JP2010515080A - Lsprにおける酵素アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年1月3日出願の米国特許仮出願第60/878,617号(本明細書にその全体が組み込まれる)の利益を主張する。
一実施形態において、本発明は、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)検出系の表面における屈折率の変化を検出する方法を提供する。この方法は、固定化酵素を用いて酵素基質から不溶性の生成物を生成することを含み、ここで不溶性生成物はLSPRの支持表面に蓄積する。この方法はまた、LSPRを用いて、不溶性生成物の存在により生じる、表面の反射光または透過光の変化を検出することを含む。
I.一般事項
本発明は、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)支持表面を用いて分析物を検出する方法を提供する。LSPR支持表面は、金被覆表面を含み、その上に、金被覆ナノ粒子、例えばビーズのアレイが存在する。本発明の方法は、サンドイッチアッセイを用いて分析物を検出する。本発明の方法は、LSPR支持表面のビーズの金表面上に固定化された第1の捕捉部分により分析物を捕捉することによって分析物を検出する。次いで、分析物の存在を、検出部分を有する第2の捕捉部分を用いて検出する。
本明細書において用いる場合、「LSPR支持表面」なる用語は、閉じ込められた自由電子の共鳴振動(一般に局在表面プラズモン共鳴と呼ばれる)を通して光学的近接場の形成が可能である表面を意味する。LSPR支持表面は、下記にて詳細に記載するように、ナノ粒子を特徴とする。LSPR支持表面は、不透明または透明であり得、光を透過するまたは反射する、または両方を行い得る。
本発明は、局在表面プラズモン共鳴(LSPR)検出系の表面における屈折率の変化を検出する方法を提供する。その方法は、固定化酵素を用いて酵素基質から不溶性の生成物を生成することを含み、ここで不溶性生成物はLSPR支持表面に蓄積する。その方法はまた、不溶性の生成物の存在により生じる表面の反射光または透過光の変化を、LSPRを用いて、LSPR表面により反射された光、またはLSPR表面を透過した光のスペクトルの変化を用いて、検出することを含む。
本発明のLSPR支持表面は、LSPR支持表面の減衰スペクトルの変化の検出が可能であり、ここで減衰スペクトルは生成物の存在に対して感受性である。不溶性生成物の存在により誘導される屈折率の変化をLSPR支持表面の吸収スペクトルを介してモニターすることにより、低濃度にて抗原を検出することができる。
本発明の方法は、いずれかの適切なアッセイにおいて実施することができ、ここで分析物は捕捉部分により捕捉され、次いで検出部分を用いて検出する。典型的には、捕捉剤および検出剤を含むサンドイッチアッセイである。最も一般的には、その物質は抗体であるが、ホルモン受容体、アドネクチン、または分析物結合剤のいずれかの他の組み合わせであり得る。
本発明の方法における色の変化の検出は、いずれかの検出方法によりなされ得る。いくつかの実施形態において、検出方法は、適切な装置を用いる比色分析検出による。他の実施形態において、検出は肉眼による。LSPR支持表面における屈折率の変化の検出は、いずれかの波長、特に約200〜約1000 nmの波長を有する光にて行われる。LSPR支持表面の屈折率の変化を検出するのに有用な検出機器は、UV-Vis分光計およびプレートリーダーを含むが、これらに限定されない。
本発明のLSPRは、第1の固体支持体、上記のような、第1の固体支持体上に配置されたLSPR支持表面、LSPR支持表面に近接して固定化酵素、および酵素基質を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、上記のようなLSPRセンサー、および酵素基質を有するキットを提供する。本発明のキットはまた、溶剤、緩衝剤、安定剤および説明書も含み得る。
実施例1:LSPR表面の屈折率の変化の検出
LSPR表面上における免疫アッセイのプロトコルは、以下に記載する様々な工程に従って進行する。
はじめに、ガラス基質上に金を沈着させ、次いで金被覆ガラス基質上にポリスチレンビーズの単層を形成させ、次いで表面全体にわたって金の別の層を沈着させることを含む、当業者に知られる方法を用いて、LSPR支持表面を調製した。次いで9:1の比率のヒドロキシル-アルカンチオールおよびカルボキシル-アルカンチオールの混合物を有する自己集合膜(SAM)によって金被覆表面を修飾する。
C反応性タンパク質またはCRPを、リン酸緩衝食塩水(PBS)、1 mM Ca2+、0.01%v/v Tween 20および10 uM BSA(ウシ血清アルブミン)から作製した緩衝液(緩衝液A)中1 pM(10-12 M)〜1 uM(10-6 M)の様々な濃度に希釈した。次いで、抗原を、5分〜2時間の範囲の間、抗体活性化LSPR支持表面とともにインキュベートした。
次に、センサーを、緩衝液A中250 nMの濃度のポリクローナルヤギ抗ヒトCRP抗体(Bethyl Labs、カタログ番号A80-125A)とともにインキュベートした。この抗体は酵素またはプローブ(例えばビオチン)により標識化できる。15〜30分のインキュベーション後、第2の抗体を緩衝液により洗い流した。
次いで、酵素連結抗体、Bethyl Lab、カタログ番号A50-101APからのロバ抗ヤギIgG抗体アルカリフォスファターゼコンジュゲートを、約2〜30分間反応させ、次いで緩衝液Aにより洗い流した。
酵素基質をLSPR支持表面に加え、30秒〜10分間インキュベートした。未反応の酵素基質を水により洗い流した。次いで、表面の吸収スペクトルまたは反射スペクトルを測定した。
Claims (22)
- 局在表面プラズモン共鳴(LSPR)検出系の表面の屈折率の変化を検出する方法であって、以下を含む方法:
a) 固定化酵素を用いて酵素基質から不溶性の生成物を生成させる、ここで不溶性生成物はLSPR支持表面に蓄積する;および
b) LSPRを用いて、不溶性生成物の存在により生じる表面の反射光または透過光の変化を検出する。 - 表面がナノ粒子を含み、各ナノ粒子が約5 nm〜約1000 nmのサイズである、請求項1の方法。
- 各ナノ粒子がAu、Ag、Ta、Pt、Pd、RhおよびCuからなる群から選択される遷移金属を含む、請求項2の方法。
- 遷移金属が金である、請求項3の方法。
- 各ナノ粒子が、ガラス、またはポリスチレン、ポリメタクリレートおよびポリアクリレートからなる群から選択されるポリマーをさらに含む、請求項3の方法。
- ナノ粒子が上部および下部を有するビーズであり、上部が金属によって被覆されている、請求項5の方法。
- ナノ粒子ビーズがポリスチレンを含み、金属が金を含む、請求項6の方法。
- 酵素基質が、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT)、5-ブロモ-4-クロロ-3'-インドリルホスフェートp-トルイジン塩(BCIP)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)、4-クロロ-1-ナフトール(4-CN)および3,3'-ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライド(DAB)からなる群から選択されるメンバーである、請求項1の方法。
- 酵素が、アルカリフォスファターゼおよび西洋わさびペルオキシダーゼからなる群から選択されるメンバーである、請求項1の方法。
- 酵素が抗体との結合によって固定化される、請求項2の方法。
- 酵素がサンドイッチアッセイを介して固定化される、請求項10の方法。
- 検出工程が、LSPRを用いて、不溶性生成物の存在により生じる表面の反射光の変化を検出することを含む、請求項1の方法。
- 検出工程が、LSPRを用いて、不溶性生成物の存在により生じる表面の透過光の変化を検出することを含む、請求項1の方法。
- LSPR支持表面が第1の固体支持体上にある、請求項2の方法。
- 酵素が第1の固体支持体上に固定化される、請求項14の方法。
- 酵素が第2の固体支持体上に固定化され、不溶性生成物の生成工程において、第2の固体支持体がLSPR支持表面に近接している、請求項14の方法。
- 第2の固体支持体が透明である、請求項16の方法。
- 第2の固体支持体が磁性ビーズである、請求項16の方法。
- 第1の固体支持体の表面が滑面である、請求項14の方法。
- 第1の固体支持体の表面が粗面である、請求項14の方法。
- 以下を含むLSPRセンサー:
第1の固体支持体;
第1の固体支持体上に配置されたLSPR支持表面;および
LSPR支持表面に近接している固定化酵素。 - 以下を含むキット:
請求項21のLSPRセンサー;および
酵素基質。
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