KR20100008827A - 인간유래 백혈병 세포주를 이용한 발암 동물모델, 그의제조방법 및 이를 이용한 항암 치료제의 검색방법 - Google Patents
인간유래 백혈병 세포주를 이용한 발암 동물모델, 그의제조방법 및 이를 이용한 항암 치료제의 검색방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20100008827A KR20100008827A KR1020080069401A KR20080069401A KR20100008827A KR 20100008827 A KR20100008827 A KR 20100008827A KR 1020080069401 A KR1020080069401 A KR 1020080069401A KR 20080069401 A KR20080069401 A KR 20080069401A KR 20100008827 A KR20100008827 A KR 20100008827A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- leukemia
- animal
- animal model
- mass
- cell line
- Prior art date
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 35
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 title description 10
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 5
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims abstract description 109
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 30
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000036737 immune function Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 229940125648 antineoplastic drug candidate Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 claims description 21
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 claims description 21
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012909 foetal bovine serum Substances 0.000 claims 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 abstract description 25
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 abstract 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 abstract 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- 229940080856 gleevec Drugs 0.000 description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 3-[6-[4-(trifluoromethoxy)anilino]-4-pyrimidinyl]benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC(C=2N=CN=C(NC=3C=CC(OC(F)(F)F)=CC=3)C=2)=C1 WEVYNIUIFUYDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N Dasatinib Chemical compound C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1Cl ZBNZXTGUTAYRHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002448 dasatinib Drugs 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000002067 L01XE06 - Dasatinib Substances 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 4
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N nilotinib Chemical compound C1=NC(C)=CN1C1=CC(NC(=O)C=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)=CC(C(F)(F)F)=C1 HHZIURLSWUIHRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000005536 L01XE08 - Nilotinib Substances 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011604 leukemia animal model Methods 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229960001346 nilotinib Drugs 0.000 description 3
- 210000004214 philadelphia chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241000132023 Bellis perennis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 208000000526 Experimental Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000014619 adult acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011184 adult acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 102000004441 bcr-abl Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010056708 bcr-abl Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 208000018805 childhood acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000011633 childhood acute lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000010726 hind limb paralysis Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- XGXNTJHZPBRBHJ-UHFFFAOYSA-N n-phenylpyrimidin-2-amine Chemical compound N=1C=CC=NC=1NC1=CC=CC=C1 XGXNTJHZPBRBHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/20—Animals treated with compounds which are neither proteins nor nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 발암 동물모델과 그의 제조방법, 및 상기 발암 동물모델을 이용한 항암제의 검색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하여 종괴를 형성시키는 단계;를 포함하는 종괴를 형성하는 발암 동물모델의 제조방법과 이에 의하여 제조된 발암 동물모델을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제조된 발암 동물모델을 이용하여 종괴를 관찰함으로써 항암 치료제 후보물질의 종류 또는 농도에 따른 치료효능을 검색하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 동물모델에 형성된 종괴를 관찰함으로써 고형암 및 혈액암 모두에 대한 항암 효과를 부작용 없이 신속하고 지속적으로 관찰하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.
발암 동물모델, 백혈병, 항암치료제, 백혈병치료제, 효능 검색
Description
본 발명은 발암 동물모델과 그의 제조방법, 및 상기 발암 동물모델을 이용한 항암제의 검색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하여 종괴를 형성시키는 단계;를 포함하는 종괴를 형성하는 발암 동물모델의 제조방법과 이에 의하여 제조된 발암 동물모델, 및 상기 제조된 발암 동물모델을 이용하여 종괴를 관찰함으로써 항암 치료제 후보물질의 종류 또는 농도에 따른 치료효능을 검색하는 용도에 관한 것이다.
백혈병 (leukemia)은 종종 필라델피아 염색체에 대해 양성반응을 보이는 암의 일종이다. 구체적으로, 만성 골수성 백혈병 (chronic myeloid leukemia)은 98%, 성인 급성 림프구성 백혈병(ALL)은 20 내지 30%, 소아 급성 림프구성 백혈병은 5% 그리고 급성 골수성 백혈병은 3% 정도가 필라델피아 염색체에 대한 양성반응을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 이러한 필라델피아 염색체는 9번 염색체와 22번 염색체 간의 전좌에 의해 유발되고 Bcr-Abl 티로신 키나제 (tyrosine kinase)의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.
이러한 백혈병의 치료제를 개발하기 위한 시도로서, 현재까지는 백혈병 치료제의 후보물질들의 검색 과정에서 각종 종양세포들을 이용하는 MTT (tetrazolium-based colorimetric) 분석법 및 FACS (fluorescence activated cell sorter) 분석법 등이 많이 사용되고 왔다. 그러나 최근에는 만성 골수성 백혈병 세포주 등을 이용하여 제작한 백혈병의 동물모델이 개발되고 이를 이용하여 새로운 항암 후보물질을 검색하려는 연구들이 시도되고 있다.
실제로 실험동물을 이용하는 항암제 연구들이 다음과 같이 보고된 바 있다. 먼저 상기 Abl 키나제 억제제 (ATP-competitive inhibitors)로서, 2-페닐아미노피리딘을 기본으로 한 화합물들(2-phenylamino pyrimidine-based compounds)로서, 노바티스사에서는 실험 쥐에게 백혈병 세포를 피하 주사하여 백혈병의 고형암을 유발시킨 다음 글리벡을 복강 투여하여 항암 효능을 조사하였다 (Brian J. Druker, Shu Tamura, Elisabeth Buchdunger, Sayuri Ohno, Gerald M. Segal, Shane Fanning, Jurg Zimmermann & Nicholas B. Lydon, Nature Medicine, 2: 5, May 1996). 또한, 노바티스사에서는 실험 쥐에게 인간 백혈병 세포를 피하 주사하여 백혈병의 고형암 을 유발시킨 다음 글리벡을 경구 및 복강 투여하여 항암 효능도 측정하였다 (Philip le Coutre, Luca Mologni, Loredana Cleris, Edoardo Marchesi, Elisabeth Buchdunger, Roberto Giardini, Franca Formelli, Carlo Gambacorti-Passerini, Journal of the National Cancer Institute, 91: 2, January 1999). 또한 노바티스사에서 실험 쥐에게 백혈병 세포를 정맥 주사하여 백혈병의 혈액암을 유발시킨 다음 글리벡 및 닐로티닙을 경구 투여하여 항암 효능을 조사하여 보고하였다 (Ellen Weisberg, Laurie Catley, Renee D. Wright, Daisy Moreno, Lolita Banerji, Arghya Ray, Paul W. Manley, Juergen Mestan, Doriano Fabbro, Jingrui Jiang, Elizabeth Hall-Meyers, Linda Callahan1, Jamie L. DellaGatta, Andrew L. Kung and James D. Griffin, Blood Oct, 2006; doi:10.1182/blood-2006-06-026377). 이외에도 노바티스사에서는 신경아세포종세포를 근육 주사하여 신경아세포종의 고형암을 유발시킨 다음 글리벡을 경구 투여하여 항암 효능을 측정한 바 있었다 (Kiichiro Beppu, Jerry Jaboine, Melinda S. Merchant, Crystal L. Mackall, Carol J. Thiele, Journal of the National Cancer Institute, 96: 1, January 2004). 또한, 노바티스사에서 실험 쥐에게 백혈병 세포를 정맥 주사하여 백혈병의 혈액암을 유발시킨 다음 글리벡을 경구 투여하여 치료 효능을 조사하여 보고하였다 (Nicholas C. Wolff and Robert L Iliaria Jr, Blood, 98: 9, November 2001).
이외에도 브리스톨마이어스스퀴브(BMS) 사에서는 실험 쥐에게 백혈병 세포를 정맥 주사하여 백혈병의 혈액암을 유발시킨 다음 다사티닙 약제를 경구 투여하여 항암 효능을 측정하였다 (Neil P. Shah, Chris Tran, Francis Y. Lee, Ping Chen, Derek Norris, Charles L. Sawyers, Science 305:16, July 2004). 또한, 상기와 동일한 과정으로 PD166326 약제 등이 경구 투여되는 연구도 이루어졌다 (Nicholas C. Wolff, Darren R. Veach, William P. Tong, William G. Bornmann, Bayard Clarkson, and Robert L. Ilaria Jr, Blood, 105: 10, 15 May 2005).
더 나아가, 일본 신야꾸사에서는 NS-187(INNO-406) 물질의 효능을 노바티스사의 글리벡과 비교하기 위하여 실험 쥐에게 인간 및 쥐의 백혈병 세포를 피하 및 정맥 주사하여 백혈병의 혈액암 및 고형암을 유발시킨 다음, 이들 후보물질들을 모두 경구 투여하여 항암 효능을 분석하여 보고하였다 (Shinya Kimura, Haruna Naito, Hidekazu Segawa, Junya Kuroda, Takeshi Yuasa, Kiyoshi Sato, Asumi Yokota1, Yuri Kamitsuji, Eri Kawata, Eishi Ashihara, Yohei Nakaya, Haruna Naruoka2, Tatsushi Wakayama, Kimio Nasu, Tetsuo Asaki, Tomoko Niwa2, Kazuko Hirabayashi and Taira Maekawa, Blood, 106: 3948-3954, Dec 2005). 또한, 상기와 동일한 과정으로 WP1130 약제 등이 복강 투여되는 연구도 이루어졌다 (Geoffrey A. Bartholomeusz, Moshe Talpaz, Vaibhav Kapuria1, Ling-Yuan Kong, Shimei Wang, Zeev Estrov, Waldemar Priebe, Ji Wu and Nicholas and J. Donato, Blood (First Edition Paper), prepublished online January 3, 2007; DOI 10.1182/blood-2006-02-005579).
본 발명자들은 백혈병을 치료할 수 있는 다양한 후보물질들을 검색하면서 인간 만성 골수성 백혈병 세포주 및 글리벡 내성 세포주를 사용하여 생체 외 (in vitro) 조건하에서 이들의 항암 효능을 조사한 바 있었다. 또한, 상기 항암 효능 을 노바티스사의 표적 항암제인 이매티닙 (Imatinib; 글리벡) 및 닐로티닙 (Nilotinib, AMN107) 그리고 브리스톨 마이어스 스퀴브 사의 다사티닙 (Dasatinib, BMS-354825)과 비교하여 분석하였으며, 그 정확한 작용 기전 등도 조사하여 보고하였다. 그러나 상기 생체 외 조건은 백혈병에 대한 치료 효능을 상세히 조사할 수 없으므로, 적절한 생체 내 (in vivo) 조건을 가지는 백혈병 질환에 대한 동물모델을 개발하는 것이 절실히 요구된다.
이에 본 발명자들은 새로운 발암 동물모델을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 면역 결핍 마우스를 선발하고 이를 안정화하여 면역 기능을 저하시키고; 인간 백혈병 K562 세포주를 피하 주사하는; 과정으로 백혈병의 마우스 동물모델을 제작한 다음 다양한 후보물질을 적절한 용매에 현탁하여 상기 동물모델에 경구 투여하는 과정이 백혈병 치료제의 효능을 검사하는 데 유용한 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 발암 동물모델과 그의 제조방법, 및 상기 발암 동물모델을 이용한 항암제의 검색방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 상세하게는 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하여 종괴를 형성시키는 단계;를 포함하는 종괴를 형성하는 발암 동물모델의 제조방법과 이에 의하여 제조된 발암 동물모델, 및 상기 제조된 발 암 동물모델을 이용하여 종괴를 관찰함으로써 항암 치료제 후보물질의 종류 또는 농도에 따른 치료효능을 검색하는 용도를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하여 종괴를 형성시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 종괴가 형성되는 발암 동물모델의 제조방법을 제공한다.
상기 설치류동물은 마우스가 바람직하고 더욱 바람직하게는 상기 마우스는 면역 결핍 마우스를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 SCID (severe combined immunodeficiency) 마우스를 사용하였다.
또한 상기 면역기능을 저하시키기 위하여 사이클로포스파마이드를 상기 동물에 투여할 수 있다. 바람직하게는 상기 사이클로포스파마이드는 생리 식염수에 녹여 백혈병 세포를 주입하기 전 46~50 시간과 22~26시간 두 차례 첨가하는 것이 바람직하고, 이 때 사이클로포스파마이드는 부피 200 ul 이하, 용량 100 내지 200 mg/kg 범위로 조정하여 복강 주사하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 동물에 주입되는 백혈병 세포는 인간 유래 백혈병 세포주 K562 인 것이 바람직하고, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 K562 세포를 RPMI 1640 배지로 배양하여 피하 주사로 복부에 주입하였다.
또한 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제작된 종괴가 형성되는 발암 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제작된 종괴가 형성되는 상기 발암 동물모델을 항암 치료제 후보물질의 효능 검색에 사용하는 용도를 제공한다. 상기 항암 치료제 후보물질은 적절한 용매에 현탁하고, 상기 마우스 동물모델에 경구 또는 피하 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 항암제의 검색에 사용될 수 있는 암 발병의 동물모델을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 안정화된 상태에서 면역 기능을 저하시킨 다음 암세포를 주입하여 암을 유발시킨 암 발병의 동물모델을 제공한다. 또한, 본 발명은 면역 결핍 마우스에 인간 백혈병 K562 세포주를 주입하여 암을 유발시킨 백혈병의 마우스 동물모델을 제공한다. 또한, 본 발명은 각종 항암제들에 대한 후보물질들을 검색하는 데 사용하는 상기 암 발병의 동물모델의 용도를 제공한다. 이 때, 상기 항암제로는 백혈병 치료제 등이 포함되고 상기 암에는 백혈병 등이 포함된다.
따라서 본 발명은 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하여 종괴를 형성시키는 단계;를 포함하여 이루어지는 종괴가 형성되는 암 발병의 동물모델의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 설치류동물의 안정화를 위하여 실험동물의 반입 후 무균 사육실에서 1주일 내외의 안정기를 거쳐 안정화시키는 것이 바람직하고, 상기 실험동물로는 면역 결핍 동물을 사용하는 것이 바람직하며, 상기 면역 결핍 동물로는 SCID (severe combined immunodeficiency) 마우스를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 실험동물의 안정화 단계에 더하여, 상기 안정기를 거친 실험동물은 암세포를 주입하기 전에 미리 동물 무게를 측정하고 안와정맥으로부터 채혈한 혈액의 백혈구의 수치를 조사한다. 이 때 백혈구 수치는 CBC (complete blood cell counter)를 사용하거나 RBC 분해 완충용액 (RBC lysis buffer)에 용해시킨 다음 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하는 것이 바람직하다. 상기 RBC 분해 완충용액은 388 mM NH4Cl, 29.7 mM NaHCO3 및 25 M Na2EDTA 의 조성으로 만들어지는 것이 바람직하고, 또한 혈액과의 비율 10 : 190 범위로 조정하여 1분 내외로 반응시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 안정화시킨 동물의 면역기능을 저하시키기 위하여 상기 동물에 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide)를 처리하는 것이 바람직하다. 상기 백혈병세포주를 주입하기 전 48 시간, 24시간에 각각 한차례씩 생리식염수에 녹인 사이클로포스파마이드를 150 mg/kg 용량으로 최대 주입량 200 ul가 넘지 않게 마우스의 복강에 주사하여 면역 기능이 저하된 상태로 만들 수 있다. 복강 투여시 대장 을 통과하여 대장내로 약물이 주입되지 않도록 주사바늘을 찌른 후 압력이 가해지는지 여부를 확인하는 것이 바람직하다.
또한 상기 암 세포주의 주입에 있어 상기 암 세포로는 동물 및 인간으로부터 유래한 암세포라면 모두 사용될 수 있고, 특히 인간 백혈병 세포주 K562을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 인간 백혈병 K562 세포주는 10% 우태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (pencilline-streptomycin)이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 계대 배양한 다음 개체당 5 X 106 내지 5 X 107개를 피하 주입하는 것이 바람직하다. 이 때 실험동물은 케타민 (ketamine) 100 mg/kg 및 자일라진 (xylazine) 15 mg/kg 등을 사용하여 전신 마취하는 것이 바람직하고, 좌측 측복부에 피하 주사로 주입하는 것은 더욱 바람직하다. 상기 과정으로 세포 주입 후에는 매일 종괴의 변화와 실험 쥐의 체중을 측정하여 백혈병 유발 여부를 확인한다.
상기 과정으로 제조한 암 발병의 동물모델은 다양한 항암 후보물질들을 검색하는 데 사용될 수 있고, 이 때, 상기 항암제로는 백혈병 치료제 등이 포함되고 상기 암에는 백혈병 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 항암 후보물질을 적절한 용매에 현탁시키고; 상기 암 발병의 동물모델에 피하 또는 경구 투여하는 과정으로 이루어진 항암제의 검색방법을 제공한다.
상기 암 발병의 동물모델로는 인간 백혈병 세포주를 주입하여 백혈병을 유발시킨 백혈병의 동물모델을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 항암제로는 백혈병 치 료제를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 동물모델에 세포를 주입한 후 3주 전후 기간에 후보약물을 투여하여 암 치료 효능을 조사하는 것이 바람직하다. 상기 후보약물은 0.5% 메틸 셀룰로스 (methyl cellulose) 용매 등을 사용하여 용해시키는 것이 바람직하고 이 때 초음파 분쇄기를 사용하여 현탁시키는 것은 더욱 바람직하다. 상기 후보약물의 현탁액은 존데 (zonde)를 이용하여 1일 1회 정도로 경구 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 후보약물을 투여하는 기간에는 일정간격으로 종괴 크기의 변화와 체중 변화를 기록하고 사망 시에는 부검을 실시하여 비장의 크기와 무게를 측정해두는 것이 바람직하다.
본 발명은 발암 동물모델, 이를 항암 치료제의 효능 검색에 사용하는 용도 및 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하는 단계;를 포함하는 발암 동물모델의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 발암 동물모델에 형성되는 종괴를 관찰함으로써 고형암 및 혈액암 모두에 대한 항암 효과를 부작용 없이 신속하고 지속적으로 관찰하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1. 백혈병의 동물모델의 제조 I>
본 발명에서는 백혈병의 마우스 동물모델을 제작하기 위하여, 먼저 예비 실험으로서 면역 결핍 SCID (severe combined immunodeficiency) 마우스인 4주령의 마우스 CBySmm.CB17-Prkdcscid/J 를 선발하여 무균 사육실에서 1주간의 안정기를 거치게 하였다. 또한, EDTA 튜브에 안와 정맥으로부터 채혈한 혈액으로 CBC (Complete Blood Count)를 실시하여 만성 골수성 백혈병을 유발시키기 직전의 백혈구 수치를 측정하였다.
또한, 인간 백혈병 세포주인 K562 세포주는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(pencilline-streptomycin)이 첨가된 RPMI1640 배지에서 일주일간 계대 배양한 다음, 개체 당 5 X 106개 정도의 백혈병 세포주를 미정맥 (lateral tail vein)을 통해 상기 마우스에 주입하였다. 상기와 같이 세포를 주입하기 48시간과 24시간 전에 2차례에 걸쳐 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide)를 150 mg/kg 용량으로 마우스 복강에 주사하여 면역 기능을 억제시켰다. 또한, K562 세포를 주입하고 3주 내지 4주가 경과한 후에 혈액 내의 백혈구 수치를 다시 측정하였다. 이로부터 백혈병의 유발이 의심되는 개체에는 14일간 백혈병 치료제의 후보약물인 IY5511-HCl 및 이매티닙을 각각 30 mg/kg, 120 mg/kg로 투여하였다.
이 때, 동일한 주령의 SCID 마우스 30마리를 각각 5 실험군으로 나누고 각각 K562 세포를 주입하지 않는 군 (음성 대조군), K562 세포 주입 후 약물을 처리하지 않는 군 (양성 대조군), 후보물질 IY5511-HCl를 처리한 군 및 이매티닙을 처리한 군으로 상기 동물모델에서 백혈병 치료제의 약효 실험을 실시하였다. 상기 후보물질은 각각 0.5% 메틸 셀룰로스 (methyl cellulose) 용매에 녹여 초음파 분쇄기로 현탁액을 만든 후 존데 (zonde)를 이용하여 1일 1회 경구 투여하였다.
상기 약물 투여를 종료한 후, 음성 대조군, 양성 대조군 및 약물 처리군에서 각각 말초혈액 검사와 생검을 실시하여 각 군 간의 체중, 비장의 무게 및 길이 그리고 백혈구 수치를 비교하였다.
<
실시예
2. 백혈병의 동물모델을 이용한
생체 내
약효 분석 I>
본 발명에서는 상기 실시예 1에 기술한 과정으로 제조한 백혈병의 동물 모델을 사용하여 다음과 같이 백혈병 치료제의 후보물질 효능을 조사한 다음 상기 마우스 동물모델이 항암제를 검색하는 데 효과적인지 여부를 조사하였다.
먼저, 1차 마우스 B6.CB17-Prkdcscid/SzJ 27마리를 선발하여 6주령에 K562 세포주를 주입하고 2주차 및 4주차에 CBC 하여 혈액 내의 백혈구 수치를 측정하였다. 그 결과, 27마리의 마우스에서 백혈병의 유발로 보이는 백혈구 수치의 증가가 관찰되지 않았다. 또한, 비장의 길이와 무게를 측정하기 위해 6마리를 생검한 결과에 서도 백혈병이 유발되지 않은 것으로 확인되었다.
또한 18주령의 1차 마우스 16마리에 K562 세포주를 주입하고 역시 2주차 및 4주차에 CBC 하여 혈액 내의 백혈구 수치를 측정한 결과, 16마리 모두에서 백혈병의 유발로 보이는 백혈구 수치의 증가가 관찰되지 않았다.
<
실시예
3. 백혈병 동물모델을 이용한
생체 내
약효 분석 Ⅱ>
본 발명에서는 하기 기술사항만을 제외하고 상기 실시예 1에 기술한 과정으로 제조한 백혈병의 동물모델을 사용하여 다음과 같이 후보물질의 효능을 측정한 다음 상기 마우스 동물모델이 항암제를 검색하는 데 효과적인지 여부를 조사하였다.
3차 마우스 CBySmm.CB17-Prkdcscid/J 30마리 중 15마리 (3마리 음성대조군, 12마리 세포 투여군)를 2군으로 나누어 일주일 간격으로 K562 세포주를 주입하였다. 그 결과, 세포 투여 후 4주차 및 3주차에 일부 개체에서 활동성 저하, 몸무게 감소가 나타났으며, 31일째 첫 사망 개체가 나타나기 시작하였다. 일부 개체에 실시한 CBC 에서는 백혈병 유발로 보이는 백혈구 수치의 증가는 볼 수 없었으나, 세포 투여 후 40일 및 41일째에 4마리에서 엉덩이 쪽에 백혈병 세포에 의해 유발된 것으로 보이는 종괴가 발견되었다. 또한 44일째 추가적으로 1마리에서 코 주위가 부어오르는 것이 발견되었다.
또한, 43일째부터 엉덩이에 종괴가 발생한 4마리를 각 2마리씩 2군으로 나누어 IY5511-HCl을 투여하기 시작하였으며 (2마리-약물 투여군/2마리-약물 무투여 대조군), 활동성이 저하된 개체, 뒷다리 마비 개체와 코에 종양이 생긴 개체에도 약물 투여를 실시하였다. 또한, 엉덩이에 종괴가 발생한 개체 중 약물 투여군 2마리는 약물 투여 10일째부터는 종양 크기가 현저히 감소하였으며, 18 일째부터는 외관상으로는 종괴를 관찰할 수 없을 정도까지 감소하였다. 반면 엉덩이 주위에 종양이 있는 개체 중 약물을 투여하지 않은 약물 무투여 대조군 2마리는 모두 시간이 경과함에 따라 종괴의 크기가 점진적으로 증가하였다. 이들 중 1마리는 K562 세포주를 주입하고 63일째, 약물 투여 개시 대조일로부터 20일째 죽었다. 엉덩이 종양이 있는 개체를 제외한 개체들은 약물 투여 후 5일에서 15일까지 생존하였다.
또한, 20일째 사망한 종양개체에서 분리한 종괴의 크기와 사망 직전 측정한 종양의 크기가 일치하는 것을 관찰할 수 있었다. 사망한 개체로부터 분리한 종괴를 파라핀 포매한 후 H&E-염색을 통해 관찰하고, 또한 BCR-ABL 유전자 탐침을 이용하여 FISH (fluorescent in situ hybridization) 법으로 확인하였다. 그 결과, 종괴는 미정맥을 통하여 주입한 인체 유래의 K562 세포인 것으로 입증되었다. 또한 종괴로부터 분리한 세포에서 트리졸 용액을 이용하여 RNA 를 분리한 다음 BCR-ABL 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)을 실시하여 유전자 증폭을 확인한 결과, K562 백혈병 세포 고유의 RNA 전사체인 b3a2 타입 유전자가 확인되었다. 따라서 SCID 마우스에 생긴 종괴가 만성 골수성 백혈병의 K562 세포에 의해 발생한 것을 알 수 있었다. 여기에 IY5511-HCl를 투여한 경 우 종괴 유발이 현저하게 감소하는 것도 확인하였다. 또한 IY5511-HCl을 투여하지 않은 개체 중 생존하고 있는 개체에서는 점진적으로 종괴의 크기가 증가하였고, K562 세포를 주입한 후 70일 정도부터는 뒷다리에 장애가 발생하여 보행도 불가능한 것으로 관찰되었다. 또한 IY5511-HCl 무투여군의 2마리는 약물 투여일로부터 각각 20일, 52일에 사망한 반면, 투여군은 150일이 지난 현재까지도 생존하였다.
<
실시예
4. 백혈병의 동물모델의 제조 Ⅱ>
본 발명에서는 백혈병의 동물모델을 제조하기 위하여, 본 실험으로서 면역 결핍 SCID 마우스를 선발하여 무균 사육실에서 1주간의 안정기를 거치게 하였다. 또한 인간 백혈병 세포주 K562 는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640 배지에서 계대 배양한 다음, 개체 당 5 X 107개 정도의 백혈병 세포를 전신 마취하 (ketamine 100 mg/kg, xylazine 15 mg/kg)에 좌측 측복부에 피하 주사 하여 상기 마우스에 주입하였다. 상기와 같이 세포를 주입하기 24시간과 48시간 전에 2차례에 걸쳐 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide)를 150 mg/kg 양으로 복강에 주사하여 면역 기능을 억제하였다. 또한 K562 세포를 주입한 후에는 매일 종괴의 변화와 실험 쥐의 체중을 측정하였다.
실제로 동일한 주령의 SCID 마우스 19마리 및 40마리를 각각 3 실험군 (대조군/IY5511-HCl 30 mg/kg/글리벡 150 mg/kg군) 및 6 실험군 (대조군/IY5511-HCl 10 mg/kg군/IY5511-HCl 30 mg/kg군/IY5511-HCl 100 mg/kg군/AMN107 30mg/kg군/글리벡 200 mg/kg군)으로 나누어 처리하였다. 또한, 각 실험군에는 K562 세포를 투여한 후 약물을 처리하지 않는 군 (양성 대조군)이 포함되도록 약효실험을 실시하였다. 또한, 상기 후보물질은 각각 0.5% 메틸 셀룰로스에 녹여 초음파 분쇄기로 현탁액을 만든 후 존데 (zonde)를 이용하여 1일 1회 경구 투여하였고 대조군은 약물을 제외한 용액만을 투여하였다. 또한 상기 약물을 투여하는 동안에 매일 각 군에서 종양의 크기 변화와 체중 변화를 기록하고, 사망 시에는 부검을 실시하여 비장의 크기와 무게를 측정하였다.
<
실시예
5. 백혈병의 동물모델을 이용한
생체 내
약효 분석 Ⅳ>
본 발명에서는 상기 실시예 5에 기술한 과정으로 제조한 백혈병의 동물모델을 이용하여 다음과 같이 후보물질의 효능을 측정하고 상기 마우스 동물모델이 항암제를 검색하는 데 효과적인지 여부를 조사하였다.
먼저 4차로 구입한 SCID 마우스 중 잔여 19마리를 대상으로 K562 세포주를 마우스의 측복부에 기존 정맥 주사 양의 5배에 해당되는 5 x 107개 세포를 피하 주사하였다. 또한 주사 후 3일째 1 마리가 죽었으나 일부에서 종괴의 발생이 관찰되기 시작하였다. 주사 후 10일째부터는 1 마리를 제외한 17마리에서 백혈병의 종괴로 의심되는 작은 혹이 증가한 것이 주사한 부위에서 모두 관찰되었다.
상기 동물모델을 이용한 경우 IY5511-HCl 투여군 (30 mg/kg)이 글리벡 투여 군 (150 mg/kg)에서의 용량보다 1/5 용량을 투여하였음에도 불구하고 투여 2일 후부터 급속히 백혈병의 종괴가 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 또한 투여 2주 후부터는 대부분의 실험 쥐에서 종괴가 육안으로는 관찰되지 않은 반면, 글리벡 투여군은 2주 이후부터 종괴의 크기 증가가 둔화되긴 하지만 여전히 종괴의 감소는 20일째까지 관찰되지 않았다. 개체 간 체중 변화도 그 양상에는 차이가 없었다. 따라서, 본 발명의 백혈병 동물모델은 항암 후보물질의 치료 효능 및 농도에 따른 항암 억제 정도를 조사하는 데 효과적인 것을 알 수 있었다.
<
실시예
6. 백혈병의 동물모델을 이용한
생체 내
약효 분석 Ⅴ >
본 발명에서는 상기 실시예 4에 기술한 과정으로 제조한 백혈병의 동물 모델을 사용하여 다음과 같이 후보물질의 효능을 측정하고 상기 마우스 동물모델이 항암제를 검색하는 데 효과적인지 여부를 조사하였다.
총 40마리의 SCID 마우스를 이용한 2차 본 실험을 실시하였다. 세포주 주입을 위한 전신 마취 당일 2마리가 죽어 38마리에서 백혈병 고형암을 만들었으며, 이를 다시 6군 (군당 6마리씩)으로 나누어 실험을 진행하였다. 본 실험에서는 IY5511-HCl의 투여 용량별 백혈병 억제 효능에서 차이가 있는지 여부를 관찰하고, 글리벡의 용량을 증량한 200mg/kg 에서의 결과와 비교하며 슈퍼 글리벡으로 불리우는 AMN107 30mg/kg 과의 효능을 비교하는 데 초점을 두고 진행되었다. 상기 실시예 6에서 기술한 바와 같이, IY5511-HCl 30 mg/kg이상에서 백혈병 종괴의 감소를 관찰할 수 있었고 닐로티닙(nilotinib) 30 mg/kg 및 다사티닙 (dasatinib) 30 mg/kg에서와 비슷한 양상으로 종괴를 감소시키는 것을 확인하였다. 글리벡 투여군의 경우 50 mg 을 증량하여 200 mg/kg을 투여한 경우에 무투여 대조군에 비해서는 종괴의 증가가 둔화되긴 하나, 지속적으로 종괴가 증가하는 것을 관찰하였다. 또한, IY5511-HCl 10 mg/kg에서는 종괴의 증가가 억제되면서 더불어 종괴 감소가 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 백혈병 동물모델은 항암 후보물질의 치료 효능을 조사하는 데 효과적인 것을 알 수 있었다.
<
실시예
7. 다중
역전사효소
중합효소 연쇄반응법 (
RT
-
PCR
)을 이용한 백혈병의 발병 조사>
본 발명에서는 상기에서 제작한 실험 마우스에서 백혈병의 발병을 확인하기 위하여, 다중 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (multiplex RT-PCR)을 다음과 같이 실시하였다. 먼저 SCID 마우스의 백혈병 종괴로부터 얻은 RNA를 이용하여, 10X 반응 완충용액 2.5μl, 25 mM MgCl2 1.5μl, 10 mM dNTP 0.5 μl, Taq (5 U/μl) 0.25μl, 마이너 bcr에 대한 센스 프라이머 0.25μl, 메이저 마이크로 bcr에 대한 센스 프라이머 0.5μl, 안티센스 프라이머 1.5μl, 증류수 16.75μl 및 cDNA 2.5μl을 첨가한 반응물(master mix)을 만들고 이로부터 cDNA를 합성하였다. 이 때 프라이머로는 서열번호 1 및 서열번호 2의 센스 프라이머 그리고 서열번호 3의 안티센스 프라이머를 사용하였다. 상기 반응 혼합물은 잘 섞고 원심분리시킨 다음, 하기 표 1의 프로그램에 따라 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 상기 반응이 끝난 후에 20분간 2% 아가로스 젤에서 전기영동을 실시하고 조명기기(trans-illuminator)를 이용하여 증폭된 유전자 밴드를 확인하였다.
| 94 ℃ | 3 분 | 1 cycle |
| 94 ℃ | 30 초 | 30 cycles |
| 63 ℃ | 30 초 | |
| 72 ℃ | 30 초 | |
| 72 ℃ | 5 분 | 1 cycle |
<
실시예
8. 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응법 (
RQ
-
PCR
)을 이용한 백혈병의 발병 조사>
본 발명에서는 상기에서 제작한 실험 마우스에서 백혈병의 발병을 확인하기 위하여, 라이트사이클러 (LightCycler, 로슈사) 증폭기와 정량 키트 (Real-QTMBCR-ABL Quantification Kit, 바이오세움사)를 사용하여 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(RQ-PCR)을 실시하였다. 먼저 BCR-ABL 및 ABL 각각의 반응 혼합물 (master mix)은 10μl 2X PCR 반응액, 4μl 프로브 및 프라이머 혼합액 및 4μl 증류수를 섞어서 준비하고, 그 결과 얻은 반응 혼합물 18μl을 라이트사이클러 어댑터 (LightCycler adaptors)에 놓여있는 모세관 (LightCycler capillaries)에 분주하였다.
그 다음, 상기에서 18μl씩 분주한 각각의 모세관에 표준 플라스미드 (standard plasmid DNA)와 미지의 cDNA 시료들을 2μl씩 분주하고 총 부피가 20μl가 되도록 맞추었다. 라이트사이클러의 부품 (LightCycler Capping Tool)을 사용하여 모든 모세관의 뚜껑을 닫은 다음, 2.000 rpm에서 3초간 원심분리를 실시하였다. 마지막 단계로서 상기 모세관들을 시료선반(LightCycler2.0 Sample Carousels)에 넣은 다음 라이트사이클러 2.0기기에 넣어주었다. 실시간 정량적 중합효소 연쇄반응(RQ-PCR)은 다음과 같이 실시하였다: 50℃ 21분 1회, 95℃ 10분 및 95℃ 10초 1회, 58℃ 10초 및 72℃ 30초 45회 그리고 40℃ 2분 1회. 반응이 끝난 뒤에는, 절대 정량/상대 정량 (Absolute Quantification/Relative Quantification) 프로그램을 사용하여 결과를 분석하였다.
본 발명은 바람직한 실시예를 참고하여 보다 자세하게 설명되었지만, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 본 명세서의 기술의 도움으로 본 발명의 범주나 정신에서 벗어나지 않는 범위내에서의 어떤 변화 및 변형이 가능할 수 있음은 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
본 발명의 발암 동물모델에 형성되는 종괴를 관찰함으로써 고형암 및 혈액암 모두에 대한 항암 효과를 부작용없이 신속하고 지속적으로 관찰하는 데 효과적으로 사용될 수 있어, 새로운 항암제의 개발 및 치료효능 검색에 유용하게 활용가능하다.
도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 백혈병으로 인해 코 주변에 종양이 유발된 마우스를 정상 마우스를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 후보약물을 투여하기 전, 종괴가 발생한 마우스를 나타낸 것이다.
도 3은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여하고 6일이 경과된 후, 마우스의 종괴 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 백혈병 치료제의 후보약물을 투여하고 9일이 경과된 후, 마우스의 종괴 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 백혈병 치료제의 후보약물을 투여하고 16일이 경과된 후, 마우스의 종괴 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여하고 18일이 경과된 후, 마우스의 종괴 변화를 나타낸 것이다.
도 7은 백혈병이 유발되어 죽은 마우스의 엉덩이 주변 종괴를 나타낸 것이다.
도 8은 백혈병이 유발되어 생긴 종괴를 파라핀 포매하여 H&E 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 백혈병이 유발되어 생긴 종괴를 파라핀 포매하고 BCR-ABL 탐식자를 이용하여 FISH 한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 백혈병이 유발되어 생긴 종괴를 파라핀 포매하고 BCR-ABL 탐식자를 이용하여 FISH 한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 백혈병이 유발되어 생긴 종괴로부터 다중 RT-PCR 을 이용하여 BCR-ABL 인간 전사체를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 백혈병이 유발되어 생긴 종괴로부터 RQ-PCR 을 이용하여 b3a2 유전자가 증폭되는 양상을 나타낸 것이다.
도 13은 백혈병이 유발되어 K562 세포의 종괴가 발생한 후, 70일이 경과된 마우스에서 종괴 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 백혈병 세포K562 에 의한 종괴가 발생한 마우스에서 백혈병 치료제의 후보약물을 투여하여 변화되는 생존 가능성을 조사하여 나타낸 것이다.
도 15는 인간 백혈병 세포 K562 를 피하 주사한 부위에서 종괴가 유발되기 시작하는 양상을 나타낸 것이다.
도 16은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여한 후, K562 세포의 종괴 크기가 변화하는 양상을 나타낸 것이다.
도 17은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여한 후, K562 세포의 종괴 크기가 변화하는 양상을 개체별로 나타낸 것이다.
도 18은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여한 후, K562 세포의 종괴가 발생한 마우스의 체중 변화를 나타낸 것이다.
도 19는 백혈병 치료제의 각종 후보약물들을 투여한 후, 외부, 내부장기, 비장 및 K562 세포의 종괴 변화를 부검하여 나타낸 것이다. 도 19a는 Placebo 군, 도 19b는 글리벡 군, 도 19c는 IY5511-HCl군의 외부, 내부장기, 종괴 및 비장이다.
도 20은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여한 후, K562 세포의 종괴 크기가 변화하는 양상을 나타낸 것이다.
도 21은 백혈병 치료제의 후보약물을 투여한 후, K562 세포의 종괴 크기가 일별로 변화하는 양상을 나타낸 것이다.
도 22는 백혈병 치료제의 후보약물을 투여한 후, K562 세포의 종괴 크기를 일별로 관찰하여 나타낸 것이다. 왼쪽부터 순서대로 1일째, 7일째, 11일째, 17일째의 사진이며, 도 22a는 대조군 개체와 IY5511-HCl을 투여한 개체, 도 22b는 Imatinib, Nilotinib, Dasatinib을 투여한 개체의 사진이다.
Claims (15)
- 설치류 동물을 안정화시키는 단계; 상기 동물의 면역 기능을 저하시키는 단계; 및 상기 동물에 백혈병 세포를 주입하여 상기 동물에 종괴를 형성시키는 단계; 를 포함하여 이루어지는 종괴가 형성되는 발암 동물모델의 제조방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 설치류 동물은 마우스 (Mus musculus)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 상기 마우스는 면역 결핍 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역기능을 저하시키는 단계에서 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide)를 상기 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 사이클로포스파마이드는 상기 백혈병세포를 주입하기 46~50시간과 22~26시간 전에 2회 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 사이클로포스파마이드는 생리식염수에 녹인 뒤, 그 부피가 200 ul 이하이고, 용량은 100~200 mg/kg 범위로 상기 동물에 복강 주사하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 백혈병 세포는 만성 골수성 백혈병을 유발하는 인간 백혈병 세포주 K562인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 인간 백혈 병세포주 K562는 FBS (Foetal Bovine Serum) 및 페니실린-스트렙토마이신 (pencilline-streptomycin)이 첨가된 배지에서 일주일간 계대 배양된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 인간 백혈병 세포주 K562는 피하 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 인간 백혈병 세포주 K562는 5×106 내지 5×107 개 주입되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 동물모델은 백혈병 발병 동물모델인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되고, 종괴가 형 성됨을 특징으로 하는 발암 동물모델.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 종괴가 형성된 발암 동물모델을 제조하는 단계;상기 종괴가 형성된 발암 동물모델에 항암 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 및상기 후보물질의 투여기간 동안 상기 동물모델에 형성된 종괴의 크기변화 및 상기 동물모델의 체중변화를 측정하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는, 종괴가 형성되는 발암 동물모델을 이용하여 항암 치료제 후보물질의 종류 또는 농도에 따른 항암 치료효능을 검색하는 검색방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 후보물질은 용매에 현탁시킨 뒤 상기 동물모델에 피하 또는 경구 투여함을 특징으로 하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 항암 치료제는 백혈병 치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080069401A KR20100008827A (ko) | 2008-07-17 | 2008-07-17 | 인간유래 백혈병 세포주를 이용한 발암 동물모델, 그의제조방법 및 이를 이용한 항암 치료제의 검색방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080069401A KR20100008827A (ko) | 2008-07-17 | 2008-07-17 | 인간유래 백혈병 세포주를 이용한 발암 동물모델, 그의제조방법 및 이를 이용한 항암 치료제의 검색방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20100008827A true KR20100008827A (ko) | 2010-01-27 |
Family
ID=41817348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080069401A KR20100008827A (ko) | 2008-07-17 | 2008-07-17 | 인간유래 백혈병 세포주를 이용한 발암 동물모델, 그의제조방법 및 이를 이용한 항암 치료제의 검색방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20100008827A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2488173C1 (ru) * | 2012-04-26 | 2013-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Способ создания биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких льюис с продолжительной циклофосфаниндуцированной лейкопенией у мышей |
| WO2016060407A1 (ko) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | 동국대학교 산학협력단 | Emp2 유전자가 결여된 폐암 유발 동물모델의 제조방법 및 이의 용도 |
-
2008
- 2008-07-17 KR KR1020080069401A patent/KR20100008827A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2488173C1 (ru) * | 2012-04-26 | 2013-07-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Способ создания биологической модели умеренного торможения роста опухоли и метастазов карциномы легких льюис с продолжительной циклофосфаниндуцированной лейкопенией у мышей |
| WO2016060407A1 (ko) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | 동국대학교 산학협력단 | Emp2 유전자가 결여된 폐암 유발 동물모델의 제조방법 및 이의 용도 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7523351B2 (ja) | 肥満細胞症の治療のための併用療法 | |
| Mizgirev et al. | A new zebrafish model for experimental leukemia therapy | |
| KR101765575B1 (ko) | 알데히드 억제제 및 비구아나이드 계열 화합물을 포함하는 암 줄기세포의 성장 억제용 약학적 조성물 | |
| CN103492369B (zh) | 大麻素受体调节剂 | |
| EP1397105B1 (en) | Compositions for inhibiting angiogenesis | |
| DE69929464T2 (de) | Zyklische polyamine zur behandlung der thrombozytopenie | |
| CN105555272A (zh) | 用于治疗flt3突变型增殖性疾病的crenolanib | |
| JP2005035977A (ja) | 新規なγ−ブチロラクトン化合物及びその医薬組成物 | |
| JP2021527111A (ja) | Ｓ−エクオールを用いた乳癌の治療及び予防方法 | |
| Holsinger et al. | Epidermal growth factor receptor blockade potentiates apoptosis mediated by paclitaxel and leads to prolonged survival in a murine model of oral cancer | |
| CN111818915A (zh) | 治疗胃肠道间质瘤的组合疗法 | |
| TW201806600A (zh) | Bcl-2抑制劑及mcl1抑制劑之組合、其用途及醫藥組合物 | |
| Guo et al. | Proteasome inhibitor MG132 enhances sensitivity to cisplatin on ovarian carcinoma cells in vitro and in vivo | |
| CN103917234A (zh) | 用于治疗慢性骨髓性白血病的n-甲基-2-〔3-((e)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1h-吲唑-6-基硫烷基〕-苯甲酰胺 | |
| KR20170118700A (ko) | (1e,4e)-2-아미노-n,n-디프로필-8-(4-(피롤리딘-1-카보닐)페닐)-3h-벤조[b]아제핀-4-카복사미드를 포함하는 고체형, 이의 조성물, 및 이의 용도 | |
| CN103002895A (zh) | 治疗血液癌症的方法 | |
| JP6865174B2 (ja) | Ｅｒｇ癌遺伝子阻害剤としてのアゾフェノール | |
| KR20100008827A (ko) | 인간유래 백혈병 세포주를 이용한 발암 동물모델, 그의제조방법 및 이를 이용한 항암 치료제의 검색방법 | |
| CN109789130A (zh) | Bcl-2抑制剂与mcl-1抑制剂的组合、其用途和药物组合物 | |
| CA2576926C (en) | Use of midostaurin for treating gastrointestinal stromal tumors | |
| KR20160141748A (ko) | 항암제 및 부작용 경감제 | |
| TW202241415A (zh) | 通路調節劑、含其的醫藥組成物、其用途和採用其的治療方法 | |
| Uchida et al. | Hes1 upregulation contributes to the development of FIP1L1-PDGRA–positive leukemia in blast crisis | |
| CN102028685A (zh) | 吉莫斯特的用途 | |
| KR102242040B1 (ko) | 줄기세포의 티오레독신 발현을 증진시키는 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |