JPH08320322A - 表面第二高調波及び和周波発生イムノ及びエンザイムアッセイ - Google Patents
表面第二高調波及び和周波発生イムノ及びエンザイムアッセイInfo
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- JPH08320322A JPH08320322A JP10956696A JP10956696A JPH08320322A JP H08320322 A JPH08320322 A JP H08320322A JP 10956696 A JP10956696 A JP 10956696A JP 10956696 A JP10956696 A JP 10956696A JP H08320322 A JPH08320322 A JP H08320322A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 結合反応から得られる界面域におけるメジア
の特性の変化を利用し、非線形光学技術により検出し得
るイムノアッセイ、ポリヌクレオチドハイブリッド形成
及びエンザイムアッセイに関する方法を提供するもので
ある。 【解決手段】 特定の抗体、抗原、ポリヌクレオチド、
酵素、酵素基質又は酵素阻害剤が配置された表面と接触
する可溶性相における抗体、抗原、ポリヌクレオチド、
酵素、酵素基質又は酵素阻害剤の非分離アッセイ法であ
って、その相互作用は、表面第二高調波発生又は和周波
発生により検出及び定量できる非線形光学特性における
変化をもたらす非分離アッセイ法である。基質の存在下
酵素反応の相補的阻害剤と酵素の相互作用又は基質と酵
素との相互作用から得られる表面の非線形光学特性の変
化による、モニターされる表面に配置された酵素の環境
的ドメイン、ボディ流体又は生産物流中に存在する基質
の連続アッセイ法である。
の特性の変化を利用し、非線形光学技術により検出し得
るイムノアッセイ、ポリヌクレオチドハイブリッド形成
及びエンザイムアッセイに関する方法を提供するもので
ある。 【解決手段】 特定の抗体、抗原、ポリヌクレオチド、
酵素、酵素基質又は酵素阻害剤が配置された表面と接触
する可溶性相における抗体、抗原、ポリヌクレオチド、
酵素、酵素基質又は酵素阻害剤の非分離アッセイ法であ
って、その相互作用は、表面第二高調波発生又は和周波
発生により検出及び定量できる非線形光学特性における
変化をもたらす非分離アッセイ法である。基質の存在下
酵素反応の相補的阻害剤と酵素の相互作用又は基質と酵
素との相互作用から得られる表面の非線形光学特性の変
化による、モニターされる表面に配置された酵素の環境
的ドメイン、ボディ流体又は生産物流中に存在する基質
の連続アッセイ法である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗体−抗原相互作
用(interaction) 、ポリヌクレオチドハイブリッド形成
及び酵素基質複合体を検出し、定量するために表面第二
高調波及び和周波発生を使用する非線形光学方法に関す
る。
用(interaction) 、ポリヌクレオチドハイブリッド形成
及び酵素基質複合体を検出し、定量するために表面第二
高調波及び和周波発生を使用する非線形光学方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】複合生物学的及び生物化学的物質内の多
くの化合物の検出及び測定は、臨床及び法的研究におけ
る基礎的必要事項であり、またバイオテクノロジー産業
及び環境モニターにおいて重要性が増大してきている。
くの化合物の検出及び測定は、臨床及び法的研究におけ
る基礎的必要事項であり、またバイオテクノロジー産業
及び環境モニターにおいて重要性が増大してきている。
【０００３】ほとんど全ての量に関するイムノアッセイ
の根幹にある基本的原理は、試験サンプルに試薬を添加
して、サンプル中に特定の成分や試薬の複合体を形成す
るというものである。結合した試薬の濃度と比較して、
結合しないままの試薬の濃度により、特定成分の測定が
なされる。多くのヘテロジニアス試験においては、結合
した試薬から結合してない試薬を分離する必要がある。
通常このことは、数種の物理的プロセスによりなされる
が、該物理的プロセスは、しばしば長時間を要し、高価
で、人手がかかり、物質の浪費を招く。複合体の形成を
視覚的に認識するために二次手順が用いられる他の試験
においては、反応が検出され得る以前に、長いインキュ
ベーション期間がしばしば要される。従来のイムノアッ
セイに伴う他の問題には、試薬の毒性、短い有効な半減
期及び費用が含まれる。例えば、最も感度が良く、広く
用いられているアッセイ技術の1 つに、ラジオイムノア
ッセイがある。しかし、かかる技術は、放射性試薬及び
廃棄物による身体上の危険性や、放射性標識の半減期に
より制限される有効な寿命期間に問題がある。
の根幹にある基本的原理は、試験サンプルに試薬を添加
して、サンプル中に特定の成分や試薬の複合体を形成す
るというものである。結合した試薬の濃度と比較して、
結合しないままの試薬の濃度により、特定成分の測定が
なされる。多くのヘテロジニアス試験においては、結合
した試薬から結合してない試薬を分離する必要がある。
通常このことは、数種の物理的プロセスによりなされる
が、該物理的プロセスは、しばしば長時間を要し、高価
で、人手がかかり、物質の浪費を招く。複合体の形成を
視覚的に認識するために二次手順が用いられる他の試験
においては、反応が検出され得る以前に、長いインキュ
ベーション期間がしばしば要される。従来のイムノアッ
セイに伴う他の問題には、試薬の毒性、短い有効な半減
期及び費用が含まれる。例えば、最も感度が良く、広く
用いられているアッセイ技術の1 つに、ラジオイムノア
ッセイがある。しかし、かかる技術は、放射性試薬及び
廃棄物による身体上の危険性や、放射性標識の半減期に
より制限される有効な寿命期間に問題がある。
【０００４】２つの方策が、非放射性検出に通常用いら
れており、(1) 酵素又は発蛍光団をプローブ内に組み込
む直接方法、(2) プローブをリガンド（ビオチン／ハプ
テン）により修飾し、ランタニド又は酵素を用いるリガ
ント−特定プロティンの複合体(conjugates)を形成した
後に検出する間接法である。光学検出法には、吸光及び
蛍光測定が含まれる。
れており、(1) 酵素又は発蛍光団をプローブ内に組み込
む直接方法、(2) プローブをリガンド（ビオチン／ハプ
テン）により修飾し、ランタニド又は酵素を用いるリガ
ント−特定プロティンの複合体(conjugates)を形成した
後に検出する間接法である。光学検出法には、吸光及び
蛍光測定が含まれる。
【０００５】結合しない試薬と結合した試薬との分離を
必要としない方法は知られており、メジア(medea) 間の
界面に存在する特異な光学特性を用いるものである。か
かる特性を利用した１つの方法は、表面プラズモン共振
であり；これは、バイオ特異性反応を検出するために市
場化されている（ＢＩＡコア；ファーマシア（登録商
標）（ＢＩＡ core; Pharmacia（登録商標）スウェーデ
ン）。表面光−ベンディング及びエバネッセント導波路
イムノセンサー技術も開示されている（米国特許第４８
８０７５２号）。しかし、バイオアッセイに関する非線
形光信号の使用は全く存在しない。
必要としない方法は知られており、メジア(medea) 間の
界面に存在する特異な光学特性を用いるものである。か
かる特性を利用した１つの方法は、表面プラズモン共振
であり；これは、バイオ特異性反応を検出するために市
場化されている（ＢＩＡコア；ファーマシア（登録商
標）（ＢＩＡ core; Pharmacia（登録商標）スウェーデ
ン）。表面光−ベンディング及びエバネッセント導波路
イムノセンサー技術も開示されている（米国特許第４８
８０７５２号）。しかし、バイオアッセイに関する非線
形光信号の使用は全く存在しない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、結合反応か
ら得られる界面域におけるメジアの特性の変化を利用
し、非線形光学技術により検出し得るイムノアッセイ、
ポリヌクレオチドハイブリッド形成及びエンザイムアッ
セイに関する方法を提供するものである。
ら得られる界面域におけるメジアの特性の変化を利用
し、非線形光学技術により検出し得るイムノアッセイ、
ポリヌクレオチドハイブリッド形成及びエンザイムアッ
セイに関する方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、特定の抗体、
抗原、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は酵素阻害
剤が配置された表面と接触する可溶性相における抗体、
抗原、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は酵素阻害
剤の非分離アッセイ法であって、その相互作用は、表面
第二高調波発生又は和周波発生により検出及び定量でき
る非線形光学特性における変化をもたらす非分離アッセ
イ法である。
抗原、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は酵素阻害
剤が配置された表面と接触する可溶性相における抗体、
抗原、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は酵素阻害
剤の非分離アッセイ法であって、その相互作用は、表面
第二高調波発生又は和周波発生により検出及び定量でき
る非線形光学特性における変化をもたらす非分離アッセ
イ法である。
【０００８】また本発明は、基質の存在下酵素反応の相
補的阻害剤と酵素の相互作用又は基質と酵素との相互作
用から得られる表面の非線形光学特性の変化による、モ
ニターされる表面に配置された酵素の環境的ドメイン、
ボディ流体又は生産物流中に存在する基質の連続アッセ
イ法である。
補的阻害剤と酵素の相互作用又は基質と酵素との相互作
用から得られる表面の非線形光学特性の変化による、モ
ニターされる表面に配置された酵素の環境的ドメイン、
ボディ流体又は生産物流中に存在する基質の連続アッセ
イ法である。
【０００９】好ましくは、上記表面は、抗原、抗体、ポ
リヌクレオチド、酵素、酵素基質又は酵素阻害剤が付着
しているガラス、ポリマー又は金属層から成り、複合体
形成は表面層の非線形光学特性を変化させる。
リヌクレオチド、酵素、酵素基質又は酵素阻害剤が付着
しているガラス、ポリマー又は金属層から成り、複合体
形成は表面層の非線形光学特性を変化させる。
【００１０】また、好ましくは、ポリヌクレオチドハイ
ブリッド形成は２本鎖ポリヌクレオチドに関する抗体特
異性の結合により検出される。
ブリッド形成は２本鎖ポリヌクレオチドに関する抗体特
異性の結合により検出される。
【００１１】また好ましくは、複合体形成における表面
非線形光学特性における変化は、任意の相互作用する種
にリガンドを付着することにより増強され、これは複合
体形成において表面での構造的及び／又は電界不連続部
を増大させる。
非線形光学特性における変化は、任意の相互作用する種
にリガンドを付着することにより増強され、これは複合
体形成において表面での構造的及び／又は電界不連続部
を増大させる。
【００１２】また好ましくは、表面層の非線形光学特性
を、外部の電界を適用することにより変調する。
を、外部の電界を適用することにより変調する。
【００１３】また好ましくは、表面で相互作用をする種
の相互配向が得られるように、複合体形成がなされる。
の相互配向が得られるように、複合体形成がなされる。
【００１４】本発明は、以下の点に特徴を有する。 １．生物学的分子（抗体、抗原、ポリヌクレオチド、エ
ンザイム、エンザイム基質及びアナログ）間の相互作用
を直接定量するための非線形光学プロセスの利用であ
る。 ２．検出は表面特異性であり、従って表面層と相互作用
しない未反応成分／種の存在下でアッセイを実施するこ
とができる。このことは、結合した成分と結合しない成
分を分離する必要性を排除するものである。
ンザイム、エンザイム基質及びアナログ）間の相互作用
を直接定量するための非線形光学プロセスの利用であ
る。 ２．検出は表面特異性であり、従って表面層と相互作用
しない未反応成分／種の存在下でアッセイを実施するこ
とができる。このことは、結合した成分と結合しない成
分を分離する必要性を排除するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】図１には、和−及び差−周波発生
のような二次光学プロセスは、メジア内で、反転シンメ
トリーとともに許容されないが、かかるシンメトリーは
界面で破壊される必要があり、従って非線形プロセスが
許容されることを示すものである。二次光学プロセス
は、界面での構造的不連続部及び電界から発現する。従
って、表面１における変化、例えば表面分子層２の形成
による変化は、検出される表面第二高調波信号３におい
て測定し得る変化をもたらす。当該信号は、更に、表面
に関する励起発光ベクトルの角度θ及び分子配向の度合
いに強く依存する。従って、表面層の表面非線形係数又
は配向が、例えば表面分子と第二分子との間の複合体の
形成により変化した場合には、第二高調波信号の特性
（例えば偏光、光度及び方向）も変化する。
のような二次光学プロセスは、メジア内で、反転シンメ
トリーとともに許容されないが、かかるシンメトリーは
界面で破壊される必要があり、従って非線形プロセスが
許容されることを示すものである。二次光学プロセス
は、界面での構造的不連続部及び電界から発現する。従
って、表面１における変化、例えば表面分子層２の形成
による変化は、検出される表面第二高調波信号３におい
て測定し得る変化をもたらす。当該信号は、更に、表面
に関する励起発光ベクトルの角度θ及び分子配向の度合
いに強く依存する。従って、表面層の表面非線形係数又
は配向が、例えば表面分子と第二分子との間の複合体の
形成により変化した場合には、第二高調波信号の特性
（例えば偏光、光度及び方向）も変化する。
【００１６】レーザーの出力周波数ｆ又は２ｆが表面種
（抗原、抗体、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は
基質アナログ）の分子励起に近い場合、表面非線形感受
性は共振増強を示す。このことは適切なレーザー又は同
調可能レーザーを使用することにより、又は抗体、抗
原、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は基質アナロ
グに対し、ｆ又は２ｆに近い分子励起を有するレポータ
ー分子の共有結合(covalent)又は他の付着物により達成
することができ、これにより共振増強の条件が生ずる。
（抗原、抗体、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は
基質アナログ）の分子励起に近い場合、表面非線形感受
性は共振増強を示す。このことは適切なレーザー又は同
調可能レーザーを使用することにより、又は抗体、抗
原、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質又は基質アナロ
グに対し、ｆ又は２ｆに近い分子励起を有するレポータ
ー分子の共有結合(covalent)又は他の付着物により達成
することができ、これにより共振増強の条件が生ずる。
【００１７】界面に関する入射（インシデント）光が２
種の周波数ｆ１及びｆ２を含み（例えば２つのレーザー
を用いた場合）、ｆ１＝ｆ２がもはや一致していない場
合、本発明のシンプルなエクステンションが生じる。こ
の場合、出力は、もはや２ｆではないがｆ１＋ｆ２であ
り、かかる場合が和周波発生を構成する。これはやはり
表面特異性である二次非線形光学作用であり、上記した
ように、表面第二高調波の他の特性を分与する。更に、
抗原、抗体、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質若しく
は基質アナログ又はこれらの任意の上記分子に付着する
リガンドが独特な電子又は振動転移(transition)を有す
る場合には、表面和周波発生は、表面で特定の転移を有
する分子の存在、又は表面に位置する場合は前記転移に
影響を及ぼす分子の変化を選択的に検出し、定量するこ
とに用いられる。このことは、ソースの出力周波数の少
なくとも1 つがターゲット転移に対応していることを確
実にすることにより達せられる。同様の効果が同調可能
ソースを用いることにより得られる。本発明の適用によ
る表面和周波発生は、本明細書中に記載したように非分
離表面を基礎とした(non-separation surface-based)バ
イオアッセイの基本として用いることができる。
種の周波数ｆ１及びｆ２を含み（例えば２つのレーザー
を用いた場合）、ｆ１＝ｆ２がもはや一致していない場
合、本発明のシンプルなエクステンションが生じる。こ
の場合、出力は、もはや２ｆではないがｆ１＋ｆ２であ
り、かかる場合が和周波発生を構成する。これはやはり
表面特異性である二次非線形光学作用であり、上記した
ように、表面第二高調波の他の特性を分与する。更に、
抗原、抗体、ポリヌクレオチド、酵素、酵素基質若しく
は基質アナログ又はこれらの任意の上記分子に付着する
リガンドが独特な電子又は振動転移(transition)を有す
る場合には、表面和周波発生は、表面で特定の転移を有
する分子の存在、又は表面に位置する場合は前記転移に
影響を及ぼす分子の変化を選択的に検出し、定量するこ
とに用いられる。このことは、ソースの出力周波数の少
なくとも1 つがターゲット転移に対応していることを確
実にすることにより達せられる。同様の効果が同調可能
ソースを用いることにより得られる。本発明の適用によ
る表面和周波発生は、本明細書中に記載したように非分
離表面を基礎とした(non-separation surface-based)バ
イオアッセイの基本として用いることができる。
【００１８】非線形光学信号の増強は次のことにより達
せられる。 １．表面での構造的及び／又は電界不連続部を増大する
作用を示す、相互作用をする任意の種に対するリガンド
の付着。 ２．複合体形成に関して表面電界を変化させる、相互作
用をする任意の種に対する電荷を帯びた粒子の付着。 ３．複合体形成に関して界面での磁場を変化させる、相
互作用をする任意の種に対する、磁場特性を有するリガ
ンドの付着。 ４．複合体形成により配向が変化する、相互作用をする
任意の種に対する、かなりの過分極(hyperpolarizibili
ty) を有するリガンドの付着。 ５．非線形光学信号が変調するように、複合体形成によ
り特性が変化する表面に対する、かなりの過分極を有す
る電荷を帯びた又は磁気種の付着。
せられる。 １．表面での構造的及び／又は電界不連続部を増大する
作用を示す、相互作用をする任意の種に対するリガンド
の付着。 ２．複合体形成に関して表面電界を変化させる、相互作
用をする任意の種に対する電荷を帯びた粒子の付着。 ３．複合体形成に関して界面での磁場を変化させる、相
互作用をする任意の種に対する、磁場特性を有するリガ
ンドの付着。 ４．複合体形成により配向が変化する、相互作用をする
任意の種に対する、かなりの過分極(hyperpolarizibili
ty) を有するリガンドの付着。 ５．非線形光学信号が変調するように、複合体形成によ
り特性が変化する表面に対する、かなりの過分極を有す
る電荷を帯びた又は磁気種の付着。
【００１９】精妙な非線形光学信号（ノイズ比に対する
信号中の増加）は、図２に記載されたように達成され
る。信号５は、レーザー励起パルス４のように、精密な
時間的プロファイルを有し、容易にタイムゲート(time
gated)でき、一方蛍光寿命６は局所環境に依存する。
信号中の増加）は、図２に記載されたように達成され
る。信号５は、レーザー励起パルス４のように、精密な
時間的プロファイルを有し、容易にタイムゲート(time
gated)でき、一方蛍光寿命６は局所環境に依存する。
【００２０】存在する光学アッセイスキームに関して、
表面第二高調波を基礎とする表面感知機構の多くの優れ
た利点は明確である。 １．表面第二高調波信号は、周波数においてアップシフ
ト(up-shifted)する。従って、周波数がダウンシフトす
る生物学的物質中の成分に関連する背景ルミネッセンス
やターゲット種の蛍光及びリン光のようなポテンシャル
な光学的ノイズソースから遠く隔たる。励起ソースから
の干渉(interference)も最小化される。 ２．周波数におけるかなりのアップシフトは、好ましく
ないまっすぐな背景光に対する信号をフィルターにかけ
る。 ３．精密な信号のタイムゲートは、例えばボックスカー
(boxcar)を用いることにより、励起パルスと直接比較し
て、偽信号を減じることができ、これによりアッセイの
ノイズ比に対して信号を改善することができる。 ４．レーザー誘導プロセスは、コヒーレントであり高度
な方向性を有する。 ５．特に電荷を帯びた又は磁気物質が表面上に位置する
場合、外部から電界又は磁界を適用することによる非線
形光学信号の変調は、信号を識別するのに用いることが
できる。 ６．感知システムは、時間、費用（試験ごと）及び熟練
者等の現在使用されているアッセイシステムにおける必
要性に関し、潜在的な減少を可能にする。
表面第二高調波を基礎とする表面感知機構の多くの優れ
た利点は明確である。 １．表面第二高調波信号は、周波数においてアップシフ
ト(up-shifted)する。従って、周波数がダウンシフトす
る生物学的物質中の成分に関連する背景ルミネッセンス
やターゲット種の蛍光及びリン光のようなポテンシャル
な光学的ノイズソースから遠く隔たる。励起ソースから
の干渉(interference)も最小化される。 ２．周波数におけるかなりのアップシフトは、好ましく
ないまっすぐな背景光に対する信号をフィルターにかけ
る。 ３．精密な信号のタイムゲートは、例えばボックスカー
(boxcar)を用いることにより、励起パルスと直接比較し
て、偽信号を減じることができ、これによりアッセイの
ノイズ比に対して信号を改善することができる。 ４．レーザー誘導プロセスは、コヒーレントであり高度
な方向性を有する。 ５．特に電荷を帯びた又は磁気物質が表面上に位置する
場合、外部から電界又は磁界を適用することによる非線
形光学信号の変調は、信号を識別するのに用いることが
できる。 ６．感知システムは、時間、費用（試験ごと）及び熟練
者等の現在使用されているアッセイシステムにおける必
要性に関し、潜在的な減少を可能にする。
【００２１】本発明においては、抗体、抗原、ポリヌク
レオチド又は酵素はセンサー表面に付着している。本発
明の一例において、異なる抗体及び／又は抗原及び又は
ポリヌクレオチド及び／又は酵素及び／又酵素基質及び
／又は酵素阻害剤が付着している空間的に分離した表面
ドメイン(domain)を含む表面で、複数の試験を実施する
ことができる。次いで表面を、補体種、即ち抗体、抗
原、ポリヌクレオチド又は酵素阻害剤を含む溶液と接触
させる。補体種の間の複合体の形成は、表面非線形光学
特性の修飾をもたらす。光度、角依存性又は表面第二高
調波発生のような非線形光学特性の変化に依る任意の他
のパラメーターの測定を、表面での複合体形成量を決定
するのに使用することができる。
レオチド又は酵素はセンサー表面に付着している。本発
明の一例において、異なる抗体及び／又は抗原及び又は
ポリヌクレオチド及び／又は酵素及び／又酵素基質及び
／又は酵素阻害剤が付着している空間的に分離した表面
ドメイン(domain)を含む表面で、複数の試験を実施する
ことができる。次いで表面を、補体種、即ち抗体、抗
原、ポリヌクレオチド又は酵素阻害剤を含む溶液と接触
させる。補体種の間の複合体の形成は、表面非線形光学
特性の修飾をもたらす。光度、角依存性又は表面第二高
調波発生のような非線形光学特性の変化に依る任意の他
のパラメーターの測定を、表面での複合体形成量を決定
するのに使用することができる。
【００２２】非線形光学信号の検出に関する機構概略図
を、図３に示す。ＱスウィッチＮｄ：ＹＡＧレーザー７
を、較正回転ステージ１０にマウントされたサンプル９
に、偏光子８を介して向ける。非線形光学信号はニュー
トラルデンシティーフィルター１１、１０６２ｎｍブロ
ッキングフィルター１２及び５３２ｎｍバンドパス干渉
フィルターを介して通過し、光電子増倍管１４により検
出される。検出器応答は、周波数重複器１５により発生
した周波数二光線ビームから記録されたものとともに、
ボックスカー１６に供給され、出力は、コンピューター
１７にダンピングされて処理及びディスプレイされる。
を、図３に示す。ＱスウィッチＮｄ：ＹＡＧレーザー７
を、較正回転ステージ１０にマウントされたサンプル９
に、偏光子８を介して向ける。非線形光学信号はニュー
トラルデンシティーフィルター１１、１０６２ｎｍブロ
ッキングフィルター１２及び５３２ｎｍバンドパス干渉
フィルターを介して通過し、光電子増倍管１４により検
出される。検出器応答は、周波数重複器１５により発生
した周波数二光線ビームから記録されたものとともに、
ボックスカー１６に供給され、出力は、コンピューター
１７にダンピングされて処理及びディスプレイされる。
【００２３】表面を調べる異なる型を図４〜６に示す。
図４は、表面に位置するバイオ分子層１９を伴なう完全
な内面反射型における導波路１８を示す。直接表面プロ
ーブ型を図５に示し、これは、表面上に分子を相互に配
列する広い範囲域を有するガラス又は好ましくはポリマ
ープラスチックから成る透明な表面に適している。バイ
オ分子層２１と相互作用した後、入射光ビーム２０は透
過２２し、反射２３し、その強度は検出器２４を用いて
記録される。信号選択性は、その角依存性を利用するこ
とにより、透過ビーム及び反射ビームの双方を用いて増
強することができる。図６に示す型は、金属表面及び他
の不透明な表面に対して適切であり、これは入射光ビー
ム２５がバイオ分子と相互作用することができ、反射ビ
ーム２６を検出できるからである；透過ビーム２７は、
材料が透明の場合に検出できる。測定は、センサー表面
を結合していない試薬を含有する溶液との接触からはず
した後（ディップ−スティック型）、又は該溶液と接触
している間に実施することができる。
図４は、表面に位置するバイオ分子層１９を伴なう完全
な内面反射型における導波路１８を示す。直接表面プロ
ーブ型を図５に示し、これは、表面上に分子を相互に配
列する広い範囲域を有するガラス又は好ましくはポリマ
ープラスチックから成る透明な表面に適している。バイ
オ分子層２１と相互作用した後、入射光ビーム２０は透
過２２し、反射２３し、その強度は検出器２４を用いて
記録される。信号選択性は、その角依存性を利用するこ
とにより、透過ビーム及び反射ビームの双方を用いて増
強することができる。図６に示す型は、金属表面及び他
の不透明な表面に対して適切であり、これは入射光ビー
ム２５がバイオ分子と相互作用することができ、反射ビ
ーム２６を検出できるからである；透過ビーム２７は、
材料が透明の場合に検出できる。測定は、センサー表面
を結合していない試薬を含有する溶液との接触からはず
した後（ディップ−スティック型）、又は該溶液と接触
している間に実施することができる。
【００２４】ガラス、ポリマー及び金属表面は、該表面
上に吸着されたランダムに配列したバイオ分子の量に比
例して変調する強い表面第二高調波信号を示すことを見
い出した。抗−ＢＳＡ抗体／ＨＲＰ連鎖抗−ＩｇＧ抗血
清を用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の従来のＥＬ
ＩＳＡアッセイと表面第二高調波発生法との比較を図７
に示す。図７Ａは、標準Ｎｕｎｃ（登録商標）プラスチ
ックアッセイトレー中で実施されたＥＬＩＳＡアッセイ
における抗体の希釈に関して得られた結果である。図７
Ｂは、図７Ａに示したと同様のウェルのアンダーサイド
から記録された入射ビームに対し４５°で得られた非線
形光学信号強度である。同様の結果が、ＢＳＡ及び抗−
ＢＳＡのみを含有するサンプルから得られた。図７ｃは
２つの方法を比較したものである。
上に吸着されたランダムに配列したバイオ分子の量に比
例して変調する強い表面第二高調波信号を示すことを見
い出した。抗−ＢＳＡ抗体／ＨＲＰ連鎖抗−ＩｇＧ抗血
清を用いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の従来のＥＬ
ＩＳＡアッセイと表面第二高調波発生法との比較を図７
に示す。図７Ａは、標準Ｎｕｎｃ（登録商標）プラスチ
ックアッセイトレー中で実施されたＥＬＩＳＡアッセイ
における抗体の希釈に関して得られた結果である。図７
Ｂは、図７Ａに示したと同様のウェルのアンダーサイド
から記録された入射ビームに対し４５°で得られた非線
形光学信号強度である。同様の結果が、ＢＳＡ及び抗−
ＢＳＡのみを含有するサンプルから得られた。図７ｃは
２つの方法を比較したものである。
【００２５】本発明は、イムノグロブリン、特定のレセ
プタープロティン、ホルモン、薬剤及び類似化合物、更
には阻害剤が知られている全ての酵素を含む全ての型の
イムノアッセイに用いることができる。本発明の特徴の
１つにおけるエンザイムアッセイは、よく特徴づけられ
た会合定数により触媒部位へ結合する特定の阻害剤（拮
抗阻害剤）の使用により構成される。阻害剤は多くの酵
素に関して知られており、基質に対して構造的に極めて
近いが反応性のないものである。これらの阻害剤は、酵
素の触媒部位への結合に関し基質と競争する。本発明の
特徴の１つとして、酵素が結合された表面に対する基質
の結合により発生する表面第二高調波信号における変化
は、基質濃度を決定するのに使用される。本発明の他の
特徴において、酵素に対する阻害剤の結合により発生す
る表面での構造的不連結部及び電界を高めるために、阻
害剤を修飾若しくは標識化することができる。かかる技
術は、連続モニター／アッセイに使用することができ
る。
プタープロティン、ホルモン、薬剤及び類似化合物、更
には阻害剤が知られている全ての酵素を含む全ての型の
イムノアッセイに用いることができる。本発明の特徴の
１つにおけるエンザイムアッセイは、よく特徴づけられ
た会合定数により触媒部位へ結合する特定の阻害剤（拮
抗阻害剤）の使用により構成される。阻害剤は多くの酵
素に関して知られており、基質に対して構造的に極めて
近いが反応性のないものである。これらの阻害剤は、酵
素の触媒部位への結合に関し基質と競争する。本発明の
特徴の１つとして、酵素が結合された表面に対する基質
の結合により発生する表面第二高調波信号における変化
は、基質濃度を決定するのに使用される。本発明の他の
特徴において、酵素に対する阻害剤の結合により発生す
る表面での構造的不連結部及び電界を高めるために、阻
害剤を修飾若しくは標識化することができる。かかる技
術は、連続モニター／アッセイに使用することができ
る。
【００２６】ポリヌクレオチドハイブリッド形成は、溶
液中のポリヌクレオチドが表面に付着した相補的ポリヌ
クレオチドにハイブリダイズした場合、発生する非線形
光学信号内の変化により検出することができる。
液中のポリヌクレオチドが表面に付着した相補的ポリヌ
クレオチドにハイブリダイズした場合、発生する非線形
光学信号内の変化により検出することができる。
【図１】二次光学プロセスの一例を概略的に示す図であ
る。
る。
【図２】非線形光学信号、レーザー励起パルス及び蛍光
寿命の時間的プロファイルを示す図である。
寿命の時間的プロファイルを示す図である。
【図３】非線形光学信号の検出機構概略図である。
【図４】内面反射型の導波路の一例を示す図である。
【図５】透明な表面に関して適切な直接表面プローブ型
の一例を示す図である。
の一例を示す図である。
【図６】金属表面及び他の不透明な表面に関して適切な
型の一例を示す図である。
型の一例を示す図である。
【図７】ＥＬＩＳＡアッセイの一例と、表面第二高調波
発生法との比較の一例を示す図である。
発生法との比較の一例を示す図である。
１ 表面 ２ 表面分子層 ３ 表面第二高調波信号 ４ レーザー励起パルス ５ 非線形光学信号 ６ 蛍光寿命 ７ Ｑ−スウィッチＮｄ：ＹＡＧレーザー ８ 偏光子 ９ サンプル １０ 較正回転ステージ １１ ニュートラルデンシティーフィルター １２ ブロッキングフィルター １３ バンドパス干渉フィルター １４ 光電子増倍管 １５ 周波数重複器 １６ ボックスカー １７ コンピューター １８ 導波路 １９，２１ バイオ分子層 ２０，２５ 入射光ビーム ２２ 透過光 ２３ 反射光 ２４ 検出器 ２６ 反射ビーム ２７ 透過ビーム
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダニエル マックスティ イギリス国 アバディーン ピーターカル ター ノース ディーサイド ロード 209 (72)発明者 リクン ヤン イギリス国 アバディーン エイビー２ １エックスジー セント ナイニアンス コート 11エスティー
Claims (7)
- 【請求項１】 特定の抗体、抗原、ポリヌクレオチド、
酵素、酵素基質又は酵素阻害剤が配置された表面と接触
する可溶性相における抗体、抗原、ポリヌクレオチド、
酵素、酵素基質又は酵素阻害剤の非分離アッセイ法であ
って、その相互作用は、表面第二高調波発生又は和周波
発生により検出及び定量できる非線形光学特性における
変化をもたらす非分離アッセイ法。 - 【請求項２】 基質の存在下酵素反応の相補的阻害剤と
酵素の相互作用又は基質と酵素との相互作用から得られ
る表面の非線形光学特性の変化による、モニターされる
表面に配置された酵素の環境的ドメイン、ボディ流体又
は生産物流中に存在する基質の連続アッセイ法。 - 【請求項３】 表面は、抗原、抗体、ポリヌクレオチ
ド、酵素、酵素基質又は酵素阻害剤が付着しているガラ
ス、ポリマー又は金属層から成り、複合体形成は表面層
の非線形光学特性を変化させる請求項１又は２記載の方
法。 - 【請求項４】 ポリヌクレオチドハイブリッド形成は２
本鎖ポリヌクレオチドに関する抗体特異性の結合により
検出される請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 複合体形成における表面非線形光学特性
における変化は、任意の相互作用する種にリガンドを付
着することにより増強され、これは複合体形成において
表面での構造的及び／又は電界不連続部を増大させる請
求項１又は２記載の方法。 - 【請求項６】 表面層の非線形光学特性を、外部の電界
を適用することにより変調する請求項１又は２記載の方
法。 - 【請求項７】 表面で相互作用をする種の相互配向が得
られるように、複合体形成がなされる請求項１又は２記
載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9508559:3 | 1995-04-27 | ||
| GBGB9508559.3A GB9508559D0 (en) | 1995-04-27 | 1995-04-27 | Surface second harmonic and sum-frequency generation immuno and enzyme assays |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08320322A true JPH08320322A (ja) | 1996-12-03 |
Family
ID=10773612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10956696A Pending JPH08320322A (ja) | 1995-04-27 | 1996-04-30 | 表面第二高調波及び和周波発生イムノ及びエンザイムアッセイ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0740156B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08320322A (ja) |
| CA (1) | CA2174360A1 (ja) |
| DE (1) | DE69615254D1 (ja) |
| GB (1) | GB9508559D0 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002044412A1 (en) * | 2000-11-29 | 2002-06-06 | Salafsky Johua S | Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interactions |
| US6953694B2 (en) * | 2000-12-06 | 2005-10-11 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Attachment of second harmonic-active moiety to molecules for detection of molecules at interfaces |
| GB0112238D0 (en) * | 2001-05-18 | 2001-07-11 | Medical Biosystems Ltd | Sequencing method |
| US20030148391A1 (en) | 2002-01-24 | 2003-08-07 | Salafsky Joshua S. | Method using a nonlinear optical technique for detection of interactions involving a conformational change |
| EP2229583B1 (en) | 2007-12-06 | 2019-04-10 | Genalyte Inc. | Label-free nucleic acid synthesis monitoring system and method |
| US9182406B2 (en) | 2008-08-04 | 2015-11-10 | Biodesy, Inc. | Nonlinear optical detection of molecules comprising an unnatural amino acid possessing a hyperpolarizability |
| ES2939310T3 (es) | 2008-10-27 | 2023-04-20 | Genalyte Inc | Biosensores basados en sondeo y detección ópticos |
| EP3733866B1 (en) * | 2010-11-05 | 2023-11-15 | Genalyte, Inc. | Optical analyte detection systems and methods of use |
| AU2012230899A1 (en) | 2011-03-21 | 2013-10-10 | Biodesy, Llc | Classification of kinase inhibitors using nonlinear optical techniques |
| GB2520111A (en) | 2012-02-05 | 2015-05-13 | Biodesy Inc | Methods for identifying modulators of Ras using nonlinear techniques |
| US20130288271A1 (en) | 2012-04-25 | 2013-10-31 | Biodesy, Llc | Methods for detecting allosteric modulators of protein |
| US9395358B2 (en) | 2012-02-05 | 2016-07-19 | Biodesy, Inc. | Methods for detecting allosteric modulators of protein |
| WO2014012848A1 (en) | 2012-07-17 | 2014-01-23 | École Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Device and method for measuring and imaging second harmonic generation scattered radiation |
| US9983206B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-05-29 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods and compositions for enhancing immunoassays |
| CN107075575B (zh) | 2014-06-30 | 2021-12-03 | 蓝光治疗公司 | 用于生物实体中的构象的高通量分析的系统和方法 |
| EP3237906B8 (en) | 2014-12-23 | 2020-10-28 | Bluelight Therapeutics, Inc. | Attachment of proteins to interfaces for use in nonlinear optical detection |
| US10672502B2 (en) | 2015-04-02 | 2020-06-02 | Biodesy, Inc. | Methods for determining protein structure using a surface-selective nonlinear optical technique |
| US11573233B2 (en) * | 2015-09-29 | 2023-02-07 | University Of Utah Research Foundation | Systems and methods for label-free detection of analytes |
| EP3455628A4 (en) | 2016-05-09 | 2019-12-04 | Biodesy, Inc. | METHOD AND DEVICES FOR DETECTING INTERACTIONS OF PERIPHERAL MEMBRANE PROTEINS USING NONLINEAR OPTICAL TECHNIQUES |
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|---|---|---|---|---|
| DE3584210D1 (de) * | 1984-09-21 | 1991-10-31 | Ciba Corning Diagnostics Corp | Dielektrische wellenleitersensoren und ihre anwendung in immunoassays. |
| JPH01314949A (ja) * | 1988-06-15 | 1989-12-20 | Canon Inc | 検体検査装置 |
-
1995
- 1995-04-27 GB GBGB9508559.3A patent/GB9508559D0/en active Pending
-
1996
- 1996-04-17 CA CA 2174360 patent/CA2174360A1/en not_active Abandoned
- 1996-04-24 EP EP96302858A patent/EP0740156B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-24 DE DE69615254T patent/DE69615254D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-30 JP JP10956696A patent/JPH08320322A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0740156A1 (en) | 1996-10-30 |
| GB9508559D0 (en) | 1995-06-14 |
| CA2174360A1 (en) | 1996-10-28 |
| DE69615254D1 (de) | 2001-10-25 |
| EP0740156B1 (en) | 2001-09-19 |
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