mM NaCl, 10mM 트리스, pH 8.0, 1mM EDTA) 0.5ml에 재현탁한다. 세포용해 혼합물 500㎕를 250㎕ 산-세정한 유리 비즈와 300㎕ 페놀-클로로포름을 함유하고 있는 에펜드로프 튜브에 넣고, 3분 동안 휘저은 다음, 에펜드로프 원심분리기에서 최대 속도로 5분간 회전시킨다. 수성상 300㎕를 새 튜브로 옮기고, 에탄올(EtOH) 600㎕를 사용하여 DNA를 침전시킨 다음, 최대 속도에서 30분간 원심분리한다. 튜브의 상청액을 가만히 따라 내고 펠릿을 70% 에탄올 1ml로 세 척한다. 튜브의 상청액을 가만히 따라 내고, DNA 펠릿을 30㎕ TE에 재현탁한다.
효모 DNA 제조물 5㎕와 세포 50㎕를 사용하여 일렉트로컴페턴트 E. coli 숙주세포(DH12S)의 형질전환을 수행한다. 세포를 2.0kV, 25μF 및 400ohm로 전기 자극한다. 전기천공 후, 1ml SOC(2% Bacto™ 트립톤(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM MgSO4, 20mM 글루코오스)를 첨가한 다음, 세포를 2개의 LB AMP 플레이트(LB 육즙(Lennox), 1.8% Bacto™ 아가(Difco), 및 100mg/L 암피실린) 위에 50㎕ 및 200㎕ 알리쿼트씩 평판한다.
*구조물에 대해 3개 클론 삽입체를 서열 분석하고, 각 구조물에 대해 정확한 서열을 함유하는 1개의 클론을 선별한다. 제조자의 사용법에 따라 상업적으로 이용가능한 키트(QIAGEN 플라스미드 메가 키트, Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 대규모로 플라스미드 DNA를 분리한다.
다음에, IL-17RC[L21-K451]_Tbx_C(Fc9) 구조물 200㎍씩의 세 세트를 각각 37℃에서 3시간 동안 200 유닛의 PvuI로 효소분해하고, IPA로 침전시킨 다음, 1.5ml 마이크로퓨즈 튜브에 넣어 원심분리한다. 상청액을 가만히 따라 낸 다음, 펠릿을 70% 에탄올 1ml로 세척하고 실온에서 5분간 인큐베이션한다. 튜브를 마이크로퓨즈에서 14,000rpm에서 10분간 회전시키고, 상청액을 가만히 따라 낸다. 다음에, 펠릿을 멸균 환경에서 PF-CHO 750㎕에 재현탁하고, 60℃에서 30분간 인큐베이션한 다음, 실온으로 냉각시킨다. 3개 튜브 각각에서 5E6 APFDXB11 세포를 회전시켜 가라앉힌 다음 DNA-배지 용액을 사용하여 재현탁한다. DNA/세포 혼합물을 0.4cm 갭 큐 벳에 넣고 다음 파라미터를 사용하여 전기천공한다: 950μF, 고 커패시턴스, 300V. 다음에, 큐벳의 내용물을 꺼내어 모아서 PF-CHO 배지로 25ml까지 희석하여 125ml 쉐이크 플라스크에 넣는다. 플라스크를 37℃, 6% 이산화탄소 조건의 쉐이커의 인큐베이터에 넣고 120rpm에서 쉐이킹한다.
셀라인에 대해 영양물 선별한 다음, 200nM 메토트렉세이트(MTX)와 그 다음 1μM MTX로 단계적으로 증폭한다. 웨스턴 블롯으로 융합 및 태그 단백질의 발현을 확인하고, CHO 세포 풀을 스케일-업하여 단백질 정제한다.
실시예 9
CHO 세포로부터 가용성 IL-17RC의 정제
IL-17RC-TbX-Fc9(SEQ ID NO:64)를 발현하는 CHO 세포로부터의 조건 배지를 2개의 Biomax 0.1㎡ 30kD 분자량 컷오프 멤브레인 카세트(Millipore, Bedford, MA)에 대해 Pellicon-II 수형회전류 시스템을 사용하여 약 10배로 농축했다. 농축된 배지를 빙초산으로 pH 5.5로 조정하고, 0.2㎛ 멸균 필터로 여과한 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 배치 크로마토그래피를 통해 Protein G Sepharose 패스트 플로우 수지 (Pharmacia, Piscataway, NJ)에 로딩했다. pH 조정된 조건 배지를 로딩하기 전에, Protein G 수지를 25mM 나트륨 아세테이트, 15OmM NaCl, pH 5.5를 5 칼럼 부피(약 150ml) 사용하여 예비-평형화했다. 여과된 pH 조정된 조건 배지의 수지에 대한 비율은 33:1(v/v)이었다.
배치 크로마토그래피 과정은 주위 실온(약 21℃)에서 수행하였다. 배치 과정을 수행하고 pH 조정하고 0.22㎛ 필터로 여과한 조건 배지를 5.5 × 20.5cm의 빈 유리 칼럼에 부어 중력에 의해 충전했다. 칼럼을 25mM 나트륨 아세테이트, 15OmM NaCl, pH 5.5를 10 칼럼 부피(약 300ml)를 사용하여 세척했다. 다음에, 결합된 단백질을 10OmM 글리신 pH 2.7로 용출했다. 9.0ml씩 분획들을 수집하고, 1.0ml 2.0M 트리스 pH 8.0로 곧바로 중화시켰다. 수집된 분획들을 SDS-PAGE 코마시 염색에 의해 분석했다. IL-17RC-Tbx-Fc9를 함유하는 분획들을 모아서 제조자의 사용법에 따라 5kD 분자량 컷오프 Biomax 멤브레인 회전 농축기(Millipore, Bedford, MA)를 사용하여 약 6배로 농축했다.
다음에, 모아진 농축된 분획들을 7kD 분자량 컷오프 멤브레인 Slide-A-Lyzer (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 4℃에서 1× 포스페이트 완충된 식염수 pH 7.3 (Sigma, St. Louis, MO)에 대해 광범하게 투석했다. 1× 포스페이트 완충된 식염수 pH 7.3 중에 조제된 IL-17RC-TbX-Fc9를 0.22㎛ 멸균 필터로 여과한 다음, 알리쿼트로 나누어 -80℃에 저장했다.
실시예 10
IL-17A 및 IL-17F와 인간 IL-17RC의 결합
A) 바이오틴화된 사이토카인과 트랜스펙션된 세포의 결합
인간 IL-17 수용체(SEQ ID NO:21), 인간 IL-17RC(SEQ ID NO:2) 또는 이들 수용체를 모두 코딩하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 아기 햄스터 신장(BHK) 세포를, 바이오틴화된 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F와 결합하는 능력에 대해 평가한다. 베르센을 사용하여 세포를 채취하여 계수한 다음, 염색 배지(SM) 중에 ml 당 107 세포 까지 희석한다. 염색 배지는 1mg/ml 소 혈청 알부민(BSA), 10mM Hepes 및 0.1% 나트륨 아지드(w/v)에 HBSS를 더한 것이다. 바이오틴화된 인간 IL-17A(SEQ ID NO:14) 및 인간 IL-17F(SEQ ID NO:16)을 다양한 농도로 얼음 위에서 30분간 세포와 함께 인큐베이션한다. 30분 후, 과잉의 사이토카인을 SM으로 세척하여 제거하고, 세포를 얼음 위에서 30분간 피코에리트린에 콘쥬게이트된 스트렙타비딘(SA-PE)의 1:100 희석물과 함께 인큐베이션한다. 과잉의 SA-PE를 세척하여 제거하고, 세포를 유세포분석법에 의해 분석한다. 사이토카인 염색의 평균 형광 강도로부터 사이토카인 결합량을 정량하였다. 이 분석으로부터 본 출원인은 인간 IL-17A가 인간 IL-17R 및 IL-17RC 양쪽에 유사한 정도로 결합한다는 것을 알았다. 또한, 인간 IL-17F는 IL-17RC에는 유사한 수준으로 결합하지만, IL-17R에는 검출은 가능하지만 IL-17A에서 보았던 것에 비해서는 훨씬 낮은 수준으로 결합한다.
B) 바이오틴화된 사이토카인과 인간 말초혈액 단핵세포의 결합
전체혈액으로부터 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 피콜 밀도구배 원심분리에 의해 얻었다. ml 당 107 세포의 PBMC를 1㎍/ml의 바이오틴화된 IL-17A 또는 IL-17F 및 다양한 백혈구 계통을 구별할 수 있도록 디자인된 특이적 세포표면 단백질에 형광단 콘쥬게이트된 항체와 함께 동시에 인큐베이션했다. 이들 마커는 CD4, CD8, CD19, CD11b, CD56 및 CD16을 포함한다. 과잉의 항체 및 사이토카인을 세척하여 제거하고, 상기 설명된 대로 SA-PE와 함께 인큐베이션하여 특이적 사이토카인 결합을 검출한다. 유세포분석법에 의해 샘플을 분석했고, 이 분석으로부터 본 출 원인은 인간 IL-17A가 모든 시험된 PBMC 개체군에는 실질적으로 결합하지만, 인간 IL-17F는 어떤 개체군에도 검출가능하게 결합하지 않는다는 것을 알았다.
C) 바이오틴화된 인간 IL-17A 및 IL-17F와 미표지 사이토카인의 특이적 결합의 저해
상기 논의된 대로 결합 연구를 수행하지만, 결합 반응에는 과잉의 미표지 인간 IL-17A 및 IL-17F가 포함된다. BHK 세포를 사용한 연구에서, 미표지 사이토카인의 양은 농도 범위에 따라 변화했으며, 본 출원인은 미표지 IL-17A의 첨가가, IL-17RC 및 IL-17R 모두에 대한 IL-17A 및 IL-17F 모두의 결합과 경합한다는 것을 알았다. 그러나, 미표지 IL-17F는 IL-17A 및 IL-17F 모두와 IL-17RC의 결합과 경합했지만, IL-17R과의 결합과는 효과적으로 경합하지 않았다. 이것은 IL-17A 및 IL-17F가 모두 IL-17RC와 특이적으로 결합하며, 결합에 대해 상호-경합하는 것에 비추어, 이들이 동일한 또는 상당히 중첩되는 부위에서 결합한다는 것을 시사한다. 또한, IL-17A는 IL-17F의 IL-17R에 대한 상대적으로 약한 결합과 경합하는데, 이는 이들 두 사이토카인이 IL-17R에서는 유사한 영역에 결합하지만, IL-17F는 IL-17RC에 비하여 훨씬 감소된 친화성으로 IL-17R과 결합한다는 것을 시사한다.
D) 바이오틴화된 인간 IL-17A 및 IL-17F와 가용성 IL-17RC 및 IL-17R의 특이적 결합의 저해
상기 논의된 대로 결합 연구를 수행하지만, 결합 반응에는 IL-17RC 또는 IL-17R의 가용성 형태가 포함된다. 이들 가용성 수용체는 인간 IgG1 불변(Fc) 영역에 융합된 각 수용체의 세포외 도메인으로부터 유래한 융합 단백질이다. 본 출원인은 가용성 IL-17RC가 IL-17R 및 IL-17RC로 트랜스펙션된 BHK 세포 모두에 대한 인간 IL-17A 및 IL-17F 모두의 결합을 억제한다는 것을 알았다. 그러나, 가용성 IL-17R은 어느 한 수용체와 IL-17A의 결합을 억제하지만, IL-17F와 IL-17RC의 결합은 효과적으로 차단하지 않았는데, 이것은 IL-17R에 대한 IL-17F의 약한 결합과 일치하는 결과이다.
실시예 11
IL-17A 및 IL-17F는 IL-17RC와 결합한다
A) 콜드 리간드를 사용한 결합 억제:
hIL-17RC(SEQ ID NO:2) 및 IL-17R(SEQ ID NO:21)로 트랜스펙션된 BHK 세포를 분석 2일 전에 24-웰 디쉬(Costar 3527)에 40,000세포/웰로 평판했다. 요오드비드법에 의해 방사성 표지된 IL-17A(SEQ ID NO:14) 및 IL-17F(SEQ ID NO:16)를 결합 버퍼(RPMI 1640 배지(JRH 51502-500M), l0mg/ml 소 혈청 알부민(Gibco 15260-037) 첨가) 중에서 웰당 250ul씩 10ng/ml로 웰에 3번 중복되게 각각 첨가했다. 콜드 경합제를 100배 몰 과량으로 첨가했다. 시험된 경합제는 IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F 및 IL-21을 포함했다. 웰을 얼음 위에서 1시간 인큐베이션한 다음, PBS(Invitrogen 20012-027)로 2번 세척하고, 고염용액(1.5M NaCl, 5OmM HEPES pH 7.4)으로 1번 세척했다. 웰을 실온에서 30분간 0.8M NaOH 500ul로 추출하고, 감마 계수기(Packard Cobra II A5005)에서 분당 계수를 측정했다.
결과는 100× 몰의 콜드 IL-17A 및 IL-17F가, 125I IL-17A과 BHK hIL-17RC의 결합을 약 7배까지 감소시킬 수 있는 반면, IL-17B, C, D, E 및 IL-21은 결합에 대 한 어떤 영향도 없었음을 나타낸다. 10O× 몰의 콜드 IL-17A는 125I IL-17A와 BHK IL-17R의 결합을 약 4배까지 감소시켰으며, 반면에 IL-17B, C, D, E, F 및 IL-21은 결합에 대해 어떤 영향도 없었다. 10O× 몰의 콜드 IL-17A 및 IL-17F는 125 IL-17F와 BHK hIL-17RC의 결합을 각각 약 4배 및 5배까지 감소시켰으며, 반면에 IL-17B, C, D, E 및 IL-21은 결합에 대해 영향이 없었다.
B) 가용성 수용체를 사용한 결합 억제:
hzytorl4(SEQ ID NO:2) 및 IL-17R(SEQ ID NO:21) 트랜스펙션된 BHK 세포에 대한 결합을 앞서와 마찬가지로 수행하였으며, 다만 경합에 있어 100배 몰 과량의 가용성 hIL-17RCxl/Fc9(실시예 8) 및 가용성 IL-17R/Fc(R&D로부터 획득; Ref. 177-IR)을 콜드 리간드 대신 사용하였다. 앞서와 마찬가지로 세포를 세척하고 추출하고 계수하였다.
가용성 hIL-17RC/Fc는 125I IL-17F와 BHK IL-17RC의 결합을 억제했으며, 이들 실험으로부터 10× 몰 과량 평균의 IC50을 가진다. 동일한 셀라인 상에서 125 IL=17A의 가용성 hIL-17RC/Fc 억제는 20× 몰 과량의 평균 IC50을 제공했고, 125I IL-17A의 가용성 IL-17R/Fc 억제는 20× 몰 과량의 평균 IC50을 제공했다.
C) 결합 포화도
트랜스펙션된 BHK 세포를 앞서와 마찬가지로 24-웰 디쉬에 평판했다. 방사성 표지된 IL-17A 및 IL17F를 4nM 농도에서 시작하여 8번의 1:3 희석물로 결합 버퍼 중에서 전체 250㎕/웰로 3회 중복하여 첨가했다(1.83pM 농도까지). 별도로, 100배 몰 과량의 콜드 리간드를 각 희석 지점에서 첨가하였다. 앞서와 마찬가지로 세 포를 세척하고 추출하여 계수하였다. 각 희석 지점에서 경합되지 않은 계수로부터 100배 과량 계수를 차감하여 분당 특정된 계수를 방사성 표지된 리간드 농도에 대해 곡선으로 그렸다. 이들 정상화된 데이터를 곡선으로 그려 방사성 표지된 리간드와 트랜스펙션된 BHK 세포의 각 조합에 대한 포화 결합 곡선을 생성했다. 표 7은 이들 3회의 실험으로부터 계산된 친화성 값을 나타낸다.
Figure 112009064297438-PCT00006
한부위(one site) 결합 곡선 핏은 IL-17R에 대한 IL-17A 및 IL-17F 결합과 거의 가깝게 일치한다. 두부위(two site) 결합 곡선 핏은 hIL-17RC에 대한 IL-17A 및 IL-17F 결합과 거의 가깝게 일치한다. 높은 친화성 결합 부위는 상기에 나타낸 값이다. 낮은 친화성 결합 부위는 매우 낮은 친화성을 가졌으며, 3번의 실험에서 광범위하게 변하였다.
실시예 12
뮤린 Nih3t3 세포는 인간 IL-17A 및 IL-17F에 대해 반응한다
A) 세포 평판 및 kz142 아데노바이러스 리포터 감염
마우스 섬유아세포(ATCC에 설명된) Nih3t3으로부터 유래하는 Nih3t3 세포를 글루타민을 함유하고 피루베이트로 변성된 DMEM/10% FBS를 사용하여 고형의 흰색이고 세포배양물로 코팅된 96웰 플레이트(Cat. #3917. Costar)에 5000세포/웰로 평판하고, 37℃, 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양했다. 둘째 날에 평판 배지를 제거하고, 5000 입자/세포의 감염 다중도(MOI)로 Kz142 아데노바이러스 입자를 글루타민을 함유하고 피루베이트로 변성된 DMEM/1% FBS 중에서 준비하여, 37℃, 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양했다.
B) kz142 아데노바이러스 리포터 감염된 nih3t3 세포의 IL-17A 및 IL-17F 활성을 측정하는 루시페라제 분석
아데노바이러스 입자 리포터와 함께 하룻밤 인큐베이션한 후, 인간 IL-17A 및 IL-17F 리간드 처리제를 0.28% BSA로 변성된 혈청 무함유 배지 중에 제조했다. 아데노바이러스 입자 및 배지를 제거하고 적합한 리간드 용량을 3번 제공했다. 계속해서 37℃, 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지를 제거하고 세포를 15분간 용해한 후, 루시페라제 분석 시스템 및 시약(Cat.#el531 Promega. Madison, WI.)과 마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 평균 형광 강도(MFI)를 측정했다. 0.1-1000ng/ml 인간 IL-17A 및 IL-17F 범위의 농도에서 활성이 검출되었으며, 두 리간드 모두에 대해 약 50ng/ml의 EC50 값이 발생하였다. 이들 데이터는 nih3t3 세포가 이들 리간드에 대한 수용체를 지니고 있으며, IL-17A 및 IL-17F가 Nf-κb/Ap-1 전사인자를 활성화한다는 것을 나타낸다.
실시예 13
뮤린 Nih3t3 세포는 IL-17RA과 IL-17RC를 모두 발현한다
nih3t3 RNA의 RT PCR 분석에 의해 이들 세포가 IL-17RA 및 IL-17RC에 대해 모두 양성임이 증명되었으며, 이것은 이들 수용체 중 하나 또는 모두를 통해 매개되는 인간 IL-17A 및 IL-17F 매개에 대한 이들의 Nf-κb/Ap-1 반응과 일치한다.
RT PCR 상세내용:
A) 뮤린 IL-17RC PCR
표준 방법을 사용하여 nih3t3 세포로부터 분리된 전체 RNA로부터 제 1 가닥 cDNA를 제조했다. PCR은 핫 스타 중합효소를 사용하고 제조자의 권장사항(Qiagen, Valencia, CA)에 따라 적용했으며,
센스 프라이머 zc38910, 5' ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG 3'(SEQ ID NO:56) 및
안티센스 프라이머, zc 38679, 5' AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG 3'(SEQ ID NO: 57)를 사용하고, 35 사이클 증폭했다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 예상되는 850bp 크기의 확실한 단일의 앰플리콘이 확인되었다.
B) 뮤린 IL-17RA PCR
표준 방법을 사용하여 nih3t3 세포로부터 분리된 전체 RNA로부터 제 1 가닥 cDNA를 제조했다. PCR은 핫 스타 중합효소를 사용하고 제조자의 권장사항(Qiagen, Valencia, CA)에 따라 적용했으며,
센스 프라이머, zc38520, 5' CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC 3'(SEQ ID NO:58) 및
안티센스 프라이머, zc 38521, 5' TGGGCAGGGCACAGTCACAG 3' (SEQ ID NO:59)를 사용하고, 35 사이클 증폭했다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 예상되는 498bp 크기의 확실한 단일의 앰플리콘이 확인되었다.
실시예 14
apl/nfkb 전사인자를 발현하는 안정한 Nih3t3 분석 클론의 제조
상기 설명된 뮤린 nih3t3 셀라인을 네오마이신 선택성 마커를 함유하는 kz 142 apl/nfkb 리포터 구조물로 안정하게 트랜스펙션했다. 네오 저항성 트랜스펙션 풀을 클론 밀도로 평판했다. 클로닝 링을 사용하여 클론을 분리하고, 유도제로서 인간 IL-17A 리간드를 사용하여 루시페라제 분석에 의해 스크리닝했다. 최고의 (Ap-1/Nf-κB 루시페라제를 통해)평균 형광 강도(MFI)를 갖는 클론 및 최저의 바탕값을 선택했다. 안정한 트랜스펙션체 셀라인을 선별하여 nih3t3/kz142.8라고 칭하였다.
실시예 15
가용성 IL-17RC 및 IL-17RA/FC 키메라를 사용한 뮤린 Nih3t3 세포에서 인간 IL-17A 및 IL-17F에 의한 활성의 억제
가용성 형태의 IL-17RC 또는 IL-17RA를 루시페라제 분석에서 Ap-1/Nf-κB 요소의 인간 IL-17A 및 IL-17F 활성화의 길항제로서 사용했다. 이들 가용성 수용체는 인간 IgG1 불변(Fc) 영역에 융합된 각 수용체의 세포외 도메인으로부터 유래하는 융합 단백질이다. 가용성 인간 IL-17R FC 융합 단백질은 구입했다(재조합 인간 IL-17R/FC 키메라, 카달로그 번호 177-IR-100, R&D Systems, Inc., Minneapolis Mn.). 가용성 인간 IL-17RC FC 키메라(IL-17RCsR/FC9)를 상기 설명된 대로 구성했다. 본 출원인은 과잉의 IL-17RCsR/FC9 및 인간 IL17RsR/FC 키메라가 뮤린 nih3t3/kz142.8 분석 셀라인의 Ap-1/Nf-κB 활성화에 인간 IL-17A 및 IL-17F 매개의 EC50 수준을 모두 억제한다는 것을 밝혔다.
IL-17RCsR/FC9 단백질은 IL-17F 활성화를 길항하는데 있어서 최대 효능을 나타냈고, IL-17RsR/FC 키메라는 IL-17A 활성화를 길항하는데 있어서 최대 효능을 나타냈다.
실시예 16
IL-17F mRNA는 뮤린 천식 모델에서 상향조절된다
IL-17F mRNA 수준을 마우스 민감화 및 기도 시험감염 모델에서 측정했다. 8 내지 10주령 마우스의 그룹을 0일 및 7일에 50% Imject Alum(Pierce) 중의 재조합 Dermatophagoides pteronyssinus 알레르겐 1(DerP1)(Indoor biotechnologies, Cardiff, UK)을 10ug 복강내 주사하여 민감화했다. 7일 이후에, 50ul PBS 중의 DerP1 20ug으로 마우스를 3일 연속(14, 15 및 16일)하여 시험감염했다. 4마리의 마우스가 이 그룹을 대표했다. 음성 대조군은 포스페이트 완충 식염수(PBS) 민감화를 제공받은 다음 PBS 시험감염시킨 5마리의 마우스를 포함했다. 추가하여, 3마리의 마우스에는 DerP1 민감화를 제공한 후 PBS로 시험감염시켰다. 알레르겐, 또는 대조군 시험감염 48시간 후, 전체 폐 조직을 수거하여 전체 RNA를 분리했다.
제 1 가닥 cDNA를 각 피험체로부터의 전체 RNA와 동일한 양을 사용하여 제조했다. IL-17F PCR을 Qiagen 핫 스타 중합효소(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하고 제조자의 권장사항에 따라서 적용했다. IL-17F PCR은 35 사이클 증폭을 이용했으며, 센스 프라이머, zc46098, 5' ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC 3' (SEQ ID NO:60) 및 안티센트 프라이머, zc46099, 5' CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA 3' (SEQ ID NO:61)를 사용했다. 주형의 질이 모든 피험체에 대해 균일하도록 하기 위해서, 베타 액틴 PCR을 IL-17F 증폭에 사용된 동일한 양의 각 주형에 적용했다. B 액틴 PCR은 25 사이클 PCR을 포함했으며,
센스 프라이머, zc44779, 5' GTGGGCCGCTCTAGGCACCA 3'(SEQ ID NO:62) 및
안티센스 프라이머, zc44776, 5' CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG 3'(SEQ ID NO: 63)를 사용했다.
DerP1 민감화되고, DerP1 시험감염된 처리 그룹(천식 자극)의 4마리 마우스는 모두 강한 IL-17F 증폭을 나타냈다. 반면에, 음성 대조군에서는 약한 IL-17F 증폭이 보였는데, DerP1 민감화/PBS 시험감염 처리 그룹을 대표하는 3마리 피험체 중 3마리 및 PBS 민감화/PBS 시험감염 처리 그룹의 5마리 피험체 중 5마리를 포함한다. B 액틴 증폭은 최소한 천식 자극 피험체에 대한 것만큼 음성 대조군에서도 강하게 나타났는데, 이것은 약한 음성 대조군 IL-17F 증폭이 주형 문제로 인한 것은 아니었음을 나타낸다.
실시예 17
COS 세포 트랜스펙션 및 분비 트랩
A) Cos 세포 트랜스펙션 및 분비 트랩 분석은 IL-17RCsR/Fc9 및 IL-17F가 수용체/리간드 쌍임을 나타낸다
분비 트랩 분석을 사용하여 인간 IL-17RC(SEQ ID NO:2)과 인간 IL-17F(SEQ ID NO:16)를 매치시켰다. 가용성 IL-17RCsR/Fc9 융합 단백질(실시예 8)을 분비 분석에서 결합 시약으로 사용하였다. 인간 IL-17B, C, D, E 및 F의 cDNA를 함유하는 발현 벡터를 함유하는 SV40 ori를 COS 세포에 일시적으로 트랜스펙션했다. 하기 설명된 분비 트랩 분석을 사용하여 트랜스펙션된 COS 세포와 IL-17RCsR/Fc9의 결합을 수행했다. IL-17RCsR/Fc9의 양성 결합은 인간 IL-17F에서만 보였다. 이들 결과는 인간 IL-17RC 및 IL-17F가 수용체/리간드 쌍이라는 새로운 발견을 증명한다.
B) COS 세포 트랜스펙션
COS 세포 트랜스펙션을 다음과 같이 수행하였다: 믹스 3ul 풀 DNA와 5ul 리포펙타민™을 92ul 혈청 무함유 DMEM 배지(500ml DMEM 중에 55mg 나트륨 피루베이트, 146mg L-글루타민, 5mg 트랜스페린, 2.5mg 인슐린, 1㎍ 셀레늄 및 5mg 페투인) 중에서 실온에서 30분간 인큐베이션한 다음, 400ul 혈청 무함유 DMEM 배지를 첨가한다. 이 500ul 혼합물을 12-웰 조직배양 플레이트에 평판한 1.5 × 105 COS 세포/웰 위에 첨가하고, 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션한다. 500ul 20% FBS DMEM 배지(500ml DMEM 중에 100ml FBS, 55mg 나트륨 피루베이트 및 146mg L-글루타민)을 첨가하고 하룻밤 인큐베이션한다.
C) 분비 트랩 분석
분비 트랩을 다음과 같이 수행하였다: PBS를 사용하여 세포로부터 배지를 헹궈낸 다음, PBS 중에서 1.8% 포름알데히드로 15분간 고정시켰다. 다음에, 세포를 TNT(물 중 0.1M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 및 0.05% Tween-20)로 세척하고, 15분간 PBS 중에서 0.1% 트리톤-X로 투과성으로 만든 다음, 다시 TNT로 세척했다. 세포를 TNB(물 중 0.1M 트리스-HCl, 0.15M NaCl 및 0.5% 차단 시약(NEN Renaissance TSA-Direct Kit)로 1시간 동안 차단시키고, TNT로 다시 세척했다. 세포를 1㎍/ml 인간 IL-17RCx1sR/Fc9 가용성 수용체 융합 단백질 세포와 함께 1시간 인큐베이션했다. 다음에, 세포를 TNT로 세척했다. 세포를 1:200 희석된 염소-항-인간 Ig-HRP (Fc 특이적)와 함께 1시간 더 인큐베이션했다. 세포를 다시 TNT로 세척했다.
희석 버퍼(NEN 키트) 중에 1:50 희석된 플루오레세인 티라미드 시약을 사용하여 양성 결합이 검출되었으며, 4-6분 인큐베이션하고 TNT로 세척했다. TNT 중에 1:5 희석된 Vectashield Mounting Media(Vector Labs Burlingame, CA)를 사용하여 세포를 보존하였다. 형광현미경 위에서 FITC 필터를 사용하여 세포를 가시화했다.
실시예 18
뮤린 항-인간 IL-17RC 모노클로날 항체의 생성
A. 항-IL-17RC 항체의 생성을 위한 면역화
1. 가용성 IL-17RC-muFc
6 내지 12주령 무손상 또는 IL-17RC 녹아웃 마우스를 주 2회 일정으로 Ribi 애쥬번트(Sigma)와 1:1(v:v) 혼합된 가용성 인간 IL-17RC-muFc 단백질(실시예 23)을 25-50ug 복강내 주사하여 면역화한다. 3차 면역화 후 7일 내지 10일에 혈액 샘플을 안후 출혈에 의해 채취하고, 혈청을 수거하여 중화 분석(예를 들어, 본원에 설명된)에서 IL-17 또는 IL-17F와 IL-17RC의 결합을 억제하는 능력과, FACS 염색 분석에서 트랜스펙션되지 않은 293 세포에 대해 트랜스펙션된 IL-17RC를 염색하는 능력에 대해 평가했다. 중화 역가가 평탄영역에 도달할 때까지 마우스를 계속 면역화하여 혈액 샘플을 채취하여 상기 설명된 대로 평가했다. 이 시점에서, 최고의 중화 역가를 가진 마우스에 PBS 중의 가용성 IL-17RC-Fc 단백질을 25-50ug 혈관내 주사하였다. 3일 후에, 이들 마우스로부터 비장 및 림프절을 수거하고, 본 분야에 공지된 표준 방법(예를 들어, Kearney, J. F. et al., J Immunol. 123:1548-50, 1979; 및 Lane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985 참조)을 사용하여, 예를 들어 마우스 흑색종(P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 본 분야에서의 다른 적합한 셀라인을 사용하여, 하이브리도마 생성에 사용하였다.
2. 가용성 IL-17RC, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, IL-17RC-CFLAG
6 내지 12주령 무손상 또는 IL-17RC 녹아웃 마우스를 주 2회 일정으로 Ribi 애쥬번트(Sigma)와 1:1(v:v) 혼합된 가용성 인간 IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, 또는 IL-17RC-CFLAG를 25-50ug 복강내 주사하여 면역화한다. 3차 면역화 후 7일 내지 10일에 혈액 샘플을 안후 출혈에 의해 채취하고, 혈청을 수거하여 중화 분석(예를 들어, 본원에 설명된)에서 IL-17 또는 IL-17F와 IL-17RCdml 결합을 억제하는 능력과, FACS 염색 분석에서 트랜스펙션되지 않은 293 세포에 대해 트랜스펙션된 IL-17RC를 염색하는 능력에 대해 평가했다. 중화 역가가 평탄영역에 도달할 때까지 마우스를 계속 면역화하여 혈액 샘플을 채취하여 상기 설명된 대로 평가했다. 이 시점에서, 최고 중화 역가를 가진 마우스에 PBS 중의 가용성 IL-17RC, IL-17RC-CEE, zcytor-CHIS, 또는 IL-17RC-CFLAG 항원 단백질을 25-50ug 혈관내 주사하였다. 3일 후에 이들 마우스로부터 비장 및 림프절을 수거하고, 본 분야에 공지된 표준 방법(예를 들어, Kearney, J. F. et al., J Immunol. 123:1548-50, 1979; 및 Lane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985 참조)을 사용하여, 예를 들어 마우스 흑색종(P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 본 분야에서의 다른 적합한 셀라인을 사용하여, 하이브리도마 생성에 사용하였다.
3. IL-17RC를 발현하는 P815 트랜스펙션체
6 내지 10주령 암컷 DBA/2 마우스에 1 × 105 생 트랜스펙션된 P815 세포, 예를 들어 P815/IL-17RC 세포(예를 들어, 2 × 105세포/ml의 세포 밀도로 0.5ml)를 복강내 주사하여 면역화한다. 주사 전 세포는 지수 성장기로 유지된다. 주사를 위해 세포를 수거하고 PBS로 3번 세척한 다음, PBS 중에 2 × 105세포/ml의 밀도로 재현탁한다. 이 모델에서, 마우스는 2-3주 이내에 복수성 종양이 발생하고, 트랜스펙션된 표적 항원에 대한 면역반응이 생기지 않을 경우 4-6주에는 사망까지 진행하게 된다. 3주째에 분명한 복부팽만(복수의 징표)을 가지지 않는 마우스는 2-3주 간격으로 상기와 같이 다시 면역화한다. 2차 면역화 후 7일 내지 10일에 혈액 샘플을 안후 출혈에 의해 채취하고, 혈청을 수거하여 중화 분석(예를 들어, 본원에 설명된)에서 IL-17 또는 IL-17F와 IL-17RC의 결합을 억제하는 능력과, FACS 염색 분석에서 트랜스펙션되지 않은 293 세포에 대해 트랜스펙션된 IL-17RC를 염색하는 능력에 대해 평가했다. 중화 역가가 평탄영역에 도달할 때까지 마우스를 계속 면역화하여 혈액 샘플을 채취하여 상기 설명된 대로 평가했다. 이 시점에서, 최고 중화 역가를 가진 마우스에 1 × 105 의 살아있는 트랜스펙션된 P815 세포를 복강내 주사하였다. 4일 후에 이들 마우스로부터 비장 및 림프절을 수거하고, 본 분야에 공지된 표준 방법(예를 들어, Kearney, J. F. et al., 상동; 및 Lane, R.D. 상동)을 사용하여, 예를 들어 마우스 흑색종(P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 본 분야에서의 다른 적합한 셀라인을 사용하여, 하이브리도마 생성에 사용하였다.
또는, 살아있는 트랜스펙션된 P815 세포를 사용하는 상기 면역화 계획의 대안은, 1-5 × 106 조사된, 트랜스펙션된 세포를 2-3주 마다 복강내 주사하는 것을 포함한다. 이 접근법에서는 어떤 동물도 복수로 인한 죽음에 이르지 않는다. 대신에, 동물들을 상기 개략된 대로 혈청에서 IL-17RC에 대한 중화 면역반응을 모니터하며, 이것은 2차 면역화 후의 채혈과 함께 시작한다. 일단 중화 역가가 최대 수준에 도달한 다음, 최고 역가를 가진 마우스에 5 × 106 조사된 세포를 관류, 복강내 주사하여 제공하고, 4일 후에 이들 마우스로부터 비장 및 림프절을 수거하여, 본 분야에 공지된 표준 방법(예를 들어, Kearney, J. F. et al., 상동; 및 Lane, R.D. 상동)을 사용하여, 예를 들어 마우스 흑색종(P3-X63-Ag8.653.3.12.11) 세포 또는 본 분야에서의 다른 적합한 셀라인을 사용하여, 하이브리도마 생성에 사용한다.
B. IL-17RC와 결합하여, IL-17 또는 IL-17F가 IL-17RC에 결합하는 것을 억제하는 항체를 위한 하이브리도마 융합체의 선별
주입 후 8-10일에 하이브리도마 상청액에 대해 3가지 상이한 1차 스크리닝을 수행한다. 최초 분석에서는 상청액 중의 항체를 플레이트 결합된 가용성 인간 IL-17RC, IL-17RC-muFc, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, 또는 IL-17RC-CFLAG 단백질에 결합하는 능력에 대해서 HRP-콘쥬게이트 염소 항-마우스 카파 및 항-람다 경쇄 2차 단계 시약을 사용하여 ELISA로 결합된 마우스 항체를 확인하였다. IL-17RC 융합 단백질의 IL-17RC 부분에 대한 특이성을 증명하기 위해서, 초기 분석에서의 양성 상청액을 동일한 뮤린 Fc 영역(mG2a), EE 서열, HIS 서열, 또는 FLAG 서열에 융합된 부적합한 단백질에 대해 평가하였다. 이들 상청액 중의 항체는 IL-17RC-융합 단백질과 결합했으며, 부적합한 muFc 또는 다른 단백질 함유 융합 단백질 서열은 IL-17RC에 대한 특이성이 없는 듯 했다. 2차 분석을 위해, 모든 하이브리도마 상청액 중의 항체를 바이오틴화된 인간 IL-17 또는 바이오틴화된 인간 IL-17F와 플레이트 결합된 IL-17RC-muFc 또는 IL-17RC-융합 단백질의 결합을 억제하는 능력에 대해 ELISA로 평가했다.
이어서, ELISA 분석에서 IL-17 또는 IL-17F와 IL-17RC의 결합을 억제하는지 또는 그렇지 않은지와는 무관하게 IL-17RC에 특이적으로 결합된 항체를 함유하는 모든 상청액을 IL-17 또는 IL-17F와 IL-17RC 트랜스펙션된 Baf3 또는 BHK 세포 또는 정상 인간 기관지 상피세포의 결합을 억제하는 능력에 대해 시험했다. 다음에, IL-17 또는 IL-17F 결합 분석에서 또는 IL-17 및 IL-17F 억제 분석에서 중화 양성이었던 모든 상청액을 트랜스펙션되지 않은 Baf3 또는 BHK 세포에 대해 IL-17RC 트랜스펙션된 Baf3 또는 BHK 세포를 염색하는 능력에 대해 FACS 분석으로 평가했다. 이 분석은 IL-17RC에 대한 IL-17 또는 IL-17F 결합의 억제가 사실상 IL-17RC 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 때문임을 확인하도록 설계되었다. 추가하여, 항-IgG 2차 단계 시약을 사용하여 FACS 분석을 수행했으므로, 특이적 FACS 양성 결과는 중화 항체가 IgG 부류에 속할 가능성이 있음을 나타낸다. 이들 수단에 의해서, 플레이트 결합 ELISA에서 결합된 IL-17RC가 ELISA 기반 억제 분석에서 IL-17 또는 IL-17F와 IL-17RC의 결합을 억제했고, IL-17 및 IL-17F와 IL-17RC 트랜스펙션된 Baf3 또는 BHK 세포의 상호작용을 각각 차단했고, 항-마우스 IgG 2차 단계 시약을 사용한 IL-17RC 트랜스펙션된 Baf3 또는 BHK 세포의 염색에 대해 강한 양성이었던 마스터 웰이 확인되었다.
3차 분석은 IL-17RC를 발현하고 IL-17F 처리에 반응하여 IL-8 또는 IL-6을 분비하도록 유도될 수 있는 1차 인간 기관지 상피세포로 구성된다. 특이적 모노클로날 항체를 이들 세포에 의한 IL-17 또는 IL-17F 자극된 IL-8 또는 IL-6 생성을 억제하는 능력에 대해 분석한다. 본원에 설명된 대로 IL-17 또는 IL-17F에 반응하는 IL-8 및 IL-6 생성을 분석한다.
또는, NIH 3T3 또는 다른 IL-17RC 함유 세포에서 IL-17 또는 IL-17F 유도된 루시페라제 생성에 대하여 모노클로날 항체, 항-IL-17RC 매개 억제를 상기 주지된 생물활성 중화분석 중 하나와 함께 또는 그것을 대신하여 사용할 수 있다. NIH 3T3 세포에서 NF-κB 매개된 루시페라제 분석이 본원에 설명된다.
C) 항-IL-17RC 특이적 항체 생성 하이브리도마 클로닝
IL-17 및 IL-17F와 적합하게 트랜스펙션된 BaF3 또는 BHK 세포의 결합을 교차-중화했던 특이적 항-IL-17RC mAb를 생성하는 하이브리도마 셀라인을 표준 저-밀도 희석(웰당 1 세포 미만) 접근법에 의해 클로닝한다. 평판 후 약 5-7일에 클론들을, 예를 들어 플레이트 결합 인간 IL-17RC-muFc에 대해 ELISA에 의해 선별한 다음, 상기 설명된 대로 융합 단백질을 함유하는 부적합한 muFc에 대해 ELISA에 의해 양성 웰을 재시험한다. 상청액이 IL-17RC-muFc와 결합하고 부적합한 muFc 함유 융합 단백질과는 결합하지 않는 선별된 클론들을 중화 분석 및 FACS 분석을 반복함으로써 특이적 항체 활성에 대해 더 확인한다. 모든 선별된 IL-17RC 항체 양성 클론들을 최소한 2회 클로닝하여 클론형성능을 보증하도록 돕고 항체 생성의 안정성을 평가한다. 바람직하게는 클론의 적어도 95%가 항-IL-17RC 항체 생산을 중화하는데 양성일 때까지 설명된 대로 추가 라운드의 클로닝을 수행하고 스크리닝한다.
D) 항-IL-17RC mAb에 의해 인식되는 분자의 생화학적 특성분석
잠정적 항-IL-17RC mAb에 의해 인식되는 표적 분자 IL-17RC가 사실상 IL-17RC라는 것의 생화학적 확인을 표준 면역침전한 후, SDS-PAGE 분석 또는 웨스턴 블롯팅 과정을 차례로 수행하며, 이 두 과정은 모두 트랜스펙션되지 않은 Baf3 또는 BHK 세포에 대하여 IL-17RC 트랜스펙션된 Baf3 또는 BHK 세포로부터의 가용성 막 제제를 적용한다. 더욱이, IL-17RC를 발현하는 비-트랜스펙션된 셀라인의 가용성 막 제제의 적용은 mAb가 자생 수용체 사슬뿐 아니라 트랜스펙션된 것도 인식한다는 것을 나타낸다. 또는, mAb에 대하여, 가용성 IL-17RC-muFc 단백질을 특이적으로 면역침전시키는 능력 또는 웨스턴 블롯하는 능력에 대해 시험한다.
실시예 19
인간 IL-17RC로 트랜스펙션된 P815 세포를 주사한 마우스의 혈청에 의한 인간 IL-17RC의 중화
세포 기반 중화 분석을 사용하여, 살아있는 인간 IL-17RC 트랜스펙션된 P815 세포(실시예 17)를 주사한 마우스의 혈청을 연속 희석물로서 1%, 0.5%, 0.25%, 0.13%, 0.06%, 0.03%, 0.02%, 및 0%로 첨가한다. 분석 플레이트를 4일 동안 37℃, 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하고, 4일째에 Alamar Blue(Accumed, Chicago, IL)를 20㎕/웰로 첨가했다. 다시, 플레이트를 16시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소에서 인큐베이션한다. 결과는 4마리 동물의 혈청이 인간 IL-17RC를 통해 huIL-17 및 huIL-17F의 신호화를 모두 중화할 수 있음을 나타냈다.
이와 같은 결과는, 예를 들어 본 발명의 IL-17RC에 대한 중화 모토클로날 항체를 통해, IL-17 또는 IL-17F 활성(개별적으로 또는 함께)을 결합, 차단, 억제, 감소, 길항 또는 중화함으로써 IL-17RC를 효과적으로 차단하는 것이 생체내에서 IL-17 및 IL-17F(단독으로 또는 함께)의 효과를 감소시키는데 유리할 수 있으며, 예를 들어, 건선, IBD, 대장염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭성섬유증 또는 IBD, 관절염, 천식, 건선성 관절염, 대장염, 염증성 피부 질환, 및 아토피 피부염을 포함하여 IL-17 및/또는 IL-17F에 의해 유도되는 다른 염증성 질환에서 보이는 것과 같은 IL-17 및/또는 IL-17F-유도 염증을 감소시킬 수 있다는 추가의 증거를 제공한다.
실시예 20
항-인간 IL-17RC 모노클로날 항체의 약동학
시험 모노클로날 항체인 항-인간 IL-17RC mAb는, 예를 들어 약 1mg/ml(280nM에서의 UV 흡광도에 의해 측정)의 농도로 3× 3mL 알리쿼트로 제공하고, 사용될 때까지 -80℃에 보관하였다. 비히클은 1× PBS(5OmM NaPO4, 109mM NaCl) pH 7.3이다. 사용 전에 mAb를 실온에서 해동하고, 알리쿼트 1 및 2를 사용하여 각각 100㎍ IV 및 SC 용량 그룹에 제공한다. 알리쿼트 3의 반을 1× PBS 중에 1:2로 희석하여 50㎍ SC 용량 그룹에 제공하고, 알리쿼트 3의 나머지 반은 1× PBS 중에 1:10으로 희석하여 10㎍ SC 용량 그룹에 제공한다. 암컷 SCID 마우스(n=96)를 Charles River Labs에서 획득한다. 도착시 동물들의 건강을 체크하고 그룹으로 나누어 수용한다(우리당 3마리). 연구 시작시에 마우스는 12주령이며 평균 체중은 약 22g이다.
A) 투약 프로토콜
암컷 SCID 마우스(n=24/용량 그룹)를 4개의 투약 그룹에 무작위로 배치한다(표 8). 그룹 1은 꼬리 정맥에 약 93㎕를 IV 주사하여 항-인간 IL-17RC mAb를 투여했고, 그룹 2, 3 및 4는 목덜미에 약 93㎕를 SC 주사하여 mAb를 투여했다.
B) 샘플 수집
혈액 채취 전에, 마우스를 할로탄 또는 이소플루오란으로 완전히 마취했다. 168hr 시간 지점을 제외한 모든 시간 지점에서 심장 스틱을 통해 혈액 샘플을 채취했다(168hr 시간 지점에서는 눈 출혈을 통해 혈액을 채혈하고, 다시 동일한 동물에서 504hr 시간 지점에서 심장 스틱을 통해 채혈했다). 혈액을 혈청 분리튜브에 수집하여 15분간 응고시켰다. 이어서 샘플을 14,000rpm에서 3분간 원심분리했다. 원심분리 후, 125-15Oul 알리쿼트를 표지된 에펜드로프 튜브에 분배하고, 분석할 때까지 즉시 -80℃에 보관했다.
Figure 112009064297438-PCT00007
C) ELISA에 의한 혈청 항-인간 IL-17RC mAb 농도의 정량
효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)이 개발되었으며, 약동학 연구 동안 항-IL-17RC mAb가 투약된 동물의 마우스 혈청 샘플을 분석하는데 적합하다. 이 분석은 상업적으로 이용가능한 2차 항체 및 TMB를 사용한 색채계 검출이 유리하도록 설계된다. 표준 곡선의 선형 부분의 한계를 개선하기 위해 표준 곡선에 사용된 희석물을 변형하였다. 2배 희석물에서 100ng/ml 내지 0.231ng/ml의 범위의 표준 곡선이 마우스 혈청 샘플 정량을 허용한다. QC 샘플을 10% SCID 마우스 혈청 중에 1:100, 1:1000 및 1:10000로 희석하고, 표준 곡선으로부터 다시 계산한다.
D) 약동학적 분석
약동학적 분석을 위해 혈청 농도 대 시간 데이터를 WinNonlin Professional 4.0 소프트웨어(Pharsight, Inc.; Cary, NC)로부터 다운로드한다. 비구획 분석을 사용하여 각 시간 지점에서의 평균 데이터에 기초한 약동학 파라미터를 결정한다.
실시예 21
항-인간 IL-17RC 모노클로날 항체에 의한 IL-17A 및 IL-17F 활성의 중화
세포-기반 중화 분석을 이용하여, 정제된 마우스 항-인간 IL-17RC 모노클로날 항체를 일련의 희석물로서, 예를 들어 lO㎍/ml, 5㎍/ml, 2.5㎍/ml, 1.25㎍/ml, 625ng/ml, 313ng/ml, 156ng/ml 및 78ng/ml로 첨가한다. 분석 플레이트를 4일 동안 37℃, 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하고, 4일째에 Alamar Blue(Accumed, Chicago, IL)를 20㎕/웰로 첨가한다. 다시, 플레이트를 16시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소에서 인큐베이션한다. 이 분석에 의해 정제된 항-인간 IL-17RC 모노클로날 항체가 인간 IL-17RC를 통해 huIL-17 및 huIL-17F의 신호화를 모두 중화할 수 있다는 것이 증명될 수 있다. 약 10㎍/ml 농도로 사용되었을 때 매우 효과적인 항체에 대해서, 항체는 huIL-17 또는 huIL-17F에 의해 유도되는 증식을 완벽히 중화하며, 더 낮은 농도에서는 용량 의존적 방식으로 증식 억제가 감소된다. 상기 설명된 농도에서 시험된 동형-일치 음성 대조군 마우스 mAb는 어느 사이토카인에 대해서도 증식 억제를 제공하지 않을 것으로 예상된다. 이들 결과는 더 나아가 IL-17RC에 대한 모노클로날 항체가 낮은 농도에서도 실제로 전-염증성 리간드인 IL-17 및 IL-17F의 활성을 길항할 수 있음을 나타낸다.
실시예 22
IL-17A는 인간 말초혈액 단핵세포에서 TNF-γ 및 TNF-α의 상승된 수준을 유도한다
인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 정제한 다음, 배지 단독, 50ng/ml 항-인간 CD3 항체, 또는 50ng/ml 항-인간 CD3 항체와 1㎍/ml 항-인간 CD28 항체의 조합 중에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 이들 각 조건에 대해 복제한 배양물을 세팅하고, 사이토카인을 제공하지 않거나, 25ng/ml 인간 IL-17A, 또는 25ng/ml 인간 IL-17F을 제공한다. 24시간 인큐베이션한 후, 각 배양물로부터 상청액을 수거하고, B-D Bioscience의 인간 Th1/Th2 시토메트릭 비드 어레이(CBA)를 사용하여 사이토카인 함량을 분석한다. 본 출원인은 항-CD3 단독 또는 항-CD3와 항-CD28 공동 자극되고 IL-17A로 보충된 배양물이, 사이토카인을 첨가하지 않거나 IL-17F를 받은 배양물에 비해 상당히 상승한 수준의 TNF-γ 및 TNF-α(각각 3-5배 상승)를 함유했음을 밝혔다. 항-CD4 자극이 첨가되지 않은 배양물은 사이토카인 수준에 그다지 변화를 보이지 않았다. 더욱이, IL-17A 첨가는 IL-2, IL-4, IL-5, 및 IL-1O을 포함하는 CBA에 대해 분석된 다른 사이토카인에서 유의한 변화를 유도하지 않았다. 이 데이터는 IL-17A가 항-CD3 단독 또는 항-CD3와 항-CD28로 공동 자극된 PBMC 배양물에서 TNF-γ 및 TNF-α의 생성을 증가시킬 수 있지만 IL-17F는 그렇지 않다는 것을 나타낸다.
실시예 23
마우스 콜라겐 유발 관절염(CIA) 모델에서, 쥐의 대리 분자인 mIL-17RA-Fc에 의한 질환 발병 및 진행의 감소
A) 마우스 콜라겐 유발 관절염(CIA) 모델
관절염의 CIA 모델은 인간 관절염을 치료하기 위한 가능한 치료약(예: 본원에 설명된 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질)을 평가하는 데 적합하고 잘 알려진 모델이다. 이 CIA 모델에서는, 관절염 마우스의 오금 림프절과 발에서 뮤린 IL-17A 및 IL-17F의 mRNA 수준이, 관절염이 없는 마우스의 림프절과 발에서 발견되는 수준에 비하여 유의있게 증가했음을 발견하였는데(10-20배 증가; p ＜ 0.001), 이는 IL-17A 및 IL-17F가 작용을 하는 질병에 대한 모델로서 사용할 수 있음을 뒷받침한다. mIL-17RA-Fc 단백질은 뮤린 IL-17A 및 IL-17F를 모두 중화할 수 있기 때문에, 본원에 설명된 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질을 대리할 수 있는 적합한 대체물이며, 상기 중화는 인간 IL-17A 및 IL-17F에 모두 결합할 수 있는 인간 IL-17RC 또는 IL-17RA/RC의 유사한 특징이다.
본 연구를 위하여, 8주 내지 10주령 수컷 DBA/1J 마우스(Jackson Labs; 각각 ∼25 - 30g)를 이용하였다. 21일에 프로인드 완전 애쥬번트(Chondrex, Redmond, WA)에 의해 제조) 중에 조제된 1mg/ml 병아리 II형 콜라겐 100㎕를 진피내 꼬리 주사하여 동물들에게 제공하고, 3주 후 0일째에 프로인드 불완전 애주번트 중에 제조된 상기와 동일한 주사를 제공한다. 동물들은 2차 콜라겐 주사 후 관절염 증상을 나타내기 시작했으며, 대부분의 동물들은 1 내지 2주 이내에 염증이 발생했다. 캘리퍼스로 발 두께를 측정하고, 각 발에 임상점수 0-3을 배정하여(0=정상, 0.5=발가락(들) 염증, 1=경미한 발 염증, 2=중등도의 발 염증, 3=중증의 발 염증), 각 발에서 질환 범위를 평가하였다. 이하 상세히 설명한다.
B) 질환 모니터링
이 모델에서 질환의 발병률은 일반적으로 95-100%이며, 전형적으로 40마리의 동물을 사용한 연구에서 0-2마리의 무반응자(관찰 6주 후에 판정)가 보인다. 주목할 점은, 염증이 시작됨에 따라 공통적으로 가변적인 저-등급 발 또는 발가락 염증이 일시적으로 발생할 수 있다는 점이다. 이런 이유로 인해 뚜렷하고 지속적인 발의 부기가 발생하기 전까지는 동물에서 질환이 확립된 것으로 간주되지 않는다.
모든 동물을 매일 관찰하여 발의 질환 상태를 평가하며, 이것은 각 발에 정성적 임상점수를 매김으로써 수행한다. 매일 각 동물에 임상 질환의 상태에 따라 동물의 4개 발에 점수를 매긴다. 임상점수를 결정하기 위해, 발은 3개의 구역, 즉 발가락, 발 자체(앞발 또는 발), 및 손목 또는 발목 관절을 가진다고 생각될 수 있다. 이들 구역에 관련하여 염증의 범위 및 심한 정도를 기록하며, 기록에는 각 발가락의 부기 관찰; 발가락의 발톱 갈라짐 또는 붉어짐; 발에서 부종 또는 붉어짐에 대한 어떤 증거의 표시; 건 또는 뼈의 미세한 해부학적 경계의 상실의 표지; 손목 또는 발목에서 어떤 부종 또는 붉어짐에 대한 평가; 및 염증이 다리 위에 인접하여 확장되었는지에 대한 표시가 포함된다. 1, 2, 또는 3의 발 점수는 첫번째로 심한 정도의 전반적인 인상에 기초하고, 두번째로 얼마나 많은 구역이 연관되는가에 기초한다. 임상점수에 사용된 스케일을 아래에 나타낸다.
C) 임상점수
0 = 정상
0.5 = 1개 이상의 발가락이 연관됨, 발가락들에만 염증 있음.
1 = 발가락 또는 발가락들을 포함할 수 있으며, 발(1개 구역)과 연관된 경미한 염증,
2 = 발에 중등도 염증, 발가락 일부 및/또는 손목/발목(2개 구역)을 포함할 수 있음.
3 = 발, 손목/발목, 및 발가락 일부 또는 전부에 중증 염증(3개 구역).
처치법 : 확립된 질환은 스코어 1 이상을 기록하는 발 염증의 정성적인 점수로서 정의된다. 일단 질환이 확립되면, 날짜를 기록하고, 이것을 동물에서 "확립된 질환"이 나타난 최초 일로서 정하여, 치료를 시작한다. 마우스를 PBS 또는 mIL-17RA-Fc(PBS로 희석하여 원하는 농도를 만듬)로 이틀에 한번 총 5회 투여량으로 다음의 용량중 하나로 복강내 투여한다: 150㎍, 75㎍, 25㎍, 10㎍.
실험기간 동안 내내 혈액을 채취하여 항-콜라겐 항체의 혈청 수준과 혈청 면역글로불린 및 사이토카인 수준을 모니터한다. 동물들을 질환이 개시된지 11일 내의 마지막 처치 후 48시간 내에 안락사시킨다. 혈청을 위해 혈액을 채취하고, 모든 발을 수거하여 조직학 검사를 위해 10% NBF에 보관한다. 면역글로불린 및 사이토카인 분석을 위해, 혈청을 채취하여 -80℃에 냉동보관한다. mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스 그룹에 대한 발의 평균 스코어를 다음 표 9에 나타낸다.
표 9 : CIA 모델에서 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스 그룹에 대한 발의 평균 스코어
처리 처리 4일째 처리 10일째
PBS 1.59 + 0.15 2.13 + 0.20
10㎍의 mIL-17RA-Fc 0.89 + 0.16* 1.49 + 0.14*
20㎍의 mIL-17RA-Fc 0.95 + 0.19* 1.35 + 0.24*
75㎍의 mIL-17RA-Fc 0.86 + 0.13* 1.18 + 0.12*
150㎍의 mIL-17RA-Fc 0.64 + 0.17* 0.83 + 0.2*
참고 : 제 1 일은 치료 처리한지 첫째날이고, 복강내 주사를 통하여 이틀에 한번 치료제를 투여하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 나타낸다. *는 PBS 처리군과 유의있게 다른 발의 평균 스코어다(p＜0.05).
PBS 처리된 마우스에 비하여 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스가, 임상 스코어 중증도에 있어서 도스 의존적으로 유의있는 감소를 나타내었다. 10㎍의 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스가 가장 적은 양의 유의있는 효율(10일간의 처리일중 3일간만 유의있었음)을 나타내었다. ANOVA를 반복 측정하여 분석한 결과, PBS에 비하여 10㎍ 및 25㎍의 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스에 대하여, 시간에 대한 트렌드가 통계적으로 달랐고(p＜0.05); 75㎍ 또는 150㎍의 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스의 시간에 대한 트렌드는 PBS 처리된 마우스에 비하여 매우 유의있었다(p＜0.001). 또한, mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스는 영향받은 발의 수가 도스 의존적으로 감소하였다. 마지막에 측정된 모든 혈청 사이토카인(IL-1β, -6, -10, -12, -15, -17, IP-10, GM-CSF, TNF-α, MIP-1α, MCP, KC 및 RANTES)의 혈청 수준은, 질병에 걸리지 않은 채혈전의 동물에 비하여 질병에 걸린 동물에서 증가하였다. mIL-17RA-Fc 처리로, PBS 처리된 마우스에 비하여 IL-1β, -6, -10, -15 및 MIP-1α의 혈청 사이토카인 수준이 감소하였다. 가장 크고 가장 유의있는 감소는, 150㎍의 mIL-17RA-Fc로 처리한 동물에서 발견되었다. 또한, 실험 마지막에 측정된 mIL-17RA-Fc의 혈청 수준이 도스 의존적으로 증가하였다. 조직 분석결과, 관절 염증과 관절 파손이 도스 의존적으로 감소하였는데, 예를 들면 75㎍의 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스 군은 p＜0.01의 유의있는 감소를 나타냈고, 150㎍의 mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스 군은 가장 큰 효율을 나타내었다(p＜0.001).
모든 질병 동물은, 채혈전의 동물에 비하여 혈청에서 ELISA 결과 항-콜라겐의 수준이 매우 높았다. 처리군간에 유의있는 차이는 발견되지 않았다.
요약하면, 이러한 결과는, 본원에 설명된 인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질의 뮤린 대체물(예, mIL-17RC-Fc)이 관절염의 적합한 모델과 관련된 발병 및 진행 뿐 아니라 염증을 감소시킬 수 있음을 시사하고, 따라서 인간 관절염의 치료에 대한 인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질의 효율을 시사한다.
실시예 24
ap1/nfkb 전사인자를 발현하는 뮤린 분석 셀라인인 Nih3t3/kz142.8에서 IL-17RC의 안정한 과발현
뮤린 nih3t3/kz142.8 분석 셀라인을 메토트렉세이트 저항 유전자(디히드로폴레이트 환원효소, DHFR)을 갖는 발현 벡터 내에서 인간 IL-17RCx1(SEQ ID NO:2)로 트랜스펙션했다. 이 트랜스펙션은 상업적으로 이용가능한 키트 및 제조자의 권장사항을 사용하여 수행했다(Mirus, Madison, WI. Cat. #MIR218). 세포를 1μM mtx 변성 성장배지에 두어 인간 IL-17RCx1 트랜스젠을 함유하는 발현 벡터를 선별했다. 선별 후, 인간 IL-17RCx1 트랜스펙션 풀을 생성하여, nih3t3/kz142.8/hcytor14x1이라고 하였다.
A) nih3t3/kz142.8 분석 셀라인을 사용한 루시페라제 분석
nih3t3/kz142.8은 안정한 kz142 리포터이므로 이 리포터를 추가하기 위한 아데노바이러스 감염은 필요하지 않다. 따라서, 루시페라제 분석 프로토콜이 단축되었으며, 다음 방식으로 행하였다:
1. 세포 평판
nih3t3/kz142.8 세포를 글루타민을 함유하고 피루베이트로 변성된 DMEM/10% FBS를 사용하여 고형의 흰색 세포배양 코팅 96웰 플레이트(Cat. #3917. Costar)에 5000세포/웰로 평판하고, 37℃, 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양하였다. 둘째 날에 평판배지를 제거하고, 글루타민을 함유하고 피루베이트로 변성된 DMEM/1% FBS로 교체한 다음, 37℃, 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양하였다.
2. 안정한 kz142 리포터의 IL-17A 및 F 활성화를 측정하는 루시페라제 분석
1% FBS에서 하룻밤 배양한 후, DMEM 배지, 인간 IL-17A 및 IL-17F 리간드 희석물을 0.28% 수준까지 BSA로 변성된 혈청 무함유 배지 중에 제조했다. 리간드 희석물을 첨가한 후, 세포를 37℃, 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 15분간 용해하여 루시페라제 분석 시스템 및 시약(Cat.#el531 Promega. Madison, WI.)과 마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 평균 형광 강도를 측정했다. 0.1 내지 1000ng/ml 범위의 농도에서 두 리간드 모두에 대해서 활성이 검출되었다. nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 트랜스펙션 풀은 뮤린 IL-17A 리간드에 대해 모 셀라인(실시예 14)과 유사한 활성을 나타냈다. 그러나, cytor14x1 트랜스펙션체 풀은 인간 IL-17A 및 F 치료에 대해 증진된 반응성을 나타냈으며, 심지어 이들 리간드 농도가 20펨토그램 정도로 작을 때도 그러했다. mIL-17A 신호화가 모 셀라인에서의 신호화(실시예 14)와 비슷하다는 사실은 인간 IL-17RC-발현 세포에 있어서 일반적인 비-특이성 문제가 없고, 뮤린 IL-17A가 대체로 내인성 뮤린 nih3t3 세포 IL-17R 또는 IL-17RC 수용체를 통해 신호화한다는 것을 시사한다. 따라서, 인간 IL-17A 및 IL-17F가 이러한 낮은 리간드 농도에서도 MFI의 상승을 야기한다는 사실은 과발현된 인간 IL-17RC 수용체를 통해 매개되는 이들 리간드에 대한 세포의 특이적 고-반응성을 지시할 수 있다.
이 결과는 유의있는 임상적이고 생물학적인 응용 및 활용도를 가진다. 예를 들어, 생리학적 상황이 IL-17RC 수용체의 국소적인 상향조절을 야기할 수 있으며, 그 다음 이들 영역이 IL-17A 및 IL-17F에 대해 고-반응성으로 될 수 있고, 그 결과 IL-17RC 과발현이 없을 때 제시된 것보다도 훨씬 낮은 리간드 농도에서 생물학적 활성화가 일어날 수 있다. 따라서, 이들 가설상 낮은 리간드 농도를 길항하는데는 본 분야의 업자들에 의해 생각되거나 인식되는 것보다도 훨씬 낮은 가용성 수용체 수준으로도 충분할 수 있다.
실시예 25
염증성 장 질환(TBD) 모델에서 IL-7F 및 IL-17A 활성에 대한 길항제는 질환 발병 및 진행을 감소시킨다
염증성 장 질환(TBD) 모델은 IBD를 가진 환자로부터의 배양된 장 조직이 건강한 대조군의 조직과 비교하여 높은 수준의 염증 매개인자를 생성함을 나타내도록 설계된다. 염증 매개인자(제한은 없지만 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, MIP 패밀리 구성원, MCP-1, G- 및 GM-CSF 등을 포함한다)의 이런 증진된 생성은 염증 경로 및 하류 이펙터 세포의 활성화에 영향(들)을 미치는 방식으로 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC) 같은 IBD에 관련된 증상 및 병리학에 기여한다. 다음에, 이들 경로 및 성분들이 생체내에서 관찰되는 조직 및 세포 손상/파괴를 이끈다. 따라서, 이 모델은 IBD의 이런 증진된 염증 매개인자 양태를 자극할 수 있다. 더욱이, 건강한 대조군 또는 인간 장 상피세포(IEC) 셀라인으로부터의 장 조직이 이들 염증 성분의 존재하에 배양되었을 때는, 염증 경로 신호화와 조직 및 세포 손상의 증거가 관찰될 수 있다.
생체내에서 인간 IBD에 효과적인 치료제는 염증 매개인자의 생산 및/또는 존재를 억제 및/또는 중화함으로써 상기 생체외 또는 IEC 모델에서 작동할 것이다.
이 모델에서, 장 생검을 겪은 IBD를 가진 환자 또는 건강한 대조군으로부터 인간 장 조직을 수거하여 재절편화하거나, 또는 부검용 조직 수거물로부터 재절편화하고, alexakis et al(Gut 53:85-90; 2004)의 변형을 사용하여 처리한다. 무균 조건하에서, 샘플을 다량의 PBS로 부드럽게 세정한 다음, (세균의 과성장을 방지하기 위해 항생제를 더한)완전 조직배양 배지의 존재하에 조직의 절편을 배양한다. 동일한 조직 절편 풀로부터의 샘플을 다음 중 하나로 처리한다: 비히클(PBS); 재조합 인간(rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A + rhIL-17F. 추가하여, 이들을 IL-17A 또는 IL-17F 중 어느 하나의 길항제로 또는 길항제 없이 단독으로 또는 (가용성 IL-17RC와 같은)조합하여 처리한다. 이 실험 프로토콜은 세포를 기존의 스톡 용액으로부터 계대한다는 것을 제외하고는 인간 IEC 셀라인을 사용한 연구를 따른다. 다양한 배양 시간 후(1h에서 수일까지), 상청액을 수거하여 상기 열거된 것들을 포함하는 염증 매개인자의 수준을 분석한다. IBD를 가진 환자로부터의 샘플 또는 rhIL-17A 및/또는 F로 처리된 샘플에서는 염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준이, 처리되지 않은 건강한 대조군 조직 샘플에 비하여 상승된다. 본 발명의 IL-17RC 가용성 수용체 및 항-인간-IL-17RC 모노크로날 및 중화 항체를 포함하는 항체와 같이, IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 대한 길항제의 첨가는 염증 매개인자의 생성을 현저히 감소시키며, 따라서 인간 IBD에 효과적일 것으로 기대된다.
실시예 26
다발성 경화증(MS) 모델에서 IL-17F 및 IL-17A 활성에 대한 길항제는 질환 발병 및 진행의 감소시킨다
다발성 경화증(MS)은 CNS 전체적으로 림프구 세포 및 단핵세포 염증 침윤병소 및 수초탈락의 존재를 포함하여, 다수의 인자들에 의해 매개된다고 생각되는 복잡한 질환이다. 소교세포는 중추신경계(CNS)에 집락을 이루고 있는 대식세포-유형 세포이며, 상처 또는 감염에 의해 활성화된다. 소교세포는 MS를 포함하는 다양한 CNS 질환에서 중요한 역할을 함으로써 연루되며, 질환의 개시, 진행 및 치료요법의 메커니즘을 연구하는데 사용될 수 있다(Nagai et al. Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001; Olson et al. J Neurosci Methods 128:33-43; 2003). 따라서, 불멸화된 인간 소교세포 셀라인 및/또는 확립된 인간 성상아교세포 셀라인을 사용하여 이들 세포 타입에 대한 염증 매개인자의 효과들 중의 일부와 이들의 중화 잠재력을 연구할 수 있다. 염증 매개인자(제한은 없지만 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, MIP 패밀리 구성원, RANTES, IP-10, MCP-1, G- 및 GM-CSF 등을 포함한다)는 염증 경로 및 하류 이펙터 세포의 활성화에 영향(들)을 미치는 방식으로 MS와 관련된 증상 및 병리학에 기여할 수 있다.
IL-17A 및 IL-17F의 전-염증성 작용, 및 이들 효과를 중화 또는 감소시키는 본 발명의 IL-17RC 가용성 수용체 및 항-인간-IL-17RC 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 항체와 같이, IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 대한 길항제의 능력을 평가하기 위해서 배양된 아교세포를 다음 중 하나로 처리한다: 비히클; rhIL-17A; rhIL-17F; rhIL-17A + IL-17F. 추가하여, 이들을 IL-17A 또는 IL-17F 중 어느 하나의 길항제로 또는 길항제 없이 단독으로 또는 (가용성 IL-17RC와 같은)조합하여 처리한다. 다양한 배양 시간 후(1h에서 수일까지), 상청액 및 세포를 수거하여 상기 열거된 것들을 포함하는 염증 매개인자의 수준 및/또는 발현을 분석한다. 비히클만으로 처리된 배양물과 비교하여 rhIL-17A 및/또는 IL-17F의 존재하에서는 염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준이 상승된다. 본 발명의 IL-17RC 가용성 수용체 및 항-인간-IL-17RC 모노크로날 및 중화 항체를 포함하는 항체와 같이, IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 대한 길항제의 첨가는 염증 매개인자의 생성 및 발현을 현저히 감소시키며, 따라서 인간 MS와 관련된 염증 양태에서 효과적일 것으로 기대된다.
실시예 27
류마티스 관절염(RA) 및 골관절염 (OA) 모델에서 IL-17F 및 IL-17A에 대한 길항제는 질환 발병 및 진행을 감소시킨다
이 모델은 인간 윤활액 배양물(윤활액 대식세포, 윤활액 섬유아세포, 및 관절연골세포를 포함) 및 RA 및 OA를 가진 환자로부터의 외식물이 건강한 대조군으로부터의 배양물/외식물과 비교하여 높은 수준의 염증 매개인자를 생성하도록 설계된다.
염증 매개인자(제한은 없지만 온코스타틴 M, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IP-10, RANTES, RANKL, MIP 패밀리 구성원, MCP-1, G- 및 GM-CSF, 산화질소 등을 포함한다)의 이런 증진된 생성은 염증 경로 및 하류 이펙터 세포의 활성화에 영향(들)을 미치는 방식으로 RA 및 OA와 관련된 증상 및 병리학에 기여한다. 다음에, 이들 경로 및 성분들이 염증 침윤병소, 연골 및 바탕질 상실/파괴, 골 상실, 및 프로스타글란딘 및 시클로옥시게나제의 상향조절을 이끈다. 따라서, 이 모델은 시험관내 및 생체외 실험에서 RA 및 OA의 파괴적 염증 양태를 자극할 수 있다. 더욱이, 건강한 대조군으로부터의 이식물 및 윤활액 배양물이 다수의 이들 염증 성분(예를 들어, 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A 및 F, IL-15 등)의 존재하에 배양되었을 때, 염증 경로 신호화가 관찰될 수 있다. 생체내 인간 RA에서 효과적일 수 있는 치료제는 염증 매개인자의 생성 및/또는 존재를 억제 및/또는 중화함으로써 상기 시험관내 및 생체외 모델에서 작용할 것이다.
이 모델에서는 인간 윤활액 외식물을 RA, OA를 가진 환자로부터, 또는 관절대체술을 겪은 건강한 대조군으로부터, 또는 부검용 조직 수거물로부터 수거하고, Wooley and Tetlow(Arthritis Res 2:65-70;2000) 및 van't Hof et al(Rheumatology 39: 1004-1008; 2000)의 변형을 사용하여 처리한다. 또한, 윤활액 섬유아세포, 윤활액 대식세포 및 관절연골세포의 배양물을 연구한다. 복제한 샘플을 다음 중 하나로 처리한다: 비히클(PBS); 재조합 인간(rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A + rhIL-17F. 일부 샘플은 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-17F 및IL-15의 다양한 조합을 함유한다. 추가하여, 이들을 본 발명의 IL-17RC 가용성 수용체 및 항-인간-IL-17RC 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 항체와 같이, IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 대한 길항제로 처리하거나, 길항제 없이 처리한다. 다양한 시간 배양한 후(1h에서 수일까지), 상청액을 수거하여 상기 열거된 것들을 포함하는 염증 매개인자의 수준을 분석한다. RA 또는 OA를 가진 환자의 샘플에서 또는 rhIL-17A 및/또는 F(단독으로 또는 다른 염증성 사이토카인과 조합하여)로 처리된 샘플에서는 미처리 건강한 대조군 외식물 또는 미처리 세포 배양물과 비교하여 염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준이 상승된다. 본 발명의 IL-17RC 가용성 수용체 및 항-인간-IL-17RC 모노클로날 및 중화 항체를 포함하는 항체와 같이, IL-17F 및/또는 IL-17A 활성에 대한 길항체의 첨가는 염증 매개인자의 생성을 현저히 감소시키며, 따라서 인간 RA 및 OA에서 효과적일 것으로 기대된다.
실시예 28
IL-17A 및 IL-17F 기능적 반응
NIH-3T3/KZ142 세포를 인간 IL-17RCx1(SEQ ID NO:1) 및 마우스 IL-17RCx1 (SEQ ID NO:25)로 안정하게 트랜스펙션했다. 상기 설명된 대로, 각 셀라인을 IL-17A, IL-17F, 뮤린 IL-17F, 및 적합한 대조군의 용량 반응에 따라 7 및 15분간 처리했다. IL-17RCx1(SEQ ID NO:1)이 트랜스펙션되었을 때 IL-17A 및 IL-17F는 모두 인산화된 IκB-α 및 p38 MAPK 전사인자에서 용량 의존적 반응을 제공하며, 이것은 대조군 셀라인으로부터의 고유한 신호화에 비해 약 30% 이상이다. 뮤린 IL-17RCx1 (SEQ ID NO:25)가 트랜스펙션되었을 때는 IL-17A 및 IL-17F는 신호화를 증가시키지 않았다. 또한, 뮤린 IL-17F는 인간 또는 뮤린 IL-17RCx1에 대한 신호화를 증가시키지 않았다.
실시예 29
뮤린 질환 모델에서 IL-17A, IL-17F, IL-17RA 및 IL-17RC 발현
4가지 뮤린 질환 모델(천식, DSS 대장염, 아토피 피부염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염)을 IL-17A, IL-17F, IL-I7R 및 IL-17RC의 발현에 대해 공지의 기술을 사용하여 분석하였다.
천식 모델에서, IL-17A 및 IL-17F는 질환 상태 마우스 및 비-질환 상태 마우스에서 폐, 비장, 폐 배출 림프절 및 폐 침윤세포에서 매우 낮은 수준 내지는 검출이 가능하지 않은 수준으로 발현된다. 비장 및 림프절에 비해 폐에서 IL-17RC 메시지가 더 많이 발현되는 것으로 밝혀졌지만 질환에 따라 조절되지는 않았다. IL-17R은 폐에 비하여 비장 및 폐 배출 림프절에서 더 많이 발현되었지만 역시 질환에 따라 조절되지는 않았다.
*천식 모델과는 반대로, 근 결장 및 원 결장 DSS-대장염 모델에서 IL-17A 및 IL-17F는 질환 상태의 마우스에서는 상당히 상향조절되었지만 정상 상태 마우스에서는 그렇지 않았다. 장간막 림프절에서는 어느 사이토카인도 그다지 상향조절되지 않았다. 더 나아가, 급성 DSS-유발 대장염에서는 두 사이토카인이 모두 상향조절되지만, 만성 DSS-유발 대장염에서는 그렇지 않다는 것이 밝혀졌다. IL-17R은 근 결장 및 원 결장에 비하여 장간막 림프절에서 현저히 발현되는 것으로 밝혀졌지만, 질환에 따라 조절되지는 않았다. 반면에, IL-17RC는 장간막 림프절에 비하여 근 결장 및 원 결장 조직에서 더 많이 발현되었다. IL-17RC 발현 역시 질환에 따라 조절되지 않았다.
아토피 피부염에서는 IL-17A mRNA가 검출되지 않았다. IL-17F는 피부 및 피부-배출 림프절에서 모두 발현되는 것으로 밝혀졌지만, 질환에 따라 그다지 조절되지는 않는 것으로 드러났다. IL-17R mRNA는 피부에 비해 피부-배출 림프절에서 더 많이 발현되었지만 질환에 따라 조절되지는 않았다. IL-17RC는 피부-배출 림프절에 비해 피부에서 더 많이 발현되었지만 역시 질환에 따라 조절되지는 않았다.
실험적 알레르기성 뇌척수염에서, 질환 상태 마우스에서는 IL-17A와 IL-17F가 모두 척수에서 상향조절되는 것으로 드러났지만 건강한 마우스에서는 그렇지 않았다. IL-17F는 척수에 비해 림프절에서 더 많이 발현되었을 가능성이 있지만, 림프절에서의 발현은 질환에 따라 조절되지 않았다. 그러나, 이들 조직에서 전체적인 발현 수준은 아주 낮았다. IL-17R은 뇌 및 척수에 비해 림프절 조직에서 더 많이 발현되었다. IL-17RC는 시험되지 않았다.
간단히 말해서, IL-17A 및 IL-17F 발현은 DSS-유발 대장염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염 모델에서는 질환에 따라 조절되지만 천식이나 아토피 피부염에서는 분명히 그렇지 않다는 것이 드러났다. IL-17R 및 IL-17RC 발현은 질환에 따라 조절되지 않는 것으로 드러났지만, IL-17R 발현은 림프 조직에서 풍부하고, IL-17RC 발현은 비-림프 조직에서 풍부한 것으로 드러났다.
실시예 30
IL-17RC는 IL-17A 및 IL-17F 모두에 대한 활성화의 매개인자이다
뮤린 nih3t3/kz142.8 분석 셀라인을 메토트렉세이트(mtx) 저항 유전자(디히드로폴레이트 환원효소, DHFR)을 갖는 발현 벡터에서 인간 IL-17RCX1(SEQ ID NO:2)로 트랜스펙션했다. 인간 IL-17RA(SEQ ID NO:21)를 이 셀라인으로 유사하게 트랜스펙션했다. 트랜스펙션은 상업적으로 입수가능한 키트를 사용하여 제조자의 권장사항에 따라 수행하였다(Minis, Madison, WI. Cat. #MIR218). 세포를 1μM mtx로 변성된 성장배지에 두고 발현 구조물을 함유하는 발현 벡터를 선별했다. 선별 후, 트랜스펙션 풀을 만들어, 이것을 nih3t3/kz142.8/hcytor14X1 및 nih3t3/kz142.8/IL-17R이라고 명명했다.
A) nih3t3/kz142.8-기초 셀라인을 이용한 루시페라제 분석
nih3t3/kz142.8 기초 셀라인은 안정한 ap1/nfkb 리포터(kz142)이므로, 이 리포터를 추가하기 위한 아데노바이러스 감염은 필요하지 않다. 따라서, 루시페라제 분석 프로토콜이 단축되었으며, 다음 방식으로 수행하였다:
1. 세포 평판
세포를 글루타민을 함유하고 피루베이트로 변성된 DMEM/10% FBS를 사용하여 고형의 흰색 세포배양 코팅 96웰 플레이트(Cat. #3917. Costar)에 5000세포/웰로 평판하고, 37℃, 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양하였다. 둘째 날에 평판배지를 제거하고, 글루타민을 함유하고 피루베이트로 변성된 DMEM/1% FBS로 교체한 다음, 37℃, 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양하였다.
2. 안정한 kz142 리포터의 IL-17A 및 F 활성화를 측정하는 루시페라제 분석
1% FBS에서 하룻밤 배양한 후, DMEM 배지, 인간 IL-17A 및 IL-17F 리간드 희석물을 0.28% 수준까지 BSA로 변성된 혈청 무함유 배지 중에 제조했다. 리간드 희석물을 첨가한 후, 세포를 37℃, 5% 이산화탄소에서 4시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고, 세포를 15분간 용해하여 루시페라제 분석 시스템 및 시약(Cat.#el531 Promega. Madison, WI.)과 마이크로플레이트 루미노미터를 사용하여 평균 형광 강도를 측정했다. 0.1 내지 100ng/ml 범위의 농도에서 두 리간드 모두에 대해서 활성이 검출되었다.
하기 논의된 EC50은 최소 4회 실험의 평균이다. nih3t3/kz142.8/hcytor14xl 트랜스펙션 풀은 뮤린 IL-17A 리간드에 대해 모 셀라인과 유사한 활성을 나타냈으며 EC50은 약 4ng/ml이었다(실시예 14). hcytor14x1 재조합 셀라인에서의 mIL-17A 신호화가 모 셀라인(실시예 14)에서의 신호화와 비슷하다는 사실은 뮤린 IL-17A가 대체로 내인성 뮤린 nih3t3 세포 IL-17RA 또는 IL-17RC 수용체를 통해 신호화하며, hcytor14X1을 통해서는 세포를 활성화하지 않는다는 것을 시사한다. 그러나, hIL-17RCX1 트랜스펙션체 풀은 인간 IL-17A 처리에 대해 상승된 반응성을 나타냈는데, EC50이 모 셀라인에서의 2.8ng/ml에 대해 0.41ng/ml이었다(4회 실험 평균)(재조합 셀라인에서 6.8배 더 강한 EC50). 추가하여, hIL-17RCX1 재조합 셀라인은 hIL-17F에 대해 상승된 반응성을 가졌으며, EC50은 모 셀라인에서의 10ng/ml에 대해 재조합 셀라인에서는 0.61ng/ml이었다(재조합 셀라인에서 17배 더 강한 EC50). hIL-17RCX1 셀라인에서 hIL-17A 및 F의 증가된 효능은 인간 IL-17RCx1이 인간 IL-17A 및 IL-17F 모두에 대해 고 친화성 수용체라는 것과 일치한다. 반면에, hIL-17RA 재조합 셀라인은 hIL-17A에 대해서만 증진된 민감성을 가졌으며, EC50은 모 셀라인의 2.8ng/ml에 대해 0.6ng/ml이었다. hIL-17RA 재조합 셀라인에서는 hIL-17F EC50이 증진되지 않았으며, IL-17F EC50은 모 셀라인에서의 8.9ng/ml에 대해 12.4ng/ml이었다.
이 결과는 hIL-17RCx1이 IL-17A 및 hIL-17F의 활성화의 매개인자로서 구체적으로 관련되기 때문에 유의하며, hIL-17RA가 hIL-17A 활성화에 대해서만 신호화를 매개하고 hIL-17F에 대해서는 그렇지 않다는 것을 시사한다.
실시예 31
IL-17A 및 IL-17F의 정맥내 투여
다양한 시간 지점에서 BALB/c 마우스에서 일반혈액검사(complete blood counts: CBC) 및 혈청 사이토카인/케모카인에 대한 뮤린 또는 인간 IL-17A 또는 IL-17F의 정맥내 송달의 효과를 측정하기 위한 것이다.
1ug mIL-17A의 정맥내 투여는 투여 1-2시간 후 순환 호중구(CBC에 의한 것)의 약 2배 증가와 혈청 KC 및 MCP-1(Luminex에 의한 것)의 약 10배 증가를 가져왔다; 5ug hIL-17A를 사용했을 때 케모카인에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다. 또한, 2h 시간 지점에서는 1ug mIL-17A(최대 증가 나타냄), 5ug IL-17A 또는 5ug hIL-17F 처리된 마우스에서 혈액 단핵세포 수준이 유의하게 증가하였다. mIL-17F 및 hIL-17F의 정맥내 투여는 1h 및 2h 시간 지점에서 혈청 IL-15(Luminex에 의한 것)의 상당한 증가를 가져왔으며, 동일한 시간 지점에서 혈청 KC 및 MCP-1은 약간 증가하였다.
실시예 32
IL-17A 및 IL-17F의 정맥내 투여의 중화
복강내 가용성 수용체(뮤린 리간드에 대해 mIL-17RA:Fc; 인간 리간드에 대해 가용성 인간 IL-17RC)를 사용하여 사이토카인 및 케모카인의 정맥내 IL-17A 및 IL-17F-매개 증가를 중화하기 위하여, 복강내 주사에 의해 암컷 BALB/c 마우스에 PBS, 100ug mIL-17RA:Fc, 또는 100ug 가용성 인간 IL-17RC 중 하나를 투여하고, 3시간 후에 꼬리 정맥내 주사에 의해 PBS; 2ug mIL-17A, 2ug mIL-17F 중 어느 하나; 또는 mIL-17A 및 mIL-17F를 모두 2ug씩(mIL-17RA:Fc를 받은 마우스에 대해)을 제공했다. 리간드 투여 1h 후에 혈청을 채취하여 소수의 혈청 사이토카인 및 케모카인을 분석했다.
복강내 뮤린 가용성 수용체로 전처리된 마우스는 PBS + IL-17A로 처리된 마우스에 비하여 IL-17A 및 KC(CXCL1)의 혈청 농도에 있어 IL-17A-매개 증가가 현저히 감소했다(∼2-2.2배 더 낮음; p＜0.05). 복강내 인간 IL-17RC-Fc로 전처리된 마우스는, IL-15의 혈청 농도에 있어 인간 IL-17F-매개 증가가 현저히 감소했고(∼2배 더 낮음; p＜0.05); KC에 있어 IL-17A-매개 증가가 현저히 감소했고(∼30% 더 낮음; p＜0.05); KC에 있어 인간 IL-17A + IL-17F 매개 증가가 현저히 감소했고(∼25% 더 낮음; p＜0.05); IL-15에 있어 인간 IL-17F 또는 IL-17A + IL-17F 매개 증가가 현저히 감소했다(∼2배; p＜0.05).
실시예 33
가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 평판-기반 단백질 결합 분석
캡처 EIA의 포맷은 다음과 같다: ELISA 플레이트를 1㎍/ml의 염소 항 인간 IgG로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 플레이트를 웰당 1% BSA 200㎕로 실온에서 1시간 동안 세척하여 차단한다. 세척하고 가용성 수용체 변이체(A1586F, A1587F) 또는 IL17RCx1(A1034F) 희석물 시리즈(100㎍/ml에서 0.10㎍/ml까지)를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척하고 바이오틴 표지 리간드 @ 10:1(IL17A) 또는 6:1(IL17F)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척하고 스트렙토아비딘-양고추냉이(Horse Radish) 퍼옥시다제 @ 0.5㎍/ml를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척하고 4분간 TMB 기질을 첨가한다. 스탑 용액을 첨가하여 반응을 중단시킨다(주: 다른 언급이 없다면 모든 시약 부피는 웰당 50㎕이다). 높은 OD 값이 양성 결과이며, 일반적으로 0.5 이상이다. 이 결과는 이 분석에서 구조물 1342(SEQ ID NO:74)가 IL-17A과 결합하지 않고 IL-17F과는 약하게 결합한다는 것을 나타낸다. 구조물 1341(SEQ ID NO:72)은 IL-17A 및 IL-17F 모두와 매우 강하게 결합한다. IL-17RCx1은 IL-17A 및 IL-17F와 결합한다.
중화 EIA의 포맷은 다음과 같다: ELISA 플레이트를 1㎍/ml의 가용성 수용체 (A1034F)로 코팅하고 4℃에서 하룻밤 인큐베이션한다. 플레이트를 웰당 1% BSA 200㎕로 실온에서 1시간 동안 세척하여 차단한다. 차단하는 동시에 다른 플레이트에서는 바이오틴 표지된 리간드 @ 10:1(IL17A) 또는 6:1(IL17F)와 함께 가용성 수용체 변이체(A1586F, A1587F) 희석물 시리즈(50㎍/ml에서 0.05㎍/ml까지)를 동일한 부피로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 차단된 플레이트를 세척하고, 차단된 플레이트에 수용체-리간드 복합체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척하고 스트렙토아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 @ 0.5㎍/ml를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척하고 7분간 TMB 기질을 첨가한다. 스탑 용액을 첨가하여 반응을 중단시킨다(주: 다른 언급이 없다면 모든 시약 부피는 웰당 50㎕이다). 낮은 OD 값이 양성 결과이며, 일반적으로 0.5 이하이다. 이 결과는 구조물 1342(SEQ ID NO:74)가 IL17A와 IL17RCx1의 결합을 약하게 중화하고, IL 17F와 IL17RCx1의 결합을 강하게 중화한다는 것을 나타낸다. 구조물 1341(SEQ ID NO:72)은 IL17A와 IL17RCx1의 결합을 약하게 중화하고, IL17F와 IL17RCx1의 결합을 약하게 중화한다. 중화는 변이체 단백질이 바이오틴화된 리간드에 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 34
FACS 결합 분석 프로토콜
리간드 IL-17A 및 IL-17F에 결합하는 본 발명의 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC /IL-17RA 폴리펩티드의 능력을 평가하기 위해서 유세포분석-기반 경합 결합 분석을 이용했다. 리간드 IL-17A 또는 IL-17F의 존재하에 전장 IL-17RCx4로 안정하게 트랜스펙션된 BHK 셀라인과 리간드에 결합하도록 표적화된 가용성 수용체의 인큐베이션에 의해 세포 표면에 결합된 리간드를 검출하고 상대적 양을 정량할 수 있다(이에 따라 가용성 수용체에 의해 결합되지 않은 리간드도 검출 및 정량할 수 있다). 리간드의 바이오틴화에 의해서 2차 스트렙토아비딘 콘쥬게이트 형광단을 이용하는 FACS의 검출이 가능해진다. 가용성 수용체의 적정에 따른 세포 결합 리간드의 감소를 세포의 평균 형광의 감소로서 기록한다. 바이오틴화 리간드는 개별적으로 염색 배지(HBSS + 1% BSA + 0.1% NaAzide + 1OmM HEPES) 중에서 적정하는 양의 가용성 수용체와 함께 1ug/ml로 100ul 부피로 미리 혼합하여 실온에서 15분간 인큐베이션한다. Versene(Invitrogen cat.15040-066)로 재현탁하고, 2 × 105 세포/10Oul까지 평형화하고, 펠릿으로 만들어 리간드/가용성 수용체 예비-혼합물에 재현탁하여 전장 IL-17RCx4로 안정하게 트랜스펙션된 BHK 셀라인을 리간드 염색을 위해 제조한다. 염색된 세포를 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 1× 염색 배지로 세척하고, 1:100 비율로 스트랩토아비딘-PE(BD Pharmingen cat. 554061)로 염색한다. 세포를 30분간 암소에서 4℃에서 인큐베이션하고, 2× 염색 배지로 세척하고, 1:1 비율의 염색 배지와 Cytofix(BD Bioscience 554655)에 재현탁한다. BD LSRII 유세포분석기 또는 유사한 기기를 사용하여 데이터를 수집하고 분석한다. 도 5는 표준 그래프를 도시한다. 이 그래프는 Prizm 소프트웨어 프로그램을 이용하여 생성되었다. Y 값은 리간드만 있는 웰과 리간드/가용성 수용체가 없는 대조군 웰에 기초한 최대 및 최소(100% 및 0%) 값으로 정규화된 MFI를 나타내며, 따라서 리간드와 세포의 결합 퍼센트이다. 소프트웨어를 사용하여 각 곡선에서 IC50을 계산한다.
실시예 35
가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드와 바이오틴화된 인간 IL-17A 및 IL-17F의 특이적 결합의 억제
IL-17A 및 IL-17F에 결합하는 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해 사용된 결합 분석이 본원에 설명된다. SEQ ID NO:157 및 158과 같은 추가의 가용성 폴리펩티드를 결합 반응에 포함시킨 것을 제외하고는 상기 설명된 대로 결합 연구를 수행하였다. 이 가용성 폴리펩티드는 인간 IL-17A 및 IL-17F 모두와 IL-17RC 트랜스펙션된 BHK 세포의 결합을 가용성 인간 IL-17RCx1 Fc 융합 단백질(SEQ ID NO:64)와 동일한 정도로 억제하였다. SEQ ID NO:157과 158의 폴리펩티드를 포함하여, 나머지 가용성 폴리펩티드들이 하기 표 10에 포함된다.
Figure 112009064297438-PCT00008
실시예 36
IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 가용성 폴리펩티드와 IL-17A 및 IL-17F의 결합 친화성
IL-17RCx1, IL-17RA 및 가용성 IL-17RC/IL-17RA 가용성 폴리펩티드(SEQ ID No:157 및 158)을 IL-17A 및 IL-17F 모두에 대한 결합 친화성에 대해 다음과 같이 시험하였다: Gt-항-Hu IgG-Fc 특이적 항체(Jackson #109-005-008)를 pH 0.5 Na 아세테이트 중에 50ug/ml로 희석하고 CM5 Biacore 칩 상에 고정하였다. 결합 및 해리를 관찰하기 위해 각 리간드를 일련의 농도로 주입하기 전에 이론적인 결합 최대치에서 수용체를 포착하도록 프로토콜을 최적화하였다. 가용성 수용체 및 IL-17RC /IL-17RA 폴리펩티드를 일련의 농도의 각 리간드의 결합에 대해 시험하였다. 주기 사이에 pH 1.75 글리신을 2 × 30초 주사하여 표면을 재생하였다. Biacore 평가 소프트웨어를 이용하여 데이터를 평가하여 반응속도학적 값들을 규정했으며, 이것을 하기 표 11에 나타낸다.
Figure 112009064297438-PCT00009
이들 데이터는 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F와 인간 IL-17RA 및 인간 IL-17RC의 결합을 나타낸다. 구체적으로, 인간 IL-17RC는 인간 IL-17A 및 IL-17F 모두에 대해 유사한 결합 친화성을 나타내며, 400 피코몰(pM) 범위의 해리평형상수(KD)를 가진다. 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 인간 IL-17F, KD 약 140pM보다 약간 더 높은 친화성, KD 약 40pM으로 인간 IL-17A와 결합했다. 인간 IL-17RA는 리간드 친화성에 있어서 최대로 불일치했으며, 인간 IL-17A, KD 약 300pM과 인간 IL-17F, KD 약 30 나노몰(nM) 결합 사이에는 100배의 차이가 있었다.
실시예 37
재조합 인간 IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 및 IL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 리포터 분석 셀라인의 제조
본원에 설명된 뮤린 NIH3T3/KZ142.8 리포터 셀라인을 사용하여 인간 IL-17RA (SEQ ID NO:21) 또는 IL-17RCx4(SEQ ID NO:166) 중 어느 하나에 대한 재조합체로서 새로운 분석 셀라인을 만들었다. 이것은 이들 cDNA를 각각 함유하는 발현 구조물로 이들 세포를 트랜스펙션함으로써 달성되었다. 이용된 발현 벡터는 pzmp11이며, 이것은 디히드로폴레이트 환원효소 유전자를 함유한다. 따라서, 트랜스펙션체를 1uM 메토트렉세이트 변성된 성장배지를 사용하여 선별하여 안정한 풀을 만들었다. 이들 분석 셀라인을 hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 및 hIL-17RCX4/NIE3T3/KZ142.8로 명명했다.
실시예 38
가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 재조합 인간 IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 세포의 인간 IL-17A 활성화를 길항한다
재조합 hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 세포의 인간 IL-17A 활성화에 대한 가용성 IL-17RC/IL-17RA 가용성 폴리펩티드(SEQ ID No:157 및 158) 경합의 효능을 다음과 같이 측정하였다: 루시페라제 분석을 위한 세포 평판 및 제조는 본원에 설명된 것과 동일했다. 분석일에 이들 세포는 2ug/ml에서 시작하여 상기 가용성 폴리펩티드 IL-17RA 및 IL-17RC를 포함하는 최종 농도의 2배로 가용성 수용체 1 부피의 2배 용량을 3회 최초로 받았다(이것은 일단 리간드와 조합되어 1ug/ml 최종 농도로 된다). 다음날, 한 부피의 IL-17A를 1ng/ml로 적용하였는데, 이것은 수용체-리간드를 함께 혼합한 것으로부터의 결과인 최종 농도 0.5ng/ml의 2배이다. 수용체 없이 IL-17A를 0.5ng/ml씩 받는 3회 세트를 사용하여 최대 활성화를 측정하였다. 리간드와 가용성 수용체를 함유하지 않는 분석 배지만을 받는 3회 세트를 사용하여 기초 활성화를 측정하였다. 데이터 분석에 의해서 가용성 폴리펩티드에 의한 상기 셀라인의 IL-17A 활성화에 대한 IC50이 7ng/ml임이 밝혀졌다. 1ug/ml 가용성 수용체의 최고 용량을 사용했을 때도 이 셀라인의 0.5ng/ml IL-17A 활성화를 길항할 만큼의 가용성 IL-17RA 또는 IL-17RC의 충분한 효능은 없었다.
실시예 39
가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 재조합 인간 IL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 세포의 인간 IL-17F 활성화를 길항한다
재조합 hIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8 세포의 인간 IL-17F 활성화에 대한 가용성 IL-17RC/IL-17RA 가용성 폴리펩티드(SEQ ID No:157 및 158) 경합의 효능을 다음과 같이 측정하였다: 루시페라제 분석을 위한 세포 평판 및 제조는 본원에 설명된 것과 동일했다. 분석일에 이들 세포는 4ug/ml에서 시작하여 상기 가용성 폴리펩티드 IL-17RA 및 IL-17RC를 포함하는 최종 농도의 2배로 가용성 수용체 1 부피의 2배 용량을 3회 최초로 받았다(이것은 일단 리간드와 조합되어 2ug/ml 최종 농도로 된다). 다음날, 한 부피의 IL-17F를 40ng/ml로 적용하였는데, 이것은 수용체-리간드를 함께 혼합한 것으로부터의 결과인 20ng/ml의 최종 농도의 2배이다. 수용체 없이 IL-17F를 20ng/ml씩 받는 3회 세트를 사용하여 최대 활성화를 측정하였다. 리간드와 가용성 수용체를 함유하지 않는 분석 배지만을 받는 3회 세트를 사용하여 기초 활성화를 측정하였다. 데이터 분석에 의해서 IL-17RC/IL-17RA 가용성 폴리펩티드에 의한 상기 셀라인의 IL-17F 활성화에 대한 IC50이 0.48ug/ml임이 밝혀졌다. 2ug/ml 가용성 수용체의 최고 용량을 사용했을 때도 이 셀라인의 20ng/ml IL-17F 활성화를 길항할 만큼의 가용성 IL-17RA 또는 IL-17RC의 충분한 효능은 없었다.
실시예 40
가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 재조합 인간 IL-17RCx4/NIH3T3/KZ142. 8 세포의 인간 IL-17F 활성화를 길항한다
재조합 hIL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 세포(상기 설명된)의 인간 IL-17F 활성화에 대한 가용성 IL-17RC/IL-17RA 가용성 폴리펩티드(SEQ ID No:157 및 158) 경합의 효능을 다음과 같이 측정하였다: 루시페라제 분석을 위한 세포 평판 및 제조는 본원에 설명된 것과 동일했다. 분석일에 이들 세포는 4ug/ml에서 시작하여 상기 가용성 폴리펩티드 IL-17RA 및 IL-17RC를 포함하는 최종 농도의 2배로 가용성 수용체 1 부피의 5배 용량을 3회 최초로 받았다(이것은 일단 리간드와 조합되어 2ug/ml 최종 농도로 된다). 다음날, 한 부피의 IL-17F lot A1275F를 2ng/ml로 적용하였는데, 이것은 수용체-리간드를 함께 혼합한 것으로부터의 결과인 1ng/ml의 최종 농도의 2배이다. 수용체 없이 IL-17F를 1ng/ml씩 받는 3회 세트를 사용하여 최대 활성화를 측정하였다. 리간드와 가용성 수용체를 함유하지 않는 분석 배지만을 받는 3회 세트를 사용하여 기초 활성화를 측정하였다. 데이터 분석에 의해서 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 IL-17F 활성화에 대한 IL50이 0.8ug/ml이고, IL-17RC는 6ug/ml이고, IL-17RA는 어떤 용량에서도 길항작용이 없다는 것이 밝혀졌다.
실시예 41
가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드는 G-CSF, IL-6 및 IL-8의 인간 IL-17A 및 IL-17F 유도의 활성을 중화한다
인간 소기도 상피세포(SAEC)를 인간 IL-17A 또는 인간 IL-17F로 처리하고 48시간 상청액을 수거했다. 이들 상청액을 분석했으며, 하기 표 12에 나타낸 대로, G-CSF, IL-6, 및 IL-8의 용량-의존적 유도를 나타냈다.
Figure 112009064297438-PCT00010
또한, SAEC를 10ng/ml 인간 IL-17A 또는 50ng/ml 인간 IL-17F와 조합하여 가용성 IL-17RC/TL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:157 및 158)의 0.01 - 10ug/ml 용량으로 처리했고(리간드와 가용성 폴리펩티드는 모두 37℃에서 30분간 함께 인큐베이션한 후 세포에 첨가했다), 48시간 상청액을 수거했다. 하기 표 13에 나타낸 대로, 이들 상청액은 감소된 G-CSF, IL-6, 및 IL-8을 나타냈으며, 이것은 가용성 IL-17RC /IL-17RA 폴리펩티드가 이들 사이토카인의 인간 IL-17A 및 인간 IL-17F 유도의 활성을 효과적으로 중화할 수 있음을 나타낸다. 주목할 점은 IL-6 중화에 대해서는 IC50 값이 측정될 수 없었다는 것인데, 이는 시험된 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 최저 용량(0.01ug/ml)에서 중화가 최대값의 약 50%까지만 회복되었기 때문이다.
Figure 112009064297438-PCT00011
실시예 42
인간 다발성 경화증 샘플에서 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 효능
다발성 경화증(MS)은 CNS 전체적으로 림프구 세포 및 단핵세포 염증 침윤병소 및 수초탈락의 존재를 포함하여, 다수의 인자들에 의해 매개된다고 생각되는 복잡한 질환이다. 소교세포는 중추신경계(CNS)에 집락을 이루고 있는 대식세포-유형 세포이며, 상처 또는 감염에 의해 활성화된다. 소교세포 및 신경세포는 MS를 포함하는 다양한 CNS 질환에서 중요한 역할을 함으로써 연루되며, 질환의 개시, 진행 및 치료요법의 메커니즘을 연구하는데 사용될 수 있다(Nagai et al. Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001; Olson et al. J Neurosci Methods 128:33-43; 2003; Giuliani et al. J Neuroimmunol 165: 83 - 91; 2005). 일차 신경세포 배양물, 불멸화된 인간 소교세포 셀라인 및/또는 확립된 인간 성상아교세포 셀라인을 사용하여 이들 세포 타입에 대한 염증 매개인자의 효과들 중의 일부와 이들의 중화 잠재력을 연구할 수 있다. 염증 매개인자(제한은 없지만 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, MIP 패밀리 구성원, RANTES, IP-10, MCP-1, G- 및 GM-CSF 등을 포함한다)는 염증 경로 및 하류 이펙터 세포의 활성화에 영향(들)을 미치는 방식으로 MS와 관련된 증상 및 병리학에 기여할 수 있다.
이들 세포 타입에 대한 IL-17A 및 IL-17F의 전-염증성 작용, 및 이들 효과를 중화 또는 감소시키는 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)과 같은, 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 능력을 평가하기 위해서 배양된 신경세포 및 아교세포를 다음 중 하나로 처리한다: 비히클; rhIL-17A; rhIL-17F; rhIL-17A+IL-17F. 추가하여, 이들을 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)과 같은, 본 발명의 가용성 폴리펩티드로 또는 이것 없이 처리한다. 별도의 배양물 세트에서, 인간 피험체로부터 분리되어 항-CD3로 활성화된 순환 T 세포를 외인성 IL-17A 또는 IL-17F의 부재하에 배양된 신경세포 및 아교세포에 첨가하며, 이로써 이들 세포 타입에 대한 활성화된 T 세포의 파괴효과를 조사하기 위한 공-배양 방법이 제공된다. T 세포를 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드 (SEQ ID NO:158)와 같은 본 발명의 가용성 폴리펩티드로 또는 이것 없이 처리한다. 다양한 배양 시간 후(1h에서 수일까지), 상청액 및 세포를 수거하여 상기 열거된 것들을 포함하는 염증 매개인자의 수준 및/또는 발현을 분석하고, 세포 생존에 대해 분석한다. 비히클만으로 처리된 배양물과 비교하여 rhIL-17A 및/또는 IL-17F의 존재하에서는 염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준, 및 신경세포 사멸 수준이 상승된다. 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)와 같은 본 발명의 가용성 수용체의 첨가는 염증 매개인자의 생성 및 발현을 현저히 감소시키고, 신경세포에서 생존 세포를 증가시킨다.
따라서, 이들 생체외 실험이 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO: 158)와 같은 본 발명의 가용성 폴리펩티드가 인간 MS의 병리생리학과 관련된 파괴 및 염증 작용을 감소시킬 수 있음을 나타냈기 때문에, 이러한 가용성 폴리펩티드를 사용한 치료가 인간 MS와 관련된 염증 양태, 신경세포 사멸 및/또는 수초탈락을 줄이는데 효과적일 수 있다고 기대된다.
실시예 43
인간 류마티스 관절염("RA") 및 골관절염("OA") 샘플에서 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 효능
이 모델은 인간 윤활액 배양물(윤활액 대식세포, 윤활액 섬유아세포, 및 관절연골세포를 포함하는) 및 RA 및 OA를 가진 환자로부터의 외식물이 건강한 대조군으로부터의 배양물/외식물과 비교하여 높은 수준의 염증 매개인자를 생성하며, 이것이 차례로 세포외 바탕질 성분(예를 들어, 뼈, 연골 등)의 퇴화에 기여할 수 있어 질환의 원인이 될 수 있을 나타내도록 설계된다. 추가하여, 하기 설명된 공-배양 모델은 RA/OA 윤활액 및/또는 활성화 T 세포에 존재하는 염증 매개인자 또한 더 많은 염증 및 바탕질 퇴화를 야기하도록 설계된다.
염증 매개인자(제한은 없지만 온코스타틴 M, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IP-10, RANTES, RANKL, MIP 패밀리 구성원, MCP-1, G- 및 GM-CSF, 산화질소 등을 포함한다)의 이런 증진된 생성은 염증 경로 및 하류 이펙터 세포의 활성화에 영향(들)을 미치는 방식으로 RA 및 OA와 관련된 증상 및 병리학에 기여한다. 다음에, 이들 경로 및 성분들이 염증 침윤병소, 연골 및 바탕질 상실/파괴, 골 상실, 및 프로스타글란딘 및 시클로옥시게나제의 상향조절을 이끈다. 따라서, 이 모델은 시험관내 및 생체외 실험에서 RA 및 OA의 파괴적 염증 양태를 모사할 수 있다. 더욱이, 건강한 대조군으로부터의 이식물 및 윤활액 배양물이 외래 추가된 염증 성분(예를 들어, 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A 및 F, IL-15 등)의 존재하에 배양되었을 때나, 또는 달리 RA 환자(내적으로 염증 성분을 함유하는)로부터의 윤활액의 존재하에 배양되었을 때는, 염증 및 파괴 경로 신호화가 관찰될 수 있다. 생체내 인간 RA에서 효과적일 수 있는 치료제는 염증 매개인자의 생성 및/또는 존재를 억제 및/또는 중화함으로써 상기 시험관내 및 생체외 모델에서 작용할 것이다.
이 모델에서는 인간 윤활액 외식물을 RA, OA를 가진 환자로부터, 또는 관절대체술을 겪은 건강한 대조군으로부터, 또는 부검용 조직 수거물로부터 수거하고, Wooley and Tetlow(Arthritis Res 2:65-70;2000) 및 van't Hof et al(Rheumatology 39: 1004-1008; 2000)의 변형을 사용하여 처리한다. 또한, 윤활액 섬유아세포, 윤활액 대식세포 및 관절연골세포의 배양물을 연구한다. 복제한 샘플을 다음 중 하나로 처리한다: 비히클(PBS); 재조합 인간(rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A + rhIL-17F. 일부 샘플은 온코스타틴 M, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-17F 및IL-15의 다양한 조합을 함유한다. 별도의 샘플 세트를 활성화 인간 T 세포, 또는 건강한 대조군 또는 RA 또는 OA를 가진 환자로부터의 윤활액으로 처리한다. 추가하여, 이들 샘플을 모두 가용성 IL-17RC 폴리펩티드 또는 가용성 IL-17RC/IL17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)과 같은 본 발명의 가용성 폴리펩티드로 또는 이것 없이 처리한다. 다양한 시간 배양한 후(1h에서 수일까지), 상청액 및 세포를 수거하여 상기 열거된 것들을 포함하여, 염증 매개인자 및 연골/뼈/바탕질 생물마커의 수준을 분석한다. RA 또는 OA를 가진 환자의 샘플에서, 또는 RA/OA 윤활액, 활성화 T 세포, rhIL-17A 및/또는 rhIL-17F(단독으로 또는 다른 염증성 사이토카인과 조합하여)로 처리된 샘플에서는 미처리 건강한 대조군 외식물 또는 미처리 세포 배양물과 비교하여 염증성 사이토카인 및 케모카인 및 연골/뼈/바탕질 퇴화 마커의 수준이 상승된다. 본 발명의 가용성 수용체의 첨가는 염증 및 연골/뼈/바탕질 퇴화 매개인자의 생성을 현저히 감소시키며, 따라서 인간 RA 및 OA에서 효과적일 것으로 기대된다.
실시예 44
점막 생검 배양물을 통한 인간 염증성 장 질환("IBD") 샘플에서 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 효능
이들 모델은 IBD를 가진 환자로부터의 배양된 장 조직이 건강한 대조군의 조직과 비교하여 높은 수준의 염증 매개인자를 생성함을 나타내도록 설계된다. 염증 매개인자(제한은 없지만 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, MIP 패밀리 구성원, MCP-1, G- 및 GM-CSF 등을 포함한다)의 이런 증진된 생성은 염증 경로 및 하류 이펙터 세포의 활성화에 영향(들)을 미치는 방식으로 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC) 같은 EBD에 관련된 증상 및 병리학에 기여한다. 다음에, 이들 경로 및 성분들이 생체내에서 관찰되는 조직 및 세포 손상/파괴를 이끈다. 따라서, 이 모델은 EBC의 이런 증진된 염증 매개인자 양태를 모사할 수 있다. 더욱이, 건강한 대조군 또는 인간 장 상피세포(EEC) 셀라인으로부터의 장 조직이 이들 염증 성분의 존재하에 배양되었을 때는, 염증 경로 신호화와 조직 및 세포 손상의 증거가 관찰될 수 있다.
생체내에서 인간 IBD에 효과적인 치료제는 염증 매개인자의 생산 및/또는 존재를 억제 및/또는 중화함으로써 상기 생체외 또는 IEC 모델에서 작동할 것이다.
이 모델에서, 장 생검을 겪은 IBD를 가진 환자 또는 건강한 대조군으로부터 인간 장 조직을 수거하여 재절편화하거나, 또는 부검용 조직 수거물로부터 재절편화하고, alexakis et al(Gut 53:85-90; 2004)의 변형을 사용하여 처리한다. 무균 조건하에서, 샘플을 다량의 PBS로 부드럽게 세정한 다음, 완전 조직배양 배지(세균의 과성장을 방지하기 위해 항생제를 더한)의 존재하에 조직의 저민 절편을 배양한다. 동일한 저민 조직 풀로부터의 샘플을 다음 중 하나로 처리한다: 비히클(PBS); 재조합 인간(rh) IL-17A; rhIL-17F; 또는 rhIL-17A + rhIL-17F. 추가하여, 이들을 가용성 IL-17RC 폴리펩티드 또는 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO: 158)과 같은 본 발명의 가용성 폴리펩티드로 또는 이것 없이 처리한다. 이 실험 프로토콜은 세포를 기존의 스톡 용액으로부터 계대한다는 것을 제외하고는 인간 IEC 셀라인을 사용한 연구를 따른다. 다양한 배양 시간 후(1h에서 수일까지), 상청액을 수거하여 상기 열거된 것들을 포함하는 염증 매개인자의 수준을 분석한다. IBD를 가진 환자로부터의 샘플 또는 rhIL-17A 및/또는 F로 처리된 샘플에서는 염증성 사이토카인 및 케모카인의 수준이 처리되지 않은 건강한 대조군 조직 샘플에 비하여 상승된다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 첨가는 염증 매개인자의 생성을 현저히 감소시키며, 따라서 인간 IBD에 효과적일 것으로 기대된다.
이 연구의 추가의 목적은 효과적인 치료를 경험한 IBD 환자와 현재 의약을 복용하지 않거나 치료에 대해 무반응자로서 생각되는 환자의 조직 생검으로부터 염증 매개인자 생성의 비교를 포함할 수 있다.
실시예 45
상피 장벽 기능을 통한 인간 IBD 샘플에서 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 효능
상피 장벽 완전성의 유지는 건강한 위장관의 보존에 있어 중요한 인자이다. 실험적인 증거에 의해 소화관에서 상피 장벽의 누출이 IBD의 발생에 기여할 수 있음이 뒷받침된다. 장 고유판에 위치한 면역세포는 일반적으로 세포 대 세포 접촉 또는 가용성 인자들의 생성을 통해 장 상피세포와 상호작용함으로써 면역감시를 유지하고 상피 장벽 완전성에 기여한다. 그렇지만, 연장된 또는 불규칙한 면역-매개 염증이 상피 장벽세포 완전성 및 기능의 결함에 기여할 수 있다. 다음 연구는 상피 장벽 완전성에 대한 T 세포-유도 IL-17A 및/또는 IL-17F의 직접적인 효과(들)를 측정하도록 설계된다.
이 실시예에서는 Caco-2 세포와 같은 장 상피 셀라인을 반투과 막 상에서 분화시키고 IBD 환자 또는 정상 개체의 생검으로부터 유래하는 T 세포 또는 단핵세포와 함께 아래옆 측 상에서 공-배양한다. 경상피 전기저항 또는 염료 확산에 대한 단층의 저항성을 평가하여 상피 단층 완전성을 시간에 걸쳐 모니터한다. 공-배양물에서 단층의 경상피 저항의 감소는 공-배양물 내 T 세포 또는 단핵세포의 활성에 의해 유도된 단층의 파괴를 시사한다. 가용성 IL-17RC 폴리펩티드 또는 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)과 같은 본 발명의 가용성 폴리펩티드와 같은 IL-17A 및 IL-17F의 억제제를 사용하여 상피 단층 파괴에 대한 IL-17A 및 IL-17F의 상대적 기여를 측정할 수 있으며, IL-17A 및 IL-17F의 억제제가 상피 장벽 완전성을 유지하는데 효과적인지를 시험할 수 있다. 이러한 분자에 의한 활성화 T 세포에 의해 유도되는 상피 단층 파괴의 예방은 본 발명의 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드가 인간에서 IBD의 치료학적 치료에 효과적일 수 있음을 시사한다.
또한, 공-배양 시스템은 IBD 환자로부터의 일차 상피에 의해 형성된 단층을 사용하여 생성될 수도 있으며, 이로써 이들 세포가 건강한 개체로부터 유래하는 상피세포에 비하여 IL-17A 및 IL-17F에 더 민감한지를 판정할 수 있다. 만일 그렇다면, 이들 데이터는 IL-17A 및 IL-17F를 억제하는 것이 IBD의 치료학적 치료를 위한 적합한 전략이 될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 46
정상 및 인간 IBD 샘플로부터의 고유판 T 세포 및 단핵세포/대식세포에 대한 IL-17A 및 IL-17F의 효과
불규칙한 또는 지속적인 면역-매개 염증이 부적합한 또는 연장된 면역반응에 따른 조직 손상 또는 영구적인 왜곡의 방식으로 IBD에 관련된 증상 및 병리학에 기여할 수 있다. 이 모델은 장 조직의 인접한 환경의 사이토카인 환경에서 존재할 수 있는 IL-17A 및 IL-17F에 질환-관련 T 세포 및 단핵세포를 노출하는 것에 따른 잠재적인 하류 결과를 측정할 수 있다.
생체내에서 인간 IBD에 효과적일 수 있는 치료제는 염증 매개인자(제한은 없지만 IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A 및 F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, MIP 패밀리 구성원, MCP-1, G- 및 GM-CSF 등을 포함한다)의 생성 및/또는 존재를 억제 및/또는 중화함으로써 상기 생체외 모델에서 작용할 것이다.
이 모델에서, T 세포 및 단핵세포/대식세포를 HBSS 중에서 생검조직을 가위로 주의 깊게 저며서 생검 샘플로부터 분리하고, 콜라게나제 및 디스파제 II로 처리한 다음, 쉐이커에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 여과하여 파편 및 세포 덩어리를 제거하고, HBSS 중에서 여러 번 세척한다. T 세포 및 대식세포/단핵세포는 직접 세포정렬법 또는 비드-고갈/부화 프로토콜을 사용하여 분리할 수 있다. 분리된 세포를 IL-17A 및 IL-17F의 존재하에 인큐베이션한다. 이것은 T 세포 및 단핵세포/대식세포에 의한 염증 매개인자의 생성을 유도하며, 높은 전-염증성 반응에 따른 이후의 T 세포 반응을 왜곡한다. IBD 환자의 세포에 의해 생성된 염증 매개인자 타입과 정상 개체의 세포로부터 생성된 염증 매개인자를 비교하였으며, 이것은 IBD 환자로부터의 T 세포 및 단핵세포/대식세포가 IL-17A 및 IL-17F의 존재하에 더 많은 전-염증성 프로파일을 생성한다는 것을 시사한다. IL-17A 및 IL-17F에 의해 유도되는 하류 염증성 매개인자의 생성을 중화할 수 있는 가용성 IL-17RC 폴리펩티드 또는 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)과 같은, 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 첨가는 이러한 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드가 IBD를 가진 환자의 치료학적 치료에 효과적일 수 있음을 시사한다.
실시예 47
자극성 장 증후군("IBS")에서 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 효능: CNS-관련 병리학
스트레스 자극을 사용하여 IBS의 특징적인 증상을 유도하는 IBS의 일차 CNS-관련 병리학에 초점을 둔 모델이다. 신생아 심리학적 스트레스 모델이 IBS 환자에 관련된 어떤 임상적 특징을 모사하는데, 여기에는 내장 통각과민, 설사 및 스트레스-과민성이 포함된다. 생후 4-18일 동안 매일 180분간 어미로부터 새끼를 분리하는 것은 어미의 행동에 변화를 가져올 것이며, 핥는 것/돌보는 것의 행동 시간을 상당히 줄일 것이다. 신생아에 대한 스트레스는 CNS에 영구적인 변화를 가져오며, 그 결과 변경된 스트레스-유도 내장 및 신체적 통증 과민성이 초래된다. 스트레스에 반응하는 결장 운동 기능이 이들 동물에서 증진되며, 예비 데이터는 증가된 장 투과성의 증거를 나타낸다(Mayer et al., 2002). 가용성 IL-17RC 폴리펩티드 또는 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)과 같은 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 사용한 치료 및 후속하여 결장 운동 기능, 상피 투과성 및 스트레스 자극 반응의 분석에 의해 이 IBS 동물 모델에서의 효능을 측정할 수 있다. 이들 억제제로 치료한 후 증상 발생의 감소는 IBS 치료에서의 잠재적인 효능을 시사한다.
실시예 48
자극성 장 증후군("IBS")에서 가용성 IL-17RC 및 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드의 효능: 일차 소화관-관련 스트레스 유도인자
이것은 일차 소화관-관련 스트레스 유도인자(즉, 소화관 염증, 감염 또는 신체적인 스트레스)에 초점을 둔 모델이다. 동물 연구는 낮은 등급의 염증 또는 면역 활성화가 변화된 운동성, 및/또는 소화관의 수입 및 상피 기능에 대한 기초일 수 있음을 나타낸다(Mayer et al,. 2002). 이 모델에서는 머스터드 오일을 매일 결장내 주사하는 형태로 신생아 동물(8-12일)에서 매일 결장을 자극한다. 머스터드 오일은 중성 자극제이며, 결장내 투여 후 내장 통각과민을 유도하는 것으로 알려졌다. 이 모델은 IBS의 중요한 특징을 모사하는데, 여기에는 내장 과민성 및 장 습관의 변화가 포함된다. 또한, 동물은 IBS 환자의 중요한 특징인 설사 또는 변비가 있다(Mayer et al., 2002; Kimball et al., 2005). 가용성 IL-17RC 폴리펩티드 또는 가용성 IL-17RC/IL-17RA 폴리펩티드(SEQ ID NO:158)와 같은, 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 송달하여 이 모델과 관련된 증상의 발생에 있어서의 변화를 측정할 수 있다. 본 발명의 억제제를 사용한 치료 후, 내장 과민성의 발생 및 크기의 감소 및 변화된 소화관 운동성의 감소는 이들 분자가 IBS의 치료에서 효과적일 수 있음을 시사한다.
실시예 49
가용성 IL-17A 및 IL-17F 길항제를 위한 단계적 단백질 생성 과정의 설계
가용성 형태의 IL-17RC에 대한 단계적 단백질 생성 과정을 개발하는데 초점을 둔 전략을 설계하는데 있어서, 조건 배지에서 높은 수준의 단백질 농도를 허용하는 발현 시스템을 확인하는데 있어서 많은 어려움에 직면했었다. 웨스턴 블롯 분석은 세포에 축적한 단백질에 관해 낮은 수준의 단백질 분비를 나타냈다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 개발에 있어서, 70개 이상의 상이한 발현 구성물을 설계하고 생성하여, BHK 세포, CHO 세포, 또는 HEK 293 세포에서의 발현에 대해 시험했다. 몇몇은 하나 이상의 숙주 셀라인에서 시험하였다. 시험된 가용성 IL-17RC 발현 카세트의 변형들은 다음을 포함했다:
1) 대체가능한 신호 서열, 예를 들어 a) 자생; b) otPA; c) 마우스 면역글로불린 중쇄 가변영역; d) 인간 성장 호르몬 ; e) 마우스 IL-17RA.
2) 2개의 상이한 자연발생 스플라이스 변이체(IL-17RCx1, SEQ ID NO:2; 및 IL-17RCx4, SEQ ID NO:166).
3) IL-17RC 세포외 도메인(ECD)와 Fc 부분 사이에 링커 서열의 추가, 예를 들어 a) 링커 없음; b) GlyGlyGlySer 기초 9개 아미노산 링커; 및 c) GlyGlyGlySer 기초 20개 아미노산 링커.
4) His 태크 모노머 형태.
5) 양쪽 아미노- 및 카르복실-말단 Fc 융합 단백질.
6) N-연결 탄수화물 부착 부위의 제거
7) Asn 아미노산 치환을 위한 Gln.
8) IL-17RA와 IL-17RC 사이의 하이브리드 융합 단백질.
가용성 IL-17RC 변이체 발현 구조물은 모두 HEK 293 세포에서 일시적 트랜스펙션에 의한 단백질 발현에 대해 시험하였다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여, 세포 용해물을 샘플링하여 세포에 보유된 단백질에 비하여 조건 배지로 분비된 단백질을 검출하였다. 대부분의 구조물은 웨스턴 블롯에 의해서 겨우 검출되는 정도로 조건 배지로 분비된 단백질을 발현하였다. 추가하여, 조건 배지 샘플과 비교하여 세포 용해물 샘플로부터의 신호가 더 컸으며, 이는 단백질이 효과적으로 분비되는 능력이 없음을 나타낸다. 조건 배지에서 최고 신호를 야기한 발현 구조물을 사용하여 안정한 CHO 세포 풀을 트랜스펙션했다. 안정한 CHO 풀로부터 단백질 역가를 측정하고, 가능한 경우 정제된 단백질을 세포 기반 경합 결합 분석에서 IL-17A 및 IL-17F 결합에 대해 분석했다. 다음의 표는 단백질 발현이 CHO 세포 안정한 풀에 있는 최고의 발현 구조물로부터의 결과임을 나타낸다. 절대 단백질 농도 기준이 검출 수준 이하였을 경우, 단백질 역가는 < 0.5mg/mL로 나타낸다.
IL-17RC 및 IL-17RC/RA 단백질 발현 구조물 번호 지정, 포함된 엑손에 대한 간단한 설명, 안정하게 트랜스펙션된 CHO 세포 풀로부터의 단백질 역가, 및 IL-17A 및 IL-17F 결합 능력. 표 14에 포함된 변이체 서열은 모두 본원에 포함된다.
Figure 112009064297438-PCT00012
실시예 50
IL-17RA/RC-Fc5의 아미노 말단 서열의 결정
단백질 발현: IL-17RA/RC-Fc5을 암호화하는 DNA(SEQ ID NO: 158의 아미노산을 암호화하는 SEQ ID NO: 157)를 함유하는 발현 구조물을 CHO DXB-11 세포에 트랜스펙션시켰다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 조건 배지 채집물로부터 IL-17RA/RC-Fc5 단백질을 정제한 후, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 수행하였다.
N-말단 아미노산 서열 분석: Applied Biosystems사의 시약을 이용하여 표준 자동 N-말단 폴리펩티드 서열분석(Edman 분해)을 수행하였다. N-말단 서열분석은 모델 494 단백질 시퀀서 시스템(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)으로 수행하였다. 데이터 분석은 SequencePro 단백질 시퀀싱 분석 소프트웨어, 버전 2.0 (Applied Biosystems)로 수행하였다. 사전 사이클링된 필터위에 샘플 100피코몰(pmol)을 로딩하여 샘플을 준비하였다.
IL-17RA/RC-Fc5 샘플의 N-말단 서열분석 결과, L33(루이신)에서 시작하는 서열을 얻었다.
실시예 51
뮤린 대체 분자인 가용성 뮤린 IL-17RA-Fc에 의한 옥사잘론 대장염(Oxazalone Colitis)의 치료
하기 옥사잘론 대장염 연구는, 암컷 C57BL/10 마우스(∼20g)에서 수행되었다. 마우스를 -5일째에 피부의 옥사졸론(oxazolone)(100% 에탄올 중의 3%)으로 민감화한 후, 0일째에 50% 에탄올 중의 1.25% 옥사졸론으로 직장내 챌린지하였다. 마우스는 다음 2-3일 동안 급성 대장염을 일으키고, 2일째에 일반적인 방법으로 질식사시켜 조직을 채취한다.
가용성 뮤린(m) IL-17RA-Fc의 처리가 인간의 궤양성 대장염과 유사한 뮤린 옥사졸론 유도 대장염에서 효과가 있는지를 결정하기 위하여, 두가지의 독립된 옥사잘론 대장염 연구를 수행하였다. mIL-17RA-Fc 단백질은 뮤린 IL-17A 및 IL-17F 모두를 중화할 수 있기 때문에, 본원에 설명된 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질에 대해 적합한 대체물이며, 상기 중화는 인간 IL-17A 및 IL-17F에 결합할 수 있는 인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC의 특징과 유사하다.
첫번째 연구 결과, mIL-17RA-Fc로 처리하면 PBS로 처리한 옥사잘론 마우스에 대한 질환 인덱스 스코어(체중감량, 스툴 농도(stool consistency) 및 스툴내 혈액을 포함)에 있어서 2배까지 유의있게 감소함(p < 0.05)을 알 수 있었다. 치료제는 옥사잘론 대장염 모델의 -6일째 또는 -1일째부터 1일째까지 100μg씩 매일 복강내 투여하였다. 또한, PBS로 처리한 옥사잘론 대장염 마우스에 비하여, mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스 군은 조직학적인 스코어가 약간 향상되었고, 중증 대장염-유도 결장 쇼트닝이 덜 일어났다.
두번째 연구에서, 마우스를 이 모델의 -6일째부터 1일째 까지 PBS 또는 mIL-17RA-Fc(100μg, i.p.)로 매일 처리하였고, 적합한 옥사잘론-비히클 대조군(에탄올만)도 포함시켰다. 또한, mIL-17RA-Fc가 본 모델의 현 단계에 영향을 미치는지 평가하기 위하여, 마우스군을 챌린지 후 7일동안 대장염에서 회복되도록 하였다. 그 결과, 본 모델의 -6일째부터 1일째 까지 매일 가용성 뮤린 IL-17RA-Fc1 치료제를 투여하면 질환 인덱스 스코어가 3배까지 유의있게 감소(p<0.05)함을 알 수 있었다. PBS 처리 마우스(마우스의 75%)에 비하여 mIL-17RA-Fc1로 처리한 옥사잘론 마우스(마우스의 37.5%)에서, 2일째에 눈에띄는 손상의 발생이 감소하였다. 또한, PBS로 처리한 옥사잘론 대장염 마우스에 비하여, mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스 군은 조직학적인 스코어가 향상되었고, 중증 대장염-유도 결장 쇼트닝이 덜 일어났다(p< 0.05). 7일째 회복군 간에는 차이가 없었는데, 모든 마우스가 이 시점까지는 모두 회복되기 때문이다. 이 모델의 2일째에 옥사잘론 마우스에서 얻어진 결장 배양물에서(37℃, 24시간 동안 결장 단편을 배양), 평가된 모든 염증 사이토카인/케모카인은 비히클(에탄올) 마우스에 비하여 증가하였다. 옥사잘론 마우스를 mIL-17RA-Fc로 처리한 결과, PBS 처리된 옥사졸론 마우스의 수준에 비하여 결장에서 IL-17A, IL-17F, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-12, GM-CSF 및 IFN-γ의 생성이 더 낮아졌다. 결장 IL-17A 및 IL-17F의 농도는 서로 상당히 관련있었다(R=0.93; p < 0.000001). IL-17A 및 IL-17F의 농도는, TNF-α(R=0.91 및 0.95; p < 0.0000001), IL-1β(모두에 대해 R=0.64 ; p < 0.01); IFN-γ(R=0.71 및 0.72; p < 0.01) 및 IL-6(모두에 대해 R=0.57; p < 0.05)의 수준과 상당히 관련있었다. 질병 인덱스 스코어는 결장의 IL-17A(R=0.70; p < 0.01), IL-17F(R=0.72; p < 0.01), TNF-α(R=0.76; p < 0.001), IL-4(R=0.59; p < 0.05); IL-1β(R=0.50; p < 0.05); 및 IFN-γ(R=0.52; p < 0.05)의 생성과 상관관계가 있었다.
요약하면, 본원에 설명된 인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질에 대한 대체물(예, mIL-17RA-Fc)로 처리하면 대장염 질환 증상을 감소시키고, 결장의 염증 사이토카인의 생성을 감소시켜 병리현상을 향상시킨다. 이러한 결과는 본원에 설명된 인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질의 사용이 인간 IBD의 치료에 효과적임을 나타낸다.
실시예 52
뮤린 질환 모델에서 마우스 IL-17F 과발현의 효과
본원에 설명된 방법(Production of Transgenic Mice, Section (K) 참조)을 사용하여, 조혈 세포-특이 프로모터(EuLck 프로모터)의 조절하에 있는 IL-17F 유전자를 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 제조한다.
IL-17F 트랜스제닉 마우스에서 IL-17F에 대한 혈청 IL-17A의 비는 인간과 유사하다: 인하우스 개발된 루미넥스 분석에 의해 측정한 결과, EuLck 프로모터로 뮤린 IL-17F을 과발현시킨 마우스는 야생형 마우스에서 발견되는 수준(검출 불가능 수준)에 비하여 IL-17F의 혈청 수준이 현저히 증가(약 2ng/mL)하였음이 관찰되었다. IL-17A의 혈청 수준은 IL-17F 트랜스제닉 마우스에서의 IL-17F 수준보다 약 10배정도 낮아졌다(-0.2 ng/mL). 따라서, 트랜스제닉 마우스에서 IL-17A:IL-17F의 비율은 -1:10이었다. 야생형 마우스에서는 단지 검출가능한 수준의 혈청 IL-17A만이 존재하였다(-0.1ng/mL). IL-17A의 수준보다 현저히 높은(예, 10배) 혈청 IL-17F 수준이 관찰되는 것은, 일반적으로 자가면역 질환을 갖는 인간에서 발견되는 것이므로, 이는 다발성 경화증 및 관절염과 같은 인간 질환의 마우스 모델에서 IL-17F의 역할을 연구하기 위하여 IL-17F 트랜스제닉 마우스를 이용할 수 있음을 뒷받침한다.
실험적 알러지성 뇌수막염(Experimental allergic encephalomyelitis, EAE) 연구: 인간 다발성 경화증, 특히 뮤린 실험적 알러지성 뇌수막염(EAE)의 마우스 모델에서 IL-17F 과발현의 효과를 평가하기 위하여, 2가지의 독립적인 연구를 수행하였다. 암컷 C57BL/6 야생형 한배 새끼 대조군 마우스 또는 C57BL/6 백그라운드상의 EuLck IL-17F 트랜스제닉 마우스(각각 ∼20-22g)를 0일째에 MOG35-55/Ribi(연구 1) 또는 MOG35-55/CFA(연구 2) 에쥬번트로 면역화한 후, 2일째에 백일해 독소를 정맥내 주사하였다. 마우스를 칭량하여 질환의 임상적 증상(예, 꼬리와 팔다리의 마비)에 대해 매일 점수매겼다. 모든 연구 결과, IL-17F 트랜스제닉 마우스는 야생형 마우스에 비하여 발병 및 중증도가 상당히 증가함을 나타내었다(p < 0.05). 연구 1에서, 트랜스제닉 마우스는 야생형 마우스보다 평균 36% 더 높은 질병 중증도 스코어를 나타내어 질병이 더 초기에 절정에 이르렀다. 연구 2에서, IL-17F 트랜스제닉 마우스는 야생형 한배 새끼 대조군 마우스보다 50-70% 더 높은 질병 중증도 스코어를 나타내었다.
콜라겐 유도 관절염(Collagen induced arthritis, CIA) 연구: 인간 류마티스 관절염, 특히 뮤린 콜라겐 유도 관절염(CIA)의 마우스 모델에서 IL-17F 과발현의 효과를 평가하기 위하여, 2가지의 독립적인 연구를 수행하였다. 수컷 C57BL/6 야생형 한배 새끼 대조군 마우스 또는 C57BL/6 백그라운드상의 EuLck IL-17F 트랜스제닉 마우스(각각 ∼23-28g)를 꼬리 주사를 통해 CFA에서 병아리 II형 콜라겐으로 면역화한 후, 3주후 IFA에서 병아리 II형 콜라겐으로 면역화하였다. 마우스를 질환의 임상적 증상(즉, 발 붓기)에 대해 매일 점수매겼다. 모든 연구 결과, IL-17F 트랜스제닉 마우스는 야생형 한배새끼 대조군 마우스에 비하여 발병 및 중증도가 상당히 증가(∼2.5-3배)함을 나타내었다(p < 0.05).
실시예 53
뮤린 IL-17RA-Fc, 인간 IL-17RA-Fc 및 인간 IL-17RA/RC-Fc의 약동학(Pharmacokinetics)
인간 가용성 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 수용체에 대한 뮤린 대체물(mIL-17RA-Fc)을 포함하여, 다양한 가용성 IL-17 수용체에 대해 3가지의 독립된 약동학 연구를 수행하였다. 본 연구를 위해, 암컷 C57BL/6 마우스를 Charles River Labs에서 구입하였다. 동물들은 도착시 건강을 체크하여 그룹별로 가두었다(케이지당 5마리). 마우스는 연구초기에 평균 약 20g의 체중을 가진 10-12주령이었다.
A) 투여량 프로토콜
3가지의 연구 각각에 대하여, 마우스(n=24/dose group)를 특정 투여경로, 즉 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.) 또는 피하(s.c; 목덜미 피하) 투여를 위해 정해진 그룹으로 랜덤하게 배치하였다. 각 그룹의 마우스를 할당된 투여경로로 적합한 단백질을 100μL의 부피로 투여하였다.
B) 샘플 수집
다양한 시점(0.25 내지 336 시간)에서 채혈하기에 앞서, 마우스를 할로탄 또는 이소플루오란으로 완전히 질식사시켰다. 혈액샘플을 모든 시점동안 심장 스틱(cardiac stick)으로 수집하였다. 혈액을 혈청 분리기 튜브에 넣고 15분동안 응고시켰다. 이어서, 샘플을 3분간 14,000rpm으로 원심분리한 후, 표지된 에펜돌프 튜브에 125-150uL의 앨리쿼트를 분배하고 분석할 때까지 즉시 -80℃에서 보관하였다.
C) 결과
뮤린 IL-17RA-Fc의 약동학 연구: i.v. 투여에 대한 반감기는 61시간이었고; i.p. 투여에 대한 반감기는 70시간이었고; s.c. 투여에 대한 반감기는 69시간이었다. i.p. 투여량은 100% 생물학적으로 이용가능하였고; s.c.의 경우는 67%였다. 분배 부피는 i.v., i.p. 및 s.c. 경로에 대하여 각각 6.7mL, 8.7mL 및 10.3mL이었다. 데이터 수집을 위한 가장 긴 시점은 투여후 120시간이었다; mIL-17RA-Fc1의 혈청 수준은 이 시간까지 기초 수준으로 돌아가지는 않았다. 이어지는 약동학 연구(하기에 설명)는 336시간까지 수행되었다.
인간 IL-17RC-Fc의 약동학 연구: i.v. 투여에 대한 반감기는 72시간이었고; i.p. 투여에 대한 반감기는 64시간이었고; s.c. 투여에 대한 반감기는 54시간이었다. i.p. 및 s.c. 투여량은 100% 생물학적으로 이용가능하였다. 분배 부피는 i.v., i.p. 및 s.c. 경로에 대하여 각각 2.7mL, 2.4mL 및 2.2mL이었다.
인간 IL-17RA/RC-Fc(변이체 1454)의 약동학 연구: i.v. 투여에 대한 반감기는 46시간이었고; i.p. 투여에 대한 반감기는 49시간이었고; s.c. 투여에 대한 반감기는 52시간이었다. i.p. 투여량은 100% 생물학적으로 이용가능하였고; s.c.의 경우는 69%였다. 분배 부피는 i.v., i.p. 및 s.c. 경로에 대하여 각각 1.7mL, 2.2mL 및 3.5mL이었다.
실시예 54
이식편대숙주병(GVHD)의 치료에 있어서, 뮤린 대체물 분자 mIL-17RA-Fc의 치료 효능
이식편대숙주병(GVHD)은 줄기세포 또는 골수 이식 후, 또는 혈액 또는 혈액 성분들의 수혈 후, 가장 일반적으로는 면역저하 환자에서 발견되는 증상이다. 가장 일반적으로는 동종조혈모세포 이식후이지만, GVHD는 또한 가장 낮은 빈도로 동계(syngeneic) 및 자가(autologous) 이식 후에 발생한다. GVHD는 HLA 일체배형(haplotype)에 대해 동형인 공여자의 혈액을 수혈받은 면역적격의 HLA 일체배형에 대해 이형인 환자에서 발생할 수 있다. 이 증상은, 이식체에 함유된 면역적격 공여자의 림프구의 생착(engraftment)에 기인하며, 이식체는 숙주의 항원에 반응하여 활성화 및 증식하게 된다. 이러한 감염 저항 세포들은 숙주 신체내의 조직을 공격한다. GVHD는 일반적으로 이식후 처음 100일내에 발생하면 급성이고, 이식후 처음 100일 이후에 발생하면 만성으로 분류된다. 일반적으로 관련있는 조직은 간, 위장간 및 피부를 포함하고, 상당한 염증이 생길 수 있다.
GVHD의 발병은 공여자와 수령자의 HLA 항원 사이의 미스매치 정도가 커질수록, 공여자의 나이가 많아질수록, 환자 나이가 많아질수록 증가한다. 이러한 파라미터 및 다른 파라미터에 따라, 발병의 범위는 약 20% 내지 70%이다. 그러나, 이 질환은 진단중이고 보고중일 수 있다. 급성 GVHD의 증상은 발진, 빌리루빈 농도의 증가로 인한 황색 피부와 눈, 및 설사를 포함한다. 급성 GVHD은 1 내지 4의 스케일로 등급화되고, 4등급은 가장 중증인 경우다. 만성 GVHD은 새롭게 발생되거나 또는 급성 GVHD로부터 진전되어 발생할 수 있으며, 급성 GVHD 보다 증상이 더 다양하며, 많은 자가면역 장애와 유사한 증상이다. 몇몇 증상은 건조한 눈과 입, 발진, 피부와 입의 궤양, 관절경축(관절을 쉽게 움직일 수 없음), 간에서 추출한 혈액의 비정상적인 테스트 결과, 폐경화(호흡곤란), 눈의 염증, 삼키기 어려움, 근육약화 또는 구강내 흰막을 포함한다. GVHD의 다른 증상은, 조직손상(소화관, 피부, 간, 그리고 몇몇 경우에는 폐와 신장) 및 순환 면역 사이토카인 수준의 증가(사이토카인 폭풍)에 기인하는 패혈증 유사 증상을 포함한다. 몇몇 중증의 경우에 GVHD는 치명적일 수 있다.
GVHD의 첫번째 치료법은 스테로이드(메틸프레드니솔론, methylprednisolone) 요법을 포함한다. 만성 GVHD은 스테로이드와 사이클로스포린 A의 조합물로 치료된다. 스테로이드 면역억제의 부작용으로서, 치명적일 수 있는 감염 및 2차 악성율의 증가를 포함한다. 현재의 치료법은 또한 이식된 공여자 세포의 이식편대종양의 활성을 방해할 수 있다. 이러한 심각한 부작용의 측면에서, 더 선택적인 치료제가 필요하다.
본원에 설명된 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질은 GVHD 및/또는 이식 치료에 효능이 있을 것으로 예상된다. 면역거부 환자 및 동물모델의 혈청 및 요소에서는, IL-17RA(및 가장 유사하게는 IL-17F) 수준이 증가한 것으로 보고되었다. 따라서 가용성 인간 IL-17RC 또는 IL-17RA/RC 단백질로 IL-17A 및 IL-17F를 중화하면 GVHD 및/또는 기관 이식에 있어서 더 좋은 결과를 얻을 수 있을 것이다.
인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질에 대한 뮤린 대체물(mIL-17RA-Fc)의 효능은 급성 GVHD의 마우스 모델에서 평가하였다(Durie et al., J. Clin. Invest. 94: 1333-1338, 1994). 마우스(C57BL/6; n=12)를 안락사시키고 비장을 채취하였다. 비장을 2개의 글라스 슬라이드로 분쇄하여 비장 세포로 분리하였다. 용해 버퍼를 비장세포 현탁액에 첨가하여 적혈구를 제거하였다. 이 세포들을 RPMI 1640(10% FBS) 배지로 세척하고, 적합한 양의 PBS로 재현탁하여 300×107 cells/ml의 세포농도로 만들었다. 수령자 마우스를 처리군(PBS 또는 mIL-17RA-Fc)으로 나누었다. 뮤린 IL-17RA-Fc 치료제는 -1일째에 시작하여 15일째까지 계속 2틀에 한번씩 복강내 주사(주사당 150μg)하였다. 0일째에, B6 마우스의 80×106 개의 비장 림프구를 수령자 마우스(C57BL/6 x DBA/2 F1 (BDF1); n=10/그룹)에 정맥내 주사하였다. 마우스는 1주일에 3번 체중변화(이 모델에서 병의 악화를 나타내는 지표) 및 사멸의 어떠한 징조를 모니터한다. 초기 체중의 20% 이상이 감량된 마우스를 질식사시켰다. 또는, 세포를 트랜스퍼한지 12-18일 후에 마우스를 희생시켜, 비장과 혈액을 채집하였다.
비장은 MHC class I 마커(H2b 및 H2d)를 포함하는 T-세포 및 B-세포 마커로 염색하여 공여자/수령자 세포 비율을 조사하였다(급성 GVHD 비장 세포는 대부분 공여자 세포이다). 혈청을 수집하여 ELISA로 혈청내 IgG1, IgG2a 및 IgE 수준을 측정하고, 시판되는 키트(Luminex Corporation, Austin, TX)로 사이토카인 및 케모카인 수준을 측정하였다.
2개의 독립된 연구 결과는 급성 GVHD이 발생된 동물 모델의 상관관계를 보여주었다. PBS 대조군에서는 숙주(BDF1) 비장 세포가 손실되었고, 공여자(C57BL/6) Treg 세포의 수는 감소하였다. 처리된 동물에서는, mIL-17RA-Fc가 숙주 비장 세포, CD4+ T 세포 및 Treg 세포를 유지시켰다. 비처리된 동물에서는 공여자(C57BL/6)의 통상의 CD4+ T 세포의 활성 또는 확장이 방지되었다. 모든 그룹들은 유사한 수의 통상의 공여자의 CD4+ T 세포를 가졌고, GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor 패밀리 관련 유전자)는 공여자 CD4+ T 세포에 의해 상향조절되었다. 두 연구 모두, IL-17RA-Fc 처리군에서의 체중감량은 심각하지 않았고, PBS 대조군(연구 #2; 도 6)에서보다 두 연구에서 체중감량이 상당히 덜하였다(p < 0.05). IL-17RA-Fc 처리는 비장:체중의 비율에 기초한 비장비대를 예방하지는 못하였으나, PBS 처리의 대조군과 비교하면 연구 #2에서 비장 세포의 수에 있어서 질환- 매개의 증가는 감소하였다(2배 더 낮은 수; p < 0.01). 연구 #1에서, mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스는 PBS 처리 대조군에 비하여 IL-10(IL-10는 1차의 항-염증 사이토카인이라 생각된다)의 혈청 농도가 상당히 더 높았다(2배 이상; p < 0.05). 연구 #2에서, mIL-17RA-Fc로 처리한 마우스는 TNF-α 및 IFN-γ의 혈청농도가 상당히 더 낮았다. 두 연구 모두에서, mIL-17RA-Fc를 처리하면 숙주 과립구의 퍼센트가 매우 낮아졌음을 알았다(2배 이상 저하; p < 0.001).
요약하면, 본원에 설명된 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질의 뮤린 대체물(mIL-17RA-Fc)로 처리한 결과, GVHD의 뮤린 모델에서 치료학적으로 효능이 있음을 알았다. 이러한 결과는, 본원에 설명된 인간 IL-17RC 및 IL-17RA/RC 단백질이 GVHD 및 이식거부의 치료에 효과적임을 나타낸다.
실시예 55
293F에서의 IL17A-CH6/IL17F-CEE 헤테로다이머 발현
IL17A-CH6(각각 SEQ ID NO: 186 및 187의 핵산 및 아미노산 서열) 및 IL17F-CEE(각각 SEQ ID NO: 188 및 189의 핵산 및 아미노산 서열)를 암호화하는 2개의 발현 플라스미드는 각각 효모에서 상동재조합을 통해 벡터 pZMP45내에 구조화하였다.
IL17A-CH6 단편은, 주형으로서 IL17A를 함유하는 미리 생성한 플라스미드와, pZMP45에서 5'이 중복되도록 하기 위해 정방향 프라이머로서 zc57312와, 세린-글리신 링커와 6개의 히스티딘 태그를 만들고 pZMP45에서 3'이 중복되도록 하기 위해 역방향 프라이머로서 zc48893을 사용하여 PCR로 제조되었다.
IL17F-CEE 단편은, 주형으로서 IL17F를 함유하는 미리 생성한 플라스미드와, pZMP45에서 5'이 중복되도록 하기 위해 정방향 프라이머로서 zc57314와, 세린-글리신 링커와 EE 태그(EEYMPME; SEQ ID NO: 190)를 만들고 pZMP45에서 3'이 중복되도록 하기 위해 역방향 프라이머로서 zc58978을 사용하여 PCR로 제조되었다. Platinum® PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, Cat. #12532-016)을 사용한 PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 2분동안 1사이클; 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 45초 동안 30사이클; 및 4℃에서 홀딩. 그 다음 PCR 반응 혼합물을 1×TAE로 1% 아가로스 겔상에 러닝하였다. 맞는 밴드를 오려 Qiagen 겔 정제 키트(Qiagen, catalog #28704)를 사용하여 정제한다.
플라스미드 pZMP45는, CMV 프로모터, 인트론 A, 코딩서열 삽입을 위한 다중 제한 부위, 및 otPA 시그널 펩티드 서열, SV40 터미네이터, E. coli 복제 오리진, 및 S. cerevisiae에서 선택 및 발현에 필요한 URA3 및 CEN-ARS 서열을 갖는 발현 카세트를 함유하는 포유류의 발현 벡터이다.
전기적격(electrocompetent) 효모세포(S. cerevisiae) 100μL를 상기의 정제된 DNA lOμl와 결합 및 BglII로 커팅한 pZMP45 플라스미드 1OOng과 혼합하고, 0.2cm의 전기천공 큐베트에 옮겼다. 이 효모-DNA 혼합물을 0.75kV(5kV/cm), ∞ 옴스, 25μF의 전기충격을 가하였다. 각 큐베트에 1ml의 1.2M 소르비톨을 첨가하고, 이 효모를 URA-DS 플레이트상에 플레이팅하고, 30℃에서 인큐베이션하였다. 약 72시간 후에, 단일 플레이트의 Ura+ 효모 형질전환체에서 얻은 약 50μL의 효모세포를, 용해 버퍼(2% Triton X-1OO, 1% SDS, 10OmM NaCl, 1OmM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA) lOOμL, Qiagen 미니프렙 키트(Qiagen, Valencia, CA, catalog #27104)의 Qiagen P1 버퍼 lOOμL, 및 Zymolyase(Zymo Research, Orange, CA, catalog #1001) 2OU에 재현탁하였다. 이 혼합물을 37℃에서 30분간 인큐베이션한 후, 시약 P2의 첨가를 시작으로 Qiagen 미니프렙 프로토콜의 나머지를 수행하였다. 이 DNA를 40μL의 EB 시약으로 용출하였다.
15μL의 전기적격 E. coli 세포(DH 12S, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 0.2 cm의 전기천공 큐베트에서 2μL의 효모 DNA로 형질전환시켰다. 이 세포에 1.75kV, 25μF 및 400옴스의 전기충격을 가하였다. 전기천공 후, 1ml의 SOC(2% 박토 트립톤(Difco, Detroit, MI), 0.5% 효모 추출물(Difco), 1OmM NaCl, 2.5mM KCl, 1OmM MgCl2, 1OmM MgSO4, 2OmM 글루코스)를 큐베트에 첨가하였다. 이 용액을 2개의 LB AMP 플레이트(LB 브로스(Lennox), 1.8% 박토 아가(Difco), 100mg/L의 암피실리)상에 플레이팅하는데, 하나는 200μL의 형질전환체로, 나머지 하나는 100μL의 형질전환체로 플레이팅한다.
형질전환 플레이트로부터 개개의 클론들을 픽업해서 IL17A-CH6에 대한 올바른 발현 구조물을 함유하는 클론과, IL17F-CEE에 대한 올바른 발현 구조물을 함유하는 클론을 확인하기 위하여 서열분석한다. 더 큰 스케일의 플라스미드 DNA는, 제조자의 지시에 따라 Invitrogen 메가프렙 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, catalog #457009)를 사용하여 분리한다.
293F 세포로의 트랜스펙션
IL17A CH6-IL17F CEE 헤테로다이머의 발현을 테스트하기 위해, 293F 세포를 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, catalog #11668-019) 및 OptiMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, catalog #31985-070)을 사용하여 일시적으로 트랜스펙션시키고, 12웰 플레이트에서 배양하였다. IL17A는 두개의 단백질 중 덜 발현되는 단백질임이 밝혀졌기 때문에, 트랜스펙션을 위해서 DNA 비율은 IL17A CH6의 3중량부 : IL17F CEE의 1중량부로 사용하였다. 트랜스펙션을 위해서 2μg의 플라스미드 DNA와 106개의 세포를 사용하였다. 96시간 후에 배지를 모아 웨스턴 블롯 분석을 위한 준비를 하였다.
웨스턴 블롯을 위해 Invitrogen 재료 및 프로토콜을 사용하였으며, IL17A CH6에 대한 검출항체로서 항-6개의 히스티딘(R&D Systems, Minneapolis, MN, catalog #MAB050H), IL17F CEE에 대한 검출항체로서 인하우스 마우스 mAb, 및 2차 항체로서 Jackson HRP-염소 항 마우스 IgG (H+L) (catalog# 115-035-003) + BD Parm. HRP-항 마우스 IgG2a (R19-15)(catalog #553391)를 이용하였다. 유의있는 발현이 관찰되었기 때문에, 단백질을 얻기 위해 거대 스케일의 트랜스펙션을 수행하였다.
실시예 56
CHO DXB11 세포 배양물 발현체로부터 단일쇄 인간 IL17A:IL17F 헤테로다이머의 정제
WAVE 장치내의 세포 배양과 CHO DXB11 세포에서의 단일쇄 구조물의 발현으로부터 재조합 인간 IL17A:IL17F 헤테로다이머 단백질(zcyto40f2 v.2)을 제조하였다. 이 구조물은 N-말단의 인간 IL17A 서열과 C-말단의 인간 IL17F 서열(construct 1789; C-His tagged)이 (G4S)3 링커를 통하여 연결된 구조이다. 생산물의 효율적인 캡처를 위하여, 히스티딘 태그를 C-말단에 첨가하였다. 약 1OL의 조건배지를 수집하여 0.2μm 필터로 멸균 여과하였다. 이 배지를 아세트산 첨가 및 교반하여 pH 5.0로 적정하였다. 이 시점에서 상당한 침전 현상이 생기므로, pH 적정된 배지를 다시 2단계로 0.8 내지 0.2 마이크론 필터(Pall Corporation)를 통하여 여과하였다.
양이온 교환 크로마토그래피
적정된 배지를 AKTATM 익스플로러 크로마토그래피 플랫폼(GE Healthcare)을 사용하여, 미리 평형화한 양이온 교환 칼럼(16mL의 베드 부피, 2cm의 직경, SP Fast Flow 수지, GE Healthcare)에 10ml/min의 속도로 로딩하였다. 평형 버퍼는 pH 5.0, 0.02M 아세트산, 0.1M NaCl이었다. 샘플 로딩을 완료하면, 안정한 UV @ 280nm 베이스라인이 얻어지는 지점에서, 이 칼럼을 평형 버퍼로 20 칼럼 부피에 대하여 세정하였다.
평형 버퍼와 용출 버퍼(0.02M 아세트산, 1.0M NaCl, pH 5.0) 사이의 20 칼럼 부피를 형성하면서, 결합된 단백질 분획을 20ml/min의 유속으로 용출하여, 5ml의 분획을 수집하였다. 분획물은 SDS-PAGE 쿠마쉬(Coomassie) 및 웨스턴 블롯 포멧으로 분석하였다. 구배 용출동안, 2개의 용출 피크중 첫번째(메인 피크)에서 38kDa의 뚜렷한 고밀도 밴드가 관찰되었다. 프랙션 #20-48을 포함하여, 메인 피크 트랜스포트 도메인은 특이적인 항-His 태그 염색을 보였고, 전체적으로 넓은 웨스턴 블롯 염색가능한 분획을 모아 본 공정의 앞쪽으로 이동시켰다.
IMAC 크로마토그래피 (금속 킬레이션 친화 단계)
5mL HisTrap IMAC 칼럼(GE Healthcare)을 20칼럼 부피의 버퍼(0.5M NaCl, 50mM NaPhos; pH 7.5의 25mM 이미다졸)로 평형화하였다. IMAC 크로마토그래피를 위해, 양이온 교환 풀 144ml에 충분한 고체 시약을 첨가하여 25mM 이미다졸 농도로 맞추었다. 2N NaOH의 첨가로 pH를 7.5로 맞춘 시점에서, 1가 및 2가 염기 인산나트륨 용액(각각 0.5M)의 동등몰 혼합물을 첨가하여 20mM의 인산 완충액을 제조하였다.
적정된 양이온 교환 풀을 HisTrap IMAC 칼럼에 로딩할 준비를 한다. 샘플로딩이 완료되면, 0.4M NaCl, 400mM 이미다졸 pH 7.5 버퍼로 용출하기 전에, IMAC 칼럼을 40 칼럼 부피의 평형 버퍼로 세정한다. 용출 버퍼로 바꾼후에, 실질적인 피크가 칼럼에서 용출된다.
마지막 공정인 크기 배제 크로마토그래피에 주입하기 위해, 이 물질들을 모아 3ml로 농축하였다.
크기 배제 크로마토그래피 공정
IMAC 단계의 농축물을 미리 평형화한 Superdex 200 (GE Healthcare; 16/60; 120ml) SEC 칼럼에 주입하고, 35mM 인산나트륨 버퍼(109mM NaCl, pH 7.3)로 구성된 이동상(mobile phase)에서 1.5ml/min 속도로 유동시킨다. 1.5ml의 분획을 모았다. 약간 초기의 낮은 수준의 용출물이 0.7 칼럼 부피에서 용출하는 대부분의 대칭 피크를 앞선다. 이 메인 피크를 바로 앞서거나 이 메인 피크 내에 있는 분획들을 쿠마쉬 염색과 함께 SDS-PAGE로 분석하였다. 가장 높은 정제도 산물을 얻도록 분획 풀을 만들고, 원치 않는 오염물과 함께 용출된 몇몇 분획들은 제외시켰다.
정제된 단일쇄의 인간 IL17A:IL17F 헤테로다이머의 분석
재조합 단일쇄의 인간 IL17A:IL17F 헤테로다이머를 0.1% 쿠마쉬 R250와 함께 SDS-PAGE(10% BisTris, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 단백질 분석하고, 이후 항-His-HRP로 면역블롯팅함으로써 니크로셀룰로스에 옮긴다. 정제된 단백질을 Invitrogen Novex's Xcell II 미니셀을 이용하여 전기영동하고, 25mM Tris 염기, 200 mM 글리신 및 20% 메탄올을 함유하는 버퍼에서 600mA로 45분간 주변온도하에 니크로셀룰로스에 옮겼다. 이 필터를 50mM Tris, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.05% Igepal(TBS)에서 10% 탈지분유로 15분간 실온하에 블락킹시켰다. 이 니크로셀룰로스를 재빨리 헹구고, 특정의 HRP 결합된 항체(1:2500)를 첨가하였다. 이 블롯을 약하게 흔들면서 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, TBS에서 각각 15분 동안 3번 세정하고, 재빨리 물로 헹구었다. 시판되는 화학발광 기질 시약(Roche LumiLight)을 이용하여 이 블롯을 현상하고, Lumi-Imager's Lumi Analyst 3.0 소프트웨어(Boehringer Mannheim GmbH, 독일제)을 이용하여 신호를 포착하였다. 비환원 쿠마시 염색을 분석한 결과, 아래쪽에 지배적으로 존재하는 물질과 함께, 다이머 산물이 한쌍 나타났다.
환원 및 비환원 산물에 대해 쿠마시 염색과 함께 SDS-PAGE 분석결과, 다이머 폴리펩티드쇄에 대해 뚜렷한 전기영동 이동상에서 한쌍의 불균형한 강도가 나타났다. 한쌍중 위쪽의 밴드가 지배적인 형태로 관찰되었다. 환원 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 데이터 결과, 무시할만한 양의 저 분자량 물질종이 나타났다. 100pmol의 산물에 대해 N-말단 서열분석을 수행하였다. 그 결과, 인간 IL17A 서열의 시작점인 N-말단 잔기로서 G24을 갖는 단일의 N-말단이 57.9pmol의 반복적인 수득율로 회수되었다. 아미노산 조성 데이터는 이론 조성과 일치하였다. 크기 배제 분석은 산물의 99+% 정제도를 나타내었다.
실시예 57
표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, Biacore)을 이용한, IL-17A/F 헤테로다이머 항원에 대한 IL-17RA/RC-Fc5의 결합 친화도 분석
본 연구는 IL-17A/F 2쇄 헤테로다이머에 대한 IL-17RA/RC-Fc5(변이체 1454)의 결합 친화도를 평가하기 위하여 수행되었다.
친화도 결정
IL-17A/F 헤테로다이머 항원과 IL-17RA/RC-Fc5의 결합반응을 위하여, 표면 플라즈몬 공명을 통해 운동속도상수, 평형결합상수 및 평형해리상수를 측정하였다. 결합속도상수(ka(M-1S-1))는 항원-수용체 복합체 형성 속도를 반영하는 값이다. 해리속도상수(kd(s-1))는 이 복합체의 안정성을 나타내는 값이다. 평형 결합 친화도는 일반적으로 평형해리상수(KD(M)) 또는 평형결합상수(KA(M-1))로서 표현된다. KD는 해리속도상수를 결합속도상수로 나누어 구하고(kd/ka), KA 는 결합속도상수를 해리속도상수로 나누어 구한다(ka/kd). 유사한 KD(또는 유사한 KA)의 길항제는 매우 다양한 결합 및 해리 속도 상수를 가질 수 있다. 결론적으로, KA 또는 KD 뿐만 아니라 ka 및 kd의 측정이, 수용체-항원 반응의 친화도를 좀더 잘 설명하는데 도움이 된다.
재료 및 방법
인간 재조합 IL-17A/F 헤테로다이머에 대해 정제된 IL-17RA/RC-Fc5 수용체의 결합 친화도를 측정하기 위한 실험이 완성되었다. 결합 역학(kinetics) 및 친화도 연구를 Biacore T100™ 시스템(GE Healthcare, Piscataway, NJ)상에서 수행하였다. Biacore T100™ 컨트롤 소프트웨어 v 1.1.1.을 사용하여, Biacore T100™에 대한 방법을 프로그래밍하였다. IL-17RA/RC-Fc5 수용체는 인간 Fc 도메인을 함유하기 때문에, 본 연구를 위한 포착 항체(capture antibody)로서 염소 항-인간 IgG Fc-γ(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 이용하였다. 상기 포착 항체는 0.4M EDC[N-에틸-N'-(3-디에틸아미노-프로필)카보디이미드] 및 0.1M NHS(N-히드록시숙신이미드)의 혼합물을 이용하여 약 4000RU의 밀도까지 CM4 센서칩에 공유결합으로 고정하였다. 항체 고정후, 플로우 셀상에 있는 나머지 활성부위를 1M 에탄올아민으로 블록킹하였다. IL-17RA/RC-Fc5 수용체는 약 90-100RU의 밀도로 CM4 칩의 플로우 셀위에 포착되었다. 고정화된 표면에 대한 상기 수용체의 포착은 10μL/min의 유속으로 수행되었다. 상기 Biacore 장치는 센서칩 표면에 결합된 단백질의 양을 측정하고, 따라서 각 분석 사이클에 대해 가용성 수용체의 포착이 확인되었다.
IL-17A/F 헤테로다이머(상기 실시예 55에 설명된 IL17A-CH6/IL17F-CEE 2쇄 헤테로다이머)에 대한 결합성을 연구하기 위하여, 항원을 33nM-0.015nM에서 시작하여 연속적으로 1:3 희석한 것을 상기 표면위에 주입하여, 센서칩상에 포착된 IL-17RA/RC-Fc5 수용체에 특이적으로 결합하도록 하였다. 각 IL-17A/F 항원 농축물을 7분의 결합 시간 및 15분의 해리 시간으로 두번 주입하였다. 역학 결합 연구는 30 μL/min의 유속으로 행하였다. 모든 결합 실험은 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20(GE Healthcare, Piscataway, NJ), 1mg/mL BSA(bovine serum albumin)(Proliant Biologicals, Boone, IA), pH 7.4의 버퍼로 25℃에서 수행하였다.
분석 사이클들 사이에, 플로우셀을 20mM의 염산으로 세정하여 표면을 재생하였다. 이 세정 단계는 포획된 IL-17RA/RC-Fc5 수용체를 고정화 항체 표면으로부터 제거하여, 다음 테스트의 샘플이 결합할 수 있도록 하였다. Biacore T100™ 평가 소프트웨어(버전 1.1.1)를 사용하여 데이터를 수집하였다. 참조 플로우 셀 및 블랭크 주입물을 감하여 데이터를 가공하였다. 재생 단계가 주입물의 시퀀스를 통하여 일관된 결합 표면을 제공했는지를 확인하기 위하여, 베이스라인 안정성을 평가하였다. 재생성을 위해 이중의 주입 커브를 체크하였다. IL-17A/F 헤테로다이머는 IL-17RA/RC-Fc5 수용체에 대하여 2개의 유력한 결합 파트너(IL-17A 및 IL-17F)를 가졌다. 만약 헤테로다이머 중 단지 하나의 부위만 수용체에 결합한다면, 단순히 1:1 결합 모델이 적합할 것이고, 이 커브들은 본 모델에 잘 맞을 것이다. 그러나, 만약 헤테로다이머의 IL-17A 및 IL-17F 부위 모두가 수용체에 결합한다면, 2가의 결합 모델이 적합할 것이고, 이 커브들을 본 모델에 맞추어야 한다. 결합 커브는 1:1 및 2가의 분석체 결합 모델 모두에 폭넓게 맞추었다.
결과
인간 IL-17A/F 헤테로다이머 항원에 대한 결합 친화도를 위해 IL-17RA/RC-Fc5 수용체를 특성분석하였다. 결합 속도 상수(ka(M-1S-1)) 및 해리 속도 상수(kd(S-1))를 측정하였다. 얻어진 결합 커브는 1:1 결합 모델과 맞지 않은 반면, 2가 분석체 모델과 잘 맞았다. 이러한 결과는 가용성 수용체에 결합하는 IL-17A/F 헤테로다이머의 두 부위(IL-17A 및 IL-17F)와 일치하였다. 2가 분석체 결합 모델은 ka(ka1 및 ka2) 및 kd(kd1 및 kd2) 모두에 대해 2개의 값을 측정한다. 첫번째 세트의 값(ka1 및 kd1)은 상호반응의 1가 역학을 설명한다. 이들 샘플에 대해 보고된 친화도는 이들 값들에서 유도된 것이고, KD1 및 KA1 으로 칭한다. 두번째 세트의 값(ka2 및 kd2)은 상호작용에 대한 요구를 나타내고, 보고되지는 않았다. 측정된 결합 역학은 ka1에 대하여는 5.E+05(M-1S-1)이고, kd1에 대하여는 2.E-03(s-1)였다. 이들 값은 IL17A/A 및 IL17F/F 호모다이머로 얻어진 결과와 비교될 수 있다.
IL-17A/F 헤테로다이머에 대한 결합 친화도
항원 ka1(M-1S-1) kd1(S-1) KD1(M) KA1(M-1)
IL-17A/F 헤테로다이머 5.E+05 2.E-03 4.E-9 2.E+8
실시예 58
IL17A/F 헤테로다이머의 활성 및 IL-17RA/RC-Fc5에 의한 중화
IL-17A/F 헤테로다이머 구조물(zcyto40f2v.1-2쇄 및 zcyto40f2-단일쇄)에 대해 활성 테스트 및 IL-17RA/RC-Fc5 중화 테스트를 행하였다. IL-17RC 활성 분석은, 루시퍼라제 리포터 분석에서 IL-17A 및 IL-17F 신호화의 NFκB 매개 검출을 위해, KZ170 리포터 구조물로 트랜스팩션된 NIH-3T3 세포주를 이용한다. 본 분석에서 헤테로다이머 구조물 모두는, 2쇄 및 단일쇄 구조물에 대하여 각각 15.19nM 및 20.59nM의 EC50 값으로서 용량-의존적 반응을 보였다. 또한, IL-17A 및 IL-17F 호모다이머는 각각 2.026nM 및 17.31nM의 EC50 값으로서 용량-의존적 반응을 보였다.
또한, NIH-3T3/KZ170 루시퍼라제 리포터 세포에 기초한 분석을 이용하여, IL-17A/F 헤테로다이머 구조물에 대해 중화 분석 시험하였다. 가용성 수용체 IL-17RA/RC-Fc5(변이체 1454)를 일정한 농도의 리간드로 적정하고, 리포터 바이오분석 시험하였다. 헤테로다이머 구조물 모두를 IL-17RA/RC-Fc5 가용성 수용체에 의해 2쇄 및 단일쇄 구조물에 대하여 각각 3.169nM 및 13.34nM의 IC50 값으로서 용량 의존적 방식으로 중화시켰다. 또한, IL-17A 및 IL-17F 호모다이머는 각각 0.1673nM 및 0.8735nM의 IC50 값으로서 용량-의존적 방식으로 중화시켰다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 특정 구체예들이 예시 목적으로 본원에서 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 가해질 수 있음은 자명하다.
SEQUENCE LISTING <110> ZymoGenetics, Inc. Levin, Steven D. Rixon, Mark W. Gao, Zeren <120> SOLUBLE IL-17RA/RC FUSION PROTEINS AND RELATED METHODS <130> 07-06PC <150> 11/691,000 <151> 2007-03-26 <150> 60/908,554 <151> 2007-03-28 <150> 60/983,822 <151> 2007-10-30 <160> 190 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2255 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (154)...(2229) <220> <223> Optimized tissue Plasminogen Activator (otPA) pre-pro signal sequence and exons 7-10 of human IL-17RC, and Fc5 <400> 1 aactacccag cacagccccc tccgccccct ctggaggctg aagagggatt ccagcccctg 60 ccacccacag acacgggctg actggggtgt ctgcccccct tggggggggg cagcacaggg 120 cctcaggcct gggtgccacc tggcacctag aag atg cct gtg ccc tgg ttc ttg 174 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu 1 5 ctg tcc ttg gca ctg ggc cga agc cca gtg gtc ctt tct ctg gag agg 222 Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro Val Val Leu Ser Leu Glu Arg 10 15 20 ctt gtg ggg cct cag gac gct acc cac tgc tct ccg ggc ctc tcc tgc 270 Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys 25 30 35 cgc ctc tgg gac agt gac 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Ala Arg Gly Arg Ala Ala 475 480 485 ctg ctc ctc tac tca gcc gat gac tcg ggt ttc gag cgc ctg gtg ggc 1662 Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly Phe Glu Arg Leu Val Gly 490 495 500 gcc ctg gcg tcg gcc ctg tgc cag ctg ccg ctg cgc gtg gcc gta gac 1710 Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gln Leu Pro Leu Arg Val Ala Val Asp 505 510 515 ctg tgg agc cgt cgt gaa ctg agc gcg cag ggg ccc gtg gct tgg ttt 1758 Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gln Gly Pro Val Ala Trp Phe 520 525 530 535 cac gcg cag cgg cgc cag acc ctg cag gag ggc ggc gtg gtg gtc ttg 1806 His Ala Gln Arg Arg Gln Thr Leu Gln Glu Gly Gly Val Val Val Leu 540 545 550 ctc ttc tct ccc ggt gcg gtg gcg ctg tgc agc gag tgg cta cag gat 1854 Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys Ser Glu Trp Leu Gln Asp 555 560 565 ggg gtg tcc ggg ccc ggg gcg cac ggc ccg cac gac gcc ttc cgc gcc 1902 Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro His Asp Ala Phe Arg Ala 570 575 580 tcg ctc agc tgc gtg ctg ccc gac ttc ttg cag ggc cgg gcg ccc ggc 1950 Ser Leu Ser Cys Val 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exons 1-13 of human IL-17RC, and exons 7-9 of human IL-17RA <400> 115 atgcctgtgc cctggttctt gctgtccttg gcactgggcc gaagcccagt ggtcctttct 60 ctggagaggc ttgtggggcc tcaggacgct acccactgct ctccgggcct ctcctgccgc 120 ctctgggaca gtgacatact ctgcctgcct ggggacatcg tgcctgctcc gggccccgtg 180 ctggcgccta cgcacctgca gacagagctg gtgctgaggt gccagaagga gaccgactgt 240 gacctctgtc tgcgtgtggc tgtccacttg gccgtgcatg ggcactggga agagcctgaa 300 gatgaggaaa agtttggagg agcagctgac tcaggggtgg aggagcctag gaatgcctct 360 ctccaggccc aagtcgtgct ctccttccag gcctacccta ctgcccgctg cgtcctgctg 420 gaggtgcaag tgcctgctgc ccttgtgcag tttggtcagt ctgtgggctc tgtggtatat 480 gactgcttcg aggctgccct agggagtgag gtacgaatct ggtcctatac tcagcccagg 540 tacgagaagg aactcaacca cacacagcag ctgcctgact gcagggggct cgaagtctgg 600 aacagcatcc cgagctgctg ggccctgccc tggctcaacg tgtcagcaga tggtgacaac 660 gtgcatctgg ttctgaatgt ctctgaggag cagcacttcg gcctctccct gtactggaat 720 caggtccagg gccccccaaa accccggtgg cacaaaaacc tgactggacc gcagatcatt 780 accttgaacc acacagacct ggttccctgc ctctgtattc aggtgtggcc tctggaacct 840 gactccgtta ggacgaacat ctgccccttc agggaggacc cccgcgcaca ccagaacctc 900 tggcaagccg cccgactgcg actgctgacc ctgcagagct ggctgctgga cgcaccgtgc 960 tcgctgcccg cagaagcggc actgtgctgg cgggctccgg gtggggaccc ctgccagcca 1020 ctggtcccac cgctttcctg ggagaacgtc actgtggaca aggttctcga gttcccattg 1080 ctgaaaggcc accctaacct ctgtgttcag gtgaacagct cggagaagct gcagctgcag 1140 gagtgcttgt gggctggcag cctttgggat cccaacatca ctgtggagac cttggacaca 1200 cagcatctgc gagtggactt caccctgtgg aatgaatcca ccccctacca ggtcctgctg 1260 gaaagtttct ccgactcaga gaaccacagc tgctttgatg tcgttaaaca aatatttgcg 1320 cccaggcaag aagaattcca tcagcgagct aatgtcacat tcactctaag caagtttcac 1380 tggtgctgcc atcaccacgt gcaggtccag cccttcttca gcagctgcct aaatgactgt 1440 ttgagacacg ctgtgactgt gccctgccca gtaatctcaa ataccacagt tcccaagcca 1500 gttgcagact acattcccct gtgg 1524 <210> 116 <211> 508 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17RC signal peptide and exons 1-13 of human IL-17RC, and exons 7-9 of human IL-17RA <400> 116 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys 35 40 45 Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr 50 55 60 His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys 65 70 75 80 Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp 85 90 95 Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly 100 105 110 Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser 115 120 125 Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val 130 135 140 Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr 165 170 175 Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro 180 185 190 Asp Cys Arg Gly Leu Glu Val Trp Asn Ser Ile Pro Ser Cys Trp Ala 195 200 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tcaggggtgg aggagcctag gaatgcctct 360 ctccaggccc aagtcgtgct ctccttccag gcctacccta ctgcccgctg cgtcctgctg 420 gaggtgcaag tgcctgctgc ccttgtgcag tttggtcagt ctgtgggctc tgtggtatat 480 gactgcttcg aggctgccct agggagtgag gtacgaatct ggtcctatac tcagcccagg 540 tacgagaagg aactcaacca cacacagcag ctgcctgact gcagggggct cgaagtctgg 600 aacagcatcc cgagctgctg ggccctgccc tggctcaacg tgtcagcaga tggtgacaac 660 gtgcatctgg ttctgaatgt ctctgaggag cagcacttcg gcctctccct gtactggaat 720 caggtccagg gccccccaaa accccggtgg cacaaaaacc tgactggacc gcagatcatt 780 accttgaacc acacagacct ggttccctgc ctctgtattc aggtgtggcc tctggaacct 840 gactccgtta ggacgaacat ctgccccttc agggaggacc cccgcgcaca ccagaacctc 900 tggcaagccg cccgactgcg actgctgacc ctgcagagct ggctgctgga cgcaccgtgc 960 tcgctgcccg cagaagcggc actgtgctgg cgggctccgg gtggggaccc ctgccagcca 1020 ctggtcccac cgctttcctg ggagaacgtc actgtggaca aggttctcga gttcccattg 1080 ctgaaaggcc accctaacct ctgtgttcag gtgaacagct cggagaagct gcagctgcag 1140 gagtgcttgt gggctggcag cctttgggat cccaacatca ctgtggagac cttggacaca 1200 cagcatctgc gagtggactt caccctgtgg aatgaatcca ccccctacca ggtcctgctg 1260 gaaagtttct ccgactcaga gaaccacagc tgctttgatg tcgttaaaca aatatttgcg 1320 cccaggcaag aagaattcca tcagcgagct aatgtcacat tcactctaag caagtttcac 1380 tggtgctgcc atcaccacgt gcaggtccag cccttcttca gcagctgcct aaatgactgt 1440 ttgagacacg ctgtgactgt gccctgccca gtaatctcaa ataccacagt tcccaagcca 1500 gttgcagact acattcccct gtgggagccc aaatcttcag acaaaactca cacatgccca 1560 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 1620 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1680 cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1740 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1800 gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1860 ctcccatcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1920 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1980 ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 2040 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 2100 agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 2160 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2220 <210> 118 <211> 740 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17RC signal peptide and exons 1-13 of human IL-17RC, and exons 7-9 of human IL-17RA, and Fc5 <400> 118 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys 35 40 45 Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr 50 55 60 His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys 65 70 75 80 Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp 85 90 95 Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly 100 105 110 Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser 115 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cggtggcaca aaaacctgac tggaccgcag atcattacct tgaaccacac agacctggtt 780 ccctgcctct gtattcaggt gtggcctctg gaacctgact ccgttaggac gaacatctgc 840 cccttcaggg aggacccccg cgcacaccag aacctctggc aagccgcccg actgcgactg 900 ctgaccctgc agagctggct gctggacgca ccgtgctcgc tgcccgcaga agcggcactg 960 tgctggcggg ctccgggtgg ggacccctgc cagccactgg tcccaccgct ttcctgggag 1020 aacgtcactg tggacaaggt tctcgagttc ccattgctga aaggccaccc taacctctgt 1080 gttcaggtga acagctcgga gaagctgcag ctgcaggagt gcttgtgggc tggcagcctt 1140 tgggatccca acatcactgt ggagaccttg gacacacagc atctgcgagt ggacttcacc 1200 ctgtggaatg aatccacccc ctaccaggtc ctgctggaaa gtttctccga ctcagagaac 1260 cacagctgct ttgatgtcgt taaacaaata tttgcgccca ggcaagaaga attccatcag 1320 cgagctaatg tcacattcac tctaagcaag tttcactggt gctgccatca ccacgtgcag 1380 gtccagccct tcttcagcag ctgcctaaat gactgtttga gacacgctgt gactgtgccc 1440 tgcccagtaa tctcaaatac cacagttccc aagccagttg cagactacat tcccctgtgg 1500 <210> 120 <211> 500 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine IL-17RA signal peptide and exons 1-6 of murine IL-17RA, exons 8-13 of human IL-17RC, and exons 7-9 of murine Il-17RA <400> 120 Met Ala Ile Arg Arg Cys Trp Pro Arg Val Val Pro Gly Pro Ala Leu 1 5 10 15 Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Asn Val Leu Ala Pro Gly Arg Ala Ser 20 25 30 Pro Arg Leu Leu Asp Phe Pro Ala Pro Val Cys Ala Gln Glu Gly Leu 35 40 45 Ser Cys Arg Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 50 55 60 Pro Lys Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asn Ile Tyr Ile Asn Leu 65 70 75 80 Ser Val Ser Ser Thr Gln His Gly Glu Leu Val Pro Val Leu His Val 85 90 95 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Lys 115 120 125 Phe Gln Phe Leu Ser Met Leu Gln His His Arg Lys Arg Trp Arg Phe 130 135 140 Ser Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr 145 150 155 160 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Lys 165 170 175 Ser Lys Ile Ile Phe Val Pro Asp Cys Glu Asp Ser 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agtgtttcct ctacccagca cggagaatta gtccctgtgt tgcatgttga gtggaccctg 300 cagacagatg ccagcatcct gtacctcgag ggtgcagagc tgtccgtcct gcagctgaac 360 accaatgagc ggctgtgtgt caagttccag tttctgtcca tgctgcagca tcaccgtaag 420 cggtggcggt tttccttcag ccactttgtg gtagatcctg gccaggagta tgaagtgact 480 gttcaccacc tgccgaagcc catccctgat ggggacccaa accacaaatc caagatcatc 540 tttgtgcctg actgtgagga cagcaagatg aagatgacta cctcatgcgt gagctcagcc 600 ctgccctggc tcaacgtgtc agcagatggt gacaacgtgc atctggttct gaatgtctct 660 gaggagcagc acttcggcct ctccctgtac tggaatcagg tccagggccc cccaaaaccc 720 cggtggcaca aaaacctgac tggaccgcag atcattacct tgaaccacac agacctggtt 780 ccctgcctct gtattcaggt gtggcctctg gaacctgact ccgttaggac gaacatctgc 840 cccttcaggg aggacccccg cgcacaccag aacctctggc aagccgcccg actgcgactg 900 ctgaccctgc agagctggct gctggacgca ccgtgctcgc tgcccgcaga agcggcactg 960 tgctggcggg ctccgggtgg ggacccctgc cagccactgg tcccaccgct ttcctgggag 1020 aacgtcactg tggacaaggt tctcgagttc ccattgctga aaggccaccc taacctctgt 1080 gttcaggtga acagctcgga gaagctgcag ctgcaggagt gcttgtgggc tggcagcctt 1140 tgggatccca acatcactgt ggagaccttg gacacacagc atctgcgagt ggacttcacc 1200 ctgtggaatg aatccacccc ctaccaggtc ctgctggaaa gtttctccga ctcagagaac 1260 cacagctgct ttgatgtcgt taaacaaata tttgcgccca ggcaagaaga attccatcag 1320 cgagctaatg tcacattcac tctaagcaag tttcactggt gctgccatca ccacgtgcag 1380 gtccagccct tcttcagcag ctgcctaaat gactgtttga gacacgctgt gactgtgccc 1440 tgcccagtaa tctcaaatac cacagttccc aagccagttg cagactacat tcccctgtgg 1500 gagcccaaat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 1560 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 1620 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 1680 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 1740 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1800 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 1860 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1920 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1980 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 2040 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 2100 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 2160 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 2196 <210> 122 <211> 2196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine IL-17RA signal peptide and exons 1-6 of murine IL-17RA, exons 8-13 of human IL-17RC, and exons 7-9 of murine Il-17RA and Fc5 <400> 122 Ala Thr Gly Gly Cys Gly Ala Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr 1 5 10 15 Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Gly Thr 20 25 30 Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly 35 40 45 Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys 50 55 60 Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys 65 70 75 80 Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys 85 90 95 Cys Cys Gly Cys Gly Cys Cys 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480 gactgcttcg aggctgccct agggagtgag gtacgaatct ggtcctatac tcagcccagg 540 tacgagaagg aactcaacca cacacagcag ctgcctgagc ccaaatcttc agacaaaact 600 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgaggggg caccgtcagt cttcctcttc 660 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 720 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 780 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 840 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 900 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 960 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1020 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1080 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1140 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1200 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1260 tctccgggta aa 1272 <210> 124 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17RC signal peptide and exons 1-6 of human IL-17RC, and Fc5 <400> 124 Met Pro Val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg Ser Pro 1 5 10 15 Val Val Leu Ser Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His 20 25 30 Cys Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys 35 40 45 Leu Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr 50 55 60 His Leu Gln Thr Glu Leu Val Leu Arg Cys Gln Lys Glu Thr Asp Cys 65 70 75 80 Asp Leu Cys Leu Arg Val Ala Val His Leu Ala Val His Gly His Trp 85 90 95 Glu Glu Pro Glu Asp Glu Glu Lys Phe Gly Gly Ala Ala Asp Ser Gly 100 105 110 Val Glu Glu Pro Arg Asn Ala Ser Leu Gln Ala Gln Val Val Leu Ser 115 120 125 Phe Gln Ala Tyr Pro Thr Ala Arg Cys Val Leu Leu Glu Val Gln Val 130 135 140 Pro Ala Ala Leu Val Gln Phe Gly Gln Ser Val Gly Ser Val Val Tyr 145 150 155 160 Asp Cys Phe Glu Ala Ala Leu Gly Ser Glu Val Arg Ile Trp Ser Tyr 165 170 175 Thr Gln Pro Arg Tyr Glu Lys Glu Leu Asn His Thr Gln Gln Leu Pro 180 185 190 Glu Pro Lys Ser Ser 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cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 780 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 840 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 900 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccatcctc catcgagaaa 960 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1020 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1080 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1140 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1200 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1260 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1299 <210> 132 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized tissue Plasminogen Activator (otPA) pre-pro signal sequence and exons 8-10 and 14-16 of human IL-17RC, and Fc5 <400> 132 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 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tissue Plasminogen Activator (otPA) pre-pro signal sequence and exons 8-10 of human IL-17RC, and Fc5 <400> 133 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggcgc cgtcttcgtt 60 tcgctcagcc aggaaatcca tgccgagttg agacgcttcc gtagagccct gccctggctc 120 aacgtgtcag cagatggtga caacgtgcat ctggttctga atgtctctga ggagcagcac 180 ttcggcctct ccctgtactg gaatcaggtc cagggccccc caaaaccccg gtggcacaaa 240 aacctgactg gaccgcagat cattaccttg aaccacacag acctggttcc ctgcctctgt 300 attcaggtgt ggcctctgga acctgactcc gttaggacga acatctgccc cttcagggag 360 gagcccaaat cttcagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 420 ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 480 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 540 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 600 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 660 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaacc 720 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt 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accagttttc cgcacatgga gaaccacagt 240 tgctttgagc acatgcacca catacctgcg cccagaccag aagagttcca ccagcgatcc 300 aacgtcacac tcactctacg caaccttaaa gggtgctgtc gccaccaagt gcagatccag 360 cccttcttca gcagctgcct caatgactgc ctcagacact ccgcgactgt ttcctgccca 420 gaaatgccag acactccaga accaattccg gactacatgc ccctgtggga gcccaaatct 480 tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgtca 540 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 600 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 660 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 720 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 780 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 840 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 900 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 960 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1020 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 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aaggtaacca cgccatgcat gagctcaggc 600 agcctgtggg accccaacat caccgtggag accctggagg cccaccagct gcgtgtgagc 660 ttcaccctgt ggaacgaatc tacccattac cagatcctgc tgaccagttt tccgcacatg 720 gagaaccaca gttgctttga gcacatgcac cacatacctg cgcccagacc agaagagttc 780 caccagcgat ccaacgtcac actcactcta cgcaacctta aagggtgctg tcgccaccaa 840 gtgcagatcc agcccttctt cagcagctgc ctcaatgact gcctcagaca ctccgcgact 900 gtttcctgcc cagaaatgcc agacactcca gaaccaattc cggactacat gcccctgtgg 960 gccctgccct ggctcaacgt gtcagcagat ggtgacaacg tgcatctggt tctgaatgtc 1020 tctgaggagc agcacttcgg cctctccctg tactggaatc aggtccaggg ccccccaaaa 1080 ccccggtggc acaaaaacct gactggaccg cagatcatta ccttgaacca cacagacctg 1140 gttccctgcc tctgtattca ggtgtggcct ctggaacctg actccgttag gacgaacatc 1200 tgccccttca gggaggaccc ccgcgcacac cagaacctct ggcaagccgc ccgactgcga 1260 ctgctgaccc tgcagagctg gctgctggac gcaccgtgct cgctgcccgc agaagcggca 1320 ctgtgctggc gggctccggg tggggacccc tgccagccac tggtcccacc gctttcctgg 1380 gagaacgtca ctgtggacaa ggttctcgag ttcccattgc 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agggaggacc cccgcgcaca ccagaacctc 900 tggcaagccg cccgactgcg actgctgacc ctgcagagct ggctgctgga cgcaccgtgc 960 tcgctgcccg cagaagcggc actgtgctgg cgggctccgg gtggggaccc ctgccagcca 1020 ctggtcccac cgctttcctg ggagaacgtc actgtggaca aggttctcga gttcccattg 1080 ctgaaaggcc accctaacct ctgtgttcag gtgaacagca cagagaagct gcagctgcag 1140 gagtgcttgt gggctgactc cctggggcct ctcaaagacg atgtgctact gttggagaca 1200 cgaggccccc aggacaacag aacactctgt gccttggaac ccagtggctg tacttcacta 1260 cccagcaaag cctccacgag ggcagctcgc cttggagagt acttactaca agacctgcag 1320 tcaggccagt gtctgcagct atgggacgat gacttgggag cgctatgggc ctgccccatg 1380 gacaaataca tccacaagga gcccaaatct tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 1440 ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 1500 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1560 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1620 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1680 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1740 tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1800 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1860 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1920 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1980 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 2040 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 2094 <210> 156 <211> 698 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exons 1-6 and 8-16 of IL17RC with Ser to Thr substitutions at residues 120, 215, 228, 374, and 408 and Fc5 <400> 156 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Leu Ser Gln Glu Ile His Ala Glu Leu Arg Arg 20 25 30 Phe Arg Arg Leu Glu Arg Leu Val Gly Pro Gln Asp Ala Thr His Cys 35 40 45 Ser Pro Gly Leu Ser Cys Arg Leu Trp Asp Ser Asp Ile Leu Cys Leu 50 55 60 Pro Gly Asp Ile Val Pro Ala Pro Gly Pro Val Leu Ala Pro Thr His 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tggaccgcag atcattacct tgaaccacac agacctggtt 780 ccctgcctct gtattcaggt gtggcctctg gaacctgact ccgttaggac gaacatctgc 840 cccttcaggg aggacccccg cgcacaccag aacctctggc aagccgcccg actgcgactg 900 ctgaccctgc agagctggct gctggacgca ccgtgctcgc tgcccgcaga agcggcactg 960 tgctggcggg ctccgggtgg ggacccctgc cagccactgg tcccaccgct ttcctgggag 1020 aacgtcactg tggacaaggt tctcgagttc ccattgctga aaggccaccc taacctctgt 1080 gttcaggtga acagctcgga gaagctgcag ctgcaggagt gcttgtgggc tgactccctg 1140 gggcctctca aagacgatgt gctactgttg gagacacgag gcccccagga caacagatcc 1200 ctctgtgcct tggaacccag tggctgtact tcactaccca gcaaagcctc cacgagggca 1260 gctcgccttg gagagtactt actacaagac ctgcagtcag gccagtgtct gcagctatgg 1320 gacgatgact tgggagcgct atgggcctgc cccatggaca aatacatcca caaggagccc 1380 aaatcttcag acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca 1440 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 1500 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 1560 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 1620 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1680 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccatcct ccatcgagaa aaccatctcc 1740 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1800 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1860 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1920 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1980 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 2040 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 2070 <210> 158 <211> 690 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17RA signal peptide and exons 1-6 of IL-17RA and exons 8-16 of IL-17RC and Fc5 <400> 158 Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser 20 25 30 Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu 35 40 45 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp 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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 336 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 384 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc 432 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 480 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 528 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 576 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 624 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 672 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 696 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 175 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc10 immunoglobulin heavy chain constant region <400> 175 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 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gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag 240 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag 288 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc 336 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc 384 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc 432 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc 480 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac 528 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac 576 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc 624 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag 672 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 696 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 180 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc5 immunoglobulin heavy chain constant region <400> 180 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 181 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Murine Il-17RA signal peptide <400> 181 Met Ala Ile Arg Arg Cys Trp Pro Arg Val Val Pro Gly Pro Ala Leu 1 5 10 15 Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Asn Val Leu Ala Pro Gly Arg Ala 20 25 30 <210> 182 <211> 1974 <212> 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Cys Val Arg 85 90 95 ttt gag ttt ctg tcc aaa ctg agg cat cac cac agg cgg tgg cgt ttt 336 Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 100 105 110 acc ttc agc cac ttt gtg gtt gac cct gac cag gaa tat gag gtg acc 384 Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr 115 120 125 gtt cac cac ctg ccc aag ccc atc cct gat ggg gac cca aac cac cag 432 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln 130 135 140 tcc aag aat ttc ctt gtg cct gac tgt gag cac gcc agg atg aag gta 480 Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val 145 150 155 160 acc acg cca tgc atg agc tca gcc ctg ccc tgg ctc aac gtg tca gca 528 Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala 165 170 175 gat ggt gac aac gtg cat ctg gtt ctg aat gtc tct gag gag cag cac 576 Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His 180 185 190 ttc ggc ctc tcc ctg tac tgg aat cag gtc cag ggc ccc cca aaa ccc 624 Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro 195 200 205 cgg tgg cac aaa aac ctg act gga ccg cag atc att acc ttg aac cac 672 Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His 210 215 220 aca gac ctg gtt ccc tgc ctc tgt att cag gtg tgg cct ctg gaa cct 720 Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro 225 230 235 240 gac tcc gtt agg acg aac atc tgc ccc ttc agg gag gac ccc cgc gca 768 Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala 245 250 255 cac cag aac ctc tgg caa gcc gcc cga ctg cga ctg ctg acc ctg cag 816 His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln 260 265 270 agc tgg ctg ctg gac gca ccg tgc tcg ctg ccc gca gaa gcg gca ctg 864 Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu 275 280 285 tgc tgg cgg gct ccg ggt ggg gac ccc tgc cag cca ctg gtc cca ccg 912 Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro 290 295 300 ctt tcc tgg gag aac gtc act gtg gac aag gtt ctc gag ttc cca ttg 960 Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu 305 310 315 320 ctg aaa ggc cac cct aac ctc tgt gtt cag gtg aac agc tcg gag aag 1008 Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys 325 330 335 ctg cag ctg cag gag tgc ttg tgg gct gac tcc ctg ggg cct ctc aaa 1056 Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys 340 345 350 gac gat gtg cta ctg ttg gag aca cga ggc ccc cag gac aac aga tcc 1104 Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser 355 360 365 ctc tgt gcc ttg gaa ccc agt ggc tgt act tca cta ccc agc aaa gcc 1152 Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala 370 375 380 tcc acg agg gca gct cgc ctt gga gag tac tta cta caa gac ctg cag 1200 Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln 385 390 395 400 tca ggc cag tgt ctg cag cta tgg gac gat gac ttg gga gcg cta tgg 1248 Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp 405 410 415 gcc tgc ccc atg gac aaa tac atc cac aag gag ccc aaa tct tca gac 1296 Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp 420 425 430 aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca 1344 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala 435 440 445 ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc 1392 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 450 455 460 tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa 1440 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 465 470 475 480 gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat 1488 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 485 490 495 aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt 1536 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 500 505 510 gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 1584 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 515 520 525 gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag 1632 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu 530 535 540 aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac 1680 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 545 550 555 560 acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg 1728 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 565 570 575 acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1776 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 580 585 590 gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1824 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 595 600 605 ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac 1872 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 610 615 620 aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat 1920 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 625 630 635 640 gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg 1968 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 645 650 655 ggt aaa 1974 Gly Lys <210> 183 <211> 658 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exons 1-6 of IL-17RA with an N-terminal Serine deletion, exons 8-16 of IL-17RC and Fc5 <400> 183 Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu 1 5 10 15 Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His 20 25 30 Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu 35 40 45 His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile 50 55 60 Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala 65 70 75 80 Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg 85 90 95 Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe 100 105 110 Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr 115 120 125 Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln 130 135 140 Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val 145 150 155 160 Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Ala Leu Pro Trp Leu Asn Val Ser Ala 165 170 175 Asp Gly Asp Asn Val His Leu Val Leu Asn Val Ser Glu Glu Gln His 180 185 190 Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Trp Asn Gln Val Gln Gly Pro Pro Lys Pro 195 200 205 Arg Trp His Lys Asn Leu Thr Gly Pro Gln Ile Ile Thr Leu Asn His 210 215 220 Thr Asp Leu Val Pro Cys Leu Cys Ile Gln Val Trp Pro Leu Glu Pro 225 230 235 240 Asp Ser Val Arg Thr Asn Ile Cys Pro Phe Arg Glu Asp Pro Arg Ala 245 250 255 His Gln Asn Leu Trp Gln Ala Ala Arg Leu Arg Leu Leu Thr Leu Gln 260 265 270 Ser Trp Leu Leu Asp Ala Pro Cys Ser Leu Pro Ala Glu Ala Ala Leu 275 280 285 Cys Trp Arg Ala Pro Gly Gly Asp Pro Cys Gln Pro Leu Val Pro Pro 290 295 300 Leu Ser Trp Glu Asn Val Thr Val Asp Lys Val Leu Glu Phe Pro Leu 305 310 315 320 Leu Lys Gly His Pro Asn Leu Cys Val Gln Val Asn Ser Ser Glu Lys 325 330 335 Leu Gln Leu Gln Glu Cys Leu Trp Ala Asp Ser Leu Gly Pro Leu Lys 340 345 350 Asp Asp Val Leu Leu Leu Glu Thr Arg Gly Pro Gln Asp Asn Arg Ser 355 360 365 Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala 370 375 380 Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly Glu Tyr Leu Leu Gln Asp Leu Gln 385 390 395 400 Ser Gly Gln Cys Leu Gln Leu Trp Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp 405 410 415 Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr Ile His Lys Glu Pro Lys Ser Ser Asp 420 425 430 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala 435 440 445 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 450 455 460 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 465 470 475 480 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 485 490 495 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 500 505 510 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 515 520 525 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu 530 535 540 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 545 550 555 560 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 565 570 575 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 580 585 590 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 595 600 605 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 610 615 620 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 625 630 635 640 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 645 650 655 Gly Lys <210> 184 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(96) <400> 184 atg ggg gcc gca cgc agc ccg ccg tcc gct gtc ccg ggg ccc ctg ctg 48 Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu 1 5 10 15 ggg ctg ctc ctg ctg ctc ctg ggc gtg ctg gcc ccg ggt ggc gcc tcc 96 Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser 20 25 30 <210> 185 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser 20 25 30 <210> 186 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL17A CH6 coding sequence <400> 186 atgactcctg ggaagacctc attggtgtca ctgctactgc tgctgagcct ggaggccata 60 gtgaaggcag gaatcacaat cccacgaaat ccaggatgcc caaattctga ggacaagaac 120 ttcccccgga ctgtgatggt caacctgaac atccataacc ggaataccaa taccaatccc 180 aaaaggtcct cagattacta caaccgatcc acctcacctt ggaatctcca ccgcaatgag 240 gaccctgaga gatatccctc tgtgatctgg gaggcaaagt gccgccactt gggctgcatc 300 aacgctgatg ggaacgtgga ctaccacatg aactctgtcc ccatccagca agagatcctg 360 gtcctgcgca gggagcctcc acactgcccc aactccttcc ggctggagaa gatactggtg 420 tccgtgggct gcacctgtgt caccccgatt gtccaccatg tggcctccgg acaccatcac 480 catcatcatt aa 492 <210> 187 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL17A-CH6 <400> 187 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala Ser Gly His His His 145 150 155 160 His His His <210> 188 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL17F-CEE coding sequence <400> 188 atgacagtga agaccctgca tggcccagcc atggtcaagt acttgctgct gtcgatattg 60 gggcttgcct ttctgagtga ggcggcagct cggaaaatcc ccaaagtagg acatactttt 120 ttccaaaagc ctgagagttg cccgcctgtg ccaggaggta gtatgaagct tgacattggc 180 atcatcaatg aaaaccagcg cgtttccatg tcacgtaaca tcgagagccg ctccacctcc 240 ccctggaatt acactgtcac ttgggacccc aaccggtacc cctcggaagt tgtacaggcc 300 cagtgtagga acttgggctg catcaatgct caaggaaagg aagacatctc catgaattcc 360 gttcccatcc agcaagagac cctggtcgtc cggaggaagc accaaggctg ctctgtttct 420 ttccagttgg agaaggtgct ggtgactgtt ggctgcacct gcgtcacccc tgtcatccac 480 catgtgcagt ccggagaaga atatatgccc atggaataa 519 <210> 189 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL17F-CEE <400> 189 Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ser Ile Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys 20 25 30 Ile Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gln Lys Pro Glu Ser Cys Pro 35 40 45 Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp Ile Gly Ile Ile Asn Glu 50 55 60 Asn Gln Arg Val Ser Met Ser Arg Asn Ile Glu Ser Arg Ser Thr Ser 65 70 75 80 Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Glu 85 90 95 Val Val Gln Ala Gln Cys Arg Asn Leu Gly Cys Ile Asn Ala Gln Gly 100 105 110 Lys Glu Asp Ile Ser Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Thr Leu 115 120 125 Val Val Arg Arg Lys His Gln Gly Cys Ser Val Ser Phe Gln Leu Glu 130 135 140 Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val Ile His 145 150 155 160 His Val Gln Ser Gly Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 165 170 <210> 190 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EE tag <400> 190 Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

Claims (30)

  1. IL-17A 및/또는 IL-17F에 결합할 수 있고, SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 32-458과 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 잔기 1-426를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린 부분(immunoglobulin moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 면역글로불린 중쇄 불변 영역인 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:183의 아미노산 잔기 1-657 또는 1-658을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 분비 신호 서열(secretory signal sequence)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 면역글로불린 부분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 면역글로불린 중쇄 불변 영역인 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 32-690과 90% 이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 SEQ ID NO: 158의 아미노산 잔기 459-689 또는 459-690을 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 면역글로불린 부분은 SEQ ID NO: 175의 아미노산 잔기 1-232를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 더 부착되어 PEG화(PEGylation)된 것을 특징으로 하는, 분리된 폴리펩티드.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는, 분리된 핵산 분자.
  14. 하기의 작동가능하게 연결된 인자(element)들을 포함하는 발현 벡터:
    a) 전사 프로모터(promoter),
    b) 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 세그먼트(segment), 및
    c) 전사 종결인자(terminator).
  15. 제 14 항의 발현 벡터를 포함하는 배양세포로서, 상기 DNA 세그먼트에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현하는 배양세포.
  16. 하기의 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 생산방법:
    제 14 항의 발현 벡터가 도입된 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 상기 DNA 세그먼트에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 발현하는 단계, 및
    상기 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계.
  17. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 분리된 폴리펩티드, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  18. 면역질환을 갖는 개체에, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 유효량 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 면역질환은, 건선(psoriasis); 건선 관절염(psoriatic arthritis); 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis); 라임 관절염(Lyme disease arthritis); 연쇄상구균 세포벽 유발 관절염(streptococcal cell wall (SCW)-induced arthritis); 궤양성 대장염(ulcerative colitis); 크론병(Crohn's disease); 과민성 장증후군(irritable bowel syndrome (IBS)); 게실증(diverticulosis); 췌장염(pancreatitis); 제1형 당뇨병(type I diabetes (IDDM)); 그레이브스병(Graves Disease); 아토피성 피부염(atopic dermatitis); 접촉성피부염(contact dermatitis); 면역매개성 신장질환(immune-mediated renal disease); 다발성 경화증(multiple sclerosis (MS)); 전신성 경화증(systemic sclerosis); 피부 경화증(scleroderma); 신증후군(nephrotic syndrome); 패혈증(sepsis); 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus (SLE)); 중증 근무력증(myasthenia gravis); 사구체경화증(glomerulosclerosis); 막성콩팥병증(membranous neuropathy); 신동맥경화증(renal arteriosclerosis); 사구체신염(glomerulonephritis); 아밀로이드증(amyloidosis); 캐슬만씨 병(Castleman's Disease); 비장종대(splenomegaly); 이식거부반응(transplant rejection); 이식편대숙주병(graft-versus-host disease (GVHD)); 동맥경화증(atherosclerosis); 내독소혈증(endotoxemia); 독성 쇼크 증후군(toxic shock syndrome); 패혈증 쇼 크(septic shock); 다장기부전(multiple organ failure); 염증성 폐상처(inflammatory lung injury); 천식(asthma); 성인 호흡기 질환(adult respiratory disease (ARD)); 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease (COPD)); 낭성섬유증(cystic fibrosis); 알러지성 천식(allergic asthma); 알러지성 관절염(allergic rhinitis); 기도 과반응(airway hyper-responsiveness); 만성기관지염(chronic bronchitis); 습진(eczema); 복막염증으로 유발된 복강내 협착(intraabdominal adhesions) 및/또는 농양(abscesses); 낭창성 신염(lupus nephritis); 뇌졸증(stroke); 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis); 간질성 각막염(herpetic stromal keratitis); 골다공증(osteoporosis); 신경염(neuritis); 재발협착증(restenosis); 및 가와사키병(Kawasaki disease)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 면역질환은 만성 면역질환인 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 만성 면역질환은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease:IBD), 관절염, 아토피성 피부염 및 건선으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염 및 크론병으로 이 루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염 및 건선 관절염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  24. 제 18 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 급성 염증성 질환인 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 급성 염증성 질환은 내독소혈증, 패혈증 및 독성 쇼크 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  26. 제 18 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 자가면역 질환인 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 제1형 당뇨병(IDDM), 다발성 경화증(MS), 전신성 홍반성 낭창(SLE), 중증 근무력증, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환(IBD) 및 과민성 장증후군(IBS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  28. 제 18 항에 있어서, 상기 면역질환은 만성 면역성 기도 질환인 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 만성 면역성 기도 질환은, 천식, 성인 호흡기 질환(ARD), 만성폐쇄성폐질환(COPD), 낭성섬유증, 알러지성 천식, 알러지성 관절염, 기도 과반응 및 만성 기관지염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
  30. 제 18 항에 있어서, 상기 면역질환은 이식거부반응 및 이식편대숙주병(GVHD)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 개체에서의 면역질환의 치료방법.
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