CN109789130A - Bcl-2抑制剂与mcl-1抑制剂的组合、其用途和药物组合物 - Google Patents

Bcl-2抑制剂与mcl-1抑制剂的组合、其用途和药物组合物 Download PDF

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Abstract

包含BCL‑2抑制剂与MCL1抑制剂的组合及其组合物和用途。

Description

BCL-2抑制剂与MCL-1抑制剂的组合、其用途和药物组合物
发明领域
本发明涉及BCL-2抑制剂与MCL1抑制剂的组合。本发明还涉及该组合在治疗癌症中的用途，特别是白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤和肺癌，且更具体地为急性髓性白血病、T细胞型急性淋巴细胞白血病、B细胞型急性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫型大B细胞性淋巴瘤和小细胞肺癌。还提供了适合于施用这类组合的药物制剂。
发明背景
细胞凋亡是一种高度调节的细胞死亡途径，其由各种细胞毒性刺激引发，包括致癌应激和化学治疗剂。已经表明，细胞凋亡的逃避是癌症的标志，且许多化学治疗剂的功效取决于内在线粒体途径的激活。BCL-2家族蛋白的三个不同亚组控制内在凋亡途径：(i)促细胞凋亡BH3(BCL-2同源3)-only蛋白质；(ii)促存活成员如BCL-2本身、BCL-XL、Bcl-W、MCL1和BCL-2A1；和(iii)促凋亡效应蛋白BAX和BAK(Czabotar等人,Nature ReviewsMolecular cell biology2014Vol 15：49-63)。BCL-2家族的抗细胞凋亡成员的超表达在许多癌症中观察到，尤其是在血液恶性肿瘤如套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma/MCL)、滤泡型淋巴瘤/弥漫型大B细胞性淋巴瘤(FL/D)和多发性骨髓瘤(Adams和Cory Oncogene2007Vol 26：1324-1337)。用最近开发的BH3-模拟药物如ABT-199和ABT-263对抗凋亡蛋白BCL-2、BCL-XL和Bcl-w的药理学抑制已经作为诱导细胞凋亡和导致癌症中肿瘤消退的治疗策略出现(Zhang等人,Drug Resist Updat 2007 Vol 10(6)：207-17)。然而，已观察到并研究了对这些药物的抗性机制(Choudhary GS等人,Cell Death and Disease 2015 Vol 6,e1593；doi：10.1038/cddis.2014.525)。
急性髓性白血病(AML)是由造血干细胞的克隆转化引起的快速致命的血癌，导致正常骨髓功能瘫痪和由于深度全血细胞减少症的并发症导致的死亡。AML占所有成人白血病的25％，发病率最高的是美国、澳大利亚和欧洲(WHO.GLOBOCAN 2012.Estimated cancerincidence,mortality and prevalence worldwide in 2012.International Agency forResearch on Cancer)。在全球范围内，每年诊断出约88,000例新病例。AML继续保持所有白血病的最低存活率，预计5年生存率仅为24％。尽管AML的标准疗法(阿糖胞苷与蒽环类组合)是在40多年前构想出来的，但对这种疾病的成功靶向治疗的引入仍然是一个难以实现的目标。此外，对于AML患者，仍然需要一种不含化疗的治疗选择。AML中靶向治疗的概念因为认识到这种疾病作为多克隆层次结构而发展而受到阻碍，白血病亚克隆迅速生长为抗药性和疾病复发的主要原因(Ding L等人,Nature 2012 481：506-10)。最近的临床研究已经证明了BCL-2抑制剂在治疗AML中的功效(Konopleva M等人,American Society ofHematology 2014：118)。尽管这些抑制剂具有临床活性，但可能需要针对其他BCL-2家族成员进行靶向以提高AML的总体功效。除BCL-2外，MCL1也已经被鉴定为AML中细胞存活的重要调节因子(Glaser SP等人,Genes&development 2012 26：120-5)。
多发性骨髓瘤(MM)是一种罕见的无法治愈的疾病，其特征是骨髓(BM)中克隆浆细胞的积累，占所有血液系统恶性肿瘤的10％。在欧洲，每年约有27,800个新病例。由于近年来新药的可用性，包括硼替佐米和来那度胺，以及自体干细胞移植(ASCT)，所以存活率得以改善。然而，对这些新药的反应往往不持久，且它成为需要新治疗的证据，特别是对于复发/顽固性患者和具有不利预后(不利的细胞遗传学表现)的患者。最近的研究表明BCL-2抑制剂在多发性骨髓瘤患者亚组中具有富有希望的活性(Touzeau C,Dousset C,Le Gouill S等人，Leukemia.2014；28(1):210-212)。MCL1也已经被鉴定为多发性骨髓瘤中细胞存活的重要调节因子(Derenne S,Monia B,Dean NM,等人.Blood.2002；100(1)：194-199；ZhangB,Gojo I,Fenton RG.Blood.2002；99(6)：1885-1893)。
弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)是最常见的非霍奇金淋巴瘤类型(25-35％)，每年有24000名新患者。DLBCL是一种具有超过十二种亚型的异质性疾病，包括双击/MYC易位、活化B细胞(ABC)和Germical Centre B细胞(GCB)。现代免疫化疗(R-CHOP)治愈大约60％的DLBCL患者，但对于剩余的40％，几乎没有治疗选择，且预后差。因此，对于在高风险DLBCL中提高治愈率和临床结果存在高度医学需求，例如ABC亚型(35％的DLBCL)，其显示出促存活的NF-κB途径的组成型活化。
神经母细胞瘤(NB)是婴儿和儿童中最常见的颅外实体瘤，占所有儿童肿瘤的8％-10％，目前分为低、中、高风险。它占儿科人群中所有癌症相关死亡人数的约15％。NB的发病率为每百万15岁以下儿童10.2例，每年报告近500例新病例。诊断的中位年龄为22个月。NB患者的预后在过去30年中已经稳步改善，5年生存率从52％上升至74％。然而，据估计，高风险人群中有50-60％的患者会复发，因此，他们的死亡率只有适度下降。复发的中位时间为13.2个月，73％的复发者为18个月或更大。总的来说，尽管采取了更积极的治疗方法，NB的总体存活率仍然非常低(5年时约为20％)(Colon和Chung,Adv Pediatr 2013 58：297-311)。治疗的主流包括化疗、手术切除和/或放射治疗。然而，许多侵袭性NB已经产生对化学治疗剂的抗性，使得复发的可能性相当高(Pinto等人，J Clin Oncol 201533：3008-11)。依赖于危险分层的NB护理标准通常是卡铂、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、依托泊苷、细胞因子(GM-CSF和IL2)和长春新碱。化疗初始反应后的复发尤其是针对高危NB治疗失败的主要原因。
化学抗性可能源自促存活BCL-2蛋白(例如BCL-2和MCL1蛋白)的活化。NB表达高水平的BCL-2和MCL1以及低水平的BCL-XL。BCL-2的抑制使细胞对死亡敏感并诱导体内NB肿瘤消退(Ham等人,Cancer Cell 29：159-172)。BCL-2和MCL1的拮抗作用在高风险NB中恢复化疗(Lestini等人,Cancer Biol Ther 2009 8：1587-1595；Tanos等人,BMC Cancer 201616：97)。因此，将BCL-2和MCL1抑制剂与新发或耐药患者中组合使用是非常合理的。
本发明提供了一种BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂的新型组合。结果表明，随着靶向BCL-2和MCL1的有效小分子的发展，在原代人AML样品(图2A和17)以及AML(图9、13和14)、多发性骨髓瘤(实施例4)、淋巴瘤(图4和12)、神经母细胞瘤(图10)、T-ALL、B-ALL细胞系(图11)和小细胞肺癌细胞系(图15(a)-(e)))中显示出高度协同的促凋亡活性。我们还表明，在小鼠和大鼠的AML和淋巴瘤异种移植模型中，联合BCL-2和MCL1体内靶向在耐受剂量是有效的(图2、5、6、7、8和16)，并且显著增加AML的复发时间(图2B和2C)。此外，在克隆形成测定中，我们证明BCL-2+MCL1靶向对白血病细胞、但不是正常的造血干细胞具有特异性毒性(图3)，与之前在小鼠中的MCL1基因靶向实验相反。在开发这些强效和选择性抑制剂之前，靶向BCL-2和MCL1二者的可行性仍然不确定。以前的谱系特异性缺失模型表明了对心脏(Wang X等人,Genes&development.2013；27(12)：1351-1364；Thomas RL等人,Genes&development.2013；27(12)：1365-1377)、粒细胞/造血干细胞(Opferman J等人,Science′sSTKE.2005；307(5712)：1101；Dzhagalov I等人,Blood.2007；109(4)：1620-1626；SteimerDA等人,Blood.2009；113(12)：2805-2815)、胸腺细胞(Dunkle A等人、Cell Death&Differentiation.2010；17(6)：994-1002)、神经元(Arbour N等人,Journal ofNeuroscience.2008；28(24)：6068-6078)和肝功能(Hikita H等人,Hepatology.2009；50(4)：1217-1226；Vick B等人,Hepatology.2009；49(2)：627-636)有潜在风险，这归因于MCL1的长期消融。尽管存在这些担心，但每周、每周两次且甚至每天两次(连续5天)静脉内递送一种新的强效短效MCL1药理抑制剂最近已被证明具有良好的耐受性和对体内一系列癌症的活性，包括AML(Kotschy A等人,Nature.2016；538(7626)：477-482；WO 2015/097123)。MCL1蛋白的短半衰期可使其在关键器官中有足够的时间再生，从而对MCL1抑制剂的短期暴露产生生理耐受性(Yang T等人,Journal of cellular physiology.1996；166(3)：523-536)。到目前为止，使用遗传工程方法，无法对BCL-2和MCL1进行模拟药物样作用的脉冲抑制。使用根据本发明的BCL-2和MCL1抑制剂的研究提供了概念验证证明，即间歇性暴露于这些药物可足以引发高度敏感的疾病如AML中的细胞凋亡和临床反应，而没有同时发生对主要器官系统的毒性。
当靶向两种抗凋亡蛋白时，在体外和体内靶向BCL-2和MCL1的协同作用以及对正常骨髓产生无毒性，仅通过有效的小分子抑制剂组合才证明。这些方面通过基因靶向实验的结果没有预期到，后者将预期造血干细胞难以耐受MCL1缺失。
发明概述
本发明涉及组合，其包含(a)式(I)的BCL-2抑制剂：
其中：
X和Y表示碳原子或氮原子，应当理解，它们不能同时表示两个碳原子或两个氮原子，
A1和A2与携带它们的原子一起形成任选取代的由5、6或7个环成员组成的芳族或非芳族Het，其除由X或Y表示的氮外还可以包含1-3个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，所述氮可以被代表氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或基团-C(O)-O-Alk的基团取代，其中Alk是直链或支链(C1-C6)烷基，
或A1和A2彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、直链或支链(C1-C6)烷基或环烷基，
T表示氢原子，任选地被1-3个卤原子取代的直链或支链(C1-C6)烷基，基团(C1-C4)烷基-NR1R2，或基团(C1-C4)烷基-OR6，
R1和R2彼此独立地表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
或R1和R2与携带它们的氮原子形成杂环烷基，
R3表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、环烷基、其中烷基部分为直链或支链的(C3-C10)环烷基-(C1-C6)烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，应当理解，上述基团或其可能取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
R4表示芳基、杂芳基、环烷基或直链或支链(C1-C6)烷基，应当理解，上述基团或其可能取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
R5表示氢或卤原子、直链或支链(C1-C6)烷基，或直链或支链(C1-C6)烷氧基，
R6表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
Ra、Rb、Rc和Rd彼此独立地表示R7、卤原子、直链或支链(C1-C6)烷氧基、羟基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、三氟甲氧基、-NR7R7′、硝基、R7-CO-(C0-C6)烷基-、R7-CO-NH-(C0-C6)烷基-、NR7R7′-CO-(C0-C6)烷基-、NR7R7′-CO-(C0-C6)烷基-O-、R7-SO2-NH-(C0-C6)烷基-、R7-NH-CO-NH-(C0-C6)烷基-、R7-O-CO-NH-(C0-C6)烷基-、杂环烷基，或(Ra,Rb)、(Rb,Rc)或(Rc,Rd)对之一的取代基与携带它们的碳原子一起形成由5-7个环成员组成的环，其可以包含选自氧和硫的1-2个杂原子，还应当理解，上文定义的环的一个或多个碳原子可以被氘代或被1-3个基团取代，所述基团选自卤素和直链或支链(C1-C6)烷基，
R7和R7′彼此独立地表示氢、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、芳基或杂芳基，或R7和R7′与携带它们的氮原子一起形成由5-7个环成员组成的杂环，
应当理解，当式(I)的化合物包含羟基时，后者可以任选地被转化成如下基团之一：–OPO(OM)(OM’)、-OPO(OM)(O-M1 +)、–OPO(O-M1 +)(O-M2 +)、–OPO(O-)(O-)M3 2+、–OPO(OM)(O[CH2CH2O]nCH3)或–OPO(O-M1 +)(O[CH2CH2O]nCH3)，其中M和M′彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、环烷基或杂环烷基，它们两者由5-6个环成员组成，同时M1 +和M2 +彼此独立地表示药学上可接受的一价阳离子，M3 2+表示药学上可接受的二价阳离子，且n是1-5的整数，
应当理解：
-“芳基”是指苯基、萘基、联苯基或茚基基团，
-“杂芳基”是指由5-10个环成员组成的任意单-或双-环基团，其具有至少一个芳族部分并且包含1-4个选自氧、硫和氮的杂原子(包括季氮)，
-“环烷基”是指任意包含3-10个环成员的任意单-或双-环、非芳族碳环基团，
-“杂环烷基”是指任意由3-10个环成员组成并且包含1-3个选自氧、硫、SO、SO2和氮的杂原子的单-或双-环、非芳族、稠合或螺基团，
对于由此定义的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基和基团烷基、烯基、炔基和烷氧基，其可能被1-3个基团取代，所述基团选自：任选被羟基、吗啉、3-3-二氟哌啶或3-3-二氟吡咯烷取代的直链或支链(C1-C6)烷基；(C3-C6)螺；任选被吗啉取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基；(C1-C6)烷基-S-；羟基；氧代；N-氧化物；硝基；氰基；-COOR′；-OCOR′；NR′R”；直链或支链(C1-C6)多卤代烷基；三氟甲氧基；(C1-C6)烷基磺酰基；卤素；任选被一个或多个卤素取代的芳基；杂芳基；芳氧基；芳硫基；环烷基；任选被一个或多个卤原子或烷基取代的杂环烷基，其中R′和R”彼此独立地表示氢原子或任选被甲氧基取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
对于式(I)中定义的Het基团，其可能被1-3个基团取代，所述基团选自直链或支链(C1-C6)烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、NR1′R1"和卤素，应当理解，R1′和R1"如对上文提及的基团R′和R”所定义，
或其对映体、非对映异构体或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐；
和(b)MCL1抑制剂。
所述式(I)的化合物、其合成、其在治疗癌症中的用途及其药物制剂描述在WO2013/110890、WO 2015/011397、WO 2015/011399和WO 2015/011400中，其内容作为引用并入。
在某些实施方案中，MCL1抑制剂选自A-1210477(Cell Death and Disease 20156,e1590；doi：10.1038/cddis.2014.561)和描述在WO 2015/097123、WO 2016/207216、WO2016/207217、WO 2016/207225、WO 2016/207226或WO 2016/033486中的化合物，这些文献作为引用并入。
本发明还涉及一种组合，其包含(a)BCL-2抑制剂和(b)式(II)的MCL1抑制剂：
其中：
A表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、氰基、-NW10W10’、-Cy6或卤原子，
W1、W2、W3、W4和W5彼此独立地表示氢原子、卤原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-烷基(C0-C6)-NW8W8’、-O-Cy1、-烷基(C0-C6)-Cy1、-烯基(C2-C6)-Cy1、-炔基(C2-C6)-Cy1、-O-烷基(C1-C6)-W9、-C(O)-OW8、-O-C(O)-W8、-C(O)-NW8W8’、-NW8-C(O)-W8’、-NW8-C(O)-OW8’、-烷基(C1-C6)-NW8-C(O)-W8’、-SO2-NW8W8’、-SO2-烷基(C1-C6)，或(W1、W2)、(W2、W3)、(W1、W3)、(W4、W5)对之一的取代基在接枝到两个相邻碳原子上时与携带它们的碳原子一起形成由5-7个环成员组成的芳族或非芳族环，其可以包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，得到的环可以被选自直链或支链(C1-C6)烷基、-NW10W10’、-烷基(C0-C6)-Cy1或氧代的基团取代，
X’表示碳或氮原子，
W6表示氢、直链或支链(C1-C8)烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基(C1-C6)基团、杂芳基烷基(C1-C6)基团，
W7表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy3、-烷基(C1-C6)-Cy3、-烯基(C2-C6)-Cy3、-炔基(C2-C6)-Cy3、-Cy3-Cy4、-炔基(C2-C6)-O-Cy3、-Cy3-烷基(C0-C6)-O-烷基(C0-C6)-Cy4、卤原子、氰基、-C(O)-W11、-C(O)-NW11W11’，
W8和W8’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或-烷基(C0-C6)-Cy1，
或(W8、W8’)与携带它们的氮原子一起形成由5-7个环成员组成的芳族或非芳族环，其除氮原子外还可以包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，所述氮可以被代表氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基的基团取代，且应当理解，可能取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
W9表示-Cy1、-Cy1-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-烷基(C0-C6)-O-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-烷基(C0-C6)-NW8-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-Cy2-O-烷基(C0-C6)-Cy5、-C(O)-NW8W8’、-NW8W8’、-OW8、-NW8-C(O)-W8’、-O-烷基(C1-C6)-OW8、-SO2-W8、-C(O)-OW8、-NH-C(O)-NH-W8、
对于由此定义的铵，其可能作为两性离子形式存在或具有一价阴离子抗衡离子，
W10、W10’、W11和W11’彼此独立地表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，W12表示氢或羟基，
W13表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
W14表示-O-P(O)(O-)(O-)基团、-O-P(O)(O-)(OW16)基团、-O-P(O)(OW16)(OW16’)基团、-O-SO2-O-基团、-O-SO2-OW16基团、-Cy7、-O-C(O)-W15基团、-O-C(O)-OW15基团或-O-C(O)-NW15W15’基团，
W15和W15’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链氨基(C1-C6)烷基，
W16和W16’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基烷基(C1-C6)基团，
Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6和Cy7彼此独立地表示环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，
n是等于0或1的整数，
应当理解：
-“芳基”是指苯基、萘基、联苯基、茚满基或茚基基团，
-“杂芳基”是指由5-10个环成员组成的任意单-或双-环基团，其具有至少一个芳族部分并且包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，
-“环烷基”是指包含3-10个环成员的任意单-或双-环非芳族碳环基团，
-“杂环烷基”是指包含3-10个环成员并且包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子的任意单-或双-环非芳族碳环基团，可以包括稠合、桥连或螺环系统，
对于由此定义的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基和烷基、烯基、炔基、烷氧基，其可能被1-4个基团取代，所述基团选自：可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷基，所述直链或支链(C1-C6)烷氧基可以被直链或支链(C1-C6)烷氧基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、卤素、氧代、-NW’W”、-O-C(O)-W’或-CO-NW’W”取代；直链或支链(C2-C6)烯基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C2-C6)炔基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、直链或支链(C2-C6)炔基、-NW’W”或羟基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的(C1-C6)烷基-S-；羟基；氧代；N-氧化物；硝基；氰基；-C(O)-OW’；-O-C(O)-W’；-CO-NW’W”；-NW’W”；-(C＝NW’)-OW”；直链或支链(C1-C6)多卤代烷基；三氟甲氧基；或卤素；应当理解，W’和W”彼此独立地表示氢原子或可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷基；且应当理解，上述可能的取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
其对映体、非对映异构体或阻转异构体，或与药学上可接受的酸或碱的加成盐。
所述式(II)的化合物、其合成、其在治疗癌症中的用途及其药物制剂描述在WO2015/097123中，该文献的内容作为引用并入。
在某些实施方案中，BCL-2抑制剂选自如下化合物：
4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-[(3-硝基-4-{[(噁-4-基)甲基]氨基}苯基)磺酰基]-2-[(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基]苯甲酰胺(venetoclax或ABT-199)；4-(4-{[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-(4-{[(2R)-4-(吗啉-4-基)-1-(苯基硫基)丁-2-基]氨基}-3-(三氟甲磺酰基)苯磺酰基]苯甲酰胺(navitoclax或ABT-263)；奥利美生(oblimersen/G3139)；奥巴克拉(obatoclax/GX15-070)；HA14-1；(±)-棉酚(BL-193)；(-)-棉酚(AT-101)；阿朴棉子酚(apogossypol)；TW-37；抗霉素A；ABT-737(Oltersdorf T等人,Nature 2005年6月2日；435(7042)：677-81)和WO 2013/110890、WO 2015/011397、WO 2015/011399和WO 2015/011400中所述的化合物，上述文献的内容作为引用并入。
本发明的第一个方面提供了一种组合，其包含：
(a)如本文所述的式(I)的BCL-2抑制剂；和
(b)如本文所述的式(II)的MCL1抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合，其包含：
(a)化合物1：N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺或其药学上可接受的盐，和
(b)MCL1抑制剂,
该组合用于同时、依次或分开应用。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合，其包含：
(a)化合物4：5-(5-氯-2-{[(3S)-3-(吗啉-4-基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基]羰基}苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺或其药学上可接受的盐，和
(b)MCL1抑制剂，
该组合用于同时、依次或分开应用。
或者，本发明提供了一种组合，其包含：
(a)BCL-2抑制剂；和
(b)化合物2：(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(5-氟呋喃-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸，
该组合用于同时、依次或分开应用。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合，其包含：
(a)BCL-2抑制剂，和
(b)化合物3：(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸，
该组合用于同时、依次或分开应用。
在另一个实施方案中，本发明提供了如本文所述的组合，其用于治疗癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供了如本文所述的组合在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种药剂，其分开或共同地包含：
(a)式(I)的BCL-2抑制剂，和
(b)MCL1抑制剂；
或
(a)BCL-2抑制剂，和
(b)式(II)的MCL1抑制剂，
用于同时、依次或分开施用，并且其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以治疗癌症的有效量提供。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，包括对有此需要的受试者施用联合治疗有效量的：
(a)式(I)的BCL-2抑制剂和
(b)MCL1抑制剂；
或
(a)BCL-2抑制剂和
(b)式(II)的MCL1抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了使患者致敏的方法，所述患者为(i)对至少一种化疗治疗是难治性的或(ii)处于化疗治疗后的复发，或(i)和(ii)两者，其中该方法包括对所述患者施用联合治疗有效量的：
(a)式(I)的BCL-2抑制剂和
(b)MCL1抑制剂；
或
(a)BCL-2抑制剂和
(b)式(II)的MCL1抑制剂。
在一个具体的实施方案中，BCL-2抑制剂是N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺盐酸盐(化合物1,HCl)。
在一个具体的实施方案中，BCL-2抑制剂是5-(5-氯-2-{[(3S)-3-(吗啉-4-基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基]羰基}苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺盐酸盐(化合物4,HCl)。
在另一个实施方案中，BCL-2抑制剂是ABT-199。
在另一个实施方案中，MCL1抑制剂是(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(5-氟呋喃-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸(化合物2)。
在另一个实施方案中，MCL1抑制剂是(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸(化合物3)。
附图简述
图1.BCL-2和MCL1的表达在AML中是普遍的。对于所示蛋白质，对具有＞70％胚细胞(blasts)的7种AML细胞系和13种原代AML样品进行免疫印迹，显示BCL-2和MCL1蛋白质与在较低比例的样品中表达的BCL-XL相比被优势表达。
图2.组合的BCL-2/MCL1靶向在体外和体内AML中具有协同作用活性。(A)将54种原代AML样品与6-log浓度范围的化合物1(HCl盐)、化合物2或1:1浓度在RPMI/15％FCS中一起温育48小时并测定LC50。(B)给四组NSG小鼠植入表达荧光素酶的MV4；11细胞。在第10天(基线)验证肿瘤植入，然后在工作日口服化合物1,HCl 100mg/d(表示为游离碱)或化合物225mg/kg IV每周两次施用，持续4周。化合物2和与化合物1的组合的影响通过在开始治疗后第14天和第28天降低的荧光素酶量和增加的总体存活率来证明(C)。
图3.组合的BCL-2/MCL1靶向对来自正常供体的正常CD34+细胞或白血病胚细胞的毒性评估。将分选的正常CD34+或白血病胚细胞铺板并用化合物1,HCl和化合物2以1:1比例以指定浓度处理。组合的化合物1+化合物2对白血病有毒但对正常CD34+祖细胞无毒。
图4.化合物3与化合物1,HCl的组合在DB细胞(A)和Toledo细胞(B)中提供的关于抑制细胞生长(左)和Loewe过度抑制(右)的细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。作用矩阵中的值的范围从0(无抑制)到100(完全抑制)。协同作用矩阵中的值表示生长抑制超过理论加和性的程度，该理论加和性是基于化合物3和化合物1,HCl在测试浓度下的单一活性剂活性计算的。协同作用在广泛的单一活性剂浓度下发生。
图5.化合物1,HCl、化合物3和化合物1,HCl+化合物3的组合在大鼠淋巴瘤Karpass422异种移植物模型中的抗肿瘤作用。
图6.大鼠淋巴瘤Karpass422异种移植物模型中用化合物1,HCl、化合物3和化合物1,HCl+化合物3的组合治疗的动物的体重改变。
图7.小鼠DLBCL Toledo异种移植物模型中化合物1,HCl、化合物3和化合物1,HCl+化合物3的组合的抗肿瘤作用。
图8.小鼠DLBCL Toledo异种移植物模型中用化合物1,HCl、化合物3和化合物1,HCl+化合物3的组合治疗的动物的体重改变。
图9.两次独立实验中化合物3(MCL1抑制剂)与化合物1,HCl(BCL-2抑制剂)的组合在AML细胞系OCI-AML3中提供的关于细胞生长抑制(左)和Loewe过度抑制(右)的细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。
作用矩阵中的值的范围从0(无抑制)到100(总抑制)。协同作用矩阵中的值表示超过理论加和性的生长抑制程度，该理论加和性是基于化合物3和化合物1,HCl在测试浓度下的单一活性剂活性计算的。协同作用在广泛的单一活性剂浓度下发生。
图10.两次独立实验(N1：上组；N2：下组)中化合物3(MCL1抑制剂)与化合物1,HCl(BCL-2抑制剂)的组合在NB细胞系LAN-6中提供的关于细胞生长抑制(左)和Loewe过度抑制(右)的细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。作用矩阵中的值的范围从0(无抑制)到100(总抑制)。协同作用矩阵中的值表示超过理论加和性的生长抑制程度，该理论加和性是基于化合物3和化合物1,HCl在测试浓度下的单一活性剂活性计算的。
图11.两次独立实验(N1：上组；N2：下组)中化合物3(MCL1抑制剂)与化合物1,HCl(BCL-2抑制剂)的组合在B-ALL细胞系NALM-6中提供的关于细胞生长抑制(左)和Loewe过度抑制(右)的细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。
图12.化合物3(MCL1抑制剂)与化合物1,HCl(BCL-2抑制剂)的组合在MCL细胞系Z-138中提供的关于细胞生长抑制(左)和Loewe过度抑制(右)的细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。
图13.两次独立实验(N1：上组；N2：下组)中化合物3(MCL1抑制剂)与ABT-199(BCL-2抑制剂)的组合在AML细胞系OCI-AML3中提供的关于细胞生长抑制(左)和Loewe过度抑制(右)的细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。
图14.化合物3(MCL1抑制剂)与化合物4,HCl(BCL-2抑制剂)的组合在AML细胞系(A中的ML-2细胞和B中的OCI-AML-3细胞)中提供的关于细胞生长抑制(左)和Loewe过度抑制(右)的示例性细胞生长抑制作用和协同作用组合矩阵。
图15(a)-(e).化合物3(MCL1抑制剂)与化合物1,HCl(BCL-2抑制剂)的组合在一组SCLC细胞系中提供的关于抑制(左)、过度抑制(中)和生长抑制(右)的剂量矩阵。
图16(a)-(b).化合物1,HCl、ABT-199、化合物3和化合物1,HCl或ABT-199+化合物3的组合在患者来源的小鼠原代AML模型HAMLX5343中的抗肿瘤作用。
图17.48h暴露后相对于化疗(伊达比星)，对BH3-模拟单一疗法或药物组合(以1:1之比测试)的AML敏感性(LC50)的热图比较。显示了48h后在DMSO中每种原代AML样品的细胞活性。
发明详述
因此，本发明在实施方案E1中提供了一种组合，其包含(a)式(I)的BCL-2抑制剂：
其中：
X和Y表示碳原子或氮原子，应当理解，它们不能同时表示两个碳原子或两个氮原子，
A1和A2与携带它们的原子一起形成任选取代的由5、6或7个环成员组成的芳族或非芳族Het，其除由X或Y表示的氮外还可以包含1-3个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，所述氮可以被代表以下的基团取代：氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或基团-C(O)-O-Alk，其中Alk是直链或支链(C1-C6)烷基，
或A1和A2彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、直链或支链(C1-C6)烷基或环烷基，
T表示氢原子、任选地被1-3个卤原子取代的直链或支链(C1-C6)烷基，基团(C1-C4)烷基-NR1R2，或基团(C1-C4)烷基-OR6，
R1和R2彼此独立地表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，或R1和R2与携带它们的氮原子一起形成杂环烷基，
R3表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、环烷基、其中烷基部分为直链或支链的(C3-C10)环烷基-(C1-C6)烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，应当理解，上述基团或其可能取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
R4表示芳基、杂芳基、环烷基或直链或支链(C1-C6)烷基，应当理解，上述基团或其可能取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
R5表示氢或卤原子、直链或支链(C1-C6)烷基，或直链或支链(C1-C6)烷氧基，
R6表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
Ra、Rb、Rc和Rd,彼此独立地表示R7、卤原子、直链或支链(C1-C6)烷氧基、羟基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、三氟甲氧基、-NR7R7′、硝基、R7-CO-(C0-C6)烷基-、R7-CO-NH-(C0-C6)烷基-、NR7R7′-CO-(C0-C6)烷基-、NR7R7′-CO-(C0-C6)烷基-O-、R7-SO2-NH-(C0-C6)烷基-、R7-NH-CO-NH-(C0-C6)烷基-、R7-O-CO-NH-(C0-C6)烷基-、杂环烷基，或(Ra,Rb)、(Rb,Rc)或(Rc,Rd)对之一的取代基与携带它们的碳原子一起形成由5-7个环成员组成的环，其可以包含选自氧和硫的1-2个杂原子，还应当理解，上文定义的环的一个或多个碳原子可以被氘代或被1-3个基团取代，所述基团选自卤素和直链或支链(C1-C6)烷基，
R7和R7′彼此独立地表示氢、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、芳基或杂芳基，或R7和R7′与携带它们的氮原子一起形成由5-7个环成员组成的杂环，
应当理解，当式(I)的化合物包含羟基时，后者可以任选地被转化成如下基团之一：–OPO(OM)(OM’)、-OPO(OM)(O-M1 +)、–OPO(O-M1 +)(O-M2 +)、–OPO(O-)(O-)M3 2+、–OPO(OM)(O[CH2CH2O]nCH3)或–OPO(O-M1 +)(O[CH2CH2O]nCH3)，其中M和M′彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、环烷基或杂环烷基，它们由5-6个环成员组成，同时M1 +和M2 +彼此独立地表示药学上可接受的一价阳离子，M3 2+表示药学上可接受的二价阳离子，且n是1-5的整数，
应当理解：
-“芳基”是指苯基、萘基、联苯基或茚基基团，
-“杂芳基”是指由5-10个环成员组成的任意单-或双-环基团，其具有至少一个芳族部分并且包含1-4个选自氧、硫和氮(包括季氮)的杂原子，
-“环烷基”是指包含3-10个环成员的任意单-或双-环非芳族碳环基团，
-“杂环烷基”是指由3-10个环成员组成并且包含1-3个选自氧、硫、SO、SO2和氮的杂原子的任意单-或双-环、非芳族、稠合或螺基团，
对于由此定义的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基和基团烷基、烯基、炔基和烷氧基，其可能被1-3个基团取代，所述基团选自：任选被羟基、吗啉、3-3-二氟哌啶或3-3-二氟吡咯烷取代的直链或支链(C1-C6)烷基；(C3-C6)螺；任选被吗啉取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基；(C1-C6)烷基-S-；羟基；氧代；N-氧化物；硝基；氰基；-COOR′；-OCOR′；NR′R”；直链或支链(C1-C6)多卤代烷基；三氟甲氧基；(C1-C6)烷基磺酰基；卤素；任选被一个或多个卤素取代的芳基；杂芳基；芳氧基；芳硫基；环烷基；任选被一个或多个卤原子或烷基取代的杂环烷基，其中R′和R”彼此独立地表示氢原子或任选被甲氧基取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
对于式(I)中定义的Het基团，其可能被1-3个基团取代，所述基团选自直链或支链(C1-C6)烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、NR1′R1"和卤素，应当理解，R1′和R1"如对上述举出的基团R′和R”所定义，
或其对映体、非对映异构体或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐，
和(b)MCL1抑制剂，
该组合用于同时、依次或分开应用。
本发明还在实施方案E2中提供了一种组合，其包含(a)BCL-2抑制剂和(b)式(II)的MCL1抑制剂：
其中：
A表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、氰基、-NW10W10’、-Cy6或卤原子，
W1、W2、W3、W4和W5彼此独立地表示氢原子、卤原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-烷基(C0-C6)-NW8W8’、-O-Cy1、-烷基(C0-C6)-Cy1、-烯基(C2-C6)-Cy1、-炔基(C2-C6)-Cy1、-O-烷基(C1-C6)-W9、-C(O)-OW8、-O-C(O)-W8、-C(O)-NW8W8’、-NW8-C(O)-W8’、-NW8-C(O)-OW8’、-烷基(C1-C6)-NW8-C(O)-W8’、-SO2-NW8W8’、-SO2-烷基(C1-C6)，或(W1、W2)、(W2、W3)、(W1、W3)、(W4、W5)对之一的取代基在接枝到两个相邻碳原子上时与携带它们的碳原子一起形成由5-7个环成员组成的芳族或非芳族环，其可以包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，得到的环可以被基团取代，所述基团选自直链或支链(C1-C6)烷基、-NW10W10’、-烷基(C0-C6)-Cy1或氧代，
X’表示碳或氮原子，
W6表示氢、直链或支链(C1-C8)烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基(C1-C6)基团、杂芳基烷基(C1-C6)基团，
W7表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy3、-烷基(C1-C6)-Cy3、-烯基(C2-C6)-Cy3、-炔基(C2-C6)-Cy3、
-Cy3-Cy4、-炔基(C2-C6)-O-Cy3、-Cy3-烷基(C0-C6)-O-烷基(C0-C6)-Cy4、卤原子、氰基、-C(O)-W11、-C(O)-NW11W11’，
W8和W8’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或-烷基(C0-C6)-Cy1，
或(W8、W8’)与携带它们的氮原子一起形成由5-7个环成员组成的芳族或非芳族环，其除氮原子外还可以包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，所述氮可以被代表以下的基团取代：氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，且应当理解，可能的取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
W9表示-Cy1、-Cy1-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-烷基(C0-C6)-O-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-烷基(C0-C6)-NW8-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-Cy2-O-烷基(C0-C6)-Cy5、-C(O)-NW8W8’、-NW8W8’、-OW8、-NW8-C(O)-W8’、-O-烷基(C1-C6)-OW8、-SO2-W8、-C(O)-OW8、-NH-C(O)-NH-W8、
对于由此定义的铵，其可能作为两性离子形式存在或具有一价阴离子抗衡离子，
W10、W10’、W11和W11’彼此独立地表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，W12表示氢或羟基，
W13表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
W14表示-O-P(O)(O-)(O-)基团、-O-P(O)(O-)(OW16)基团、-O-P(O)(OW16)(OW16’)基团、-O-SO2-O-基团、-O-SO2-OW16基团、-Cy7、-O-C(O)-W15基团、-O-C(O)-OW15基团或-O-C(O)-NW15W15’基团，
W15和W15’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链氨基(C1-C6)烷基，
W16和W16’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基烷基(C1-C6)基团，
Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6和Cy7彼此独立地表示环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，
n是等于0或1的整数，
应当理解：
-“芳基”是指苯基、萘基、联苯基、茚满基或茚基基团，
-“杂芳基”是指5-10个环成员组成的任意单-或双-环基团，其具有至少一个芳族部分并且包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，
-“环烷基”是指包含3-10个环成员的任意单-或双-环非芳族碳环基团，
-“杂环烷基”是指包含3-10个环成员并且包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子的任意单-或双-环非芳族碳环基团，其可以包括稠合、桥连或螺环系统，
对于由此定义的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基和烷基、烯基、炔基、烷氧基，其可能被1-4个基团取代，所述基团选自：可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷基，所述直链或支链(C1-C6)烷氧基可以被直链或支链(C1-C6)烷氧基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、卤素、氧代、-NW’W”、-O-C(O)-W’或-CO-NW’W”取代；直链或支链(C2-C6)烯基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C2-C6)炔基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、直链或支链(C2-C6)炔基、-NW’W”或羟基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷氧基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的(C1-C6)烷基-S-；羟基；氧代；N-氧化物；硝基；氰基；-C(O)-OW’；-O-C(O)-W’；-CO-NW’W”；-NW’W”；-(C＝NW’)-OW”；直链或支链(C1-C6)多卤代烷基；三氟甲氧基；或卤素；应当理解，W’和W”彼此独立地表示氢原子或可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷基；且应当理解，上述可能的取代基的碳原子的一个或多个可以被氘代，
其异构体、非对映异构体或阻旋异构体，或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐，
该组合用于同时、依次或分开应用。
本发明另外描述的实施方案(E)如本文所述。可以认识到，每个实施方案中指定的特征可以与另外指定的特征组合，得到本发明另外的实施方案。
E3.根据E1的组合，其中MCL1抑制剂是如E2中所定义的式(II)的化合物。
E4.根据E1-E3任一项的组合，其中BCL-2抑制剂是N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺。
E5.根据E1-E3任一项的组合，其中BCL-2抑制剂是5-(5-氯-2-{[(3S)-3-(吗啉-4-基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基]羰基}苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺。
E6.根据E4的组合，其中N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺是盐酸盐形式。
E7.根据E5的组合，其中5-(5-氯-2-{[(3S)-3-(吗啉-4-基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基]羰基}苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺是盐酸盐形式。
E8.根据E4或E6的组合，其中在联合治疗期间N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺的剂量为50mg-1500mg。
E9.根据E1-E8任一项的组合，其中每周1次施用BCL-2抑制剂。
E10.根据E6或E8的组合，其中在联合治疗期间每日1次施用N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺。
E11.根据E1-E3任一项的组合，其中BCL-2抑制剂是ABT-199。
E12.根据E1-E11任一项的组合，其中MCL1抑制剂是(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(5-氟呋喃-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸。
E13.根据E1-E11任一项的组合，其中MCL1抑制剂是(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸。
E14.根据E1-E13任一项的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂口服施用。
E15.根据E1-E13任一项的组合，其中BCL-2抑制剂口服施用并且MCL1抑制剂静脉内施用。
E16.根据E1-E13任一项的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂静脉内施用。
E17.根据E1-E16任一项的组合，用于治疗癌症。
E18.用于E17的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以联合治疗有效治疗癌症的量提供。
E19.用于E17的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以协同有效治疗癌症的量提供。
E20.用于E17的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以协同有效量提供，使得能够降低每种化合物在治疗癌症中所需的剂量，同时提供有效的癌症治疗和最终减少的副作用。
E21.用于E17-E20任一项的组合，其中所述癌症是白血病。
E22.用于E21的组合，其中所述癌症是急性髓性白血病、T-ALL或B-ALL。
E23.用于E17-E20任一项的组合，其中所述癌症是骨髓增生异常综合征或骨髓增殖性疾病。
E24.用于E17-E20任一项的组合，其中所述癌症是淋巴瘤。
E25.用于E24的组合，其中所述淋巴瘤是非霍金奇淋巴瘤。
E26.用于E25的任一项的组合，其中所述非霍金奇淋巴瘤是弥漫型大B细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
E27.用于E17-E20任一项的组合，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
E28.用于E17-E20任一项的组合，其中所述癌症是神经母细胞瘤。
E29.根据E17-E20任一项的组合，其中所述癌症是小细胞肺癌。
E30.根据E1-E16任一项的组合，还包含一种或多种赋形剂。
E31.根据E1-E16任一项的组合在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。
E32.根据E31的用途，其中所述癌症是白血病。
E33.根据E32的用途，其中所述癌症是急性髓性白血病、T-ALL或B-ALL。
E34.根据E31的用途，其中所述癌症是骨髓增生异常综合征或骨髓增殖性疾病。
E35.根据E31的用途，其中所述癌症是淋巴瘤。
E36.根据E35的用途，其中所述淋巴瘤是非霍金奇淋巴瘤。
E37.根据E36的用途，其中所述非霍金奇淋巴瘤是弥漫型大B细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
E38.根据E31的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
E39.根据E31的用途，其中所述癌症是神经母细胞瘤。
E40.根据E31的用途，其中所述癌症是小细胞肺癌。
E41.药剂，分开或共同地包含
(a)如E1中所定义的式(I)的BCL-2抑制剂，和
(b)MCL1抑制剂，
用于同时、依次或分开施用，并且其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以有效治疗癌症的量提供。
E42.药剂，分开或共同地包含
(a)BCL-2抑制剂，和
(b)如E2中定义的式(II)的MCL1抑制剂，
用于同时、依次或分开施用，并且其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以有效治疗癌症的量提供。
E43.治疗癌症的方法，包括对有此需要的受试者施用联合治疗有效量的(a)如E1中所定义的式(I)的BCL-2抑制剂，和(b)MCL1抑制剂。
E44.治疗癌症的方法，包括对有此需要的受试者施用联合治疗有效量的(a)BCL-2抑制剂，和(b)如E2中所定义的式(II)的MCL1抑制剂。
E45.一种致敏患者的方法，所述患者是(i)对至少一种化疗治疗是难治性的或(ii)处于用化疗治疗后的复发，或(i)和(ii)两者，其中该方法包括对所述患者施用联合治疗有效量的(a)如E1中所定义的式(I)的BCL-2抑制剂，和(b)MCL1抑制剂。
E46.一种致敏患者的方法，所述患者是(i)对至少一种化疗治疗是难治性的或(ii)处于用化疗治疗后的复发，或(i)和(ii)两者，其中该方法包括对所述患者施用联合治疗有效量的(a)BCL-2抑制剂，和(b)如E2中所定义的式(II)的MCL1抑制剂。
“组合”是指在一个单位剂型(例如胶囊、片剂或小药囊)中的固定剂量组合，非固定剂量组合，或用于组合施用的成套药盒，其中本发明的化合物和一种或多种组合伴侣(例如如下所述的另一种药物，也称为“治疗剂”或“共同活性剂剂”)可以同时独立地施用或在时间间隔内分开施用，特别是这些时间间隔允许组合伙伴显示合作、例如协同的作用。
术语“共同施用”或“联合施用”等在本文中使用的意图包括将所选择的组合伴侣施用于需要其的单个受试者(例如患者)，并且旨在包括其中活性剂不一定通过相同的施用途径或同时施用的治疗方案。
术语“固定剂量组合”是指活性成分，例如式(I)的化合物和一种或多种组合伴侣，以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。
术语“非固定剂量组合”是指活性成分、例如本发明的化合物和一种或多种组合伴侣，作为单独的实体同时或依次地施用于患者，没有特定的时间限制，其中这样的施用在患者体内提供治疗有效水平的两种化合物。后者也适用于鸡尾酒疗法，例如施用三种或多种活性成分。
“癌症”是指一类细胞组表现出不受控制的生长的疾病。癌症类型包括血液学癌(淋巴瘤和白血病)和实体瘤，包括癌、肉瘤或胚细胞瘤。特别地，“癌症”是指白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤，更尤其是急性髓性白血病。
术语“联合治疗有效”是指治疗剂可以在它们偏好的时间间隔内在待治疗的温血动物、特别是人类中分开地(以时间上交错的方式，特别是顺序特定方式)给予，仍显示(优选协同)相互作用(联合治疗效果)。无论这种情况是否情形是否如此可以尤其通过跟踪血液水平来确定，表明两种化合物至少在某些时间间隔内存在于待治疗人的血液中。
“协同有效”或“协同作用”是指在施用两种或多种活性剂后观察到的治疗效果大于施用每种单一活性剂后观察到的治疗效果的总和。
如本文所用，术语任何疾病或病症的“治疗”在一个实施方案中是指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减少疾病的发展或其临床症状的至少一种)。在另一个实施方案中，“治疗”是指缓解或改善至少一种身体参数，包括患者可能无法辨别的那些身体参数。在另一个实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如可辨别的症状的稳定)、生理上(例如身体参数的稳定)或它们两者来调节疾病或病症。
如本文所用，受试者是“需要”治疗的条件是该受试者在生物学、医学或生活质量方面可以得益于这类治疗。
另一方面，提供了一种使(i)对至少一种化疗治疗是难治性的或(ii)处于用化疗治疗后复发或(i)和(ii)的人致敏的方法，其中该方法包括给患者施用如本文所述的式(I)的BCL-2抑制剂与MCL1抑制剂的组合。被致敏的患者是对涉及如本文所述的式(I)的BCL-2抑制剂与MCL1抑制剂的组合治疗有响应的患者，或者对这种治疗没有产生抗性的患者。
“药剂”是指药物组合物或几种药物组合物的组合，其在一种或多种赋形剂存在下包含一种或多种活性成分。
“AML”是指急性髓性白血病。
“T-ALL”和“B-ALL”是指急性T细胞型急性淋巴细胞白血病和B细胞型急性淋巴细胞白血病。
“游离碱”是指非盐形式时的化合物。
在本发明的药物组合物中，按重量计的活性成分比例(组合物总重中的活性成分重量)为5-50％。
在本发明的药物组合物中，将更特别地使用那些适合于通过口服、肠胃外和特别是静脉内、经皮或透皮、鼻、直肠、经舌、眼或呼吸途径施用的药物组合物，更特别是片剂、糖衣丸、舌下片、硬明胶胶囊、经舌给药剂型(glossettes)、胶囊、锭剂、注射剂、气雾剂、滴眼液或滴鼻剂、栓剂、霜剂、软膏、皮肤凝胶等。
本发明的药物组合物包含一种或多种赋形剂或载体，其选自稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、防腐剂、吸收剂、着色剂、甜味剂、矫味剂等。
作为非限制性实例，可以举出：
作为稀释剂：乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇、纤维素、甘油；
作为润滑剂：二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其镁和钙盐、聚乙二醇；
作为粘合剂：硅酸镁铝、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮；
作为崩解剂：琼脂、藻酸及其钠盐、泡腾混合物。
组合的化合物可以同时或依次施用。施用途径优选是口服途径，并且相应的药物组合物可以允许活性成分的瞬时或延迟释放。此外，组合的化合物可以以两种分开的药物组合物的形式施用，每种药物组合物含有活性成分之一，或为单一药物组合物的形式，其中活性成分是混合物形式。
优选给予为片剂的药物组合物。
包含50mg和100mg药物物质的化合物1HCl盐薄膜包衣片的药物组合物
药理学数据
实施例1-3的材料和方法：
原发性AML患者样品：根据Alfred医院人类研究伦理委员会批准的指南，在知情同意后收集来自AML患者的骨髓或外周血样。通过Ficoll-Paque(GE Healthcare，VIC，Aus)密度梯度离心分离单核细胞，然后在氯化铵(NH4Cl)裂解缓冲液中在37℃下进行红细胞耗尽10分钟。然后将细胞重悬于含有2％胎牛血清(Sigma，NSW，Aus)的磷酸盐缓冲盐水中。然后将单核细胞悬浮于含有青霉素和链霉素(GIBCO)和热灭活的胎牛血清15％(Sigma)的RPMI-1640(GIBCO VIC，Aus)培养基中。
细胞系、细胞培养物和生成荧光素酶报道分子的细胞系：将细胞系MV4；11、OCI-AML3、HL-60、HEL、K562、KG-1和EOL-1维持在37℃、5％CO2的RPMI-1640(GIBCO)中，其补充有10％(v/v)胎牛血清(Sigma)和青霉素和链霉素(GIBCO)。通过慢病毒转导产生MV4；11荧光素酶细胞系。
抗体：用于蛋白质印迹分析的一抗是MCL1、BCL-2、Bax、Bak、Bim、BCL-XL(内部产生的WEHI)和微管蛋白(T-9026，Sigma)。
细胞活性：将来自AML患者样品的新鲜纯化的单核细胞调节至2.5x105/ml的浓度，并每孔等分加样100μL细胞到96孔板(Sigma)中。然后用化合物1,HCl、化合物2、ABT-199(Active Biochem,NJ,USA)或伊达比星(Sigma)在1nM至10μM的6log浓度范围内处理细胞48小时。对于组合测定，药物以1:1的比例从1nM加至10uM并在37℃ 5％CO2下温育。然后用sytox蓝核酸染色剂(Invitrogen,VIC,Aus)染色细胞，并使用LSR-II Fortessa(BectonDickinson，NSW，Aus)通过流式细胞术分析测量荧光。FACSDiva软件用于数据收集，且FlowJo软件用于分析。使用前向和侧向散射特性门控胚细胞。对于每种药物，在6种浓度下测定排除sytox蓝的活细胞，并测定50％致死浓度(LC50,以μM计)。
LC50测定和协同作用：将Graphpad Prism用于计算LC50，使用非线性回归。基于所描述的Chou Talalay方法，通过计算组合指数(CI)来确定协同作用(Chou Cancer Res；70(2)2010年1月15日)。
集落测定：对来自AML患者的新鲜纯化和冷冻的单核级分进行集落形成测定。将原代细胞在35mm培养皿(Griener-bio，Germany)中以1x 104-1x 105一式两份培养。将细胞接种于0.6％琼脂(Difco NSW，Aus)：AIMDM 2x(IMDM powder-Invitrogen)，其补充有NaHCO3、葡聚糖、Pen/Strep、B巯基乙醇和天冬酰胺)：胎牛血清(Sigma)，比例为2:1:1。对于最佳生长条件，所有平板均含有GM-CSF(每板100ng)，IL-3(100ng/板R&D系统，美国)SCF(100ng/板R&D系统)和EPO(4U/板)(生长为2-3周，在37℃，5％CO2下，在高湿度培养箱中，存在和不存在药物下。温育后，用含有2.5％戊二醛的盐水固定板，并使用来自Oxford Optronix(Abingdon,United Kingdom)的GelCount进行评分。
蛋白质印迹：在NP40裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.4,137mM NaCl，10％甘油，1％NP40)中制备裂解物，所述缓冲液中补充有蛋白酶抑制剂合剂(Roche，Dee Why，NSW，Australia)。将蛋白质样品在还原负载染料中煮沸，然后在4-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Mulgrave，VIC，Australia)上分离，并转移至Hybond C硝化纤维素膜(GE,Rydalmere,NSW,Australia)与指定的抗体一起温育。使用含有0.1％(v/v)Tween-20磷酸盐缓冲盐水(PBST)或Tris缓冲盐水的PBS中的5％(v/v)脱脂乳进行所有膜阻断步骤和抗体稀释，并且洗涤步骤使用PBST或TBST进行。通过增强的化学发光(GE)使蛋白质印迹可视化。
体内实验AML移植：动物研究在Alfred医学研究和教育区动物伦理委员会批准的机构指南下进行；用荧光素酶报告基因(pLUC2)转导的MV4；11细胞以1×105个细胞静脉内注射到受照射的(100Rad)非肥胖糖尿病患/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID/IL2rγnull)小鼠，如前所述(Jin等人.,Cell Stem Cell 2009年7月2日,第5卷第1期,第31–42页)。通过流式细胞术和生物发光MV4；11细胞的IVIS成像来定量PB中hCD45+细胞的百分比，在第7天测量植入。在第10天，小鼠每天口服灌注化合物1,HCl(200μL100mg/kg-以游离碱表示的剂量)，溶解在PEG400(Sigma)、无水乙醇(Sigma)和蒸馏水40:10:60中，或每周两次化合物2(200μL 25mg/kg)，溶解于50％2-(羟基丙基)-β-环糊精(Sigma)和50％50mM HCl，或药物组合或媒介物，持续4周。使用血液分析仪(BioRad,Gladesville,NSW)测定血细胞计数。
IVIS成像：使用Caliper IVIS Lumina III XR成像系统进行生物发光成像。用isofleurine麻醉小鼠，腹膜内注射100μL 125mg/kg荧光素(Perkin Elmer,Springvale,VIC)。
实施例4的材料和方法：
细胞系：人骨髓瘤细胞系(HMCL)来源于在RPMI 1640培养基中培养的原代骨髓瘤细胞，所述培养基补充有5％胎牛血清和3ng/mL重组IL-6，用于IL-6依赖性细胞系。HMCL代表了表型和基因组异源性以及患者对疗法反应的可变性。
MTT测定：使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓)比色存活测定法测量细胞活力。将细胞与化合物一起在包含最终体积为100μl/孔的96孔板中温育。(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(5-氟呋喃-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸(化合物2)相应于单一活性剂敏感性使用9种不同浓度。N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺盐酸盐(化合物1,HCl)以固定剂量使用-1μM。在每次处理结束时，将细胞与1mg/mL MTT(50μl MTT溶液，每孔2.5mg/ml)在37℃温育3小时，使MTT代谢。将裂解缓冲液(100μl裂解缓冲液：DMF(2:3)/SDS(1:3))加入每个孔中以溶解甲晶体，并且在温育18小时后，使用分光光度计在570nm处测量活细胞中的吸光度。
作为对照，将细胞与单独的培养基和与包含0.1％DMSO的培养基一起温育。作为骨髓瘤细胞生长对照，每天记录骨髓瘤细胞吸光度(D0、D1、D2、D3和D4)。
将全部实验重复3次，且在每次实验中，在至少一式三份的孔中重复每种实验条件。
使用如下公式计算抑制作用：
抑制作用(％)＝(1-被处理细胞的吸光度值/对照细胞的吸光度值)*100
实施例1：BCL-2和MCL1是在AML中表达的优势促存活蛋白
对7个AML细胞系和13个具有＞70％胚细胞的原代AML样品进行蛋白质免疫印迹，如图1中所示。
如图1所示，AML中BCL-2家族成员表达的蛋白质组学调查显示，除BCL-2外，大多数原发性AML样品和AML细胞系共表达促存活蛋白MCL1。BCL-XL在AML中表达频率低。
实施例2：组合的BCL-2和MCL1靶向在AML中展示出协同杀伤作用
将54例AML患者样品与6-log浓度范围的化合物1(HCl盐)、化合物2或1:1浓度在RPMI/15％FCS一起温育48小时并测定LC50(图2A)。
大约20％的原发性AML样品对化合物1或化合物2高度敏感，48小时后杀死50％原发性AML胚细胞所需的药物致死浓度(LC50)在低纳摩尔范围内(LC50<10nM)(图2A)。相比之下，当组合化合物1和化合物2时，敏感的AML样品的比例显著增加至70％，表明当同时靶向BCL-2和MCL1时的协同活性(图2A)。一些结果显示在图17中。
为了验证该方法的体内活性，将表达荧光素酶的MV4；11AML细胞移植到NSG小鼠中并用化合物1(HCl盐)或化合物2单独或以组合方式处理，并在疗法14和21天后评估肿瘤负荷(图2B)。在28天疗法完成后，跟踪小鼠的存活(图2C)。这些实验表明，化合物1和化合物2的组合在体内高度有效，证实了在体外使用原代AML细胞观察到的令人印象深刻的活性。
本文图2A-2C中呈现的数据显示化合物1,HCl和化合物2在AML中的协同作用组合活性。
实施例3：组合的BCL-2和MCL1抑制靶向白血病、但非正常先祖(progenitor)功能
为了评估BCL-2抑制组合MCL1抑制对正常人CD34+细胞或来自AML患者的ficolled胚细胞的毒性，在暴露于联合治疗2周后评估克隆形成潜力。使集落在补充有10％FCS、IL3、SCF、GM-CSF和EPO的琼脂中生长14天，并用自动分析仪计数集落。原发性AML样品的测定一式两份进行并取平均值。CD34+的误差表示2个独立的正常供体样品的平均值+/-SD。将结果标准化为在DMSO对照中计数的集落数。将所示的药物浓度在D1铺板。值得注意的是，化合物1+化合物2抑制AML集落形成活性，而不影响正常CD34+集落生长的功能。
总之，实施例2和3显示，BCL-2和MCL1的双重药理学抑制是治疗AML的新方法，其不需要额外的化疗且具有可接受的治疗安全窗口。
实施例4：响应于作为单一活性剂的MCL1抑制剂或其与BCL-2抑制剂组合的多发性 骨髓瘤细胞存活率的体外评估
通过使用MTT细胞活力测定法，分析27种人多发性骨髓瘤细胞系对化合物1、化合物2或化合物2在1μM化合物1存在下的敏感性。测定50％抑制浓度(IC50，以nM计)。
结果展示在下表中：
与单独的化合物相比，在大多数细胞系中当组合化合物1和化合物2时，证明了强烈的协同活性。
实施例5：MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂的组合在一组17个弥漫型大B细胞性淋巴瘤 (DLBCL)细胞系中对增殖的体外作用
材料和方法
如表1所示，收集细胞系并维持在补充有FCS(胎牛血清)的基础培养基中。此外，所有培养基都含有青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。除非另有说明，否则培养基和补充剂均来自Amimed/Bioconcept(Allschwil,瑞士)。
将细胞系在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中培养，并使其在T-75烧瓶中扩展。在所有情况下，细胞从冷冻原种中解冻，使用适当的稀释度经≥1次传代扩增，计数并使用CASY细胞计数器(Omni Life Science，Bremen，Germany)评估活力，然后以表1中所示的密度以25μl/孔铺板至384-孔板(Corning)。通过在Idexx Radil(Columbia,MO,USA)进行的PCR测定确定所有细胞系均不含支原体污染，并且通过在Asuragen(Austin,TX,USA)或在内部评估一组48个小核苷酸多态性(SNP)，排除了错误鉴定。
在DMSO(Sigma)中以10mM浓度制备化合物的储备溶液，并储存在-20℃。如果需要提供完整的剂量-反应曲线，将储备溶液在DMSO中预稀释至所需起始浓度的1000倍(参见表2)。在细胞接种后的那一天，使用非接触式300D数字分配器(TECAN,瑞士)以棋盘方式单独或以所有可能的排列方式分配8个2.5倍系列稀释的每种化合物，直接进入细胞分析板，如图4所示。所有孔中DMSO的最终浓度为0.2％。
使用CellTiterGlo(Promega,Madison,WI,USA)、以25μL试剂/孔和n＝每个条件2个重复板、通过定量细胞ATP水平，评估37℃/5％CO2温育2天后单一活性剂以及它们的棋盘组合对细胞活力的影响。在M1000多用途平板读数器(TECAN,瑞士)上量化发光。同时评估加入化合物时细胞的数量/活力，并用于评估特定细胞系的群体倍增时间的程度。
使用标准四参数曲线拟合计算单一活性剂IC50。根据Loewe加合性模型、使用Excess Inhibition 2D矩阵评估化合物组合之间的潜在协同相互作用，并报告为协同作用评分(Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)。所有计算均使用组合分析模块内部软件进行。将IC50定义为CTG信号被降低至媒介物(DMSO)对照测量值的50％时的化合物浓度。
协同作用评分解释如下：
SS～0→累加
SS＞1→弱协同作用
SS＞2→协同作用
表1.用于组合实验的17种弥漫型大B细胞性淋巴瘤细胞系的鉴定和测定条件
*该培养基用50μM 2-巯基乙醇进一步补充。基于与化合物温育开始时比较的终点时ATP水平的差异计算倍增时间。
表2.显示了化合物3和化合物1,HCl的单一活性剂IC50值，及其组合的协同作用评分。如果观察到当评分≥2.0时，认为相互作用是协同性的。
“Start conc”是指起始浓度。
“Abs IC50”是指绝对IC50.
“Max Inh”是指最大抑制。
结果
在一组17种弥漫型大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)细胞系中评估了MCL1抑制剂化合物3与BCL-2抑制剂化合物1,HCl组合对增殖的影响。
作为单一活性剂的化合物3强烈抑制了所测试的17种DLBCL系中大多数的生长(表1)。因此，14种细胞系显示IC50低于100nM，另外1种细胞系显示IC50在100nM和1μM之间。只有2种细胞系显示IC50高于1uM。
化合物1,HCl作为单一活性剂也抑制了所测试的17种DLBCL系中大多数的生长，不过，效能稍低(表2)。因此，2种细胞系显示IC50低于100nM，而6种胞系显示IC50在100nM和1uM之间。9种细胞系显示IC50高于1μM(其中4种高于10μM)。
化合物3和化合物1,HCl的组合处理，在所测试的17种DLBCL细胞系中的16种中引起协同生长抑制(即协同作用评分高于2-Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)(表2)。在5种细胞系中，协同作用效果被标记，其中协同作用评分在5-10之间。在4种细胞系中，协同作用效果罕见，达到10-17.3之间的协同作用评分。重要的是，协同作用不依赖于单一活性剂抗增殖作用，并且实际上在其本身不显示抗增殖作用的化合物3和化合物1的浓度下特别强烈。例如，在DB细胞中，测试的第二低浓度的化合物3和化合物1仅分别引起1和2％的生长抑制，而两种化合物的相应组合提供96％的生长抑制(图4A，左边组)，因此，高于基于单一活性剂活性计算的加合性91％(图4A，右边组)。作为另外的实例，在Toledo细胞中，其中化合物3的效能较低并且在所测试的最高浓度下仅实现部分生长抑制(46％)，与第二最低浓度的化合物1的组合导致98％的协同生长抑制。(图4B，左边组)，因此，高于基于单一活性剂活性计算的加合性52％(图4B，右边组)。
此外，值得注意的是，协同作用发生在广泛的单一活性剂浓度范围内，这应该证明了在体内在给药剂量水平和计划的灵活性方面是有益的。
总之，化合物3和化合物1的组合在所测试的大多数DLBCL细胞系中提供了强烈至罕见的协同生长抑制。
实施例6：使用MCL1抑制剂(化合物3)和BCL-2抑制剂(化合物1)的组合在 Karpas422异种移植物中的体内效能
材料和方法
肿瘤细胞培养和细胞接种
Karpas 422人B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞系是由患有化疗耐药性NHL的患者的胸腔积液建立。从DSMZ细胞库获得细胞，并在补充有10％FCS(BioConcept Ltd.Amimed)、2mM L-谷氨酰胺(BioConcept Ltd.Amimed)、1mM丙酮酸钠(BioConcept Ltd.Amimed)和10mM HEPES(Gibco)的RPMI-1640培养基(BioConcept Ltd.Amimed)中、在37℃、5％CO2的空气中培养。将细胞维持在0.5-1.5×106个细胞/mL之间。为了建立Karpas 422异种移植物，收获细胞并重悬于HBSS(Gibco)中并与Matrigel(BD Bioscience)(1:1v/v)混合，然后在用异氟烷麻醉的动物右侧皮下注射含有1x107细胞的200μL。在细胞接种前24小时，使用γ-辐射器在2分钟内以5Gy照射所有动物。
肿瘤生长
在细胞接种后定期监测肿瘤生长，当肿瘤体积达到适当体积时，将动物随机分入治疗组(n＝5)。在治疗期间，使用卡尺测量肿瘤体积，大约每周两次。肿瘤大小(以mm3计)由下式计算：(L x W2xπ/6)。其中W＝肿瘤的宽度且L＝肿瘤的长度。
治疗
当肿瘤达到适合大小时将携带肿瘤的动物(大鼠)纳入治疗组(n＝5)，以形成平均肿瘤体积约450mm3的组。治疗组如表3所示。用于化合物1,HCl的媒介物或化合物1,HCl通过口服(po)管饲，1小时后通过静脉内输注15分钟施用化合物3的媒介物或化合物3。对于静脉内输注，用异氟烷/O2麻醉动物，并通过尾静脉中的套管施用媒介物或化合物3。在给药日对动物称重，并根据体重调整剂量，两种化合物的给药体积为10ml/kg。
体重
每周给动物至少称重2次并且频繁检查任何不良反应的明显迹象。
数据分析和统计学评价
使用GraphPad Prism 7.00(GraphPad Software)统计分析肿瘤数据。如果数据的方差是正态分布的，则使用单尾ANOVA和事后Dunnett检验分析数据，以比较治疗组与对照组。事后Tukey检验用于组内比较。否则，使用Kruskal-Wallis秩和检验事后Dunn检验。如果适用，结果表示为平均值±SEM。
作为效能的量度，在本实验结束时根据如下公式计算％T/C值：
(Δ肿瘤体积治疗/Δ肿瘤体积对照)*100
根据如下公式计算肿瘤消退率：
-(Δ肿瘤体积治疗/肿瘤体积治疗开始时)*100
其中Δ肿瘤体积表示评价当天时的平均肿瘤体积减去本实验开始时的平均肿瘤体积。
表3.在带有Karpass422异种移植物的大鼠中的组合效能治疗组
当平均肿瘤体积约为450mm3时开始治疗。将化合物1,HCl配制在PEG400/EtOH/Phosal 50PG(30/10/60)中并且将化合物3置于溶液中。
QW是指每周1次。
结果
用化合物1游离碱以150mg/kg po、1小时后以20mg/kg iv静脉内输注化合物3进行组合治疗，在开始治疗后第30天在所有Karpas422肿瘤中诱导了完全消退(图5)。在第35天至第90天停止治疗后，治疗组中的所有动物都保持无肿瘤。与单一活性剂活性相比，在组合组中观察到阳性组合效应。在第34天，单一活性剂化合物3和组合组中的肿瘤反应与媒介物组之间存在显著性差异(p<0.05)。组合治疗基于体重变化耐受良好(图6)。
实施例7：使用MCL1抑制剂(化合物3)和BCL-2抑制剂(化合物1,HCl)的组合在 DLBCL Toledo异种移植物中的体内效能
材料和方法
细胞植入
通过将具有50％基质胶(matrigel)的300万Toledo细胞悬浮液直接皮下(sc)植入SCID/米色小鼠的皮下区域来建立异种移植模型。所有程序均使用无菌技术进行。在整个手术过程中将小鼠麻醉。
通常，每个组共有6只动物参加效能研究。对于单一活性剂和组合研究，通过口服管饲(po)给予化合物1并且通过尾静脉静脉注射(iv)给予化合物3，对动物进行给药。将化合物1,HCl配制成PEG300/EtOH/水(40/10/50)中的溶液，并将化合物3置于溶液中。当肿瘤在细胞植入后第26天达到约220mm3时，将携带肿瘤的小鼠随机分入治疗组。
将包括所有治疗组的剂量方案的研究设计总结在下表中。在给药日对动物称重，并根据体重调整剂量，给药体积为10ml/kg。在随机分组时收集肿瘤尺寸和体重，之后每周两次收集肿瘤尺寸和体重用于研究持续时间。在每天数据收集后提供以下数据：死亡率，个体和组平均体重，以及个体和组平均肿瘤体积。
对于Toledo模型中的研究，在细胞植入后第26天，当平均肿瘤体积～218-228mm3时，治疗开始。
QW是指每周1次。
体重(BW)
将体重改变％计算为(BW当前-BW起始)/(BW起始)x 100。将数据表示为相对于治疗开始当天的体重改变百分比。
肿瘤体积和研究中剩余的小鼠百分比
治疗/对照(T/C)百分比值使用如下公式计算：
％T/C＝100×ΔT/ΔC，条件是ΔT＞0
％消退＝100×ΔT/T0，条件是ΔT<0
其中：
T＝本研究最终一天时药物治疗组的平均肿瘤体积；
ΔT＝本研究最终一天时药物治疗组的平均肿瘤体积–给药开始日药物治疗组的平均肿瘤体积；
T0＝成组当日药物治疗组的平均肿瘤体积；
C＝本研究最终一日时对照组的平均肿瘤体积；和
ΔC＝本研究最终一日时对照组的平均肿瘤体积–给药开始日时的对照组的平均肿瘤体积。
研究中剩余的小鼠百分比＝6-达到终点的小鼠数量/6*100
统计学分析
所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用δ肿瘤体积和体重变化百分比进行统计学分析。在组间比较使用单尾ANOVA，然后进行事后Tukey检验。为了进行所有统计学评价，将显著性水平设定为p<0.05。除非另有说明，否则报告的是与媒介物对照组相比的显著性。
结果
治疗 在第42天时的T/C％
媒介物 100
化合物1,HCl 37
化合物3 102
化合物1,HCl+化合物3 3
在Toledo模型中，100mg/kg的化合物1游离碱产生具有37％T/C的统计学显著的抗肿瘤作用。25mg/kg的化合物3产生具有102％T/C的无抗肿瘤作用(图7)。化合物1+化合物3的组合导致3％T/C的肿瘤停滞，与媒介物、化合物1和化合物3治疗的肿瘤相比具有统计学显著性(p<0.05，通过单尾ANOVA检验)。
因此，DLBCL中BCL-2和MCL1的联合抑制可在临床上提供治疗益处。此外，Toledo的平均体重变化如图8所示。用化合物1,HCl和化合物3治疗小鼠表现出体重增加(分别为1.081％和2.3％)。组合组显示轻微的体重减轻(-3.2％)。在本研究中未观察到其他不良事件的迹象。所有6只动物在整个研究中存活。
总之，实施例2、6和7显示，MCL1抑制剂和BCL-2抑制剂的组合在具有急性髓性白血病和淋巴瘤人源细胞系的异种移植物的小鼠和大鼠中在耐受剂量下是有效的，这启示在这些疾病中使用这种组合可以实现适合的治疗窗。
实施例8：MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂的组合在一组13种急性髓性白血病(AML)细 胞系中对增殖的体外作用
材料和方法
如表1所示，收集细胞系并且维持在补充有FBS(胎牛血清)的基础培养基中。此外，所有培养基都含有青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。
将细胞系在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中培养，在T-150烧瓶中扩增。在所有情况下，将细胞从冷冻原液中解冻，使用适当的稀释度经≥1次传代扩增，计数并使用CASY细胞计数器评估活力，然后以表1中所示的密度将150μl/孔接种到96孔板中。所有细胞系均被确定为自身没有支原体污染。
制备化合物的储备溶液，浓度为在DMSO中5mM，并且储存在-20℃。
为了分析化合物作为单一活性剂的活性，将细胞接种并用9种2倍连续稀释的每种化合物处理，所述化合物被直接单独分配到细胞试验板中。通过使用75μL试剂/孔的CellTiterGlo定量细胞ATP水平，评估在37℃/5％CO2温育3天后的化合物对细胞活力的影响。所有实验一式三份进行。在多功能板读数器上量化发光。使用标准四参数曲线拟合计算单一活性剂IC50。将IC50定义为CTG信号被降低至媒介物(DMSO)对照测量值的50％时的化合物浓度。
为了分析化合物的组合活性，将细胞接种并用七种或八种3.16倍连续稀释的每种化合物处理，所述化合物被单独或者以棋盘方式以所有可能的排列方式直接分配进入细胞测定板中，如图9所示。通过使用75μL试剂/孔的CellTiterGlo定量细胞ATP水平，在37℃/5％CO2温育3天后评估单一活性剂以及它们的棋盘组合对细胞活力的影响。进行了两次独立的实验，每次实验一式两份进行。在多功能板读数器上量化发光。
根据Loewe加合性模型、使用Excess Inhibition 2D矩阵评估化合物组合之间的潜在协同相互作用，并报告为协同作用评分(Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)。所有计算均使用ClaliceTM Bioinformatics软件进行。
表3中所示的倍增时间是从细胞解冻到其接种在96-孔板中的不同传代(在T-150烧瓶中)获得的倍增时间的平均值。
协同作用是解释如下：
SS～0→累加
SS＞1→弱协同作用
SS＞2→协同作用
表3.用于组合实验的13种急性髓性白血病(AML)细胞系的鉴定和测定条件
细胞系 培养基(来源) ％FBS 倍增时间(小时) 接种细胞数/孔
MV4；11 RPMI(ATCC) 10 31.0 56520
MOLM-13 RPMI(DSMZ) 10 32.4 56520
PL-21 RPMI(DSMZ) 10 32.4 56520
ML-2 RPMI(DSMZ) 10 31.6 56520
Nomo-1 RPMI(DSMZ) 10 43.5 56520
THP-1 RPMI(ATCC) 10 49.6 56520
HL-60 IMDM(ATCC) 20 34.8 56520
Kasumi-1 RPMI(ATCC) 20 59.4 56520
OCI-AML3 MEMα(DSMZ) 20 25.7 56520
EOL-1 RPMI(DSMZ) 10 37.6 113040
GDM-1 RPMI(ATCC) 10 31.6 56520
KG1 IMDM(ATCC) 20 45.7 56520
KG1a IMDM(ATCC) 20 36.5 56520
表4a.显示了化合物3、化合物1,HCl和ABT-199在13种AML细胞系中的单一活性剂IC50值。在3天期间与细胞一起温育化合物。
表4b.显示了化合物4,HCl在5种AML细胞系中的单一活性剂IC50值。在3天期间与细胞一起温育化合物。
表5a.示出了化合物3和化合物1的组合在13种AML细胞系中的协同作用评分。当观察到≥2.0的评分时，相互作用被认为是协同的。示出了化合物的起始浓度、最大抑制的平均值和协同作用评分的标准偏差(sd)。在3天内将化合物与细胞一起温育。
表5b.示出了化合物3和ABT-199的组合在8种AML细胞系中的协同作用评分。当观察到≥2.0的评分时，相互作用被认为是协同的。示出了化合物的起始浓度、最大抑制的平均值和协同作用评分的标准偏差(sd)。在3天期间将化合物与细胞一起温育。
表5c.示出了化合物3和化合物4,HCl的组合在5种AML细胞系中的协同作用评分。当观察到≥2.0的评分时，相互作用被认为是协同的。示出了化合物的起始浓度、最大抑制的平均值和协同作用评分的标准偏差(sd)。在3天期间将化合物与细胞一起温育。
结果
组合(a).在一组13种急性髓性白血病(AML)细胞系中评估了将MCL1抑制剂化合物3与BCL-2抑制剂化合物1组合对增殖的影响。
作为单一活性剂的化合物强烈抑制了所测试的13种AML系的大部分的生长(表4a)。因此，10种细胞系显示IC50低于100nM，另外2种细胞系显示IC50在100nM和1μM之间。仅1种细胞系显示IC50高于1uM。
化合物1,HCl作为单一活性剂也抑制了所测试的几种AML系的生长，不过效能稍差(表4a)。因此，5种细胞系显示IC50低于100nM，2种细胞系显示IC50在100nM和1uM之间。6种细胞系显示IC50高于1μM。
化合物3和化合物1,HCl的组合处理在全部测试的13种细胞系中引起协同生长抑制(即协同作用评分高于2)(表5a)。在2种细胞系中，协同作用效果显著，协同作用评分在5和10之间。在10种细胞系中，协同作用效果异常，达到10和19.8之间的协同作用评分。重要的是，协同作用不依赖于单一活性剂的抗增殖作用，并且实际上在化合物3和化合物1自身不具有抗增殖活性的浓度下特别强。例如，在OCI-AML3细胞中，在所测试的第三低浓度下，化合物3和化合物1分别引起5和1％的生长抑制，而两种化合物的相应组合提供84％的生长抑制(图9A，左上组)，因此比基于单一活性剂活性计算的加合性高79％(图9A，右上组)。
此外，值得注意的是，协同作用发生在广泛的单一活性剂浓度范围内，这应该证明了在给药剂量水平和时间表的灵活性方面在体内是有益的。
总之，化合物3和化合物1的组合在所有测试的13种AML细胞系中提供了协同生长抑制。重要的是，在测试的大多数AML细胞系(10/13)中观察到罕见的协同生长抑制。
组合(b).在一组8种急性髓性白血病(AML)细胞系中评估了将MCL1抑制剂化合物3与BCL-2抑制剂ABT-199组合对增殖的影响。
作为单一活性剂的化合物3强烈抑制了所测试的8种AML系的大部分的生长(表4a)。因此，5种细胞系显示IC50低于100nM，另外2种细胞系显示IC50在100nM和1μM之间。仅1种细胞系显示IC50高于1uM。
作为单一活性剂的ABT-199也抑制AML细胞系的生长，但是效能较低(表4a)。因此，仅1种细胞系显示IC50低于100nM，而2种细胞系显示IC50在100nM和1uM之间。五种细胞系显示IC50高于1uM。
在组合中，MCL1抑制剂和ABT-199处理在测试的8种细胞系的整个组中引起协同生长抑制(即协同作用评分高于2)(表5b)。在大多数细胞系中，协同作用效果异常，达到10和17.6之间的协同作用评分。重要的是，协同作用不依赖于单一活性剂的抗增殖作用，并且事实上在MCL1抑制剂和ABT-199自身不具有抗增殖作用的浓度下特别强。例如，在OCI-AML3细胞中，测试的第三低浓度的MCL1和ABT-199分别引起26％和18％的生长抑制，而两种化合物的相应组合提供了91％的生长抑制(图13，左上组)。
此外，值得注意的是，协同效应发生在广泛的单一活性剂浓度范围内，这应该证明了在剂量水平和时间表的灵活性方面在体内是有益的。
总之，化合物3和ABT-199的组合在所有测试的8种AML细胞系中提供了协同生长抑制。重要的是，在测试的大多数AML细胞系中观察到罕见的协同生长抑制(7/8)。
组合(c).在一组5种急性髓性白血病(AML)细胞系中评估了将MCL1抑制剂化合物3与BCL-2抑制剂化合物4组合对增殖的影响。
作为单一活性剂的化合物3强烈抑制了所测试的5种AML系的生长(表4b)。因此，所有细胞系显示IC50低于200nM。作为单一活性剂的化合物4,HCl也抑制了所测试5种细胞系中4种的生长，IC50低于或等于40nM，一种细胞系对化合物4具有抗性，IC50为10μM。在组合中，化合物3和化合物4,HCl的处理在整个测试的5种细胞系中引起协同生长抑制(即协同作用评分高于2)(表5c)。在2细胞系中，协同作用效果明显，协同作用评分在5和10之间。在1种细胞系中，协同作用效果罕见，达到协同作用评分16.5。重要的是，协同作用不依赖于单一活性剂的抗增殖作用，事实上，在化合物4,HCl和化合物3自身没有或具有低抗增殖作用的浓度下作用特别强。例如，在OCI-AML3细胞中，化合物4,HCl和化合物3在测试的第三低浓度下分别引起1和40％的生长抑制，而两种化合物的相应组合提供98％的生长抑制(图1A，左组；代表两个独立实验)，因此比基于单一活性剂活性计算的加合性高53％(图14A，右组)。在ML-2中，化合物4,HCl和化合物3在测试的第五个最低浓度下分别引起18和26％的生长抑制，而两种化合物的相应组合提供100％的生长抑制(图14B，左组；代表两个独立实验)，因此比基于单一活性剂活动计算的加合性高51％(图15，右组)。
总之，化合物4和化合物3的组合在所有测试的5种AML细胞系中提供了协同生长抑制。
实施例9：MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂组合在一组12种神经母细胞瘤(NB)细胞系中 对增殖的体外作用
材料和方法
如表1所示，收集细胞系并维持在补充有FBS的基础培养基中。此外，所有培养基都含有青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。将细胞系在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中培养，在T-150烧瓶中扩增。在所有情况下，将细胞从冷冻原液中解冻，使用适当的稀释度经≥1次传代扩增，计数并使用CASY细胞计数器评估活力，然后将150μl/孔以表6中所示的密度接种到96孔板中。所有细胞系均被确定为内部没有支原体污染。
制备化合物的储备溶液，浓度为在DMSO中5mM，并储存在-20℃。为了分析化合物作为单一活性剂的活性，将细胞接种并用9种3.16倍连续稀释的每种化合物直接分配到细胞试验板中进行处理。通过使用150μL试剂/孔的CellTiterGlo定量细胞ATP水平，评估在37℃/5％CO2温育2或3天后化合物对细胞活力的影响(如表6中所示)。进行两个独立的实验，每一个一式两份进行。所有实验一式三份进行。在多功能板读数器上量化发光。使用标准四参数曲线拟合计算单一活性剂IC50。将IC50定义为CTG信号被降低至媒介物(DMSO)对照测量值的50％时的化合物浓度。
进行相同实验以评价化合物组合之间的潜在相互作用。根据Loewe加合性模型、使用Excess Inhibition 2D矩阵评价协同作用评分(Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)。所有计算均使用Clalice TM Bioinformatics软件进行。
表6中所示的倍增时间是从细胞解冻到其接种在96-孔板中的不同传代(在T-150烧瓶中)获得的倍增时间的平均值。
协同作用评分解释如下：
SS～0→累加
SS＞1→弱协同作用
SS＞2→协同作用
表6.用于组合实验的12种神经母细胞瘤(NB)细胞系的鉴定和测定条件
表7.显示了化合物3和化合物1,HCl的单一活性剂IC50值。在2或3天期间与细胞一起温育化合物。
表8.显示了化合物3和化合物1,HCl组合的协同作用评分。当观察到≥2.0的评分时，相互作用被认为是协同的。在2或3天期间将化合物与细胞一起温育。
结果
在一组12种神经母细胞瘤细胞系中评估组合的MCL1抑制剂化合物3与BCL-2抑制剂化合物1对增殖的作用。测试的12种细胞系中的3种对作为单一活性剂的化合物3敏感(表7)。一种细胞系展示出低于100nM的IC50，而另外2种细胞系展示出100nM-1uM的IC50。
全部细胞系对作为单一活性剂的化合物1,HCl耐受，测试的全部细胞系展示出高于1μM的IC50。在组合中，化合物3和化合物1处理导致测试的12种NB细胞系中有11种中的协同生长抑制(即协同作用评分高于2-Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)(表8)。在5种细胞系中，协同作用是罕见的，实现了协同作用评分为10-17.81。重要的是，协同作用不依赖于单一活性剂的抗增殖作用，而实际上，在其自身不具有抗增殖作用的化合物3和化合物1,HCl的浓度下特别强烈。例如，在LAN-6细胞中，化合物3和化合物1,HCl在630nM引起生长抑制分别仅为12％和0％，而两种化合物的相应组合得到生长抑制为95％(图10,上左组)，由此比基于单一活性剂活性计算的加合性高76％(图10,上右组)。总之，化合物3和化合物1的组合在大部分测试的神经母细胞瘤细胞系中提供强烈至罕见的协同生长抑制。
实施例10：MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂组合在一组8种B-细胞型急性淋巴细胞白血 病(B-ALL)和10种T-细胞型急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系中对增殖的体外作用
材料和方法
如表1所示，收集细胞系并维持在补充有FBS的基础培养基中。此外，所有培养基都含有青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。将细胞系在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中培养，在T-150烧瓶中扩增。在所有情况下，将细胞从冷冻原液中解冻，使用适当的稀释度经≥1次传代扩增，计数并使用CASY细胞计数器评估活力，然后将150μl/孔以表9中所示的密度接种到96孔板中。所有细胞系均被确定为内部没有支原体污染。
制备化合物的储备溶液，浓度为在DMSO中5mM，并储存在-20℃。为了分析化合物作为单一活性剂的活性，将细胞接种并用9种2倍连续稀释的每种化合物直接分配到细胞试验板中进行处理。通过使用75μL试剂/孔的CellTiterGlo定量细胞ATP水平，在37℃/5％CO2温育3天后评估化合物对细胞活力的影响。所有条件一式三份测试。在多功能板读数器上量化发光。使用标准四参数曲线拟合计算单一活性剂IC50。将IC50定义为CTG信号被降低至媒介物(DMSO)对照测量值的50％时的化合物浓度。
为了分析化合物的组合活性，将细胞接种并用七种或八种3.16倍连续稀释的每种化合物处理，所述化合物序列稀释液或者单独或者以棋盘方式以所有可能的排列方式直接分配进入细胞测定板中，如图1所示。通过使用75μL试剂/孔的CellTiterGlo定量细胞ATP水平，在37℃/5％CO2温育3天后评估单一活性剂以及它们的棋盘组合对细胞活力的影响。对于B-ALL细胞系，进行了两次独立的实验，每次实验一式两份进行。对于T-ALL细胞系，一式三份进行了一种实验。在多功能板读数器上量化发光。
根据Loewe加合性模型、使用Excess Inhibition 2D矩阵评估化合物组合之间的潜在协同相互作用，并报告为协同作用评分(Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)。所有计算均使用可在Horizon website获得的ClaliceTM Bioinformatics软件进行。
表9中所示的倍增时间是从细胞解冻到其接种在96-孔板中的不同传代(在T-150烧瓶中)获得的倍增时间的平均值。
协同作用评分的解释如下：
SS～0→累加
SS＞1→弱协同作用
SS＞2→协同作用
表9.用于组合实验的8种B-ALL和10种T-ALL细胞系的鉴定和测定条件
表10.显示化合物3和化合物1,HCl在8种-ALL和10种T-ALL细胞系的单一活性剂IC50值。在3天期间将化合物与细胞一起温育。
表11.显示了化合物3和化合物1,HCl组合在8种B-ALL和10种T-ALL细胞系中的协同作用评分。当观察到≥2.0的评分时，相互作用被认为是协同的。示出了化合物的起始浓度、最大抑制平均值和协同作用评分的标准偏差(sd)。在3天期间将化合物与细胞一起温育。
结果
在一组8种B-ALL和10种T-ALL细胞系中评估了MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂的组合对增殖的作用。
MCL1抑制剂作为单一活性剂强烈抑制了大部分测试的ALL细胞系的生长(表10)。因此，13种ALL细胞系展示出低于100nM的IC50，而另外2种ALL细胞系展示出100nM-1uM的IC50。仅3种ALL细胞系展示出高于1uM的IC50。
BCL-2抑制剂作为单一活性剂也抑制几种测试的ALL细胞系的生长，不过效能较低(表10)。因此，5种细胞系展示出低于100nM的IC50，而2种细胞系展示出100nM-1uM的IC50。11种ALL细胞系展示出高于1uM的IC50。
在组合中，MCL1抑制剂和BCL-2抑制剂处理导致在全部测试的17/18ALL细胞系中的协同生长抑制(即协同作用评分高于2-Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)。在6种细胞系中，协同作用是显著的，协同作用评分在5至10之间。在5种细胞系中，协同作用是罕见的，实现了协同作用评分在10～15.9。重要的是，协同作用不依赖于单一活性剂的抗增殖作用，而实际上在自身不具有抗增殖作用的MCL1抑制剂和BCL-2抑制剂的浓度下特别强烈。例如，在NALM-6细胞中，MCL1抑制剂和BCL-2抑制剂在测试的第四最低浓度下分别引起生长抑制仅为6和8％，而两种化合物的相应组合得到生长抑制为61％(图10,上左组)。
此外，值得注意的是，协同作用在广泛单一活性剂浓度范围中发生，这应该证明关于给药剂量水平和时间表的灵活性方面在体内是有益的。
总之，MCL1抑制剂和BCL-2抑制剂的组合在大部分测试的ALL细胞系中(17/18)提供协同生长抑制。重要的是，在测试的5/18ALL细胞系中观察到罕见的协同生长抑制。
实施例11：MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂的组合在5种套细胞淋巴瘤(MCL)细胞系组 中对增殖的体外作用
材料和方法
如表12所示，收集细胞系并维持在补充有FBS的基础培养基中。此外，所有培养基都含有青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)。
将细胞系在37℃、含5％CO2的潮湿气氛中培养，在T-150烧瓶中扩增。在所有情况下，将细胞从冷冻原液中解冻，使用适当的稀释度经≥1次传代扩增，计数并使用CASY细胞计数器评估活力，然后将150μl/孔以表12中所示的密度接种到96孔板中。所有细胞系均被确定为内部没有支原体污染。
制备化合物的储备溶液，浓度为在DMSO中5mM，并且储存在-20℃。为了分析化合物作为单一活性剂或以组合方式的活性，将细胞接种并用7或8种3.16-倍连续稀释的每种化合物单独或以所有可能的棋盘格式中的排列方式直接分配到细胞试验板中进行处理。通过使用150μL试剂/孔的CellTiterGlo定量细胞ATP水平，在37℃/5％CO2温育2天后评估单一活性剂及其棋盘组合对细胞活力的影响。所有条件一式三份进行测试。在多功能板读数器上量化发光。
根据Loewe加合性模型、使用Excess Inhibition 2D矩阵评估化合物组合之间的潜在协同相互作用，并报告为协同作用评分(Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)。所有计算均使用可以在Horizon website获得的ClaliceTM Bioinformatics软件进行。
使用标准四参数曲线拟合计算单一活性剂IC50。将IC50定义为CTG信号被降至对媒介物(DMSO)对照测定的浓度的50％时的化合物浓度。
表12中所示的倍增时间是从细胞解冻到其接种在96-孔板中的不同传代(在T-150烧瓶中)获得的倍增时间的平均值。
协同作用评分
SS～0→累加
SS＞1→弱协同作用
SS＞2→协同作用
表12.用于组合实验的5种套细胞淋巴瘤细胞系的鉴定和测定条件
细胞系 培养基 ％FBS 来源 时间(小时) 接种细胞数/孔
Z-138 RPMI 10 ATCC 22.5 37500
Jeko RPMI 20 ATCC 26.0 27000
Mino RPMI 15 ATCC 31.1 56250
JVM-2 RPMI 10 ATCC 76.0 56250
REC-1 RPMI 10 ATCC 36.0 56250
表13.显示化合物3和化合物1,HCl在5种套细胞淋巴瘤细胞系中的单一活性剂IC50值。在2天期间将化合物与细胞一起温育。
表14.显示了化合物3和化合物1,HCl的组合在5种套细胞淋巴瘤细胞系中的协同作用评分。当观察到≥2.0的评分时，相互作用被认为是协同的。示出了化合物的起始浓度、最大抑制和协同作用评分。在2天期间将化合物与细胞一起温育。
结果
在一组5种套细胞淋巴瘤细胞系中评估了MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂的组合对增殖的影响。
作为单一活性剂，与BCL-2抑制剂相比，MCL1抑制剂显示出更优的活性。因此，对于MCL1抑制剂，3种细胞系显示低于100nM的IC50，而对于BCL-2抑制剂，仅一种细胞系显示IC50低于100nM(表13)。
在组合中，在所有测试的细胞系中，MCL1抑制剂和BCL-2抑制剂处理引起了协同生长抑制(即协同作用评分高于2-Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666)(表14)，如图12所示。重要的是，在4/5细胞系中，协同作用效果是显著的，其中协同作用评分高于5。
实施例12：MCL1抑制剂与BCL-2抑制剂组合在一组5种小细胞肺癌(SCLC)细胞系中 对增殖的体外作用
所有细胞系均获自ATCC。含有补充有10％FBS(HyClone)的RPMI1640培养基(Invitrogen)用于COR-L95、NCI-H146、NCI-H211、SHP-77、SW1271、NCI-H1339、NCI-H1963和NCI-H889。含有Waymouth’s MB 752/1(Invitrogen)和10％FBS的培养基用于DMS-273。包含含有5％FBS的DMEM/F12(Invitrogen)并且补充有0.005mg/ml胰岛素、0.01mg/ml转铁蛋白和30nM亚硒酸钠溶液(Invitrogen)、10nM氢化可的松(Sigma)、10nMβ-雌二醇(Sigma)和2mML-谷氨酰胺(HyClone)的培养基用于NCI-H1105。
将细胞系在37℃和5％CO2培养箱中培养并在T-75培养瓶中扩增。在所有情况下，将细胞从冷冻原种中解冻，使用1:3稀释度经≥1传代扩增，计数并使用ViCell计数器(Beckman-Coulter)评估活力，然后在384孔中铺板。为了分裂和扩增细胞系，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO)从烧瓶中取出细胞。通过在Idexx Radil(Columbia，MO，USA)进行的PCR检测方法测定，并通过检测一组SNP正确鉴定，确定所有细胞系都没有支原体污染。
在72小时CellTiter-GloTM(CTG)测定(Promega G7571)中测量细胞增殖，并且显示的所有结果是至少三次测量的结果。对于CellTiter-GloTM测定，将细胞分配到组织培养物处理的384孔板(Corning 3707)中，最终体积为35μL培养基，密度为每孔5000个细胞。铺板后24小时，将5μL每种化合物稀释系列转移至含有细胞的平板中，得到化合物浓度范围为0-10μM，最终DMSO(Sigma D8418)浓度为0.16％。将板温育72小时，并使用CellTiter-GloTM发光细胞活力测定法(Promega G7571)和Envision读板仪(Perkin Elmer)测定化合物对细胞增殖的作用。
CellTiter-发光细胞活力测定法是一种基于对存在的ATP定量来确定培养物中存活细胞数的同质方法，其表示代谢活性细胞的存在。该方法在Technical BulletinTB288 Promega中有详细描述。简言之，如上所述，将细胞铺板在不透明壁的多孔板中的培养基中。还制备含有培养基但不含细胞的对照孔以获得背景发光的值。然后加入15uLCellTiter-试剂并在轨道振荡器上混合内容物10分钟以诱导细胞裂解。接下来，使用读板器记录发光。
使用Chalice软件(CombinatoRx，Cambridge MA)分析生长抑制百分比和过度抑制。相对于DMSO的生长抑制百分比显示在标记为抑制的小组中，超过预期量的抑制量显示在标记为ADD过度抑制的小组中(图15(a)-(e))。化合物1,HCl的浓度沿着从左到右的底行示出，且化合物3沿着最左侧的柱图从底部到顶部浓度增加。网格中的所有剩余点显示来自两个抑制剂的组合的结果，其对应于在两个轴上表示的单一活性剂浓度。使用Chalice分析仪进行细胞增殖的数据分析，如Lehar等人,Nat Biotechnol.2009年7月；27(7)：659–666所述。使用Loewe协同作用模型计算过度抑制，该模型测量相对于两种药物以剂量累加方式表现时预期的对生长的影响。正数表示增加协同作用的区域。
协同作用评分
SS～0→剂量累加
SS＞2→协同作用
SS＞1→弱协同作用
结果
在组合中，化合物1和化合物3处理在8/10小细胞肺癌细胞系中导致了协同生长抑制(即协同作用评分高于2)。重要的是，在6种细胞系中，协同作用是显著的，协同作用得分高于6。
实施例13：使用MCL1抑制剂(化合物3)和BCL-2抑制剂(化合物1,HCl或ABT-199)的 组合在患者来源的原发性AML模型HAMLX5343中的体内效能材料和方法
材料
动物
在操作之前，使体重17-27克的NOD scidγ(NSG)雌性小鼠(JacksonLaboratories)适应环境，随意获取食物和水3天。
原发性肿瘤模型
携带KRAS突变和野生型FLT3的患者来源的原发性AML模型HAMLX5343获自DanaFarber Cancer Institute。
测试化合物、制剂
将化合物1,HCl配制在5％乙醇、20％Dexolve-7中作为静脉内施用的溶液，或配制在PEG300/EtOH/水(40/10/50)中用于口服施用。将ABT-199配制在PEG300/EtOH/水(40/10/50)中用于口服施用。所有这些在4℃稳定至少一周。将化合物3配制成脂质体制剂作为静脉内溶液制剂，其在4℃稳定三周。媒介物和化合物根据需要制备给药溶液。所有动物给药化合物1(表示为游离碱)或ABT-19910mL/kg，或给药化合物35mL/kg。
方法
研究设计
研究7844HAMLX5343-XEF中使用八个治疗组，如表15中总结。当平均肿瘤负荷(％CD-45阳性细胞)在8％和15％之间时，开始所有治疗。
在该研究中，化合物1通过口服管饲法(po)或静脉内施用以50mg/kg每周一次施用，ABT-199以25mg/kg通过口服管饲法(po)每周施用一次，分别作为单一活性剂或与每周1次12.5mg/kg的化合物3组合，持续18天。
化合物1(表示为游离碱)和ABT-199均以10mL/kg施用。化合物3以5mL/kg施用。剂量根据体重调整。每周两次记录体重，每周记录一次肿瘤负荷。
表15.7844HAMLX5343-XEF的剂量*和剂量方案
*剂量表示为游离碱
原发性AML模型
对于该实验，32只小鼠植入原代AML系HAMLX5343。给小鼠静脉内注射200万个白血病细胞。当肿瘤负荷在8％-15％之间时，将动物随机分成8组，每组4只小鼠，用于媒介物、化合物1(po)、化合物1(iv)、ABT-199、化合物3或组合治疗。治疗18天后，当肿瘤负荷达到99％时终止研究。通过FACS分析测量肿瘤负荷。
动物监测
每天监测两次动物健康和行为，包括梳理和移动。监测小鼠的一般健康状况并每天记录死亡率。将任何垂死的动物处死。
肿瘤测量
每周通过尾部剪切一次将小鼠放血。将血液分至96孔板的IgG对照孔和CD33/CD45孔。在室温用200μl RBC裂解缓冲液裂解血液两次，然后用FACS缓冲液(PBS中的5％FBS)洗涤一次。然后将样品在4℃、在100μl封闭缓冲液(5％小鼠Fc Block+5％人Fc Block+90％FACS缓冲液)中温育10-30分钟。将20μl IgG对照混合物(2.5μl小鼠igG1K同种型对照-PE+2.5μl小鼠igG1K同种型对照-APC+15μl FACS缓冲液)加入IgG对照孔和20ul CD33/CD45混合物(2.5μl小鼠抗人CD33-PE+2.5μl小鼠抗人CD45-APC+15μl FACS缓冲液)。将样品在4℃温育30-60分钟，然后在分析前洗涤两次。使用FACSDiva软件在Canto上运行样品。用FloJo软件进行分析。报告CD45阳性、活的单细胞的百分比为肿瘤负荷。
数据分析
使用如下公式计算治疗/对照(T/C)百分比值：
％T/C＝100×ΔT/ΔC，条件是ΔT＞0
％消退＝100×ΔT/T起始，条件是ΔT<0
其中：
T＝在本研究最终一天时药物治疗组的平均肿瘤负荷；
ΔT＝在本研究最终一天时药物治疗组的平均肿瘤负荷–在给药起始日时药物治疗组的平均肿瘤负荷
T起始＝在给药起始日时药物治疗组的平均肿瘤负荷；
C＝在本研究最终一天时对照组的平均肿瘤负荷；且
ΔC＝在本研究最终一天时对照组的平均肿瘤负荷–在给药起始日时对照组的平均肿瘤负荷。
所有数据均表示为平均值±SEM。使用δ肿瘤负荷和体重进行统计学分析。使用ANOVA和Tukey检验进行最终测量值的组间比较。使用GraphPad Prism进行统计学分析。
统计学分析
所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。Delta肿瘤体积和体重用于统计分析。使用Kruskal-Wallis ANOVA进行组间比较，然后进行事后Dunn检验或Tukey检验。对于所有统计学评价，将显著性水平设定为p<0.05。除非另有说明，否则报告了与媒介物对照组相比的显著性。药理学研究中使用的标准方案没有预先加能(pre-powered)以证明组合物相对于相应的单一活性剂治疗具有统计学上显著的优越性。统计能力通常受限于强单一活性剂响应和/或模型可变性。然而，提供了组合相对于单一活性剂治疗的p值。
结果
组合的MCL1和BCL-2抑制的协同抗肿瘤作用
在7844HAMLX5343-XEF研究中，当分别以50mg/kg(口服或iv)、25mg/kg(口服)或12.5mg/kg(iv)每周一次施用时，单独的化合物1、ABT-199或化合物3在携带KRAS突变的HAMLX5343模型中未显示抗肿瘤活性(％T/C分别为98、92、98或99％,p＞0.05)。
在该模型中，当口服施用时，化合物1以50mg/kg或ABT-199以25mg/kg与化合物3(12.5mg/kg iv)组合每周一次，导致了肿瘤停滞(％T/C分别为3％或6％，p<0.05)。
另一方面，静脉内施用化合物1与化合物3的组合诱导了接近完全肿瘤消退(％消退为100％)，其与单一活性剂(p<0.05)或化合物1/化合物3po/iv组合显著不同。对于18天治疗期，每个治疗组的平均肿瘤负荷对时间作图，如图1所示。肿瘤负荷的变化、％T/C或％消退在表16和图16(a)-(b)中给出。
表16.7844HAMLX5343-XEF研究中的抗肿瘤作用概述
治疗 T/C％ 消退％
媒介物 100
化合物1 50mpk po 98
化合物1 50mpk iv 92
ABT-199 25mpk po 98
化合物3 12.5mpk iv 99
化合物1+化合物3(po/iv) 3*
化合物1+化合物3(iv/iv) 100**
ABT-199+化合物3(po/iv) 6*
*与媒介物和单一活性剂相比p<0.05(ANOVA,Tukey检验)
**与po/iv组合相比p<0.05(ANOVA,Tukey检验)
结论
AML是因获得遗传改变造成的造血祖细胞转化导致的攻击性和异类血液恶性肿瘤(Patel等人,New England Journal of Medicine 2012 366：1079-1089)。AML的5-年存活率因缺乏有效疗法而较低。规避细胞凋亡是癌症的标志(Hanahan等人，Cell 2000 100：57-70)。癌细胞规避细胞凋亡的主要形式之一是通过增量调节促存活BCL-2家族蛋白如BCL-2、BCL-xL和MCL1。
MCL1基因是癌症患者中最常见被扩增的基因(Beroukhim等人,Nature 2010 463：899-905)。此外，BCL-2和MCL1均在AML中高度表达。因此，化合物1(BCL-2i)和化合物3(MCL1)的组合可以通过增强作为对抗AML的一般机制的促细胞凋亡信号而提供协同作用。
我们在此证实，BCL-2抑制剂化合物1或ABT-199与化合物3(MCL1抑制剂)的组合在具有KRAS突变(wt FLT3)的AML异种移植物模型中具有治疗AML的显著协同作用。iv/iv化合物1/化合物3组合优于相同剂量水平的po/iv组合。结果表明，BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂的组合可以为对抗AML的有效疗法。

Claims (46)

1.一种组合，其包含：
(a)式(I)的BCL-2抑制剂：
其中：
◆X和Y表示碳原子或氮原子，应当理解，它们不能同时表示两个碳原子或两个氮原子，
◆A1和A2与携带它们的原子一起形成任选取代的由5、6或7个环成员组成的芳族或非芳族Het，所述环成员除由X或Y表示的氮外还可以包含1-3个独立地选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，所述氮可以被代表以下的基团取代：氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或基团-C(O)-O-Alk，其中Alk是直链或支链(C1-C6)烷基，
或A1和A2彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、直链或支链(C1-C6)烷基或环烷基，
◆T表示氢原子，任选地被1-3个卤原子取代的直链或支链(C1-C6)烷基，基团(C1-C4)烷基-NR1R2，或基团(C1-C4)烷基-OR6，
◆R1和R2彼此独立地表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
或R1和R2与携带它们的氮原子一起形成杂环烷基，
◆R3表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、环烷基、其中烷基部分为直链或支链的(C3-C10)环烷基-(C1-C6)烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，应当理解，上述基团或其可能取代基的一个或多个碳原子可以被氘代，
◆R4表示芳基、杂芳基、环烷基或直链或支链(C1-C6)烷基，应当理解，上述基团或其可能取代基的一个或多个碳原子可以被氘代，
◆R5表示氢或卤原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链(C1-C6)烷氧基，◆R6表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
◆Ra、Rb、Rc和Rd彼此独立地表示R7、卤原子、直链或支链(C1-C6)烷氧基、羟基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、三氟甲氧基、-NR7R7′、硝基、R7-CO-(C0-C6)烷基-、R7-CO-NH-(C0-C6)烷基-、NR7R7′-CO-(C0-C6)烷基-、NR7R7′-CO-(C0-C6)烷基-O-、R7-SO2-NH-(C0-C6)烷基-、R7-NH-CO-NH-(C0-C6)烷基-、R7-O-CO-NH-(C0-C6)烷基-、杂环烷基，或(Ra,Rb)、(Rb,Rc)或(Rc,Rd)对之一的取代基与携带它们的碳原子一起形成由5-7个环成员组成的环，所述环可以包含选自氧和硫的1-2个杂原子，还应当理解，上文定义的环的一个或多个碳原子可以被氘代或可以被1-3个基团取代，所述基团选自卤素和直链或支链(C1-C6)烷基，
◆R7和R7′彼此独立地表示氢、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、芳基或杂芳基，或R7和R7′与携带它们的氮原子一起形成由5-7个环成员组成的杂环，
应当理解，当式(I)的化合物包含羟基时，后者可以任选地被转化成如下基团之一：–OPO(OM)(OM’)、-OPO(OM)(O-M1 +)、–OPO(O-M1 +)(O-M2 +)、–OPO(O-)(O-)M3 2+、–OPO(OM)(O[CH2CH2O]nCH3)或–OPO(O-M1 +)(O[CH2CH2O]nCH3)，其中M和M′彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、均由5或6个环成员组成的环烷基或杂环烷基，同时M1 +和M2 +彼此独立地表示药学上可接受的一价阳离子，M3 2+表示药学上可接受的二价阳离子，且n是1-5的整数，
应当理解：
-“芳基”是指苯基、萘基、联苯基或茚基基团，
-“杂芳基”是指由5-10个环成员组成的任意单-或双-环基团，其具有至少一个芳族部分并且包含1-4个选自氧、硫和氮(包括季氮)的杂原子，
-“环烷基”是指包含3-10个环成员的任意单-或双-环非芳族碳环基团，
-“杂环烷基”是指任意的单-或双-环、非芳族、稠合或螺基团，其由3-10个环成员组成并且包含1-3个选自氧、硫、SO、SO2和氮的杂原子，
对于由此定义的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基以及基团烷基、烯基、炔基和烷氧基，其可能被1-3个基团取代，所述基团选自：直链或支链(C1-C6)烷基，任选被羟基、吗啉、3-3-二氟哌啶或3,3-二氟吡咯烷取代；(C3-C6)螺；直链或支链(C1-C6)烷氧基，任选被吗啉取代；(C1-C6)烷基-S-；羟基；氧代；N-氧化物；硝基；氰基；-COOR′；-OCOR′；NR′R”；直链或支链(C1-C6)多卤代烷基；三氟甲氧基；(C1-C6)烷基磺酰基；卤素；任选被一个或多个卤素取代的芳基；杂芳基；芳氧基；芳硫基；环烷基；任选被一个或多个卤原子或烷基取代的杂环烷基，其中R′和R”彼此独立地表示氢原子或任选被甲氧基取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
对于式(I)中定义的Het基团，其可能被1-3个基团取代，所述基团选自直链或支链(C1-C6)烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、NR1′R1"和卤素，应当理解，R1′和R1"如对上文所提及的基团R′和R”所定义，
或其对映体、非对映异构体或其与药学上可接受的酸或碱的加成盐，和(b)MCL1抑制剂，
用于同时、依次或分开应用。
2.一种组合，其包含：
(a)BCL-2抑制剂和
(b)式(II)的MCL1抑制剂：
其中：
◆A表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、氰基、-NW10W10’、-Cy6或卤原子，
◆W1、W2、W3、W4和W5彼此独立地表示氢原子、卤原子、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、氰基、硝基、-烷基(C0-C6)-NW8W8’、-O-Cy1、-烷基(C0-C6)-Cy1、-烯基(C2-C6)-Cy1、-炔基(C2-C6)-Cy1、-O-烷基(C1-C6)-W9、-C(O)-OW8、-O-C(O)-W8、-C(O)-NW8W8’、-NW8-C(O)-W8’、-NW8-C(O)-OW8’、-烷基(C1-C6)-NW8-C(O)-W8’、-SO2-NW8W8’、-SO2-烷基(C1-C6)，
或(W1、W2)、(W2、W3)、(W1、W3)、(W4、W5)对之一的取代基在接枝到两个相邻碳原子上时与携带它们的碳原子一起形成芳族或非芳族环，其由5-7个环成员组成，可以包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，得到的环可以被选自直链或支链(C1-C6)烷基、-NW10W10’、-烷基(C0-C6)-Cy1或氧代的基团取代，
◆X’表示碳或氮原子，
◆W6表示氢、直链或支链(C1-C8)烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基(C1-C6)基团、杂芳基烷基(C1-C6)基团，
◆W7表示直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C2-C6)烯基、直链或支链(C2-C6)炔基、-Cy3、-烷基(C1-C6)-Cy3、-烯基(C2-C6)-Cy3、-炔基(C2-C6)-Cy3、-Cy3-Cy4、-炔基(C2-C6)-O-Cy3、-Cy3-烷基(C0-C6)-O-烷基(C0-C6)-Cy4、卤原子、氰基、-C(O)-W11、-C(O)-NW11W11’，
◆W8和W8’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或-烷基(C0-C6)-Cy1，
或(W8、W8’)与携带它们的氮原子一起形成芳族或非芳族环，其由5-7个环成员组成，除氮原子外还可以包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，应当理解，所述氮可以被代表以下的基团取代：氢原子，或直链或支链(C1-C6)烷基，且应当理解，可能的取代基的一个或多个碳原子可以被氘代，
◆W9表示-Cy1、-Cy1-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-烷基(C0-C6)-O-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-烷基(C0-C6)-NW8-烷基(C0-C6)-Cy2、-Cy1-Cy2-O-烷基(C0-C6)-Cy5、-C(O)-NW8W8’、-NW8W8’、-OW8、-NW8-C(O)-W8’、-O-烷基(C1-C6)-OW8、-SO2-W8、-C(O)-OW8、-NH-C(O)-NH-W8、
对于由此定义的铵，可能存在两性离子形式或具有一价阴离子抗衡离子，
◆W10、W10’、W11和W11’彼此独立地表示氢原子或任选取代的直链或支链(C1-C6)烷基，
◆W12表示氢或羟基，
◆W13表示氢原子或直链或支链(C1-C6)烷基，
◆W14表示-O-P(O)(O-)(O-)基团、-O-P(O)(O-)(OW16)基团、-O-P(O)(OW16)(OW16’)基团、-O-SO2-O-基团、-O-SO2-OW16基团、-Cy7、-O-C(O)-W15基团、-O-C(O)-OW15基团或-O-C(O)-NW15W15’基团，
◆W15和W15’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或直链或支链氨基(C1-C6)烷基，
◆W16和W16’彼此独立地表示氢原子、直链或支链(C1-C6)烷基或芳基烷基(C1-C6)基团，
◆Cy1、Cy2、Cy3、Cy4、Cy5、Cy6和Cy7彼此独立地表示环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基，
◆n是等于0或1的整数，
应当理解：
-“芳基”是指苯基、萘基、联苯基、茚满基或茚基基团，
-“杂芳基”是指任意的单-或双-环基团，其由5-10个环成员组成，具有至少一个芳族部分并且包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，
-“环烷基”是指包含3-10个环成员的任意单-或双-环非芳族碳环基团，
-“杂环烷基”是指任意的单-或双-环非芳族碳环基团，其包含3-10个环成员并且包含1-3个选自氧、硫和氮的杂原子，其可以包括稠合、桥连或螺环系统，
对于由此定义的芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基以及烷基、烯基、炔基、烷氧基，其可能被1-4个基团取代，所述基团选自：直链或支链(C1-C6)烷基，其可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代，所述直链或支链(C1-C6)烷氧基可以被直链或支链(C1-C6)烷氧基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、羟基、卤素、氧代、-NW’W”、-O-C(O)-W’或-CO-NW’W”取代；直链或支链(C2-C6)烯基；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C2-C6)炔基；直链或支链(C1-C6)烷氧基，可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基、直链或支链(C1-C6)多卤代烷基、直链或支链(C2-C6)炔基、-NW’W”或羟基的基团取代；可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的(C1-C6)烷基-S-；羟基；氧代；N-氧化物；硝基；氰基；-C(O)-OW’；-O-C(O)-W’；-CO-NW’W”；-NW’W”；-(C＝NW’)-OW”；直链或支链(C1-C6)多卤代烷基；三氟甲氧基；或卤素；应当理解，W’和W”彼此独立地表示氢原子或可以被代表直链或支链(C1-C6)烷氧基的基团取代的直链或支链(C1-C6)烷基；且应当理解，上述可能的取代基的一个或多个碳原子可以被氘代，
其异构体、非对映异构体和阻转异构体及其与药学上可接受的酸或碱的加成盐，用于同时、依次或分开应用。
3.权利要求1的组合，其中MCL1抑制剂是如权利要求2中所定义的式(II)的化合物。
4.权利要求1-3任一项的组合，其中BCL-2抑制剂是N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺。
5.权利要求1-3任一项的组合，其中BCL-2抑制剂是5-(5-氯-2-{[(3S)-3-(吗啉-4-基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基]羰基}苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺。
6.权利要求4的组合，其中N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺是盐酸盐形式。
7.权利要求5的组合，其中5-(5-氯-2-{[(3S)-3-(吗啉-4-基甲基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基]羰基}苯基)-N-(5-氰基-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-基)-N-(4-羟基苯基)-1,2-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺是盐酸盐形式。
8.权利要求4或6的组合，其中在组合治疗期间N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺的剂量为50mg-1500mg。
9.权利要求1-8任一项的组合，其中的BCL-2抑制剂每周1次施用。
10.权利要求6或8的组合，其中N-(4-羟基苯基)-3-{6-[((3S)-3-(4-吗啉基甲基)-3,4-二氢-2(1H)-异喹啉基)羰基]-1,3-苯并间二氧杂环戊烯-5-基}-N-苯基-5,6,7,8-四氢-1-吲嗪甲酰胺在组合治疗期间每日1次施用。
11.权利要求1-3任一项的组合，其中BCL-2抑制剂是ABT-199。
12.权利要求1-11任一项的组合，其中MCL1抑制剂是(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(5-氟呋喃-2-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[1-(2,2,2-三氟乙基)-1H-吡唑-5-基]甲氧基}苯基)丙酸。
13.权利要求1-11任一项的组合，其中MCL1抑制剂是(2R)-2-{[(5Sa)-5-{3-氯-2-甲基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯基}-6-(4-氟苯基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基}-3-(2-{[2-(2-甲氧基苯基)嘧啶-4-基]甲氧基}苯基)丙酸。
14.权利要求1-13任一项的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂口服施用。
15.权利要求1-13任一项的组合，其中BCL-2抑制剂口服施用并且MCL1抑制剂静脉内施用。
16.权利要求1-13任一项的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂静脉内施用。
17.权利要求1-16任一项的组合，用于治疗癌症。
18.用于权利要求17的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以联合有效治疗癌症的量提供。
19.用于权利要求17的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以协同有效治疗癌症的量提供。
20.用于权利要求17的组合，其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以协同有效量提供，其使得能够降低每种化合物在治疗癌症中所需的剂量，同时提供有效的癌症治疗与最终减少的副作用。
21.用于权利要求17-20任一项的组合，其中所述癌症是白血病。
22.用于权利要求21的组合，其中所述白血病是急性髓性白血病、T-ALL或B-ALL。
23.用于权利要求17-20任一项的组合，其中所述癌症是骨髓增生异常综合征或骨髓增殖性疾病。
24.用于权利要求17-20任一项的组合，其中所述癌症是淋巴瘤。
25.用于权利要求24的组合，其中所述淋巴瘤是非霍金奇淋巴瘤。
26.用于权利要求25的组合，其中所述非霍金奇淋巴瘤是弥漫型大B细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
27.用于权利要求17-20任一项的组合，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
28.用于权利要求17-20任一项的组合，其中所述癌症是神经母细胞瘤。
29.用于权利要求17-20任一项的组合，其中所述癌症是小细胞肺癌。
30.权利要求1-16任一项的组合，还包含一种或多种赋形剂。
31.权利要求1-16任一项的组合在制备用于治疗癌症的药剂中的用途。
32.权利要求31的用途，其中所述癌症是白血病。
33.权利要求32的用途，其中所述白血病是急性髓性白血病、T-ALL或B-ALL。
34.权利要求31的用途，其中所述癌症是骨髓增生异常综合征或骨髓增殖性疾病。
35.权利要求31的用途，其中所述癌症是淋巴瘤。
36.权利要求35的用途，其中所述淋巴瘤是非霍金奇淋巴瘤。
37.权利要求36的用途，其中所述非霍金奇淋巴瘤是弥漫型大B细胞性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。
38.权利要求31的用途，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。
39.权利要求31的用途，其中所述癌症是神经母细胞瘤。
40.权利要求31的用途，其中所述癌症是小细胞肺癌。
41.药剂，分开或共同包含：
(a)如权利要求1中所定义的式(I)的BCL-2抑制剂；和
(b)MCL1抑制剂，
用于同时、依次或分开施用，并且其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以有效治疗癌症的量提供。
42.药剂，分开或共同包含：
(a)BCL-2抑制剂，和
(b)如权利要求2中所定义的式(II)的MCL1抑制剂，
用于同时、依次或分开施用，并且其中BCL-2抑制剂和MCL1抑制剂以有效治疗癌症的量提供。
43.治疗癌症的方法，包括对有此需要的受试者施用联合治疗有效量的(a)如权利要求1中所定义的式(I)的BCL-2抑制剂，和(b)MCL1抑制剂。
44.治疗癌症的方法，包括对有此需要的受试者施用联合治疗有效量的(a)BCL-2抑制剂，和(b)如权利要求2中所定义的式(II)的MCL1抑制剂。
45.一种致敏患者的方法，所述患者(i)对至少一种化疗治疗是难治性的，或(ii)处于用化疗治疗后的复发，或(i)和(ii)两者，其中该方法包括对所述患者施用联合治疗有效量的(a)如权利要求1所定义的式(I)的BCL-2抑制剂，和(b)MCL1抑制剂。
46.一种致敏患者的方法，所述患者(i)对至少一种化疗治疗是难治性的，或(ii)处于用化疗治疗后的复发，或(i)和(ii)两者，其中该方法包括对所述患者施用联合治疗有效量的(a)BCL-2抑制剂，和(b)如权利要求2所定义的式(II)的MCL1抑制剂。
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