UA125138C2 - Комбінація інгібітора bcl-2 та інгібітора mcl-1, їхнє застосування і фармацевтичні композиції - Google Patents

Комбінація інгібітора bcl-2 та інгібітора mcl-1, їхнє застосування і фармацевтичні композиції Download PDF

Info

Publication number
UA125138C2
UA125138C2 UAA201901704A UAA201901704A UA125138C2 UA 125138 C2 UA125138 C2 UA 125138C2 UA A201901704 A UAA201901704 A UA A201901704A UA A201901704 A UAA201901704 A UA A201901704A UA 125138 C2 UA125138 C2 UA 125138C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
compound
inhibitor
combination
inhibition
synergism
Prior art date
Application number
UAA201901704A
Other languages
English (en)
Inventor
Ендрю Вей
Эндрю Вей
Донія Моуджаллед
Дония Моуджаллед
Джіованна Поміліо
Джиованна Помилио
Ана Летісіа Мараньо
Ана Летисиа Мараньо
Олівьє Женест
Оливье Женест
Одрі Клаперон
Одри КЛАПЕРОН
Хейко Мааке
Енсар Халіловіч
Энсар ХАЛИЛОВИЧ
Дейл ПОРТЕР
Дэйл Портер
Ерік Морріс
Эрик МОРРИС
Йочжен Ванг
Снеха Сангаві
Снеха Сангави
Пракаш Містрі
Пракаш МИСТРИ
Original Assignee
Ле Лаборатуар Сервьє
Ле Лаборатуар Сервье
Новартіс Аг
Новартис Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ле Лаборатуар Сервьє, Ле Лаборатуар Сервье, Новартіс Аг, Новартис Аг filed Critical Ле Лаборатуар Сервьє
Priority claimed from PCT/EP2017/068453 external-priority patent/WO2018015526A1/en
Publication of UA125138C2 publication Critical patent/UA125138C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
    • A61K31/4725—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/28—Dragees; Coated pills or tablets, e.g. with film or compression coating
    • A61K9/2806—Coating materials
    • A61K9/2833—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/286—Polysaccharides, e.g. gums; Cyclodextrin
    • A61K9/2866—Cellulose; Cellulose derivatives, e.g. hydroxypropyl methylcellulose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Комбінація, яка містить інгібітор BCL-2 та інгібітор MCL1, та їхні композиції та застосування.

Description

(54) КОМБІНАЦІЯ ІНГІБІТОРА ВСІ--2 ТА ІНГІБІТОРА МСЇ.-1, ЇХНЄ ЗАСТОСУВАННЯ І ФАРМАЦЕВТИЧНІ
КОМПОЗИЦІЇ
(57) Реферат:
Комбінація, яка містить інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МОЇ 1, та їхні композиції та застосування.
Область техніки, до якої належить винахід
Цей винахід стосується комбінації інгібітору ВСІ-2 та інгібітору МСІ1. Винахід також стосується застосування зазначеної комбінації для лікування злоякісного новоутворення, особливо лейкозу, лімфоми, множинної мієломи, нейробластоми та раку легені, і більш особливо гострого мієлоїдного лейкозу, Т-клітинного гострого лімфобластного лейкозу, В- клітинного гострого лімфобластного лейкозу, лімфоми з клітин зони мантії, дифузної крупноклітинної В-клітинної лімфоми і дрібноклітинного раку легені. Також забезпечуються фармацевтичні препарати, які підходять для введення таких комбінацій.
Передумови створення винаходу
Апоптоз являється строго регульованим шляхом загибелі клітин, який ініціюється різними цитотоксичними стимулами, включаючи онкогенний стрес і хіміотерапевтичні засоби. Показано, що ухилення від апоптозу є характерною ознакою злоякісного новоутворення і що ефективність багатьох хіміотерапевтичних засобів залежить від активації внутрішнього мітохондріального шляху. Три різні підгрупи білків сімейства ВСІ -2 контролюють внутрішній апоптотичний шлях: () проапоптотичні ВНЗ (ВСІ -2 гомологія 3)-тільки білки; (ІЇ) представники, що сприяють виживанню, такі як сам ВСІ -2, ВСІ -ХІ, Всі-м, МС 1 ї ВСІ -2а1; ї (ПІ) проапоптотичні ефекторні білки ВАХ и ВАК (Слаброїаг та ін., Маїште Неміемує Моїесшціаг сеї! Біоїоду 2014 том 15:49-63).
Надекспресія анти-апоптотичних представників сімейства ВСІ-2 спостерігається за багатьох злоякісних новоутворень, особливо при злоякісних захворюваннях системи крові, таких як лімфома з клітин зони мантії (МС), фолікулярна лімфома/дифузна крупноклітинна В-клітинна лімфома (ЕГ/О0О) і множинна мієлома (Адате апа Согу Опсодепе 2007 том 26:1324-1337).
Фармакологічне інгібування анти-апоптотичних білків ВСІ-2, ВСІ-ХІ та Всі-м за допомогою розроблених недавно ВНЗ-міметичних лікарських засобів, таких як АВТ-199 ії АВТ-263, є терапевтичною стратегією для індукування апоптозу та викликає регресію пухлини при злоякісному новоутворенні (папу та ін., Огид Невзібї Ордаї 2007 Мо! 10(6):207-17). Проте, проводяться спостереження та дослідження щодо механізмів резистентності до цих лікарських засобів (Споцанагу 05 і ін. Се Оеай апі Оібзеабе 2015 том 6, е1593; доії:10.1038/садіб.2014.525).
Гострий мієлоїдний лейкоз (АМІ) являє собою смертельне злоякісне захворювання крові,
Зо що стрімко розвивається, і що виникає при клональній трансформації гемопоетичних стовбурових клітин, що призводить до паралічу нормального функціонування кісткового мозку та смерті внаслідок ускладнень від абсолютної панцитопенії. АМІ відповідає за 25 95 всіх лейкозів у дорослих, і найбільший коефіцієнт захворюваності спостерігається в Сполучених
Штатах Америки, Австралії та Європі (М/НО. СІ ОВОСАМ 2012. Евіітайей сапсег іпсідепсе, топаїйу апа ргемаіепсе жопам/іаеє іп 2012. Іпіегпаййопа! Адепсу ог Незеєагсй оп Сапсег!). У всьому світі щорічно діагностується приблизно 88 тис. нових випадків. АМІ продовжує зберігати найбільш низький коефіцієнт виживаності з усіх лейкозів, з передбачуваним 5-ти річним виживанням тільки 24 95. Незважаючи на те, що стандартна терапія для АМІ (цитарабін в комбінації з антрациклінами) була розроблена більше 4 десятиліть тому, введення успішних націлених терапій для цього захворювання залишається важкодоступною метою. Крім того, залишається потреба в можливості лікування без хіміотерапії для пацієнтів з АМІ. Концепція націленої терапії за АМІ була припинена внаслідок встановлення того, що в це захворювання залучена мультиклональна ієрархія, з швидким розростанням лейкемічних субклонів як основної причини резистентності до лікарських засобів і рецидивування захворювання (біпод |. та ін., Маїште 2012 481:506-10). У недавніх клінічних дослідженнях показана ефективність інгібіторів ВСІ-2 для лікування АМІ (Копорієма М та ін., Атегісап Босієїу ої Нетаїйіоду 2014:118). Незважаючи на те, що ці інгібітори є клінічно активними, ймовірно, що інші представники сімейства ВСІ-2 потребуватимуть націлювання для посилення сумарної ефективності при АМІ. На додаток до ВСІ-2, МСІ 1 також був ідентифікований як важливий регулятор клітинного виживання при АМІ. (Сіавзег 5Р та ін., сепе5 б демеортепі 2012 26:120-5).
Множинна о мієлома (ММ) являє собою рідкісне і невиліковне захворювання, яке характеризується накопиченням клонованих плазмоцитів у кістковому мозку (ВМ) і відповідає за 10 95 усіх злоякісних захворювань системи крові. В Європі щороку реєструється приблизно 27 800 нових випадків. Завдяки доступності нових засобів за останні роки, включаючи бортезоміб і леналідомід, і трансплантації аутологічних стовбурових клітин (АЗСТ), поліпшено коефіцієнт виживання. Проте, відповідна реакція на ці нові засоби часто є недовгостроковою і стає очевидною необхідність в новому лікуванні, особливо для пацієнтів з рецидивами/пацієнтів, що важко піддаються лікуванню, і пацієнтів з несприятливим прогнозом (несприятливим цитогенетичних профілем). Останні дослідження підтверджують перспективну активність ВС -2 60 в підгрупі пацієнтів з множинною мієломою (Тоигеаий С, Юоив5еї С, І е Соції! 5, та ін. енКетіа.
2014; 28(1):210-212). МСІ1 також був ідентифікований як важливий регулятор клітинного виживання при множинній мієломі (Оєгеппе 5, Мопіа В, Оєап ММ, та ін. Віоса. 2002; 100(1): 194- 199; 7Напо В, Со)о І, Репіоп НО. Віоса. 2002; 99(6):1885-1893).
Дифузна крупноклітинна В-клітинна лімфома (0І ВСІ) являє собою найбільш частий тип (25- 35 95) неходжкінської лімфоми з 24 тис. нових пацієнтів/рік. ОЇ ВСІ являє собою гетерогенне захворювання з понад дванадцятьма підтипами, включаючи подвійну-пі/МУсС транслокацію, активовані В-клітини (АВС) і зародковий центр В-клітин (СВ). За допомогою сучасної імунної хіміотерапії (В-СНОР) лікують приблизно 60 95 пацієнтів з СІ ВСІ, але для решти 40 95 існує незначний можливий метод лікування і прогноз є поганим. Відтак, існує значна медична потреба в підвищенні показників ефективності лікування і клінічних результатів з високим ризиком
РІ ВС, таким як АВС підтип (35 95 від БІ ВСІ), який проявляє конститутивну активацію МЕ-КкВ шляху, що сприяє виживанню.
Нейробластома (МВ) являє собою позачерепну солідну пухлину, що найбільш часто зустрічається у новонароджених і дітей, що становить 8 95-10 Фо всіх пухлин у дітей, яка в даний час класифікована на категорії низького, проміжного або високого ризику. На неї припадає близько 15 95 всіх смертей, пов'язаних із злоякісними новоутвореннями, у пацієнтів дитячого віку. Частота МВ становить 10,2 випадків на мільйон дітей у віці до 15 років, і щороку реєструється близько 500 нових випадків. Середній вік встановлення діагнозу становить 22 місяці. Результати у пацієнтів 3 МВ поліпшуються незмінно протягом останніх 30 років з 5-ти річними коефіцієнтами виживання, що зростають від 5295 до 7495. Проте, за наявними оцінками припускають, що у 50-60 905 пацієнтів в групі високого ризику розвивається рецидив, і, внаслідок цього, у них спостерігається лише незначне зниження смертності. Медіана часу до рецидиву становить 13,2 місяця, і 73 95 тих, у яких настає рецидив, мав вік 18 місяців або старше. Взяті разом сумарні коефіцієнти виживання МВ залишаються повністю неприйнятними (720 95 через 5 років), незважаючи на більш агресивні терапії (Соїоп і Спипо, Адм Реаіаїг 2013 58:297-311). Основними видами лікування є хіміотерапія, хірургічна резекція та/або променева терапія. Проте, у багатьох агресивних МВ розвинулася резистентність до хіміотерапевтичних засобів, що зберігає досить високу ймовірність рецидиву (Ріпоо та ін., / Сіїп Опсої 201533:3008- 11). Стандартами лікування для МВ в залежності від стратифікації ризику є часто карбоплатин,
Зо цисплатин циклофосфамід, доксорубіцин, етопозид, цитокіни (ЯМ-СЕ і 1/2) і вінкристин.
Погіршення після початкової реакції у відповідь на хіміотерапію є основною причиною неуспішного лікування, особливо при високому ризику МВ.
Хіміорезистентність може розвиватися внаслідок активації білків ВСІ-2, що сприяють виживанню (наприклад, білків ВСІ -2 і МСІ 1). МВ експресує високі рівні ВСІ -2 і МСІ 1 і низький рівень ВСІ-ХІ. Інгібування ВСІ-2 сенсибілізує клітини до загибелі й індукує МВ-регресію пухлини іп мімо (Нат та ін., Сапсег Сеї! 29:159-172). Антагонізми ВСІ-2 і МСІ1 відновлюють хіміотерапію при високому ризику МВ (І евіїпі та ін., Сапсег Віо! Тнег 2009 8:1587-1595; Тапоз та ін, ВМС Сапсег 2016 16:97). Таким чином, існує сильна доцільність комбінувати ВСІ -2 і МС 1 для пацієнтів, яких раніше не лікували, або резистентних пацієнтів.
Цей винахід забезпечує нову комбінацію інгібіторів ВСІ-2 і МСІ1. Отримані результати свідчать, що з розвитком ефективних низькомолекулярних націлених ВСІ-2 і МСІ1, високо синергетична проапоптотична активність виявляється в первинних зразках АМІ. людини (фігура 2А і 17), а також в АМІ. (фігури 9, 13 ї 14), множинній мієломі (приклад 4), лімфомі (фігури 4 та 12), нейробластомі (фігура 10), Т-АЇЇ, В-АЇЇ клітинних лініях (фігура 11) ії в клітинних лініяхдрібноклітинного раку легені (фігури 15 (а)-(е)). Нами також показано, що комбіноване націлювання ВСІ-2 і МСІЇ1 іп мімо ефективне в переносимих дозах для АМІ і лімфомних моделях ксенотрансплантатів у мишей і щурів (фігури 2, 5, 6, 7, 8 і 16), та істотно підвищує час до розвитку рецидиву при АМІ (фігури 2В і 23). Крім того, в клоногенних дослідженнях нами показано, що націлювання ВСІ -2-МСЇІ 1 специфічно токсичне для лейкозогенних клітин, але не для нормальних гемопоетичних стовбурових клітин (фігура 3), на відміну від попередніх експериментів націлювання гена МСІ1 у мишей. Перед розробкою цих ефективних і селективних інгібіторів, здійсненність націлювання обох ВСІ-2 і МСІ1 залишається невизначеною. Попередні моделі делецій, специфічні для клональних ліній, вказують на потенційний ризик для серцевої (У/апа Х та ін., Сепе5 б демеіортепі. 2013; 27(12): 1351-1364;
Тпотавз ВІ та ін., Сепе5 8 демеіортепі. 2013; 27(12):1365-1377), гранулоцито/гемопоетичної (Орієттап У та ін., 5сівєпсе5 5ІКЕ. 2005; 307(5712):1101; О2Нада!юм І! та ін., Віоса. 2007; 109(4):1620-1626; 5івітег БА та ін., Віоса. 2009; 113(12):2805-2815), тимоцитної (ОшпкКіє А та ін.,
Се! Оєай 4 ОіпПегепіанйоп. 2010; 17(6):994-1002), нейронної (Апбойг М та ін., Чошйгпа! ої
Мешйгозсіеєпсе. 2008; 28(24):6068-6078) та печінкової функції (Ніка Н та ін., Нераїшюіоду. 2009; бо 50(4):1217-1226; МісК В та ін., Нерашюіоду. 2009; 49(2):627-636), що розвивається внаслідок тривалої абляції МСІ1. Незважаючи на ці потенційні проблеми, недавно було показано, що щотижнева, два рази на тиждень і навіть щоденна (протягом 5 послідовних днів) внутрішньовенна доставка нового потенційного фармакологічного інгібітору МСІ1 з короткою дією добре переноситься та є активним по відношенню до різних злоякісних новоутворень іп мімо, включаючи АМІ (Коїбвспу А та ін., Майте. 2016; 538(7626):477-482; МО 2015/097123).
Короткий період напіввиведення білка МСІ1 може надавати достатньо часу для його регенерації в критичних органах, таким чином, надаючи можливість фізіологічної толерантності для інгібіторів МСІ 1 з коротким часом дії (Мапа Т та ін., Уошгпаї ої сеїїшаг рпузіоіоду. 1996; 166(3):523-536). До цього часу пульсуюче інгібування ВСІ -2 і МОЇ 1 імітує ефект, що подібний до дії лікарського засобу, який не був можливий при використанні підходів генетичної інженерії.
Дослідження з використанням інгібіторів ВСІ -2 і МСІ1 відповідно до цього винаходу забезпечує експериментальне підтвердження концепції про те, що переривчастий вплив для цих лікарських засобів може бути достатнім для запуску апоптозу і клінічної реакції для багатьох високо чутливих захворювань, таких як АМІ., без супутньої токсичності на основні системи органів.
Синергетичний ефект націлювання обох ВСІ -2 і МС 1 іп міо та іп мімо і нетоксичність для нормального функціювання кісткового мозку при націлювання обох анти-апоптотичних білків тільки була показана за допомогою комбінації ефективних низькомолекулярних інгібіторів. Ці аспекти не можуть бути передбачені внаслідок результатів експериментів націлювання генів, які можуть передбачити, що МСІ1 делеція погано переноситься гемопоетичними стовбуровими клітинами.
Сутність винаходу
Цей винахід стосується комбінації, що містить (а) інгібітор ВСІ -2 формули (1): пе
У г дк х
ТЗ --к р ву А.
У вжи ун К
Тай а ше щи о б ох Ка" т "в
КУ й (І) де:
Х і М являють собою атом вуглецю або атом азоту, мається на увазі, що вони не можуть одночасно представляти собою два атома вуглецю або два атоми азоту,
А і А», разом з атомами, які їх несуть, утворюють необов'язково заміщений, ароматичний або неароматичний гетероцикл Неї, що складається з 5, 6 або 7 кільцевих членів, який може містити, додатково до атома азоту, що представлений за допомогою Х або за допомогою У, від одного до З гетероатомів, які незалежно вибирають з кисню, сірки та азоту, мається на увазі, що вказаний атом азоту може бути заміщений групою, що представляє собою атом водню, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу або групу С(0)-О-АЇК, де АЇК являє собою лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, або Аї і А?» незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійний або розгалужений (С:і-Св)полігалоалкіл, лінійну або розгалужену(Сі-Св)алкільну групу або циклоалкіл,
Т являє собою атом водню, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, необов'язково заміщену одним-трьома атомами галогену, групу(С1-Са)алкіл-МА.:Р» або групу (С1-Са)алкіл-ОН в,
В: ї В» незалежно один від одного являють собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу,
або В; і В2 утворюють з атомом азоту, з яким вони зв'язані, гетероциклоалкіл,
Аз являє собою лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (Сг-
Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, циклоалкільну групу, (Сз-
Сіо)циклоалкіл-(Сі-Св)алкільну групу, де алкільний компонент є лінійним або розгалуженим, гетероциклоалкільну групу, арильну групу або гетероарильну групу, мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю попередніх груп, або їх можливих замісників, можуть бути дейтеровані,
Ва являє собою арильну групу, гетероарильну групу, циклоалкільну групу або лінійну або розгалужену(С1-Св)алкільну групу, мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю попередніх груп, або їх можливих замісників, можуть бути дейтеровані,
Во являє собою атом водню або галогену, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкокси групу,
Ве являє собою атом водню або лінійну або розгалужену(С1-Св)алкільну групу,
Ва, НЬь, Все і Ва, кожен, незалежно один від одного, являють собою В?7, атом галогену, лінійну або розгалужену (С:і-Св)алкокси групу, гідрокси групу, лінійну або розгалужену (С1-
Св)полігалоалкільну групу, трифторметокси групу, -МА7В7, нітро, Н;-СО-(Со-Св)алкіл-, В-СО-
МН-(Со-Св)алкіл-,. МАН7-СО-(Со-Св)алкіл-, МА7Н7-СО-(Со-Св)алкіл-О-,. В-502-МН-(Со-Св)алкіл-,
В8;-МН-СО-МН-(Со-Св)алкіл-, В8;-0О-СО-МН-(Со-Св)алкіл-, гетероциклоалкільну групу, або замісники однієї із частин (Ва, Рь), (Рь, Вс) або (Бе, Ва) утворюють разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, кільце, що складається з 5-7 кільцевих членів, яке може містити від одного до 2 гетероатомів, вибраних з кисню і сірки, також мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю кільця, визначені раніше в цій заявці, можуть бути дейтеровані або заміщені однією - З групами, вибраними з галогену і лінійного або розгалуженого(С1-Св)алкілу,
В; ії В7 незалежно один від одного являють собою водень, лінійний або розгалужений (С1-
Св)алкіл, лінійний або розгалужений (С2-Св)алкеніл, лінійний або розгалужений (С2-Св)алкініл, арил або гетероарил, або В; і В7 разом з атомом азоту, з яким вони зв'язані, утворюють гетероцикл, що складається з 5-7 кільцевих членів, мається на увазі, що якщо сполука формули (І) містить гідрокси групу, то ця група необов'язково може бути перетворена в одну з наступних груп: -ОРО(ОМХОМ), ОРО(ОМХО:
Коо) Мі, -«ОРО(ОМІ)(О М), -ОРО(О3(03Мз32, -ОРО(ЮМХО|СНаСНоО|СН:І), або -ОРО(О:
МіЗ(ОІСНСНгО сн»), де М і М' незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (С:-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, циклоалкіл або гетероциклоалкіл, обидва складаються з 5-6 кільцевих членів, в той час як Мі: їі Ме: незалежно один від одного являють собою фармацевтично прийнятний одновалентний катіон, Мз» являє собою фармацевтично прийнятний двовалентний катіон, і п являє собою ціле число від 1 до 5, мається на увазі, що: - "арил" означає фенільну, нафтильну, біфенільну або інденільну групу, - "тгетероарил" означає будь-яку моно- або бі-циклічну групу, що складається з 5-10 кільцевих членів, має щонайменше один ароматичний компонент і містить від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту (включаючи четвертинні азоти), - "циклоалкіл" означає будь-яку моно- або бі-циклічну, неароматичну, карбоциклічну групу, яка містить 3-10 кільцевих членів, - "гетероциклоалкіл" позначає будь-яку моно- або бі-циклічну, неароматичну, конденсовану або спіро групу, що складається з 3-10 кільцевих членів і містить від 17 до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки, 50, 50: і азоту, представляється можливим для арильних, гетероарильних, циклоалкільних (Іі гетероциклоалкільних груп, визначених такими, і груп алкіл, алкеніл, алкініл і алкокси бути заміщеними 1-3 групами, вибраними з: лінійний або розгалужений (С.1-Св)алкіл, необов'язково заміщений гідроксилом, морфолін, 3-3-дифторпіперидин або 3-3З-дифторпіролідин; (Сз-Св)спіро; лінійний або розгалужений (С1-Св)алкокси, необов'язково заміщений морфоліном; (С1-Св)алкіл- 95-; гідроксил; оксо; М-оксид; нітро; ціано; -СООВ'; -ОСОВ; МВ'В"; лінійний або розгалужений (С1-Св)полігалоалкіл; трифторметокси; (С1-Св)алкілсульфоніл; галоген; арил, необов'язково заміщений одним або декількома галогенами; гетероарил; арилокси; арилтіо; циклоалкіл; гетероциклоалкіл, необов'язково заміщений одним або декількома атомами галогену або алкільними групами, де В'ї К" незалежно один від одного являють собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, необов'язково заміщену метокси, представляється можливим для Неї групи, визначеної у формулі (І), бути заміщеною однією- трьома групами, вибраними з лінійного або розгалуженого (С.1-Св)алкілу, гідрокси, лінійного або розгалуженого (Сі-Св)алкокси, МА А:" і галогену, мається на увазі, що А/А;:" мають значення, як визначено для груп РЕ і В", зазначених раніше в цій заявці, або його енантіомери, діастереоїзомери, або їхні солі приєднання з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, і (6) інгібітор МСІ 1,
Зазначені сполуки формули (І), їхній синтез, їхнє застосування для лікування злоякісного новоутворення та їхні фармацевтичні препарати описані в МО 2013/110890, МО 2015/011397,
МО 2015/011399 ії М/О 2015/011400, зміст яких включено як посилання.
В окремих випадках виконання винаходу інгібітор МСІ 1 вибирають з А-1210477 (Сеї! Оєват апа Оізеазе 2015 6, е1590; доїі:10.1038/садів.2014.561) і сполук, описаних в МО 2015/097123,
МО 2016/207216, МО 2016/207217, МО 2016/207225, МО 2016/207226 або в МО 2016/033486, зміст яких включено як посилання.
Цей винахід також стосується комбінації, що містить (а) інгібітор ВСІ -2 і (6) інгібітор МОЇ 1 формули (І): яв ж і; х 1.
У ху их З
Ум й тк о ве Кк / к й | і А о дик -е що кана ще х Ж ох, шк Ше о (Ії) де:
А являє собою лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (С2-
Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкокси групу, -5-(С1-Св)алкільну групу, лінійний або розгалужений (С.1-Св)полігалоалкіл, гідрокси групу, ціано, -МУМіоУМ:о, -Сувє або атом галогену,
ММ, М/2, М/з, Маг і М/5 незалежно один від одного являють собою атом водню, атом галогену, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, лінійний або розгалужений /(С-
Св)полігалоалкіл, гідрокси групу, лінійну або розгалужену (С:і-Св)алкокси групу, -5-(С1- Св)алкільну групу, ціано, нітро групу, -алкіл(Со-Св)-ММУвУМв, -О-Суї, -алкіл(Со-Св)-Су:, -алкеніл(Се-
Св)-Суї, -алкініл(С2-Св)-Суї, -О-алкіл(С1-Св)-ММе, -С(О)-ОМУв, -0О-С(О)-МУв, -С(О)-ММУвМУв, -ММУв-
С(О)-М/в', -ММУв-С(О0)-ОМУв, -алкіл(С1-Св)-ММУв-С(О)-МУв', -«502-ММУвМУв, -5О2-алкіл(С1-Св), або замісники однієї з частин (МУ/:ї, МУг), (МУг, Муз), (ММ1, Муз), (М/4, МУ), коли прищеплені на два суміжних атома вуглецю, утворюють разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані,
Зо ароматичне або неароматичне кільце, що складається з 5-7 кільцевих членів, яке може містити від одного до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, мається на увазі, що отримане кільце може бути заміщене групою, вибраною з лінійної або розгалуженої (С1-Св)алкільної групи, -МУМіомМ о, -алкіл(Со-Св)-Суї або оксо,
Х' являє собою атом вуглецю або азоту,
МУє являє собою водень, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу, арильну, гетероарильну групу, арилалкіл(С1-Св) групу, гетероарилалкіл(С:-Св) групу,
МУ; являє собою лінійну або розгалужену (С:-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (Се2-
Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, -Суз, -алкіл(С1-Св)-Суз, - алкеніл(С2-Св)-Суз, -алкініл(С2-Св)-Суз, -Суз-Сух, -алкініл(С2-Св)-О-Суз, -Суз-алкіл(Со-Св)-О- алкіл(Со-Св)-Сух, атом галогену, ціано, -С(О)-ММ11, -С(О)-МММ УМ,
МУв і М/ув незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу або -алкіл(Со-Св)-Су!, або (МУв, МУг) утворюють разом з атомом азоту, з яким вони зв'язані, ароматичне або неароматичного кільце, що складається з 5-7 кільцевих членів, яке може містити, додатково до атома азоту, від одного до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, мається на увазі, що зазначений атом азоту може бути заміщений групою, що представляє собою атом водню або лінійну, або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, і мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю можливих замісників можуть бути дейтеровані,
МУсг являє собою -Суї, -Су-алкіл(Со-Св)-Су», -Суї-алкіл(Со-Св)-О-алкіл(Со-Св)-Су», -Суї- алкіл(Со-Св)-ММУ/в-алкіл(Со-Св)-Су», -Суї-Су»-О-алкіл(Со-Св)-Сув, -С(О)-ММУвМУв, -ММУвУМв' -ОМУв, -
ММУв-С(О)-МУв, -О-алкіл(С1-Св)-ОМУв, -5О2-М/в, -С(О0)-ОМУв, -МН-С(О)-МН-МУв, і т ще го н п У шою, Шо НЕ 3 нн, о, | е н о рад ТУ тотем : т ай . | ; Ше ЗЕ а Ек і і т Н Х з я ль ри ї, ден - ще У йон чу 18 ше Меси Ка Н представляється можливим для амонію, визначеного таким, існувати в формі цвітер-іона або мати моновалентний аніонний протиіон,
ММіо, ММіо, ММ: ії МИ незалежно один від одного являють собою атом водню або необов'язково заміщену лінійну або розгалужену (С:-Св)алкільну групу,
МУ/12 являє собою водень або гідрокси групу,
М/1з являє собою атом водню або лінійну, або розгалужену (С:-Св)алкільну групу,
МУ/14 являє собою -О-Р(ФХО(О) групу, -«О-Р(ОХО (ОМ в) групу, -«О-Р(ОХОМ в (ОМ в) групу, -0-502-0" групу, -0-502-ОМ/16 групу, -Су?, -0О-С(0)-ММ15 групу, -0-С(0)-ОМУ/15 групу або -0О-С(0)-
МУМі5ММ в групу,
ММ15 і М/15 незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу або лінійну або розгалужену аміно(С:-Св)алкільну групу,
МУів і М/1єї незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу або арилалкіл(С:-Св) групу,
Су, Суг, Суз, Суз, Су5, Сув і Су; незалежно один від одного являють собою циклоалкільну групу, гетероциклоалкільну групу, арильну або гетероарильну групу, п являє собою ціле число, яке дорівнює 0 або 1, мається на увазі, що:
Зо - "арил" означає фенільну, нафтильну, біфенільну, інданільну або інденільну групу, - "тгетероарил" означає будь-яку моно- або бі-циклічну групу, що складається з 5-10 кільцевих членів, що має щонайменше один ароматичний компонент і містить від 1 до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, - "циклоалкіл" означає будь-яку моно- або бі-циклічну неароматичну карбоциклічну групу, яка містить 3-10 кільцевих членів, - "гетероциклоалкіл" означає будь-яку моно- або бі-циклічну неароматичну карбоциклічну групу, яка містить 3-10 кільцевих членів, і яка містить від 1 до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, яка може включати конденсовані, місткові або спірокільцеві системи, представляється можливим для арильних, гетероарильних, циклоалкільних (Бі гетероциклоалкільних груп, визначених такими, і алкілу, алкенілу, алкінілу, алкокси бути заміщеними від 1 до 4 груп, вибраних з лінійного або розгалуженого (С:і-Св)алкілу, який може бути заміщений групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С:-Св)алкокси, який може бути заміщеним лінійним або розгалуженим (С1і-Св)алкокси, лінійний або розгалужений (Сі-Св)полігалоалкіл, гідрокси, галоген, оксо, -ММУ"МУ", -0О-С(0)-МИ або -СО-ММУМУ"; лінійну або розгалужену (С2-Св)алкенільну групу; лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, яка може бути заміщена групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С.:-Св)алкокси; лінійний або розгалужений (С1-Св)алкокси, який може бути заміщений групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (Сі-Св)алкокси, лінійний або розгалужений (С1-
Св)полігалоалкіл, лінійний або розгалужений (С2-Св)алкініл, -ММУМУ" або гідрокси; (Сі-Св)алкіл-5- л який може бути заміщений групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С1-
Св)алкокси; гідрокси; оксо; М-оксид; нітро; ціано; -С(0)-ОМУ" -0-С(0)-МУ"; -СО-ММИ МУ" -ММИ МУ"; - (С-ММ/)-ОМУ"; лінійний або розгалужений (Сі1-Св)полігалоалкіл; трифторметокси; або галоген; мається на увазі, що М/' і МУ" незалежно один від одного являють собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, яка може бути заміщена групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (Сі-Св)алкокси; і мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю попередніх можливих замісників можуть бути дейтеровані, його енантіомери, діастереоїзомери або атропізомери, або їхні солі приєднання з фармацевтично прийнятної кислотою або основою.
Зазначені сполуки формули (Ії), їхній синтез, їхнє застосування для лікування злоякісного новоутворення та їхні фармацевтичні препарати описані в МО 2015/097123, зміст якої включено шляхом посилання.
В окремих випадках виконання винаходу інгібітор ВСІ -2 вибирають із таких сполук: 4-(4-Ц2-(4-хлорфеніл)-4,4-диметилциклогекс-1-єн-1-іл|метил/)піперазин-1-іл)-М-(З-нітро-4- (Коксан-4-ілуметиліаміно)феніл)усульфоніл|-2-((1 Н-піроло|2,3-6|Іпіридин-5-іл)/окси|бензамід (венетоклакс або АВТ-199); 4-(4-Ц2-(4-хлорфеніл)-5,5-диметилциклогекс-1-ен- 1- іл|метил)піперазин-1-іл)-М-(4-((28)-4-(морфолін-4-іл)-1-(фенілсульфаніл)бутан-2-іл|аміно)-3- (трифторметансульфоніл)бензолсульфоніл|бензамід (навітоклакс або АВТ-263); облімерсен (23139); обатоклакс (24Х15-070); НА14-1; (ж)-госипол (ВІ--193); (-)-госипол (АТ-101); апогосипол;
ТУМУ-37; антиміцин А, АВТ-737 (ОПМегзаоп Т та ін., Маїште 2005 дипе 2; 435(7042):677-81) та сполуки, описані в М/О 2013/110890, МО 2015/011397, МО 2015/011399 ії МО 2015/011400, зміст яких включено як посилання.
Відповідно до першого аспекту винаходу забезпечується комбінація, яка містить: (а) інгібітор ВСІ -2 формули (І), як описано в цій заявці, і (Б) інгібітор МСІ 1 формули (ІЇ), як описано в цій заявці.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує комбінацію, яка містить: (а) сполуку 1: М-(4-гідроксифеніл)-3-(6-((35)-3-(4-морфолінилметил)-3,4-дигідро-2(1Н)- ізохінолініл/укарбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл-5,6,7,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід або його фармацевтично прийнятну сіль, і (6) інгібітор МС 1 для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує комбінацію, яка містить: (а) сполуку 4: 5-(5-хлор-2-Ц(35)-3-(морфолін-4-ілметил)-3,4-дигідроізохінолін-2(1 Н)- іл|карбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2-диметил-1 Н-пірол-3-іл)-М-(4-гідроксифеніл)-1,2-диметил-1 Н-
Зо пірол-З-карбоксамід або його фармацевтично прийнятну сіль, і (6) інгібітор МС 1 для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
Як альтернатива, винахід забезпечує комбінацію, яка містить: (а) інгібітор ВСІ -2 і (б) сполуку 2: (28)-2-1(55а)-5-(3-хлор-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(5- фторфуран-2-іл)тієно|2,3-4|Іпіримідин-4-іл|окси)-3-(2-11-(2,2,2-трифторетил)-1Н-піразол-5- іл|метокси)феніл)упропіонову кислоту для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує комбінацію, яка містить: (а) інгібітор ВСІ -2 і (б) сполуку 3: (28)-2-1(55а)-5-(3-хлор-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(4- фторфеніл)тієно(2,3-4|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-Ц2-(2-метоксифеніл)піримідин-4- іл|метокси)феніл)упропіонову кислоту для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує комбінацію, як описано в цій заявці, для застосування в лікуванні злоякісного новоутворення.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує застосування комбінації, як описано в цій заявці, для приготування лікарського засобу для лікування злоякісного новоутворення.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує лікарський засіб, що містить, окремо або разом, (а) інгібітор ВСІ -2 формули (І) і (6) інгібітор МСІ 1, або (а) інгібітор ВСІ -2 і (6) інгібітор МСІ 1 формули (ІЇ) для одночасного, послідовного або роздільного введення, і де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор
МОЇ 1 забезпечуються в ефективних кількостях для лікування злоякісного новоутворення.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує спосіб лікування злоякісного новоутворення, що включає введення спільно терапевтично ефективної кількості: (а) інгібітору ВСІ -2 формули (І) і 60 (6) інгібітору МСІ 1,
або (а) інгібітору ВСІ -2 і (6) інгібітору МСІ 1 формули (ІІ) суб'єкту, який цього потребує.
В іншому варіанті здійснення винахід забезпечує спосіб сенсибілізації пацієнта, який (І) є рефракторним до щонайменше одного хіміотерапевтичного лікування, або (Ії) має рецидив після лікування із застосуванням хіміотерапії, або в обох випадках (І) і (ІІ), де спосіб включає введення спільно терапевтично ефективної кількості: (а) інгібітору ВСІ -2 формули (І) і (6) інгібітору МСІ 1, або (а) інгібітору ВСІ -2 і (6) інгібітору МСІ 1 формули (ІІ) вказаному пацієнту.
В особливо переважному варіанті здійснення інгібітор ВСІ-2 являє собою М-(4- гідроксифеніл)-3-16-(((35)-3-(4-морфолінилметил)-3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)карбоніл|-1,3- бензодіоксол-5-ілу-М-феніл-5,6,7 ,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід гідрохлорид (сполука 1,
НОЇ).
В особливо переважному варіанті здійснення інгібітор ВСІ -2 являє собою 5-(5-хлор-2-((35)-
З-(морфолін-4-ілметил)-3,4-дигідроізохінолін-2(1Н)-ілікарбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1, 2-диметил- 1Н-пірол-З3-іл)-М-(4-гідроксифеніл)-1,2-диметил-1Н-пірол-3-карбоксамід гідрохлорид (сполука 4,
НОЇ).
В іншому варіанті здійснення інгібітор ВСІ -2 являє собою АВТ-199.
В іншому варіанті здійснення інгібітор МСІ1 являє собою (2Н8)-2-((55а)-5-(3-хлор-2-метил-4- (2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(5-фторфуран-2-іл)тієно(2,3-4|піримідин-4-іл|окси)-3- (2-(Ц1-(2,2,2-трифторетил)-1Н-піразол-5-іліметокси)феніл)пропіонову кислоту (сполука 2).
В іншому варіанті здійснення інгібітор МСІ1 являє собою (2Н8)-2-((55а)-5-(3-хлор-2-метил-4- (2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(4-фторфеніл)тієно|2,3-д|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-Ц2- (2-метоксифеніл)піримідин-4-іл|Іметоксихфеніл)пропіонову кислоту (сполука 3).
Зо Короткий опис креслень
Фігура 1. Експресія ВСІ -2 і МСІ1 переважає в АМІ. 7 клітинних ліній АМІ і 13 зразків первинних АМІ з » 70 95 бластів були іммуноблотовані для визначення зазначених білків, і було показано, що білки ВСІ-2 і МСІ1 домінантно експресувалися на відміну від ВСІ-ХІ, який експресувався в меншій кількості зразків.
Фігура 2. Комбіноване ВСІ -2/МС11 націлювання має синергічну активність в АМІ іп мійго та іп мімо. (А) 54 зразки первинних АМІ. інкубували в діапазоні концентрацій 6-І0д сполуки 1 (НСІ сіль), сполуки 2 або 1: 1 концентрації в ВРМІ/15 925 ЕС5 протягом 48 год. і визначали І Сво (В)
Чотирьом групам М5Сі-мишей прищеплювали ММ4;11 клітини, які експресують люциферазу.
Приживлення пухлини верифікували в день 10 (початкове значення) і потім здійснювали введення сполуки 1, НСІ 100 мг/добу перорально в робочі дні (вираженої у вигляді вільної основи) або сполуки 2 25 мг/кг в/в два рази на тиждень протягом 4 тижнів. Про вплив сполуки 2 і комбінації зі сполукою 1 свідчило зменшення кількості маси люциферази в дні 14 і 28 після початку терапії і підвищення загального виживання (С).
Фігура 3. Визначення токсичності комбінованого ВСІ -2/МСІ1 націлювання на нормальні
СО34- клітини від нормальних донорів або лейкемічні бластні клітини. Сортовані нормальні
СОЗ34-- або лейкемічні бластні клітини висівали і обробляли за допомогою сполуки 1, НСІ і сполуки 2 при співвідношенні 1:1 в зазначених концентраціях. Комбінація сполука 1 ї сполука 2 є токсичною для лейкемічних, але не для нормальних СОЗ34-- попередників.
Фігура 4. Матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєуе (праворуч), що забезпечуються сполукою З в комбінації зі сполукою 1, НСІ в клітинах ОВ (А) і клітинах Тоієдо (В). Значення в матриці впливу знаходяться в діапазоні від 0 (без інгібування) до 100 (тотальне інгібування). Значення в матриці синергізму являють собою ступінь інгібування росту понад теоретичну адитивність, розраховану на підставі активності окремо взятих засобів сполуки З і сполуки 1, НСІ при концентраціях, що тестуються. Синергетичні ефекти проявляються для широкого діапазону концентрацій окремо взятих засобів.
Фігура 5. Протипухлинні ефекти сполуки 1, НСІ, сполуки З і комбінації сполука 1, НСІ -- сполука З на моделі ксенотрансплантату Кагра55422 лімфоми у щурів.
Фігура 6. Зміна маси тіла у тварин, яких лікували із застосуванням сполуки 1, НСІ, сполуки З і комбінації сполука 1, НС1 ж сполука З на моделі ксенотрансплантату Каграз5422 лімфоми у щурів.
Фігура 7. Протипухлинні ефекти сполуки 1, НСІ, сполуки З і комбінації сполука 1, НСІ -- сполука З на моделі ксенотрансплантату І ВС. Тоїєдо в мишей.
Фігура 8. Зміна маси тіла в тварин, яких лікували із застосуванням сполуки 1, НСІ, сполуки З і комбінації сполука 1, НСІ я сполука З на моделі ксенотрансплантату 0І ВСІ. ТоЇедо в мишей.
Фігура 9. Матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєуе (праворуч), що забезпечуються сполукою З (інгібітор МОЇ 1) в комбінації зі сполукою 1, НОСІ (інгібітор ВСІ -2) в клітинній лінії АМІ ОСІ-АМІ З у двох незалежних експериментах.
Значення в матриці впливу знаходяться в діапазоні від 0 (без інгібування) до 100 (тотальне інгібування). Значення в матриці синергізму являють собою ступінь інгібування росту понад теоретичну адитивність, розраховану на підставі активності окремо взятих засобів сполуки З і сполуки 1, НСІ при концентраціях, що тестуються. Синергетичні ефекти проявляються для широкого діапазону концентрацій окремо взятих засобів.
Фігура 10. Матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєуе (праворуч), що забезпечуються сполукою З (інгібітор МОЇ 1) в комбінації зі сполукою 1, НСЇІ (інгібітор ВСІ -2) в клітинної лінії МВ ГГ АМ-6 у двох незалежних експериментах (М1: верхня панель; М2: нижня панель). Значення в матриці впливу знаходяться в діапазоні від 0 (без інгібування) до 100 (тотальне інгібування). Значення в матриці синергізму являють собою ступінь інгібування росту понад теоретичну адитивність, розраховану на підставі активності окремо взятих засобів сполуки З і сполуки 1, НСІ при концентраціях, що тестуються.
Фігура 11. Матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєуе (праворуч), що забезпечуються сполукою З (інгібітор МС 1) в комбінації зі сполукою 1, НСЇІ (інгібітор ВСІ -2) у клітинній лінії В-АГІ. МАГ М-6 у двох незалежних експериментах (М1: верхня панель; М2: нижня панель).
Фігура 12. Матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування
Зо росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєуе (праворуч), що забезпечуються сполукою З (інгібітор МС 1) в комбінації зі сполукою 1, НСЇІ (інгібітор ВСІ -2) в клітинній лінії МС 272-138.
Фігура 13. Матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєуе (праворуч), що забезпечуються сполукою З (інгібітор МОЇ 1) в комбінації зі сполукою 1, НСЇІ (інгібітор ВСІ -2) у клітинній лінії АМІ ОСІ-АМІ З у двох незалежних експериментах (М1: верхня панель; М2: нижня панель).
Фігура 14. Типові матриці впливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надлишку І оєме (праворуч), що забезпечуються сполукою З (інгібітор МС 1) у комбінації зі сполукою 4, НОСІ (інгібітор ВСІ -2) в клітинних лініях
АМІ (клітини МІ -2 в А і ОСІ-АМІ -3 у В).
Фігури 15 (а)-(е). Дозові матриці для інгібування (зліва), інігібування надлишку Іоємжме (посередині) та інгібування росту, що забезпечуються сполукою З (інгібітор МОЇ 1) у комбінації зі сполукою 1, НС (інгібітор ВСІ -2) у панелі клітинних ліній 5СІ 0.
Фігури 16 (а)-(Б). Протипухлинні ефекти сполуки 1, НСІ, АВТ-199, сполуки З і комбінації сполука 1, НСІ або АВТ-199 ї- сполука З на отриманій від пацієнтів первинної моделі АМІ.
НАМІ Х5343 у мишей.
Фігура 17. Порівняння теплокарти чутливості АМІЦ(І Сво) до ВНЗ-міметичної монотерапії, або комбінаціям лікарських засобів (що тестуються при співвідношенні 1:1), щодо хіміотерапії (ідарубіцин) після впливу протягом 48 годин. Представлена життєздатність клітин кожних первинних зразків АМІ. після 48 год. в ДМСО.
Детальний опис винаходу
Таким чином, винахід забезпечує в варіанті здійснення ЕЇ комбінацію, яка містить (а) інгібітор ВСІ -2 формули (1):
у т дини М. ос ї х А, с
Ох
К и тд и й в че б р ще Е й
М н Калте тВ, т. й ()) де:
Х і М являють собою атом вуглецю або атом азоту, мається на увазі, що вони не можуть одночасно представляти собою два атома вуглецю або два атоми азоту,
А і А», разом з атомами, які їх несуть, утворюють необов'язково заміщений, ароматичний або неароматичний гетероцикл Неї, що складається з 5, 6 або 7 кільцевих членів, який може містити, додатково до атома азоту, що представлений за допомогою Х або за допомогою У, від одного до З гетероатомів, які незалежно вибирають з кисню, сірки та азоту, мається на увазі, що вказаний атом азоту може бути заміщений групою, що представляє собою атом водню, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу або групу С(0)-О-АЇК, де АЇК являє собою лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, або Аї і А?» незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійний або розгалужений (С:і-Св)полігалоалкіл, лінійну або розгалужену(Сі-Св)алкільну групу або циклоалкіл,
Т являє собою атом водню, лінійну або розгалужену (С1і-Св)алкільну групу, необов'язково заміщену одним-трьома атомами галогену, групу(С1-Са)алкіл-МА.:Р» або групу (С1-Са)алкіл-ОН в,
В: ї В» незалежно один від одного являють собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, або В; і В2 утворюють з атомом азоту, з яким вони зв'язані, гетероциклоалкіл,
Аз являє собою лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (Сг-
Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, циклоалкільну групу, (Сз-
Сіо)циклоалкіл-(Сі-Св)алкільну групу, де алкільний компонент є лінійним або розгалуженим, гетероциклоалкільну групу, арильну групу або гетероарильну групу, мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю попередніх груп, або їх можливих замісників, можуть бути дейтеровані,
Ва являє собою арильну групу, гетероарильну групу, циклоалкільну групу або лінійну або розгалужену(С1-Св)алкільну групу, мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю попередніх груп, або їх можливих замісників, можуть бути дейтеровані,
Во являє собою атом водню або галогену, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу,
Зо або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкокси групу,
Ве являє собою атом водню або лінійну або розгалужену(С:1-Св)алкільну групу,
Ва, НЬь, Все і На, кожен, незалежно один від одного, являють собою В?7, атом галогену, лінійну або розгалужену (С:і-Св)алкокси групу, гідрокси групу, лінійну або розгалужену (С1-
Св)полігалоалкільну групу, трифторметокси групу, -МА7В7, нітро, Н;-СО-(Со-Св)алкіл-, В-СО-
МН-(Со-Св)алкіл-,. МАН7-СО-(Со-Св)алкіл-, МА7Н7-СО-(Со-Св)алкіл-О-,. В-502-МН-(Со-Св)алкіл-,
В8;-МН-СО-МН-(Со-Св)алкіл-, В8;-0О-СО-МН-(Со-Св)алкіл-, гетероциклоалкільну групу, або замісники однієї із частин (Ва, Рь), (Рь, Вс) або (Бе, Ва) утворюють разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, кільце, що складається з 5-7 кільцевих членів, яке може містити від одного до 2 гетероатомів, вибраних з кисню і сірки, також мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю кільця, визначені раніше в цій заявці, можуть бути дейтеровані або заміщені однією - З групами, вибраними з галогену і лінійного або розгалуженого(С1-Св)алкілу,
В; ії В7 незалежно один від одного являють собою водень, лінійний або розгалужений (С1-
Св)алкіл, лінійний або розгалужений (С2-Св)алкеніл, лінійний або розгалужений (С2-Св)алкініл, арил або гетероарил, або В; і В7 разом з атомом азоту, з яким вони зв'язані, утворюють гетероцикл, що складається з 5-7 кільцевих членів, мається на увазі, що якщо сполука формули (І) містить гідрокси групу, то ця група необов'язково може бути перетворена в одну з наступних груп: -ОРО(ОМХОМ), ОРО(ОМХО:
Мі, -«ОРО(ОМІ)(О М), -ОРО(О3(03Мз32, -ОРО(ЮМХО|СНаСНоО|СН:І), або -ОРО(О:
МіЗУ(ОІСНСНгО сн»), де М і М' незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (С:-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, циклоалкіл або гетероциклоалкіл, обидва складаються з 5-6 кільцевих членів, в той час як Мі: їі Ме: незалежно один від одного являють собою фармацевтично прийнятний оодновалентний катіон, Мз» являє собою фармацевтично прийнятний двовалентний катіон, і п являє собою ціле число від 1 до 5, мається на увазі, що: - "арил" означає фенільну, нафтильну, біфенільну або інденільну групу, -"гетероарил" означає будь-яку моно- або бі-циклічну групу, що складається з 5-10 кільцевих членів, має щонайменше один ароматичний компонент і містить від 1 до 4 гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту (включаючи четвертинні азоти), - "циклоалкіл" означає будь-яку моно- або бі-циклічну, неароматичну, карбоциклічну групу, яка містить 3-10 кільцевих членів, - "гетероциклоалкіл" позначає будь-яку моно- або бі-циклічну, неароматичну, конденсовану або спіро групу, що складається з 3-10 кільцевих членів і містить від 1 до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки, 50, 50: і азоту, представляється можливим для арильних, гетероарильних, циклоалкільних (Іі гетероциклоалкільних груп, визначених такими, і груп алкіл, алкеніл, алкініл і алкокси бути заміщеними 1-3 групами, вибраними з: лінійний або розгалужений (С.1-Св)алкіл, необов'язково заміщений гідроксилом, морфолін, 3-3-дифторпіперидин або 3-3З-дифторпіролідин; (Сз-Св)спіро; лінійний або розгалужений (С1-Св)алкокси, необов'язково заміщений морфоліном; (С1-Св)алкіл- 95-; гідроксил; оксо; М-оксид; нітро; ціано; -СООВ'; -ОСОВ; МВ'В"; лінійний або розгалужений
Зо (С1-Св)полігалоалкіл; трифторметокси; (С1-Св)алкілсульфоніл; галоген; арил, необов'язково заміщений одним або декількома галогенами; гетероарил; арилокси; арилтіо; циклоалкіл; гетероциклоалкіл, необов'язково заміщений одним або декількома атомами галогену або алкільними групами, де Ві К" незалежно один від одного являють собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, необов'язково заміщену метокси, представляється можливим для Неї групи, визначеної у формулі (І), бути заміщеною однією- трьома групами, вибраними з лінійного або розгалуженого (С.1-Св)алкілу, гідрокси, лінійного або розгалуженого (Сі-Св)алкокси, МА А:" і галогену, мається на увазі, що А/А;:" мають значення, як визначено для груп РЕ і В", зазначених раніше в цій заявці, або його енантіомери, діастереоїзомери, або їхні солі приєднання з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, і (6) інгібітор МСІ 1, для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
Винахід також забезпечує в варіанті здійснення Е2 комбінацію, яка містить (а) інгібітор ВСІ -2 і (6) інгібітор МСІ 1 формули (ІІ):
ді. її а З -- и: цик | й Й ес ї с І х яю і в / ще . ЗА
ОО, шк Її ТЕ ше а др а чо ЦІ яв" й о за - і іш Я . і А
АЮ ц
МОХ ХХ шо о ч 26 їх (1) де:
А являє собою лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (С2-
Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкокси групу, -5-(С1-Св)алкільну групу, лінійний або розгалужений (С.1-Св)полігалоалкіл, гідрокси групу, ціано, -МУМіоУМ:о, -Сувє або атом галогену,
ММ, М/2, М/з, Маг і М/5 незалежно один від одного являють собою атом водню, атом галогену, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, лінійний або розгалужений /(С-
Св)полігалоалкіл, гідрокси групу, лінійну або розгалужену (С:і-Св)алкокси групу, -95-(С1-
Св)алкільну групу, ціано, нітро групу, -алкіл(Со-Св)-ММУвмУв, -О-Суз, -алкіл(Со-Св)-Су:, -алкеніл(С»-
Св)-Суї, -алкініл(С2-Св)-Суї, -О-алкіл(С1-Св)-ММе, -С(О)-ОМУв, -0О-С(О)-МУв, -С(О)-ММУвМУв, -ММУв-
С(О)-М/в', -ММУв-С(О0)-ОМУв, -алкіл(С1-Св)-ММУв-С(О)-МУв', -«502-ММУвМУв, -5О2-алкіл(С1-Св), або замісники однієї з частин (МУ/:ї, МУг), (МУг, Муз), (ММ1, Муз), (М/4, МУ), коли прищеплені на два суміжних атома вуглецю, утворюють разом з атомами вуглецю, з якими вони зв'язані, ароматичне або неароматичне кільце, що складається з 5-7 кільцевих членів, яке може містити від одного до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, мається на увазі, що отримане кільце може бути заміщене групою, вибраною з лінійної або розгалуженої (С1-Св)алкільної групи, -МУМіомМ о, -алкіл(Со-Св)-Суї або оксо,
Х являє собою атом вуглецю або азоту,
МУє являє собою водень, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу, арильну, гетероарильну групу, арилалкіл(С1-Св) групу, гетероарилалкіл(С:-Св) групу,
МУ; являє собою лінійну або розгалужену (С:-Св)алкільну групу, лінійну або розгалужену (Се2-
Св)алкенільну групу, лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, -Суз, -алкіл(С1-Св)-Суз, - алкеніл(С2-Св)-Суз, -алкініл(С2-Св)-Суз, -Суз-Сух, -алкініл(С2-Св)-О-Суз, -Суз-алкіл(Со-Св)-О- алкіл(Со-Св)-Сух, атом галогену, ціано, -С(О)-ММ11, -Б(О)-МММ УМ,
МУв і М/в незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу або -алкіл(Со-Св)-Су!, або (МУв, МУг) утворюють разом з атомом азоту, з яким вони зв'язані, ароматичне або неароматичного кільце, що складається з 5-7 кільцевих членів, яке може містити, додатково до атома азоту, від одного до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, мається на увазі, що зазначений атом азоту може бути заміщений групою, що представляє собою атом водню або лінійну, або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, і мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю можливих замісників можуть бути дейтеровані,
МУсг являє собою -Суї, -Су-алкіл(Со-Св)-Су», -Суї-алкіл(Со-Св)-О-алкіл(Со-Св)-Су», -Суї- алкіл(Со-Св)-ММУв-алкіл(Со-Св)-Суг, -Суї-Су»-О-алкіл(Со-Св)-Сув, -С(О)-ММУвМУв, -ММУвМУв -ОМУв, -
ММУв-С(О)-МУв, -О-алкіл(С1-Св)-ОМУв, -5О2-М/в, -С(О0)-ОМУв, -МН-С(О)-МН-МУв,
«ков сек, сн. - я В.
ЕК ще | й І жк жи у З - ем : ех кН а пе ій | | !
Ух йо - | | щі Ук - пен ге 7 й
М акт Ма ще В представляється можливим для амонію, визначеного таким, існувати в формі цвітер-іона або мати моновалентний аніонний протиіон,
ММіо, ММіо, ММ: ії МИ незалежно один від одного являють собою атом водню або необов'язково заміщену лінійну або розгалужену (С:-Св)алкільну групу,
МУ/12 являє собою водень або гідрокси групу,
М/1з являє собою атом водню або лінійну, або розгалужену (С:-Св)алкільну групу,
МУ/14 являє собою -О-Р(ФО (СО) групу, -«О-Р(ОХО ХОМ в) групу, -«О-Р(ОХОМ в (ОМ в) групу, -0-502-0" групу, -0-502-ОМ/16 групу, -Су?, -0О-С(0)-ММ15 групу, -0-С(0)-ОМУ/15 групу або -0О-С(0)-
ММ БУМ в групу,
ММ15 і М/15 незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (Сі-Св)алкільну групу або лінійну або розгалужену аміно(С:-Св)алкільну групу,
МУів і М/1єї незалежно один від одного являють собою атом водню, лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу або арилалкіл(С:-Св) групу,
Су, Суг, Суз, Суз, Су5, Сув і Су; незалежно один від одного являють собою циклоалкільну групу, гетероциклоалкільну групу, арильну або гетероарильну групу, п являє собою ціле число, яке дорівнює 0 або 1, мається на увазі, що: - "арил" означає фенільну, нафтильну, біфенільну, інданільну або інденільну групу, - "тгетероарил" означає будь-яку моно- або бі-циклічну групу, що складається з 5-10 кільцевих членів, що має щонайменше один ароматичний компонент і містить від 1 до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, - "циклоалкіл" означає будь-яку моно- або бі-циклічну неароматичну карбоциклічну групу, яка містить 3-10 кільцевих членів, - "гетероциклоалкіл" означає будь-яку моно- або бі-циклічну неароматичну карбоциклічну групу, яка містить 3-10 кільцевих членів, і яка містить від 1 до З гетероатомів, вибраних з кисню, сірки та азоту, яка може включати конденсовані, місткові або спірокільцеві системи, представляється можливим для арильних, гетероарильних, циклоалкільних (Іі гетероциклоалкільних груп, визначених такими, і алкілу, алкенілу, алкінілу, алкокси бути
Зо заміщеними від 1 до 4 груп, вибраних з лінійного або розгалуженого (С1-Св)алкілу, який може бути заміщений групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С1-Св)алкокси, який може бути заміщеним лінійним або розгалуженим (С1-Св)алкокси, лінійний або розгалужений (С1-Св)полігалоалкіл, гідрокси, галоген, оксо, -ММИМУ", -0-С(0)-МИ або -СО-ММ/МУ"; лінійну або розгалужену (С2-Св)алкенільну групу; лінійну або розгалужену (С2-Св)алкінільну групу, яка може бути заміщена групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С:-Св)алкокси; лінійний або розгалужений (С1-Св)алкокси, який може бути заміщений групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С1-Св)алкокси, лінійний або розгалужений (С1-
Св)полігалоалкіл, лінійний або розгалужений (С2-Св)алкініл, -ММУМУ" або гідрокси; (Сі-Св)алкіл-5- , який може бути заміщений групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (С1-
Св)алкокси; гідрокси; оксо; М-оксид; нітро; ціано; -С(0)-ОМУ" -0-С(0)-МУ"; -СО-ММИ МУ" -ММИ МУ"; - (С-ММ/)-ОМУ"; лінійний або розгалужений (Сі1-Св)полігалоалкіл; трифторметокси; або галоген; мається на увазі, що М/' і МУ" незалежно один від одного являють собою атом водню або лінійну або розгалужену (С1-Св)алкільну групу, яка може бути заміщена групою, що представляє собою лінійний або розгалужений (Сі-Св)алкокси; і мається на увазі, що один або кілька атомів вуглецю попередніх можливих замісників можуть бути дейтеровані, його енантіомери, діастереоїзомери або атропізомери, або їхні солі приєднання з фармацевтично прийнятної кислотою або основою для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
У цій заявці описані додаткові пронумеровані варіанти здійснення (Е) винаходу. Слід взяти до уваги, що характерні особливості, зазначені в будь-якому варіанті здійснення, можуть бути комбіновані з іншими зазначеними характерними особливостями, щоб забезпечити подальші характерні варіанти здійснення цього винаходу.
ЕЗ. Комбінація відповідно до ЕТ, де інгібітор МС являє собою сполуку формули (ІІ), як визначено в Е2.
Е4. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-ЕЗ, де інгібітор ВСІ-2 являє собою М-(4- гідроксифеніл)-3-16-(((35)-3-(4-морфолінилметил)-3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолінил)карбоніл|-1,3- бензодіоксол-5-ілу-М-феніл-5,6,7 ,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід.
Е5. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-ЕЗ, де інгібітор ВСІ -2 являє собою 5-(5-хлор-2- ((35)-3-(морфолін-4-ілметил)-3,4-дигідроізохінолін-2(1 Н)-ілІікарбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2- диметил-1Н-пірол-З3-іл)-М-(4-гідроксифеніл)-1,2-диметил-1 Н-пірол-3-карбоксамід.
Еб. Комбінація відповідно до Е4, де М-(4-гідроксифеніл)-3-16-(((35)-3-(4-морфолінилметил)- 3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)карбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл-5,6,7,8-тетрагідро-1- індолізин карбоксамід представлений у формі гідрохлоридної солі.
Е7. Комбінація відповідно до Е5, де 5-(5-хлор-2-1(35)-3-(морфолін-4-ілметил)-3,4- дигідроізохінолін-2(1 Н)-ілікарбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2-диметил-1 Н-пірол-З-іл)-М-(4- гідроксифеніл)-1,2-диметил-1 Н-пірол-3-карбоксамід представлений у формі гідрохлоридної солі.
Е8. Комбінація відповідно до Е4 або Еб, де доза М-(4-гідроксифеніл)-3-(6-((35)-3-(4- морфолінилметил)-3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолініл) карбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл- 5,6,7,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксаміду при здійсненні комбінованого лікування складає від 50 мг до 1500 мг.
Е9У. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е8, де інгібітор ВСІ -2 вводять один раз на тиждень.
ЕТ10. Комбінація відповідно до Еб або Е8в, де М-(4-гідроксифеніл)-3-16-(((35)-3-(4- морфолінілметил)-3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)укарбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл- 5,6,7,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід вводять при здійсненні комбінованого лікування один раз на добу.
Е11. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-ЕЗ, де інгібітор ВСІ -2 являє собою АВТ-199.
Е12. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е11, де інгібітор МСІ1 являє собою В)-2- ((55а)-5-(3-хлор-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)/етокси|феніл)-6-(5-фторфуран-2- іл)утієно|2,3-4|Іпіримідин-4-іл|окси)-3-(2-111-(2,2,2-трифторетил)-1Н-піразол-5- іл|метоксиуфеніл)пропіонову кислоту.
Е13. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е11, де інгібітор МСІ1 являє собою (2Н8)-2- ((55а)-5-(3-хлор-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)уетокси|феніл)-6-(4-фторфеніл)тієно|2,3-
Зо д9|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-Ц2-(2-метоксифеніл)піримідин-4-іл|метокси)феніл)пропіонову кислоту.
Е14. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е13, де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МОЇ 1 вводять перорально.
Е15. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е13, де інгібітор ВСІ -2 вводять перорально та інгібітор МСІ1 вводять внутрішньовенно.
Е16. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е13, де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МСОІ 1 вводять внутрішньовенно.
Е17. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е16 для застосування в лікуванні злоякісного новоутворення.
Е18. Комбінація для застосування відповідно до Е17, де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МОЇ 1 забезпечуються в кількостях, які спільно терапевтично ефективні для лікування злоякісного новоутворення.
Е19. Комбінація для застосування відповідно до Е17, де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МОЇ 1 забезпечуються в кількостях, які синергітично ефективні для лікування злоякісного новоутворення.
Е20. Комбінація для застосування відповідно до Е17, де ВСІ -2 інгібітор і МОЇ 1 інгібітор забезпечуються в синергетично ефективних кількостях, які здатні зменшувати дозу, необхідну для кожної сполуки для лікування злоякісного новоутворення, забезпечуючи при цьому ефективне лікування злоякісного новоутворення, зі зменшенням в кінцевому підсумку побічних ефектів.
Е21. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е17-Е20, де злоякісне новоутворення являє собою лейкоз.
Е22. Комбінація для застосування відповідно до Е21, де злоякісне новоутворення являє собою гострий мієлоїдний лейкоз, Т-АЇ І. або В-АГ І.
Е23. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е17-Е20, де злоякісне новоутворення являє собою мієлодиспластичний синдром або мієлопроліферативне захворювання.
Е24. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е17-Е20, де злоякісне новоутворення являє собою лімфому.
Е25. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е24, де злоякісне бо новоутворення являє собою неходжкінську лімфому.
Е26. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е25, де неходжкінська лімфома являє собою дифузну крупноклітинну В-клітинну лімфому або лімфому з клітин зони мантії.
Е27. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е17-Е20, де злоякісне новоутворення являє собою множинну мієлому.
Е28. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е17-Е20, де злоякісне новоутворення являє собою нейробластому.
Е29. Комбінація для застосування відповідно до будь-якого з Е17-Е20, де злоякісне новоутворення являє собою дрібноклітинний рак легені.
ЕЗ30. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е16, яка додатково містить один або кілька наповнювачів.
ЕЗ31. Комбінація відповідно до будь-якого з Е1-Е16 для приготування лікарського засобу для лікування злоякісного новоутворення.
Е32. Застосування відповідно до ЕЗ1, де злоякісне новоутворення являє собою лейкоз.
Е33. Застосування відповідно до ЕЗ2, де злоякісне новоутворення являє собою гострий мієлоїдний лейкоз, Т-АЇ І або В-АЇЇ.
ЕЗ34. Застосування відповідно до ЕЗ1, де злоякісне новоутворення являє собою мієлодиспластичний синдром або мієлопроліферативне захворювання.
Е35. Застосування відповідно до ЕЗ1, де злоякісне новоутворення являє собою лімфому.
ЕЗ36. Застосування відповідно до ЕЗ35, де лімфома являє собою неходжкінську лімфому.
Е37. Застосування відповідно до ЕЗб, де неходжкінська лімфома являє собою дифузну крупноклітинну В-клітинну лімфому або лімфому з клітин зони мантії.
Е38. Застосування відповідно до ЕЗ1, де злоякісне новоутворення являє собою множинну мієлому.
Е39. Застосування відповідно до ЕЗ1, де злоякісне новоутворення являє собою нейробластому.
Е40. Застосування відповідно до ЕЗ1, де злоякісне новоутворення являє собою дрібноклітинний рак легені.
Е41. Лікарський засіб, що містить, окремо або разом,
Зо (а) інгібітор ВСІ -2 формули (І), як визначено в Е1, і (6) інгібітор МС 1 для одночасного, послідовного або роздільного введення, і де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор
МОЇ 1 забезпечуються в ефективних кількостях для лікування злоякісного новоутворення.
Е42. Лікарський засіб, що містить, окремо або разом, (а) інгібітор ВСІ -2 і (а) інгібітор МСІ 1 формули (ІЇ), як визначено в Е2 для одночасного, послідовного або роздільного введення, і де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор
МОЇ 1 забезпечуються в ефективних кількостях для лікування злоякісного новоутворення.
Е43. Спосіб лікування злоякісного новоутворення, що включає введення спільно терапевтично ефективної кількості (а) інгібітору ВСІ -2 формули (І), як визначено в Е1, і (6) інгібітору МОЇ 1, суб'єкту, який цього потребує.
Е44. Спосіб лікування злоякісного новоутворення, що включає введення спільно терапевтично ефективної кількості (а) інгібітору ВСІ -2 і (6) інгібітору МСІ 1 формули (ІІ), як визначено в Е2, суб'єкту, який цього потребує.
Е45. Спосіб сенсибілізації пацієнта, який (І) є рефракторним до щонайменше одного хіміотерапевтичного лікування, або (Ії) має рецидив після лікування з застосуванням хіміотерапії, або в обох випадках (І) і (ІІ), де спосіб включає введення спільно терапевтично ефективної кількості (а) інгібітору ВСІ -2 формул (І), як визначено в ЕТ, і (б) інгібітору МОЇ 1 зазначеному пацієнту.
Е46. Спосіб сенсибілізації пацієнта, який (І) є рефракторним до щонайменше одного хіміотерапевтичного лікування, або (Ії) має рецидив після лікування з застосуванням хіміотерапії, або в обох випадках (І) і (ІІ), де спосіб включає введення спільно терапевтично ефективної кількості (а) інгібітору ВСІ -2 і (6) інгібітору МСІ 1 формули (ІІ), як визначено в Е2, зазначеному пацієнту. "Комбінація" відноситься або до будь-якої комбінації з фіксованою дозою в одній індивідуальній дозованій формі (наприклад, капсулі, таблетці або саше), комбінації з нефіксованою дозою, або набору для комбінованого введення, де сполука згідно з цим винаходом та один або декілька компонентів із комбінації (наприклад, інший лікарський засіб, як пояснюється нижче, також позначається у вигляді "тнерапевтичного засобу" або "співагента") бо можуть вводитись незалежно в один і той самий час або нарізно протягом часових інтервалів,
особливо, якщо ці часові інтервали надають можливість компонентам комбінації виявити спільний, наприклад, синергетичний ефект.
Терміни "спільне введення" або "комбіноване введення" або тому подібні, як використовується в цій заявці, охоплюють введення вибраного компонента комбінації одиничному суб'єкту, який цього потребує (наприклад, пацієнту), і включають схеми лікування, за яких агенти не обов'язково вводяться одним і тим самим шляхом введення або в один і той самий час.
Термін "комбінація з фіксованою дозою" позначає, що активні компоненти, наприклад, сполука формули (І) і один або декілька компонентів комбінації, обидва вводяться пацієнтові одночасно в формі єдиного цілого або дозування.
Термін "комбінація з нефіксованою дозою" позначає, що активні компоненти, наприклад, сполука відповідно до цього винаходу та один або декілька компонентів комбінації, обидва вводяться пацієнтові у вигляді роздільних складових або одночасно, або послідовно, без специфічних тимчасових обмежень, де таке введення забезпечує терапевтично ефективні рівні двох сполук в організмі пацієнта. Останнє також застосовується для коктейльної терапії, наприклад, введення трьох або більше активних компонентів. "Злоякісне новоутворення" позначає клас захворювань, в якому група клітин проявляє неконтрольований ріст. Типи злоякісних новоутворень включають гематологічну злоякісну пухлину (лімфому та лейкоз) і солідні пухлини, включаючи карциному, саркому або бластому.
Зокрема "злоякісне новоутворення" відноситься до лейкозу, лімфоми або множинної мієломи, і більш особливо до гострого мієлоїдного лейкозу.
Термін "спільно терапевтично ефективні" означає, що терапевтичні засоби можуть вводитися окремо (в хронологічно встановленому порядку, зокрема, специфічним до послідовності чином) в такі тимчасові інтервали, що вони можуть переважно, в теплокровної тварини, особливо у людини, лікувати, все ще проявляючи (переважно синергетичну) взаємодію (спільний терапевтичний ефект). У будь-якому випадку це може бути встановлено, зокрема, шляхом визначення наступних рівнів у крові, які свідчать про те, що обидві сполуки наявні в крові людини, що піддається лікуванню, щонайменше протягом певних часових інтервалів. "Синергетично ефективні" або "синергізм' означає, що терапевтичний ефект, який спостерігаються після введення двох або більше агентів є більшим, ніж сума терапевтичних ефектів, які спостерігаються після введення кожного одиничного засобу.
Як використовується в цій заявці, термін "лікувати", "лікування" або "терапія" будь-якого захворювання або розладу відноситься в одному варіанті здійснення до ослаблення захворювання або порушення (тобто, полегшення або припинення, або зменшення розвитку захворювання або щонайменше одного з його клінічних симптомів). В іншому варіанті здійснення "лікувати", "лікування" або "терапія" відноситься до ослаблення або полегшення щонайменше одного фізичного параметра, включаючи ті, які можуть не відчуватися пацієнтом.
У ще іншому варіанті здійснення "лікувати", "лікування" або "терапія" відноситься до модуляції захворювання або розладу або фізично, і наприклад, стабілізація помітного симптому), фізіологічно, (наприклад, стабілізація фізичного параметру), або і те, і інше.
Як використовується в цій заявці, суб'єкт "потребує" лікування, якщо такий суб'єкт буде отримувати переваги біологічно, медично або якості життя від такого лікування.
В іншому аспекті забезпечується спосіб сенсибілізації людини, яка є (І) рефракторною до щонайменше одного хіміотерапевтичного лікування, або (Ії) має рецидив після лікування із застосуванням хіміотерапії, або в обох випадках (І) і (ІІ), де спосіб включає введення інгібітору
ВСІ -2 формули (І) в комбінації з інгібітором МС 1, як описано в цій заявці, пацієнту. Пацієнт, який є сенсибілізованим, являє собою пацієнта, що відповідає на лікування, яке включає введення інгібітору ВСІ -2 формули (І) в комбінації з інгібітором МОЇ 1, як описано в цій заявці, або в якого не розвинулася резистентність до такого лікування. "Лікарський засіб" означає фармацевтичну композицію або комбінацію декількох фармацевтичних композицій, яка містить одне або декілька активних компонентів за наявності одного або декількох наповнювачів. "АМІ означає гострий мієлоїдний лейкоз.
Т-АГТ Її "В-АГІ означає Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз і В-клітинний гострий лімфобластний лейкоз. "Вільна основа" відноситься до сполуки, коли вона не представлена у формі солі.
У фармацевтичних композиціях за цим винаходом пропорція активних компонентів за вагою (вага активних компонентів по відношенню до загальної ваги композиції) становить 5-50 95.
Як фармацевтичні композиції за цим винаходом більш особливо використовують ті, які є 60 придатними для введення пероральним, парентеральним і особливо внутрішньовенним, крізь-
або транс-шкірним, назальним, ректальним, під'язиковим, очним або респіраторним шляхом, більш специфічно таблетки, драже, під'язикові таблетки, тверді желатинові капсули, таблетки для повільного розчинення під язиком, капсули, пастилки, препарати, що ін'єкуються, аерозолі, очні краплі або краплі в ніс, супозиторії, креми, мазі, шкірні гелі та ін.
Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть містити один або декілька наповнювачів або носіїв, обраних з розріджувачів, змащувальних речовин, зв'язуючих, дезінтеграторів, стабілізаторів, консервантів, абсорбентів, барвників, підсолоджувачів, ароматизаторів та ін.
Як необмежуючий приклад можна зазначити: - як розріджувачі: лактоза, декстроза, сахароза, маніт, сорбіт, целюлоза, гліцерин, - як змащувальні речовини: діоксид кремнію, тальк, стеаринова кислота і її магнієва та кальцієва солі, поліетиленгліколь, - як зв'язуючі: алюмосилікат магнію, крохмаль, желатин, трагакант, метилцелюлоза, натрій карбоксиметилцелюлоза та полівінілпіролідон, - як дезінтегратори: агар, альгінова кислота й її натрієва сіль, шипучі суміші.
Сполуки комбінації можуть вводитися одночасно або послідовно. Шлях введення переважно являє собою пероральний шлях, і відповідні фармацевтичні композиції можуть надавати можливість негайного або відтермінованого вивільнення активних компонентів.
Сполуки комбінації, крім того, можуть вводитися в формі двох роздільних фармацевтичних композицій, кожна з яких містить один із активних компонентів, або у формі єдиної фармацевтичної композиції, в якій активні компоненти представлені в суміші.
Переважними є фармацевтичні композиції, що являють собою таблетки.
Фармацевтична композиція сполуки 1 НСІ солі, що представляє собою покриту плівковою оболонкою таблетку, яка містить 50 мг і 100 мг лікарської речовини 11111111 Кількстьбмо////////// | Функця З (Таблетка 0 (БОмгдозуванняї ТбОмгдозування | /-/:/ (СУК
Ен івйініан НЛП ТИН НОННННННЯ на основу (Кукурудзянийкрохмаль | 666 | 133,2 | Дезінтегрант/://Н./СКСС. (Стеаратмавнію | 3,33 | 666 /Змащшувальнаречовина.:Ш/ безводний й й текучість (тип А)
Бійки ШОЕ ЗИ НИ ЛАН НОЯ масою оПлівюювваоболонка.ї | 7777777771Ї7111111111111111111111 й Матеріал для надання
Компонент, що сприяє (Перехіднінаповнювачії / | (ЇЇ 77777111
Кошетнни| вен плівкою оболонкою, з масою
Фармакологічні дані
Матеріали та методи для прикладів 1-3
Зразки початкових АМІ. від пацієнтів. Зразки кісткового мозку або периферичної крові від пацієнтів з АМІ збирали після отримання інформованої згоди відповідно до вимог, затверджених дослідним комітетом з етичних питань Айтей Нозріїаї Нитап. Мононуклеарні клітини виділяли за допомогою центрифугування в градієнті щільності РісоІ-Радоє (СЕ
Неайнсаге, МІС, Аи5) з подальшим виснаженням еритроцитів в лізуючому буфері хлориду амонію (МНАСІ) за 37 "С протягом 10 хвилин. Потім клітини ресуспендували в фосфатно- сольовому буферному розчині, що містить 2 95 фетальну бичачу сироватку (б5ідта, МОМУ, А!йв).
Після цього мононуклеарні клітини суспендували в середовищі ВРМІ-1640 (СІВСО МІС, А!йв), що містить пеніцилін і стрептоміцин (СІВСО) та інактивовану нагріванням фетальну бичачу сироватку 15 95 (Зідта).
Клітинні лінії, клітинні культури та створення люциферазних репортерних клітинних ліній.
Клітинні лінії ММ4А;11, ОСІ-АМІ 3, НІ-60, НЕЇ, К5б62, Ка-1 і ЕОІ-1 підтримували за 37 "С, 5 95
СО» в ВРМІ-1640 (СІВСО), доповненому 10 95 (об./06.) фетальною бичачою сироваткою (бідта) і пеніциліном і стрептоміцином (СІВСО). Люциферазні клітинні лінії ММ4;11 створювали за допомогою лентивірусної трансдукції.
Антитіла. Первинні антитіла, які використовуються для вестерн-блотингу, представляли собою МСЇІ 1, ВСІ -2, Вах, Вак, Віт, ВСІ -ХІ. (створені на власній базі МЕНІ) і тубулін (Т-9026, зЗідта).
Життєздатність клітин. Тільки-но очищені мононуклеарні клітини із зразків АМІ. пацієнтів доводили до концентрації 2,5х10»/мл і вносили 100 мкл аліквот клітин на лунку в планшети на 96 лунок (бідта). Після цього клітини обробляли за допомогою сполуки 1, НСІ, сполуки 2, АВТ- 199 (Асіїме Віоспет, МУ, ОА) або ідарубіцина (бідта) в діапазоні б-лог концентрацій від 1 нм до 10 мкМ протягом 48 годин. Для дослідження комбінацій лікарські засоби додавали в співвідношенні 1:1 від 1 нМ до 10 мкМ та інкубували за 37 "С 595 СО». Після цього клітини фарбували за допомогою синього полінуклеотидного барвника зуїох (Іпмігодеп, МІС, А!йв) і вимірювали флуоресценцію за допомогою проточного цитометричного аналізу, використовуючи
ІЇЗ5В-ІЇ Ропезза (Весіоп ОісКіпвоп, МОМУ, Ав). Для збору даних використовували програмне забезпечення РАС5ОЇма, для аналізу - програмне забезпечення Ріомуо. Бластні клітини регулювали, використовуючи властивості прямого і бокового світлорозсіювання. Життєздатні клітини, виключаючи офарбованих синій зуїох, визначали при б концентраціях для кожного лікарського засобу та визначали 50 95 летальну концентрацію (І Со, в НМ).
Визначення І Со і синергізму. Для розрахунку І С5о використовували Старпрай Р'тгїзт, застосовуючи нелінійну регресію. Синергізм визначали шляхом обрахування індексу
Зо адитивності (ІА на підставі методу Спои Таїаіау, як описано (Спои Сапсег Вез; 70(2) дапиагу 15, 2010).
Дослідження колоній. Дослідження утворення колоній здійснювали на свіжоприготовлених і заморожених мононуклеарних фракціях від АМІ. пацієнтів. Первинні клітини культивували в двох повторах у чашках 35 мм (Спієпег-Біо, Септапу) за концентрацій от 1х107 до 1х105. Клітини висіювали в 0,695 агар (Ойсо М5МУ, А!цв): АІМОМ 2х (МОМ ромаег-Іпийодеп), доповнене
МансСоОз, декстраном, Пен/Стрепт, В меркаптоетанолом і аспарагіном):фетальна бичача сироватка (бідта) при співвідношенні 2:1:11. Для оптимальних умов росту всі планшети, що містять 4М-С5Е (100 нг на планшет)», І/-3 (100 нг/планшет А а О Бувієтв, ОБА) 5СЕ (100 нг/лпланшет А 4 О Бувзієтв) і ЕРО (4 Од/планшет) (Ріст відбувався протягом 2-3 тижнів за наявності та відсутності лікарського засобу за 37 "С при 595 СО» в інкубаторі з підвищеною вологістю. Після інкубування планшети фіксували за допомогою 2,595 глутаральдегіду в сольовому розчині і оцінювали, використовуючи СеІСошпі від Охіога Орігопіх (Абіпддоп, Опіїєй
Кіпддот).
Вестерн-блотинг. Лізати готували в лізуючому буфері МР40 (10 мМ Ттівз-НОЇ рн 7,4, 137 мМ
Масі, 10 95 гліцерин, 1 95 МР40), доповненому коктейлем інгібітору протеази (Воспе, Оее М/Ну,
МОМУ, Аийзвігаійа). Білкові зразки кип'ятили за зменшеного навантаження барвника перед розподілом на 4-12 95 Біс-Тріс поліакриламідних гелях (Іпийгодеп, МиїЇдгаме, МІС, Аийвігаїа), і переносили на нітроцелюлозну мембрану Нубопа С (СЕ, ВудаІтеге, МОМУ, А!Їзігаійа) для інкубування зі специфічними антитілами. Усі стадії блокування мембран і розведення антитіл здійснювали, використовуючи 5 95 (0б./06.) знежиреного молока в РВ5, що містить 0,1 95 (об./06.) Твін-20 фосфатно-сольового буферного розчину (РВОТ) або ТРІС-буферизованого фізрозчину, а стадії промивання здійснювали з РВОТ або ТВ5Т. Вестерн-блотинг візуалізували за допомогою посиленої хемілюмінесценції (СЕ).
Експерименти іп мімо з прищеплення АМІ. Дослідження на тваринах здійснювали згідно з правилами, затвердженими Айгтей Медіса! Незеатєсп апа Едисайоп Ргесіпсїі Апіта! Ефісв5
СоттінНеє, клітини ММ4;11, трансдуковані з репортером люциферази (рі ОС2), внутрішньовенно ін'єктували в кількості 1х105 клітин опроміненим (100 рад) діабетичним/ з тяжким комбінованим імунодефіцитом мишам, які не страждають на ожиріння (МОБ/5СІОЛІ 2гупиї), як було описано раніше (іп та ін., СеїЇ бЇет Сеї| 2 липня 2009 р., том 5, видання 1, сторінки 31-42). Клітини, що 60 прижилися, вимірювали в день 7 шляхом кількісного визначення пПСО45- клітин в РВ за допомогою проточної цитометрії та за допомогою візуалізації ІМІ5 біолюмінесценції клітин
МУ4;11. В день 10 миші отримували щодня перорально примусове годування сполукою 1, НС (200 мкл 100 мг/кг - дозування, виражене у вигляді вільного основи), розчиненою в РЕС400 (б5ідта), абсолютному етанолі (бідта) і дистильованій НгО 40:10:60 або сполукою 2 (200 мкл 25 мг/кг) два рази на тиждень, розчиненою в 50 95 2-гідроксипропіл) -В-циклодекстрині (5ідта) і 5095 50 мМ НС або комбінацією лікарських засобів або наповнювача протягом 4 тижнів.
Підрахунки імпульсів у крові здійснювали, використовуючи гематологічний аналізатор (ВіоНад,
СпіадевмШе, МОМ).
Візуалізація ІМІ5. Біолюмінесцентну візуалізацію здійснювали, використовуючи систему візуалізації Саїїрег ІМІ5 Гитіпа Ії ХА. Мишей анестезували ізофлеуріном і внутрішньочеревинно ін'єктували 100 мкл 125 мг/кг люциферину (Реїкіп ЕІтег, Зргіпрдма!є, МІС).
Матеріали та методи для прикладу 4
Клітинні лінії. Клітинні лінії мієломи людини (НМСЇ) походили з первинних мієломних клітин, культивованих в середовищі ВАРМІ 1640, доповненому 5 96 фетальною телячою сироваткою від і
З нг/мл рекомбінантного ІІ -6 для ІІ -6 залежних клітинних ліній. НМСОЇ були репрезентативними для фенотипічної та геномної гетерогенності та мінливості реакції у відповідь пацієнта на терапію.
МТ Т-дослідження. Життєздатність клітин вимірювали, використовуючи МТ (3-(4,5- диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолій бромід) колориметричний аналіз виживання. Клітини інкубували зі сполуками в планшетах на 96 лунок, що містять кінцевий об'єм 100 мкл/лунку в часі. (28)-2-1(55а)-5-(3-хлор-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(5-фторфуран- 2-іл)тієно(2,3-4|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-11-(2,2,2-трифторетил)-1 Н-піразол-5- іл|метокси)феніл)упропіонову кислоту (сполука 2) використовували в 9 різних концентрація відповідно до чутливості до одного засобу. //М-(4-гідроксифеніл)-3-16-((35)-3-(4- морфолінілметил)-3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)укарбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл- 5,6,7,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід гідрохлорид (сполука 1, НСЇ) використовували в фіксованій дозі - 1 мкМ. Після закінчення кожного лікування клітини інкубували з 1 мг/мл МТТ (50 мкл розчину МТТ 2,5 мг/мл для кожної лунки) за 37 "С протягом З годин, надаючи можливість МТТ метаболізуватися. У кожну лунку додавали лізуючий буфер (100 мкл лізуючого
Зо буферу: ДМФА (2:33/505 (1:3)3) для розчинення кристалів формазану та після інкубування протягом 18 годин, вимірювали абсорбцію життєздатних клітин при 570 нм, використовуючи спектрофотометр. Як контроль, клітини інкубували тільки з середовищем і з середовищем, що містить 0,1 956 ДМСО. Як контроль зростання мієломних клітин, абсорбцію мієломних клітин записували кожен день (00, 01, 02, ОЗ і 04).
Усі експерименти повторювали З рази, і кожну експериментальну умову повторювали щонайменше в лунках в трьох повторах в кожному експерименті. Інгібуючий ефект розраховували відповідно до такої формули: Інгібуючий ефект (95) - (1 - Значення абсорбції клітин, що лікуються/Значення абсорбції контрольних клітин)"100
Приклад 1. ВСІ -2 ії МС 1 являють собою домінантні білюи, що сприяють виживанню, і які експресуються в АМІ.
Зразки 7 АМІ. клітинних ліній і 13 первинних АМІ з » 70 95 бластів піддавали імуноблотингу для визначення білків, як зазначено на фігурі 1. Як проілюстровано на фігурі 1, протеомний огляд експресії представників сімейства ВСІ -2 в АМІ. свідчить про те, що додатково до ВСІ -2 більшість зразків первинних АМІ. і клітинних ліній АМІ. спільно експресують білок МСІ1, який сприяє виживанню. ВСІ -ХІ. менш часто експресується в АМІ.
Приклад 2. Комбіноване ВСІ-2 і МОЇ 1 націлювання проявляє синергетичне знищення в
АМІ. 54 зразки АМІ від пацієнтів інкубували в діапазоні концентрацій б-лог сполуки 1 (НОСІ сіль), сполуки 2 або 1:1 концентрація в ВРМІ/15 95 ЕС5 протягом 48 год. і визначали І Со (фігура 2А).
Приблизно 20 95 зразків первинних АМІ були надзвичайно чутливі або до сполуки 1 або сполуки 2 з летальною концентрацією лікарського засобу, необхідної для знищення 50 95 первинних АМІ. бластів через 48 годин (І Со) в нижньому наномолярному діапазоні (І Сво«с10
НМ) (фігура 2А). На відміну від цього, якщо комбінували сполуку 1 і сполуку 2, то пропорція зразків АМІ, які були чутливі, істотно підвищувалася до 7095, вказуючи на синергетичну активність при одночасному націлюванні ВСІ-2 і МС (фігура 2А). Деякі результати представлені на фігурі 17.
Щоб верифікувати активність цього підходу іп мімо, клітини ММ4;11 АМІ, які експресують люциферазу, прищеплювали М5Сї мишам і обробляли за допомогою сполуки 1 (НСІ сіль) або сполуки 2 окремо або в комбінації, і пухлинне навантаження оцінювали через 14 і 21 днів терапії бо (фігура 28. Після завершення 28 днів терапії за мишами спостерігали для визначення виживання (фігура 2С). Ці експерименти вказують на те, що комбінація сполуки 1 і сполуки 2 є високоефективною іп мімо, підтверджуючи надзвичайно хорошу активність, що спостерігається при використанні первинних клітин АМІ. в міїго.
Дані, представлені на фігурі 2А-2С в цій заявці, свідчать про синергетичну активність комбінації між сполукою 1, НСІ і сполукою 2 на АМІ.
Приклад 3. Комбіноване інгібування ВСІ-2 і МСЇ1 націлене на функцію лейкемічних попередників, але не функцію нормальних попередників
Щоб оцінити токсичність інгібування ВСІ -2 в комбінації з інгібуванням МСІ1 на функцію нормальних СО34ж- клітин людини або фікольованих бластних клітин від пацієнтів з АМІ, клоногенний потенціал оцінювали після впливу протягом 2 тижнів для комбінованих терапій.
Колонії вирощували на агарі, доповненому 10 95 ЕС5, І 3, 5СЕ, СМ-С5Е і ЕРО протягом 14 днів і колонії підраховували за допомогою автоматизованого аналізатора СвісоипіФ. Дослідження для зразків первинних АМІ. здійснювали в двох повторах і усереднювали. Похибки для СОЗ4-- являють собою середнє значення -/- СП 2 незалежних нормальних донорських зразків.
Результати нормовували до числа колоній, підрахованих в ДМСО-контролі. Зазначені концентрації лікарських засобів поміщали в планшет в 01. Слід зазначити, що сполука 1 їх сполука 2 пригнічує колонієутворюючу активність АМІ. без впливу на функції зростання колоній нормальних СОЗА.к.
У сукупності, приклади 2 і З свідчать про те, що подвійне фармакологічне інгібування ВСІ -2 і
МСЇІ 1 являє собою новий підхід для лікування АМІ без необхідності додаткової хіміотерапії та з прийнятним терапевтичним вікном безпеки.
Приклад 4. Оценювання іп міо виживання клітин множинної мієломи у відповідь на дію інгібітора МОЇ 1 як єдиного засобу або в комбінації з інгібітором ВСІ -2
Аналізували чутливість 27 клітинних ліній множинної мієломи людини до сполуки 1, сполуки 2 або до сполуки 2 за наявності 1 мкМ сполуки 1 шляхом застосування МТ -дослідження життєздатності клітин. Визначали 50 95 інгібуючі концентрації (Іво, в НМ).
Результати наведені в таблиці нижче.
Кк мММмі | 72392063. | ....ююЮюЮД578.ЮЮЙ|.ЮюЮЙМ/. 86 ших ст лини ШЕ ЕХ РТ ДЯ По ТС Я ПО: ПО
Сильна синергетична активність показана при комбінуванні сполуки 1 і сполуки 2 в більшості клітинних ліній у порівнянні зі сполуками окремо.
Приклад 5. Вплив іп мйт на проліферацію комбінування інгібітора МОЇ 1 з інгібітором ВО -2 на панелі 17 клітинних ліній дифузної крупноклітинної В-клітинної лімфоми (І ВСІ)
Матеріали та методи
Клітинні лінії отримували з джерел і підтримували в основному середовищі, доповненому
ЕС5 (фетальна теляча сироватка), як зазначено в таблиці 1. Додатково, всі середовища містили пеніцилін (100 МО/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) і І -глутамін (2 мМ). Якщо спеціально не вказано інше, то культуральні середовища та добавки отримували від Атітеа/Віосопсері (Аївспмії, єм/іїгепапа).
Клітинні лінії культивували за 37 С у зволоженій атмосфері, що містить 595 Со» і підтримували в колбах Т-75. У всіх випадках клітини розморожували із заморожених маткових розчинів, проводили через 21 пасаж, використовуючи відповідні розведення, підрахунок і оцінку життєздатності, використовуючи пристрій САБМУ для підрахунку клітин (Отпі І їе Зсієпсе,
Вгетеп, Септапу) перед висіюванням по 25 мкл/лунку при щільностях, зазначених в таблиці 1 в планшети на 384 лунок (Согпіпа). Усі клітинні лінії визначали як такі, що не містять мікоплазматичних забруднень за допомогою ПЛР-аналізу, здійсненого на Ідехх Радії (СоІштрбіа,
МО, БА), і виключення помилкової ідентифікації проводили за допомогою панелі 48 поліморфізму невеликих нуклеотидів (5МР) в Азигадеп (А!йзвійп, ТХ, ОА) або самостійно.
Маткові розчини сполук готували при концентрації 10 мМ в ДМСО (5ідта) і зберігали за - 20 7С. За необхідності для отримання повної кривої залежності "доза-ефект" маткові розчини попередньо розводили в ДМСО до 1000-кратної бажаної початкової концентрації (див. таблицю 2). На наступний день після висівали клітин, вісім 2,5-кратних серійних розведень кожної сполуки відміряли, або індивідуально або у всіх можливих перестановках у шаховому порядку, безпосередньо в планшети для клітинних аналізів, використовуючи безконтактний цифровий диспенсер 3000 Біойа! Різрепзег (ТЕСАМ, Маппедоїт, бм/йгепапа), як представлено на фігурі 4.
Кінцева концентрація ДМСО складала 0,2 95 у всіх ланках.
Вплив окремих агентів, а також їхніх комбінацій в шаховому порядку на життєздатність клітин оцінювали після інкубування протягом 2 днів за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного аналізу
Зо клітинних рівнів АТФ, використовуючи СеїЇ/ПіегЗіо (Рготеда, Мадібзоп, УМІ, ОА) при 25 мкл реагенту/лунку і п-2 повторах планшет на умову. Люмінесценцію кількісно вимірювали на багатофункціональному планшет-рідері МІ 000 (ТЕСАМ, Маппедопї бЗмйгепапа).
Кількість/життєздатність клітин під час додавання сполуки також оцінювали і використовували для оцінки порядку часу подвоєння популяції конкретної клітинної лінії.
ІЇСво для окремих агентів розраховували, використовуючи підгонку кривих за чотирма параметрами. Потенційні синергичні взаємодії між комбінаціями сполук оцінювали, використовуючи 20-матрицю надлишкового інгібування відповідно до моделі адитивності І оєме і описували у вигляді оцінки синергізму (Зупегау бсогеє) (І еНаг та ін., Маї ВіоїесНнпої. липень 2009 р.; 27(7): 659-666). Усі розрахунки здійснювали з використанням модуля аналізу комбінацій з власним програмним забезпеченням. ІСво визначали у вигляді концентрації сполуки, за якої сигнал СТО зменшується на 5095 щодо такого сигналу, виміряного для контрольного наповнювача (ДМСО).
Інтерпретацію оцінки синергізму (Зупегду 5согеє) здійснювали таким чином: 55-00 -» Адитивний 51 - Слабкий синергізм 55 »2 - Синергізм
Таблиця 1
Ідентичність і умови досліджень для 17 клітинних ліній дифузної крупноклітинної В-клітинної лімфоми, що використовуються в комбінованих експериментах. й я. о Час подвоєння Кількість висіяних 08 | ВРМІАТСС) | 10 317 | 500 Ж ЖеЯ
МЕМ
Таблиця 1
Ідентичність і умови досліджень для 17 клітинних ліній дифузної крупноклітинної В-клітинної лімфоми, що використовуються в комбінованих експериментах. "Це середовище додатково доповнене 50 мкМ 2-меркаптоетанолу. Час подвоєння розраховували на підставі відмінності рівнів АТФ після закінчення експерименту в порівнянні з початком інкубації зі сполукою.
Таблиця 2
Представлені значення ІСхо єдиних агентів для сполуки З і сполуки 1, НСІ, а також оцінювання синергізму для їхньої комбінації. Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0
Клітинна Поч. Абс ІСво | Макс Інг Поч, Абс ІСво | Макс Інг| Оцінка Похибка лІНІЯ и (921 коні. | мкм) (95| синергізму // ОЦІНКИ (мкм ІмкМ синегрізму 08 | 1 00129 992 | 10 | 276 | 957 | 7173 | 08
НТ 1 71 (000638) 993 | 10 | о | 372 | 235 | 006
КАВРАЗ-422| 1 /000214| 983 / 10 | ги | 909 | 974 | 052
В | ло 1 303 | 955 | 10 | б2гві | 990 | 7127 | 098 в8Ш-оНі-Я | 1 00178) 995 / 10 | 086 | 969 | 708 | 028 імуви-рісі2| 1 1000792| 990 | 10 | 02 | 993 | 867 | оз "Поч. конц." означає початкову концентрацію. "Абс ІСво" означає абсолютну ІСво. "Макс Інг" означає максимальне інгібування.
Результати
Вплив на проліферацію комбінування інгібітору МС 1 сполука З з інгібітором ВСІ -2 сполука 1, НС оцінювали на панелі 17 клітинних ліній дифузної крупноклітинної В-клітинної лімфоми (ПІ ВСІ).
Сполука З як єдиний засіб сильно інгібувала ріст більшості 17 ліній СІ ВСІ, що тестувалися (таблиця 1). Таким чином, 14 клітинних ліній проявляли значення ІСсо нижче за 100 нМ, і додаткова 1 клітинна лінія проявляла значення ІСзхо у діапазоні від 100 нМ їі до мкМ. Тільки 2 клітинні лінії проявляли ІСво більше 1 мкМ.
Сполука 1, НСІ як єдиний засіб також інгібувала ріст більшості 17 ліній ОСІ ВСЇ, що тестувалися, хоча трохи менш ефективно (таблиця 2). Таким чином, 2 клітинні лінії проявляли значення ІСхо нижче за 100 нМ, і 6 клітинних ліній проявляли значення ІСво між 100 нМ і 1 мкМ.
Дев'ять клітинних ліній проявляли ІСзо вище 1 мкМ (чотири з яких вище 10 мкМ).
У комбінації лікування із застосуванням сполуки З і сполуки 1, НСІ викликає синергічне інгібування росту (тобто, оцінка синергізму вище 2-І еРаг та ін., Маї Віоїеснпої. Липень 2009 р.; 27(7): 659-666) в 16 із 17 клітинних ліній ОСІ ВСІ, що тестувалися (таблиця 2). У 5 клітинних лініях помітний синергетичний ефект з оцінками синергізму між 5 і 10. У 4 клітинних лініях синергетичний ефект являється екстраординарним, досягаючи оцінок синергізму між 10 і 17,3.
Надзвичайно важливо, що синергізм не залежить від антипроліферативних ефектів одиничного агента, і в дійсності, є особливо сильним при концентраціях сполуки З і сполуки 1, які не виявляють антипроліферативний ефект самостійно. Наприклад, в клітинах ОВ сполука З і сполука 1 за другої найбільш низької концентрації, що тестується, проявляють інгібування росту тільки на 1 і 295 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 96 95 (фігура 4А, ліва панель), таким чином, будучи на 91 95 вище адитивності, розрахованої на підставі активності окремо взятих засобів (фігура 4А, права панель). Як додатковий приклад, на клітинах ТоЇєдо, в яких сполука З є менш ефективною і забезпечує тільки часткове інгібування росту (46 95) за найбільш високої концентрації, що тестується, комбінація з другою найбільш низькою концентрацією сполуки 1 призводить до синергетичного інгібування росту на 98 95 (фігура 4В, ліва панель), таким чином, будучи на 52 95 вище адитивності, розрахованої на підставі активності окремо взятих засобів (фігура 4В, права панель). Крім того, слід зазначити, що синергетичні ефекти проявляються для широкого
Зо діапазону концентрацій окремо взятих засобів, які повинні виявитися корисними іп мімо по відношенню до гнучкості щодо рівнів і схем дозування.
На закінчення, комбінація сполуки З і сполуки 1 забезпечує від сильного до екстраординарного синергетичного інгібування росту в більшості клітинних ліній ОЇ ВСІ, що тестувалися.
Приклад 6. Ефективність іп мімо на Кагра5 422 кеенотрансплантатах при застосуванні комбінації інгібітору МОЇ 1 (сполука 3) та інгібітору ВСІ -2 (сполука 1)
Матеріали та методи
Культура пухлинних клітин та інокуляція клітин
Клітинну лінію Каграх 422 В-клітинної неходжкінської лімфоми людини (МНІ) отримували з плеврального ексудату пацієнта з резистентною до хіміотерапії МНІ. Клітини отримували з клітинного банку Ю5М/ і культивували в середовищі АРМІ-1640 (Віобопсері Ца. Атітеад, ) доповненого 10 95 ЕС5 (ВіоСопсері |. Атітеєд), 2 мМ І-глутаміном (ВіоСопсері |. Атітеєа), 1
ММ піруватом натрію (ВіоСопсері ЦЯ. Атітед) і 10 мМ НЕРЕЗ (Сіірсо) за 37 "С в атмосфері 5 90
СО» на повітрі. Клітини підтримували в діапазоні 0,5 і 1,5х106 клітин/мл. Щоб встановити ксенотрансплантати Кагра:з 422, клітини збирали та ресуспендували в НВ55 ((сзірсо) і змішували з матрігелем (ВО Віозсіепсеє) (1:11 об./об.) перед ін'єктуванням 200 мкл, що містять 1х107 клітин підшкірно в праву лапу тварин, які були анестезовані ізофлураном. За двадцять чотири години до інокуляції клітин всіх тварин опромінювали 5 Гр протягом 2 хвилин, використовуючи тх- випромінювач.
Ріст пухлини
За ростом пухлини спостерігали регулярно після інокуляції клітин, і тварин рандомізували на групи лікування (п-5), коли розмір пухлини досягав відповідного об'єму. Під час періоду лікування об'єм пухлини вимірювали приблизно два рази на тиждень, використовуючи штангенциркулі. Розмір пухлини в мм3, розраховували базуючись на формулі: (І х М2 х п/б).
Где МУ - ширина і Ї - довжина пухлини.
Лікування
Тварин, що несуть пухлину (щури), поділяли на групи лікування (п-:5), коли їхні пухлини досягали відповідного розміру з утворенням групи із середнім об'ємом пухлини приблизно 450 мм3. Лікування групи представлені в таблиці 3. Наповнювач для сполуки 1, НСІ або сполуку 1, бо НСІ вводили шляхом перорального (по) примусового введення за 1 год. перед наповнювачем для сполуки З або сполуку 3, яку вводили шляхом 15 хвилинної вв інфузії. Для вв інфузії тварин анестезували за допомогою ізофлурану/О», і наповнювач або сполуку З вводили через канюлю в хвостову вену. Тварин зважували в день (ї) дозування та дозу коректували на масу тіла, дозований об'єм склав 10 мл/кг для обох сполук.
Маса тіла
Тварин зважували щонайменше 2 рази на тиждень і досліджували більш часто у разі прояву ознак будь-яких побічних ефектів.
Аналіз даних і статистична оцінка
Дані пухлин аналізували статистично, використовуючи СтарпРай Ргізт 7.00 (СтарпРай
Зойпмаге). Якщо варіантності в даних нормально розподілені, то дані аналізували за допомогою однофакторного АМОМА з апостеріорним критерієм Даннетта для порівняння лікування щодо контрольної групи. Тест Тьюкі з апостеріорним критерієм використовували для міжгрупових порівнянь. В інших випадках використовували критерій Крускала-Уолліса з апостеріорним тестом Данна. Якщо це являється застосовним, то дані представляли у вигляді середнього значення - СПО.
Як критерій ефективності розраховували значеннядо Т/С (лікування/контроль) після закінчення експерименту відповідно до: (Доб'єму пухлиниг"'данні лікуванню/доб'єму пухлиниконтроль)1 00
Регресію пухлини розраховували відповідно до: -(Доб'єму пухлиниг"іданні лікуванню б'єму пухлиниг"іданні лікуванню на початку лікування) 5 00, де Доб'єму пухлини являє собою середнє значення об'єму пухлини в день оцінки мінус середнє значення об'єму пухлини на початку експерименту.
Таблиця З
Групи лікування для визначення ефективності комбінацій на щурах, які несуть ксенотрансплантат Кагразз 422 . Доза (виражена у Кількість
Групи Лікування вигляді вільної Схема : основи) щурів
Наповнювач для сполуки 1, НСІ (РЕС400/ЕЮН/Рпозаї 50 Ра 1. |(30/10/60,, по за 1 год. до 10 мл/кг 10 мл/кг | БИ" лова угод до я 5 ; вв інфузія наповнювача для сполуки 3, 15 хвилин вв інфузія 10 мл/кг сполука З РН, вв інфузія сполуки З РН, вв інфузія
РН, по за 1 год. до їх
Лікування починали, коли середній об'єм пухлини становив приблизно 450 мм3. Сполуку 1,
НС готували в РЕБ400/ЕЮН/Рнозаї! 50 РО (30/10/60) та сполуку З поміщали в розчин.
РН означає раз на тиждень.
Результати
Лікування за допомогою комбінації вільної основи сполуки 1 в дозі 150 мг/кг по за 1 год. до
Зо сполуки З в дозі 20 мг/кг вв інфузії індукує повну регресію у всіх пухлинах Каграз 422 на день 30 від початку лікування (фігура 5). Усі тварини в групі лікування мали ремісію без пухлини після лікування, яка зупинялася в розвитку з дня 35 аж до дня 90. Позитивний ефект комбінації спостерігався в групі з комбінацією в порівнянні з активністю одного агенту. У день 34 пухлинна відповідь у групі з одним агентом сполуки З і в групі з комбінацією істотно відрізнялися від групи з наповнювачем (р«е0,05). Лікування з використанням комбінації добре переносилося на підставі зміни маси тіла (фігура 6).
Приклад 7. Ефективність іп мімо на ксенотрансплантаті СІ ВСІ ТоїЇєдо при застосуванні комбінації інгібітору МОЇ 1 (сполука 3) та інгібітору ВСІ -2 (сполука 1, НС)
Матеріали та методи
Імплантація клітин
Модель ксенотрансплантату встановлювали шляхом прямої підшкірної (пк) імплантації суспензії З мільйонів клітин Тоіедо з 5095 матрігеля в підшкірну область 5СІЮО/мишам із природженою відсутністю природних клітин-кілерів. Усі процедури здійснювали з використанням асептичних технік. Мишей анестезували на весь період здійснення процедури.
У цілому всього 6 тварин на групу включали в дослідження ефективності. Щоб дослідити дії одного агенту та комбінації, тваринам вводили дози шляхом перорального примусового введення через зонд (по) для сполуки 1 і внутрішньовенно (вв) через хвостову вену для сполуки 3. Сполуку 1, НСІ готували у вигляді розчину в РЕСЗО0О/ЕЮН/воді (40/10/50), та сполуку З поміщали в розчин. Коли пухлини досягали приблизно 220 мм? в день 26 після імплантації клітин, мишей, що несуть пухлини, рандомізували в групи лікування.
Схема дослідження, включаючи схему дозування, для всіх груп лікування, узагальнена в таблиці нижче. Тварин зважували в день (дні) дозування та дозу коректували на масу тіла, дозований об'єм склав 10 мл/кг. Розміри пухлини та маси тіла збирали під час рандомізації та два рази на тиждень після цього під час здійснення дослідження. Після кожного дня збору даних отримували такі дані: частота смертності, індивідуальні та групові середні значення маси тіла та індивідуальні та групові середні значення об'єму пухлини. основи)
РЕСЗО0О/ЕЮН/вода о1ронеювнююм | ур 00 16 2 | Сполукаї, НС | ЛОбмиг | Рн.по | 6 « 3 | Сполуаа3/ | -( 25миг | РНнвв. | 6 жзФві сен 10
Сполука З 25 мг/кг РН, вв
Для дослідження на моделі ТоіІедо, лікування починали в день 26 після імплантації клітин, коли середній об'єм пухлини становив -218-228 мм3.
РН означає раз на тиждень.
Маса тіла (МТ)
Фо зміну маси тіла розраховували згідно з формулою (Мт поточна - МТ початкова)//М1 початкова) х 100.
Дані представлені у вигляді зміни маси тіла у відсотках від дня початку лікування.
Об'єм пухлини та відсоток мишей, які залишилися в дослідженні
Процентні значення лікування/контроль (Т/С) розраховували, використовуючи таку формулу:
Фо Т/С - 100х АТ/ДС, якщо АТ 50
Фо регресії - 100х АТ/ТГо, якщо АТ «0
Зо де:
Т - середній об'єм пухлини групи, що лікували лікарським засобом, в останній день дослідження;
АТ - середній об'єм пухлини групи, що лікували лікарським засобом, в останній день дослідження - середній об'єм пухлини групи, що лікували лікарським засобом, в початковий день дозування;
То - середній об'єм пухлини групи, що лікували лікарським засобом, в день розподілення на групи;
С - середній об'єм пухлини контрольної групи в останній день дослідження; і
ДС - середній об'єм пухлини контрольної групи в останній день дослідження - середній об'єм пухлини контрольної групи в початковий день дозування.
Відсоток мишей, які залишилися в дослідженні - 6- Кількість мишей, які досягли кінцевої точки/67100
Статистичний аналіз
Усі дані виражали у вигляді середнього значення ж стандартна похибка середнього (СПО).
Різниця (дельта) об'єму пухлини та відсоток зміни маси тіла використовували для статистичного аналізу. Порівняння між групами здійснювали за допомогою однофакторного АМОМА з наступним апостеріорним критерієм тесту Тьюкі. Для всіх статистичних оцінок рівень значущості встановлювали при р«0,05. Описували достовірність у порівнянні з контрольною групою з наповнювачем, якщо спеціально не вказано інакше.
Результати
Сполука З
На моделі ТоїЇєдо сполука 1 у вигляді вільної основи в дозі 100 мг/кг продукує статистично достовірні протипухлинні ефекти з 37 95 Т/С. Сполука З в дозі 25 мг/кг призводить до відсутності протипухлинних ефектів з 102 95 Т/С (фігура 7). Комбінація сполука 1 т сполука З призводить до опухолестазу з З 95 Т/С, що є статистично достовірним у порівнянні з групами, яким вводили
Наповнювач, сполуку 1 і сполуку З (р«0,05 за допомогою однофакторного тесту АМОМА).
Таким чином, комбіноване інгібування ВСІ-2 і МСІ1 в 0ОІВСІЇ може забезпечити терапевтичну перевагу в клініці. Додатково, середня зміна маси тіла для ТоЇєдо представлена на фігурі 8. Лікування мишей із застосуванням сполуки 1, НСІ ї сполуки З проявляє приріст маси тіла (1,081 95 ї 2,3 95 відповідно). Група, якій вводили комбінацію, проявляє незначну втрату маси тіла (-3,2 95). Інших ознак побічних ефектів не спостерігали в цьому дослідженні. Усі б тварин виживали під час проведення дослідження.
Взяті в сукупності приклади 2, 6 і 7 показали, що комбінація інгібітору МОЇ 1 і інгібітору ВСІ -2 є ефективною при переносимих дозах у мишей і щурів, які несуть ксенотрансплантати клітинних ліній, що мають походження з гострого мієлолейкозу та лімфоми людини, та свідчить про те, що за допомогою цієї комбінації досягається відповідне терапевтичне вікно при цих захворюваннях.
Приклад 8. Вплив іп міо на проліферацію комбінації інгібітору МОЇ 1 з інгібітором ВСІ -2 на панелі 13 клітинних ліній гострого мієлоїдного лейкозу (АМО.
Матеріали та методи
Клітинні лінії отримували з джерел і підтримували в основному середовищі, доповненому
ЕВ5 (фетальна бичача сироватка), як зазначено в таблиці 1. Додатково, всі середовища містили пеніцилін (100 МО/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) і І -глутамін (2 мМ).
Клітинні лінії культивували за 37 "С у зволоженій атмосфері, що містить 595 Со», і підтримували в колбах Т-150. У всіх випадках клітини розморожували із заморожених матеріалів, пропускали через 21 пасаж, використовуючи відповідні розведення, підраховували й аналізували для визначення життєздатності, використовуючи САБУ лічильник клітин перед висіванням 150 мкл/лунку при щільності, зазначеній у таблиці 1, в планшети на 96 лунок. Усі клітинні лінії визначали як такі, що не містять мікоплазматичних забруднень на власній базі.
Зо Маткові розчини сполук готували при концентрації 5 мМ в ДМСО і зберігали за -20 "С.
Для аналізу активності сполук як єдиних засобів клітини висівали та обробляли дев'ятьма 2- кратними серійними розведеннями кожної сполуки, диспергованого індивідуально безпосередньо в планшети для аналізу клітин. Вплив сполук на життєздатність клітин оцінювали через З дні інкубації за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного визначення клітинних рівнів
АТФ, використовуючи СеПТйенкз іо при концентрації 75 мкл реагенту/лунку. Усі експерименти здійснювали в трьох повторах. Люмінесценцію кількісно визначали на мультифункціональному планшет-рідері. ІСво для одиничного засобу розраховували, використовуючи стандартну підгонку кривої за чотирма параметрами. ІСзво визначали у вигляді концентрації сполуки, за якої сигнал СТО зменшується на 5095 щодо такого сигналу, виміряного для контрольного наповнювача (ДМСО).
Для аналізу активності сполук в комбінації клітини висівали та обробляли із застосуванням семи або восьми 3,16-кратних серійних розведень розподіленої кожної сполуки або індивідуально, або у всіх можливих комбінаціях в шаховому порядку, безпосередньо в планшети для аналізу клітин, як показано на фігурі 9. Ефекти агентів у вигляді монотерапії, а також їхніх комбінацій у шаховому порядку на життєздатність клітин оцінювали через З дні інкубації за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного визначення клітинних рівнів АТФ, використовуючи
СейПТпек«Зіо при концентрації 75 мкл реагенту/лунку. Здійснювали два незалежних експерименти, кожен з них проводили в двох повторах. Люмінесценцію кількісно визначали на мультифункціональному планшет-рідері.
Потенційні синергичні взаємодії між комбінаціями сполук оцінювали, використовуючи 20- матрицю надлишкового інгібування відповідно до моделі адитивності І оєме і представляли у вигляді оцінки синергізму (Зупегду 5согеє) (І еНаг та ін., Маї Віотеснпої. липень 2009 р.; 27(7): 659- 666). Усі розрахунки здійснювали, використовуючи Сіаїїсе "М Віоіптоптаїйсв5 5оїмаге.
Час подвоєння, вказаний у таблиці З, являє собою середнє значення часу подвоєння, отримане при різних пасажах (у колбах Т-150), здійснених із розморожених клітин при їхньому висівання в планшети на 96 лунок.
Інтерпретацію оцінки синергізму (Зупегду 5согє) здійснювали таким чином: 55 0 -- Адитивний 55 21 - Слабкий синергізм 55 22 - Синергізм
Таблиця З
Ідентичність і умови досліджень для 13 клітинних ліній гострого мієлоїдного лейкозу (АМІ), що використовуються в комбінованих експериментах (джерело) (години) клітин/лунка
Таблиця 4а
Представлені значення ІСво при монотерапії для сполуки 3, сполуки 1, НСІ ії АВТ-199 в 13 клітинних лініях АМІ.. Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів 11111111 Сполуказ | Сполукаї, НС | АВТЯЛ99 . с. Поч. конц. ІСво Поч. конц. ІСво Поч. конц. ІСво о мМалі! | 001 | бо | о | 003 | нд | нд. / о мошШмяз | 001 | 0002 | 01 | 004 | нд | нд. / ме | оло | 005 | 20 | 004 | нд | нд. / о Кавит-ї | 200 | 0033 | 300 | 077 | нд | нд. / свом- | оло | 0боов | ю20 | 006 | нд. | нд. /
Таблиця 4р
Представлені значення ІСво при монотерапії для сполуки 4, НСІ в 5 клітинних лініях АМІ.
Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів 11111111 Сполкай. НС: З
Таблиця 5а
Представлені оцінки синергізму для комбінації сполуки З і сполуки 1 в 13 клітинних лініях АМІ.
Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0. Представлені початкові концентрації сполуки, середнє значення макс, інгібування та середньоквадратичне відхилення (св) оцінок синергізму. Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів що Середнє Середнє Похибка
Клітинна лінія | Поч. конц. Середнє Поч. конц. М значення оцінки акс Інг : :
ІмкМІ Макс Інг (бо) ІмкМІ 86 оцінки синергізму синергізму (св) о мошШМ-тз3 10111995 | юф 03 | 900 | 82 | 13 о тТНнРЯЯ 177103 1 990 | юЮюЮюЮюД5О0 | 55 | 132 | 0
ЕОСНІ 101 1 7000 | 10 | лоббо | 58 | 08 бом 101 1 990 .юЮюьєюь03 | 870 | Пи | 14
Кола | 20 | 285 | 50 | 730 | 130 | 09
Таблиця 50
Представлені оцінки синергізму для комбінації сполуки З ії АВТ-199 в 8 клітинних лініях АМІ.
Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0. Представлені початкові концентрації сполуки, середнє значення макс. інгібування та середньоквадратичне відхилення (св) оцінок синергізму. Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів
Що Середнє Середнє Похибка
Клітинна лінія | Поч. конц. Середнє Поч. конц. М значення оцінки акс Інг : .
ІмкМІ Макс Інг (Ос) ІмкМІ (92) оцінки синергізму синергізму (св) кеї | 20 | 890 | 20 | 545 | 122 | 08
Таблиця 5с
Представлені оцінки синергізму для комбінації сполуки З і сполуки 4, НСІ в 5 клітинних лініях
АМІ.. Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0.
Представлені початкові концентрації сполуки, середнє значення макс. інгібування та середньоквадратичне відхилення (св) оцінок синергізму. Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів
Середнє Середнє Похибка
Клітинна лінія | Поч. конц. Середнє Поч. конц. М значення оцінки акс Інг : .
ІмкМІ Макс Інг (бо) ІмкМІ 86 оцінки синергізму синергізм св о омошШмМяЗ 10117700 17770 | 99 | 384 | 002
Ме 1701 170010 | 99 | 709 | 096 і серомя | 01 1 л00 | 01 | 99 | 703 | 052
Результати
Комбінація (а). Вплив на проліферацію комбінування інгібітору МС 1 сполука З з інгібітором
ВСІ -2 сполука 1 оцінювали на панелі 13 клітинних ліній гострого мієлоїдного лейкозу (АМІ).
Сполука З як єдиний засіб сильно інгібувала ріст більшості 13 ліній АМІ, що тестувалися (таблиця 4а). Таким чином, 10 клітинних ліній проявляли ІСхо нижче за 100 нМ, і додаткові 2 клітинні лінії проявляли значення ІСвзо між 100 нМ і 1 мкМ. Тільки 1 клітинна лінія проявляла ІСво більше 1 мкМ.
Сполука 1, НСІ як єдиний засіб також інгібувала ріст декількох ліній АМІ,, що тестувалися, хоча трохи менш ефективно (таблиця 4а). Таким чином, 5 клітинних ліній проявляли ІСв5о нижче за 100 нМ, і 2 клітинні лінії проявляли значення ІСво між 100 нМ і 1 мкМ. Шість клітинних ліній проявляли ІСзо більше 1 мкМ.
У комбінації лікування сполукою З і сполукою 1, НСІ викликає синергічне інгібування росту (тобто оцінка синергізму вище 2) у всіх 13 клітинних лініях, що тестувалися (таблица 5а). У 2 клітинних лініях помітний синергетичний ефект з оцінками синергізму між 5 і 10. У 10 клітинних лініях синергетичний ефект являється екстраординарним, досягаючи оцінок синергізму між 10 і 19,8. Надзвичайно важливо, що синергізм не залежить від антипроліферативних ефектів одиничного агенту, і в дійсності, Є особливо сильним при концентраціях сполуки З і сполуки 1, які самостійно не мають антипроліферативного ефекту. Наприклад, на клітинах ОСІ-АМІ З сполука З і сполука 1 за третьої найбільш низької концентрації, що тестується, проявляють інгібування росту тільки на 5 і 1 95 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 84 95 (фігура 9А, верхня ліва панель), таким чином, будучи на 79 95 вище адитивності, розрахованої на підставі активності окремо взятих засобів (фігура 9А, верхня права панель).
Крім того, слід зазначити, що синергетичні ефекти проявляються для широкого діапазону концентрацій окремо взятих засобів, які повинні виявитися корисними іп мімо по відношенню до гнучкості щодо рівнів і схем дозування. Як висновок, комбінація сполуки З і сполуки 1 забезпечує синергетичне інгібування росту у всіх 13 клітинних лініях АМІ, що тестувалися.
Важливо, що екстраординарне синергетичне інгібування росту спостерігали в більшості клітинних ліній АМІГ., що тестувалися (10/13).
Комбінація (б) Вплив на проліферацію комбінування інгібітору МСІ 1 сполука З з інгібітором
ВСІ -2 АВТ-199 оцінювали на панелі 8 клітинних ліній гострого мієлоїдного лейкозу (АМІ).
Сполука З як єдиний засіб сильно інгібувала ріст більшості з 8 ліній АМІ, що тестувалися (таблиця 4а). Таким чином, 5 клітинних ліній проявляли ІСхо нижче за 100 нМ, і додаткові 2 клітинні лінії проявляли значення ІСвзо між 100 нМ і 1 мкМ. Тільки 1 клітинна лінія проявляла ІСво більше 1 мкМ.
АВТ-199 як єдиний засіб також інгібував ріст ліній АМІ, хоча з меншою ефективністю (таблиця 4а). Таким чином, тільки одна клітинна лінія проявляла ІСхзо нижче за 100 НМ, і 2 клітинні лінії проявляли ІСво між 100 нМ і 1 мкМ. П'ять клітинних ліній проявляли ІСзо більше 1
МКМ.
У комбінації лікування інгібітором МСІ1 і АВТ-199 викликає синергічне інгібування росту (тобто оцінка синергізму вище 2) на всій панелі 8 клітинних ліній, що тестувалися (таблица 56).
У більшості клітинних лініях синергетичний ефект являється екстраординарним, досягаючи оцінок синергізму між 10 і 17,6.
Надзвичайно важливо, що синергізм не залежить від антипроліферативних ефектів одиничного агенту, і в дійсності, Є особливо сильним при концентраціях інгібітору МСІ 1 і АВТ- 199, які самостійно не мають антипроліферативного ефекту. Наприклад, в клітинах ОСІ-АМІ З
МОЇ 1 ї АВТ-199 у третій найбільш низькій концентрації, що тестується, проявляють інгібування росту на 26 95 і 18 95 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 91 95 (фігура 13, верхня ліва панель).
Крім того, слід зазначити, що синергетичні ефекти проявляються для широкого діапазону концентрацій окремо взятих засобів, які повинні виявитися корисними іп мімо по відношенню до гнучкості щодо рівнів і схем дозування. Як висновок, комбінація сполуки З ії АВТ-199 забезпечує синергетичне інгібування росту у всіх 8 клітинних лініях АМІ, що тестувалися. Важливо, що екстраординарне синергетичне інгібування росту спостерігали в більшості клітинних ліній АМІ, що тестувалися (7/8).
Комбінація (с). Вплив на проліферацію комбінування сполуки З інгібітору МОЇ 1 зі сполукою 4 інгібітором ВСІ -2 оцінювали на панелі 5 клітинних ліній гострого мієлоїдного лейкозу (АМІ).
Сполука З як єдиний засіб сильно інгібувала ріст 5 ліній АМІ,, що тестувалися (таблиця 46).
Таким чином, всі клітинні лінії проявляли ІСхзо нижче 200 нМ. Сполука 4, НСІ як єдиний засіб також інгібувала ріст 4 з 5 клітинних ліній, що тестувалися, з ІСво нижче або рівним 40 нМ, одна клітинна лінія є резистентною до сполуки 4 з ІСво 10 мкМ. У комбінації лікування сполукою З і сполукою 4, НСІ викликає синергічне інгібування росту (тобто оцінка синергізму вище 2) у всіх 5 клітинних лініях, що тестувалися (таблица 5с). У 2 клітинних лініях помітний синергетичний ефект з оцінками синергізму між 5 і 10. В 1 клітинній лінії синергетичний ефект є екстраординарним, забезпечуючи оцінку синергізму 16,5. Надзвичайно важливо, що синергізм не залежить від антипроліферативних ефектів одиничного агенту, і в дійсності, є особливо сильним при концентраціях сполуки 4, НСІ і сполуки 3, які самостійно не мають або мають низький антипроліферативний ефект. Наприклад, на клітинах ОСІ-АМІ З сполука 4, НС. і сполука З за третьої найбільш низької концентрації, що тестується, проявляють інгібування росту тільки на 1 і 40 95 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 98595 (фігура ТА, ліва панель, характерно для двох незалежних експериментів), таким чином, будучи на 5395 вище адитивності, розрахованої на підставі активності окремо взятих засобів (фігура 14А, права панель). У клітинах МІ -2 сполука 4, НСІ ї сполука З за п'ятої найбільш низької концентрації, що тестується, проявляють інгібування росту тільки на 18 і 26 95 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 10095 (фігура ТА, ліва панель, характерно для двох незалежних експериментів), таким чином, будучи на 51 95 вище адитивності, розрахованої на підставі бо активності окремо взятих засобів (фігура 15, права панель).
Зо
Як висновок, комбінація сполуки 4 і сполуки З забезпечує синергетичне інгібування росту у всіх 5 клітинних лініях АМІ.,, що тестувалися.
Приклад 9. Ефект іп міо на проліферацію комбінування інгібітору МОЇ 1 з інгібітором ВО -2 на панелі 12 клітинних ліній нейробластоми (МВ).
Матеріали та методи
Клітинні лінії отримували з джерел і підтримували в основному середовищі, доповненому
ЕВ5, як зазначено в таблиці 1. Додатково, всі середовища містили пеніцилін (100 МО/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) і І -глутамін (2 мМ). Клітинні лінії культивували за 37 "С у зволоженій атмосфері, що містить 595 СО», і підтримували в колбах Т-150. У всіх випадках клітини розморожували із заморожених матеріалів, пропускали через 51 пасаж, використовуючи відповідні розведення, підраховували й аналізували для визначення життєздатності, використовуючи САУ лічильник клітин перед висіванням 150 мкл/лунку при щільності, зазначеній у таблиці б, в планшети на 96 лунок. Усі клітинні лінії визначали як такі, що не містять мікоплазматичних забруднень на власній базі. Маткові розчини сполук готували при концентрації 5 мМ в ДМСО і зберігали за -20 "С. Для аналізу активності сполук як єдиних засобів клітини висівали та обробляли із застосуванням дев'яти 3,16-кратних серійних розведень кожної сполуки, диспергованого індивідуально безпосередньо в планшети для аналізу клітин. Вплив сполук на життєздатність клітин оцінювали через 2 або З дні інкубації (як зазначено в таблиці 6) за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного визначення клітинних рівнів АТФ, використовуючи СеїТпетксіо в кількості 150 мкл реагенту/лунку. Здійснювали два незалежних експерименти, кожен з них проводили в двох повторах. Усі експерименти здійснювали в трьох повторах. Люмінесценцію кількісно визначали на мультифункціональному планшет-рідері. ІСво для окремих агентів як монотерапії розраховували, використовуючи стандартну підгонку кривої за чотирма параметрами. ІСзо визначали у вигляді концентрації сполуки, за якої сигнал СТО зменшується на 50 95 щодо такого сигналу, виміряного для контрольного наповнювача (ДМСО).
Здійснювали ідентичні експерименти для оцінки потенційних синергічних взаємодій між комбінаціями сполук. Проводили оцінку синергізму, використовуючи 20-матрицю надлишкового інгібування відповідно до моделі адитивності І оєме (І ейаг та ін., Маї Віотеснпої. липень2009 р.; 27(7): 659-666). Всі розрахунки здійснювали, використовуючи програмне забезпечення СпПаїїсе
Зо ТМ Віоіпіюоптаїсв.
Час подвоєння, вказаний у таблиці б, являє собою середнє значення часу подвоєння, отримане при різних пасажах (у колбах Т-150), здійснених із розморожених клітин при їхньому висівання в планшети на 96 лунок.
Інтерпретацію оцінки синергізму (Зупегду 5согє) здійснювали таким чином: 0 -- Адитивний 55 51 - Слабкий синергізм 55 22 - Синергізм
Таблиця 6
Ідентичність і умови досліджень для 12 клітинних ліній нейробластоми (МВ), що використовуються в комбінованих експериментах . Час Кількість Дні
Клітинна о й - (години) (|клітин/лунка!| зі спол.
ВІМА ІАРМІД5МА) 77777777777717171717171711111110 | 60 | 187560 | З
ЗН-5У- |1/2 ЕМЕМ без глутаміну «т 1/2 Нат 5К-АМ-РІ (ОМЕМ(АТОС) //7777777777717171717111о | 60 | 7500 | 2
Таблиця 7
Представлені значення ІСво при монотерапії для сполуки З і сполуки 1, НСІ. Сполуки інкубували з клітинами протягом 2 або З днів.
Таблиця 8
Представлені оцінки синергізму для комбінації з сполукою З і сполукою 1, НС. Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0. Сполуки інкубували з клітинами протягом 2 або З днів.
Клітинналінія| СполукаЗ | Сполука | ї неї | Комбінаця не Я рестя М енд с (мкМІ Макс Інг (до (мкМІ Фо синергізму синегрізму 8КМА5 | 2 | 84 | 1 9 | 278 | 046 о85К-мрйи | 2 | 25 | 2 | ло | 034 | 006 5ІМА | 2 2 | 0 | 2 485 | 2 | 075
МВ! | з | 99 | з | 1 | ло072 | 4933
Кебу | з | 99 | з | 27 | 962 | 048 ок | з | з | з | 6 | 455 | 09
Результати
Вплив на проліферацію комбінування сполуки З інгібітору МСІ 1 зі сполукою 1 інгібітором
ВСІ-2 оцінювали на панелі 12 клітинних ліній нейробластоми. Три з 12 клітинних ліній, що тестувалися, є чутливими до сполуки З як єдиного засобу (таблиця 7). Одна клітинна лінія проявляла ІСзо нижче за 100 нМ, і додаткові 2 клітинні лінії проявляли ІСвхо між 100 нМ і 1 мкМ.
Усі клітинні лінії є резистентними до сполуки 1, НСІ як єдиного засобу, де всі клітинні лінії, що тестувалися, виявляють ІСзо вище 1 мкМ. У комбінації лікування із застосуванням сполуки З і сполуки 1 викликає синергічне інгібування росту (тобто, оцінка синергізму вище 2-І еНаг та ін.,
Маї Віотесппої. Липень 2009 р.; 27(7): 659-666) в 11 із 12 клітинних ліній МВ, що тестувалися (таблиця 8). У 5 клітинних лініях синергетичний ефект являється екстраординарним, досягаючи оцінок синергізму між 10 ії 17,81. Надзвичайно важливо, що синергізм не залежить від антипроліферативних ефектів одиничного агенту, і в дійсності, є особливо сильним при концентраціях сполуки З і сполуки 1, НСІ, які самостійно не мають антипроліферативного ефекту. Наприклад, в клітинах І АМ-б сполука З і сполука 1, НСІ при 630 нм проявляють інгібування росту тільки на 12 і 0 95 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 95 95 (фігура 10, верхня ліва панель), таким чином, будучи на 76 95 вище адитивності, розрахованої на підставі активності окремо взятих засобів (фігура 10, верхня права панель). На закінчення, комбінація сполуки З і сполуки 1 забезпечує від сильного до екстраординарного синергетичного інгібування росту в більшості нейробластомних клітинних ліній, що тестувалися.
Приклад 10. Ефект іп міо на проліферацію комбінування інгібітору МОЇ 1 з інгібітором ВО -2 на панелі 8 клітинних ліній В-клітинного гострого лімфобластного лейкозу (В-АГ І) і 10 клітинних ліній Т-клітинного гострого лімфоблаєтного лейкозу (Т-АЇ І).
Матеріали та методи
Клітинні лінії отримували з джерел і підтримували в основному середовищі, доповненому
ЕВ5, як зазначено в таблиці 1. Додатково, всі середовища містили пеніцилін (100 МоО/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) і І -глутамін (2 мМ). Клітинні лінії культивували за 37 "С у зволоженій атмосфері, що містить 595 СО», і підтримували в колбах Т-150. У всіх випадках клітини розморожували із заморожених матеріалів, пропускали через 51 пасаж, використовуючи відповідні розведення, підраховували й аналізували для визначення життєздатності, використовуючи САУ лічильник клітин перед висіванням 150 мкл/лунку при щільності, зазначеній у таблиці 9, в планшети на 96 лунок. Усі клітинні лінії визначали як такі, що не містять мікоплазматичних забруднень на власній базі. Маткові розчини сполук готували при концентрації 5 мМ в ДМСО і зберігали за -20 "С. Для аналізу активності сполук як єдиних засобів клітини висівали та обробляли із застосуванням дев'яти 2-кратних серійних розведень кожної сполуки, диспергованої індивідуально безпосередньо в планшети для аналізу клітин.
Вплив сполук на життєздатність клітин оцінювали через З дні інкубації за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного визначення клітинних рівнів АТФ, використовуючи СеїїПіегсіо при концентрації 75 мкл реагенту/лунку. Усі умови тестували в трьох повторах. Люмінесценцію кількісно визначали на мультифункціональному планшет-рідері. Розраховували ІСсо для одиничних агентів як монотерапії, використовуючи стандартну підгонку кривої за чотирма параметрами. ІСво визначали у вигляді концентрації сполуки, за якої сигнал СТО зменшується на 50 95 щодо такого сигналу, виміряного для контрольного наповнювача (ДМСО).
Для аналізу активності сполук в комбінації клітини висівали та обробляли із застосуванням семи або восьми 3,16-кратних серійних розведень розподіленої кожної сполуки або індивідуально, або у всіх можливих комбінаціях в шаховому порядку, безпосередньо в планшети для аналізу клітин, як показано на фігурі 1. Ефекти агентів у вигляді монотерапії, а
Зо також їхніх комбінацій у шаховому порядку на життєздатність клітин оцінювали через З дні інкубації за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного визначення клітинних рівнів АТФ, використовуючи
СеПТпегдіо при концентрації 75 мкл реагенту/лунку. Для клітинних ліній В-АЇ ЇЇ здійснювали два незалежних експерименти, кожен з них проводили в двох повторах. Для клітинних ліній Т-АГЇ. один здійснений експеримент проводили в трьох повторах. Люмінесценцію кількісно визначали на мультифункціональному планшет-рідері.
Потенційні синергічні взаємодії між комбінаціями сполук оцінювали, використовуючи 20- матрицю надлишкового інгібування відповідно до моделі адитивності І оєме і представляли у вигляді оцінки синергізму (Гепаг та ін., Маї ВіоїесппоЇ. липень 2009 р.; 27(7): 659-666). Всі розрахунки здійснювали, використовуючи програмне забезпечення СпПаїїсе ТМ Віоіпіоптаїісв, доступне на веб-сайті Ногі2оп.
Час подвоєння, вказаний у таблиці 9, являє собою середнє значення часу подвоєння, отримане при різних пасажах (у колбах Т-150), здійснених із розморожених клітин при їхньому висівання в планшети на 96 лунок.
Інтерпретацію оцінки синергізму (Зупегду 5согеє) здійснювали таким чином: 0 -- Адитивний 55 21 - Слабкий синергізм 55 22 - Синергізм
Таблиця 9
Ідентичність і умови досліджень для 8 клітинних ліній В-АГ І. і 10 клітинних ліній Т-АЇ Її, які використовуються в комбінованих експериментах
Час Кількість
Клітинна лінія Тип раку | Середовище (джерело) ЕВ подвоєння висіяних години клітин/лунка
Таблиця 9
Ідентичність і умови досліджень для 8 клітинних ліній В-АГ І. і 10 клітинних ліній Т-АЇ Її, які використовуються в комбінованих експериментах сененні тер |некениснтню| чне | «жу ОК
Клітинна лінія Тип раку | Середовище (джерело) ЕВ подвоєння висіяних (години) клітин/лунка
Таблиця 10
Представлені значення ІСво при монотерапії для сполуки З і сполуки 1, НСІ в 8 клітинних лініях В-
АЇ |. і 10 клітинних лініях Т-АЇГ І. Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів
Клітинна Тип раку . Тривалість Поч. конц. Поч. конц. о 8ОР-ВІБ | ВАШ | 72 | 20 | 0078 | 090 | 0025 вал! | ВАШ | 72 | 090 | 0079 | 900 | 0020 94501 | ТАШЩ | 48 | 060 | 0029 | 3000 | 9000 сСовВеСЕМІ ТА 777748 | 090 | 0047 | 3000 | (7500
І болсу,ї | ТАШЩ | 48 | 090 | 0064 | 375 | 0231
Таблиця 11
Представлені оцінки синергізму для комбінації сполуки З і сполуки 1, НС і в 8 клітинних лініях В-
АЇ І і 10 клітинних лініях Т-АГ І. Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0. Представлені початкові концентрації сполуки, середнє значення макс. інгібування та середньоквадратичне відхилення (св) оцінок синергізму. Сполуки інкубували з клітинами протягом З днів. . Тривалість Похибка
Клітинна Тип й Середнє Середнє | Середня й пінія раку лікування |Поч. конц. Макс Інг Поч. конц. Максінго оцінка оцінки (год.) ІмкМІ ІмкМІ й синергізму (бе Іо синергізму (св) 8ОР-ВІ5 | ВА. 72 | 20 | 990 | 03 / 970 / 56 | 04 оМмАСМ-гї | ВАШ. 72 | 03 | 990 | 03 / 845 | 96 | 00 ТАМООЕ | ВАШ. 72 | 50 | 785 | 50 | 130 | 10 | 06 о Кавиті2 | ВАШ. 72 | 03 | 990 | 20 | 820 | ло | 19 вВА-1 |ВАШ | 72 | 03 | 960 | 03 / 1000 63 | 03 вЕ1З3 |ТА 72 | 10 | 950 | 50 | 00 / 88 | 04 о МОІт4 |ТА 72 | 10 | 990 | 50 / 630 | 44 | 01 ТАш-104| ТА. 72 | 10 | 990 | 20 | 290 | 151 | 05 .втЗт35| ТАН. 48 | 20 | 990 | 20 | 320 | 38 | 01 цоису |ТАШЩ І 48 | 20 | 71000 | 20 | 770 | 113 | 06
Результати
Вплив на проліферацію комбінування інгібітору МСІ11 з інгібітором ВСІ-2 оцінювали на панелі 8 В-АГІ і 10 Т-АЇ ЇЇ. клітинних ліній.
Інгібітор МСІЇ1 як єдиний засіб сильно інгібував ріст більшості клітинних ліній АЇЇ, що тестувалися (таблиця 10). Таким чином, 13 клітинних ліній АГ І. роявляли ІСзо нижче за 100 НМ, і додаткові 2 клітинні лінії АГ Ї. роявляли значення ІСзо між 100 нМ і 1 мкМ. Тільки З АЇ ЇЇ. клітинні лінії проявляли ІСво більше 1 мкМ.
Інгібітор ВСІ -2 як єдиний засіб також інгібував зростання декількох клітинних ліній АГ, що тестувалися, хоча він був менш ефективним (таблиця 10). Таким чином, 5 клітинних ліній проявляли ІСзо нижче за 100 нМ, і 2 клітинні лінії проявляли значення ІСзо між 100 нМ і 1 мкМ.
Одинадцять клітинних ліній АГ І. проявляли ІСзо більше 1 мкМ.
У комбінації лікування із застосуванням інгібітору МСІ1 та інгібітору ВСІ-2 викликає синергічне інгібування росту (тобто, оцінка синергізму вище 2-І еНаг та ін., Маї Віоїеснпої. липень 2009 р.; 27(7): 659-666) у всіх 17/18 клітинних лініях АГЇ, що тестувалися (таблиця 11). У 6 клітинних лініях помітний синергетичний ефект з оцінками синергізму між 5 і 10. У 5 клітинних лініях синергетичний ефект являється екстраординарним, досягаючи оцінок синергізму між 10 і 15,9. Надзвичайно важливо, що синергізм не залежить від антипроліферативних ефектів одиничного агенту, і в дійсності, є особливо сильним при концентраціях інгібітору МСІ 1 і ВСІ -2, які самостійно не мають антипроліферативного ефекту. Наприклад, в клітинах МАГ М-6 інгібітор
МОЇ 1 та інгібітор ВСІ -2 у четвертій найбільш низькій концентрації, що тестується, проявляють інгібування росту на 6 95 і 8 95 відповідно, в той час як відповідна комбінація з двох сполук забезпечує інгібування росту на 61 95 (фігура 11, верхня ліва панель).
Крім того, слід зазначити, що синергетичні ефекти проявляються для широкого діапазону концентрацій окремо взятих засобів, які повинні виявитися корисними іп мімо по відношенню до гнучкості щодо рівнів і схем дозування. Як висновок, комбінація інгібітору МС 1 та інгібітору
ВСІ -2 забезпечує синергетичне інгібування росту в більшості (17/18) клітинних ліній АЇЇ, що тестувалися. Надзвичайно важливо, екстраординарне синергетичне інгібування росту спостерігали в 5/18 клітинних лініях АЇ ЇЇ, що тестувалися.
Приклад 11. Вплив іп міго на проліферацію комбінування інгібітору МОЇ 1 з інгібітором ВСІ -2 на панелі 5 клітинних ліній лімфоми з клітин зони мантії (МС)
Матеріали та методи
Клітинні лінії отримували з джерел і підтримували в основному середовищі, доповненому
ЕВ5, як зазначено в таблиці 12. Додатково, всі середовища містили пеніцилін (100 МО/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) і І -глутамін (2 мМ). Клітинні лінії культивували за 37 "С у зволоженій атмосфері, що містить 595 СО», і підтримували в колбах Т-150. У всіх випадках клітини розморожували із заморожених матеріалів, пропускали через 51 пасаж, використовуючи відповідні розведення, підраховували й аналізували для визначення життєздатності, використовуючи САУ лічильник клітин перед висіванням 150 мкл/лунку при щільності, зазначеній у таблиці 12, в планшети на 96 лунок. Усі клітинні лінії визначали як такі, що не містять мікоплазматичних забруднень на власній базі. Маткові розчини сполук готували при концентрації 5 мМ в ДМСО і зберігали за -20 "С. Для аналізу активності сполук як єдиних засобів або в комбінації клітини висівали та обробляли із застосуванням семи або восьми 3,16- кратних серійних розведень розподіленої кожної сполуки або індивідуально, або у всіх можливих комбінаціях у шаховому порядку безпосередньо в планшети для аналізу клітин.
Ефекти агентів у вигляді монотерапії, а також їхніх комбінацій у шаховому порядку на життєздатність клітин оцінювали після інкубування протягом 2 днів за 37 "С/5 95 СО» шляхом кількісного визначення клітинних рівнів АТФ, використовуючи СеПТетгсіо у кількості 150 мкл реагенту/лунку. Усі умови тестували в трьох повторах. Люмінесценцію кількісно визначали на мультифункціональному планшет-рідері.
Потенційні синергичні взаємодії між комбінаціями сполук оцінювали, використовуючи 20- матрицю надлишкового інгібування відповідно до моделі адитивності І оєме і представляли у вигляді оцінки синергізму (Гепаг та ін., Маї ВіоїесппоЇ. липень 2009 р.; 27(7): 659-666). Всі розрахунки виконували, використовуючи програмне забезпечення СпПаїїсе"М Віоіпіоптаїйісв, доступне на веб-сайті Ногі2оп.
Розраховували ІСво для одиничних агентів як монотерапії, використовуючи стандартну
Зо підгонку кривої за чотирма параметрами. ІСзво визначали у вигляді концентрації сполуки, за якої сигнал СТО зменшується на 5095 щодо такого сигналу, виміряного для контрольного наповнювача (ДМСО).
Час подвоєння, вказаний у таблиці 12, являє собою середнє значення часу подвоєння, отримане при різних пасажах (у колбах Т-150), здійснених із розморожених клітин при їхньому висівання в планшети на 96 лунок.
Оцінка синергізму 55-00 -» Адитивний 55 21 - Слабкий синергізм 55 22 - Синергізм
Таблиця 12
Ідентичність і умови досліджень для 5 клітинних ліній лімфоми з клітин зони мантії, що використовуються в комбінованих експериментах зтенелн снеюени те | дюкю Г'ДД" Мтни
Клітинна лінія | Середовище ЕВ Джерело висіяних (години) й . клітин/лункі
Таблиця 13
Представлені значення ІСво при монотерапії для сполуки З і сполуки 1, НСІ в 5 клітинних лініях лімфоми з клітин зони мантії. Сполуки інкубували з клітинами протягом 2 днів
Таблиця 14
Представлені оцінки синергізму для комбінації сполуки З і сполуки 1, НСІ в 5 клітинних лініях лімфоми з клітин зони мантії. Взаємодії інтерпретуються як синергетичні, якщо спостерігаються оцінки 2 2,0. Представлені початкові концентрації сполук, максимальне інгібування й оцінки синергізму. Сполуки інкубували з клітинами протягом 2 днів 2-38 | 20 | 960 | 50 | 250 | пл
ОВЕС | 20 | 990 | 20 | 750 | 5
Результати
Вплив на проліферацію комбінування інгібітору МС11 з інгібітором ВСІ-2 оцінювали на панелі 5 клітинних ліній лімфоми з клітин зони мантії.
Як єдиний засіб, інгібітори МСІ 1 проявляли більшу активність в порівнянні з інгібітором ВСІ - 2. Таким чином, З клітинні лінії проявляли ІСзхо нижче за 100 нМ для інгібітору МОЇ 1, в той час як тільки одна клітинна лінія виявляла ІСзо нижче за 100 нМ для інгібітору ВСІ -2 (таблиця 13).
У комбінації лікування із застосуванням інгібітору МСІЇ1 та інгібітору ВСІЇ-2 викликає синергічне інгібування росту (тобто, оцінка синергізму вище 2-І еНаг та ін., Маї Віоїеснпої. липень 2009 р.; 27(7): 659-666) у всіх клітинних лініях, що тестувалися, (таблиця 14), як проілюстровано на фігурі 12. Надзвичайно важливо, в 4/5 клітинних лініях помітно синергетичний ефект з оцінками синергізму вище 5.
Приклад 12. Вплив іп міго на проліферацію комбінування інгібітору МОЇ 1 з інгібітором ВСІ -2 на панелі 5 клітинних ліній дрібноклітинного раку легені (501 0).
Всі клітинні лінії отримували від АТСС. Культуральне середовище, що містить АРМІ1640 (Іпмйтодеп), доповнене 1095 ЕВ5 (НуСіопе), використовували для СОВ-І 95, МСІ-НІТ46, МОЇІ-
Нг11, 5НР-77, 5МУ1271, МСІ-НІ1І339, МСІ-НІ1963, ії МСІ-НВ89. Культуральне середовище, що містить МУаутоцій МВ 752/1 (Іпийтодеп) з 1095 ЕВ5, використовували для ОЮМ5-273.
Культуральне середовище, що містить ЮОМЕМ / Е12 (Іпуйтодеп), що містить 595 ЕВ5, та доповнене 0,005 мг/мл інсуліну, 0,01 мг/мл трансферину, і 30 нМ розчину селеніту натрію (Іпмйтодеп), 10 нМ гідрокортизону (Зідта), 10 нМ бета-естрадіолу (бідта), і 2 мМ І-глутаміну (НуСіопе), використовували для МСІ-НІ1105.
Клітинні лінії культивували за 37 "С і 5 95 СО» в інкубаторі та вирощували в колбах Т-75. У всіх випадках клітини розморожували із заморожених матеріалів, пропускали через 21 пасаж, використовуючи 1:3 розведення, підраховували й аналізували для визначення життєздатності, використовуючи УМіСеїЇ лічильник (ВесКтап-Соцег), перед висіванням в 384-лунки. Для розмноження та вирощування клітинних ліній, клітини відокремлювали від колб,
Зо використовуючи 0,25 95 Трипсин-ЕОТА (СІВСО). Всі клітинні лінії визначали як такі, що не містять мікоплазматичне забруднення, що визначали за допомогою методології ПЛР-
виявлення, аналізуючи на Ідехх Райдії (Соіштбріа, МО, О5А) і коректно ідентифікували шляхом виявлення панелі ЗМР.
Проліферацію клітин вимірювали протягом 72 годин в СеПТег-Сіо7м (СТО) аналізах (Рготєеда С7571) і всі представлені результати виражали результат вимірювань щонайменше в трьох повторах. Для аналізів сеї! Піег-С1іо М клітини розподіляли в культуру тканин в планшетах на 384 лунки (Сотіпд 3707) з кінцевим об'ємом 35 мкл середовища і при щільності 5000 клітин на лунку. Через 24 години після висівання по 5 мкл серій розведень кожної сполуки переносили в планшети, що містять клітини, що призводило до одержання концентрацій сполук в інтервалі 0-10 мкМ і кінцевої концентрації ДМСО (Зідта 08418) 0,16 95. Планшети інкубували протягом 72 годин і вплив сполук на проліферацію клітин визначали, використовуючи люмінесцентний аналіз життєздатності клітин Сей Пег-Сіотм (Рготеда с17571) і Епмівіоп планшет-рідер (Регкіп
ЕІтег»).
Люмінесцентний аналіз СейПТійег-СпіИоФ життєздатності клітин є гомогенним метод для визначення кількості життєздатних клітин у культурі на підставі кількісного визначення присутнього АТФ, що сигналізує про присутність метаболічно активних клітин. Метод детально описаний в ТесНпіса! ВиїПеїйп, ТВ288 Рготеда. Якщо коротко, клітини висівали в багатолунковий планшет зі світлонепроникними стінками в культуральне середовище, як описано вище. Також готували контрольні лунки, що містять середовище без клітин, для отримання значення фонової люмінесценції. Після цього додавали 15 мкл реагенту Се ТПіег-Стіоф і вміст змішували протягом 10 хвилин на орбітальному струшувачі на індукуванні лізису клітин. Після цього записували люмінесценцію, використовуючи планшет-рідер.
Відсоток інгібування росту та надлишкового пригнічення аналізували, використовуючи програмне забезпечення СГаїїсе (СотбіпаївВх, Сатбргідає МА). Процентне значення інгібування росту щодо ДМСО проявляли на панелі міченого інгібування, і кількість інгібування в надлишку розрахованої кількості на панелі міченого АОО надлишкового інгібування (фігури 15 (а)-(е)).
Концентрації сполуки 1, НСІ представлені в нижньому рядку зліва направо і зростаючі концентрації сполуки З у крайній зліва колонці від низу до верху. Вся решта точок в системі даних являють собою результати дії комбінації двох інгібіторів, що відповідають концентраціям окремих агентів, представлених на двох осях. Аналіз даних проліферації клітин здійснювали, використовуючи аналізатор СпНаїїсе, як описано в Іегаг та ін., Маї Віоїеснпої. липень 2009 р.; 27(7): 659-666). Надлишкове інгібування розраховували, використовуючи модель синергізму
Їоємеє, яка вимірює вплив на ріст щодо тих значень, які передбачають отримати, якщо два лікарських засоби поводяться адитивним чином в залежності від дози. Позитивні числа представляють собою площі зростаючого синергізму.
Оцінка синергізму 55-00 -» Адитивна доза 55 22 - Синергізм 55 21 - Слабкий синергізм
Результати
У комбінації лікування із застосуванням сполуки 1 і сполуки З викликає синергічне інгібування росту (тобто, оцінка синергізму вище 2) в 8/10 клітинних ліній дрібноклітинного раку легені. Надзвичайно важливо, що в 6 клітинних лініях помітно синергетичний ефект з оцінками синергізму вище 6.
Приклад 13. Влив іп мімо в отриманій від пацієнта первинній моделі АМІ НАМІ Х5343 із застосуванням комбінації інгібітору МС 1 (сполука 3) та інгібітору ВСІ -2 (сполука 1. НСІ або
АВТ-199)
Матеріали та методи
Матеріали
Тварини
Самицям мишей МОЮ всій гамма (МО) вагою 17-27 грам (дасКвоп І арогайгіев) надавали можливість акліматизуватися з доступом до корму і води ай ІПрішт протягом З днів перед маніпуляціями.
Первинні моделі пухлин
Первинну модель АМІ. НАМІ Х5343, отримана від пацієнта з КВА5-мутацією і РІ ТЗ диким типом, отримували від Оапа ЕРагбег Сапсег Іпвійціе.
Сполуки, що тестуються, препарати
Сполуку 1, НСІ готували в 55905 етанолу, 2095 ОЮехоїме-7 у вигляді розчину для внутрішньовенного введення або готували в РЕСЗО0О/ЕЮН/воді (40/10/50) для перорального введення. АВТ-199 готували в РЕСЗОО/ЕЮН)/воді (40/10/50) для перорального введення. Всі бо вони були стабільними щонайменше протягом одного тижня за 4 "С. Сполуку З готували в ліпосомальному препараті у вигляді розчину для внутрішньовенного препарату, який є стабільним протягом трьох тижнів за 4 "С. Наповнювач і дозовані розчини сполуки готували за необхідності.
Всім тваринам вводили дозу 10 мл/кг сполуки 1 (вираженої у вигляді вільної основи) або
АВТ-199, або 5 мл/кг для сполуки 3.
Методи
Схема експерименту
Вісім груп лікування використовували в дослідженні 7844НАМІ Х5343-ХЕБН, як узагальнено в таблиці 15. Все лікування починали при досягненні середнього пухлинного навантаження (90
СО-45 позитивних клітин) в інтервалі від 8 95 до 15 95.
У цьому дослідженні сполуку 1 вводили шляхом перорального примусового введення (по) або внутрішньовенного введення в дозі 50 мг/кг один раз на тиждень, АВТ-199 вводили в дозі 25 мг/кг шляхом перорального примусового введення (ро) один раз на тиждень або в якості одиничного засобу, або в комбінації зі сполукою З в дозі 12,5 мг/кг один раз на тиждень, відповідно, протягом 18 днів.
Обидва, як сполуку 1 (виражену у вигляді вільної основи), так і АВТ-199 вводили в дозі 10 мл/кг. Сполуку З вводили в дозі 5 мл/кг. Дозу коригували на масу тіла. Масу тіла записували два рази в тиждень, а пухлинне навантаження записували один раз в тиждень.
Таблиця 15
Дози " і схеми дозування для 7844НАМІ Х5343-ХЕЕ х Дози представлені у вигляді вільної основи
Первинна модель АМІ.
Для цього експерименту 32 мишам імплантували первинну лінію АМІ НАМІ Х5343. Мишам ін'єктували внутрішньовенно 2,0 мільйони лейкозних клітин. Коли пухлинне навантаження досягало 895 - 1595, тварин рандомізували на вісім груп по чотири тварини в кожну для наповнювача, сполуки 1 (по), сполуки 1 (вв), АВТ-199, сполуки З або комбінованого лікування.
Після здійснення лікування протягом 18 днів дослідження зупиняли, якщо пухлинне навантаження досягало 99 95. Пухлинне навантаження визначали за допомогою ГАС5-аналізу.
Спостереження за тваринами
Стан і поведінку тварин, включаючи догляд за зовнішнім виглядом і здатність пересуватися,
Зо моніторили два рази на день. Спостерігали за загальним станом здоров'я мишей і записували смертність щодня. Будь-яких помираючих тварин умертвляли.
Вимірювання пухлини
У мишей відбирали зразки крові шляхом надрізу хвоста один раз на тиждень. Кров вносили в Да контрольну лунку і СО33/2045 лунку планшета на 96 лунок. Кров лізували за допомогою 200 мкл лізуючого буфера АВС два рази при КТ, потім промивали один раз за допомогою буфера ГАС5 (595 ЕВ5 в РВ5). Після цього зразки інкубували протягом 10-30 хвилин за 4С в 100 мкл блокуючого буфера (595 мишачого Ес ВіосК--5 95 людського Ес ВіоскК-90 95 БАС5 буфера). 20 мкл контрольної суміші Ід (2,5 мкл мишачого ідаі К ізотипного контролю - РЕ ж 2,5 мкл їда1 К ізотопного контролю-АРС ж 15 мкл ЕАС5 буфера) додавали в ІдС контрольні лунки і 20 мкл СО33/6045 суміші (2,5 мкл антитіла миші до людського СОЗ3-РЕ-2,5 мкл антитіла миші до людського СО45-АРСЯ15 мкл ЕАС5 буфера). Зразки інкубували протягом 30- 60 хвилин за 4С, після чого промивали два рази перед виконанням аналізу. Зразки запускали на
Сапю за допомогою програмного забезпечення ЕАС5ОЇїма. Аналіз здійснювали за допомогою програмного забезпечення Ріощо. Відсоток СО45-позитивних, живих, одиничних клітин описували у вигляді пухлинного навантаження.
Аналіз даних
Відсоткові значення лікування/контроль (Т/С) розраховували, використовуючи таку формулу:
Фо Т/с - 100х ДТ/АС, якщо АТ » 0
Фо Регресії - 100хАТлЛ початкове, ЯКЩО ДТ « 0 де:
Т є середнє пухлинне навантаження групи, що лікувалася лікарським засобом, в останній день дослідження;
АТ - середнє пухлинне навантаження групи, що лікувалася лікарським засобом, в останній день дослідження - середнє пухлинне навантаження групи, що лікувалася лікарським засобом, в початковий день дозування;
Тплочатюве - середнє пухлинне навантаження групи, що лікувалася лікарським засобом, в початковий день дозування;
С - середнє пухлинне навантаження контрольної групи в останній день дослідження; і
ДС - середнє пухлинне навантаження контрольної групи в останній день дослідження - середнє пухлинне навантаження контрольної групи в початковий день дозування.
Усі дані виражали у вигляді середнього значення їх СПС. Різницю (дельта) пухлинного навантаження та маси тіла використовували для статистичного аналізу. Здійснювали порівняння між групами для кінцевих вимірювань, використовуючи АМОМА з критерієм Тьюкі.
Статистичний аналіз здійснювали, використовуючи СтарнРаай Р'гізт.
Статистичний аналіз
Всі дані виражали у вигляді середнього значення х стандартна похибка середнього (СПО).
Різницю (дельта) об'єму пухлини та маси тіла використовували для статистичного аналізу.
Здійснювали порівняння між групами, використовуючи КгивКаїЇ-УУаїй5 АМОМА з наступним апостеріорним критерієм Данна або критерієм Тьюкі. Для всіх статистичних оцінок рівень значущості встановлювали при р«0,05. Описували достовірність у порівнянні з контрольною групою з наповнювачем, якщо спеціально не вказано інакше. Стандартні протоколи, що використовували в фармакологічних дослідженнях, попередньо не проводили для демонстрації статистично достовірних переваг комбінацій в порівнянні з відповідним лікуванням агентами у вигляді монотерапій. Статистична потужність часто обмежена ефективністю відповіді
Ко) одиничного засобу і/або варіабельністю моделі. Втім, представлені р-значення для комбінацій відносно лікування одиничними засобами у вигляді монотерапій.
Результати
Синергетичний протипухлинний ефект комбінованого МОЇ 1 і ВСІ -2 інгібування
У дослідженні 7844НАМІ Х5343-ХЕРЕ сполука 1, АВТ-199 або сполука З окремо не виявляють протипухлинну активність на моделі НАМІ Х5343, що несе КВА5-мутацію, при введенні в дозе 50 мг/кг (перорально або вв), 25 мг/кг (перорально) або 12,5 мг/кг (вв) один раз на тиждень відповідно (95Т/С 98, 92, 98 або 99 95 відповідно, р»0,05).
При пероральному введенні сполука 1 в дозі 50 мг/кг або АВТ-199 в дозі 25 мг/кг в комбінації зі сполукою З (12,5 мг/кг вв) один раз на тиждень призводить до опухолестазу (95 Т/С З 95 або 6 95, відповідно, р«е0,05) на цій моделі.
З іншого боку комбінація сполуки 1 зі сполукою 3, що вводиться внутрішньовенно, індукує практично повну регресію пухлини (95 регресії 100 95), що достовірно відрізняється від будь- якого одиничного засобу (р«0,05) або комбінації сполука 1/сполука З по/вв. Середнє пухлинне навантаження для кожної групи лікування представляли графічно в динаміці в часі для періоду лікування тривалістю 18 днів, як представлено на фігурі 1. Зміна пухлинного навантаження, 90
Т/С або 9орегресії представлено в таблиці 16 та на фігуру 16 (а)-(в).
Таблиця 16
Узагальнені результати протипухлинного ефекту в дослідженні 7844НАМІ Х5343-ХЕЕ
Наповнювач. Ї111111100 Її (Сполукаї7 50 мг/кгтмаситілапої 77777711 Ї11111198Ї111111111111сСсСсС (Сполукаї7 50 мг/кгмаситілавв./-/://);/ссСЇ1177111792Ї11111111111111сСсСсС
АВТ-19925Ммг/юсмаситілапої //-/-/-:/77777777111Ї7111111798Ї1111111111111сСсСсС (Сполука 312,5 мг/кгмаситілавв./-.:/|/ /;./ НС Ї.77777С799Ї11111111111111сСс21С (Сполука! є СполукаЗ(по?вв).ї 11111181 (Сполукаї є СполукаЗ(вв/вв) 11111111 Ї1111111л1ои1 (АВТ-199 кСполукаЗ(по/вв).д -/-://СЇ11111176Є1111Ї11111111111111111с1
"р 0,05 порівнюючи з наповнювачем і окремими агентами (АМОМА, критерій Тьюкі) "хр «0,05 порівнюючи з комбінацією по/вв (АМОМА, критерій Тьюкі)
Висновок
АМІ являє собою агресивне і гетерогенне злоякісне захворювання системи крові, що викликається трансформацією гематологічних клітин- попередників внаслідок надбаних генетичних перебудов (Раїє! та ін., Мем/ Епдіапа дЧоштаї ої Медісіпе 2012 366:1079-1089). 5-ти річний коефіцієнт виживання при АМІ є низьким внаслідок відсутності ефективних терапій.
Обхід апоптозу є характерною відмітною ознакою злоякісного новоутворення (Напапйап та ін.,
Сеї! 2000 100:57-70). Одним із первинних засобів, за допомогою яких ракові клітини уникають апоптозу, є підвищене регулювання білків сімейства ВСІ -2, що сприяють виживанню, таких як
ВСІ -2, ВСІ -х! і МСІ 1.
Ген МСІ1 є геном, який найбільш часто ампліфікують у пацієнтів зі злоякісним новоутворенням (ВегоциКпіт та ін., Маїште 2010 463: 899-905). Крім того, обидва ВСІ -2 і МС 1 високо експресуються при АМІ. Отже, комбінація сполуки 1 (ВСІ -2і) і сполуки З (МС 1) може забезпечувати синергізм шляхом посилення проапоптотичних сигналів як основного механізму проти АМІ.
У цій заявці нами показано, що сполука інгібітору ВСІ-2 або АВТ-199 в комбінації зі сполукою З (інгібітор МС 1) мають яскраво виражений синергетичний ефект у лікуванні АМІ. на моделі ксенотрансплантату АМІ з КВА5-мутацією (дт РІ Т3). Комбінація вв/вв сполука 1/сполука
З має переваги в порівнянні з лікуванням комбінацією по/вв на одному і тому самому рівні дозування. Отримані результати вказують на те, що комбінація і МС 1 інгібітори будуть ефективною терапією для АМІ.

Claims (6)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Комбінація, яка містить: (а) інгібітор ВСІ -2, вибраний із: () М-(4-гідроксифеніл)-3-16-((35)-3-(4-морфолінілметил)-3,4-дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)карбоніл|- 1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл-5,6,7,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід або його сіль Зо приєднання з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, (ії) 5-(5-хлоро-2-1(35)-3- (морфолін-4-ілметил)-3,4-дигідроіїзохінолін-2(1Н)-іл|Ікарбаноілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2-диметил- 1Н-пірол-З3-іл)-М-(4-гідроксифеніл)-1,2-диметил-1Н-пірол-3-карбоксамід або його сіль приєднання з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, і (її) /4-(4-Ц2-(4-хлорофеніл)-4,4-диметилциклогекс-1-ен-1-іл|метил/)піперазин-1-іл)-М-|(З-нітро-4- (Коксан-4-ілуметилІіаміно)феніл)сульфоніл|-2-(1 Н-піроло|2,3-5|Іпіридин-5-іл)/окси|бензамід (АВТ- 199); і (6) інгібітор МС 1, вибраний із: (ім) (28)-2-((55а)-5-(3-хлоро-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)уетокси|феніл)-6-(5- фторфуран-г-іл)тієно(2,3-4|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-111-(2,2,2-трифторетил)-1Н-піразол-5- іл|метокси)феніл)упропіонова кислота або її сіль приєднання з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, і (хм) (28)-2-((55а)-5-(3-хлоро-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)уетокси|феніл)-6-(4- фторофеніл)тієно|(2,3-4|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-Ц2-(2-метоксифеніл)піримідин-4- іл|Іметокси)феніл)/пропіонова кислота або її сіль приєднання з фармацевтично прийнятною кислотою або основою, для одночасного, послідовного або роздільного застосування.
2. Комбінація за п. 1, де інгібітор ВСІ-2 являє собою М-(4-гідроксифеніл)-3-(6-((35)-3-(4- морфолінілметил)-3,4-дигідро-2(1 Н)-ізохінолініл)укарбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл- 5,6,7,8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід.
З. Комбінація за п. 1, де інгібітор ВСІ-2 являє собою 5-(5-хлоро-2-(((35)-3-(«морфолін-4- ілметил)-3,4-дигідроізохінолін-2(1Н)-ілікарбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2-диметил-1 Н-пірол-З-іл)- М-(4-гідроксифеніл)-1,2-диметил-1Н-пірол-3-карбоксамід.
4. Комбінація за п. 2, де М-(4-гідроксифеніл)-3-16-(((35)-3-(4-морфолінілметил)-3,4-дигідро- 2(1Н)-ізохінолініл)карбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл-5,6,7 8-тетрагідро-1-індолізин карбоксамід представлений у формі гідрохлоридної солі.
5. Комбінація за п. 3, де 5-(5-хлоро-2-1((35)-3-(морфолін-4-ілметил)-3,4-дигідроізохінолін-2(1Н)- іл)карбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2-диметил-1 Н-пірол-3-іл)-М-(4-гідроксифеніл)-1,2-диметил-1 Н- пірол-3-карбоксамід представлений у формі гідрохлоридної солі.
6. Комбінація за п. 2 або 4, де доза М-(4-гідроксифеніл)-3-16-((35)-3-(4-морфолінілметил)-3,4- дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)карбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл-5,6,7 8-тетрагідро-1- індолізин карбоксаміду при здійсненні комбінованого лікування складає від 50 до 1500 мг.
7. Комбінація за будь-яким із пп. 1-6, де інгібітор ВСІ -2 вводять один раз на тиждень.
8. Комбінація за п. 4 або 6, де М-(4-гідроксифеніл)-3-16-((35)-3-(4-морфолінілметил)-3,4- дигідро-2(1Н)-ізохінолініл)карбоніл|-1,3-бензодіоксол-5-іл)-М-феніл-5,6,7 8-тетрагідро-1- індолізин карбоксамід вводять при здійсненні комбінованого лікування один раз на добу.
9. Комбінація за п. 1, де інгібітор ВСІ -2 являє собою АВТ-199.
10. Комбінація за будь-яким із пп. 1-9, де інгібітор МСІ1 являє собою К)-2-((552)-5-(З-хлоро-2- метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(5-фторфуран-2-іл)тієно|2,3-4|піримідин-4- іл|окси)-3-(2-Ц1-(2,2,2-трифторетил)-1 Н-піразол-5-іл|метокси)феніл)пропіонову кислоту.
11. Комбінація за будь-яким із пп. 1-9, де інгібітор МСІ 1 являє собою (2К)-2-1(55а)-5-(3-хлоро- 2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1-іл)етокси|феніл)-6-(4-фторфеніл)тієно|(2,3-4|піримідин-4- іл|окси)-3-(2-Ц2-(2-метоксифеніл)піримідин-4-іл|метокси)феніл)пропіонову кислоту.
12. Комбінація за п. 1, де: інгібітор ВСІ-2 являє собою 5-(5-хлоро-2-1((35)-3-(морфолін-4-ілметил)-3,4-дигідроізохінолін- 2(1Н)-іл|ікарбонілуфеніл)-М-(5-ціано-1,2-диметил-1 Н-пірол-З3-іл)-М-(4-гідроксифеніл)-1,2- диметил-1Н-пірол-3-карбоксамід, і інгібітор МСІ1 являє собою (2К)-2-((55а)-5-(3-хлоро-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1- іл)етокси|феніл)-6-(4-фторфеніл)тієно(2,3-4|піримідин-4-іл|окси)-3-(2-Ц2-(2- метоксифеніл)піримідин-4-ілІіметоксиу)феніл)пропіонову кислоту.
13. Комбінація за п. 1, де: інгібітор ВСІ -2 являє собою АВТ-199, і інгібітор МСІ1 являє собою (2К)-2-((55а)-5-(3-хлоро-2-метил-4-(2-(4-метилпіперазин-1- іл)етокси|феніл)-6-(4-фторфеніл)тієно|2,3-4|Іпіримідин-4-іл|окси)-3-(2-Ц2-(2- метоксифеніл)піримідин-4-ілІіметоксиу)феніл)пропіонову кислоту.
14. Комбінація за будь-яким із пп. 1-13, де інгібітор ВСІ-2 та інгібітор МСІ1 вводять перорально.
15. Комбінація за будь-яким із пп. 1-13, де інгібітор ВСІ -2 вводять перорально, а інгібітор МСІ 1 Зо вводять внутрішньовенно.
16. Комбінація за будь-яким із пп. 1-13, де інгібітор ВСІ-2 та інгібітор МСІ1 вводять внутрішньовенно.
17. Комбінація за будь-яким із пп. 1-16 для застосування в лікуванні злоякісного новоутворення.
18. Комбінація для застосування за п. 17, де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МСІ 1 забезпечуються в кількостях, які спільно терапевтично ефективні для лікування злоякісного новоутворення.
19. Комбінація для застосування за п. 17, де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МСІ1 забезпечуються в кількостях, які спільно синергетично ефективні для лікування злоякісного новоутворення.
20. Комбінація для застосування за п. 17, де ВСІ -2 інгібітор і інгібітор МСІ1 забезпечуються в синергетично ефективних кількостях, які здатні зменшувати дозу, необхідну для кожної сполуки для лікування злоякісного новоутворення, забезпечуючи при цьому ефективне лікування злоякісного новоутворення зі зменшенням в кінцевому підсумку побічних ефектів.
21. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 17-20, де злоякісне новоутворення являє собою лейкоз.
22. Комбінація для застосування за п. 21, де злоякісне новоутворення являє собою гострий мієлоїдний лейкоз, Т-АГ І. або В-АЇ І.
23. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 17-20, де злоякісне новоутворення являє собою мієлодиспластичний синдром або мієлопроліферативне захворювання.
24. Комбінація для застосування за будь-яким із п. 17-20, де злоякісне новоутворення являє собою лімфому.
25. Комбінація для застосування за п. 24, де злоякісне новоутворення являє собою неходжкінську лімфому.
26. Комбінація для застосування за п. 25, де неходжкінська лімфома являє собою дифузну крупноклітинну В-клітинну лімфому або лімфому з клітин зони мантії.
27. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 17-20, де злоякісне новоутворення являє собою множинну мієлому.
28. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 17-20, де злоякісне новоутворення являє собою нейробластому.
29. Комбінація для застосування за будь-яким із пп. 17-20, де злоякісне новоутворення являє 60 собою дрібноклітинний рак легені.
30. Фармацевтична композиція, яка містить комбінацію за будь-яким із пп. 1-16, що додатково містить один або декілька наповнювачів.
31. Застосування комбінації за будь-яким із пп. 1-16 для приготування лікарського засобу для лікування злоякісного новоутворення.
32. Застосування за п. 31, де злоякісне новоутворення являє собою лейкоз.
33. Застосування за п. 32, де злоякісне новоутворення являє собою гострий мієлоїдний лейкоз, Т-АЇЇ. або В-АГІ.
34. Застосування за п. 31, де злоякісне новоутворення являє собою мієлодиспластичний синдром або мієлопроліферативне захворювання.
35. Застосування за п. 31, де злоякісне новоутворення являє собою лімфому.
36. Застосування за п. 35, де злоякісне новоутворення являє собою неходжкінську лімфому.
37. Застосування за п. 36, де неходжкінська лімфома являє собою дифузну крупноклітинну В- клітинну лімфому або лімфому з клітин зони мантії.
38. Застосування за п. 31, де злоякісне новоутворення являє собою множинну мієлому.
39. Застосування за п. 31, де злоякісне новоутворення являє собою нейробластому.
40. Застосування за п. 31, де злоякісне новоутворення являє собою дрібноклітинний рак легені.
41. Лікарський засіб, який містить, окремо або разом, (а) інгібітор ВСІ -2, як визначено вп. 1, і (6) інгібітор МС 1, як визначено в п. 1, для одночасного, послідовного або роздільного введення, і де інгібітор ВСІ -2 та інгібітор МСІ 1 забезпечуються в ефективних кількостях для лікування злоякісного новоутворення.
42. Спосіб лікування злоякісного новоутворення, який включає введення спільно терапевтично ефективної кількості (а) інгібітора ВСІ -2, як визначено в п. 1, і (б) інгібітора МС 1, як визначено в п. 1, суб'єкту, який цього потребує.
43. Спосіб сенсибілізації пацієнта, який (І) є рефракторним до щонайменше одного хіміотерапевтичного лікування, або (І) має рецидив після лікування із застосуванням хіміотерапії, або в обох випадках (І) і (І), де спосіб включає введення спільно терапевтично ефективної кількості (а) інгібітора ВСІ -2, як визначено в п. 1, і (б) інгібітора МС 1, як визначено в п. 1, зазначеному пацієнту. Експресія ВСІ -2 ії МСІ 1 переважає в АМІ. Аналіз за допаногою імуноблотингу показав експресію представників сімейства НОСІЇ -2 у первинних зразках АМІ і клітинних ліній АМІ. НС 2 ї МС 1 білкн демінантно експрасувались на відміну від ВСІ -ХІ, який експресувався в меншій кількості первинних зразків АМІ і клітинних лінін АМІ. Первення АК. кпітинні ліні А що ж я ко вк - 88 В хх ве. не миро пис мих пи з ПИ В шо щошйвощйошй я он я Еш ше ше Еш ше ше ше ше ШОН в он: се ФМ: Я о ом СЯ ж: чи о ЩЕ ОО жо КОЖ ВОСТАЖ ПО О ов заживе о В НВ її 0. дн те йо сени ие «ие МИТЬ а ПОВ ОВ ОВ В ВО З В ВО В ВО ВО ПАРЮН Он чек не зе сно» чен нен жен жене ве Не сне ее пот в ен нене Кос оси М нн К Он
Фіг. 1
Комбіноване ВСІ-ЛМСЬЯЇ націпювання має синергічну активність в КИ. ТА) Серії зразків первинних АДМІ інкубували зі спапукоаю 1 Сблол З ІНСЇ сіль)і сполукою 2) спол ? окремо, або в комбінації і визначали афект С50, що знищує. Не показало істотний синергетичних ефект цієї комбінації в ненпикій частині зразків первинних АМІ. Ж ВІ групах мишей 5 МО прищеплюявали клітинами АВ. люц-яма їі після підтнеддженого віюплення мишей пікували через 10 днів іззастосуванням сполуки 1, НСБ мгкх по у робочі дні - дозування представляли у вигляді вільної основи або сполуки 2 25 мкг в/в два рази на тиждень окремо, або в комоїнації протягом 4 послідовних тижнів. Бведення тільки наповнювача одній групі слугувало контролем. При біовізуалізації мишей в день їі 28 після шеплення виявили памітну супресію АКИ в групах, які лікувалися сполукою 2 і сполукою ії ж сполукою 2. Проте, в З виживання дия мишей, яких пікували із застосуванням сполуки З З спопуки 2, Вупо Істотно збільшеним, у порівнянні з Іншими групами, які лікуваннся, що підтверджує клінічну перевагу двокомпонентної ВК - ФМС націленої теранії г яко. А В Вихідний рівень День 14 День 26 : ій осекО юмнНє ВОС ехо жо | на а о НН Ї --- Наповнювач їх о З ШИ ко ПЕ ще Ох ПИТ Єрки кит х просо соровсюює опорою опо ооо юрвювя МО ВКОНЯ - Шк ши тек ННЯ в Я і я Стелі щ- . її: о с ні ДФ Ф(о( г. нн Ше ше В й росу Ста? Ша 7 й Вино ння нн нн а АЮ чех їх Х Же К я кое опти одесовисвавсови: ПІК : ши ше йо фроспоп п п. її п У чя І й - Он 0. я: ШО а У ль КО С бо іч ОО ОХ ВО З ке У ше жк п ва я . ; гу й С КО миші, прищеплені клітинами МУ ЩЕ а о К ТВ рннтяснтвн ох вірню ; з Наповнювач вай а я : 5 7 Сполука М / Во о ох - Своптжкя З КК их шли Ж Ши тя їм : АЖ й В І РН Стіл р Ку ти сх КК я КУ ш Н 15 ї ВАМНе Ок КИЙ Ж о но. и БИ я чі : ше НА т. БОБ ян годнетнютнюннннрня вок с ї Спелі и Сплолі: кі ЕН щк Я а 2 ЗИ В Ящй 12 К Вні після трансплантації Ще
Яіг. 2
Визначення токсичності націлювання ВО -2 зі слолукаю ті спол; НОЇ сіль) в ковбінації з націпювавням МСЕ (зі спопукою 2 спол 2) на клоногенне (вункціонування нормальних СЕН хлітнин від здорових донорів або пейкеамічних бБластних клітме від пацієнтів 3 АКИ.
Нікарські засоби в зазначених концентраціях інкубували з клітинами і підраховували колонії через 14-21 днів, використовуючи аналізатор беістнтибю.
Колонії нормилізували відносно ДМСЮ контролю.
Сполука ї у комбінзиН з сполукою 2 пригнічує колонісутворюючу активність ДМ без впливу на функцію вормального росту калоній СЕК,
1590 : ж,
Ж | - й а -к т - че осо
Е са май гіда
Е й ж їн ч - АМЕ АНЕБИЯ?
З зро се ше Її 0- АМЕ АНОТООТВО нення ВЕК пт з
В і Во пити ФК, - АНаЗОЛЬЦК
-- ч «и ш су ка з СУ, - АНІОВДІБВО дп - жк - Пветдівав нен кА кіло ж : З - АНЯ ї х - АНЕАТВЯВ в п їх - АНВТ8ВОБО
Е з ;
п 1 то Я, канцентзація спало Слоп Я (МИ яріг.
З
Матриці впливу інгібування на ріст кпітин і синергізму комбінації дпя інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надпишку І сеже (піхаворучі, які забезпечуються сполукою З У конбінації зі спопукою 1, НОСІЇ в кпітинах ПН (ДІ клітинах Тоїеіо (В. ЗА Матриця впливу Матриця синергізму ше Б з Ви її тя мем их мм ке ме Всіх кн з ВН ; я дк ВЛВІКА ККД ен Ж - в у х нк Я зехоннвннки 0 000ту 0 СинОцінка: ш с т же Ї 473 че Кона о ке В ї зво н ВЕ с НК ОА в ке зи ІГе Ех що й ся я мрменнен ен флповува З НК Яеконуза НЯ Дек: 4в Матриця впливу Матриця синергізму Я КАМИ МКОК НМ Би МКК ЕК чі ох ие гЗ 5 КВ ООМИнКии ї «й МО як; її хо 2 ОККО сов БВЯНея жк х 8 б ее панно бо 5б 0 СинОцінка: - т но коном се ен що З КИ г МІ Хо ш х ен ОО ЕН 5 мк В В В Зк КЗ коки Кн я Е шок ВВЕ ОО я ж І З ВЕ В сш 0 ЕБ я 5 флуме ВО ОКО е оленя яка ВЕ : фоовувяи і НЕТ ІМКВВ беонуха 1; НО (ні
Фіг. 4 Протипухлинні ефекти сполуки 1, НОСІ, сполуки Я ї комбінації сполука 1, НСІ ж сполука З на моделі ксенетрансплантата Кагразе422 лімфоми у щурів.
Й. С й Кг ве ? і яо їй Ж ту Зах НЕШЕВ г З г. оч Наповнювач я Наповнювач, па Е я нин й КЕ я Сполука З ДО гг я Наповнювач, пжй з СУ г я -к Наповнювач є сполука 1 З БО МЕР, п-й ше м щ А ке сполука З об вик е Сполука З ЗО кг, п- я Х пк т КИ ІЗ К що КИ з зма нан ана анна знан знан ван що тб 3 25 35 «й 55 5 ша БОБ же ща бЕ о Вк МЕНЕ гежзлкя; герані дове і ре
Фіг. 5
Зміни маси тіла в тедрнн, яких лікували із застосуванням сполуки 1, НС, сполуки З і комбінації сполука 1, НСІ - спопука Я на моделі ксенотрансплантата КаграєеЯ2? пімфоми у щурів. т їб ш - г їжи ї «вт іі Ко й Дд їх. Ж ЩЕ Ен н- е Кз й -й й що Х 1: аа г Ж в-я НЕК Зо ЗІ 7 Х о ЗХ жк Квя Е: 31 - Наповнювач є Наповнювач, п-Я у -- Сполука З ВО мМоЖг є Сполука З БО МОЖЕ, п-В -й Й -їд й в Знеятин ! в 5 зв ж ж се» З 35 45 Я5 ЩІ 85 БО б5 70 тв ЗБ ЗБ Ж Дні позлкя пери доми
Фіг.
6 Протипухлинні ефекти сполуки 1, НСЇ, сполуки З ії комбінації сполука 1, НсСІнсполука З на моделі ксенотрансплантата СІ ВСІ Тоїедо у мишей.
ЖК. Ф ї е вк. . ші снчнйє Наюинева по, ве шою. шох зе Єпопука ОА влкг, па. вв Ж - В. ве . ю яв Щ с Ж Е: що БИЮлуКН Я Мо МИ, ВЕ, Ж и - шва ей - зи ша з. щ ж ГУ Е ЗАКО де тео зок СТЮ КИ ЇЇ З Сполука хіп Ве й ХВ), ВА а: нн В няня ск ШЕ в В виш що Я ві
Тв. вав 85 35 жо 38 Я Дн після імплантації ж ВОНА Вди. наловнювкча ВМ відн. наповнювача, стопу ТЕ НО та уки З хх. ЧНОЇ зміни наси тіла у твеарнн, яких лікувапн із застосуваннян сполукн 1, НСІ, сполуки З і комбінації сполука 1, Нсінсполука 4 на моделі ксенотрансплантата ПІ СІ Тенейо у мишей
- Я. й хи КЗ. Наповнювач, по ря Е в Бий зе ВрОлолука З ОО Моб, по, ДН ща --е Я Ж з «фрак ю. - - ку году «че з ті Ще р но ви ні кн й ще Ко сессодюе КЗ ЕХПЮМТИКЯ Я в спопуюа Зло, я. ЗЕ хві ва р 8 Ше що Кай Мен Ук х и " 1 «а : : : я З да 35 35 38 454 Дні після імплантавні
Фіг. 8 Матриці вплику інгібування на ріст кпітин і синергізму комбінації для інгібування росту клітин ізліва| та інгібування надпишку І оее іпраноруч), які забезпечуються сполукою З (МС 1 інгібіторі в ковбінації хі сполукою 1, НОЇ (ВСІ -2 інгіоїто рі в кпітинної лінії АМІ ССІ-АМІ З у двох незалежних експериментах д Матриця впливу Матриця синергізму се й ХХдНннннни ож . ЩЕ ОМ прово ЗВ ші ще о Кок КО ВЖЕ ОНКО НК ї Ех шо с ї З Ж ВК охо ново В КЕ ХО Я поту : ШО й с 00 ЖЕК г і шо 5 БОБ 0 Оцінка ШЕ оно ви 5 В 5 ЩО сятічкии шия ШЕ; г. п ї пвавтну: я ж ВШ шк 4 я -х.. ВН пок и ї ВВ я ї хЕ - ТОН МІ " фа й : В : : З. : : : й по пкт не Е з шЖЕ посдюх пи - : ВЕ інсбітов ін ВЕК іктібітор ней Матриця впливу Мадриця синерріома ни и п В Ос ЩЕ 5 ЦІ 00600000 (ШЕ . зи 00 НО ш 000000 ШЕ Оцінка : : ВОМ ою М В НН ї: шк ши - 7" ВЕН | Шо сни, ВД ВібЕтодв іваВВ: ЖК інтебітою уБЕиЕЕ
Фіг. З
Матриці єпливу інгігування на ріст кпітин і сннергізму комбінації для інгібування росту клітин (зліва) та інгібування надпишку І вежа (праворуч, які забезпечуються сполукою З ІМС 1 інгібіторі в комбінації зі сполукою 1. НС (ВСІ -2 інгібітері у клітинний лінії МБ ГАМ.-б у двех незапежних експериментах (Мі: верхня панель: М2: нижня панель. д Матриця впливу Матриця синергізму КО КЕ як Е М о че НН ко Е - ВИН ОН о В з «ВН В а їй п ВООВЕВВОЯ МО З В ї Е : п: Ж С - : зів Оу їх г - » -- ВЕ о ОК щ ПЕ ВВ ВО НО іїнка з БВ ше: Фо Б Очінка шк 00000000 ЕЕ, еннерпяму: Е ж: МО з хо нн М МіО Г-- М ММ ню В ши ої й її - ПЕК - п нн Мох ИМЕНИ х ВИНО Е: ва оті тк зх п Б шо ро : х З - Ж ВЖК інгбітсв зяай ВАК вет зва В в Матриця впливу Матриця синергізму Е ХО ПЕШКНТИИХ дно В НИКИ ве шо 5 Ба Е ще о 5 з ї ш 0060 Е 5 НН я ми 05 в ВМ Оцінка - Ж ВМО 5 ВМ Е з ШЕ ШЕ с: 00 з" шк: сі Її омнергму;
Е І. 00 ШІ п ща. ш Кох М2-ї8 23 ЕЕ З 5: хх ІІ ве 5 МОН зов Ба ее З а М х "о НН хх Шо хво зх ШЕУ Ки ше лі г : | ї ї м м і : КУ БО жимтор їж Вже вибітос іх
Фіг. 10
Матриці інгібування впливу на ріст клітин і сннергізнму конбінації для інгібування росту кпітин (зліва| та інгібування надпишку І осзче (праноруч), що забезпечуються спопукою 5 (інгібітор МС Я; в комбінації зі сполукою 1, НС йнгібітор ВСІ 2 еЕ клітинній лінії БА І МА! М-б в двиех незалежних експериментах (НІ: верхня панель; М: нижня панель) Матриця впливу Матриця синергізму ПИПИДИПЛИ они, ПЛИНИ ОВ
З. - ВОМ -НЕВН НК ОК З ж ї Ка В ВО НИи І; оо її. в 5 Е. Оцінка ; ж 0 ОНИ з о ТЕ і х шнх Є 11110000 5000 синергізму: з їх ВИН я у хх ЩЕ с З в щи хх 5 с: и. 0 І шШ а НН. шо. и ОБ ння ши вн як вні ЗАБЕ впоєтев бю Ех зе уеріх Матриця впливу. Матриця синергізму о в НО . «ЗВ ОКХ - я Б овоч в й с о. с - 5 МОМ Кк КІ с З я дні :Е УЗ оно ж з 5 - ВИНИ с ї є чанка ку в І. ши сутки зах - ж ВО и ок В ш ВИН . БЕЗ сянергіяму: ре У. пон ОВ жк ВЕБ . 5 ла вт Ей ВІ хе Каетад? й 505 с Пс вх е 5 шиї нн В - - ВЕ «ВОМ МВ ВС вні інн В інтер інд Чі Матриці єпливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації дпя інгібування росту клітин ізліва| та інгібування надпишку І оехже (праворуч), які забезпечуються сполукою З (інгібітор МІ 1 в комбінації зі сполукою , НС! інгібітор ВСІ -2) в клітинній лінії МСЇ 5-13. Матриця впливу Матриця синергізму - 0 ЕНН А пе 5 Щ У ОК ОВ М ВЕК ЕЗ Ж щок М З о в ї я чо і. ше їЗ грднкх й ТИ КО я 1. Я ПИТИ ОККО й Ж х МЛК ВЕ ХХХ ОК КК : МУБУМ ТЕМУ ши с 5 ї п. | ях ух ОК НИ о Я З Я ОО КИ ВННИНЙ о. Я Х. КУ с с Я що с є В М с УКВ СХ Те п ЕК МЕ ОБОВ ЕВНННН МО ще з с тик ее з Я ви Е У КеЯ У -У її Ж ОС - Без інгібутер мк) Най апетор які
Фіг. 17
Матриці вливу інгібування на ріст клітин і синергізму комбінації дпя інгібування росту клітин (зліка) та інгібування надлишку І сеже іпракоручі, які забезпечуються спопукоаю З (інгібітор МС 1) в комбінації з ДЕТ-199 (ВСІ -2 інгібітор є клітинній лінії АМІ ОСІ АМІ З в двех незапежних експериментах (НІ: верхня панель; М2: нижня панель). Матриця впливу Матриця синергізму ПИ ПК ВОВНИ 5-0 БОКУ «В. нн. у ч ПЕШНЕШИНИМИНИХ : : : ще 7 й Я ПИТИ ВВ Я хЕ шиї ншШшН а: ШЕ Бе я я ВОЗ мое мото г 7 ВК в сх
З. б ППИЛИПИНИНИ я у ПИШЕ. ПІСОК Е Ех - в щЗ о мошок ме - Б нн. ї Оцінка ши Не | ше 000 ВЕН я ки ВОВК В їх х ШВОМ ООН У ж ЗВ с том в Бшш с з н ш Ж ВОМ я г: я: « ВЕНЕНННО ННМІ о ВИМ ме М " ВОВЕенее ВАсь інгібітор інн Во інгібітор (ннію ! пичзжее Матриця синергізму Мат риця вплив У : засн Гриця си зво ненявннвня у ШО шк «000 щ-к о БОШ МО Ве УК: х У КК ВВ ! ще КО ЩЕ - ВО ОН З ш шо ШО У ж де ду т ЖЕ « : ШО ООН чо Ж в то ВИ ВН о зей - М ВК я ому кі ох ИН о КН її дізк ш В що ях ши (ШЕ Оцінка з мо В ПЕШИЕШИЙИЙ : нео ПИЖИ ТІКИКООВЯ ї хм о ви | М - с: хо : синергізму: дО КМИН х пов ПИШНИЙ КИНЕ ПИТИ не й ж Б облі в нет ЕЕ З ЩІ зн 5 ей :- я Бе не НИ ї я пон ЖК ся -к р КН пе п ся и х м що де й ій їй ЯоеЯ інгсе кор; дяк Не вгійсторівкв) «Фіг. 13
Типові матриці вппиву інгібування наріст клітин і синергізму комбінації дпя інгібування росту кпітин зліва) та інгібування надпншку І овуе (праворуч, які забезпечуються сполукою У Пнсібітор МС в ковібінації зі сполукою 1, НОЇ (інгібітор ВС -2) в клітинних лініях АМІ. іклітини Мі -2 в АД ї ОСІ-АМІ -3 в ВІ. д Матриця впливу Матриця синергієму п ще пт ж « ООН сх Я ВО о ко жене юю З є В сх - ї 5 пох он у | 5 «ВН я. о оо ов В ЗК З МОНО ВЕ кі ве їцка ше Ще БЕН с п. о В Оцінка МУ Сх ВОМ ми т ФО ВОВИХ Мних 77 ЗВ НЕ х же ша 0550000 еввну
5 є. ЩЕ: с: 00 МІкТ В ш її и ї00 НЕ ш-б 0 0 ВШ С . с і . ви КОЮ а " ВІН Б ще ПЕК ПК чі под В их ши Ж сі: найвхвв МКМ МОЖ р т ї Восени ВО інавнов ай; паалоаааладааоаааадааоаа аа аа аа аа аа аа аа аа аа аа аа аа аа аааааааааааааааааьс в Матриця впливу Матриця синергізму Еш ен ШУ ко ВЕ КЗ М і А и 5 ж І що щоЗ ШОК МО пж с ло шли 5 в Ме МИМО т Е оті жьуст У Ж КЕ Ви ШЕ В «(ВЕЖ пн в В | ганергпму ох я шк Мат то ШЕ 55 ВШ 5 . о ов КЕ мавки ши г ш ощДБЕ у - нн - ВОМ МН - ВО " Ваня що 5 ши ін то о " че 7 й х В-? взійворінка; ВСЯ ооихумімк
Фіг. Я
Дохові натриці для інгібування (зліва), інгібування надлишку І ве (посередині) та інгібування росту, які забезпечуються сполукою З (МС Я інгібітор) в комбінації зі сполукою 1, НС ВСІ е-інгівітао рі на панелі клітинних ліній СІ С. поет каккхнеки ат мене ТОЛІ Аа ОО ЗНО ваза мАНІЗНОМІ дб ТОНЯ не В о я ШИНИ и ДИ ТИ ТЕХ, в . ОК З КАК У що КК в о в ФА шо КВК тд пт БО ода М де Кп ЗВУ ЩЕ ОО й о В ТКА ВЕ ПДВ Ж ЖЕ ЕК ВЖх В З ТК ВЕК КК о ЗБК: і гЕ ж леЗ УКХ КВ ОК КІВ В Фо Кс п ти Ж с й Ж ОВ х є» Ох щих о ЕВ У Б. ВО - й ЗЕ їх вв с 5 Обом; ча ї ЕЗ шк 00000000 КН 00006 ШЕ 00000000 8 ек: 1: Ел : сі м ОК По Х ї А уд НН. Ез- й 3 СД в Зм еВ ооо ННЯ ТЗ КК а ЖІ ж ее и се пов НІХ г т 0-х ши Со ЕК КВК ВВ й я І ЖК КК Кк УВУ І пн а ? ЕЕ. ОМ НМ вай а: ще М о о Не я шк с Кон У УЗН З ЧНО со Ок Не А ООН ЯН ее п ПИ Я вх Нв а ОМА МС Швканука НКУ КА Кпллука З, НЕХОНЕВІ пеки СТЕ (Я Яцінея симергізу бе ПАК ЇВ ЗОЗ ИМоя ЗАЖМУНОМІ СН 123 273 зезвнісв ВАННІ ВО ЕН ВВ ДИ Ан ЗАБННЕНИ СПО ХОМЕКУХ ПК З КК МАМО ЕН 0 я ОКО я жк Ж пе ОС КК о Зоні. с 5 Вемі 00 бівтоєт ю мом 05 . ШЕ 0000060Й060Й0Й0 0 ШИ 5 Еш 0 Ж дм п У г У він Ве Е Е МАО КІМ ЗК ОСВКЕ то «5 с ШЕУ п ; : ц ВАН ее ке ОН Ж у: ши рр КВН з НН НН НК с прое доли ЛУК КЕ то В о ій СОНЯ ге В 5 ; ИН Я ж г, МОНА " т. пн ни Шалена З, НОЇ ТьНОМЖ: Шванукх З, КС пах; шнатпунх ї. НОЯ Єцічжа синергізму ов ВІ 33
Фіг. 15 їаї
Дозові матриці дпя інгібування ізпіва|, інгібування надлишку І свуме. іпосереднні) та інгібування росту, які забезпечуються спопукою З ІМС інгібіторі в комбінації зі сполук НО ВСІ 2 інгібітор) ЇМСІ 1 інгібіторі в комбінації зі сполукою 1, НС (ВСІ 2 інгібіте рі на панелі клітинних ліній СІ С, МОХБ ЕХ БАчеНемЕ КЕКС ВІВ УК АНОВЕВІ НН ГЕНА ЖЕО ЗХ ЗАМОК ФІ МСККЕ В зві шо кош о пиво БЕ ШО за зе Б шив и В-ВО 5 000000 ще С її: пе Ж ТЛА З вв о Я ША М Х КУ НЯ ее гДгюДюДЙюЙюЙЮ00ш ЦБ Еш 00 ХУ КК ОАЕ ша КА ЖЕ Ме КК КК БУ -к що ВЕК шаг КК Ки У Ж нт ос т к ВОМ А ши Ж 00000 ШЕ 0000 ЕНН о 5 й 5 ан БЕ нин п в я М Ох с: ВЕВНЯ вх СОУ Сблшнивот і жів яю 5 и. "З ша ЕВ й Ше дея : о ПМК Я ДЖ дл. ТОК ОО плит дю ще то Ко дк Кок Ж шуй й С ннношнн шкня 5 Й .ш: в в г" ЖІ ЖІ ви ке Соло но не НН з дощ шкокмо хх ово нан сна в ши М ЕЕ ШОН З ЕЕ Не: Еткелики 1, НК за блопекх ї, НОТА Юаепукх З ВСЯ В Оціни симергінку і деже ПАК ЛВ ТПХВ-Я У ЗАМКОМ ПОЖЕЖ Е ВНАУ зозчава ВАВЗНЕМЕ ОК ВНУ ВИКЕ ОЙ АФОММІ КІ ЗНЕУХ іі Ж о тт КН ВЕ во о КОНЯ плх ВЕК ня 5 ант у: ю ГІ ОКХ ВВА Еш 5 пн Мк на о о ВВ ш- з Ши ЇСсС ши ша З о В хе НК МКК . ха ВЕЛНИТК ик иа Он те Еш 53 ОО щ-о . 0 Еш шен 000 Бе С ок КОД КОКО ПОКИ Ж і ТУ я ва ї ШИПИ БОБ - Шин ПОМ Ж КІТ ОО ВВ В «нн вн жк 5 Б с шення п. БЕ п В В НИ ИЙ 0. т в І ОЗ МлЯХ В ня о г З пах ВИН - х шоків: х о з 5 5 ОК Ки КО Ко х ВК В щодю СИ нн нн ВК шин: с ї Чен вав кеш о ОВ ОК зн М тн КН х ОО ТОЖ КА Я в - ВО ІМС ЕОД ТВ Я Те - ПИТВО КОСІ . Ж ? пн 3 ї - 3. 5 У І а - жов жом Я ее А НН оо НЯ ше Осо кЕ ФЕО Же Ле йЖ сах Ах ох От Сполука ї, НО біалека З БСК ав швсолука 1, НК (жк Сннка синергіому вве АК а
Фіг. 15
Даозові матриці дпя інгібування (хліва), інгібування надпишку І везе іпосерединії та інгібування росту, які забезпечуються сполука з ІМС 1-інгібітор; в комбінації зі сполукою ї, НС (ВСІ -2-інгібітея на панелі клітинних ліній СІ С. чесні кек, же мк навняютнн рвеглет зона БАМОНеМІ БО Ух т ВО КВ КО ВВ ес ОВК НН НАННЯ за и зей ЕЕ зах віра вояов ОН ї і ех ВИК ВК ВН к НИ шу КЛІ ВК НВ З ше ХК КО ВНННН, «хв в у ді козаї Ж і 'яЯшиИи Б - Нкшшнн шне ОЗ зе я деп ані я Бі їй п в. и 000 ВН ОО ном ни вм ан мо М Й ши 5 М ши и ше МОН З ї - Я з о ОК Федишин пін МОесцині ВХ ОВЕН ша 5 І НД НН их її З заро мІ ЗІМ ЖЕЖКІ іяВ І. х З В 5 5 ОВ ння В ши м ОК ВО АЮ МЕ Ко Кт Я и в КН НН: 553 хх ВЕ зи ,ОЦМ МН я М ссх воос ово нн с вон - неви йе ї а я тя, ОКО ко кОм -ОДКОО ще сджо ко ОС ж ся У Во Свалява ЗНО які Сполеюв ЗНО іа Шівронтена З, НЕ в Хіна синергізму г ешее МАМ ОХ ВККЕЕЕККУ В Ж УКВ ВЖНЮ ОК 1 ЗОЖНЕЕКВ ЗНАКУ МАМИ КН: ЕКО СВКЕКВН Я КАВНЯЕ МЕТ сю; зе КОКО виш вк ОО о. Он вн нн ПОМ Ж ВИ ВОК КК Ху дах ов ож ші ш еко | о. і 6 КО ин В ОХ В ее ВК де КК ОВ ни У ка ЕЕ Ж Е «В о: й во З ОБ ОО ПЕ КІ РОН: 5: У КОКС хе Мам 5 ОК п В ОН В де ве. ен 0 її Зно ОА о ни ї Гой Зо . . . : х КАК зма о мів 8 зе о. ї Е кає 0 - Е Е КО ОКО : КК ще пок оо 7 - ан т СТЕ БЕ ЗК 5 І ЕК ее я КУ в дк В ес х: КИ пн я я нин пня ши ник 7 і. т : МО дО Ж як й о КК ОК Ох ж М ШО дО м Сполука х, КД ник Юелелукт З КО КяКАУ бпеляевх , НО Зах і Оцінжа симергізну і пеже НАХ 132
Фіг. 15 (єї
Дозові натриці дпя інгібування (зліва, інгібування надлишку І веде (посередині) та інгібування росту, які зайезпечуються сполукою З ІМС 1-інгібітор) в комбінації зі спелукою 1. НО (ВС -2 інгібітор на панелі клітинних ліній 5 С. ФІН АРМ НЕ ЕВ В ЛНВ вм панами рені НК АКНЕ ИКХ світ віти ЖЕ ВЕУ Ж ДК ал Кю, г МЕ ех КЕ СО В ЖЕК ЗЕ ХОББІ КН ЩЕ БЖ ІІ: ВІКІ ВИ х ЛКК, АК ЕК х х ЗА И ДОВ МК ЗВІЛОЕНВЯ лек ЩЕ п на и в М я ВВ -к ех ро ос й
С. вн, мав жодні В ї ша ох КН ЕН ВВ зак ов В Е З Кіт 8 З. 5 ПІТЕР Ох і Хе Й тку зно вн а оо: ї Жар із чо шко и ОО НЕ вх 5 Ж ами о Я Он они нн и м р ХХХ нн ня ; пос ви т» Ко ОК ЕС, гу Без в ВОЗ ОМ КОВКА ні Ж 5 пек ТЕО К ОК ОВ жк ЗаХ Ву І: ї і Ки ВВ о С НКУ Вик ооо у МТВ І ЖМЯ БВ . Х ЯК В о МОКІЯ ї 5 а Шона т те . ДМК НОЯ ї я НЯ о. не ПІБ В я В ПЕ ТО ВИК й ПЕК. "660 гГНн Б жо НИК. Н ї ї. ЗХ ИН ВХ К ХХХ х вне зх Й й Пе ВВ - я ККУ НА аа се ВК сі ЗК ОО ЕІ «3 о ЯН Б. ЖОРЖ ЛЬ ЖИ ГЗК ХХ МК пиши ЖК. Б а кан нь БУ пе ІД ІІТ Х. си С МИНИК, же ; У о БУ є є п НН зн и я хя - по ЖЖ ех ШКО ЖК ЕК еко МО М ж Дону З, ВСЕ яку бролуюх в СМ Ствотука З, КС (вк Єінкх скнергізму і овжше ПАК ЗВ січки дек ва гачку Ми Ея Замов ян УНІ ЖЕК В З ЗАМОМУМІ ВИ ВЕН Ж УВК ОВеза ЕЗЖНЯМХ ХеЖ І МНН зе ні о ВСЯ 7 дин нини дитя ідесвн Пс п КН КА о НН між шві аю іі ст ни, шо БО фЕБкоОВ еВ ї- «сх ВИН На зам мощів м ІВ ОМ 0 дов КАНЕ ДЕва и я я 5 Коко о АК о КК Кн г зх НОВ У зано іак За 5 МОЯ ех МОЯ СЕЗ ЕЕ КВК ЗХ р лк ск пек е ваних ОВ Зх З ОО З ХУ е НОВ С Ка Ж пі зи: ЗВ В Е Б ск ку ВО ОО НЯ В. дю Ве ж Х ТТ дек ийнн нний ЗВАНА ЕІ із Ан ня Ки ж 5 КК КЕКВ ЕЕ Ж др я м о ох я х ОХ ХМ єю хх ВХ ШЕ Ж т ШОВ СОУ ОВ М ох - ПЛІВОК СОМ ї що ВО я СЯ КУ згєгегсєтєкекивекккк я ж Ж ВОМ Ж 3. З ве ІЗ Халат во ЗК Ох ями НН 5 а: МОНА ВЕ. З М а ВІ КК КУ дО ВЕ ОК ІМК ЗХ З ПО КОКО КК бе КУ ОО НВ нах о ще п и я З 5 0 0 МОМ М ду ам ОВК НК ОЦ ОХ пет ВМ ня 5 СТИ пи в м ОСНО в ВЕУ ОО я ОК в В «КН стю з ОКО КК па ОО с шо шо ко до ок КОХ ол ж ково КО За І й ж С НЯ В ща МОЖ я лох ОН ни У КОЮ ле т зі ноз Шпола ї, НС КІ Швотужз , НК (вк) Свовука 1, НС аа Оцінка емнергікюм С осже АК ТА
Фіг. 15 (ЧІ
Дозові матриці дпя інгібування (ізліва|, інгібування надлишку І оеже іпосередннії та інгібування росту, які забезпечуються сполукою З ІМС 1 -інгібітор) в комбінації зі сполукою 1. НС (ВСІ 2 -інгібітарі на панелі клітинних ліній ЖІ С. дк дя ОАМЕНІМО ЮК МЕНЮ ВИНИ Х Вам і МУК УМОВ ЛЮК ХУ БЕВОМБН ДОФІ МОКНЕХ ДЕ в «а ооо ох А Кан ТЕКИ МК ВК ВЖК ВМО Я тям ОО РУХОМ о кеВ ОО сан нов ние Я шо ОН шУ КО З БО МКУ ВК жі я кка ши х З нн І ОО ОО ще З сх о о ан с БК Ве а В НЯ с БЕЗ о. СЕ | ЖК В ВМО У Я СКК нти вт ДЕ З КОКО дах а зу КК океан нн т ОВ Ж гум с ков жі р ові о. я БІ Б. ОО ОН НЕ Е а Ос не мн о ж ОВ КВ че ПО КК ее с МКК ЯК вка я 0. 2 Ес «х се З З щі НН ш-к 0000000 Еш 00. М (ЩЕ нн ши 550 0 Б щі! ХА НО ЕН ВЕС под шо що охо МО є оо щоко ВХ А Не ННЯ Стели 1, НОЇ же бвотука НО вк і) Спелеукз ї, НО інве Оиняз синергізму і сеча ПАХ Я п А НАВ "ЖНВИКВУ вам чех ЕСЕ ВНа ВЕНУ. КАНОНУ ВІ ВЗН шк М в иа в з о ВАНН ж: 5 ВО Я М Ов НН ЕК з ВВ ВВ ка п 5 не о. г: ЗИ т-во узи КК ад а шві В АК пу КАМ 00000 Б пк --000Е зх 1 з' ЩЕ: ОН ВОІВ ж З км Я де В їх сх ВМ Б х ях ОБОВ ПО Е Її -- сн о ши 0-5 НН г в В ВЕ: дк вл І с
Е. ше Я ШЕ НН ЕК Тв ши . о а Х ШО НЯ і ЕН 5-5 8 ЗОМ КК ВІ З й КОЖ кокос ИЙ «М ОК У ся НО а о КК ЕВ Х Ку й: Е ОВО МОЯ "ж ЕВ М Ве Коволтука Є. СЕ вАВІ смволуки ї, ВДЕ ЖВ Євноєтука З, НОЗІ ТБ Єцінка евняергізму і олууа МАК Я УВ
Фіг. 15 (ге) Протипухлинні ефекти сполуки 1, НОСІ, АВТ-1, сполуки З і комбінації сполука 1, НОЇ або АВТ-199 кю сполука З на отриманій від пацієнтів моделі переннної АМІ НАМІ Х5343 у мишей. м 00 свв ме Щщ й Ос вннвй й зад Капавнуевяч за Р В що Й Знай ее Сполука Ї Зб т за вн хо Гу і а х стев КД
В. я і жна Сполука З ЖЕ знівг ав ЕН г во й й Е
Е.» Я же відь АВТО нив зх РН Зк КЕ й ж в Р ; жов й 8 «0 СЯ явне брталука З 12,5 мижг вв ЕВ й є КЕ ін Сполука 23 Суюмтуюа ЗЗДИІ, 5 побвву Р г КУ і З є ох о ін мот ей сані з мефюн Суотплуха їЕ рриука ЗМІ Ж ввівві ЕН ІЗ я КО ан БИК ; пе о я Шк : Ве ; не ДДТ ЩО Є Сполука 3135135. поївну ЕН як жа рес а Ден після ллантяці т ве ОО відносно маповнювача і зхремих агектв ДМОМА, зритерії Тьеюі тк д є ОБ вудносмо наповнювача, оивемих агентів і пегва кемонаці МАМО критеви Тьюшжо
Яіг. 16 (а)
Протипухлинні ефекти сполуки 1, НСІ, АЕТ-199, сполуки З і камбінації сполука 1, НСІ або АБТ-199 ж сполука З на отриманій від пацієнтів моделі первинної АМІ. НАМІ Х5345 у мишей. День 40 пухлинного кавзитаження ше ЗК заийкодрдх соки га зак ЕЗ Е : 50 з т В з ж Зк - с в --- ще яко Ка КИ Й І вхсв ще ож че «й мк І й х Ух ОБ віднено насовнавч і время зкенте ЯМА, дені; Тех; З. Е У й о я я, С як а те ОХ ВКОНОсН МПОВНавона, ОБКЕМНАХ Кант і пове КОХ АТМ вино уи ТЬУМ кН З НЯ КЗя Ку ок І Ки Я Я я ш ШИсИ р хх й Я «Фіг. 15 (Б Порівняння теплокарти чутливості АМІ 4 СОЇ до ВНЗ мішети чна монотерапії, або комбінацій лікарських засобів іпротестеваних при співвідношенні 1:1), відносно хіністерапії йдарубіцнні після впливу протагом 46 годин. Представлена життєздатність кпітин кожних зразків первинних АМІ черяз 18 годин в ДМ. еанійций Х Ве Ек ІМ ВВ ідентифіканійний ки нин и ве ме НК номер ВМ. ЕТНО, ЕЕ Сл: ТАКИ КК їх ЕК З І з ИН ОХ х хх КАСА КЗ БА її. вдвениноїс с ОО ОО ОО 5. о. У . о. ВІН с че ЕС ми 0 З: шщш До. З о. о шо шини ріг. 17
UAA201901704A 2016-07-22 2017-07-21 Комбінація інгібітора bcl-2 та інгібітора mcl-1, їхнє застосування і фармацевтичні композиції UA125138C2 (uk)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16180918 2016-07-22
EP16306420 2016-10-28
US201762464554P 2017-02-28 2017-02-28
US201762517252P 2017-06-09 2017-06-09
PCT/EP2017/068453 WO2018015526A1 (en) 2016-07-22 2017-07-21 Combination of a bcl-2 inhibitor and a mcl-1 inhibitor, uses and pharmaceutical compositions thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA125138C2 true UA125138C2 (uk) 2022-01-19

Family

ID=65524552

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201901704A UA125138C2 (uk) 2016-07-22 2017-07-21 Комбінація інгібітора bcl-2 та інгібітора mcl-1, їхнє застосування і фармацевтичні композиції

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20190240225A1 (uk)
EP (1) EP3487499A1 (uk)
JP (1) JP7050744B2 (uk)
KR (1) KR102505218B1 (uk)
CN (1) CN109789130A (uk)
AU (1) AU2023202746A1 (uk)
BR (1) BR112019001024A2 (uk)
CA (1) CA3030967C (uk)
CL (1) CL2019000144A1 (uk)
CO (1) CO2019000596A2 (uk)
CR (2) CR20220452A (uk)
CU (1) CU20190002A7 (uk)
DO (1) DOP2019000015A (uk)
EC (1) ECSP19006687A (uk)
GE (1) GEP20217301B (uk)
IL (1) IL264261B2 (uk)
MA (1) MA45718A (uk)
MX (1) MX2019000919A (uk)
NI (1) NI201900006A (uk)
PH (1) PH12019500121A1 (uk)
RU (1) RU2746705C2 (uk)
SG (2) SG10202013206TA (uk)
SV (1) SV2019005811A (uk)
TN (1) TN2019000014A1 (uk)
UA (1) UA125138C2 (uk)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021092061A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Unity Biotechnology, Inc. Combination treatment for senescence-associated diseases
WO2021092053A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Unity Biotechnology, Inc. Mcl-1 inhibitor macrocycle compounds for use in clinical management of conditions caused or mediated by senescent cells and for treating cancer
CN115856302B (zh) * 2023-03-02 2023-06-02 北京大学人民医院 用于成熟b细胞肿瘤免疫分型的抗体组合物及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3008975A1 (fr) * 2013-07-23 2015-01-30 Servier Lab Nouveaux derives de pyrrole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR3008979B1 (fr) * 2013-07-23 2015-07-24 Servier Lab Nouveaux derives phosphates, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
FR3015483B1 (fr) * 2013-12-23 2016-01-01 Servier Lab Nouveaux derives de thienopyrimidine, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent

Also Published As

Publication number Publication date
TN2019000014A1 (en) 2020-07-15
ECSP19006687A (es) 2019-02-28
SV2019005811A (es) 2019-05-20
RU2019104105A3 (uk) 2020-09-28
CA3030967A1 (en) 2018-01-25
EP3487499A1 (en) 2019-05-29
AU2023202746A1 (en) 2023-05-18
JP2019528250A (ja) 2019-10-10
CA3030967C (en) 2022-02-15
MA45718A (fr) 2019-05-29
GEP20217301B (en) 2021-10-11
KR20190031291A (ko) 2019-03-25
RU2019104105A (ru) 2020-08-24
PH12019500121A1 (en) 2019-09-30
CR20220452A (es) 2022-10-27
IL264261B2 (en) 2023-05-01
IL264261A (en) 2019-02-28
CL2019000144A1 (es) 2019-05-31
DOP2019000015A (es) 2019-05-15
SG11201900402UA (en) 2019-02-27
US20190240225A1 (en) 2019-08-08
CR20190022A (es) 2019-04-03
IL264261B1 (en) 2023-01-01
CU20190002A7 (es) 2019-09-04
JP7050744B2 (ja) 2022-04-08
BR112019001024A2 (pt) 2019-05-14
MX2019000919A (es) 2019-08-29
SG10202013206TA (en) 2021-02-25
CO2019000596A2 (es) 2019-02-08
KR102505218B1 (ko) 2023-02-28
RU2746705C2 (ru) 2021-04-19
NI201900006A (es) 2019-05-10
CN109789130A (zh) 2019-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI759316B (zh) Bcl-2抑制劑及mcl1抑制劑之組合、其用途及醫藥組合物
UA125138C2 (uk) Комбінація інгібітора bcl-2 та інгібітора mcl-1, їхнє застосування і фармацевтичні композиції
US11278561B2 (en) Combination treatment for hematological cancers
US10576050B2 (en) Methods and compositions for treatment of cancer
TWI753178B (zh) Mcl-1抑制劑與血液癌症標準療法之組合，其用途及醫藥組合物
US20220016118A1 (en) Combination of a mcl-1 inhibitor and midostaurin, uses and pharmaceutical compositions thereof
UA125142C2 (uk) Комбінація інгібітору mcl-1 і таксанової сполуки, її застосування та фармацевтична композиція
RU2792057C2 (ru) Комбинация ингибитора mcl-1 и стандартного лекарственного препарата для лечения гематологических злокачественных новообразований, её применение и содержащие её фармацевтические композиции
US20230270748A1 (en) Combination of a bcl-2 inhibitor and a hypomethylating agent for treating cancers, uses and pharmaceutical compositions thereof
OA19591A (en) Combination of a Mcl-1 inhibitor and a standard of care treatment for hematologic cancers, uses and pharmaceutical compositions thereof.
WO2023166492A2 (en) Dual inhibitors of tryptophan dioxygenases (ido1 and tdo) and their use in therapy
JP2020176145A (ja) 血液癌の併用療法
EA039621B1 (ru) Комбинация bcl-2 ингибитора и mcl-1 ингибитора, их применения и фармацевтические композиции
JP2020075894A (ja) 抗血液悪性腫瘍薬
EA044990B1 (ru) Комбинация ингибитора mcl-1 и стандартного лекарственного препарата для лечения гематологических злокачественных новообразований, ее применение и содержащие ее фармацевтические композиции
OA19180A (en) Combination of A BCL-2 inhibitor and A MCL1 inhibitor, uses and pharmaceutical compositions thereof.
NZ789582A (en) Combination of a bcl-2 inhibitor and a mcl-1 inhibitor, uses and pharmaceutical compositions thereof
EA040521B1 (ru) Комбинированная терапия с применением иметельстата и abt-199 для лечения острого миелоидного лейкоза, набор и фармацевтическая композиция для её реализации, способ in vitro индукции апоптоза в клетке острого миелоидного лейкоза