JP2005283141A - バイオセンサー - Google Patents

Abstract

【課題】 生理活性物質の固定効率を改善したバイオセンサー用検出表面を提供すること。
【解決手段】 基板の表面に下記一般式（A）で表される構造を有するリンカーが結合している、バイオセンサー。
【化１】

（式中、Ｘはバイオセンサー表面又はバイオセンサー表面に存在する官能基と結合しうる基を示し、Ｗは生理活性物質もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示し、Ｚは荷電を有する基を示し、Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は各々独立に２価の連結基を示し、Ｌ₄は３価以上の基を示し、ｍ、ｎは各々独立に０以上の整数を示し、ｐは自然数を示す。）
【選択図】 なし

Description

本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。

現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。

上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。

一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。

生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。

上記測定チップは、生理活性物質の等電点によっては、固定効率が著しく下がり、等電点より低い緩衝液にて固定を行っている。しかし、生理活性物質によっては、pH変化で不安定化する場合もあり固定効率の良いリンカーが求められている。

特許第２８１５１２０号 特開平９−２６４８４３号

本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、生理活性物質の固定効率を改善したバイオセンサー用検出表面を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、基板上に荷電を有する基を導入することによって、生理活性物質の固定効率を改善したバイオセンサー用検出表面を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、基板の表面に下記一般式（A）で表される構造を有するリンカーが結合している、バイオセンサーが提供される。

（式中、Ｘはバイオセンサー表面又はバイオセンサー表面に存在する官能基と結合しうる基を示し、Ｗは生理活性物質もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示し、Ｚは荷電を有する基を示し、Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は各々独立に２価の連結基を示し、Ｌ₄は３価以上の基を示し、ｍ、ｎは各々独立に０以上の整数を示し、ｐは自然数を示す。）

好ましくは、一般式（A）で表されるリンカーの分子量は50以上10000以下である。
好ましくは、Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は各々独立に、−（ＣＨ₂）_q−（式中、ｑは１〜１０の整数を示す）で表される２価の連結基である。
好ましくは、ｍが０であり、ｐが１であり、ｎが１である。

好ましくは、基板は、金属表面又は金属膜から成る基板である。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜である。
好ましくは、疎水性高分子化合物のコーティング厚さは１オングストローム以上５０００オングストローム以下である。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用され、特に好ましくは、表面プラズモン共鳴分析に使用される。

本発明の別の側面によれば、基板に下記一般式（A’）で表される化合物を反応させて結合する工程；

次いで、Ｘ₂−（Ｌ₅）_q−Ｗ１で表される化合物を反応させて結合する工程（式中、Ｘ、Ｚ、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃、Ｌ₄、ｍ、ｎ及びｐは上記と同義であり、Ｙ₁はＸ₂で示される基と結合しうる基を示し、Ｌ₅は２価の連結基であり、ｑは自然数を示し、Ｗ１は生理活性物質もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示す）を含む、上記した本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している、上記した本発明のバイオセンサーが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記した本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、上記方法において、生理活性物質と相互作用する物質は非電気化学的方法により検出または測定され、特に好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質は表面プラズモン共鳴分析により検出または測定される。

本発明により、生理活性物質の固定効率を改善したバイオセンサー用検出表面を提供することが可能になった。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、基板の表面に下記一般式（A）で表される構造を有するリンカーが結合していることを特徴とする。

（式中、Ｘはバイオセンサー表面又はバイオセンサー表面に存在する官能基と結合しうる基を示し、Ｗは生理活性物質もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示し、Ｚは荷電を有する基を示し、Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は各々独立に２価の連結基を示し、Ｌ₄は３価以上の基を示し、ｍ、ｎは各々独立に０以上の整数を示し、ｐは自然数を示す。）

一般式（A）において、Ｘはバイオセンサー表面もしくはバイオセンサー表面に存在する官能基と結合しうる基を表す。バイオセンサー表面が金属である場合には、Ｘとしては、硫黄原子、アミノ基などが挙げられる。また、バイオセンサー表面に存在する官能基と反応しうる基としては、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ₂、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。Ｘは特に好ましくはアミノ基又は保護基により保護されたアミノ基である。

ここでいう保護基とは、反応系内で脱保護して官能基を形成させる事のできる基であり、例えばアミノ基の保護基としては、tertブチルオキシカルボニル基（Boc）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）、ニトロフェニルスルフェニル基（Nps）、ジチアスクシニル基（Dts）等が挙げられる。また、水酸基の保護基としては、アシル基等が挙げられる。ここでいう脱離基は、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基、ハロゲン化アルキルカルボニルオキシ基、アルキルスルホニルオキシ基、ハロゲン化アルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基等を挙げることができる。また、脱離基としては、カルボン酸と既知の脱水縮合試薬（例えばカルボジイミド類）とＮ-ヒドロキシ化合物を組み合わせて生成されるエステル基も好ましく用いられる。

一般式（A）において、Ｚは、荷電を有する基を表す。この場合、対塩を有していても良い。負荷電をもつ基としては、カルボン酸塩、スルホン酸塩、スルフィン酸塩、リン酸塩などが上げられる。また、正電荷を持つ基としては、オニウム塩（アンモニウム塩、ピリジニウム塩、スルフォニウム塩、ホスホニウム塩など）、置換、無置換のアミノ基、グアニジル基などが好ましく用いられる。Ｚは特に好ましくはスルホン酸基（−ＳＯ₃）（又はスルホン酸塩）である。

一般式（A）において、Ｗは、生理活性物質を固定化できる基もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ₂、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。Ｗは特に好ましくはカルボキシル基である。

一般式（A）において、Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は各々独立に２価の連結基を示す。
Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は、途中で分岐していても直鎖でもよい。Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は、好ましくは主鎖の原子数１〜１０の連結基であり、さらに好ましくは、−（ＣＨ₂）_s−（式中、ｓは１〜１０の整数を示す）で表される２価の連結基である。

一般式（A）において、Ｌ₄は３価以上の基を示し、好ましくは炭素原子（即ち、ＣＨで表される３価の基）、芳香族環（例えば、ベンゼン環、ナフタレン環など）、又は複素環である。
一般式（A）において、ｍ及びｎは各々独立に０以上の整数を示し、好ましくは０〜５の整数を示し、さらに好ましくは０〜３の整数を示し、特に好ましくは０又は１である。一般式（A）において、ｐは自然数を示し、好ましくは１〜５の自然数を示し、さらに好ましくは１〜３の自然数を示し、特に好ましくは１である。
一般式（A）で表される化合物の分子量は好ましくは50以上10000以下であり、さらに好ましくは50以上5000以下であり、特に好ましくは100以上1000以下である。

一般式（A’）において、Ｙ₁はＸ₂で示される基と結合しうる基を示し、好ましくは、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ₂、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。Ｙは特に好ましくはカルボキシル基である。

本明細書において、Ｘ₂はＹ₁で示される基と結合しうる基を示し、ハロゲン原子、アミノ基、もしくは保護基により保護されたアミノ基、カルボキシル基、もしくは脱離基を有するカルボニル基、水酸基、保護基により保護された水酸基、アルデヒド基、-ＮＨＮＨ₂、-Ｎ=Ｃ=Ｏ、-Ｎ=Ｃ=Ｓ、エポキシ基、又はビニル基である。保護基、脱離基は、前述のものと同様なものを用いることができる。

本明細書において、Ｌ₅は２価の連結基を表す。−（Ｌ₅）_q−において、主鎖の原子数は５以上になることが好ましく、さらに好ましくは5〜800である。Ｌ₅は、例えば、−（ＣＨ₂）_t−（式中、ｔは５〜８００の整数を示す）である。
ｑは１以上の整数を示し、好ましくは１〜５の整数を示し、さらに好ましくは１〜３の整数を示し、特に好ましくは１である。
Ｗ１は、前記Ｗと同義である。

なお、本発明においては、基板にＺで表される基（荷電）を持つ化合物を導入してからさらにリンカーを導入してもよいし、系外で荷電を持つ化合物とリンカーを反応させたあとに、それを基板に導入してもよい。
一般式（A）の構造で示されるリンカーの具体例としては、以下のものが挙げられる。

本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。

本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、１オングストローム以上５０００オングストローム以下であるのが好ましく、特に１０オングストローム以上２０００オングストローム以下であるのが好ましい。５０００オングストロームを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、１オングストローム以上、１００オングストローム以下であるのが好ましい。

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

本発明においては、基板は、例えば、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜でもよいし、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜でもよいが、好ましくは、疎水性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。

本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。

疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。

本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。

疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。

浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。

浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。

浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。

基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１％以上３０％以下、さらに好ましくは０．１％以上１０％以下である。

固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。

疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ³)^1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）^1/2
例として、実施例に使用した疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。

基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。

疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは１オングストローム以上５０００オングストローム以下であり、特に好ましくは１０オングストローム以上３０００オングストローム以下である。

本発明で用いることができるポリヒドロキシ高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。

本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。

ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。

ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹について詳細に説明する。

Ｘ¹は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR¹¹Ｙ¹¹、−SSR¹Y¹）、スルフィド（−SR¹¹Ｙ¹¹、−SR¹Y¹）、ジセレニド（−SeSeR¹¹Ｙ¹¹、−SeSeR¹Y¹）、セレニド（SeR¹¹Ｙ¹¹、−SeR¹Y¹）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO₂）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。

Ｒ¹（とＲ¹¹）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。

Ｙ¹とＹ¹¹はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ¹とＹ¹¹は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。

有機分子Ｘ¹−Ｒ¹−Ｙ¹の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。

チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。

本発明のバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。

上記のようにして得られたセンサー用基板は、上記の一般式（A）中の官能基であるＷを介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。

本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。

免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。

微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。

上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。

本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。

表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。

表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。

なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。

上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。

この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。

そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。

また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。

上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。

なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。

また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。

試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。

なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。

さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。

本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１：バイオセンサー用チップの作製
（１）ポリメチルメタクリレートでコーティングしたバイオセンサー用チップの作製
金膜の厚さが500オングストロームになるように金を蒸着した1cm(1cmのカバーガラスをModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で30分処理した後、スピンコート機（MODEL ASS-303、ABLE製）にセットし1000rpmにて回転させ、金蒸着カバーガラス中央にポリメチルメタクリレートのメチルエチルケトン溶液（2mg/ml）を50μｌ滴下し、2分後に回転を止めた。エリプソメトリー法（In-Situ Ellipsometer MAUS-101、Five Lab製）により膜厚を測定したところ、ポリメタクリル酸メチル膜の厚さは200オングストロームであった。このサンプルをPMMA表面チップと呼ぶ。

（２）PMMA表面へのCOOH基の導入
上記のように作成したポリメチルメタクリレートをコーティングしたカバーガラスをNaOH水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間浸漬した後、水で3回洗浄した。このサンプルをPMMA/COOH表面チップと呼ぶ。

（３）吉草酸を有する表面の作成-1（比較用）
上記（２）で作成したPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに浸漬した後、5-アミノ吉草酸溶液（１M、ｐH8.5に調整）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。このサンプルをPMMA/Val表面チップと呼ぶ。

（４）システイン酸を有する表面の作成-2（本発明用）
上記（２）で作成したPMMA/COOH表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、L-システイン酸（和光純薬（株））水溶液（１M、ｐH8.5に調整）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。このサンプルをPMMA/Cys-S表面チップと呼ぶ。

（５）生理活性物質を固定化する表面の作成-1（比較例）
上記（３）で作成したPMMA/Val表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに浸漬した後、L-システイン酸（和光純薬（株））水溶液（１M、ｐH8.5に調整）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。このサンプルをPMMA/Val/Cys-S表面チップと呼ぶ。

（６）生理活性物質を固定化する表面の作成-2（本発明）
上記（４）で作成したPMMA/Cys-S表面チップを１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液２ｍｌに６０分浸漬した後、5-アミノ吉草酸溶液（１M、ｐH8.5に調整）２ｍｌに１６時間浸漬した。最後に水で５回洗浄した。このサンプルをPMMA/Cys-S/Val表面チップと呼ぶ。

実施例２：バイオセンサー用チップの性能評価：
（１）蛋白質の固定量の測定
バイオセンサー表面に対する生理活性物質の固定量は、その生理活性物質と結合する物質を検出する上で、多いほうが好ましい。以下のサンプル１−１と１−２においてProtein-A（ナカライテスク製）の固定量を測定した。
サンプル１−１：PMMA/Val/Cys-S表面チップ（実施例１−（５）の方法で作製）
サンプル１−２：PMMA/Cys-S/Val表面チップ（実施例１−（６）の方法で作製）

上記サンプル１−１〜サンプル１−２の各チップを市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ビアコア社製、BIACORE3000）のカートリッジブロック上に設置し、１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液１５０μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。その後、ヒト血清アルブミン（シグマ社製）0.1mg/ml溶液（酢酸バッファーpH5.5）１５０μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。その後、エタノールアミン・HCｌ溶液（１M、ｐH8.5）１５０μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで測定セルに流した。その後、共有結合していないプロテインＡを除去するため、10mMのNaOH水溶液１０μＬを流速１０μＬ／ｍｉｎで２回測定セルに流し、洗浄した。各注入の前後には、HBS-EPバッファー（ビアコア社製、ｐH7.4）（ＨＥＰＥＳ 0.01mol/l（ｐＨ7.4）；ＮａＣｌ 0.15mol/l；ＥＤＴＡ 0.003mol/l；Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０ 0.005重量％）を流速１０μＬ／ｍｉｎで流した。

１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（４００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１００ｍＭ）との混合液の注入前の数値を0とし、ＮａＯＨ溶液での洗浄後の数値をプロテインＡの固定量（ＲＵ）とした。

（３）結果
表1にヒト血清アルブミンの固定量の測定結果を示す。

表１の結果から、本発明の構成により、蛋白質の固定量の多い表面を提供できることがわかる。

Claims (16)

1. 基板の表面に下記一般式（A）で表される構造を有するリンカーが結合している、バイオセンサー。
   

   

   （式中、Ｘはバイオセンサー表面又はバイオセンサー表面に存在する官能基と結合しうる基を示し、Ｗは生理活性物質もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示し、Ｚは荷電を有する基を示し、Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は各々独立に２価の連結基を示し、Ｌ₄は３価以上の基を示し、ｍ、ｎは各々独立に０以上の整数を示し、ｐは自然数を示す。）
2. 一般式（A）で表されるリンカーの分子量が50以上10000以下である、請求項１に記載のバイオセンサー。
3. Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃が各々独立に、−（ＣＨ₂）_q−（式中、ｑは１〜１０の整数を示す）で表される２価の連結基である、請求項１又は２に記載のバイオセンサー。
4. ｍが０であり、ｐが１であり、ｎが１である、請求項１から３の何れかに記載のバイオセンサー。
5. 基板が、金属表面又は金属膜から成る基板である、請求項１から４の何れかに記載のバイオセンサー。
6. 金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項５に記載のバイオセンサー。
7. 基板が、疎水性高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜である、請求項１から６の何れかに記載のバイオセンサー。
8. 疎水性高分子化合物のコーティング厚さが１オングストローム以上５０００オングストローム以下である、請求項１から７の何れかに記載のバイオセンサー。
9. 非電気化学的検出に使用される、請求項１から８の何れかに記載のバイオセンサー。
10. 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項１から９の何れかに記載のバイオセンサー。
11. 基板に下記一般式（A’）で表される化合物を反応させて結合する工程；
    

    

    次いで、Ｘ₂−（Ｌ₅）_q−Ｗ１で表される化合物を反応させて結合する工程（式中、Ｘ、Ｚ、Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃、Ｌ₄、ｍ、ｎ及びｐは請求項１と同義であり、Ｙ₁はＸ₂で示される基と結合しうる基を示し、Ｘ₂はＹ₁で示される基と結合しうる基を示し、Ｌ₅は２価の連結基であり、ｑは自然数を示し、Ｗ１は生理活性物質もしくは生理活性物質と結合する化合物と結合しうる基を示す）を含む、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
12. 生理活性物質が共有結合により表面に結合している、請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサー。
13. 請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を共有結合により結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
14. 生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項１から１０の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
15. 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１４に記載の方法。
16. 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１４又は１５に記載の方法。