KR20090112682A - Ｌｓｐｒ을 위한 효소 분석법 - Google Patents

Ｌｓｐｒ을 위한 효소 분석법 Download PDF

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랜디 스토러
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람다젠 코퍼레이션
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Abstract

본 발명은 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR) 검출 장치의 표면에서의 굴절률의 변화를 검출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 고정화 효소를 사용하여 효소 기질로부터 불용성 생성물을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 불용성 생성물은 LSPR 지지 표면에 축적된다. 당해 방법은 또한 LSPR을 사용하여 불용성 생성물의 존재로 인한 표면의 반사광 또는 투과광의 변화를 검출하는 단계도 포함한다.
국소 표면 플라스몬 공명, LSPR 센서, 고정화 효소, 효소 기질, 굴절률

Description

ＬＳＰＲ을 위한 효소 분석법{Enzymatic assay for LSPR}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2007년 1월 3일자로 출원된 미국 임시출원 번호 제60/878,617호의 이익을 주장하며, 상기 출원의 전문을 본 명세서에 참조로 인용한다.
신호 증폭을 위한 효소 반응에 기초하는 비색 분석법은 사용이 편리하고 충분한 감도를 갖기 때문에 임상학적 진단 분야에서 폭넓은 용도를 갖는다. 감도는 효소 표지의 순환 속도, 사용된 효소 기질, 및 효소의 양으로 나타내어진다. 가장 대중적인 효소 표지 중 두 가지가 알칼리성 포스파타제와 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제이다. 전자는 종종 니트로-블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT) 및/또는 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염(BCIP)과 함께 사용된다. 후자는 종종 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(4-CN), 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB) 등과 함께 사용된다. 효소 기질과 효소가 반응할 때 불용성의 착색된 생성물이 침전된다. 불용성 생성물을 육안으로 검측하여 정성적 결과를 얻거나 간단한 광학적 검출기를 사용하여 반-정량적 결과를 얻는다. 따라서, 얼마나 많은 불용성 생성물이 축적되고 축적과 함께 광학 밀 도가 얼마나 많이 변화하느냐가 검출 한계를 나타낸다.
효소 작용의 효율을 높이고 광학적으로 조밀한 반응 생성물을 갖는 기질을 개발하기 위해서 많은 노력이 이미 이루어졌다. 온도를 높임으로써 효소 반응을 촉진시키는 것은 온도가 더 높을 경우 효소의 분해가 초래되므로 더 이상은 가능하지 않다. 효소의 양을 증가시키는 것도 도움은 되지만 고체 표면에 부착될 수 있는 항체의 양에는 한계가 있다. 이 한계는 면역-크로마토그래피 키트에 사용된 다공성 막에서 이미 도달되었으므로 현격한 개선은 기대할 수 없다. 비색 분석법과 관련한 다른 단점은 불충분한 동적 범위이다. 이 검출법이 흡광도의 측정에 의존하는 한, 정밀 측정은 2 미만의 광학 밀도에 대해서 가능하고 그 반면에 최소 흡광도는 0.1 정도이다. 따라서, 범위는 불과 20에 지나지 않아 단지 한 크기 차수에만 걸쳐져 있다.
확실히 개선이 이루어질 수는 있다 하더라도, 넓은 범위의 효소/기질 조합에 적용될 수 있는 일반적인 방법은 존재하지 않는다. 본 발명은 놀랍게도 특정한 효소 또는 기질의 개선에 의존하지 않는 일반적인 방법을 제공한다.
[발명의 개요]
한 양태에서, 본 발명은 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR) 검출 장치의 표면에서의 굴절률의 변화를 검출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 고정화 효소를 사용하여 효소 기질로부터 불용성 생성물을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 불용성 생성물은 LSPR 지지 표면에 축적된다. 당해 방법은 또한 LSPR을 사용하여 불용성 생성물의 존재로 인한 표면의 반사광 또는 투과광의 변화를 검출하는 단계도 포함한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은 제1 고상 지지체, 제1 고상 지지체 위에 배치된 LSPR 지지 표면, LSPR 지지 표면에 근접해 있는 고정화 효소, 및 효소 기질을 갖는 LSPR 센서를 제공한다.
도 1은 종래의 방법과 본 발명의 방법에서 수행되는 2-단계 비색 샌드위치 분석법을 비교한 도면이다.
도 2는 본 발명의 방법을 사용한 1-단계 분석법을 보여준다.
도 3은 효소 반응이 일어난 후의 금 나노입자의 주사 전자 현미경(SEM) 사진(1)과, IL-6 분석 마지막에서 효소 반응 동안의 광학 밀도의 변화를 보여주는 그래프(2)이다.
도 4는 항체를 나노입자(1), 제1 고상 지지체(2) 및 제2 고상 지지체(3,4)에 부착시킬 수 있는 다양한 방법을 보여준다.
Ⅰ. 개괄
본 발명은 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR) 지지 표면을 사용하여 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. LSPR 지지 표면은 금으로 피복된 표면을 포함하며 이 표면 위에는 금으로 피복된 비드(bead)와 같은 나노입자들이 배열되어 있다. 본 발명의 방법은 샌드위치 분석법을 이용하여 분석물을 검출한다. 본 발명의 방법은 LSPR 지지 표면의 비드의 금 표면 위에 고정화된 제1 포착 물질로 분석물을 포착함으로써 분석물을 검출한다. 그 다음, 검출 물질을 갖는 제2 포착 물질을 사용하여 분석물의 존재를 검출한다.
바람직한 양태에서, 샌드위치 분석법은 포착 물질이 항체이고 분석물이 항원인 면역 분석법이다. 다른 바람직한 양태에서, 검출 물질은 효소이며, 제2 포착 물질이 분석물과 결합할 때 그 혼합물 속으로 용해성 효소 기질이 들어가고 효소가 그 효소 기질을 불용성 생성물로 전환시키며 이것이 LSPR 지지 표면 위에 축적된다. LSPR 지지 표면 위에 불용성 생성물이 축적되면 반사광 또는 투과광의 파장이 이동하게 되는데 이것은 육안으로 볼 수 있다. LSPR의 특성은 육안으로 볼 수 있는 파장 이동을 유도하기 위해 매우 소량의 불용성 생성물이 필요하다는 것이다. 본 발명의 방법과 달리 기존의 방법은 불용성 생성물의 존재를 비색 분석법을 사용하여 직접 검출하기 때문에 다량의 불용성 생성물의 침착이 요구된다.
본 발명의 방법은 불용성 생성물이 LSPR 지지 표면 위에 축적되게 함으로써 비색 효소 면역 분석의 감도를 증가시킨다. 이것은 국소 표면 플라스몬 공명 효과에 의한 향상된 검출을 제공하고, 낮은 용적의 반응 영역에서 시료를 교반시킴으로써 분석 시간을 단축하며, 동적 범위를 여러 크기 차수에 걸쳐서 확대시킨다.
비색 효소 면역 분석의 감도는 LSPR 지지 표면과 관련한 근접장 광학을 활용함으로써 향상될 수 있다. 종래의 분석법에서는 효소 반응에 의한 착색 생성물의 형성을 육안으로 검출하거나 간단한 장치로 특정 파장에서의 흡광도를 모니터하여 검출한다. 비색 효소 면역 분석을 LSPR 지지 표면 위에서 수행하면, 반사광 또는 투과광의 파장 이동을 검출함으로써 착색 생성물의 형성을 훨씬 더 낮은 농도에서 간접적으로 검출할 수 있다. 고체 표면 위에 흡착된 나노입자들은 가파른 소광 스펙트럼이 특징인 LSPR 지지 표면을 생성한다. 가파른 소광 스펙트럼은 가시 영역과 같이 전자기 스펙트럼의 어떠한 부분이라도 가능하다. 가파른 소광 스펙트럼은 국소 표면 플라스몬 현상, 즉 국소화된 자유 전자들의 집단적인 진동 운동에 기인한다. 소광 스펙트럼은 국소 굴절률에 매우 민감하게 의존한다. LSPR 지지 표면 위의 불용성 생성물의 축적에 의한 굴절률 변화를 이의 흡수 스펙트럼을 통해 모니터함으로써 항원을 보다 낮은 농도에서 검출할 수 있다.
축적된 효소 반응 생성물의 직접적인 광학적 검출에 의존하는 종래의 비색 분석법은 단지 한 크기 차수에 걸친 동적 범위를 갖는다. 이렇게 제한되는 것은 대부분의 광학 장치들이 0.1 내지 1.5 범위 내에서 광학 밀도를 높은 정확도로 측정할 수 있기 때문이다. 본 발명의 방법은 LSPR 지지 표면의 소광 스펙트럼의 변화를 다양한 파장에서 모니터할 수 있다. 종래의 비색 분석법을 이용하는 유사한 시도들이 이루어지고 있으나, 기존의 방법들은 본 발명에서와 같은 간접적인 모니터링 대신에 착색 생성물의 직접적인 모니터링을 이용한다. 또한, LSPR 지지 표면의 감도는 물리적 인자들을 조작함으로써 조정할 수 있다. 따라서, 동적 범위가 여러 크기 차수에 걸쳐서 확대될 수 있다.
Ⅱ. 정의
본원에서 사용되는 "LSPR 지지 표면"이란 통상적으로 국소 표면 플라스몬 공명이라 불리우는 갇힌 자유 전자들의 공명 진동을 통해서 광학 근접장을 형성할 수 있는 표면을 의미한다. LSPR 지지 표면은 아래에 더욱 상세히 설명되는 바와 같은 나노입자들이 특징이다. LSPR 지지 표면은 불투명하거나 투명할 수 있고 빛을 투과시키거나 반사시킬 수 있으며 양쪽 모두일 수도 있다.
본원에서 사용되는 "나노입자"란 약 10-9 내지 약 10-7m의 치수를 갖는 입자 및 비드를 의미한다. 나노입자는 임의의 적합한 재료로 만들어질 수 있으며, 비제한적으로 비드, 피라미드, 와이어, 메쉬 등이 포함된다. 당업자는 다른 나노입자들도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
본원에서 사용되는 "전이 금속"이란 Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, La, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au 및 Ac를 포함하는 주기율 표의 원소들을 의미한다. 당업자는 상술된 전이 금속이 각각 다수의 상이한 산화 상태를 가질 수 있으며 이들 모두가 본 발명에 유용함을 알 것이다. 일부의 경우 가장 안정한 산화 상태가 형성되지만, 다른 산화 상태들도 본 발명에 유용하다.
본원에서 사용되는 "고상 지지체"란 그 위에 LSPR 지지 표면이 추가되거나 성장할 수 있는 임의의 재료를 의미한다. 적합한 고상 지지체의 예로는 유리(조절-기공 유리 포함), 중합체(예: 폴리스티렌, 폴리우레탄, 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체), 실리콘 고무, 석영, 라텍스, 전이 금속, 자성 재료, 실리콘 다이옥사이드, 실리콘 니트라이드, 갈륨 아르세나이드, 및 이들의 유도체가 비제한적으로 포함된다. 표면상의 반응 부위를 제외하고는 고상 지지체 재료는 일반적으로 이들이 경험할 수 있는 각종 화학적 반응 조건에 대해 내성을 갖는다. 본 발명에 유용한 고상 지지체는 매끄럽거나 거칠거칠할 수 있다. 매끄러운 표면은 표면 위에 거칠기를 형성하는 피쳐(feature)를 최소한으로 갖는다. 거칠거칠한 표면은 표면 위에 여러 개의 피쳐를 가져서 마찰을 일으킨다. 본 발명의 고상 지지체는 제1 고상 지지체와 제2 고상 지지체를 포함한다. 고상 지지체는 편평하거나 편평하지 않을 수 있고 유연하거나 단단할 수 있다. 또한, 고상 지지체는 다공성 메쉬 또는 직물일 수 있다. 고상 지지체는 불투명하거나 투명할 수 있고 빛을 투과시키거나 반사시킬 수 있으며 양쪽 모두일 수도 있다. 당업자는 다른 고상 지지체들도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
본원에서 사용되는 "LSPR 검출 장치"란 LSPR 지지 표면의 굴절률의 변화를 모니터함으로써 표적 분석물을 검출하기 위한 장치를 의미한다. 이러한 변화는 플라스몬 피크 이동, 흡수, 반사 또는 투과 스펙트럼의 모양의 변화, 또는 흡수, 반사 또는 투과 스펙트럼의 영역 또는 비율과 같은 그와 관련된 측정 기준의 변화일 수 있다.
본원에서 사용되는 "불용성 생성물"이란 LSPR 지지 표면 위에 축적되어 LSPR 지지 표면의 굴절률을 변화시키는 화합물을 의미한다. 불용성 생성물은 효소 기질이 효소에 의해서 전환되어 생긴다. 불용성 생성물은 색을 띠거나 띠지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 "효소 기질"이란 효소에 의해 불용성 생성물로 전환된 후 LSPR 지지 표면 위에 축적되어 이의 굴절률을 변화시키는 가용성 화합물을 의미한다. 본 발명에서 효소 기질로서 유용한 화합물의 예가 아래에 설명된다. 효소 기질은 색을 띠거나 띠지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 "고정화 효소"란 고상 지지체 위에 고정되고 LSPR 지지 표면에 근접해 있으며 효소 기질을 불용성 생성물로 전환시키는 효소를 의미한다. 고정화 효소 및 효소의 고정화 방법의 예가 아래에 설명된다.
본원에서 사용되는 "면역 분석법"이란 2개의 포착제를 사용하여 분석물을 검출하는 분석법을 의미하는데, 하나의 포착제는 통상적으로 고상 지지체 재료에 결합하고 또 다른 포착제는 검출 물질을 포함한다. 고체상 ELISA 면역 분석법과 같은 다양한 방식의 면역 분석법을 사용할 수 있다(참조: Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), 특정한 면역 반응을 측정하는 데 사용될 수 있는 면역 분석법의 방식과 조건의 설명). 분석물을 검출하는 데 사용될 수 있는 면역 분석법으로는 예컨대 웨스턴 블롯, 방사능 면역 분석법, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역 분석법, 면역침전 분석법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사 분석법, 형광 면역 분석법, 단백질 A 면역 분석법 등과 같은 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템이 포함된다. 당업자는 다른 면역 분석법들도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
본원에서 사용되는 "항체"란 분석물(항원)을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는, 면역글로불린 유전자(들)에 의해 실질적으로 암호화되는 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 의미한다. 알려진 면역글로불린 유전자로는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 부위 유전자, 및 무수한 면역글로불린 가변 부위 유전자들이 포함된다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이들은 다시 각각 면역글로불린 종류인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다.
대표적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 동일한 두 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 이루어져 있으며 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25kD)와 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70kD)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산으로 된 가변 부위를 한정한다. 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)라는 용어는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 예컨대 완전한 면역글로불린으로서 존재하거나, 각종 펩티다제에 의해 분해되어 생긴 다수의 충분히 특성화된 단편들로서 존재한다. 예로서, 펩신은 경첩 부위 내의 다이설파이드 결합 아래에서 항체를 분해하여 F(ab)'2를 생성하는데, 이것은 그 자체로 디설파이드 결합에 의해 VH-CH 1에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체이다. F(ab)'2는 온화한 조건하에 환원되어 경첩 부위 내의 다이설파이드 결합을 끊음으로써 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킬 수 있다. Fab' 단량체는 본질적으로 경첩 부위의 부분을 갖는 Fab이다(참조: Paul(Ed.) Fundamental Immunology, 제3판, Raven Press, NY (1993)). 다양한 항체 단편들을 완전 항체의 분해에 의해 정의하였으나, 당업자는 이러한 단편들은 화학적으로 또는 재조합 DNA 기법에 의해서 신생(de novo) 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 항체의 용어는 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편 또는 재조합 DNA 기법을 사용하여 신생 합성된 것들(예: 단일쇄 Fv)도 포함한다.
본원에서 사용되는 "샌드위치 분석법"이란 포착된 분석물의 양을 직접 측정하는 분석법을 의미한다. 한 "샌드위치" 분석법에서는 예컨대 포착제를 고상 지지체에 직접 결합시켜서 고정화할 수 있다. 그러면 이들 고정화된 포착제가 시험 시료에 존재하는 표적 분석물을 포착한다. 이렇게 고정화된 표적 분석물은 검출 물질을 갖는 제2의 포착제(예: 효소를 지닌 제2 포착제)에 의해 결합된다. 또는, 검출 물질은 제2 포착제가 유래된 성분에 특이적인 제3의 표지된 포착제일 수도 있다. 제2 포착제는 비오틴과 같은 검출가능한 물질로 개질될 수 있고, 여기에 효소 표지 스트렙타비딘과 같은 제3의 표지된 분자가 특이적으로 결합할 수 있다. 포착제는 항체 또는 후술되는 바와 같은 애드넥틴(adnectin)일 수 있다.
본원에서 사용되는 "투명"하다는 것은 재료가 빛을 투과시킬 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명에서, 일부의 고상 지지체 재료는 투명하고 이 재료를 통과하는 빛을 거의 흡수하지 않는다.
Ⅲ. 국소 표면 플라스몬 공명( LSPR ) 검출 장치의 표면에서의 굴절률 변화의 검출 방법
본 발명은 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR) 검출 장치의 표면에서의 굴절률의 변화를 검출하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 고정화 효소를 사용하여 효소 기질로부터 불용성 생성물을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 불용성 생성물은 LSPR 지지 표면에 축적된다. 당해 방법은 또한 LSPR을 사용하여 불용성 생성물의 존재로 인한 표면의 반사광 또는 투과광의 변화를 LSPR 표면에서 반사 또는 투과된 광의 스펙트럼 변화를 이용하여 검출하는 단계도 포함한다.
본 발명의 기본 원리는 나노 크기의 귀금속 입자와 관련된 국소 표면 플라스몬에 의한 상승 효과에 기초를 둔다. 크기가 5㎚ 내지 1,000㎚ 범위인 이들 입자에서는 갇힌 자유 전자의 공명 진동으로 인한 현저한 광학적 소광이 존재한다. 공명하는 전자는 국소화되지 않은 표면 플라스몬에 비해서 여러 크기 차수만큼 향상된 강도를 갖는 강한 국소 전자기장을 형성한다. 통상적으로 광학 근접장이라 불리우는 국소 장은 표면으로부터 수 십 ㎚ 연장된다. 근접장 내에서 굴절률이 변할 때 입자에 의한 소광이 매우 민감하게 변화한다. 이러한 감도의 이점을 취하여 본 발명은 LSPR 지지 표면 부근에서의 비색 효소 분석법을 제공한다. 생성물이 LSPR 지지 표면 위에 침착될 때 소광 스펙트럼은 10㎚ 이하의 침착 두께에서 육안으로 검출될 정도로 충분하게 변한다. 모니터하는 것은 효소 생성물의 흡광도가 아니다. 오히려 주변의 생성물의 존재에 의해 민감하게 영향을 받는 LSPR 지지 표면의 소광 스펙트럼의 변화를 모니터하는 것이다. 모니터하는 파장은 요구되는 감도에 따라 선택할 수 있는데, 높은 감도에는 피크에 더 가까운 20 내지 50㎚의 파장 영역이 적합하고 보다 낮은 감도에는 더 먼 영역들이 적합하다. 따라서, 여러 파장에서 또는 전체 스펙트럼을 모니터함으로써 동적 범위를 확대시킬 수 있다.
표면 흡착 입자를 형성하는 방법은 다수 존재하나, 본 발명의 방법은 고상 지지체 위에서 성장하는 귀금속 표면 위에 먼저 단층의 단분산 입자를 흡착시킨다. 고상 지지체는 규소, 유리 또는 중합체와 같은 임의의 적합한 재료일 수 있다. 단층의 나노입자 위에 다른 귀금속층을 배치시킨다. 나노입자의 치수와 귀금속층의 두께를 신중하게 선택함으로써, 검출하고자 하는 전체 범위의 광에 걸쳐서 어떠한 파장에도 적합될 수 있는 소광 피크를 갖는 LSPR 지지 표면을 제공할 수 있다. 예컨대, 가시 스펙트럼 내의 어떠한 파장도 이 방식으로 적합될 수 있다. 또한, 다양한 나노입자 크기를 갖는 LSPR 지지 표면은 상이한 감도를 나타내므로 다양한 형태와 크기를 갖는 입자들을 사용하면 동적 범위를 한층 더 확대시키는 데 유용할 수 있다. 본 발명의 입자는 비제한적으로 구형 또는 삼각형일 수 있고, 귀금속 및 다른 물질, 즉 중합체, 금속, 금속 합금 또는 비-금속 복합체로 만들어진 입자일 수 있으며, 중공 또는 다공성일 수 있고, 상이한 재료, 액체 또는 내부 물질로 채워질 수 있으며, 5㎚ 내지 100㎛의 치수, 길이 또는 크기를 가질 수 있고, 기계적, 진공 또는 화학적 방법에 의해 패턴화되거나 마스크를 사용 및/또는 제거함으로써 제조될 수 있다.
A. LSPR 지지 표면
본 발명에서는 LSPR 지지 표면의 소광 스펙트럼의 변화를 검출할 수 있는데, 이 소광 스펙트럼은 생성물의 존재에 민감하다. 불용성 생성물의 존재로 인해 유도된 굴절률의 변화를 LSPR 지지 표면의 흡수 스펙트럼을 통해 모니터함으로써 항원을 보다 낮은 농도에서 검출할 수 있다.
도 1은 종래의 방법과 본 발명의 방법에서 수행되는 2-단계 비색 샌드위치 분석법을 보여준다. 종래의 방법은 항체로 피복된 표면으로부터 출발한다(1). 표적 분자(항원)를 함유한 시료를 첨가하여 표면-결합 항체와 항원 간의 결합을 개시한다(2). 이어서, 효소-결합된 제2 항체를 첨가한다(3). 기질을 첨가하면 착색된 효소 반응 생성물이 형성된다(4). 착색된 생성물이 표면 위에 얼마나 많이 형성되었는가에 따라서 시료에 존재하는 항원의 양을 측정한다(5). 본 발명의 방법은 고정화 항체를 갖는 금 입자 피복된 표면으로부터 출발한다(6). 항원을 함유한 시료를 첨가하여 첫 번째 항원/항체 반응을 일으킨다(7). 제2 항체를 첨가하고(8), 효소 반응을 위한 기질을 첨가한다(9). 마지막으로 금 입자의 소광 스펙트럼의 변화에 의해 항원의 양을 측정한다(10). 보다 긴 파장 쪽으로 전체 이동이 이루어진다. 상이한 파장에서 또는 전체 스펙트럼에서 스펙트럼 이동을 모니터함으로써 감도를 조절할 수 있다.
도 2는 1-단계 분석이라 불리우는 또 다른 면역 분석 방식의 수행 방법을 보여준다. 여기서는 항원과 제2 항체가 둘 다 여전히 액체상에 자유롭게 현탁된 상태에서 항원/제2 항체 복합체를 형성한다. 이 복합체가 표면-결합 항체에 의해 포착된다(2). 도 1의 2-단계 분석법에서와 같이, 검출은 금 입자의 소광 스펙트럼의 변화를 모니터함으로써 수행한다(3). 1-단계 분석법은 보다 짧은 분석 시간이 요구되는 시험에 적합하다.
도 3(1)은 효소 반응이 일어난 후의 금 입자의 주사 전자 현미경(SEM) 사진을 보여준다. 표지는 알칼리성 포스파타제이고, 기질은 NBT와 BCIP의 혼합물이다. 입자 직경은 100㎚이고, 입자를 둘러싸고 있는 외피는 효소 반응의 침착 생성물이다. 침착 두께는 약 20㎚로 추정된다. (2)는 IL-6 분석 마지막에서 효소 반응 동안의 광학 밀도의 최대 위치의 변화를 보여주는 그래프이다. 금 입자의 소광 스펙트럼의 피크는 570㎚에 존재하고, 모니터링의 파장 범위는 620 내지 630㎚이다. BCIP/NBT 기질 혼합물은 t= 50초에서 주입한다. 항원 농도는 상부로부터 하부까지 60, 6, 0.6, 0.06ng/㎖이다.
LSPR 지지 표면은 배열, 패턴화, 적층 또는 이들의 혼합 형태를 가질 수 있는 나노입자들을 포함할 수 있다. 나노입자는 콜로이드, 메쉬, 나노막대, 나노와이어 및 비드와 같은 임의의 크기 및 형상을 가질 수 있다. 나노입자는 단층 또는 다층의 나노입자일 수 있다. 일부의 양태에서, 나노입자는 단층을 형성한다.
LSPR 지지 표면의 나노입자는 단일 물질 또는 혼합 물질로 만들어질 수 있다. 나노입자가 혼합 물질로 만들어진 경우, 혼합물은 균질 또는 불균질일 수 있어서 나노입자 내에 2개 이상의 재료 층이 형성된다. 나노입자는 중공 또는 다공성일 수 있다. 나노입자는 불투명하거나 투명할 수 있고 빛을 투과시키거나 반사시킬 수 있으며 양쪽 모두일 수도 있다.
본 발명의 LSPR 지지 표면의 나노입자는 임의의 유용한 재료로 만들어질 수 있다. 본 발명의 나노입자로서 유용한 재료의 예로는 비제한적으로 금속, 중합체, 세라믹(예: 실리카) 및 유리가 포함된다.
일부의 양태에서, 본 발명의 나노입자는 Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, La, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au 및 Ac를 포함하는 전이 금속을 포함한다. 당업자는 상술된 전이 금속이 각각 다수의 상이한 산화 상태를 가질 수 있으며 이들 모두가 본 발명에 유용함을 알 것이다. 일부의 경우 가장 안정한 산화 상태가 형성되지만, 다른 산화 상태들도 본 발명에 유용하다. 추가로, 본 발명의 전이 금속은 금속 산화물일 수 있다. 일부의 양태에서, 전이 금속은 Au, Ag, Ta, Pt, Pd, Cu 또는 Rh일 수 있다. 다른 양태에서, 전이 금속은 금일 수 있다.
본 발명의 LSPR 지지 표면의 나노입자로서 유용한 중합체는 임의의 적합한 중합체일 수 있다. 일부의 양태에서, 중합체는 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리아크릴레이트일 수 있다. 일부의 양태에서, 나노입자는 유리, 또는 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리아크릴레이트를 포함하는 중합체일 수 있다. 본 발명의 나노입자로서 유용한 세라믹은 임의의 세라믹일 수 있다. 일부의 양태에서, 세라믹은 SiO2 또는 유리일 수 있다.
다른 양태에서는 재료들의 혼합물을 LSPR 지지 표면의 나노입자에 사용한다. 임의의 재료들의 배합물을 사용할 수 있다. 일부의 양태에서, 나노입자는 금으로 피복된 폴리스티렌 또는 금으로 피복된 유리일 수 있다. 당업자는 다른 재료들도 본 발명의 나노입자로서 유용함을 알 것이다.
다른 양태에서, LSPR 지지 표면의 각각의 나노입자는 상부와 하부를 갖는 비드이며, 상부는 전이 금속으로 피복된다. 다른 양태에서, 나노입자 비드는 폴리스티렌이고 전이 금속은 금이다. 금 피복된 유리 비드와 같이 본 발명의 나노입자 비드가 피복되는 경우, 피복물은 임의의 유용한 두께를 가질 수 있다. 일부의 양태에서, 금 피복물은 1㎚ 이하, 수 나노미터, 또는 수 백 나노미터의 두께를 가질 수 있다. 나노입자의 피복은 증발, 스퍼터링 및 CVD와 같은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 LSPR 지지 표면의 나노입자는 임의의 크기 및 치수를 가질 수 있다. 일부의 양태에서, 나노입자는 5㎚ 내지 약 1,000㎚의 크기를 갖는다. 다른 일부의 양태에서, 비드는 약 10㎚ 내지 약 1,000㎚의 직경을 갖는다. 또 다른 양태에서, 비드는 약 50㎚ 내지 약 500㎚의 직경을 갖는다. 당업자는 다른 크기 및 치수의 나노입자도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
본 발명에 사용되는 LSPR 지지 표면의 나노입자의 크기와 모양은 LSPR 지지 표면의 소광 피크를 가시광의 전 영역에 걸쳐서 어떠한 파장에도 적합되도록 조정할 수 있게 해준다. LSPR 지지 표면의 감도와 동적 범위도 상이한 모양, 크기 및 재료의 나노입자를 사용하여 조정할 수 있다.
본 발명의 고상 지지체는 LSPR 지지 표면을 지지하는 임의의 재료일 수 있다. 고상 지지체에 유용한 재료로는 비제한적으로 전이 금속, 세라믹, 중합체 및 유리가 포함된다. 당업자는 다른 재료들도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
고상 지지체의 표면을 평활화하거나 거칠게 하여 나노크기의 피쳐를 만듦으로써 표면을 개질시킬 수 있다. 일부의 양태에서, 고상 지지체는 상술된 바와 같은 전이 금속으로 피복된다. 일부의 다른 양태에서, 고상 지지체는 금으로 피복된다. 피복물은 1㎚ 미만, 수 나노미터 및 수 백 나노미터를 포함하는 임의의 유용한 두께를 가질 수 있다.
LSPR 지지 표면 및 고상 지지체 재료는 LSPR 지지 표면의 굴절률의 변화를 검출하는 데 사용되는 광의 파장에서 불투명하거나 투명할 수 있다. 일부의 양태에서는 반사광을 사용하여 LSPR 지지 표면의 굴절률의 변화를 검출한다. 다른 양태에서는 투과광을 사용하여 LSPR 지지 표면의 굴절률의 변화를 검출한다. 다른 일부의 양태에서는 반사광과 투과광을 둘 다 사용하여 불용성 생성물의 존재를 검출한다.
B. 분석, 효소 및 효소 기질
본 발명의 방법은 분석물을 포착 물질에 의해 포착한 후 검출 물질을 사용하여 검출하는 임의의 적합한 분석법으로 수행될 수 있다. 통상적으로 이것은 포착제와 검출제를 포함하는 샌드위치 분석법이다. 상기 물질들은 가장 일반적으로는 항체이나, 호르몬 수용체, 애드넥틴 또는 임의의 다른 분석물 결합제의 배합물일 수도 있다.
일부의 양태에서, 분석법은 면역 분석법이다. 다양한 방식의 면역 분석법은 비제한적으로 고상 ELISA 면역 분석법(참조: Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988), 특정한 면역 반응을 측정하는 데 사용될 수 있는 면역 분석법의 방식과 조건의 설명)을 포함할 수 있다. 분석물을 검출하는 데 사용될 수 있는 면역 분석법으로는 예컨대 웨스턴 블롯, 방사능 면역 분석법, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석법), "샌드위치" 면역 분석법, 면역침전 분석법, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 분석법, 응집 분석법, 보체-고정 분석법, 면역방사 분석법, 형광 면역 분석법, 단백질 A 면역 분석법 등과 같은 경쟁 및 비경쟁 분석 시스템이 포함된다. 바람직한 양태에서, 분석법은 ELISA 분석법과 같은 샌드위치 분석법이다. ELISA 분석법은 미지량의 항원을 표면에 부착시킨 후 표면 위에 특정한 항체를 첨가하여 그것이 항원과 결합할 수 있도록 하는 단계를 포함한다. 이 항체는 효소에 결합하고, 최종 단계에서 어떤 물질을 첨가하여 효소가 일부의 검출가능한 신호로 전환될 수 있게 한다. 이와 같이, 형광 ELISA의 경우에는 시료 위에 광이 조사될 때 임의의 항원/항체 복합체가 형광을 내어 시료 중의 항원의 양을 측정할 수 있다.
ELISA의 수행은 특정한 항원에 대해 특이성을 갖는 하나 이상의 항체를 포함한다. 미지량의 항원을 갖는 시료를 고상 지지체 위에 (표면에의 흡착을 통해서) 비특이적으로 고정화하거나 ("샌드위치" ELISA에서는 동일한 항원에 특이적인 다른 항체에 의한 포착을 통해서) 특이적으로 고정화한다. 항원이 고정화된 후, 검출 항체를 첨가하여 항원과의 복합체를 형성한다. 검출 항체는 효소에 공유 결합할 수 있거나, 생접합을 통해 효소에 결합되는 제2의 항체에 의해 그 자체로 검출될 수 있다. 각각의 단계 사이에서는 통상적으로 플레이트를 온화한 세제 용액으로 세정하여 특이적으로 결합하지 않은 임의의 단백질 또는 항체를 제거한다. 최종의 세정 단계 후, 효소 기질을 첨가하여 플레이트를 전개시켜서 시료 중의 항원의 양을 나타내는 가시적 신호를 생성한다.
본 발명에 유용한 효소는 가용성 화합물을 불용성 화합물로 전환시키는 것들이다. 본 발명에 유용한 효소의 예로는 비제한적으로 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이 퍼옥시다제가 포함된다. 당업자는 다른 효소들도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
본 발명에 유용한 효소 기질은 효소에 의해서 가용성 화합물로부터 불용성 화합물로 전환되는 것들을 포함한다. 일부의 양태에서, 가용성 화합물은 색을 띠지 않고 불용성 화합물은 색을 띤다. 효소 기질의 예로는 니트로-블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT), 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염(BCIP), 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(4-CN) 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)가 비제한적으로 포함된다. 추가의 효소 기질로는 ECL 또는 ECL 플러스(Plus)로 알려진 전기화학적 발광 화학물질이 포함된다. 당업자는 다른 효소 기질들도 본 발명에 유용함을 알 것이다.
다른 양태에서, 효소는 항체에 부착됨으로써 고정화된다. 일부의 다른 양태에서, 효소는 샌드위치 분석법을 통해서 고정화된다.
포착제를 배치하기 위해 다수의 상이한 방법들이 이용될 수 있다. 가장 간단한 방법은 항체를 LSPR 지지 표면 위에 직접 위치시키는 것이다. 포착제를 금 입자와는 다른 표면 위에 부착시킬 수도 있다. 이 표면은 위치가 금 입자에 대해 영구적으로 정해지거나 효소 반응의 기간 동안에만 정해질 수 있다. 예컨대, 포착제는 고상 지지체 위, 또는 자성 비드와 같은 제2의 고상 지지체 위에 고정화될 수 있다. 일부의 양태에서, 포착제는 항체이다.
본 발명의 효소는 임의의 적합한 방식으로 나노입자 또는 고상 지지체에 고정화될 수 있다. 효소의 고정화는 공유 결합 형성, 이온 결합 형성, 수소 결합 및 반데르발스 힘 등을 통해서 이루어질 수 있다. 도 4는 항체가 부착될 수 있는 다양한 방식을 보여준다. 항체는 (1)에서와 같이 LSPR 지지 표면의 나노입자 위에 직접 부착되거나, (2)에서와 같이 나노입자에 근접한 별개의 영역 위에 부착될 수 있다. 달리, 항체는 항체-피복된 표면에 가까운 부근에 위치할 수 있는 별개의 표면 위에 부착될 수 있으며, 이 경우 항체에의 항원 접근을 보장하고 조사 광이 항체-피복 표면에 도달하도록 하기 위해 지지 표면은 다공성이면서 투명하게 만들어진다. 또 다른 시도는 외부 자석에 의해 금 입자 피복 표면에 접촉하게 될 수 있는 항체-피복 자성 비드를 사용한다(4). 효소 반응 생성물이 침착된 후, 자성 비드를 제거하여 광학적 판독을 용이하도록 할 수 있다. 항체를 별개의 표면 위에 부착시키는 방식의 이점은 신호가 증가한다는 것인데, 이미 항체로 덮혀진 LSPR 지지 표면보다는 아무 것도 없는 LSPR 지지 표면 위에 효소 반응 생성물이 침착될 때 변화가 더 커진다.
다른 양태에서, LSPR 지지 표면은 제1 고상 지지체 위에 존재한다. 다른 양태에서, 효소는 제1 고상 지지체 위에 고정화된다. 일부의 다른 양태에서, 효소는 생성 단계 동안 LSPR 지지 표면에 가까운 부근에 존재하는 제2 고상 지지체 위에 고정화된다. 또 다른 양태에서, 제2 고상 지지체는 투명하다. 다른 양태에서, 제2 고상 지지체는 자성 비드이다. 다른 양태에서, 제1 고상 지지체의 표면은 매끄럽다. 또 다른 양태에서, 제1 고상 지지체의 표면은 거칠거칠하다.
청구된 본 발명에 유용한 자성 라텍스 비드 및 산화철 입자와 같은 자성 비드 또는 입자는 당업자들에게 알려져 있다. 예컨대, 자성 입자는 미국 특허 제4,672,040호에 기술되어 있다. 자성 입자는 예를 들면 PerSeptive Biosystems, Inc.사(Framingham Mass.), Ciba Corning사(Medfield Mass.), Bangs Laboratories사(Carmel Ind.), 및 BioQuest, Inc.사(Atkinson N.H.)로부터 시판된다.
항체와 유사한 방식으로 표적물을 표적화하고 이에 결합하는 기타의 화합물들이 개발되고 있다. 이들 "항체 모사물" 중 일부는 항체의 가변 부위를 위한 단백질 골격 대체물로서 비-면역글로불린 단백질 골격을 사용한다.
예컨대, 미국 특허 제5,260,203호(Ladner 외)에는 결집되어 있으나 분자적으로는 분리된 경쇄 및 중쇄 가변 부위의 항체와 유사한 결합 특이성을 갖는 단일 폴리펩타이드 쇄 결합 분자가 개시되어 있다. 이 단일쇄 결합 분자는 펩타이드 링커로 연결된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위 둘 모두의 항원 결합 부위를 함유하고, 2개의 펩타이드 항체의 것과 유사한 구조로 접혀질 것이다. 단일쇄 결합 분자는 종래의 항체에 비해 크기가 더 작고 안정성이 더 높으며 더 쉽게 개질된다는 등의 다수의 이점을 제공한다.
사이토크롬 b562 기반 항체에 대한 대체물이 문헌에 기술되어 있다(참조: Ku 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(14):6552-6556 (1995)). 쿠(Ku) 등(1995)은 사이토크롬 b562의 2개의 루프를 소 혈청 알부민에 대한 결합을 위해 무작위로 선택한 라이브러리를 창출하였다. 개별적인 돌연변이들은 항-BSA 항체와 유사하게 BSA와 선택적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다.
미국 특허 제6,818,418호 및 제7,115,396호(Lipovsek 외)에는 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유사 단백질 골격과 하나 이상의 가변 루프가 특징인 항체 모사물이 개시되어 있다. 애드넥틴으로 알려진 이들 피브로넥틴-기반 항체 모사물은 임의의 표적 리간드에 대한 높은 친화성 및 특이성을 포함하여 천연 또는 합성의 항체와 동일한 다수의 특성을 나타낸다. 신규 또는 개선된 결합 단백질을 개발하기 위한 임의의 기술이 이들 항체 모사물에 사용될 수 있다.
이들 피브로넥틴-기반 항체 모사물의 구조는 IgG 중쇄의 가변 부위의 구조와 유사하다. 따라서, 이들 모사물은 천연 항체의 것과 성질 및 친화성이 유사한 항원 결합 특성을 나타낸다. 또한, 이들 피브로넥틴-기반 항체 모사물은 항체 및 항체 단편에 대해 특정한 이점을 나타낸다. 예를 들면, 이들 항체 모사물은 고유의 접힘 안정성에 대해 다이설파이드 결합에 의존하지 않기 때문에 보통은 항체를 분해시키는 조건에서 안정하다. 또한, 이들 피브로넥틴-기반 항체 모사물의 구조는 IgG 중쇄의 것과 유사하기 때문에, 생체내 항체의 친화성 성숙 과정과 유사한 루프 무작위화 및 셔플링(shuffling) 과정을 시험관내에서 사용할 수 있다.
리포칼린 골격을 기반으로 하는 항체 모사물(안티칼린(Anticalin®))이 문헌에 기술되어 있다(참조: Beste 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96(5): 1898-1903 (1999)). 리포칼린은 단백질의 말단에 4개의 과가변 루프를 갖는 β-배럴(barrel)로 구성된다. 베스테(Beste)(1999)는 루프를 무작위 돌연변이화하고 예컨대 플루오레세인과의 결합을 위해 선택하였다. 3개의 변이는 플루오레세인과의 특이적 결합을 나타내었고, 1개의 변이는 항-플루오레세인 항체의 것과 유사한 결합을 보였다. 추가의 분석 결과 모든 무작위화 위치는 가변성인 것으로 드러났고 이것은 안티칼린®이 항체의 대체물로서 사용되기에 적합함을 나타낸다.
안티칼린®은 통상적으로 160 내지 180개의 잔기를 갖는 작은 단일쇄 펩타이드로, 항체에 비해서 생산 비용이 낮고 저장 안정성이 높으며 면역 반응이 낮다는 등의 다수의 이점을 제공한다.
미국 특허 제5,770,380호(Hamilton 외)에는 결합 부위로 사용된 다수의 가변 펩타이드 루프에 부착된 칼릭사렌(calixarene)의 경질 비-펩타이드 유기 골격을 사용한 합성 항체 모사물이 개시되어 있다. 펩타이드 루프들은 칼릭사렌으로부터 기하학적으로 동일한 측면으로 모두 돌출되어 있다. 이러한 기하학적 구조 때문에 모든 루프들이 결합에 이용될 수 있어서 리간드에 대한 결합 친화성이 증가한다. 그러나, 다른 항체 모사물에 비해서 칼릭사렌-기반 항체 모사물은 전적으로 펩타이드로 이루어지지 않았기 때문에 프로테아제 효소에 의한 공격에 덜 취약할 수 있다. 골격도 순전히 펩타이드, DNA 또는 RNA로 이루어지지 않아서 이 항체 모사물은 엄격한 환경 조건에서 비교적 안정하고 장시간의 수명을 갖는다. 또한, 칼릭사렌-기반 항체 모사물은 비교적 작기 때문에 면역 반응을 일으킬 확률이 더 적다.
항체를 보다 작은 펩타이드 모사물로 환원시키는 방법이 문헌에 논의되어 있다(참조: Murali 외, Cell Mol Biol 49(2):209-216 (2003)). 이 펩타이드 모사물은 "항체-유사 결합 펩타이드 모사물"(ABiP)이라 불리우며, 항체의 대체물로서 유용할 수 있다.
비-면역글로불린 단백질 골격 이외에, RNA 분자와 인위적 올리고머(예: 프로테아제 억제제, 벤조디아제핀, 푸린 유도체 및 베타-회전 모사물)를 포함하는 화합물에서도 항체의 특성이 모사되었다.
효소를 표면에 결합시키기 위한 추가의 방법에서는 동종 이관능성 및 이종 이관능성 링커를 사용한다. 길이가 0인 가교결합제는 어떠한 외부 물질도 도입시키지 않으면서 2개의 리간드를 직접 접합시킨다. 다이설파이드 결합의 형성을 촉매하는 시약이 이 범주에 속한다. 또 다른 예는 카복시 그룹과 일차 아미노 그룹을 축합시켜서 아미드 결합을 형성하는 시약, 예컨대 카보디이미드, 에틸클로로포르메이트, 우드워드(Woodward) 시약 K1, 카보닐디이미다졸 등이다. 동종 이관능성 시약은 2개의 동일한 관능 그룹을 함유하는 반면, 이종 이관능성 시약은 2개의 다른 관능 그룹을 함유한다. 대부분의 이종 이관능성 가교결합제는 일차 아민-반응성 그룹과 티올-반응성 그룹을 함유한다. 포르밀과 티올의 결합을 위한 신규한 이종 이관능성 링커가 문헌에 개시되어 있다(참조: Heindel, N. D. 외, Bioconjugate Chem. 2, 427-430 (1991)). 바람직한 양태에서, 공유 가교결합제는 다이설파이드(-S-S-), 글리콜(-CH(OH)-CH(OH)-), 아조(-N=N-), 설폰(-S(=O2)-) 또는 에스테르(-C(=O)-O-) 결합을 형성할 수 있는 시약들로부터 선택된다.
다른 방법에서는 리간드들을 이들의 올리고사카라이드를 통해서 결합시킨다. 폴리펩타이드 리간드 위의 올리고사카라이드를 화학적 또는 효소적으로 산화시켜서 알데하이드를 수득하면 분자 위에 단독의 관능 그룹이 얻어지는데 이것은 예컨대 아민 하이드라진, 하이드라지드 또는 세미카바자이드를 함유하는 화합물과 반응할 수 있다. 폴리펩타이드 분자 내에 글리코실화 부위가 잘 한정되어 있기 때문에, 산화된 올리고사카라이드 잔기를 통한 선택적 결합은 다른 결합 방법에 비해서 더 균일한 생성물을 제공할 것이고, 리간드의 수용체 결합 특성에 악영향을 덜 미칠 것으로 예상된다. 예컨대 1992년 8월 5일자로 출원된 동시 계류 중인 특허 출원 일련 번호 제07/926,077호, 미국 특허 제5,329,029호에는 탄수화물-표적 이종 이관능성 가교결합제가 개시되어 있다.
C. 검출
본 발명의 방법에서 색 변화의 검출은 어떠한 검출 방법으로도 달성될 수 있다. 일부의 양태에서는 적합한 장치를 사용하여 비색 검출에 의해 달성한다. 다른 양태에서는 육안으로 검출한다. LSPR 지지 표면에 대한 굴절률 변화의 검출은 임의의 파장에서 수행하며 특히 약 200 내지 약 1,000㎚의 파장을 갖는 광을 사용한다. LSPR 지지 표면의 굴절률 변화를 검출하는 데 유용한 검출 장치로는 UV-Vis 분광 광도계 및 플레이트 판독기가 비제한적으로 포함된다.
Ⅳ. LSPR 센서
본 발명의 LSPR 센서는 제1 고상 지지체, 제1 고상 지지체 위에 배치된 상술된 바와 같은 LSPR 지지 표면, LSPR 지지 표면에 근접해 있는 고정화 효소, 및 효소 기질을 포함한다.
Ⅴ. 키트
일부의 양태에서, 본 발명은 상술된 바와 같은 LSPR 센서와 효소 기질을 갖는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 용매, 완충액, 안정화제 및 사용 설명서도 포함할 수 있다.
Ⅵ. 실시예
실시예 1. LSPR 표면에서의 굴절률 변화의 검출
LSPR 표면 위에서의 면역 분석을 위한 프로토콜을 아래에 설명된 여러 단계에 따라서 수행한다.
단계 1. 포착 항체의 고정화
먼저 당업계에 알려진 방법을 사용하여 LSPR 지지 표면을 제조하는데, 이 방법은 유리 기판 위에 금을 침착시킨 후, 금 피복된 유리 기판 위에 단층의 폴리스티렌 비드를 형성하고, 이어서 또 다른 층의 금을 전체 표면에 걸쳐서 침착시킴을 포함한다. 이어서, 금 피복 표면을 하이드록실-알칸티올과 카복실-알칸티올의 혼합물(9:1 비율)을 갖는 자기 조립 단층(SAM)으로 개질시킨다.
SAM-관능화된 LSPR 지지 표면을 0.05% 트윈(Tween) 20 수용액으로 세척한다. 이어서, 이것을 ddH2O로 세정하고 건조시킨다. LSPR 지지 표면의 카복실 그룹을 (0.1M MES 완충액 중의 100mM NHS + 400mM EDC)의 용액으로 15 내지 30분간 활성화시킨다(참조: Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996).
30분간의 항온처리 후, 용액을 씻어내고 500nM 항체 용액으로 교체한다. 항체 용액은 PBS와 같은 아민-무함유 완충액 중의 용액이다. 항체 고정화는 30분 내지 24시간 동안 수행한다. 예컨대, C-반응성 단백질 검출을 위한 포착 항체는 마우스 모노클로날 항-CRP 항체(제조원: Biodesign, Cat# M86007M)이다. 표면을 30분간 50mM 아미노-폴리에틸렌 옥사이드 수용액과 반응시켜서 나머지의 EDC/NHS-활성화 카복실 그룹을 켄칭한다.
이어서, 표면을 물로 세척하고 스타팅블록(StartingBlock) 완충액(제조원: Pierce chemicals) 중에서 15분간 항온처리함으로써 비-특이적 결합에 대해 추가로 차단시킨다. 이어서, 포착 항체로 활성화된 LSPR 지지 표면을 ddH2O로 세정하고 센서 사용시까지 습한 환경에서 유지시킨다.
단계 2. 항원의 포착
C-반응성 단백질(CRP)을 포스페이트 완충 염수(PBS), 1mM Ca2+, 0.01%(v/v) 트윈 20 및 10μM BSA(소 혈청 알부민)로 구성된 완충액(완충액 A) 중에 1pM(10-12M) 내지 1μM(10-6M) 범위의 다양한 농도로 희석한다. 이어서, 항원을 항체 활성화된 LSPR 지지 표면과 함께 5분 내지 2시간 동안 항온처리한다.
단계 3. 제2 항-항원 항체 포착
이어서, 센서를 폴리클로날 염소 항-사람 CRP 항체(Bethyl Labs, Cat# A80- 125A)와 함께 완충액 A 중에서 250nM의 농도로 항온처리한다. 이 항체를 효소 또는 프로브(예: 비오틴)로 표지시킬 수 있다. 15 내지 30분간의 항온처리 후, 제2 항체를 완충액으로 씻어낸다.
단계 4. 제2 항-항원 항체에 대한 효소-결합 항체
이어서, 효소-결합 항체인 당나귀 항 염소 IgG 항체 알칼리성 포스파타제 접합체(제조원: Bethyl Lab, Cat# A50-101AP)를 약 2 내지 30분간 반응시킨 후 완충액 A로 씻어낸다.
단계 5. 비색 분석
LSPR 지지 표면에 효소 기질을 첨가하고 30초 내지 10분간 항온처리한다. 반응하지 않은 효소 기질을 물로 씻어낸다. 이어서, 표면의 흡수 스펙트럼 또는 반사 스펙트럼을 측정한다.
본 발명을 명확한 이해를 위해서 예시와 실시예를 통해 상세히 설명하였으나, 당업자는 첨부된 청구의 범위 내에서 특정한 변화와 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에 제공된 각각의 문헌은 이들이 개별적으로 인용된 바와 동일한 정도로 전문이 참조로서 인용된다.

Claims (22)

  1. a) 고정화 효소를 사용하여 효소 기질로부터 불용성 생성물을 생성하는 단계 (여기서, 상기 불용성 생성물은 국소 표면 플라스몬 공명(LSPR) 지지 표면에 축적된다); 및
    b) LSPR을 사용하여 상기 불용성 생성물의 존재로 인한 상기 표면의 반사광 또는 투과광의 변화를 검출하는 단계
    를 포함하는, LSPR 검출 장치의 표면에서의 굴절률의 변화를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표면이 나노입자들을 포함하고, 각각의 나노입자는 약 5㎚ 내지 약 1,000㎚의 크기를 갖는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 각각의 나노입자가 Au, Ag, Ta, Pt, Pd, Rh 및 Cu로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 전이 금속을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 전이 금속이 금인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 각각의 나노입자가 유리, 또는 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트 및 폴리아크릴레이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중합체를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 나노입자가 상부와 하부를 갖는 비드(bead)이며, 상부는 상기 전이 금속으로 피복되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 나노입자 비드가 폴리스티렌을 포함하고, 상기 전이 금속이 금을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 효소 기질이 니트로-블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT), 5-브로모-4-클로로-3'-인돌릴포스페이트 p-톨루이딘 염(BCIP), 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘(TMB), 4-클로로-1-나프톨(4-CN) 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 구성원인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 효소가 알칼리성 포스파타제 및 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 구성원인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 효소가 항체에 부착됨으로써 고정화되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 효소가 샌드위치(sandwich) 분석법을 통해 고정화되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 검출 단계가 LSPR을 사용하여 불용성 생성물의 존재로 인한 표면의 반사광의 변화를 검출함을 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 검출 단계가 LSPR을 사용하여 불용성 생성물의 존재로 인한 표면의 투과광의 변화를 검출함을 포함하는 방법.
  14. 제2항에 있어서, LSPR 지지 표면이 제1 고상 지지체 위에 존재하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 효소가 제1 고상 지지체 위에 고정화되는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 효소가 상기 생성 단계 동안 LSPR 지지 표면에 가까운 부근에 존재하는 제2 고상 지지체 위에 고정화되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 제2 고상 지지체가 투명한 방법.
  18. 제16항에 있어서, 제2 고상 지지체가 자성 비드인 방법.
  19. 제14항에 있어서, 제1 고상 지지체의 표면이 매끄러운 방법.
  20. 제14항에 있어서, 제1 고상 지지체의 표면이 거칠거칠한 방법.
  21. 제1 고상 지지체;
    상기 제1 고상 지지체 위에 배치된 LSPR 지지 표면; 및
    상기 LSPR 지지 표면에 근접해 있는 고정화 효소
    를 포함하는 LSPR 센서.
  22. 제21항에 따른 LSPR 센서; 및
    효소 기질
    을 포함하는 키트.
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