CN103917234A - 用于治疗慢性骨髓性白血病的n-甲基-2-〔3-((e)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1h-吲唑-6-基硫烷基〕-苯甲酰胺 - Google Patents

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Abstract

本发明关于治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，诸如N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。本发明还关于包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，诸如N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

Description

用于治疗慢性骨髓性白血病的N-甲基-2-〔3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基〕-苯甲酰胺
【发明领域】
本发明关于治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，诸如N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。本发明还关于包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，诸如N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
【发明背景】
慢性骨髓性白血病(CML)为由骨髓中骨髓细胞增加和无序生长以及过多白血球积累所引起的血液学干细胞病症。阿伯尔森(Abelson)酪氨酸激酶(ABL)为一种参与细胞生长及增殖且通常受到严格控制的非受体酪氨酸激酶。然而，95％的慢性骨髓性白血病患者具有与来自22号染色体的断点簇基因(BCR)融合的来自9号染色体上的ABL基因，产生称为费城染色体的短染色体。此费城染色体负责产生BCR-ABL融合蛋白，此为一种导致细胞增殖失控的组成性活性酪氨酸激酶。美国FDA核准使用ABL抑制剂，伊马替尼(imatinib)治疗慢性骨髓性白血病且目前是作为第一线治疗剂使用。据报导，80％的CML患者对伊马替尼有反应，5年内疾病恶化的比率在3％以下(Schwartz,P.A.,et al.,Bioorg Chem39:192(2011))。然而，临床反应的持久性因为显现出对药物疗法的抗性而受到不利的影响。2001年中报导第一种伊马替尼耐药性突变株，称为T315l BCR-ABL“守门者(gatekeeper)”突变。随后的分析透露在整个催化和调节域中发生的超过55个记录的点突变中再次发生时有很大的百分比是位于G-环及守门者位置(同上)上。临床治疗的成功已在大多数突变上取得，但并无批准的针对守门者T315l突变株的药剂(O'Hare,T.,et al.,Clin Cancer Res17:212(2011))。
具以下结构的化合物，N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或6-[2-(甲基氨甲酰基)苯基硫烷基]-3-E-[2-(吡啶-2-基)乙烯基]吲唑：
被称为阿昔替尼(axitinib)或AG-013736。
阿昔替尼为血管内皮生长因子(VEGF)受体1、2及3的强力及选择性抑制剂。这些受体涉及病理性血管生成、肿瘤生长及癌症的转移恶化。阿昔替尼已被证明能有效抑制由VEGF介导的内皮细胞增殖和存活(Hu-Lowe,D.D.,et al.,Clin Cancer Res14:7272-7283(2008)；Solowiej,S.,et al.,Biochemistry48:7019-31(2009))。目前正在进行临床试验以研究使用阿昔替尼治疗各种癌症，包括肝癌、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、肾细胞癌、软组织肉瘤及固体肿瘤。(阿昔替尼)已被美国、欧洲、日本和其他司法管辖区核准用于治疗肾细胞癌。
美国专利第6,534,524号中描述阿昔替尼以及其药学上可接受的盐。美国专利第6,884,890和7,232,910号、美国专利申请公开案第2006-0091067和2007-0203196号以及国际专利申请公开案第WO2006/048745号中描述制造阿昔替尼的方法。美国专利申请公开案第2004-0224988号中描述阿昔替尼的剂型。美国专利申请公开案第2006-0094763、2008-0274192及2010-0179329号中还描述阿昔替尼的多晶型及药物组合物。上文列出的专利和专利申请案在此以引用方式并入本文。
【发明内容】
下文中描述的各实施方式可与此文中描述的任何不会与其组合的实施方式不协调的其他实施方式组合。
一些实施方式关于治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物或其药学上可接受的盐。
另外的实施方式关于上文描述的方法，其中该受试者的BCR-ABL酪氨酸激酶具有T315l突变。
进一步的实施方式关于上文描述的方法，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
更多实施方式关于治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
另外的实施方式关于治疗其BCR-ABL酪氨酸激酶具有T315l突变的受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物或其药学上可接受的盐。
进一步的实施方式关于治疗其BCR-ABL酪氨酸激酶具有T315l突变的受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
另外的实施方式关于治疗其BCR-ABL酪氨酸激酶具有T315l突变的受试者的慢性骨髓性白血病的方法，其包含给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
一些实施方式关于包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
进一步的实施方式关于上述的药物组合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
另外的实施方式关于包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，以及其药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
进一步的实施方式关于治疗受试者的慢性骨髓性白血病的药物组合物，其包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
另外的实施方式关于治疗其BCR-ABL酪氨酸激酶具有T315l突变的受试者的慢性骨髓性白血病的药物组合物，其包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
发明的详细描述
本文中可使用下列缩写：ABLtide(以ABL的C-端为基础的合成肽序列([5-羧基荧光素]-EAIYAAPFAKKK-COHN2))；ADP(二磷酸腺苷)；ATP(三磷酸腺苷)；BRIJ-35(聚氧乙烯月桂基醚)；BSA(牛血清白蛋白)；DMSO(二甲亚砜)；二硫苏糖醇(DTT)；EGTA(乙二醇四醋酸)；ELISA(酶联免疫吸附分析)；FBS(胎牛血清)；HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸))；NADH(还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸加氢)；RPMI(罗斯韦尔公园纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute))；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tyr(酪氨酸)；Tyr02肽(肽序列(EAIYAAPF))；及WT(野生型)。
除非另有说明，此处所使用的短语“药学上可接受的盐(类)”包括可存在于此处所描述的化合物中的酸性或碱性基团的盐。此处所描述的本质为碱性的化合物可与各种无机和有机酸形成多种盐类。可以制备此处所描述的这类碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸为那些形成非毒性酸加成盐者，该非毒性酸加成盐为，例如：含有药学上可接受的阴离子的盐类，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、醋酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐(pamoate)[即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘酸盐)]盐类。除了上文提及的酸外，此处所描述的包括碱性部分(诸如氨基)的化合物可与各种氨基酸形成药学上可接受的盐类。
除非另有说明，此处所使用的术语“治疗(treating)”意指逆转、减轻、抑制该术语所适用的这类病症或病况的进展，或预防该病症或病况，或逆转、减轻、抑制该术语所适用的这类病症或病况的一或多种症状的进展，或预防该病症或病况的一或多种症状。除非另有说明，此处所使用的术语“治疗(treatment)”是指如上文定义的“治疗(treating)”的治疗行为。
此处所使用的术语“受试者”可能为人类或非人类的哺乳动物(例如兔、大鼠、小鼠、马、猴子、其他较低等的灵长类动物，等)。在一个实施方式中，术语“受试者”是指人类。
给药此处所描述的化合物可受到任何能将该化合物递送至作用部位的方法或途径影响。这些方法包括口服途径、十二指肠内途径，肠胃道外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)、局部及直肠给药。
当然，给药的剂量将随所使用的化合物、给药模式、所需的治疗及指示的病症而有不同。该剂量可为单次剂量或根据多剂量方案，单独或与其他化合物、药剂或物质组合。本领域的普通技术人员将能够根据诸如受试者尺寸大小、受试者症状的严重性及选择给药的特定组合物或给药途径等这类因素来测定这类量。该化合物或其药学上可接受的盐的每日剂量可能在0.1毫克至1克的范围内，优选为0.1毫克至250毫克，更优选为0.1至50毫克。
在一些实施方式中，当给药的阿昔替尼或其药学上可接受的盐的每日剂量为约0.01毫克/公斤至约0.4毫克/公斤体重时可得到令人满意的结果，这些剂量任选地以一天2至4次的分割剂量形式给药。预计每天的总剂量将为约0.1至约25毫克，优选为约1毫克至约10毫克，一天给药两次，更优选为约2至约10毫克，一天给药两次。此剂量方案可经调整以提供最适的治疗反应。例如，可每日给药数个分割的剂量，或者可根据治疗情况的紧急需要依指示将该剂量按比例减少或增加。
该药物组合物可能，例如为适合口服的形式，诸如片剂、胶囊、药丸、粉末，缓释配制剂、溶液或悬浮液、用于肠胃道外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液形式，用于局部给药的软膏或乳膏形式，或用于直肠给药的栓剂形式。该药物组合物可能为适合单次给药精确剂量的单位剂型。该药物组合物包括习知的药学上可接受的载体或赋形剂，以及作为活性成分的本文所描述的化合物。此外，其可能包括其他医学或药学的药剂、载体或佐剂。
示范性的肠胃道外给药形式包括在无菌水溶液中的活性化合物的溶液或悬浮液，例如水性丙二醇或右旋糖溶液。若需要时可将这类剂型适当地缓冲。
合适的药学载体包括惰性稀释剂或填充剂、水及各种有机溶剂。若需要时，该药物组合物可包含额外的成分，诸如调味剂、粘合剂、赋形剂等。因此，在口服给药方面，含有各种赋形剂(诸如柠檬酸)的片剂可能与各种崩解剂(诸如淀粉、藻酸及某些复合硅酸盐)，及与粘合剂(诸如蔗糖、明胶及阿拉伯胶)一起使用。另外，润滑剂(诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石)经常有用于压片目的。相似类型的固体组合物还可被用在软及硬的填充明胶胶囊中。因此，优选的材料包括乳糖或奶糖及高分子量聚乙二醇。当需要水性悬浮液或酏剂来用于口服时，其中的活性化合物可能与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料，若需要时，乳化剂或悬浮剂，加上稀释剂(诸如水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合)相组合。
【实施方式】
实施例1.ABL1激酶分光光度测量耦合的酶分析法
在先前已描述(Solowiej,J.,et al.,Biochemistry,48:7019-7031(2009))的用于测量ABL1和ABL1[T315l]酶活性的分光光度测量耦合的酶分析法中测试阿昔替尼。伴随着人类小胃泌素1肽(LEEEEEAYGWMDF-NH2)中ATP的γ-磷酸盐的磷酰基转移至酪氨酸残基而发生的由激酶催化产生ADP的作用透过丙酮酸激酶(PK)及乳酸脱氢酶(LDH)的作用与NADH的氧化作用结合。伴随ADP的产生β-NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原型)转化成β-NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化型)，此转化作用是经由在25℃下使用Beckman DU800分光光度计测量在340nm的吸光度(ε＝6220cm-1M-1)减少来监控。典型的反应溶液为在25mM HEPES，pH值7.5中含有2mM磷酸烯醇丙酮酸化物、0.28mM NADH、50mM MgCl2、2mM DTT、ATP、小胃泌素、15单位/毫升PK、15单位/毫升LDH。为了测定动力学参数，ATP的变化为5至1000μM。添加20nM的全长ABL1或100nM ABL1[T315l]以起动分析。使用相同的耦合的酶分析模式进行抑制百分比及Ki的测定。在100％DMSO中制备阿昔替尼。在分析试验中的DMSO的最终浓度为1％。ATP的浓度为3X km(165μM ABL1和40μM ABL1[T315l]。小胃泌素的浓度为500μM。从速度分数绘图，将作为抑制剂浓度函数的Ki拟合入用于竞争性抑制作用的二次方程式“莫里森方程式(Morrison equation)”中，以酶浓度作为变量来取得Ki测定值(Morrison,J.F.,Biochimica et biophysica acta,185:269-286(1969))。
如表1中所示，产生的阿昔替尼的％抑制数据指示对ABL1[T315l]突变的效力移位。
表1.通过ABL1激酶分光光度测量耦合的酶分析法测定的阿昔替尼对ABL1蛋白的酶活性的抑制效力
实施例2.ABL1激酶移动率变动分析
通过Caliper LabChip3000分析(Caliper生命科学，麻萨诸塞州霍普金顿)测试阿昔替尼，该Caliper LabChip3000分析为结合微流环境中的毛细管电泳的基本原则的移动率变动分析(MSA)。在100％DMSO中制备阿昔替尼，以20mM HEPES pH7.5稀释成25％DMSO，并加入反应物中使DMSO的最终浓度为6％。抑制剂浓度在1.0μM至0.00003μM之间变化。典型的反应物为20微升，其中包含ABL1或ABL1[T315l]、ATP(ABL1；25μM及ABL1[T315l]；5μM)、1.0μMABLtide、5mM MgCl2、2mM DTT、X-100(Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯)、在20mM HEPES，pH7.5中的6％DMSO。在室温下将该混合物培育在384孔聚丙烯盘中一小时，经由加入60微升的QuickScout Screening Assist MSA缓冲液(Carna生物科技公司，日本神户)来终止反应。将反应混合物施放在LabChip3000系统上，将产品/底物肽类的波峰分开。从产品(P)及底物(S)肽类的波峰高度计算产品比例(P/(P+S))以定量激酶反应。
如表2中所示，产生的阿昔替尼数据证明相对于该野生型酶，其对守门者突变的效力变动14倍。
表2.通过ABL1激酶移动率变动分析测定的阿昔替尼对ABL1蛋白的酶活性的抑制效力
激酶 IC50(nM)
ABLWT 7.784
ABL(T315I) 0.5511
实施例3.ABL1激酶Z'-筛选分析
使用Z'-筛选方案(Invitrogen公司，加州卡尔斯巴德)测试阿昔替尼。在100％DMSO中制备阿昔替尼并添加至反应物中使DMSO的最终浓度为1％。抑制剂浓度在1.0μM至0.00003μM之间变化。典型的反应物为10微升，其中包含ABL1或ABL1[T315l]、ATP(ABL1；10μM及ABL1[T315l]；5μM)、2.0μM Tyr02肽、10mM MgCl2、1.0mMEGTA、0.01％BRIJ-35、在50mM HEPES，pH7.5中的1％DMSO。在室温下，将该混合物培育在384孔聚丙烯盘中一小时，使用Z'-筛选方案，经由加入5微升的1:64稀释的显现试剂再摇动30秒来终止反应。令显现的反应物在室温下培育一小时。在荧光盘读计上读取所产生的荧光并分析数据。
如表3中所示，产生的阿昔替尼数据证明相对于该野生型酶，其对守门者突变的效力变动6.2倍。
表3.通过ABL1激酶Z'-筛选分析测定的阿昔替尼对ABL1蛋白的酶活性的抑制效力
激酶 IC50(nM)
ABLWT 2.6
ABL(T315I) 0.418
实施例4.BCR-ABL经遗传工程处理的BaF3细胞的自身磷酸化ELISA
从俄勒冈健康与科学大学取得BaF3WT BCR-ABL及BaF3-T315l突变种BCR-ABL细胞株并将其生长在补充有10％FBS及1％青霉素链霉素的RPMI-1640培养基(100X储备液＝每毫升中含5000单位的青霉素及5000微克的链霉素)中。在c-ABL磷酸酪氨酸ELISA方面，使用移液管将细胞放入50毫升的管中，在1000RPM下离心，再将细胞小丸重新悬浮于分析培养基(具有0.1％FBS、0.05％BSA重量/体积及1％青霉素链霉素的RPMI-1640)中。使用Innovatis Cedex细胞计数器计算细胞，以每孔40,000细胞接种在96孔平底盘中，并在37℃，5％CO2，95％空气下与分析培养基一起培育2小时。将阿昔替尼溶解在100％DMSO中以制备10mM的储备液。然后，在聚丙烯96孔盘中，使用3倍系列稀释将阿昔替尼在100％DMSO中稀释。对照孔中含有不具测试化合物的100％DMSO(未受抑制的对照组)。将DMSO药物稀释盘在分析培养基(具有0.1％FBS、0.05％BSA重量/体积及1％青霉素链霉素的RPMI-1640)中稀释40倍，以产生用于分析的5X药物来源盘。从5X药物来源盘转移25微升至细胞分析盘中并将该分析盘与阿昔替尼在37℃，5％CO2，95％空气下再培育2小时。培育后，将细胞在1500RPM离心5分钟并移除80微升上清液。经由在每一孔中加入100微升补充有1％SDS、蛋白酶抑制剂(Sigma P8340)及磷酸酶抑制剂(Sigma P0044及Sigma P5726)的新鲜制备的细胞传信技术(Cell SignalingTechnology)裂解缓冲液(#9803)来将细胞裂解。将具有裂解缓冲液的细胞分析盘在4℃下摇动10分钟，然后从每个孔中转移100微升的细胞裂解液到山羊抗兔子96孔ELISA盘(Pierce#15135)中(其预先与在阻断缓冲液(Pierce StartingBlock)中1:200稀释的兔子抗c-ABL抗体(细胞传信技术#2862))培育)。将细胞裂解液与经抗c-ABL涂覆的ELISA盘在室温下培育1小时，然后以细胞传信技术ELISA洗涤缓冲液(来自试剂盒#7903)洗涤4次。将分析盘倒置以除去最后的洗涤液后，在各孔中添加100微升的1:5000稀释的小鼠单株(IgG2b)抗磷酸酪氨酸抗体(Santa Cruz生物技术公司SC508HRP)。然后，将该ELISA盘在室温下培育45分钟，每孔中100微升。依上述将盘洗涤4次，除去最后的洗涤液并在各孔中添加100微升的TMB底物(SantaCruz生物技术公司SC286967)。在颜色显现期间在655nm处读取分析盘，或通过在每孔中添加50-100微升的0.16M硫酸终止溶液来停止颜色显现并在450nm处读取分析盘。
如表4中所示，产生的阿昔替尼数据证明相对于该野生型酶，其对守门者突变的效力变动8.6倍。
表4.通过BCR-ABL经遗传工程处理的BaF3细胞ELISA测定的阿西替尼对抑制BCR-ABL自身磷酸化的T315l突变的抑制效力
激酶 IC50(nM)
ABLWT 177±58(n＝2)
ABT(T315I) 207±4.6(n＝3)
实施例5.BCR-ABL遗传工程处理的BaF3细胞增殖分析(方法A)
从俄勒冈健康与科学大学取得BaF3WT BCR-ABL及BaF3-T315l突变种BCR-ABL的细胞株并将其生长在如上述的具有10％FBS的RPMI-1640中。在增殖分析方面，使用移液管将细胞放入50毫升的管中，在1000RPM下离心，再将细胞小丸重新悬浮于具有1％FBS及1％青霉素链霉素的RPMI-1640中。使用Innovatis Cedex细胞计数器计算细胞并以每孔1,500个细胞的密度接种在96孔平底盘中。依上述将阿昔替尼在100％DMSO中进行系列稀释，然后在具有1％FBS和1％青霉素链霉素的RPMI-1640中稀释40倍，以取得5X来源盘。从该5X来源盘转移25微升至细胞分析盘，并将细胞与阿昔替尼在37℃，5％CO2，95％空气中培育4天。在添加药物后第4天，将细胞分析盘在1000RPM离心2分钟，从每个孔中移除80微升的上清液，并在每个孔中添加100微升的新鲜培养基。然后，在每个孔中加入15微升的1毫克/毫升刃天青(Resazurin)(Sigma公司R7017)并将该细胞分析盘在37℃，5％CO2，95％空气中培育6小时。使用530nm激发波长和595nm发射波长读取荧光信号。
如表5中所示，产生的阿昔替尼数据证明相对于该野生型酶，其对守门者突变的效力变动10倍。
表5.通过BCR-ABL经遗传工程处理的BaF3细胞增殖分析测定的阿西替尼对BCR-ABL T315l突变介导的细胞增殖的抑制效力
激酶 IC50(nM)
ABLWT 217±46(n＝2)
ABL(T315I) 21.0±3.6(n＝3)
实施例6.野生型BCR-ABL CML细胞增殖分析
使用实施例5的方法，表6显示出在野生型BCR-ABL CML细胞株中产生的阿昔替尼的数据。
表6.通过BCR-ABL CML细胞增殖分析测定的阿昔替尼对野生型BCR-ABL介导的细胞增殖的抑制效力
WTBCR-ABLCML细胞株 IC50(nM)
MEG01(1％FBS) 105
MEG01(10％FBS) 314
K562(10％FBS) 323
实施例7.BCR-ABL经遗传工程处理的BaF3细胞增殖分析(方法B)
使用先前发表的方法(le Coutre P,Mologni L,Cleris L,Marchesi E,Buchdunger E,Giardini R,Formelli F,Gambacorti-Passerini C.,"In vivo eradication of humanBCR/ABL-positive leukemia cells with an ABL kinase inhibitor."J Natl Cancer Inst.1999Jan20；91(2):163-8)，以104细胞/孔(10％FBS)的浓度将细胞接种于具有完整培养基及逐渐增加浓度(范围为10至0μM)的抑制剂的96孔圆底细胞培养盘中。在72小时使用前述的氚化胸腺嘧啶核苷掺入分析测量细胞增殖。与先前揭露的方法的唯一区别是该标记时间为8小时(接种后64小时，以3H胸腺嘧啶核苷标示细胞，培育8小时再收获)。每种试验均以一式四份进行且至少重复两次。使用GraphPad Prism软件计算IC50值。
如表7中所示，产生的阿昔替尼数据证明相对于该野生型酶，其对守门者突变的效力变动8.4倍。
表7.通过BCR-ABL经遗传工程处理的BaF3细胞增殖分析测定的阿西替尼对BCR-ABL的T315l突变的抑制效力
激酶 IC50(nM)
ABLWT 823
ABL(T315I) 98

Claims (7)

1.治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，包括给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
2.如权利要求1的方法，其中该受试者为人类。
3.治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，包括给予该受试者化合物，其是N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求3的方法，其中该受试者为人类。
5.治疗受试者的慢性骨髓性白血病的方法，该受试者具有BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变，包括给予该受试者抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
6.如权利要求5的方法，其中该受试者为人类。
7.治疗受试者的慢性骨髓性白血病的药物组合物，其包含抑制BCR-ABL酪氨酸激酶的T315l突变的化合物，其中该化合物为N-甲基-2-[3-((E)-2-吡啶-2-基-乙烯基)-1H-吲唑-6-基硫烷基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
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