KR20090102744A - 방사선요법 및 화학요법에 대하여 암세포를 민감하게 하기 위한 표적화 엔비에스1―에이티엠 상호작용 - Google Patents

방사선요법 및 화학요법에 대하여 암세포를 민감하게 하기 위한 표적화 엔비에스1―에이티엠 상호작용

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KR20090102744A
KR20090102744A KR1020097011353A KR20097011353A KR20090102744A KR 20090102744 A KR20090102744 A KR 20090102744A KR 1020097011353 A KR1020097011353 A KR 1020097011353A KR 20097011353 A KR20097011353 A KR 20097011353A KR 20090102744 A KR20090102744 A KR 20090102744A
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atm
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KR1020097011353A
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제이. 카리베유 미카엘
보 슈
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써던 리서취 인스티튜트
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Abstract

본원에는 방사선요법과 화학요법에 대해 암세포를 민감하게 하는 데 사용하기 위한 조성물과 방법이 제공된다.

Description

방사선요법 및 화학요법에 대하여 암세포를 민감하게 하기 위한 표적화 엔비에스1―에이티엠 상호작용{TARGETING NBS1―ATM INTERACTION TO SENSITIZE CANCER CELLS TO RADIOTHERAPY AND CHEMOTHERAPY}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2006년 10월 30일에 출원된 미국 임시 출원 번호 60/863,457호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 내용은 본원에 전체를 참조하는 것으로 통합된다.
기술분야
본 발명은 신규한 방사선 민감성 증강물질 및 그것의 제조 방법과 사용방법에 관한 것이다.
미국에서 새롭게 암으로 진단된 130여만 명으로 추산되는 피험자들 중에서 2/3 정도는 치료요법의 일부로서 결국에는 방사선요법의 형태를 갖춘 치료를 받게 될 것이다. 방사선요법은 많은 종류의 암에 대해 특히 전이를 일으키지 않는 국부 암에 대해 가장 중요하고 강력한 치료법 중 하나로 간주된다. 방사선요법에 의해 치료될 종양들 중에서 오직 소수의 것만이, 이를테면 림프종과 정상피종만이 매우 반응성이다. 그러나 다른 많은 고체성 종양, 예를 들면 흑색종, 신경교아세포종, 및 전립선암등은 전형적으로 방사선에 대해 매우 내성적이며, 그것들은 매우 많은 양의 방사선 처리 후에 진행되는 경향을 보인다. 치료요법은 자주 방사선 종양학 전문의들이 정상 조직 손상을 치료 프로토콜에서 용량과 분획의 수를 제한하는 반응으로 간주할 때보다 복잡해진다. 치료가 실패하는 이유는 흔히 복합적이고 가변적이다 (Pawlik and Keyomarsi, 2004). 종양 인자들, 예컨대 위치, 크기 및 부적절한 혈관 공급 (산소결핍)은 모두 이온화 방사선 (IR)에 대한 신생물의 반응성의 결핍에 중요한 역할을 할 수 있다. 아마도 가장 중요한 것은 방사선-민감성 조절에 관련된 세포 및 유전적 인자들, 예를 들면 차등적인 조직-특이적 유전자 발현인데, 그것은 방사선-내성 세포 표현형을 유발할 수 있다. 과학자들은 IR에 대한 종양 세포 민감성을 증가시키기 위한 다양한 방법을 개발하기 위해 오랫동안 노력해 왔다. 그런 것으로는 저산소성 방사선 민감성 증강물질, 고농도의 산소가 있고, 보다 최근에는 방사선 민감성에 관련된 많은 유전적 인자들을 표적화하는 것이 포함된다 (Choudhury et al., 2006). 그러나 지난 수십 년 동안 분자 생물학과 생화학분야에서 과학적으로 큰 발전이 있었음에도 불구하고, 암 유전학과 분자 방사선 생물학 분야에서는 효과적이고 특이한 방사선 민감성 증강물질의 개발의 진전이 제한적으로 이루어져 왔을 뿐이다.
발명의 개요
본 발명의 목적에 따르면, 본원에서 구체화되고 광범위하게 설명되는 것과 같이, 본 발명은 신규한 방사선 민감성 증강물질 및 그것의 제조 방법과 사용방법에 관한 것이다.
개시된 방법과 조성물의 추가의 장점은 이어지는 상세한 설명에서 부분적으로 설명될 것이고, 부분적으로는 설명으로부터 이해되거나 혹은 개시된 방법과 조성물을 실시함으로써 학습 될 수 있다. 개시된 방법과 조성물의 장점들은 특히 첨부되는 청구범위에서 강조된 요소들과 조합에 의해 이루어지고 얻어질 수 있다. 전술한 일반적인 설명과 이어지는 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명을 위한 것이며, 청구되는 것과 같은 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
첨부되는 도면은 본 명세서에 통합되며 그것의 일부를 구성하는 것으로, 개시된 방법과 조성물의 여러 구체예를 예시하며, 설명과 함께 개시된 방법과 조성물의 원리를 설명하기 위한 것이다.
도 1은 NBS1 억제 펩티드의 개발을 도시한다. 도 1A는 ATM과 NBS1의 기능성 도메인과 그것들의 상호작용을 개략적으로 도시한다. NBS1의 C-말단은 ATM 활성화 및 DNA 손상 부위에 대한 회복에 필요하다. 그것은 최소한 두 세트의 아미노산 잔기, 즉 736-737(EE) 및 741-743(DDL)로 구성되는데, 그것은 진화론적으로 보존된 것이고 ATM 결합에 필요하다. NBS1은 ATM에서 두 세트의 열 반복부 (Heat Repeat 2 (a.a 248-522)와 Heat Repeat 7 (a.a 1436-1770)에 결합한다. 도 1B는 개발된 R9, wtNIP, 및 scNIP 펩티드에 대한 아미노산 서열을 도시한다.
도 2는 펩티드 내재화 및 세포독성을 도시한다. 도 2A는 HeLa 세포가 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 플루오레신-포합된(conjugated) 스트렙트아비딘으로 염색된 후에 면역형광 현미경에 의해 분석된 것을 도시한다. 도 2B는 HeLa 세포가 표시된 용량의 탁솔과 NIP 펩티드로 처리된 것을 도시한다. 처리 후 24시간이 지난 후에 세포 생존율이 표준 MTT 분석에 의해 정량되었다.
도 3은 wtNIP가 NBS1-ATM 결합을 억제하는 것을 도시한다. NIP 펩티드로 처리된 HeLa 세포는 방사선으로 조사되었다 (0 또는 6Gy). 면역침전은 토끼 NBS1 항체를 사용하여 수행되었고, ATM, NBS1 또는 MRE11에 대한 단클론성 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅이 수행되었다.
도 4는 wtNIP가 γ-H2AX 병소 형성을 억제할 수 있음을 도시한다. 도 4A는 HeLa 세포가 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 0 또는 6Gy로 조사된 다음, 30분 후에 수확된 후, 면역형광 현미경을 사용하여 방사선-유도된 γ-H2AX 병소가 검출된 것을 도시한다. 도 4B는 임의 단위로 표현된, Image Pro 5.1 소프트웨어를 사용하여 각 영상에 대해 측정된 핵당 평균 γ-H2AX 핵 병소를 도시한다. 에러바는 +/-1 SD를 나타내고, 그래프로 표시된 것은 3회의 독립적인 실험의 평균이다.
도 5는 wtNIP 펩티드에 대한 노출이 IR-유도된 NBS1 인산화를 무효화하는 것을 도시한다. 도 5A는 HeLa 세포가 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 0 또는 6Gy로 조사된 다음, 30분 후에 수확된 후, 면역형광 현미경을 사용하여 항-Ser343 NBS1 항체를 사용하여 방사선-유도된 γ-H2AX 병소가 형성되었는지가 검출되었음을 도시한다. 도 4B는 3회의 독립적인 실험에서 최소한 25개의 세포 집단으로부터 측정된 핵당 NBS1 병소의 평균수를 도시한다. 에러바는 +/-1 SD를 나타내고, 그래프로 표시된 것은 3회의 독립적인 실험의 평균이다.
도 6은 wtNIP가 세포의 방사선 민감성을 증가시키는 것을 도시한다. 도 6A는 제한 희석률로 세포가 시딩되고 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 계속해서 펩티드에 24시간 동안 노출된 후에 10 내지 12일 후에 수확되고, 결정성 바이올렛으로 염색된다. A(HeLa), C(MO59) 및 D(GM9607)에 보이는 것은 표시된 용량의 방사선이 조사된 후의 생존 곡선이다. 에러바는 +/-1 SEM을 나타내고, 그래프로 표시된 것은 3회의 독립적인 실험의 평균이다. 도 6B는 HeLa 세포에서의 NIP 중재된 방사선 민감성에 대한 집락형성 분석법의 대표적인 플레이트(plate)를 도시한다.
도 7은 R9, wtNIP eh는 scNIP 펩티드의 분해를 도시한다. HeLa 세포는 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 표시된 시간 지점에 수득된 다음, 항-스트렙트아비딘 항체로 염색하여 면역형광 현미경에 의해 분석되었다.
도 8은 wtNIP가 전립선 암셀라인 DU-145에서의 γ-H2AX 병소 형성을 억제하는 것을 도시한다. 도 8A는 DU-145 세포가 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 0 또는 6Gy로 조사된 다음, 30분 후에 수확된 후, 면역형광 현미경을 사용하여 방사선-유도된 γ-H2AX 병소가 검출되었음을 도시한다. 도 8B는 Image Pro 5.1 소프트웨어를 사용하여 각 영상에 대해 측정된 핵당 평균 γ-H2AX 핵 병소를 도시하며, 임의 단위로 표현된다. 에러바는 +/-1 SD를 나타내고, 그래프로 표시된 것은 3회의 독립적인 실험의 평균이다.
도 9는 wtNIP에 대한 노출이 전립선 암셀라인 DU-145에서 IR-유도된 NBS1 인산화를 무효화하였음을 도시한다. 도 9A는 DU-145 세포가 10μM의 R9, wtNIP 또는 scNIP로 1시간 동안 처리된 후 0 또는 6Gy로 조사된 다음, 120분 후에 수확된 후, 면역형광 현미경을 사용하여 항-Ser343 NBS1 항체를 사용하여 방사선-유도된 NBS1 병소가 형성되었는지가 검출되었음을 도시한다. 도 9B는 3회의 독립적인 실험에서 최소한 25개의 세포 집단으로부터 측정된 핵당 NBS1 병소의 평균수를 도시한다. 에러바는 +/-1 SD를 나타내고, 그래프로 표시된 것은 3회의 독립적인 실험의 평균이다.
도 10은 결합 및 유리 텍사스 레드 표지된 NBS1 펩티드로 인한 형광 편광을 도시한다.
개시된 방법 및 조성물은 특별한 구체예에 대한 아래의 상세한 설명과 그것에 포함된 실시예 및 도면과 도면에 대한 전술한 설명과 아래의 설명을 참조로 하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명에 개시되는 것은 개시된 방법과 조성물을 위하여 사용될 수 있는, 혹은 그것과 조합하여 사용될 수 있거나, 혹은 개시된 방법과 조성물을 위해 제조하는 데 사용되거나 그 제품인 물질, 조성물, 및 성분들이다. 이들 및 다른 물질들은 본원에 개시되며, 이들 물질의 조합, 하위세트, 상호작용, 그룹 등은 이들 화합물이 개시될 때, 다양한 개별적이고 포괄적인 각각의 조합의 구체적인 언급이 명백하게 개시되지 않을 수 있는 한편으로, 각각은 구체적으로 본원에 포함되고 설명되는 것으로 인지된다. 예를 들어 만약 펩티드가 개시되고 논의되며 펩티드를 포함하는 많은 분자에 대하여 이루어질 수 있는 많은 변형이 논의된다면, 펩티드의 각각의, 그리고 모든 조합과 변경 및 가능한 변형들은 특별히 반대로 언급되지 않는 한 구체적으로 고려된다. 그러므로 만약 분자 A, B 및 C의 부류가 개시되고, 마찬가지로 분자 D, E 및 F의 부류가 개시되며, 조합 분자의 실례, 예컨대 A-D가 개시된다면, 각각은 개별적으로 인용되지 않은 것과 같고, 각각은 개별적으로 그리고 포괄적으로 고려된다. 그러므로 이 실례에서 조합 A-E, A-F, B-D, B-F, C-D, C-E 및 C-F의 각각은 구체적으로 고려되며 개시된 A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D로부터 개시되는 것으로 여겨져야 한다. 마찬가지로, 이것들의 어떠한 하위세트나 조합도 또한 구체적으로 고려되고 개시된다. 그러므로 예를 들어 ㅁ-ㄷ, B-F, 및 C-E의 하위그룹이 구체적으로 고려되며 A, B, 및 C; D, E 및 F;그리고 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된 것으로 고려되어야 한다. 이런 개념은 개시된 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 포함하여, 그것에만 한정되는 것은 아니지만, 본 출원의 모든 측면에 적용된다. 그러므로 만약 수행될 수 있는 추가의 다양한 단계가 있다면, 이들 추가의 단계는 각각 개시된 방법의 어떠한 구체적인 구체예 혹은 구체예들의 조합으로 수행될 수 있으며, 각각의 그러한 조합은 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 한다.
개시된 방법과 조성물은 다를 수 있는 것으로 설명된 특별한 방법론, 프로토콜, 및 시약에 제한을 받지 않는다는 것이 인지되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특별한 구체예를 설명하기 위한 것이며, 첨부되는 청구범위에 의해서만 제한될 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 아니라는 것이 인지되어야 한다.
개시된 방법 및 조성물은 다음의 특별한 구체예 및 그것에 포함된 실시예에 대한 상세한 설명과 도면 및 그것에 대한 전술한 및 이어지는 설명을 참조로 하여 보다 쉽게 이해될 수 있다.
A. 조성물
1. ATM-중재된 DNA 손상 반응
본원에는 방사선요법 및 화학요법에 대한 세포, 예를 들면 암세포의 민감성을 증가시키기 위하여 ATM의 활성화를 억제하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 방사선요법은 또한 비-악성 질환에, 예를 들면 삼차 신경통, 심각한 갑상선 눈병, 익상편의 치료, 켈로이드성 반흔 성장의 방지, 및 이소성 골화증의 방지에 적용된다.
현대의 분자 방사선 종양학에서, 생물학적 표적화는 세포 증식, DNA 수복 및 세포 사망과 관련된 세포 반응의 메커니즘의 심층적인 이해를 필요로 한다. 방사선 조사 (IR)-유도된 DNA 손상에 대한 세포 반응은 간결하게 조직된 신호 변환 네트워크에 의해 조절되는 것으로 잘 알려져 있다. 이런 네트워크는 많은 유전자 생성물로 구성되는데, 그것에는 센서, 변환기(transducer) 및 이펙터가 포함된다. DNA 이중 가닥 파괴 (DSB)는 키나제 변환의 활성화를 야기하는 센서 분자에 의해 검출된다. 이들 변환기는 그런 다음 이펙터 분자를 인산화하여 세포 주기 체크포인트를 조절하고, DNA 수복 조직에 영향을 미치거나, 혹은 아폽토시스성 경로를 야기하는 신호화 캐스케이드를 조절하게 된다. 네트워크의 한 중심 요소는 ATM 단백질로, 그것의 돌연변이는 혈관확장성 실조증 (A-T)으로 불리는 사람 상염색체성 퇴행성 장애의 원인이 된다 (Shiloh, 2003). A-T는 점진적인 신경-축퇴성, 가변적인 면역결핍성, 악성 림프종의 발달에 대한 매우 높은 경향성, 및 IR에 대한 과민성을 특징으로 한다. A-T 피험자로부터 유도된 세포는 다양한 비정상, 이를테면 세포 주기 체크포인트 결함, 염색체 불안정성 및 IR에 대한 반응의 과민성을 나타낸다. 이 질병의 원인이 되는 유전자는 1995년에 클론되었고, 돌연변이된 혈관확장성 실조증 (ATM)으로 명명되었다 (Savitsky et al., 1995). ATM 유전자는 그것의 큰 크기와 그것의 카르복실 말단에 PI-3 키나제와 유사한 서열이 존재한다는 점에서 주목할 만하다. 유전자 패밀리, 이를테면 효모의 Tel1, Mec1 및 Rad3, 초파리의 Mei-41, 및 척추동물의 ATR과 DNA-PK는 크기와 카르복실 말단의 키나제 서열이 유사하며, 모두 DNA 손상 반응을 조절하는데 포함된다 (Abraham, 2001). ATM 유전자는 370-KD 단백질 키나제를 코드화하는데, 그것은 예를 들면 상기 언급된 PI3 키나제 중에서 보존되고 단백질-단백질 상호작용 도메인으로서 작용할 수 있는 FAT 도메인을 포함하여, 여러 개의 기능성 도메인으로 구성된다. 키나제 도메인은 세린/트레오닌과 이어서 글루타민 (S/T-Q 일치 서열)을 인산화할 수 있고, FAT 카르복시-말단 도메인 (FATC)은 단백질 활성과 안정성을 조절할 수 있다. 선행 연구는 DNA 손상 후에 FAT 도메인 내에 있는 세린 부위 중 하나인 세린 1981상에서 ATM의 분자 간 자동인산화로 인해 ATM의 비활성 이량체가 활성 단량체 형태로 분해되는 것을 증명하였다 (Bakkenist and Kastan, 2003). 그러나 마우스를 사용한 연구결과, 마우스의 보존된 세린 잔기인 Ser1987에서 세린의 알라닌으로의 돌연변이를 일으킨 ATM은 ATM-중재된 DNA 손상 반응을 수복하는 관점에서는 충분히 기능적인 것으로 나타났다 (Pellegrint et al., 2006). 그러므로 ATM 활성화에서 Ser1981 자동인산화의 역할은 배제되었다.
ATM 활성화에 대한 다른 모델은 ATM 활성화가 NBS1과 Mrel1의 부재시에 손상되며, 이들 두 가지는 Rad50과 복합체 (소위 MRN 복합체)를 형성한다는 사실을 토대로 한다. MRN 복합체는 고도로 보존된 것으로, 염색체 파괴 대사과정의 각 측면에 영향을 미치고, 움 가닥 파괴를 검출하기 위한 DNA 손상 센서로 간주된다 (Difilippantonio et al., 2005; Dupre et al., 2006). NBS1의 보존된 C-말단 모티프는 ATM의 여러 HEAT 반복부에 결합하며, 그것은 키나제를 활성화하기 위해 필수적인 상호작용이다 (Falck et al., 2005). 연구결과 MRN 복합체가 DNA 이중가닥 파괴를 검출할 수 있고, 손상된 DNA 분자에 대해 ATM을 회복할 수 있는 것으로 드러났다 (Lee and Paull, 2004; Lee and Paull, 2005; Difilippantonio et al., 2005). 활성화된 ATM은 많은 하류의 표적을 인산화할 수 있어서 최적의 세포 반응을 촉진시킨다. 지난 10년에 걸쳐, DNA 손상에 대한 최적의 세포 반응에 필수적인 많은 단백질이 ATM 효소 기질로서 인식되어 왔다. 이렇게 계속해서 늘어나는 ATM 기질 목록의 좋은 실례는 가장 최근에 발견된 것으로 E3 유비퀴틴(ubiquitin) 리가제 COP1이 ATM에 의해 인산화될 수 있고, 그것의 수반되는 기능은 DNA 손상에 대한 반응으로 p53을 안정화시키는 것이다 (Dornan et al., 2006).
ATM이 방사선 조사에 대한 세포반응의 중심에 있기 때문에 그것의 활성화 혹은 활성을 차단하는 것은 실제로 방사선에 대해 훨씬 더 민감한 모든 유형의 종양을 만들 수 있다. 1995년에 유전자를 클로닝한 이래로 많은 연구자가 ATM을 표적화하기 위하여 여러 가지 방법을 사용하였다. 그런 방법들로는 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA (siRNA), 및 ATM의 작은 분자 억제제를 선별하는 것을 포함한다. 장(Zhang) 등은 계속해서 반대 방향의 전체 길이의 ATM의 cDNA를 CB3AR 세포에 하위클론시켰고, 그때에 방사선 민감성이 크게 증가되는 것으로 나타났다. 안티센스 구성물은 A-T 세포에서 관찰된 것과 유사하게 방사선 민감성을 대략 3배나 증가시켰다. 형질전환된 세포에서도 염색체 파괴의 수와 외관상 방사선 내성으로 보이는 DNA 합성이 증가하였다 (Zhang et al., 1998). 또한 신경교아세포종 및 전립선 선암종 세포에서 안티센스 ATM에 의해 부여된 방사선 민감성은 형질전환되지 않은 세포에서 관찰된 것보다 무려 4배나 더 많은 것으로 나타났다 (Guha et al., 2000; Fan et al., 2000).
최근에 siRNA의 개발은 전립선 암세포에서 ATM 기능을 억제할 수 있는 siRNA의 생성을 유도하였다. 콜리스(Collis) 등은 사람 암세포에서 ATM을 표적화하는 siRNA를 코드화하는 외인성 플라스미드를 계획하고 전달하였다. DU-145 및 PC-3 세포는 두 가지 모두 위의 플라스미드로 형질전환될 때, 임상적으로 관련된 방사선 용량에서 방사선 민감성이 증가되는 것으로 나타났다 (Collis et al., 2003). 보다 최근에는, ATM 특이적인 siRNA를 사용하여 Hela 세포를 안정하게 형질전환함으로써 이온화 방사선에 대한 민감성이 10배 증가되었다. 또한 p53 결핍 세포에서 ATM을 침묵시키는 것은 세포 주기 체크포인트의 손상을 유발하고, 독소루비신과 조합될 때, 3.1배나 많은 화학물질 민감성 증강이 관찰되었다 (Mukhopadhyay et al., 2005). siRNA가 생체 내에서 전도유망한 결과를 나타낸 반면, 임상 연구로 전환되면 그 결과가 느려졌다.
DNA-PK 억제제 LY294002 주변의 화합물의 조합 라이브러리를 선별함으로써 힉슨 (Hickson) 등은 ATM 키나제를 선택적으로 억제하는 화합물 (KU55933)을 보고하였다. 그들의 연구는 Hela 세포에서 방사선 민감성이 상당히 증가하였음을 나타냈고, 에토포시드에 대한 민감성이 35.5배나 많이 증가하였음을 밝혀냈다 (Hickson et al., 2004). 그러나 생체 내 방사선 민감화 효과나 화합물의 독성은 보고되지 않았다. 상기에서 언급된 방법들을 적용함에 있어 여러 가지 장애물이 존재하는데, 이를테면 다음과 같다: 1) 안티센스 전략이나 siRNA 기법에 의해 ATM 유전자를 유전자 조작하는 것은 유전자의 큰 크기 때문에 임상적인 세팅에서는 번거로운 것이다; 2) 이들 방법은 종양 특이적 표적화를 보증하지 못한다. 그러므로 치료 지수의 증가는 불확실하다; 그리고 3) 보다 중요한 것은, 유전자의 돌연변이의 다면발현성 효과로 인하여, ATM 키나제 활성을 직접적으로 표적화하는 결과는, 이들 시약의 유일한 효과가 방사선 민감화를 부여할 것인지가 불명확하기 때문에 복잡해질 수 있다.
2. 작은 억제 펩티드
NBS1-ATM 상호작용은 ATM의 IR-유도된 활성화 및 제한 방사선 민감성에 중요하기 때문에, 본원에는 선택적으로 신호화 경로를 파괴하는 방사선 민감성 증강물질을 개발하기 위한 접근법이 개시된다. 한 가지 제공된 방법은 NBS1-ATM 상호작용을 차단하기 위한 작은 비-기능성 펩티드를 사용하는 것이다. 예를 들어 야생형 C-말단 NBS1 서열을 함유하는 작은 펩티드는 NBS1-ATM 상호작용과 ATM 활성화를 억제할 수 있다. 유사하게, ATM의 열 반복 서열을 포함하는 작은 펩티드는 NBS1-ATM 상호작용과 ATM 활성화를 억제할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드"와 "폴리펩티드"는 둘 또는 그 이상의 아미노산의 중합체를 언급하는 동의어로 사용되며 특별한 길이나 제조 방법을 나타내는 것을 의미하지는 않는다.
그러므로 본원에는 NBS1의 카르복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 혹은 그것의 보존성 변이체 (본원에서는 NIP로 언급되기도 한다)가 제공된다. 예를 들어 제공된 펩티드는 C-말단의 최대 4 내지 30개의 아미노산 내에 NBS1의 아미노산 734 내지 754 (SEQ ID NO:1)를 포함하여 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이런 맥락에서, 펩티드는 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 어떤 측면으로는 펩티드는 아미노산 서열 xEExxxDDLx를 포함하며, 여기서 x는 모든 아미노산이다 (SEQ ID NO:55).
펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10에 대해 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한 본원에는 ATM의 NBS1-결합 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 혹은 그것의 보존성 변이체가 제공된다. 예를 들어 폴리펩티드는 NBS1에 결합하는 ATM의 열 반복 서열, 혹은 그것의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 제공된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56을 포함할 수 있다. 제공된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:57을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 NBS1에 결합하는, SEQ ID NO:56에 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열, 혹은 그것의 단편을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 NBS1에 결합하는, SEQ ID NO:57에 대해 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열, 혹은 그것의 단편을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 것과 같이, 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 카르복시-말단에 대한 ATM의 결합을 억제할 수 있다. 또한 본원에 개시된 것과 같이, 제공된 폴리펩티드는 세포, 예컨대 암세포의 방사선요법 및 화학요법에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다. 그러므로 한 측면으로, 본원에 제공된 분리된 폴리펩티드는 피험자에게 투여하기에 적당한 약제학적 조성물로 제공된다.
한 측면으로, 본원에 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 카르복시-말단의 대부분의 아미노산을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있고, 단 그 펩티드는 전체 길이의 NBS1이 아니다. 그러므로 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 C-말단의 대부분의 4 내지 30 아미노산, 이를테면 NBS1의 C-말단의 최대 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 아미노산, 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 아미노산 734 내자 754 (SEQ ID NO:1)를 포함할 수 있다. 제공된 폴리펩티드는 C-말단의 최대 4 내지 30 아미노산, 이를테면 NBS1의 아미노산 734 내지 754 (SEQ ID NO:1) 내에 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이런 맥락으로, 펩티드는 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10에 대해 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10에 대해 최소한 96%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10에 대해 최소한 97%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10에 대해 최소한 98%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 또는 SEQ ID NO:10에 대해 최소한 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 측면으로, 폴리펩티드는 예를 들면 C-말단에서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 아미노산을 포함하지 않는다. 그러므로 펩티드는 NBS1의 아미노산 734-753, 734-752, 734-751, 734-750, 734-749, 734-748, 734-747, 734-746, 734-745, 734-744를 포함할 수 있다. 그러므로 펩티드는 어떤 측면으로는 아미노산 754, 753, 752, 751, 750, 749, 748, 747, 746, 745를 포함하지 않는다.
NBS1의 C-말단은 ATM 활성화 및 DNA 손상 부위들의 회복에 필요하다. 그것은 최소한 2 세트의 아미노산 잔기, 즉 736-737 (EE) 및 741-743 (DDL)를 포함하며, 그것들은 진화적으로 보존되고 ATM 결합에 필요하다. 그러므로 NBS1은 아미노산 서열 xEExxxDDLx를 포함할 수 있고, 이때 x는 어떠한 아미노산 서열이다 (SEQ ID NO:55).
추가의 측면으로 본원에 제공된 폴리펩티드는 ATM의 NBS1-결합 도메인을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있는데, 단 펩티드는 전 길이의 ATM이 아니어도 된다. 그러므로 본원에 제공된 폴리펩티드는 ATM의 열 반복부 2 및/또는 7을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있다. 그로써 본원에 제공된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:52에 개시된 ATM 서열의 아미노산 248 내지 522를 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있다. 그러므로 본원에 제공된 폴리펩티드는 아미노산 SEQ ID NO:56을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있다. 그러므로 본원에 제공된 폴리펩티드는 ATM의 아미노산 1436-1770 (SEQ ID NO:51)을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있다. 그러므로 본원에 제공된 폴리펩티드는 아미노산 SEQ ID NO:57을 포함하는 어떠한 폴리펩티드일 수 있다. 제공된 폴리펩티드는 ATM의 열 반복부 2 및/또는 7 내에 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이런 맥락으로 펩티드는 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56 또는 SEQ ID NO:57에 대해 최소한 95%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56 또는 SEQ ID NO:57에 대해 최소한 96%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56 또는 SEQ ID NO:57에 대해 최소한 97%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56 또는 SEQ ID NO:57에 대해 최소한 98%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56 또는 SEQ ID NO:57에 대해 최소한 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
제공된 폴리펩티드는 또한 융합 단백질을 구성하거나 혹은 그렇지 않으면 추가의 N-말단, C-말단 혹은 중간체 아미노산 서열, 예컨대 링커 또는 태그를 구성할 수 있다. 본원에서 사용되는 "링커"란 두 개의 구별되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편을 연결하거나 분리하기 위해 사용될 수 있는 아미노산 서열 또는 삽입부분이고, 이때 링커는 그렇지 않다면 조성물의 본질적인 기능에 기여하지 않는다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드는, 예를 들면 아미노산 GLS, ALS 또는 LLA를 포함하는 아미노산 링커를 가질 수 있다. 본원에서 사용되는 "태그"는 제공된 폴리펩티드를 검출하거나 정제하기 위해 사용될 수 있는 구별되는 아미노산 서열을 말하며, 이때 태그는 그렇지 않으면 조성물의 본질적인 기능에는 관여하지 않는다. 제공된 폴리펩티드는 추가로 폴리펩티드의 본질적인 활성에 관여하지 않는 N-말단, C-말단 또는 중간 아미노산이 결실될 수 있다.
3. 융합 단백질
본원에 개시된 폴리펩티드는 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질은 또한 키메릭 단백질로서도 알려져 있고, 원래 별개의 단백질을 코딩하는 둘 또는 그 이상의 유전자들이 연결됨으로써 생성된 단백질이다. 이 융합 유전자의 번역 결과 각각의 원래 단백질로부터 유도된 기능 특성을 가지는 단일한 폴리펩티드가 생성된다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구나 치료에 사용하기 위한 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성될 수 있다. 키메릭 돌연변이 단백질은 대규모의 돌연변이, 전형적으로는 염색체상의 전위(translocation)가 두 개의 상이한 유전자로부터 코딩 서열의 일부를 함유하는 새로운 코딩 서열을 생성할 때 자연적으로 일어난다.
융합 단백질의 기능성은 많은 단백질의 기능성 도메인이 모듈 방식이라는 사실에 의해 가능하게 만들어진다. 달리 표현하자면, 주어진 도메인, 예컨대 티로신 키나제 도메인에 상응하는 폴리펩티드의 선형 부분은 그것의 고유한 효소적 능력을 잃어버리지 않으면서 단백질의 나머지 부분으로부터 제거될 수 있다. 그러므로 본원에 개시된 융합 도메인은 모두 융합 단백질을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
재조합 융합 단백질은 융합 유전자의 유전공학을 통해 생성된 단백질이다. 그것은 전형적으로 첫 번째 단백질을 코딩하는 cDNA 서열로부터 중지 코돈을 제거한 후, 결찰 또는 중첩 연장 PCR을 통해 프레임에 두 번째 단백질의 cDNA 서열을 부착하는 것을 포함한다. 그 DNA 서열은 그런 다음 세포에 의해 단일 단백질로서 발현될 것이다. 단백질은 두 개의 원래의 단백질 전부, 혹은 둘 중 한쪽 부분만의 전체 서열을 포함하도록 공학제조될 수 있다.
만약 두 실체가 단백질이라면, 자주 링커 (또는 "스페이서") 펩티드가 또한 첨가되고, 그것으로 인해 단백질은 독립적으로 접혀지고 예상하는 것과 같이 행동하게 되는 것 같다. 특히 링커가 단백질 정제를 가능하게 하는 경우에, 단백질 혹은 펩티드 융합물에 있는 링커는 때로 두 개의 별도의 단백질의 유리(liberation)를 가능하게 하는 프로테아제 또는 화학적 제제에 대한 절단 부위를 가지도록 공학제조된다. 이런 기법은 자주, 니켈 또는 코발트 수지 (친화성 크로마토그래피)를 사용하여 분리될 수 있는 GST 단백질, FLAG 펩티드, 또는 헥사-his 펩티드 (aka: 6xhis-태그)를 융합함으로써 단백질의 확인과 정제를 위해 사용된다. 키메릭 단백질은 또한 질병 발생을 연구하기 위하여 그것들에 부착된 독소 또는 항체를 사용하여 제조될 수 있다.
또는 달리, 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 요소들은 다중유전자, 또는 다중 시스트론성 메시지를 제조하기 위해 사용될 수 있다. IRES 요소들은 5' 메틸화된 Cap 의존성 번역의 리보솜 주사(scanning) 모델을 우회할 수 있고 여러 내부 부위에서 번역을 시작할 수 있다 (Pelletier and Sonenberg, 1988). 피코르나바이러스 패밀리의 두 구성원 (소아마비와 뇌척수 심근염)으로부터의 IRES 요소는 이미 설명되었을 뿐 아니라 (Pelletier and Sonenberg, 1988), 포유류 메시지로부터의 IRES도 설명되어 있다 (Macejak and Sarnow, 1991). IRES 요소들은 이종성 오픈 리딩 프레임에 연결될 수 있다. 다중 오픈 리딩 프레임은 함께 전사될 수 있으며, 각각은 IRES에 의해 분리되어 다중 시스트론성 메시지를 생성할 수 있다. IRES 요소에 의해 각각의 오픈 리딩 프레임은 효과적인 번역을 위해 리보솜에 쉽게 접근할 수 있다. 다중 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현되어 단일 메세지가 전사될 수 있다 (미국 특허 번호 제 5,925,565호 및 5,935,819호; PCT/US99/05781호). IRES 서열은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 뇌척수 심근염 바이러스 (EMCV)로부터의 IRES 서열 (Ghattas, I. R. et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5849 (1991)); BiP 단백질 (Mac더마 andSarnow, Nature, 353:91 (1991)); 초파리의 안테나페디아(antennapedia) 유전자 (엑손 d와 e) (Oh et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)); 폴리오바이러스의 IRES 서열들 (Pelletier and Sarnow, Nature, 334:320-325 (1988); 및 Mountford and Smith, TIG, 11:179-184 (1985))을 포함한다.
4. 내재화 서열
NBS1 펩티드는 효과적으로 세포 안으로 들어가기 위해 내재화 서열 혹은 단백질 변환 도메인에 연결될 수 있다. 최근의 연구 결과 여러 개의 세포 침투 펩티드, 이를테면 HIV 바이러스의 TAT 전이활성 도메인, 안테나페디아, 및 쉽게 분자 및 작은 펩티드를 원형질막을 가로질러 수송할 수 있는 트랜스포탄(transportan)이 확인되었다 (Schwarze et al., 1999; Derossi et al., 1996; Yuan et al., 2002). 보다 최근에는, 폴리아르기닌이 원형질막을 가로질러 펩티드와 단백질을 훨씬 더 효율적으로 수송함으로써 펩티드 중재된 수송에 대한 매력적인 도구가 되고 있는 것으로 나타났다 (Fuchs and Raines, 2004). 노나아르기닌 (R9, SEQ ID NO:18)은 가장 효율적인 폴리아르기닌 기저 단백질 변환 도메인 중 하나로서 설명되었고, TAT나 안테나페디아보다 상당히 더 큰 최대 흡수를 나타낸다. 펩티드 중재된 세포독성은 또한 폴리아르기닌-기저 내재화 서열이 더 적은 것으로 나타났다. R9 중재된 막 수송은 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 결합 및 세포내 패키징을 통해 촉진된다. 일단 내재되면, 헤파란은 헤파라나제에 의해 분해되고, 그 결과 R9가 방출되어 세포질로 누출된다 (Deshayes et al., 2005). 최근의 연구 결과 폴리아르기닌의 유도체가 전체 길이의 p53 단백질을 구강 암세포에 전달하여 그것의 성장과 전이를 억제함으로써 강력한 세포 침투 펩티드로서 폴리아르기닌이 규정되는 것으로 나타났다 (Takenobu et al., 2002).
그러므로 제공된 폴리펩티드는 세포 내재화 수송물질 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 공지되어 있거나 새롭게 당해 기술분야에서 발견된 어떠한 내재화 서열, 또는 그것의 보존성 변이체일 수 있다. 세포 내재화 수송물질 및 서열의 비-제한적인 실례로는 폴리아르기닌 (예컨대 R9), 안테나페디아 서열, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A (Antp 돌연변이체), Buforin II, 트랜스포탄, MAP (모델 양친매성 펩티드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC (비스-구아니디니움-스퍼미딘-콜레스테롤), 및 BGTC (비스-구아니디니움-트렌-콜레스테롤)가 있다 (표 1 참조).
표 1: 세포 내재화 수송물질
명칭 서열 SEQ ID NO
폴리아르기닌 RRRRRRRRR SEQ ID NO:18
Antp RQPKIWFPNRRKPWKK SEQ ID NO:19
HIV-Tat GRKKRRQRPPQ SEQ ID NO:20
페네트라틴 RQIKIWFQNRRMKWKK SEQ ID NO:21
Antp-3A RQIAIWFQNRRMKWAA SEQ ID NO:22
Tat RKKRRQRRR SEQ ID NO:23
부포린 II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK SEQ ID NO:24
트랜스포탄 GWTLNSAGYLLGKINKALAALAKKIL SEQ ID NO:25
모델 양친매성 펩티드(MAP) KLALKLALKALKAALKLA SEQ ID NO:26
K-FGF AAVALLPAVLLALLAP SEQ ID NO:27
Ku70 VPMLK-PMLKE SEQ ID NO:28
프리온 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP SEQ ID NO:29
pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK SEQ ID NO:30
Pep-1 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV SEQ ID NO:31
SynB1 RGGRLSYSRRRFSTSTGR SEQ ID NO:32
Pep-7 SDLWEMMMVSLACQY SEQ ID NO:33
HN-1 TSPLNIHNGQKL SEQ ID NO:34
BGSC(비스-구아니디니움-스퍼미딘-콜레스테롤)
BGTC(비스-구아니디니움-트렌-콜레스테롤)
그러므로, 제공된 폴리펩티드는 추가로 아미노산 서열 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, 또는 SEQ ID NO:34를 포함할 수 있다. (또한 Bucci, M. et al., 2000. Nat. Med. 6, 1362-1367; Derossi, D., et al. 1994. Biol. Chem. 269, 10444-10450; Fischer, P.M. et al. 2000. J. Pept. Res. 55, 163-172; Frankel, A. D. & Pabo, C. O. 1988. Cell 55, 1189-1193; Green, M. & Loewenstein, P. M. 1988. Cell 55, 1179-1188; Park, C. B., et al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8245-8250; Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. 12, 67-77; Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys. Acta 1414, 127-139; Lin, Y. Z. et al. 1995. J. Biol. Chem. 270. 14255-14258; Sawada, M., et al. 2003. Nature Cell Biol. 5, 352-357; Lundberg, P. et al., 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90; Elmquist, A., et al. 2001. Exp. Cell Res. 269, 237-244; Morris, M. C., et al. 2001. Nature Biotechnol. 19, 1173-1176; Rousselle, C. et al. 2000. Mol. Pharmacol. 57, 679-686; Gao, C. et al. 2002.Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-4065; Hong, F. D. & Clayman, G. L. 2000. Cancer Res. 60, 6551-6556 참조). 제공된 폴리펩티드는 추가로 BGSC (비스-구아니디니움-스퍼미딘-콜레스테롤) 또는 BGTC (비스-구아니디니움-트렌-콜레스테롤)을 포함할 수 있다 (Vigneron, J. P. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9682-9686). 앞의 참조문헌들은 세포의 내재화 벡터 및 서열을 교시하기 위해 본원에 전체가 참조되는 것으로 언급된다. 현재 공지되어 있거나 나중에 확인된 어떠한 다른 내재화 서열들도 본 발명의 펩티드와 조합될 수 있다.
예를 들면 폴리펩티드는 NBS1의 카르복시-말단의 대부분의 아미노산과 폴리아르기닌 내재화 서열을 포함할 수 있다. 그러므로 예를 들면 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, 또는 SEQ ID NO:42를 포함할 수 있다.
5. 종양-특이적 표적화
바람직한 방사선 민감물질은 오직 종양 세포만을 감지하며, 정상 세포는 피해간다. 이것을 이루기 위한 한 가지 접근법은 내재화 및 종양 특이적 표적화 능력 두 가지를 모두 가지고 있는 폴리펩티드 (예컨대 변형되거나 융합된 단백질)를 활용하는 것이다. 종양 혈관 구조는 주변의 정상 조직의 혈관구조와 다르기 때문에, 형태와 생화학 두 측면에서 모두, 이런 차이는 최근에 이르러 종양 진전의 중요한 결정요인으로서 및 신규한 항암 치료법에 대한 잠재적 표적으로서 점점 더 각광을 받고 있다. 생화학적으로, 종양 혈관은 많은 혈관신생-관련 분자, 예컨대 특정한 인티그린, 내피세포 성장인자 수용체, 프로테아제, 세포표면 프로테오글리칸 및 세포외재성 매트릭스 성분 들을 발현함으로써 자기 자신을 나머지 혈관과 구별한다 (Ruoslahti, 2000). 마우스에 주사되었을 대 종양 혈관구조로 복귀되는 펩티드에 대한 라이브러리를 나타내는 파지의 생체 내 선별은 종양 회귀에 대한 여러 모티프를 시사하였다. 그것에는 순환성 펩티드 CDCRGDCFC (SEQ ID NO:12)의 RGD, 및 순환성 종양-회귀 펩티드, CNGRC (SEQ ID NO:11)의 NGR이 포함된다. NGR-함유 펩티드는 세포독성 약물, 프로-아폽토시스성 펩티드, 및 종양 괴사 인자 α를 종양 혈관구조로 전달하는 데 유용한 것으로 증명되었다 (Ellerby et al., 1999; Arap et al., 1998; Arap et al., 2002; Curnis et al., 2002). 세 번째 모티프인 GSL 또한 다양한 유형의 종양으로 선별할 때 자주 분리되었다 (Arap et al., 1998). RGD, NGR 및 GSL 모티프 펩티드를 운반하는 파지의 종양 회귀는 종양 유형과 무관하며 (Arapet al., 1998; Pasqualini et al., 2000; Pasqualini et al., 1997), 오히려 회귀는 종양 혈관구조의 혈관신생 특성에 좌우된다. NGR 종양 회귀 펩티드에 대한 수용체는 인티그린이 아니다. 대신, 아미노펩티다제 N (APN 또는 CD13)은 종양 혈관구조에서 NGR 모티프 펩티드에 대한 수용체로서 확인되었다 (Pasqualini et al., 2000). NGR-함유 펩티드는 세포독성 약물, 프로-아폽토시스성 펩티드, 및 종양 괴사 인자 α를 종양 혈관구조로 전달하는 데 유용한 것으로 증명되었다 (Ellerby et al., 1999; Arap et al., 1998; Arap et al., 2002; Curnis et al., 2002). 보다 흥미로운 것은, NGR 펩티드가 전립선의 일차 및 전이성 종양에 결합할 수 있지만, 정상적인 전립선 조직에는 결합하지 않는 것으로 밝혀진 것이다 (Pasqualini et al., 2000). NGR 펩티드는 또한 시토졸성 내재화에 대한 능력을 나타낸다 (Arap et al., 1998).
특이한 조직을 표적으로 할 수 있는 어떠한 분자든지 본 발명의 폴리펩티드 (예를 들면 NIP를 포함하는 융합 단백질에서)의 표적화 분자로서 사용될 수 있다. 예를 들어 표적화 분자는 사람 상피 세포 뮤신 (Muc-1; Muc-1 당단백질에 대한 20 아미노산 코어 반복, 유방암세포와 전립선 암세포에 존재한다), Ha-ras 종양유전자생성물, p53, 암태아성 항원 (CEA), raf 종양유전자 생성물, gp100/pme17, GD2, GD3, GM2, TF, sTn, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE, 티로시나제, gp75, 멜란-A/Mart-1, gp100, HER2/neu, EBVLMP 1 & 2, HPV-F4, 6, 7, 전립선-특이적 항원 (PSA), HPV-16, MUM, 알파-페토단백질 (AFP), CO17-1A, GA733, gp72, p53, ras 종양유전자 생성물, HPV E7, 빌름 종양 항원-1, 텔로머라제, 흑색종 강글리오시드, 또는 단순 경막 서열과 상호작용하는 분자일 수 있다.
살아있는 신체에서 암세포에 치료제를 선택적으로 전달하는 것은 암에 특이적인 생체 마커의 표적화가 집중적으로 연구되는 또 다른 연구 영역이다 (E. Mastrobattista, G. A. Koning, and G. Storm, "Immonoliposomes for the Targeted Delivery of Antitumor Drugs," Adv Drug Delivery Reviews 1999, 40:103-27; J. Sudimack and R. J. Lee, "Targeted Drug Delivery Via Folate Receptor," Adv Drug Delivery Reviews 2000, 41:147-62; S. P. Vyas and V. Sihorkar, "Endogenous Carriers and Ligands in Non-Irnrnunogenic Site-Specific Drug Delivery," Adv Drug Delivery Reviews 2000, 43: 101- 64). 폴레이트 수용체에 대한 단클론성 항체 (E. Mastrobattista, G. A. Koning, and G. Storm, "Immunoliposomes for the Targeted Delivery of Antitumor Drugs, "Adv. Drug Delivery Reviews 1999, 103-27; J. Sudimack and R. J. Lee, "Targeted Drug Delivery Via Folate Receptor," Adv Drug Delivery Reviews 2000, 41:147-62), CA-125에 대한 단클론성 항체 (E. Mastrobattista, G. A. Koning, and G. Storm, "Immunoliposomes for the Targeted Delivery of Antitumor Drugs, "Adv. Drug Delivery Reviews 1999, 103-27) 및 HER2/neu 항원에 대한 단클론성 항체 (D. B. Kirpotin, J. W. Park, K. Hong, S. Zalipsky, W. L. Li, P. Carter, C. C. Benz, and D. Papahadjopoulos, "Sterically Stabilized anti-HER2 immunoliposomes: design and targeting to human breast cancer cells in vitro, "Biochemistry 1997, 36:66-75)를 사용하는 면역리포솜-중재된 표적화가 설명되어 있다.
그러므로 본원에 제공된 폴리펩티드는 추가로 종양 특이적 표적화 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 종양 특이적 표적화 서열은 RGD, NGR, 또는 GSL 모티프를 포함할 수 있다. 한 측면으로 종양 특이적 표적화 서열은 종양 혈관 내피 세포를 표적화한다. 그러므로 폴리펩티드는 SEQ ID NO:11 또는 SEQ ID NO:12에 표시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
6. 이펙터
본원에 제공된 조성물은 추가로 이펙터 분자를 포함할 수 있다. '이펙터 분자'란 표적 세포(들) 또는 지조기에 작용하여 원하는 효과를 불러일으키는 물질을 의미한다. 그 효과는 예를 들면 표적 세포(들) 또는 조직의 표지화, 활성화, 억제, 또는 사망일 수 있다. 그러므로 이펙터 분자는 예를 들면 작은 분자, 약제학적 약물, 독소, 지방산, 검출가능한 마커, 포합용 태그, 나노입자 또는 효소일 수 있다.
표적화 펩티드에 포합될 수 있는 작은 분자와 약제학적 약물의 실례는 당해 기술분야에 알려져 있다. 이펙터는 표적 세포를 죽일 수 있는 세포독성 작은 분자이거나 약물일 수 있다. 예를 들어 작은 분자 또는 약물은 세포 주기를 억제하거나, 단백질 분해를 활성화하거나, 아폽토시스를 유발하거나, 키나제 활성을 조절하거나, 또는 세포골격 단백질을 변형할 수 있다. 어떠한 공지된 또는 새롭게 개발된 세포독성 작은 분자 또는 약물이든지 표적화 펩티드와 함께 사용되는 것이 고려된다.
이펙터는 표적화된 세포를 죽이는 독소일 수 있다. 독소의 비-제한적인 실례로는 아브린, 모데신, 리신 및 디프테리아 독소가 있다. 다른 공지된 또는 새롭게 발견된 독소는 제공된 조성물과 함께 사용되는 것이 고려된다.
제공된 조성물에 포합될 수 있는 지방산 (즉 지질)로는 펩티드를 리포솜 안으로 효과적으로 통합시키는 것이 가능한 것들을 포함한다. 일반적으로 지방산은 극성 지질이다. 그러므로 지방산은 인지질일 수 있다. 제공된 조성물은 천연 또는 합성 인지질을 포함한다. 인지질은 포화 또는 불포화 모노 또는 디-치환된 지방산을 포함하는 인지질 및 그것들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 그러한 인지질로는 디롤레오일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜세린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티드산, 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 팔미토일올레오일포스파티딜세린, 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 팔미토일올레오일포스파티딜세린, 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티드산, 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜콜린, 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜세린, 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미텔라이도일올레오일포스파티딜글리세롤, 팔미텔라이도일올레오일포스파티드산, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜콜린, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜세린, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜에탄올아민, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜글리세롤, 미리스톨레오일올레오일포스파티드산, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜세린, 디리놀레오일포스파티딜에탄올아민, 디리놀레오일포스파티딜글리세롤, 디리놀레오일포스파티드산, 팔미티클리놀레오일포스파티딜콜린, 팔미티클리놀레오일포스파티딜세린, 팔미티클리놀레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미티클리놀레오일포스파티딜글리세롤, 팔미티클리놀레오일포스파티드산이 있다. 이들 인지질은 또한 포스파티딜콜린의 모노아실화된 유도체 (리소포스파티딜콜린), 포스파티딜세린의 모노아실화된 유도체 (리소포스파티딜세린), 포스파티딜에탄올아민의 모노아실화된 유도체 (리소포스파티딜에탄올아민), 포스파티딜글리세롤의 모노아실화된 유도체 (리소포스파티딜글리세롤) 및 포스파티드산의 모노아실화된 유도체 (리소포스파티드산)일 수 있다. 이들 리소포스파티딜 유도체의 모노아실 사슬은 팔미토일, 올레오일, 팔미톨레오일, 리놀레오일, 미리스토일 또는 미리스톨레오일일 수 있다. 인지질은 또한 합성일 수 있다. 합성 인지질은 다양한 공급원으로부터 쉽게 상업적으로 구할 수 있는데, 예를 들면 AVANTI Polar Lipids (Albaster, Ala.); Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.)에서 구입할 수 있다. 이들 합성 화합물은 다양하며 자연 발생 인지질에서는 발견되지 않는 그것들의 지방산 사슬도 다양하다. 지방산은 PS 또는 PC의 어느 한쪽 혹은 둘 다에 C14, C16, C18 또는 C20 사슬 길이를 가지는 불포화된 지방산 측쇄를 가질 수 있다. 합성 인지질은 구성성분으로서 디올레오일(18:1)-PS; 팔미토일(16:0)-올레오일(18:1)-PS, 디미리스토일(14:0)-PS, 디팔미톨레오일(16:1)-PC, 디팔미토일(16:0)-PC, 디올레오일(18:1)-PC, 팔미토일(16:0)-올레오일(18:1)-PC, 및 미리스토일(14:0)-올레오일(18:1)-PC를 가질 수 있다. 그러므로 실례로서 제공된 조성물은 팔미토일 16:0을 포함할 수 있다.
검출가능한 마커는 표적 조직 또는 세포(들)을 표지하거나 염색하기 위해 사용될 수 있는 모든 물질이다. 검출가능한 마커의 비-제한적인 실례는 방사성 활성 동위원소, 효소, 형광색소, 및 양자 돗트 (Qdot®)를 포함한다. 다른 공지 또는 새롭게 발견된 검출가능한 마커도 제공된 조성물과 함께 사용되는 것이 고려된다.
이펙터 분자는 나노입자, 예컨대 열 생성 나노쉘일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 '나노쉘'은 하나 또는 그 이상의 전도성 쉘층에 의해 둘러싸여 있는 불연속적인 유전성 또는 반-전도성 코어 단면을 가지고 있는 나노입자이다. 미국 특허 제 6,530,944호는 금속 나노쉘을 제조하고 사용하는 방법을 교시하기 위해 전체 내용이 참조로서 본원에 삽입된다. 나노쉘은 유전성 또는 비활성 물질, 예컨대 규소의 코어와 함께 형성될 수 있고, 순수한 적외광 (대략 800 내지 1300nm)과 같은 방사선을 사용하여 여기될 수 있는 고도로 전도성 금속과 같은 물질로 코팅될 수 있다. 여기될 때, 나노쉘은 열을 방출한다. 그 결과 이상 고열은 주변의 세포(들) 또는 조직을 죽일 수 있다. 나노쉘의 쉘과 코어의 직경의 조합은 수십 나노미터부터 수백 나노미터 범위이다. 순수한 적외광이 조직을 침투하는 그것의 능력 때문에 유익하다. 다른 유형의 방사선도 또한 나노입자 코팅 및 표적화된 세포의 선택에 따라 사용될 수 있다. 실례로는 x-선, 자기장, 전기장, 및 초음파가 있다. 이상 고열에 대한 기존의 방법, 특히 암치료에 사용하기 위한 방법, 예컨대 가열된 탐침, 마이크로파, 초음파, 레이저, 관류, 고주파 에너지, 및 복사 가열의 사용이 가지는 문제점들은, 본원에서 설명된 것과 같이 사용된 방사선의 수준이 나노입자의 표면에서를 제외하면 고열이상을 유도하기에는 불충분하기 때문에 피할 수 있는데, 나노입자의 표면에서는 에너지는 유전체의 금속 표면에 의해 보다 효과적으로 응집된다. 입자는 또한 영상화, 특별히 적외선 확산 광양자 영상화 방법을 사용하여 영상화를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 표적화 분자는 항체 또는 그것의 단편, 특이한 수용체에 대한 리간드, 또는 특히 표적화될 세포 표면에 특이하게 결합하는 다른 단백질일 수 있다.
이펙터 분자는 방사성 동위원소일 수 있다. 예를 들어 이펙터 분자는 이식에 적당한 어떠한 방사성 동위원소를 포함하는 "시드(seed)" 또는 와이어와 같은 물질일 수 있다. 방사성 시드를 조직에 이식하기 위해 많은 장치가 사용될 수 있다 (예컨대 미국 특허 제 2,269,963호 (Wappler); 미국 특허 제 4,402,308호 (Scott); 미국 특허 제 5,860,909호 (Mick); 및 미국 특허 제 6,007,474호 (Rydell) 참조). 전립선암을 치료하기 위한 전형적인 프로토콜에서 특수한 바늘을 가지는 이식 장치는 직장과 음낭 사이의 피부를 통해 전립선에 삽입되어 방사성 시드를 전립선에 전달한다. 시드가 이식되어야 하는 전립선의 다른 부위에 바늘이 옮겨지거나 새로운 바늘이 사용될 수 있다. 전형적으로는 20 내지 40개의 바늘이 전립선 하나에 대해 약 50 내지 150개의 시드를 전달하기 위해 사용된다. 초음파 탐침이 바늘의 위치를 추적하기 위해 사용될 수 있다.
현재 시판되는 방사성 시드는 방사성 동위원소를 캡슐 안에 담고 있는 캡슐의 형태를 취한다. 예를 들면 다음과 같은 것들이 있다: Symmetra.RTM. I-125 (Bebig GmbH, Germany); IoGold.TM. I-125 및 IoGold.TM. Pd-103 (North American Scientific, Inc., Chatsworth, Calif.); Best.RTM. I-125 및 Best Pd-103 (Best Industries, Springfield, Va.); Brachyseed.RTM. I-125 (Draximage, Inc., Canada); Intersource.RTM. Pd-103 (International Brachytherapy, Belgium); Oncoseed.RTM. I-125 (Nycomed Amersham, UK); STM 1250 1-125 (Sourcetech Medical, Carol Stream, III.); Pharmaseed.RTM. I-125 (Syncor, Woodland Hills, Calif.); Prostaseed.TM. I-125 (Urocor, Oklahoma City, Okla.); 및 I-plant.RTM. I-125 (Implant Sciences Wakefield, Mass.). 이들 시드의 캡슐은 티탄 또는 스테인레스 스틸과 같은 생체적합한 물질로 만들어질 수 있고, 방사성 동위원소가 새어나오지 않도록 빈틈없이 밀봉된다. 캡슐의 크기는 이식 장치에 사용된 바늘 중 하나의 구멍에 꼭 맞도록 정해질 수 있다. 대부분의 그런 바늘이 약 18게이지이기 때문에, 캡슐은 전형적으로 약 0.8mm의 직경과 약 4.5mm의 길이를 가진다. 근접치료 시드에 가장 흔히 사용되는 두 개의 방사성 동위원소는 요오드 (I-125)와 팔라듐 (Pd-103)이다. 이 두 가지는 낮은 에너지의 방사선을 방출하며 종양을 치료하기 위한 이상적인 반감기 특성을 지니고 있다. 예를 들면 I-125 시드는 매 60일마다 50%의 속도로 쇠퇴하므로, 전형적인 출발 용량을 사용하면 그것의 방사능은 10개월 후에는 거의 사라진다. Pd-103 시드는 좀 더 빨리 쇠퇴하는데, 17일이면 그것의 에너지의 절반을 잃어버리므로 그것은 겨우 3개월 후면 거의 비활성이 된다.
방사성 근접치료 시드는 또한 다른 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어 표준 X-선 영상화 기술을 사용하여 그것의 적절한 배치를 추적하는 것을 보조하기 위해 그런 시드는 방사성 불투과성 마커를 함유할 수 있다. 마커는 전형적으로 원자가가 큰 (즉 "높은 Z") 요소 또는 그런 요소들을 함유하는 합금 또는 혼합물로 만들어진다. 그런 마커의 실례로는 백금, 이리듐, 레늄, 금, 탄탈, 납, 비스무트 합금, 인듐 합금, 납과 주석의 합금 또는 저융점과의 다른 합금, 텅스텐, 및 은이 있다. 많은 방사성 불투과성 마커가 현재 시판되고 있는데 예를 들면 다음과 같다: 백금/이리듐 마커 (Draximage, Inc. and International Brachytherapy), 금막대 (Bebig GmbH), 금/구리 합금 마커 (North American Scientific), 팔라듐 막대 (Syncor), 텅스텐 마커 (Best Industries), 은 막대 (Nycomed Amersham), 은 스피어 (International Isotopes Inc. and Urocor), 및 은 와이어 (Implant Sciences Corp.)가 있다. 다른 방사성 불투과성 마커로는 다양한 물질이 주입된 중합체가 있다 (예컨대 미국 특허 제 6,077,880호 참조).
많은 상이한 미국 특허들이 근접치료에 관련된 기술에 대해 기재되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제 3,351,049호에는 근접치료 공급원으로서 저에너지 X-선 방출 침입형 이식편의 사용에 대해 개시되어 있다. 또한 미국 특허 제 4,323,055호, 4,702,228호, 4,891,165호, 5,405,309호, 5,713,828호, 5,997,463호, 6,066,083호, 및 6,074,337호에 근접치료 장치에 관련된 기법들이 개시되어 있다.
이펙터 분자는 개시된 펩티드에 공유결합을 통해 연결될 수 있다. 이펙터 분자는 개시된 펩티드의 아미노 말단부에 연결될 수 있다. 이펙터 분자는 개시된 펩티드의 카르복시 말단부에 연결될 수 있다. 이펙터 분자는 개시된 펩티드 내에 있는 아미노산에 연결될 수 있다. 본원에 제공된 조성물은 또한 이펙터 분자와 개시된 펩티드를 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 개시된 펩티드는 또한 나노쉘을 펩티드로 코팅하기 위해 사용될 수 있는 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 코팅 물질에 포합될 수 있다 (Tkachenko et al., (2003) J Am Chem Soc, 125, 4700-4701).
개시된 펩티드에 이펙터 분자를 교차결합시키기 위해 사용될 수 있는 단백질 교차결합제는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 활용성과 구조를 토대로 규정되며, 예를 들면 다음과 같은 것들이 있다: DSS (디숙신이미딜수베레이트), DSP (디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), DTSSP (3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)), SULFO BSOCOES (비스[2-술포숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]술폰), BSOCOES (비스[2-(숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]술폰), SULFO DST (디술포숙신이미딜타르트레이트), DST (디숙신이미딜타르트레이트), SULFO EGS (에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)), EGS (에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트)), DPDPB (1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도]부탄), BSSS (비스(술포숙신이미딜)수베레이트), SMPB (숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), SULFO SMPB (술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), MBS (3-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), SULFO MBS (3-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르), SIAB (N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트), SULFO SIAB (N-술포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트), SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트), SULFO SMCC (술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트), NHS LC SPDP (숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트), SULFO NHS LC SPDP (술포숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), NHS BROMOACETATE (N-히드록시숙신이미딜브로모아세테이트), NHS IODOACETATE (N-히드록시숙신이미딜요오도아세테이트), MPBH (4-(N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 염산염), MCCH (4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드 염산염), MBH (m-말레이미도벤조산 히드라지드 염산염), SULFO EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)술포숙신이미드), EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드), PMPI (N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트), KMUH (N-(카파=말레이미도운데칸산)히드라지드), LC SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트)), SULFO GMBS (N-(감마-말레이미도부티릴옥시)술포숙신이미드 에스테르), SMPH (숙신이미딜-6-(베타-말레이미도프로피온아미도헥사노에이트)), SULFO KMUS (N-(카파-말레이미도운데카노일옥시)술포숙신이미드 에스테르), GMBS (N-(감마-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드), DMP (디메틸피멜리미데이트 염산염), DMS (디메틸수베르이미데이트 염산염), MHBH(우드 시약)(메틸-p-히드록시벤즈이미데이트 염산염, 98%), DMA (디메틸아디피미데이트 염산염).
7. 조합 치료
본원에는 NIP와 암에 전달될 수 있는 어떠한 공지된 또는 새롭게 발견된 물질을 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어 제공된 조성물은 추가로 하나 또는 그 이상의 다음의 부류의 물질을 포함할 수 있다: 항체 (예컨대 아미노글리코시드, 케팔로스포린, 클로르암페니콜, 클린다마이신, 에리트로마이신, 플루오로퀴놀론, 마크로리드, 아졸리드, 메트로니다졸, 페니실린류, 테트라사이클린류, 트리메토프림-술파메톡사졸, 반코마이신), 스테로이드류 (예컨대 안드란 (예컨대 테스토스테론), 콜레스탄 (예컨대 콜레스테롤), 콜산 (예컨대 콜산), 코르티코스테로이드 (예컨대 덱사메타손), 에스트라엔 (예컨대 에스트라디올), 프레그난 (예컨대 프로게스테론)), 마취성 및 비-마취성 진통제 (모르핀, 코데인, 헤로인, 히드로모르폰, 레보르파놀, 메페리딘, 메타돈, 옥시돈, 프로폭시펜, 펜타닐, 메차돈, 날록손, 부프레노르핀, 부토파놀, 날부핀, 펜타조신), 항염증제 (예컨대 알클로페낙; 알클로메타손 디프로피오네이트; 알게스톤 아세토니드; 알파 아밀라제; 암시나팔; 암시나피드; 암페낙 나트륨; 아미프릴로스 염산염; 아나킨라; 아니롤락; 아니트라자펜; 아파존; 발살라지드 2나트륨; 벤다작; 베녹사프로펜; 벤지다민 염산염; 브로멜라인; 브로페라몰; 부데소니드; 카프로펜; 시클로프로펜; 신타존; 클리프로펜; 클로베타솔 프로피오네이트; 클로베타손 부티레이트; 클로피락; 클로티카손 프로피오네이트; 코르메타손 아세테이트; 코르토독손; 데카노에이트; 데플라자코르트; 델라테스트릴; 데포-테스토스테론; 데소니드; 데속시메타손; 덱사메타손 디프로피오네이트; 디클로페낙 칼륨; 디클로페낙 나트륨; 디플로라손 디아세테이트; 디플루미돈 나트륨; 디플루니살; 디플루프레드네이트; 디프탈론; 디메틸 술폭시드; 드로시노니드; 엔드리손; 엔리모마브; 에놀리캄 나트륨; 에피리졸; 에토돌락; 에토페나메이트; 헬비낙; 페나몰; 펜부펜; 펜클로페낙; 펜클로락; 펜도살; 페니팔론; 펜티아작; 플라잘론; 플루아자코르트; 플루페남산; 풀미졸; 플루니솔리드 아세테이트; 플루닉신; 플루닉신 메글루민; 플루코르틴 부틸; 플루오로메톨론 아세테이트; 플루부아존; 플루르비프로펜; 플루레토펜; 플루티카손 프로피오네이트; 푸라프로펜; 푸로부펜; 할시노니드; 할로베타솔 프로피오네이트; 할로프레돈 아세테이트; 이부페낙; 이부프로펜; 이부프로펜 알루미늄; 이부프로펜 피코놀; 일로니답; 인도메타신; 인도메타신 나트륨; 인도프로펜; 인독솔; 인트라졸; 이소플루프레돈 아세테이트; 이속세팍; 이속시캄; 케토프로펜; 로페미졸 염산염; 로목시캄; 로테프레드놀 에타보네이트; 메클로페나메이트 나트륨; 메클로페남산; 메클로리손 디부티레이트; 메페남산; 메살라민; 메세클라존; 메스테롤론; 메탄드로스테놀론; 메테놀론; 메테놀론 아세테이트; 메틸프레드니솔론 술레프타네이트; 모미플루메이트; 나부메톤; 난드롤론; 나프록센; 나프록센 나트륨; 나프록솔; 니마존; 올살라진 나트륨; 오르고테인; 오르파녹신; 옥산드롤란; 옥사프로진; 옥시펜부타존; 옥시메톨론; 파라닐린 염산염; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜부타존 나트륨 글리세레이트; 피르페니돈; 피록시캄; 피록시캄 신나메이트; 피록시캄 올라민; 피르프로페니 프레드나제이트; 프리펠론; 프로돌산; 프로부아존; 프록사졸; 프록사졸 시트레이트; 리멕솔론; 로마자리트; 살콜렉스; 살나세딘; 살살레이트; 상구이나리움 클로라이드; 세클라존; 세르메타신; 스타노졸롤; 수독시캄; 술린닥; 수프로펜; 탈메타신; 탈니플루메이트; 탈로살레이트; 테부펠론; 테니답; 테니답 나트륨; 테녹시캄; 테시캄; 테시미드; 테스토스테론; 테스토스테론 혼합물; 테트리다민; 티오피낙; 틱소코르톨 피발레이트; 톨메틴; 톨메틴 나트륨; 트리클로니드; 트리플루미데이트; 지도메타신; 조메피락 나트륨), 또는 항히스타민제 (예컨대 에탄올아민류 (예컨대 디펜히다민 카르비녹사민), 에틸렌디아민 (예컨대 트리펠레나민 피릴라민), 알킬아민 9예컨대 클로르페니라민, 덱스클로르페니라민, 브롬페니라민, 트리프롤리딘), 다른 항히스타민류, 예컨대 아스테미졸, 로라타딘, 펙소페나딘, 브로페니라민, 클레마스틴, 아세트아미노펜, 슈도에페드린, 트리프롤리딘).
많은 항암 약물이 본 발명의 방법 및 조성물과 함께 조합하기 위해 사용될 수 있다. 다음은 현재 개시된 DOC1 활성-증강 또는 발현-증강 방법과 조합하여 사용될 수 있는 항암 (항-신생물) 약물의 목록이다.
항신생물: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 염산염; 아크르퀴닌; 아도겔레신; 알데스로이킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테이미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스페를린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비스안트렌 염산염; 비스나피드 디메실레이트; 비겔레신; 블레오마이신 술페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부술판; 카크티노마이신; 칼류스테론; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 염산염; 카르겔레신; 세데핑골; 클로름부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라디리빈; 크리스나톨 메실레이트; 시클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 염산염; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 독세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 염산염; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로미틴 염산염; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 염산염; 에그불로졸; 에소루비신 염산염; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨; 에타니다졸; 에티오다이즈드 오일 I 131; 에토포시드; 에토도시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 염산염; 파자라빈; 펜레티니드; 플로수리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루오로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 나트륨; 겜시타빈; 겜시타빈 염산염; 골드 Au 198; 히드록시우레아; 이다루비신 염산염; 이포스파미드; 일모포신; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-1a; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴; 이리노테칸 염산염; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 염산염; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로속산트론 염산염; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민 염산염; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메트로프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토프로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 염산염; 미소페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가세; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 술페이트; 페르포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피록산트론 염산염; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 염산염; 푸로마이신; 푸로마이신 염산염; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사픔골; 사핀골 염산염; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 염산염; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 스트론튬 클로라이드 Sr 89; 술로페누르; 탈리소마이신; 탁산; 탁소이드; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔록산트론 염산염; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스톨락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토포테칸 염산염; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세에트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 튜불로졸 염산염; 우라실 무스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신; 빈데신 술페이트; 비네피딘 술페이트; 빈글리시네이트 술페이트; 빈로이로신 술페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 술페이트; 빈졸리딘 술페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스트틴; 조루비신 염산염.
다른 항-신생물 화합물로는 다음과 같은 것들이 있다: 20-에피-1,25 디히디록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도겔레신; 알데스로이킨; ALL-TK 길항체; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 아트르사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관신생 억제제; 길항체 D; 길항체 G; 안타렐릭스; 척추 형태 생성 방지 단백질-1; 안티안드로겐, 전립선 암종; 안티에스트로겐; 안티네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아폽토시스 유전자 조절제; 아폽토시스 조절제; 아퓨린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 탈아민효소; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스트틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 박카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항체; 벤조클로린; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루타미드; 비산트렌; 비스아지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비겔레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 술폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄포테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복시아미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골조직 유도된 억제제; 카르겔레신; 카제인 키나제 억제제 (ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린; 클로로퀴녹살린 술폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816; 크리스나톨; 크립토파이신 8; 크립토파이신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜타안트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해성 인자; 시토스타틴; 다클릭시맵; 데시타빈; 데히드로디뎀닌 B; 데스로렐린; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디뎀닌 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로탁솔, 90; 디옥사마이신; 디페닐 스피로뮤스틴; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카니신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맵; 에플로르니틴; 엘레멘; 에미테푸르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 아고니스트; 에스트로겐 길항체; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 프마스테리드; 플라보피리돌; 플레겔라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 염산염; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리니움 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 겔라티나제 억제제; 제미시타빈; 글루타티온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 히페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극성 펩티드; 인슐린-유사 성장 인자 -1 수용체 억제제; 인터페론 아고니스트; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 요오독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이리노테칸; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 야스플라키놀리드; 카할라리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 술페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류크롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친유성 이당 펩티드; 친유성 백금 화합물; 리소클리나미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로소크산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테티움 텍사피린; 리소필린; 용해성 펩티드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 잘못 매치된 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장인자-사포린; 미토크산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 단클론성 항체, 사람 융모막 성 생식선 자극 호르몬; 모노포스포릴 지질 A+ 미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기저 치료법; 겨자의 항암제; 미카페록시드 B; 미코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 질산 산화물 조절제; 니트록시드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구용 시토킨 인듀서; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파겔립틴; 페가스파르가제; 펙데신; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 염산염; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트리아민 복합체; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아솜 억제제; 단백질 A-기초 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 키나제 C 억제제, 마이크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로크리딘; 피리독실롸된 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 포합체; rag 길항체; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트란스페라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 메틸제거된 레텔리프틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; 의태 Sdi 1; 세무스틴; 세네센 유도된 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 변환 억제제; 신호 변환 조절제; 단일 사슬 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 나트륨 보로캅테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로모스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스부알라민; 줄기세포 억제제; 줄기세포 분할 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 술프모신; 초활성 혈관작용성 장내 펩티드 길항체; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메티오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로메라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 탈리도미드; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 의태 트롬보포이에틴; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 아고니스트; 티모트리난; 갑상선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 2염화물; 토포테칸; 토프센틴; 토레미펜; 분화전능성 줄기세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 티로신 키나제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 유베니멕스; 비뇨생식동(urogenital sinus)-유도된 성장 억제 인자; 유로키나제 수용체 길항체; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 치료법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘TM 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈크살틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 지노스타틴 스티말라머.
본원에 제공된 조성물은 추가로 하나 또는 그 이상의 추가의 방사선 민감성 증강물질을 포함할 수 있다. 공지된 방사선 민감성 증강물질의 실례로는 젬시타빈, 5-플루오로우라실, 펜톡시필린, 및 비노렐빈이 있다 (Zhang et al., 1998; Lawrence et al., 2001; Robinson and Shewach, 2001; Strunz et al., 2002; Collins et al., 2003; Zhang et al., 2004).
8. 단백질 변이체
특이한 단백질이 본원에서 언급될 때 그것의 변이체, 유도체 및 단편들도 고려된다. 단백질 변이체와 유도체는 당업자들에게 잘 알려져 있고, 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 아미노산 서열의 변형은 전형적으로 세 가지 부류, 즉 치환, 삽입 또는 결실 변이체 중 하나 또는 그 이상의 부류에 포함된다. 삽입은 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 삽입은 통상 아미노 또는 카르복실 말단 융합의 삽입부분보다 작은, 예를 들면 하나 내지 4개의 잔기 정도의 삽입이 될 것이다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 제거되는 것이 특징이다. 이들 변이체는 통상 단백질을 코드화하는 DNA에서 부위-특이적인 뉴클레오티드의 돌연변이생성에 의해 제조되고, 그로써 변이체를 코드화하는 DNA가 생성된 후에 재조합 세포배양물에서 DNA가 발현된다. 공지 서열을 포함하는 DNA의 예정된 부위에서 치환 돌연변이를 만드는 기법들은 잘 알려져 있으며, 예를 들면 M13 프라이머 돌연변이생성과 PCR 돌연변이생성과 같은 기법이 있다. 아미노산 치환은 전형적으로 하나의 잔기로 이루어지지만, 많은 상이한 유전자좌에서 한꺼번에 일어날 수 있고, 삽입은 보통 약 1 내지 약 10개의 아미노산 잔기의 크기로 일어날 것이다. 결실이나 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍에서, 즉 2개의 잔기가 결실되거나 2개의 잔기가 삽입된다. 치환, 결실, 삽입 또는 그것들의 어떠한 조합도 최종 구성물을 이루기 위해 조합될 수 있다. 돌연변이는 리딩 프레임 밖의 서열에서는 일어나지 않아야 하며, 바람직하게는 mRNA의 이차 구조의 변화를 원하지 않는 한, 이차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보하는 영역을 생성하지 않는 것이 좋다. 치환 변이체는 최소한 하나의 잔기가 제거된 후에 그 자리에 다른 잔기가 삽입되는 것이다. 그러한 치환은 일반적으로 아래의 표 2에 따라 일어나며, 보존성 치환으로 언급된다.
표 2: 아미노산 치환
원래의 잔기 예시적인 치환 원래의 잔기 예시적인 치환
Ala Ser Leu Ile; Val
Arg Lys Lys Arg; Gln
Asn Gln Met Leu; Ile
Asp Glu Phe Met; Leu; Tyr
Cys Ser Pro Gly
Gln Asn Ser Thr
Glu Asp Thr Ser
Gly Pro Trp Tyr
His Gln Tyr Trp; Phe
Ile Leu; Val Val Ile; Leu
예를 들어 한 아미노산 잔기를 생물학적으로나 및/또는 화학적으로 유사한 다른 것으로 대치하는 것은 당업자들에게는 보존성 치환으로서 알려져 있다. 예를 들어 보존성 치환은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로, 혹은 극성 잔기를 다른 것으로 대신하는 것이다. 그런 치환은 위의 표 2에 나타낸 조합을 포함한다. 각각의 명백하게 개시된 서열의 보존적으로 치환된 변이는 본원에 제공된 폴리펩티드에 포함된다.
전형적으로 보존성 치환은 결과적으로 생성되는 폴리펩티드의 생물학적 활성에는 거의 영향을 주지 않는다. 특정한 실례에서, 보존성 치환은 실질적으로 펩티드의 생물학적 기능에 영향을 주지 않는 펩티드의 아미노산 치환이다. 펩티드는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 2 내지 10개의 보존성 치환, 2 내지 5개의 보존성 치환, 4 내지 9개의 보존성 치환, 예컨대 2, 5 또는 10개의 보존성 치환을 포함한다.
폴리펩티드는 그 폴리펩티드를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 예를 들면 표준 과정, 예컨대 부위-특정 돌연변이생성 또는 PCR을 사용하여 조작함으로써 하나 또는 그 이상의 보존성 치환을 함유하도록 제조될 수 있다. 또는 달리 폴리펩티드는 표준 펩티드 합성 방법을 사용함으로써 하나 또는 그 이상의 보존성 치환을 함유하도록 제조될 수 있다. 단백질의 어떤 아미노산 잔기가 아미노산 치환을 견디는지를 확인하기 위해 알라닌 주사가 사용될 수 있다. 한 실례에서, 단백질의 생물학적 활성은 알라니, 혹은 다른 보존성 아미노산 (아래에 열거되는 것과 같은 것들)이 하나 또는 그 이상의 천연 아미노산 대신 치환될 때 25% 이상, 예를 들염 20% 이상, 예를 들면 10% 이상 감소되지 않는다.
보존성 치환에 대한 추가의 정보에 대해서는 다른 참고문헌들 중에서도 Ben-Bassat et al., (J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), O'Regan et al., (Gene 77:237-51, 1989), Sahin-Toth et al., (Protein Sci.: 3:240-7, 1994), Hochuli et al., (Bio'Technology 6:1321-5, 1988)과 유전학과 분자생물학에 대한 표준 교재에서 찾아볼 수 있다.
치환 또는 결실 돌연변이는 N-글리코실화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글리코실화 (Ser 또는 Thr)에 대한 삽입 부위에 대해 사용될 수 있다. 시스테인 또는 다른 불안정한 잔기의 결실도 또한 바람직할 수 있다. 잠재적인 단백질 가수분해 부위, 예컨대 Arg의 결실 또는 치환은 예를 들면 염기성 잔지를 결실시키거나 굴루타민 또는 히스티딘 잔기로 그것을 치환함으로써 이루어진다.
특정한 후-번역 유도체화는 발현된 폴리펩티드에 대한 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타민과 아스파라긴 잔기는 상응하는 글루탐산과 아스파르트산 잔기에 대해 자주 번역 후에 탈아미드화된다. 또는 달리 이들 잔기는 약한 산성 조건하에서 탈아미드화된다. 다른 후-번역 변형은 프롤린과 라이신의 가수분해, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]), N-말단 아민의 아세틸화와, 어떤 경우에는 C-말단 카르복실의 아미드화를 포함한다.
개시된 조성물에 포함될 수 있는 수많은 아미노산과 펩티드 유사체가 있다는 것이 인지되어야 한다. 예를 들어 아래의 표 3에는 아미노산보다 상이한 기능성 치환체를 가지는 많은 D 아미노산이 제시되어 있다. 자연 발생 펩티드의 반대쪽 입체이성질체뿐 아니라 펩티드 유사체의 입체이성질체가 개시된다. 이들 아미노산은 쉽게 tRNA 분자를 선택된 아미노산으로 채우고 부위 특이적인 방식으로 펩티드 사슬에 유사한 아미노산을 삽입하기 위해 예컨대 암버 코돈을 활용하는 유전자 구성물을 유전공학적으로 제조함으로써 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있다 (Thorson et al., Methods in Molec . Biol . 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); Ibba, Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13:197-216 (1995), Cahill et al, TIBS, 14(10):400-403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158-163 (1994); Ibba and Hennecke, Biotechnology, 12:678-682 (1994), 이것들은 모두 아미노산 유사체에 관련된 물질에 대한 참조로써 본원에 삽입된다).
분자들은 폴리펩티드를 닮도록 제조될 수 있지만, 천연 펩티드 연쇄를 통하여 연결되지는 않는다. 예를 들어 아미노산 또는 아미노산 유사체들에 대한 연쇄로는 CH2NH--, -CH2S--, -CH2--CH2--, -CH=CH-- (시스 및 트란스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 --CHH2SO-가 있다 (이것들과 다른 것들은 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다: Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH2NH--, CH2CH2--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H2--S); Hann J. Chem . Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH-CH--, 시스 및 트란스); Almquist et al. J. Med . Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay et al. Tetrahedron . Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--); 및 Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2-S--); 이것들은 모두 본원에 참조로 삽입된다). 펩티드 유사체는 결합 원자들 사이에 적어도 하나의 원자, 예컨대 b-알라닌, g-아미노부티르산 등을 가질 수 있다는 것이 인지되어야 한다.
아미노산 유사체와 펩티드 유사체는 자주 증강되거나 바람직한 특성, 예컨대 보다 경제적인 제조, 보다 큰 화학적 안정성, 증강된 약리학적 특성 (반감기, 흡수율, 효능, 효력 등), 변경된 특이성 (예컨대 생물학적 활성의 넓어진 스펙트럼), 감소된 항원성, 생물학적 장벽 (예컨대 소화관, 혈관, 혈액-뇌 장벽)을 가로지르는 보다 커진 능력 등을 가진다.
D-아미노산은 보다 안정한 펩티드를 생성하기 위해 사용될 수 있는데, D 아미노산이 펩티다제와 그런 것들에 의해 인지되지 않기 때문이다. 동일한 유형의 D-아미노산 (예컨대 L-라이신 대신 D-라이신)을 사용하여 일치 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 인위적으로 치환함으로써 보다 안정한 펩티드를 생성할 수 있다. 시스테인 잔기는 둘 또는 그 이상의 펩티드를 함께 부착하거나 고리화하는 데 사용될 수 있다. 이것은 억지로 펩티드를 특정한 형태로 만들려고 할 때 유익할 수 있다 (Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992) 참조).
본원에 개시된 유전자와 단백질의 어떠한 변이체, 변형, 또는 유도체를 규정하는 한 가지 방식은 특이한 공지된 서열에 대한 서열 동일성 (본원에서는 상동성으로도 언급된다)의 관점에서 변이체, 변형, 및 유도체를 정의하는 것이다. 구체적으로 본원에는 표시된 또는 공지된 서열에 대해 최소한 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 가지는 핵산 및 폴리펩티드의 변이체들이 개시된다. 당업자들은 두 개의 단백질 또는 핵산의 서열 동일성을 측정하는 방법을 쉽게 이해할 것이다. 예를 들어 서열 동일성은 두 개의 서열을, 서열 동일성이 가장 높은 수준으로 나오도록 배열한 후에 계산할 수 있다.
서열 동일성을 계산하는 또 다른 방법은 공개된 알고리즘에 의해 수행될 수있다. 비교를 위한 서열의 최적의 배열은 스미스와 워터맨의 국소 서열 동일성 알고리즘에 의해 (Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), 니들만과 분쉬의 서열 동일성 배열 알고리즘에 의해 (Needleman and Wunsch, J Mol Biol. 48:443 (1970), 피어슨과 리프만 의유사성 방법에 대한 연구에 의해 (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), 이들 알고리즘을 컴퓨터로 실행함으로써 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 정밀조사에 의해 수행될 수 있다. (상기 참조문헌들은 서열 동일성을 계산하는 방법에 대해 전체적으로 참조되는 것으로 본원에 삽입된다.)
동일한 유형의 서열 동일성은 핵산에 대해, 예를 들면 주커 등의 문헌에 개시된 알고리즘에 의해 얻어질 수 있다 (Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol . 183:281- 306, 1989, 이것들은 최소한 핵산 배열에 관련된 물질에 대하여 참조로 삽입된다).
그러므로 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 C-말단에 대해 최소한 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러므로 한 측면으로 제공된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ BD NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10에 대하여 최소한 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
9. 핵산
또한 본원에는 본원에 제공된 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산이 제공된다. 예를 들어 본원에는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ BD NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산이 개시된다. 그러므로 본원에는 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, 또는 SEQ ID NO:50에 표시된 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산이 개시된다.
개시된 핵산은 예를 들면 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 또는 뉴클레오티드 치환체로 이루어진다. 이것들과 기타 분자들의 비-제한적인 실례가 본원에서 논의된다. 예를 들어 벡터가 세포에서 발현될 때 발현된 mRNA는 전형적으로 A, C, G, 및 U로 이루어질 것이라는 것이 인지되어야 한다.
'분리된 핵산' 또는 '정제된 핵산'은 본 발명의 DNA가 유도되는 유기체의 자연-발생 게놈에서 유전자 양옆에 있는, 유전자가 없는 DNA를 의미한다. 그러므로 이 용어는 예를 들면 벡터에 통합되는, 예를 들면 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵세포 혹은 진핵세포의 게놈 DNA에 통합되는 (예컨대 유전자도입); 또는 별도의 분자로서 존재하는 (예컨대 PCR, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 혹은 화학적 또는 시험관 내 합성에 의해 제조된 cDNA 또는 게놈 혹은 cDNA 단편) 재조합 DNA를 포함한다. 또한 이 용어는 추가의 폴리펩티드 서열을 코드화하는 혼성 유전자의 부분인 재조합 DNA를 포함한다. 용어 "분리된 핵산"은 또한 RNA, 예컨대 분리된 DNA 분자에 의해 코드화된 mRNA 분자, 혹은 화학적으로 합성되거나, 최소한 약간의 세포 성분도 실질적으로 없거나 그것으로부터 분리된 mRNA 분자, 예컨대 다른 유형의 RNA 분자 또는 폴리펩티드 분자를 말한다.
그러므로 본원에는 아미노산 서열 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ BD NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10을 포함하는 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산이 제공된다. 그러므로 제공되는 핵산은 핵산 서열 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, 또는 SEQ ID NO:50을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한 본원에는 본원에 제공된 핵산의 하나 또는 그 이상을 포함하는 벡터가 제공되는데, 벡터 안에서 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 생체 내에서나 시험관 내에서 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있는 조성물과 방법은 많이 있다. 이들 방법과 조성물은 크게 두 부류로 나누어지는데, 하나는 바이러스를 기초로 한 전달 시스템이고, 다른 하나는 바이러스를 기초로 하지 않는 전달 시스템이다. 예를 들어 핵산은 많은 직접적인 전달 시스템, 예컨대 일렉트로포레이션, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 플라스미드, 바이러스 벡터, 바이러스 핵산, 파지 핵산, 파지, 코스미드, 또는 세포 또는 담체, 예컨대 양이온 리포솜을 이용한 유전자 물질의 전달을 통해 전달될 수 있다. 형질전환, 이를테면 바이러스 벡터를 포함한 적절한 형질전환 수단, 화학적 형질전환 물질, 또는 일렉트로포레이션과 직접적인 DNA의 확산과 같은 물리적-화학적 방법은 문헌에 설명되어 있다 (Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468, (1990); and Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)). 그런 방법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있고, 본원에서 설명되는 조성물 및 방법들과 함께 사용하기 위해 쉽게 적용될 수 있다. 어떤 경우에 방법은 큰 DNA 분자를 사용하여 특이하게 기능을 하기 위해 변형될 것이다. 나아가 이들 방법은 담체의 표적화 특성을 사용함으로써 특정 질병과 세포 집단을 겨냥하는 데 사용될 수 있다.
10. 벡터
본원에는 NBS1의 카르복시-말단 아미노산 서열을 코드화하는 핵산, 또는 그것의 보존성 변이체를 포함하는 벡터가 제공되는데, 그 벡터 안에서 폴리펩티드는 전길이의 NBS1을 포함하지는 않는다. 또한 본원에는 ATM의 NBS1-결합 서열을 코드화하는 핵산, 또는 그것의 보존성 변이체를 포함하는 벡터가 제공된다. 예를 들어 폴리펩티드는 NBS1에 결합하는 ATM의 열 반복 서열, 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 바람직한 벡터는 저산소증 종양 조직을 표적으로 한다. 그러므로 벡터는 저산소증-표적 아데노바이러스 벡터일 수 있다.
전달 벡터는 유전자를 세포 (예컨대 플라스미드) 안으로 전달하기 위하여, 또는 유전자를 전달하기 위한 일반적인 전략의 일부로서, 예컨대 재조합 레트로바이러스 또는 아데노바이러스의 일부로서 사용되는 어떠한 뉴클레오티드 구성물일 수 있다 (Ram et al., Cancer Res. 53:83-88, (1993)).
본원에서 사용되는 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 개시된 핵산, 예컨대 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, 또는 SEQ ID NO:50을 분해됨이 없이 세포 안에 수송하는 제제이고, 그것이 전달되는 세포에서 유전자의 발현을 촉진하는 프로모터를 포함한다. 어떤 구체예에서 프로모터는 바이러스 혹은 레트로바이러스로부터 유도된다. 바이러스 벡터는 예를 들면 아데노바이러스, 아데노-결합 바이러스, 포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오 바이러스, AIDS 바이러스, 신경 영양성 바이러스, 신드비스 및 다른 RNA 바이러스와, HIV 골격을 가지고 있는 상기 바이러스들이다. 또한 본원에는 위의 바이러스들을 벡터로서 사용하기에 적당하게 만드는 상기 바이러스들의 특성을 공유하는 모든 바이러스 패밀리가 개시된다. 레트로바이러스는 쥐과의 말로니 백혈병 바이러스, MMLV, 및 벡터로서 MMLV의 바람직한 특성을 발현하는 레트로바이러스를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 다른 바이러스 벡터보다 더 큰 유전자 하중, 즉 도입유전자 또는 마커 유전자를 운반할 수 있는데, 이런 이유로 통상적으로 사용되는 벡터이다. 그러나 그것은 증식하지 않는 세포에서는 유용하지 않다. 아데노바이러스 벡터는 상대적으로 안정하며, 사용하기가 용이하고, 고역가를 가지고 있으며, 에어로솔 제형으로 전달될 수 있고, 분할하지 않는 세포를 형질전환할 수 있다. 수두바이러스 벡터는 크고 유전자 삽입을 위한 부위가 여러 개이며, 열에 안정하고 실온에서 보관할 수 있다. 또한 본원에는 바이러스 항원에 의해 유도된, 숙주 유기체의 면역 반응을 억제하기 위해 공학적으로 제조된 바이러스 벡터가 개시된다. 이런 유형의 벡터는 인터류킨 8 또는 10에 대한 코딩 영역을 운반할 수 있다.
바이러스 벡터는 세포 안에 유전자를 도입하기 위하여 화학적 또는 물리적 방법보다 더 큰 처리능력 (유전자 도입능력)을 가질 수 있다. 전형적으로 바이러스 벡터는 비구조적 초기 유전자, 구조적 후기 유전자, RNA 중합표소 III 전사물, 복제 및 단백질막으로 싸기 위해 필요한 역전된 말단 반복부, 및 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 조절하기 위한 프로모터를 함유한다. 벡터로서 공학제조될 때, 바이러스는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 제거된 초기 유전자를 가지며, 유전자 또는 유전자/프로모터 카세트는 제거된 바이러스 DNA 대신에 바이러스 게놈 안에 삽입된다. 이런 유형의 구성물은 약 8kb의 외래 유전자 물질을 운반할 수 있다. 제거된 초기 유전자의 필요한 기능들은 전형적으로 초기 유전자의 유전자 생성물을 트란스로 발현하기 위하여 공학적으로 제조된 셀라인에 의해 공급된다.
레트로바이러스는 모든 유형, 하위패밀리, 부류, 친화성을 포함하여 레트로비리다에의 바이러스 패밀리에 속하는 동물 바이러스이다. 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 문헌에 설명되어 있다 (Verma, I.M. , Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology-1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)). 유전자 치료법을 위해 레트로바이러스 벡터를 사용하는 방법의 실례는 미국 특허 제 4,868,116호 및 4,980,286호; PCT 출원 WO 90/02806호 및 WO 89/07136호; 및 Mulligan, Science 260:926-932 (1993)에 설명되어 있다.
레트로바이러스는 본질적으로 핵산 내용물을 그 안에 포장하는 패키지이다. 핵산 내용물은 그것과 함께 패키징 신호를 운반하는데, 그것은 복제된 딸 분자가 패키지코트 내에 효과적으로 패키지될 것을 보장한다. 패키지 신호 외에, 복제, 및 복제된 바이러스의 패키징을 위해 시스로(in cis) 요구되는 분자가 많이 있다. 전형적으로 레트로바이러스 게놈은 단백질 코트(protein coat)를 만드는 데 관련된 gag, pol, 및 env 유전자를 함유한다. 전형적으로 표적 세포에 전달될 외래 DNA에 의해 대체되는 것은 gag, pol, 및 env 유전자이다. 레트로바이러스 벡터는 전형적으로 패키지 코트 안에 통합하기 위한 패키징 신호, gag 전사 유닛의 출발을 신호하는 서열, 역전사에 필요한 요소들, 이를테면 역전사의 tRNA 프라이머를 결합시키기 위한 프라이머 결합 부위, DNA가 합성되는 중에 RNA 가닥의 스위치를 안내하는 말단 반복 서열, DNA 합성의 두 번째 가닥의 합성을 위한 프라이밍 부위로서 작용하는 퓨린 풍부 서열 5' 내지 3' LTR, 및 숙주 게놈 안에 삽입하기 위해 레트로바이러스의 DNA 상태의 삽입을 가능하게 하는 LTR의 단부 가까이에 있는 특이한 서열을 함유한다. gag, pol, 및 env 유전자의 제거는 약 8kb의 외래 서열이 바이러스 게놈 안에 삽입되고, 역전사되며, 복제시에 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지 되는 것을 가능하게 한다. 이런 양의 핵산은 각 전사물의 크기에 따라 하나 내지 여러 개의 유전자를 전달하기에 충분하다.
대부분의 레트로바이러스 벡터의 복제 장치 및 패키징 단백질은 제거되었기 때문에 (gag, pol, 및 env), 벡터는 전형적으로 그것들을 패키징 셀라인 안에 놓음으로써 생성된다. 패키징 셀라인은 복제 및 패키징 장치를 함유하는 레트로바이러스로 형질전환되었지만, 어떠한 패키징 신호가 결핍되어 있는 셀라인이다. 선택된 DNA를 은닉하는 벡터가 이들 셀라인에 형질전환될 때, 관심의 유전자를 함유하는 벡터는 헬퍼 세포에 의해 시스로 제공된 장치에 의해 복제되고 새로운 레트로바이러스 입자로 패키지된다. 장치에 대한 게놈은 그것이 필요한 신호를 갖고 있지 않기 때문에 패키지되지 않는다.
복제-결핍성 아데노바이러스의 구성은 문헌에 설명되어 있다 (Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987); Massie et al., MoI. Cell. Biol. 6:2872- 2883 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986); Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987); Zhang 'Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis' BioTechniques 15:868- 872 (1993)). 이들 바이러스를 벡터로서 사용할 때의 유익은 그것들이 다른 세포 유형으로 확산될 수 있는 정도로만 제한된다는 것이다. 왜냐하면 그것들은 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있지만, 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수는 없기 때문이다. 재조합 아데노바이러스는 직접 기도 내피세포, 간세포, 혈관 상피세포, CNS 유조직 및 많은 다른 조직 부위로 생체 내에서 전달된 후에 고효율의 유전자 전달을 이루는 것으로 밝혀졌다 (Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993); La Salle, Science 259:988-990 (1993); Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994); Zabner, Cell 75:207-216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993); and Ragot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)). 재조합 아데노바이러스는 특이한 세포표면 수용체에 결합함으로써 유전자 변환을 이루며, 그런 후 바이러스는 야생형 또는 복제-결핍성 아데노바이러스와 동일한 방식으로 수용체-중재된 세포 이물 흡수에 의해 내재화된다 (Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442- 449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51 :650-655 (1984); Seth, et al., MoI. Cell. Biol. 4:1528- 1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)).
바이러스 벡터는 E1 유전자가 제거되어 있는 아데노바이러스를 토대로 한 것이며, 이들 비리온은 사람 293 셀라인과 같은 셀라인에서 생성된다. 한 측면으로 E1과 E3 유전자는 둘 다 아데노바이러스 게놈으로부터 제거된다.
다른 유형의 바이러스 벡터는 아데노-결합 바이러스 (AAV)를 토대로 한다. 이 결핍성 파르보바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있지만 사람에게는 병을 일으키지 않는다. AAV, 유형의 벡터는 약 4 내지 5kb를 수송할 수 있고, 야생형 AAV는 염색체 19 안으로 안정하게 삽입하는 것으로 알려진다. 실례로서, 이런 벡터는 Avigen (San Francisco, CA)에 의해 제조된 P4.1 C 벡터일 수 있고, 그것은 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자, HSV-tk, 및/또는 마커 유전자, 예컨대 그린 형광 단백질, GFP를 코드화하는 유전자를 함유할 수 있다.
AAV 바이러스의 다른 유형으로, AAV는 프로모터를 함유하는 최소한 하나의 카세트의 양 옆에 한 쌍의 역전된 말단 반복부 (ITR)을 함유하고 있는데, 그것은 이종성 유전자에 작동가능하게 연결된 세포-특이적 발현을 지시한다. 이런 맥락에서 이종성은 AAV 또는 B19 파르보바이러스에 고유하지 않은 어떠한 뉴클레오티드 서열 또는 유전자를 말한다.
전형적으로 AAV 및 B19 코딩 영역은 결실되었고, 그 결과 안전하고 비세포독성인 벡터가 생성된다. AAV ITR 또는 그것의 변형은 감염성 및 부위-특이적 통합을 부여하지만 세포독성은 나타내지 않으며, 프로모터는 세포-특이적 발현을 지시한다. 미국 특허 제 6,261,834호는 본원에 AAV 벡터에 관련된 물질에 대한 참조로 삽입된다.
그렇게 개시된 벡터는 실질적인 독성없이 포유류 염색체 안에 통합될 수 있는 DNA 분자를 제공한다.
바이러스 및 레트로바이러스에 삽입된 유전자는 보통 원하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 것을 보조하기 위해 프로모터, 및/또는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 일반적으로 전사 출발 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위치에 있을 때 기능을 하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소 및 전사 인자들의 기본적인 상호작용에 필요한 코어 요소를 함유하며, 상류 쪽 요소들과 반응 요소들을 함유할 수 있다.
커다란 사람 포진 바이러스를 사용하여 수행한 분자유전학 실험들은 커다란 이종성 DNA 단편이 포진 바이러스로 감염되기 쉬운 세포에서 클론되고, 증식되며 수립될 수 있는 수단을 제공하였다 (Sun et al., Nature genetics 8: 33-41, 1994; Cotter and Robertson, Curr Opin MoI Ther 5: 633-644, 1999). 이들 커다란 DNA 바이러스들 (단순 포진 바이러스 (HSV) 및 엡스타인-바르 바이러스 (EBV))은 특이한 세포에 대하여 150kb보다 큰 사람 이종성 DNA의 단편들을 전달할 수 있는 잠재력이 있다. EBV 재조합체는 에피솜성 DNA와 같은 감염된 B-세포에서 DNA의 큰 조각을 유지할 수 있다. 개별적인 클론들은 유전적으로 안정해보이는 330kb 까지의 사람 유전자 삽입물을 운반하였다. 이들 에피솜을 유지하기 위해서는 EBV로 감염되는 동안 구조적으로 발현되는 특이한 EBV 핵 단백질인 EBNA1이 필요하다. 추가로, 이들 벡터는 형질전환을 위해 사용될 수 있으며, 그때 다량의 단백질이 일시적으로 시험관 내에서 생성될 수 있다. 포진바이러스 암플리콘 시스템은 또한 220kb보다 큰 조각들을 패키지하고 에피솜으로서 DNA를 안정하게 유지할 수 있는 세포를 감염시키기 위하여 사용되기도 한다.
다른 유용한 시스템으로는 예를 들면 복제 및 숙주-제한된 비-복제 백시니아 바이러스 벡터가 있다.
개시된 조성물은 다양한 방식으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 예를 들면 조성물은 일렉트로포레이션을 통해서, 또는 리포펙션을 통해서, 또는 인산칼슘 침전을 통해서 전달될 수 있다. 선택된 전달 메커니즘은 부분적으로는 표적이 된 세포의 유형에 따라, 그리고 전달이 예를 들면 생체 내에서 혹은 시험관 내에서 일어나는 지에 따라 좌우될 것이다.
그러므로 조성물은 개시된 폴리펩티드 외에, 핵산 또는 벡터, 예를 들면 리포솜, 예컨대 양이온 리포솜 (예를 들면 DOTMA, DOPE, DC-콜레스테롤) 또는 음이온 리포솜과 같은 지질을 포함할 수 있다. 리포솜은 추가로, 필요에 따라, 특정 세포를 표적화하는 것을 촉진하기 위한 단백질을 포함할 수 있다. 화합물과 양이온 리포솜을 포함하는 조성물의 투여는 표적 기관에 구심성인 혈액에 투여되거나 기도의 세포를 표적으로 하기 위해 기도 안으로 흡입될 수 있다. 리포솜에 관해서는 참조문헌을 참조한다 (Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. 1:95-100 (1989); Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417 (1987); 미국 특특허 제 4,897,355호). 나아가, 화합물은 특이한 세포 유형, 예컨대 마크로파지에 대해 표적화될 수 있는 미소캡슐의 화합물로서 투여될 수 있고, 또는 미소캡슐로부터의 화합물의 확산 또는 화합물의 전달이 특이한 속도 또는 단위용량에 대해 고안된다.
외인성 DNA가 피험자의 세포 안에 투여되거나 흡수되는 것을 포함하는 상술된 방법에서 (즉 유전자 변환 또는 형질전환에서), 세포에 대한 조성물의 전달은 다양한 메커니즘을 통해 이루어질 수 있다. 한 실례로서 전달은 리포솜을 경유하여, 상업적으로 활용할 수 있는 리포솜 제제, 예컨대 LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany) 및 TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)을 사용하여, 그리고 당해 기술분야의 표준 과정에 따라 개발된 다른 리포솜을 통해 이루어질 수 있다. 또한 개시된 핵산 또는 벡터는 생체 내에서, Genetronics, Inc. (San Diego, CA)로부터 활용할 수 있는 일렉트로포레이션에 의해, 그리고 SONOPORATION 기계 (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)에 의해 전달될 수 있다.
숙주 세포 게놈 안에 통합될 세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 통합 서열을 함유한다. 이들 서열은 때로 바이러스 관련된 서열로, 특히 바이러스 기초 시스템이 사용될 때 그러하다. 이들 바이러스 통합 시스템은 또한 비-핵산 기초 전달 시스템, 예컨대 리포솜을 사용하여 전달되는 핵산 안에 통합되고, 그로써 전달 시스템에 함유된 핵산은 숙주 게놈 안에 통합될 수 있다.
숙주 게놈 안에 통합하기 위한 다른 일반적인 기법들로는 예를 들면 숙주 게놈과의 동종 재조합을 촉진하기 위해 계획된 시스템을 포함한다. 그런 시스템은 전형적으로 벡터 핵산과 표적 핵산 사이의 재조합이 일어나서 숙주 게놈 안으로 전달된 핵산이 통합될 수 있도록 숙주 게놈 내의 표적 서열과 충분한 상동성을 가지는, 발현될 핵산의 양옆의 서열에 의존한다. 동종 재조합을 촉진하는데 필요한 그런 시스템과 방법들은 당업자들에게 알려져 있다.
조성물은 피험자의 세포에 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 메커니즘 (예컨대 순수한 DNA의 흡수, 리포솜 융합, 유전자 총을 경유한 DNA의 근육내 주사, 세포 이물흡수작용 등)에 의해 전달될 수 있다.
만약 생체 외 방법이 사용된다면 세포나 조직은 당업자들에게 잘 알려져 있는 표준 프로토콜에 따라 제거되고 신체 외부에서 유지될 수 있다. 조성물은 어떠한 유전자 전달 메커니즘, 예컨대 인산칼슘 중재된 유전자 전달, 일렉트로포레이션, 마이크로주사 또는 단백질 함유 리포솜을 통해 세포에 도입될 수 있다. 그런 다음 유전자 도입된 세포는 세포 또는 조직 유형에 대한 표준 방법대로 주입되거나 (예컨대 약제학적으로 허용되는 담체에 넣어) 또는 피험자에게 다시 동위적으로(homotopically) 이식된다. 피험자에게로 다양한 세포를 이식 또는 주입하는 표준 방법은 알려져 있다.
세포에 전달되는 핵산은 전형적으로 발현 조절 시스템을 함유한다. 예를 들어 바이러스와 레트로바이러스 시스템에 삽입된 유전자들은 통상 원하는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 것을 보조하기 위한 프로모터, 및/또는 인핸서를 함유한다. 프로모터는 보통 전사 출발 부위와 관련하여 상대적으로 고정된 위체에 있을 때 기능을 하는 DNA의 서열 또는 서열들이다. 프로모터는 RNA 중합효소와 전사 인자들의 기본적인 상호작용에 필요한 핵심 요소들을 함유하며, 상류 요소와 반응 요소들을 함유할 수 있다.
포유류 숙주 세포의 벡터로부터 전사를 조절하는 프로모터는 다양한 공급원, 예를 들면 바이러스, 예컨대 폴리오마 바이러스, 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 사이토메갈로바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종성 포유류 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터로부터 얻어질 수 있다. SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 편리하게도 또한 SV40 바이러스 복제 기원을 함유하고 있는 SV40 제한 단편으로서 얻어진다 (Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)). 사람 사이토메갈로바이러스의 즉시 초기 프로모터는 편리하게도 HindIII E 제한 단편으로서 얻어진다 (Greenway, P.J. et al., Gene 18:355-360 (1982)). 물론 숙주 세포 또는 관련된 종으로부터 얻어지는 프로모터 또한 본원에서는 유용하다.
인핸서는 일반적으로 전사 출발 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 기능을 하는 DNA의 서열을 말하고, 전사 유닛에 대해 5'쪽 (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)) 또는 3'쪽 (Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983))에 있을 수 있다. 나아가 인핸서는 코딩 서열 자체 내에 (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984) 뿐 아니라 인트론 내에도 있을 수 있다 (Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)). 그것들은 통상 10 내지 300bp 길이이며, 시스로 기능한다. 인핸서는 가까운 프로모터로부터 전사를 증가시키기 위하여 기능을 한다. 인핸서는 또한 때로는 전사 조절을 중재하는 반응 요소들을 함유한다. 프로모터는 또한 전사 조절을 중재하는 반응 요소들을 함유한다. 인핸서는 때로 유전자의 발현 조절을 결정한다. 많은 인핸서 서열이 포유류 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있는 한편, 전형적으로 누구든지 일반적인 발현을 위해 진핵세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그것의 실례는 복제 기원의 후기에 작용하는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기에 사용되는 폴리오마 바이러스 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.
프로모터 및/또는 인핸서는 그것들의 기능을 야기하는 특이한 화학적 사건 또는 빛에 의해 특이하게 활성화된다. 시스템은 테트라사이클린 및 덱사메타손과 같은 시약들에 의해 조절될 수 있다. 또한 방사선, 예컨대 감마 방사선, 또는 알킬화 화학요법 약물에 노출함으로써 바이러스 벡터 유전자 발현을 증강시키는 방법들이 있다.
특정 구체예에서, 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 전사될 전사 유닛의 영역의 발현을 최대화하기 위하여 구조적 프로모터 및/또는 인핸서로서 작용할 수 있다. 어떤 구성물에서 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 그것이 특별한 시간에 세포의 특별한 유형에서만 발현된다 할지라도, 모든 진핵세포 유형에서 활성이다. 이런 유형의 프로모터는 CMV 프로모터 (650 염기)이다. 다른 그런 프로모터는 SV49 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (전 길이의 프로모터), 및 레트로바이러스 벡터 LTR이다.
모든 특이한 조절 요소들은 클론될 수 있고, 흑색종 세포와 같은 특이한 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구성하기 위하여 사용될 수 있는 것으로 알려졌다. 신경교원 섬유 산성 단백질 (GFAP) 프로모터는 신경교 기원의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현하기 위해 사용되어 왔다.
진핵 숙주세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 사람 또는 핵화된 세포)에서 사용된 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 미칠 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열들을 함유할 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 코드화하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화된 절편으로서 전사된다. 3' 미번역 영역은 또한 전사 종결 부위를 포함한다. 전사 유닛은 또한 폴리아데닐화 영역을 함유할 수 있다. 이 영역의 한 가지 유익은 그것이 전사된 유닛이 mRNA와 같이 프로세스되고 수송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 발현 구성물에서 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용에 대해서는 잘 정립되어 있다. 동종 폴리아데닐화 신호는 유전자 도입 구성물에서 사용될 수 있다. 어떤 전사 유닛에서는, 폴리아데닐화 영역은 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유도되고, 약 400 염기로 구성된다. 전사된 유닛은 다른 표준 서열을 단독으로 또는 구성물로부터의 발현, 또는 구성물의 안정성을 개선하는 상기의 서열과 조합하여 함유한다.
바이러스 벡터는 마커 생성물을 코드화하는 핵산 서열을 포함한다. 이 마커 생성물은 유전자가 세포에 전달되었는지, 또 일단 전달되면 발현되는 지를 측정하기 위해 사용된다. 마커 유전자의 실례를 들면 β-갈락토시다제를 코드화하는 대장균 lacZ 유전자와 그린 형광 단백질이 있다.
어떤 구체예에서는, 마커는 선택가능한 마커일 수 있다. 포유류 세포에 대한 적당한 선택가능한 마커의 실례는 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 히드로마이신, 및 퓨로마이신이다. 그런 선택가능한 마커가 포유류 숙주세포에 성공적으로 전달될 때 형질전환된 포유류 숙주세포는 선택적인 압력하에 놓인 것처럼 생존할 수 있다. 선택적인 방법이 사용되는 범주는 크게 두 가지로 구별된다. 첫 번째 범주는 세포의 대사과정과 보충된 배지와는 무관하게 성장하는 능력이 결핍되어 있는 돌연변이 셀라인을 사용하는 것을 토대로 한다. 이것에 대해서는 두 가지의 실례가 있다. 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) DHFR- 세포와 마우스 LTK-세포가 그것이다. 이들 세포는 티미딘 또는 히포크산틴과 같은 영양소가 첨가되지 않아도 성장할 수 있는 능력이 결핍되어 있다. 이들 세포는 완전한 뉴클레오티드 합성 경로에 필요한 특정 유전자가 없기 때문에, 그것들은 빠져있는 뉴클레오티드가 보충된 배지에 제공되지 않는 한 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 것의 대안은 무상 DHFR 또는 TK 유전자를 각각의 유전자가 부족한 세포 안에 도입하는 것이고, 그로써 그것들의 성장 필요조건을 변경하는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 개별적인 세포들은 보충되지 않은 배지에서는 생존할 수 없을 것이다.
두 번째 범주는 어떠한 세포 유형에서든지 사용된 선택 도식을 말하는 우세한 선택이고, 그것은 돌연변이 셀라인의 사용을 필요로 하지 않는다. 이들 도식은 전형적으로 숙주 세포의 성장을 억제하기 위한 약물을 사용한다. 신규한 유전자를 가지고 있는 그런 세포들은 약물 내성을 전달하는 단백질을 발현할 것이고, 선택에도 생존할 것이다. 그런 우세한 선택의 실례는 네오마이신 (Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982)), 미코페놀산 (Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)) 또는 히그로마이신 (Sugden, B. et al., MoI. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985))을 사용한다. 위의 세 가지 실례는 각각 적절한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신), xgpt(미코페놀산) 또는 히그로마이신에 대한 내성을 전달하기 위하여 진핵세포의 조절하에 박테리아 유전자를 사용한다. 다른 것으로는 네오마이신 유사체 G418과 퓨라마이신이 있다.
11. 아데노바이러스-중재된 종양 유전자 치료법
종양 바이러스요법은 암치료에 대한 새로운 지평을 나타낸다. 그것의 매력적인 특징으로는 종양-선택적인 표적화와, 현재의 치료법에 대해 교차 내성이 없다는 것이다. 하위그룹 C의 사람 아데노바이러스 (Ad)(예컨대 Ad5)는 유아에게서 징후가 없거나 경미한 호흡기 감염을 유발하는 병원균이고 평생 면역을 유발한다. 그 결과로서, 종양 유전자 치료법에 대한 아데노바이러스 벡터는 매력적이고 고려할만한 관심을 가진다. 두 가지 유형의 Ad 벡터 (복제-결핍성 및 복제-경합성)가 항암 요법에 대해 개발되었다 (Adam and Nasz, 2001: Glasgow et al., 2006). 대다수의 비-복제성 항종양 아데노바이러스 벡터가 광범위한 종양-표적화 메커니즘을 가지도록 고안되었는데, 예를 들면 면역조절 유전자 요법, 종양 억제 유전자 요법, 및 화학유전자 요법이 그것들이다. 복제-경합성 벡터는 종양 세포에서 선택적으로 복제하도록 고안되었고, 따라서 종양 용해를 유발한다. 비록 항종양 효과의 증거가 두 가지 유형의 벡터를 사용한 임상적인 시도들로부터 보고되었지만, 실질적인 임상적 유익을 얻기 위해서는 효능이 개선되어야 한다. 유전자 요법을 종래의 방사선 요법과 통합하기 위한 접근법들은 빈약하게 연구되고 개발되어 오긴 했지만, 표적화된 치료법에 대한 전망을 제공한다. 상이한 종양 표적화 메커니즘을 동시에 활용하고 있는 그런 조합은 최대의 항종양 효과를 생성하기 위하여 상조적인 항종양 효과를 초래할 수 있다. 그러므로 본원에는 저산소증 종양 조직에서 wtNIP를 발현하는 저산소증-유발된 아데노바이러스 벡터가 개시된다. 이 유전자-치료용 벡터는 다음의 두가지 특징, 즉 1) 종양-선택성 및 저산소증-특이적 표적화, 및 2) 종양 방사선 민감화를 가진다.
12. 세포
또한 본원에는 본원에 제공된 벡터를 하나 또는 그 이상 포함하는 세포가 제공된다. 본원에서 사용되는 '세포', '셀라인', 및 '세포 배양물'은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 그런 표시는 모두 자손도 포함한다. 개시된 세포는 본원에 제공된 벡터를 클론하거나 증식하기 위해 사용되는 모든 세포일 수 있다. 그러므로 세포는 어떠한 일차 세포 배양물 또는 수립된 셀라인으로부터의 세포일 수 있다. 방법은 모든 세포, 이를테면 원핵 또는 진핵세포, 예컨대 박테리아, 식물, 동물 등의 세포에 적용될 수 있다. 세포 유형은 벡터의 선택과 원하는 용도를 토대로 당업자에 의해 선택될 수 있다. 세포는 분리되거나 유기체에 있을 수 있다.
본원에는 본원에 개시된 핵산 분자 또는 벡터 중 어느 것을 가지는 동물 내의 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 동물이 개시된다. 또 본원에 개시된 핵산 분자 또는 벡터 중 어느 것을 가지는 동물 내에 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 동물이 개시되는데, 동물은 포유류이다. 또한 본원에는 본원에 개시된 핵산 분자 또는 벡터 중 어느 것을 동물 내의 세포를 형질전환시키는 과정에 의해 제조된 동물이 개시되는데, 그때 포유류는 마우스, 토끼, 쥐, 소, 양, 돼지 eh는 영장류이다.
13. 약제학적으로 허용되는 담체
개시된 조성물은 억제제의 투여, 전달 또는 다른 측면과 그것들의 사용을 보조하기 위하여 담체와 기타 다른 조성물과 또는 그것들에 조합되거나 포합되거나 결합될 수 있다. 편리를 위해서 그러한 조성물은 본원에서 담체로서 언급될 것이다. 담체는 예를 들면 작은 분자, 약제학적 약물, 지방산, 검출가능한 마커, 포함용 태그, 나노입자 또는 효소일 수 있다.
개시된 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 조합하여 치료적으로 사용될 수 있다. '약제학적으로 허용되는'이란 생물학적으로나 다르게는 바람직하지 않은 물질을 의미하는데, 즉 물질은 어떠한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 그것이 함유된 약제학적 조성물의 어떠한 다른 성분들과 해로운 방식으로 상호작용하는 일 없이 피험자에게 조성물과 함께 투여될 수 있다. 담체는 당업자에게 잘 알려져 있는 것과 같이, 자연적으로 활성 성분의 어떠한 분해를 최소화하고 피험자에게서 어떠한 해로운 부작용을 최소화하기 위하여 선택될 수 있다.
그러므로 본원에는 본원에 제공된 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드, 핵산, 또는 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체에 포함하는 조성물이 제공된다. 그로써 본원에는 본원에 제공된 둘 또는 그 이상의 NBS1 폴리펩티드의 조합물을 약제학적으로 허용되는 담체에 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어 본원에는 약제학적으로 허용되는 담체에 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ED NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ED NO:9, SEQ ED NO:10, SEQ ED NO:43, SEQ ED NO:44, SEQ ED NO:45, SEQ ED NO:46, SEQ ED NO:47, SEQ ED NO:48, SEQ ED NO:49, 또는 SEQ ED NO:50을 포함하는 조성물이 제공된다.
적당한 담체 및 그것들의 제형은 문헌에 설명되어 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995). 전형적으로 적절한 양의 약제학적으로 헝요되는 염이 제형을 등장성으로 만들게 하기 위해 제형에 사용된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 실례로는, 그것에 한정되는 것은 아니지만, 식염수, 링거액 및 덱스트로오스 용액이 있다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이며, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 또한 담체는 항체를 함유하고 있는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 방출 지속성 제제를 포함하는데, 이때 매트릭스는 어떤 형태를 갖춘 물품의 형태, 예를 들면 필름, 리포솜 또는 미소입자이다. 당업자들에게는 특정 담체가 예를 들면 투여 경로와 투여될 조성물의 농도에 따라 더 바람직할 수 있다는 것이 드러날 것이다.
약제학적 담체는 당업자들에게 공지되어 있다. 그것들은 대부분 전형적으로 사람에 투여되는 약물용인 표준 담체, 이를테면 멸균수, 식염수, 및 생리적 pH의 완충 용액일 것이다. 조성물은 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 다른 화합물들은 당업자에게 사용된 표준 과정에 따라 투여될 수 있다.
약제학적 조성물은 선택된 분자 외에 담체, 농축제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면 활성제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 항균제, 항염증제, 마취제 등과 같은 하나 또는 그 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비-수성 용매의 실례로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트가 있다. 수성 담체는 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액, 이를테면 식염수와 완충된 배지를 포함한다. 비경구용 비히클은 염화나트륨 용액, 링거용 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화 나트륨, 락테이트화된 링거액, 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클로는 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거용 덱스트로오스를 토대로 하는 것), 등이 있다. 보존제 및 다른 첨가제들, 예를 들면 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 비활성 기체 등이 존재할 수 있다.
국소 투여용 제형은 연고, 로션, 크림, 겔, 점적액(drop), 좌제, 분무제, 액체 및 분말을 포함한다. 종래의 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 기제, 농축제 등도 필요하거나 바람직할 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 1회용 봉지, 또는 정제를 포함한다. 농축제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제도 바람직하다.
어떤 조성물은 잠재적으로 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산, 및 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산과의 작용에 의해, 또는 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨과 같은 무기 염기, 및 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴 아민과 치환된 에탄올아민과 같은 유기 염기와의 반응에 의해 형성된 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기-부가염으로서 투여될 수 있다.
물질은 용액, 현탁액 (예를 들면 미소입자, 리포솜, 또는 셀에 통합된)의 형태일 수 있다. 이것들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드를 경유하여 특별한 세포 유형을 표적으로 할 수 있다. 다음의 참고문헌들은 종양 조직에 특이한 단백질을 표적화하기 위해 상기 기술을 사용하는 것에 대한 실례이다: Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 및 Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991). '스텔스(stealth)' 및 다른 항체 포합된 리포솜 (콜로니성 암종에 대한 지질 중재된 약물 표적화를 포함하여)과 같은 비히클, 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 중재된 표적화, 림프구 지시된 종양 표적화, 및 생체 내에서의 쥐 교질세포의 매우 특이한 치료용 레트로바이러스 표적화. 다음의 참고문헌은 종양 조직에 대한 특이한 단백질을 표적화하기 위하여 이 기술을 사용하는 것에 대한 실례이다: Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); 및 Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992). 일반적으로, 수용체는 세포 이물흡수작용의 경로에, 그것이 구조적이거나 리간드 유도된 것이거나 포함된다. 이들 수용체는 클라트린(clathrin)-코팅된 씨 모양으로 밀집하여 클라트린-코팅된 소포체를 경유하여 세포로 들어가, 수용체가 분류되는 산성화된 엔도솜을 통과한 후, 세포표면으로 재순환하여 세포내에서 보관되거나, 또는 리소솜에서 분해된다. 내재화 경로는 다양한 기능, 예를 들면 영양분 흡수, 활성화된 단백질의 제거, 거대분자의 제거, 바이러스와 독소의 기회주의적인 유입, 리간드의 결합 및 분해, 및 수용체-수준의 조절을 수행한다. 많은 수용체가 세포 유형, 수용체 농도, 리간드의 유형, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라 하나 이상의 세포내 경로를 따른다. 수용체-중재된 세포 이물흡수 작용의 분자 및 세포 메커니즘은 문헌에서 개관되었다 (Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
담체 분자는 개시된 억제제에 공유적으로 연결될 수 있다. 담체 분자는 개시된 펩티드의 아미노 말단부에 연결될 수 있다. 담체 분자는 개시된 펩티드의 카르복시 말단부에 연결될 수 있다. 담체 분자는 개시된 펩티드 내에서 아미노산에 연결될 수 있다. 본원에 제공된 조성물은 나아가 담체 분자와 개시된 억제제를 연결시키는 링커를 포함할 수 있다. 개시된 억제제는 또한 미소입자, 나노쉘의 나노입자를 억제제로 코팅하는 데 사용될 수 있는 소 혈청 알부민 (BSA)(Tkachenko et al., (2003) J Am Chem Soc, 125, 4700-4701)과 같은 코팅 분자에 포합될 수 있다.
단백질 교차결합체가 억제제, 예를 들면 본원에 개시된 펩티드에 담체 분자를 교차결합시키기 위해 사용될 수 있으며, 그런 것들은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 활용성과 구조를 토대로 정의된다. 예로는 다음과 같은 것들이 있다: DSS (디숙신이미딜수베레이트), DSP (디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)), DTSSP (3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트)), SULFO BSOCOES (비스[2-(술포숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]술폰), BSOCOES (Bis[2-(숙신이미독시카르보닐옥시)에틸]술폰), SULFO EGS (에틸렌 글리콜비스(숙신이미딜숙시네이트)), EGS (에틸렌 글리콜비스(술포숙신이미딜숙시네이트)), DPDPB (1,2-디[3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도]부탄), BSSS (비스(술포숙신이미딜)수베레이트), SMPB(숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), SULFO SMPB (술포숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), MBS (3-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), SULFO MBS (3-말레이미도벤조일-N-히드록시술포숙신이미드 에스테르), SIAB (N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트), SULFO SLAB (N-술포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트), SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트), SULFO SMCC (술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트), NHS LC SPDP (숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트), SULFO NHS LC SPDP (술포숙신이미딜-6-[3-(2-피리딜디티오)프로피온아미도)헥사노에이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), NHS BROMOACETATE (N-히드록시숙신이미딜브로모아세테이트), NHS IODOACETATE (N-히드록시숙신이미딜요오도아세테이트), MPBH (4-(N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 염산염), MCCH (4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 히드라지드 염산염), MBH (m-말레이미도벤조산 히드라지드 염산염), SULFO EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)술포숙신이미드), EMCS (N-(엡실론-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드), PMPI (N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트), KMUH (N-(카파-말레이미도운데칸산)히드라지드), LC SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트)), SULFO GMBS (N-(감마-말레이미도부티릴옥시)술포숙신이미드 에스테르), SMPH (숙신이미딜-6-(베타-말레이미도프로피온아미도헥사노에이트)), SULFO KMUS (N-(카파-말레이미도운데카노일옥시)술포숙신이미드 에스테르), GMBS (N-(감마-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드), DMP (디메틸피멜리미데이트 염산염), DMS (디메틸수베리미데이트 염산염), MHBH (우드 시약)(메틸-p-히드록시벤즈이미데이트 염산염, 98%), DMA (디메틸아디피미데이트 염산염).
i. 나노입자, 미소입자, 및 미소관
용어 '나노입자'는 나노미터로 측정되는 크기를 가지는 나노규모의 입자, 예를 들면 최소한 하나의 크기가 약 100nm보다 적은 나노규모의 입자를 말한다. 나노입자의 실례로는 상자성 나노입자, 초상자성 나노입자, 금속 나노입자, 풀루렌-유사 물질, 무기 나노튜브, 덴드리머(dendrimer)(예컨대 공유부착된 금속 킬레이트와 함께), 나노섬유, 나노홈(nanohom), 나노-어니언(nano-onion), 나노막대, 나노로프 및 양자 돗트가 있다. 나노입자는 검출가능한 신호를 예를 들면 광자 (무선주파수와 가시적인 광자를 포함하여)의 흡수 및/또는 방출과 플라즈몬 공명을 통해 검출가능한 신호를 생성할 수 있다.
미소구 (또는 미소기포) 또한 본원에 개시된 방법과 함께 사용될 수 있다. 발색단을 함유하고 있는 미소구는 매우 다양한 용도로, 이를테면 광결정, 생물학적 표지, 및 미세유체 통로에서 활용되어 왔다 (Y. Lin, et al., Appl. Phys Lett. 2002, 81, 3134; D. Wang, et al., Chem. Mater. 2003, 15, 2724; X. Gao, et al., J. Biomed. Opt. 2002, 7, 532; M. Han, et al., Nature Biotechnology. 2001, 19, 631; V. M. Pai, et al., Mag. & Magnetic Mater. 1999, 194, 262). 발색단의 광안정성과 미소구의 단일분산성은 둘 다 중요하다.
나노입자, 예를 들면 실리카 나노입자, 금속 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 또는 반도체 나노결정은 미소구에 통합될 수 있다. 나노입자의 광학, 자성, 및 전자적 특성은 나노입자가 미소구와 결합되어 있는 상태에서 관찰되는 것을 가능하게 하고, 미소구가 확인되거나 공간적으로 모니터되는 것을 가능하게 한다. 예를 들어 콜로이드상으로 합성된 반도체 나노결정의 높은 광안정성, 양호한 형광 효율 및 넓은 방출 조정 가능성은 그 나노결정이 발색단으로서 탁월하게 선택될 수 있게 한다. 유기 염료와는 달리, 상이한 색 (즉 상이한 파장)을 방출하는 나노결정은 단일한 광원과 동시에 여기될 수 있다. 콜로이드상으로 합성된 반도체 나노결정 (예컨대 코어-쉘 CdSe/ZnS 및 CdS/ZnS 나노결정)은 미소구에 통합될 수 있다. 미소구는 단일분산성 실리카 미소구일 수 있다.
나노입자는 금속 나노입자, 금속 산화물 나노입자, 또는 반도체 나노결정일 수 있다. 금속 나노입자 또는 금속 산화물 나노입자의 금속은 티탄, 지르코늄, 하프늄, 바나듐, 니오븀, 탄탈, 크로뮴, 몰리브덴, 텅스텐, 망간, 테크네튬, 레늄, 철, 루테늄, 오스뮴, 코발트, 로듐, 이리듐, 니켈, 팔라듐, 백금, 구리, 은, 금, 아연, 카드뮴, 스칸듐, 이트륨, 란타늄, 란타니드 시리즈 혹은 악티니드 계열 요소 (예컨대 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메튬, 사마리움, 유로피움, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 튤리움, 이테르븀, 류테티움, 토리움, 프로탁티늄, 및 우라늄), 붕소, 알루미늄, 갈륨, 인듐, 탈륨, 규소, 게르마늄, 주석, 납, 안티몬, 비스무트, 폴로늄, 망간, 칼슘, 스트론튬, 및 바륨을 포함한다. 어떤 구체예에서, 금속은 철, 레테늄, 코발트, 로듐, 니켈, 팔라듐, 백금, 은, 금, 세륨 또는 사마륨일 수 있다. 금속 산화물은 이들 물질 또는 물질들의 조합 중 어느 것의 산화물일 수 있다. 예를 들면 금속은 금일 수 있고, 금속 산화물은 철 산화물, 코발트 산화물, 아연 산화물, 세륨 산화물, 또는 티탄 산화물일 수 있다. 금속과 금속 산화물 나노입자의 제조에 대해서는 미국 특허 제 5,897,945호 및 6,759,199호에 설명되어 있다.
예를 들어 개시된 조성물은 실리카 나노입자 (SNP) 상에 고정될 수 있다. SNP는 그것들의 유리한 표면적-대-부피 비율, 수월한 제조 및 형광 표지의 부착 가능성, 자성 나노입자 (Yang, H.H. et al., 2005) 및 반도체성 나노결정 (Lin, Y. W. et al.2006)으로 인하여 생물학적 감지 (바이오센서)와 촉매적 적용에 광범위하게 사용되고 있다.
나노입자는 또한 열생성 나노쉘일 수 있다. 본원에서 사용되는 '나노쉘'은 하나 또는 그 이상의 전도성 쉘 층에 의해 둘러싸인 불연속적인 유전성 또는 반전도성 코어 부분을 가지는 나노입자이다. 미국 특허 제 6,530,944호에는 금속 나노쉘의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있고, 그것은 전체가 본원에 참조된다.
표적화 분자는 개시된 조성물 및/또는 담체에 부착될 수 있다. 예를 들어 표적화 분자는 항체, 또는 그것의 단편, 특이한 단백질에 대한 리간드, 또는 표적화될 세포의 표면에 특이하게 결합하는 다른 단백질일 수 있다.
ii. 리포솜
본원에서 사용되는 '리포솜'은 내부의 수성 공간을 둘러싸고 있는 외부의 지질 이중- 또는 다중-층 막을 포함하는 구조물을 말한다. 리포솜은 어떠한 생물학적으로 활성 제제를 세포에 대한 전달을 위해 패키지하는 데 사용될 수 있다.
리포솜을 형성하기 위한 물질과 과정은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 적절한 매질에 분산될 때 광범위한 인지질이 팽창하고, 수화되어 지질 이중 층을 분리시키는 수성 매질의 층들과 함께 다중층의 집중적인 이중층 소포체를 형성한다. 이들 시스템은 다중층 리포솜 또는 다중층 지질 소포체 ('MLV')로 언급되며, 10nm 내지 100㎛ 범위 내의 직경을 갖는다. 이들 MLV는 먼저 문헌에 설명되어 있다 (Bangham, et al., J Mol. Biol. 13:238-252 (1965)). 일반적으로 지질 또는 친유성 물질은 유기 용매에 녹는다. 예컨대 진공하에서 회전 증발에 의해 용매가 제거될 때, 액체 잔기는 용기의 벽 위에 필름을 형성한다. 전형적으로 전해질 또는 친수성 생물학적 활성 물질을 함유하는 수성 용액은 그런 다음 필름에 첨가된다. 큰 MLV는 교반시의 생성물이다. 더 작은 MLV가 바람직할 경우에 보다 큰 소포체에는 초음파 처리, 기공의 크기가 감소해가거나 다른 형태의 기계적 전단에 의해 감소된 필터를 통한 순차적인 여과가 수행된다. 또한 그것에 의해 MLV가 크기나 층의 숫자에 있어서 둘 다 감소하는, 예컨대 가압된 압출에 의한 기법이 활용되는 기법이 있다 (Barenholz, et al., FEBS Lett. 99:210-214 (1979)).
리포솜은 또한 단일층 소포체의 형태를 취할 수 있는데, 그것은 보다 집중적인 MLV의 초음파 처리에 의해 제조되고, 수성 용액 주변의 단일한 구형 지질 이중층으로 구성된다. 단일층 소포체 ('ULV')는 작고, 20 내지 200nm 범위의 직경을 가지는 한편, 보다 큰 ULV는 200nm 내지 2㎛ 범위의 직경을 가질 수 있다. 단일층 소포체를 만드는 기법은 여러 가지가 잘 알려져 있다. 문헌에는 인지질의 수성 분산액을 초음파 처리함으로써 수성 용액을 둘러싸고 있는 지질 이중층을 가지는 작은 ULV가 생성되는 것이 설명되어 있다 (Papahadjopoulos, et al., Biochim et Biophys Acta 135:624-238 (1968)). 슈나이더(Schneider)는 미국 특허 제 4,089,801호에서 초음파 처리와, 이어서 양친매성 화합물을 함유하는 수성 매질을 첨가하고 생체분자 지질층 시스템을 형성하기 위해 원심분리함으로써 리포솜 전구체가 형성되는 것에 대해 설명하였다.
작은 ULV는 또한 바츠리 등에 의해 설명된 에탄올 주사 기법에 의해 (Batzri, et al., Biochim et Biophys Acta 298:1015-1019 (1973)), 디머 등의 에테르 주사 기법에 의해 (Deamer, et al., Biochim et Biophys Acta 443:629-634 (1976)) 제조될 수 있다. 이들 방법은 지질의 유기 용액을 완충용액 안으로 신속하게 주입하는 것을 포함하며, 그 결과 단일층 리포솜이 빠르게 형성된다. ULV를 만드는 다른 기법은 문헌을 참조한다 (Weder, et al. in 'Liposome Technology', ed. G. Gregoriadis, CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., Vol. I, Chapter 7, pg. 79-107 (1984)). 이 계면활성제 제거 방법은 원하는 소포체를 생성하기 위하여 교반 또는 초음파 처리에 의해 계면활성제를 포함한 첨가제와 지질을 용해하는 것을 포함한다.
Papahadjopoulos 등은 미국 특허 제 4,235,871호에서 유기 용매 중의 지질의 유-중-수 에멀션과 수성 완충용액 중의 캡슐화될 약물의 형성을 포함하는 역상 증발 기법에 의해 커다란 ULV를 제조하는 것을 설명하였다. 유기 용매는 감압하에 제거되어 수성 매질에서 교반되거나 분산될 때 커다란 ULV로 전환된다. 스즈끼 등은 미국 특허 제 4,016,100호에서, 제제와 지질의 수성 인지질 분산액을 냉동/해동시킴으로써 단일층 소포체 중에 제제들을 캡슐화하는 또 다른 방법을 설명하였다.
MLV 및 ULV 외에, 리포솜은 또한 다중소포체일 수 있다. 문헌에는 이들 다중소포체 리포솜이 구형이며 내부는 과립 구조를 가지고 있는 것으로 설명되었다 (Kim, et al., Biochim et Biophys Acta 728:339-348 (1983)). 외막은 지질 이중층이고, 내부 영역에는 이중층 격막으로 분리된 작은 구획들이 함유되어 있다. 또 다른 리포솜 유형은 올리고층 소포체 ('OLV')로서, 그것은 여러 말단 지질층에 의해 둘러싸여진 커다란 중심 구획을 가진다. 이런 소포체는 직경이 2 내지 15㎛이고, 칼로 등의 문헌에 설명되어 있다 (Callo, et al., Cryobiology 22(3):251-267 (1985)).
메제이(Mezei) 등은 미국 특허 제 4,485,054호 및 4,761,288호에서 또한 지질 소포체의 제조 방법을 설명하였다. 보다 최근에는 Hsu가 미국 특허 제 5,653,996호에서 에어로졸을 만드는 기법을 활용하여 리포솜을 제조하는 방법을 설명하였고, Yiourmas 등은 미국 특허 제 5,013,497호에서 고속-전단 혼합 챔버를 활용하여 리포솜을 제조하는 방법을 설명하였다. ULV를 생성하기 위해 (Wallach, et al., 미국 특허 제 4,853,228호) 또는 OVL를 제조하기 위하여 (Wallach, 미국 특허 제 5,474,848호 및 5,628,936호) 특이한 출발 물질을 사용하는 방법들이 또한 설명되어 있다.
상기 언급한 지질 소포체와 그것의 제조방법에 대한 포괄적인 개관은 'Liposome Technology' (ed. G. Gregoriadis, CRC Press Inc., Boca Raton, Fla., Vol. I, II & III (1984))에서 설명되었다. 이것과 상기에서 언급된 참조문헌들은 본원에 참조로 삽입된 본 발명에 사용하기 위해 적당한 다양한 지질 소포체를 설명하였다.
제공된 조성물에 포합될 수 있는 지방산 (즉 지질)은 리포솜에 프로단백질 전환효소가 효과적으로 통합되는 것을 가능하게 하는 것들이다. 일반적으로 지방산은 극성 지질이다. 그러므로 지방산은 인지질일 수 있다. 제공된 조성물은 천연 또는 합성 인지질을 포함할 수 있다. 인지질은 포화 또는 불포화 모노 또는 이중치환된 지방산과 그것들의 조합을 함유하는 인지질로부터 선택될 수 있다. 그런 인지질은 다음과 같은 것일 수 있다: 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜세린, 디올레오일포스파티딜에탄올아민, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티드산, 팔미토일올레오일포스파티딜 콜린, 팔미토일올레오일포스파티딜세린, 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티드산, 팔미트엘라이도일올레오일포스파티딜콜린, 팔미트엘라이도일올레오일포스파티딜세린, 팔미트엘라이도일올레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미트엘라이도일올레오일포스파티딜글리세롤, 팔미트엘라이도일올레오일포스파티드산, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜콜린, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜세린, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜에탄올아민, 미리스톨레오일올레오일포스파티딜글리세롤, 미리스톨레오일올레오일포스파티드산, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜세린, 디리놀레오일포스파티딜에탄올아민, 디리놀레오일포스파티딜글리세롤, 디리놀레오일포스파티드산, 팔미틱리놀레오일포스파티딜콜린, 팔미틱리놀레오일포스파티딜세린, 팔미틱리놀레오일포스파티딜에탄올아민, 팔미틱리놀레오일포스파티딜글리세롤, 팔미틱리놀레오일포스파티드산. 이들 인지질은 또한 다음의 모노아실화된 유도체일 수 있다: 포스파티딜콜린 (리소포스파티딜콜린), 포스파티딜세린 (리소포스파티딜세린), 포스파티딜에탄올아민 (리소포스포타딜에탄올아민), 포스파티딜글리세롤 (리소포스파티딜글리세롤) 및 포스파티드산 (리소포스파티드산). 이들 리소포스파티딜 유도체에서 모노아실 사슬은 팔미토일, 올레오일, 팔미토올레오일, 리놀레오일 미리스토일 또는 미리스톨레오일일 수 있다. 인지질은 또한 합성일 수 있다. 합성 인지질은 다양한 공급원으로부터, 예컨대 AVANTI Polar Lipids (Albaster, Ala.); Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.)로부터 쉽게 상업적으로 구할 수 있다. 이들 합성 화합물들은 달라질 수 있고, 자연 발생 인지질에서 발견되지 않는 그것들의 지방산 측쇄에 변이가 있을 수 있다. 지방산은 PS 또는 PC중 하나 혹은 둘 다에서 C14, C16, C18 또는 C20의 사슬 길이를 가지는 불포화 지방산 측쇄를 가질 수 있다. 합성 인지질은 디올레오일 (18:1)-PS; 팔미토일 (16:0)-올레오일 (18:1)-PS, 디미리스토일 (14:0)-PS; 디팔미놀레오일 (16:1)-PC, 디팔미토일 (16:O)-PC, 디올레오일 (18:1)-PC, 팔미토일 (16:0)-올레오일 (18:1)-PC, 및 미리스토일 (14:0)-올레오일 (18:1)-PC를 구성성분으로서 가질 수 있다. 그러므로 실례로서 제공된 조성물은 팔미토일 16:0을 포함할 수 있다.
iii. 생체 내/생체 외
상기에서 설명된 것과 같이, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체로 투여될 수 있고, 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 메커니즘 (예컨대 순수한 DNA의 흡수, 리포솜 융합, 유전자 총을 경유한 DNA의 근육내 주사, 세포 이물 흡수 작용 등)에 의해 생체 내에서 및/또는 생체 외에서 피험자의 세포에 전달될 수 있다.
만약 생체 외 방법이 사용된다면, 세포 또는 조직은 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 표준 프로토콜을 따라 제거된 후 신체 외부에서 유지될 수 있다. 조성물은 어떠한 유전자 전달 메커니즘, 예를 들면 인산칼슘 중재된 유전자 전달, 일렉트로포레이션, 미세주사 또는 단백성 리포솜을 경유하여 세포 안으로 도입될 수 있다. 유전자도입된 세포는 그런 다음 주입되거나 (예컨대 약제학적으로 허용되는 담체에 넣어져) 또는 세포 또는 조직 유형에 대한 표준 방법대로 피험자의 몸 안에 다시 동위적으로 이식된다. 피험자에게 다양한 세포를 이식 또는 주입하기 위한 표준 방법들이 공지되어 있다.
B. 방법
1. 치료 방법
방사선요법에 대한 조직 민감도를 증가시키는 방법이 본원에 제공되며, 이 방법은 NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 조직에 투여하는 단계, 및 조직에 방사선을 조사하는 단계를 포함한다. 조직은 암 또는 양성 성장물을 비롯한 방사선요법이 바람직한 어떤 조직일 수 있다.
i. 암
이에 따라, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 암에 투여하는 단계, 및 암에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 피험자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계, 및 화학치료제를 암에 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 이에 따라, 개시된 방법의 화학치료제는, 예를 들어 본원에 개시된 신생물성 약물 중 어느 것일 수 있다.
개시된 방법에서 암은 조절 불가한 성장, 침습, 또는 전이를 겪은 피험자의 어떤 세포일 수 있다. 어떤 측면에서, 암은 현재 방사선요법이 사용되고 있는 어떤 신생물 또는 종양일 수 있다. 또는 달리, 암은 표준 방법을 사용한 방사선요법에 충분히 민감하지 않은 신생물 또는 종양일 수 있다. 이에 따라, 암은 육종, 림프종, 백혈병, 암종, 모세포종, 또는 생식세포 종양일 수 있다. 제한은 아니지만, 개시된 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 대표적인 암의 리스트에는 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계암, 두경부암, 두경부의 편평세포암종, 신장암, 폐암, 예를 들어 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 신경모세포종/아교모세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 목, 후두, 및 폐의 편평세포암종, 결장암, 자궁경부암, 자궁경부암종, 유방암, 상피암, 신장암, 생식기암, 폐 관련 암, 식도암종, 두경부암종, 대장암, 조혈세포암, 고환암, 직결장암, 전립선 관련 암, 및 췌장 관련 암이 포함된다.
a. 두부와 경부암
제공된 조성물 및 방법은 두부와 경부암의 치료에 사용될 수 있다. 두부와 경부암을 가진 환자에서, 방사선은 1차 요법 또는 수술 후 치료로서 사용될 수 있다. 때로 방사선은 화학요법과 병용된다. 방사선요법의 가장 유리한 결과 중 하나는 성대에 암이 있는 사람에서 후두가 보존된다는 것이다. 비인두암은 위치상의 이유 때문에 방사선요법으로 일차적으로 치료된다. 종양이 재발한 많은 환자들이 성공적으로 재치료될 수 있다. 크고 광범한 침습성 종양이나 경계가 명확하거나 폐쇄된 종양을 가진 환자들, 및 명확한 림프절을 가진 환자들은 수술 후에 국소적 또는 지엽적 재발의 위험이 높다. 방사선요법은 이러한 종양의 국소 제어 기회를 증가시키고, 대체로 두경부 종양을 가진 환자의 생존율을 개선한다.
b. 피부암
제공된 조성물 및 방법은 피부암의 치료에 사용될 수 있다. 피부암은 일차적으로 또는 수술 후에 방사선으로 치료될 수 있다. 일반적으로, 1차 치료는 수술로 인한 미용상의 결과가 부적합할 가능성이 있는 부위에 사용되도록 예비된다. 가장 일반적으로, 이들은 코, 귀, 윗입술과 경계면, 눈꺼풀 및 안각 주변의 부위를 포함한다. 유사하게, 수술 후 방사선 조사는 고-위험 환자 6에서 국소 제어를 증가시킨다.
c. 중추신경계 종양
제공된 조성물 및 방법은 중추신경계의 암을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이들 종양에서는 종양 위치가 수술이 어렵기 때문에 일차적으로 방사선요법이 처방될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로, 방사선은 수술 후에 사용된다. 방사선요법은 고 등급 신경교종을 가진 대부분의 환자와 저 등급 신경교종을 가진 일부 환자에서 생존율을 개선한다. 3-차원 기술을 이용하여 더욱 정밀하게 치료 빔의 초점을 맞추는 공초점 입체지향 요법의 새로운 방법에 의해 더 많은 용량의 방사선이 안전하고 정확하게 투여될 수 있다. 이런 기술은 뇌종양의 치료에 특히 유망할 수 있다.
d. 생식기암
제공된 조성물 및 방법은 생식기암의 치료에 사용될 수 있다. 침습성 방광암을 가진 선별된 환자에서, 화학요법과 병용한 방사선은 방광과 그 기능을 보존하는데 도움이 될 수 있다. 전립선암은 일차적으로 또는 수술 후에 방사선으로 치료될 수 있다. 단계적인 근치적 전립선절제술과 1차적 방사선요법은 전립선암 환자에 완치된 생존의 동일한 기회를 제공하는 것으로 나타났다. 최근, 안드로겐 차단이 국소 제어를 증진시키고 생존율을 개선한다는 것이 밝혀졌다. 방사선요법은 전립선암 환자의 이환율 저하와 관련되며, 공초점 요법 또는 방사선 활성 종자 이식이 사용될 때 특히 그러하다. 방사선을 사용하면 다른 요법에서는 매우 일반적으로 발생하는 발기부전과 실금 발생을 피하는 것이 대체로 가능하다.
경계가 명확한 종양을 가지거나 전립선-특이적 항원(PSA)의 수준이 상승한 환자와 같은 전립선절제술을 받은 국소 재발 위험이 높은 환자에서, 방사선은 국소 제어와 생존율을 개선할 수 있다. 초기 고환종 환자는 근치적 고환절제술 후 저용량 방사선 조사 치료를 받았을 때 매우 높은 생존율을 나타낸다.
e. 부인과 종양
제공된 조성물 및 방법은 부인과 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 초기(I 기) 자궁경부암은 수술만큼이나 효과적으로 방사선요법에 의해 치료될 수 있다. 후기(II 및 III 기) 종양은 방사선 조사에 의해서 가장 잘 치료된다. 불리한 조직학적 특성을 가진 대부분의 자궁경부암과 자궁내막암은 수술 후 방사선요법에 의해 더 잘 제어된다. 난소암을 가진 어떤 환자들은 수술 후에 제공되는 복강내 방사선 활성인 물질이 유리할 수 있다. 질음문암의 경우에는, 흔히 환자가 고령이고 필요한 수술이 너무 비용이 많이 들기 때문에 주로 방사선요법으로 치료된다.
f. 유방암
제공된 조성물 및 방법은 유방암의 치료에 사용될 수 있다. 방사선은 원발성 유방암의 관리를 극적으로 변경시켰다. 유방종양제거술과 방사선요법을 이용한 유방 보존은 초기 유방암에서 선택되는 치료이다. 대부분의 환자에서 미용상의 결과가 좋고, 생존율에는 손해가 없다. 유방 종양제거술만으로 관리될 수 있는 위험성이 낮은 환자를 확인하기 위한 시도가 있지만, 지금까지 모든 그룹의 환자는 방사선요법을 부가했을 때 국소 제어가 더 양호했다. 국소 진행된 유방암을 가진 대부분의 환자는 방사선요법에 의해 국소 제어가 개선되고, 방사선요법 후 생존율이 증가된다.
g. 위장관 종양
제공된 조성물 및 방법은 위장관 종양의 치료에 사용될 수 있다. 식도암은 일반적으로 환자가 치료를 시도하는 순간까지 진행된다. 화학요법과 병용한 방사선요법은 대부분의 식도암 환자에서 수술만큼 효과적인 것으로 나타났다. 선별된 환자들에서 수술 전 화학방사선요법이 최상의 결과를 제공할 수 있다. 또한, 위암 환자가 흔히 진행된 질환을 나타낸다. 어떤 연구는 이런 환자에서 가장 좋은 치료는, 종양이 절제 가능한 경우라면 수술 후 화학방사선요법이고, 종양이 절제 가능하지 않다면 단독적인 화학방사선요법이라고 제안한다. 유사하게, 수술 후 화학방사선요법 또는 단독적인 화학방사선요법은 절제 가능한 췌장암과 절제 가능하지 않은 췌장암에서도 바람직한 치료이다.
국소 진행된 결장암을 가진 어떤 고-위험 환자는 보조적인 방사선요법에 의해 국소 제어 및 생존율이 더 좋아질 수 있다. 흔히 화학치료제와 함께 투여되는 수술 전 방사선요법은 진행된 또는 저위 직장암의 단계를 낮출 수 있고, 괄약근의 절제 및 보존을 허용한다. 고-위험 수술 환자에서, 방사선요법은 역시 수술 후에 도움이 될 수 있다. 항문 및 항문주위 암은 우수한 결과가 얻어지고 괄약근이 보존될 수 있기 때문에 일반적으로 방사선요법과 화학요법을 병용하여 치료된다.
h. 폐암
제공된 조성물 및 방법은 폐암의 치료에 사용될 수 있다. 폐암은 가능하다면 언제든지 수술에 의해 치료되어야 한다. 수술 후 방사선요법은 국소 제어를 개선하며, 어떤 고-위험 수술 환자에서 생존율을 개선할 수 있다. 절제 불가능한 폐암은 이따금 수술 전에 방사선으로 절제 가능하게 만들 수 있다. 절제가 불가능한 경우, 방사선요법과 화학요법을 병용한 접근법이 바람직하다. 화학치료제의 투여는 방사선요법에 선행하거나 또는 동시에 이루어질 수 있다.
i. 육종
제공된 조성물 및 방법은 육종의 치료에 사용될 수 있다. 기능이 보존되는 광범한 국소 적출이 연조직 육종에서 처방된다. 수술 전 또는 수술 후 방사선 조사를 받은 고-위험 환자들은 국소 제어와 생존율에 개선을 나타낸다. 수술 전 방사선은 종양을 수축시켜서 더욱 제한적인 수술을 허용하고, 국소 제어를 개선하여, 사지 보존을 가능하게 할 수 있다.
j. 림프종
제공된 조성물 및 방법은 림프종의 치료에 사용될 수 있다. 비-호지킨 림프종 또는 호지킨 림프종을 가진 일부 환자는 방사선요법으로 가장 잘 치료될 수 있다. 저 등급 비-호지킨 림프종을 가진 대부분의 환자는 방사선요법만으로 치료될 수 있으며, 국소 제어가 우수하다. I 기 또는 II 기 질환의 고 등급 비-호지킨 림프종을 가진 일부 환자는 화학요법 후의 방사선 조사에 의해 생존율이 개선된다. 초기 질환을 가진 선별된 환자에서 호지킨 림프종은 방사선요법 단독으로 또는 화학요법과 병용하여 치료되어야 한다. 또한, 방사선요법은 더욱 진행된 호지킨 림프종의 제어에 도움을 줄 수 있다.
k. 소아암
제공된 조성물 및 방법은 소아암의 치료에 사용될 수 있다. 소아암 환자는 중추신경계 종양 (뇌실막세포종, 별아교세포종, 속질모세포종, 배아 종양, 뇌간 신경교종, 두개인두종, 송과체 종양, 소뇌 별아교세포종, 눈 신경교종, 망막모세포종, 척수 종양), 신경모세포종, 림프종, 유잉씨 육종, 횡문근육종 및 윌름씨 종양에서 방사선요법이 유리할 수 있다.
l. 완화성 치유
제공된 조성물 및 방법은 완화성 치유를 위해 사용될 수 있다. 전이성 암을 가진 환자에서, 방사선은 주로 삶의 질을 개선하고 심지어 생존율까지도 개선한다. 방사선은 고통스런 뼈 전이의 완화에 우수하며, 중량을 지닌 뼈의 병적 골절을 예방할 수 있다. 일반적으로, 방사선에 의해 제공되는 통증 완화는 통증 약물치료와 약물 부작용을 감소시킨다. 암으로 인한 척추의 압박은 주로 방사선요법만으로 효과적으로 치료될 수 있는 위급상황이다. 등의 통증, 사지의 약화, 또는 장이나 방광 제어의 문제를 가진 환자들은 척수 압박으로 다루어지도록 즉시 평가되어야 한다. 또 다른 잠재적 위급상황인 상대정맥은 일반적으로 방사선요법에 잘 반응한다. 환자들은 일반적으로 호흡곤란, 좌위호흡 및 목과 상체의 정맥울혈을 나타낸다. 마찬가지로, 암에 의한 기도 압박이 대체로 방사선요법으로 효과적으로 치료될 수 있다. 단기 방사선은 뇌 전이 환자에서 평균 생존율 및 삶의 질을 개선할 수 있다. 유일한 임상 질환이 단일 뇌 전이라면, 수술과 전체 뇌 방사선 조사 또는 입체지향 방사선 조사와 전체 뇌 방사선 조사를 병용하는 접근법이 가장 극적으로 평균 생존율을 개선한다.
ii. 양성 질환
제공된 조성물 및 방법은 양성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사선요법은 사기질종, 동맥류성 골낭, 혈관섬유종, 동·정맥 기형, 화학감수체종, 척삭종, 두개인두종, 데스모이드 종양, 그레이브스 눈병증, 전립선암의 호르몬 관리와 관련된 유방이상비대, 혈관종, 이소성 뼈 형성, 지라과다증, 켈로이드, 각질가시세포종, 수막종, 페이로니병, 뇌하수체 선종, 익상편, 자가면역질환 또는 기관 이식 동안의 총 림프양 방사선 조사, 3차 신경통, 갑상선 안질환의 치료, 및 혈관 재협착 예방에 사용될 수 있다.
a. 3차 신경통
이에 따라서, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 3차 신경에 투여하는 단계, 및 3차 신경에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 피험자에서 3차 신경통을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
3차 신경통은 눈, 입술, 코, 두피, 이마, 및 아래턱에 강도 높은 통증을 일으키는 3차 신경의 신경병증 장애이다. 가장 고통스런 상태를 경험하는 대부분의 사람이 3차 신경통으로 간주되며, 효과적인 치료가 발견되기 전에는 상당수의 사람이 스스로의 삶을 저당 잡혀 있었기 때문에 일찍이 자살 질환이라는 꼬리표가 붙었다. 15,000명 중 1명이 3차 신경통으로 고통받는 것으로 추정되며, 이 수는 빈번한 오진으로 인해 상당히 더 높을 것으로 생각된다.
3차 신경은 다섯 번째 두개(골) 신경으로서, 턱선 위의 안면에서 기원하는 촉각(압력), 온도감각(온도), 및 통각(통증)과 같은 지각 데이터를 담당하는 혼성 두 개신경이다. 또한, 이것은 안면에 나타나지는 않지만 씹는 것에 관련된 근육인 저작근육의 운동기능을 담당한다. 몇몇 이론가들이 이런 통증 증후군의 가능한 원인을 설명한다. 선도적인 설명은 혈관이 뇌교와 연결된 근처에서 3차 신경을 압박한다는 것이다. 상부 소뇌동맥이 가장 많이 인용되는 문제 부분이다. 이러한 압박은 신경의 보호성 미엘린 외피를 손상시켜, 신경의 불규칙적인 과다활성 기능화를 야기할 수 있다. 이것은 신경이 가닿은 어떤 부위에서 아주 약한 자극에도 통증 공격을 야기할 수 있을 뿐만 아니라, 자극 종료 후 통증 신호를 차단하는 신경의 능력을 방해할 수 있다. 또한, 이런 종류의 손상은 동맥류(혈관의 낭상돌출), 종양, 소뇌교각의 거미줄막 낭종, 또는 자동차 사고나 혀 피어싱과 같은 외상에 의해 일어날 수도 있다. 3차 신경통 환자 중 일반적으로 더 어린 2 내지 4%의 환자는 3차 신경 또는 다른 관련 뇌 부분을 손상시킬 수 있는 다발성 경화증의 증거를 나타낸다. 구조적인 원인이 없는 경우에는 이 증후군을 특발증이라고 한다. 대상포진 후 발생하는 대상포진 후 신경통은 3차 신경이 침범된 경우 유사한 증상을 일으킬 수 있다.
통증 신호 전달을 방지하기 위하여 감마 나이프나 노발리스 모양 빔과 같은 유사한 방사선수술 장치를 이용하여 신경을 손상시킬 수 있다. 이 과정에 절개는 포함되지 않는다. 이것은 방사선을 사용하여 신경근에 충격을 가하는데, 이때 혈관 압박이 주로 발견되는 동일한 지점의 선택적 손상을 목표로 한다. 이런 옵션은 특히 긴 시간의 일반 마취가 의학적으로 부적당한 사람들이나, 또는 혈액 응고 예방약(예를 들어, 와파린)을 복용 중인 사람들에게 사용된다.
따라서, 개시된 조성물은 방사선 수술 과정 전에 신경을 방사선에 민감하게 하는 데 사용될 수 있다.
b. 익상편
국소 스트론튬 적용이 수술에 의해 절제된 눈 익상편의 국소 재발을 예방하는데 도움이 될 수 있다. 표피 근처의 저용량 방사선 치료는 수술에 의해 절제된 켈로이드의 국소 재발을 예방하는데 도움이 될 수 있다. 방사선요법은 주로 최소 이환율로 성공적으로 뇌하수체 선종을 치료하는 데 사용된다. 저용량 방사선 조사는 때때로 다른 종류의 치료요법이 실패한 선별된 환자에서 그레이브스 눈병증을 개선할 수 있다. 마찬가지로, 다른 치료에 반응하지 않는 각질가시세포종은 일반적으로 방사선 조사에 잘 반응한다. 또한, 혈관종도 저용량 방사선 조사에 잘 반응한다. 방사선요법은 고 위험 데스모이드 및 페이로니병을 제어하는데 도움이 될 수 있다. 일부 정형외과 수술 후 환자에서, 저용량 방사선이 이소성 뼈 형성을 예방할 수 있다. 마지막으로, 중추신경계의 동·정맥 이상형성이 이 이상형성이 외과적으로 접근 불가능한 경우 입체지향적 방사선요법에 의해 제거될 수 있다.
또, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 결막에 투여하는 단계, 및 결막에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 피험자에서 익상편을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
익상편은 결막의 양성 성장물이라고 할 수 있다. 또는 달리, 이것은 목, 눈꺼풀, 무릎, 팔꿈치, 발목 또는 손가락에 생긴 어떤 날개모양의 삼각형 막을 말한다(J. Pediatr. Orthop. B 2004, 13:197-201). 예로서 다리에 침범한 오금 익상편 증후군이 있다.
결막과 관련될 때, 익상편은 일반적으로 비측 공막에서부터 성장한다. 이것은 자외선 노출(예를 들어, 일광), 낮은 습도, 및 먼지와 관련되며, 이들에 의해 발생된다고 생각된다. 익상편이 비측에서 우세한 것은 태양 광선을 굴절시켜 대뇌변연 부위에 초점을 맞추는 각막을 통해 태양 광선이 측면 통과하기 때문인 것 같다. 일광은 눈의 측면으로부터 방해 없이 통과되어 각막을 통과한 후 중앙 윤부에 집중된다. 그러나, 반대쪽에서는 중앙에 있는 코의 그림자가 측면/일시적 윤부 상에 집중된 일광의 강도를 감소시킨다.
결막의 익상편은 콜라겐의 탄성 변성과 섬유 혈관 증식을 특징으로 한다. 이것은 목에 의해 익상편의 주요부에 연결된 익상편의 머리라고 하는 진행 중인 부분을 가진다. 때때로 익상편의 머리 부근에 철 침착 라인이 보이는데, 이것을 스톡커 라인이라고 한다. 이 라인의 위치는 성장 패턴을 표시할 수 있다. 이것은 양성 성장물이기 때문에, 그것이 눈동자를 덮어 시야를 방해할 정도로 자라지 않는 한 치료는 필요하지 않다. 또한, 일부 환자에서 이 성장물이 너무 보기 흉할 경우 수술을 선택할 수도 있다. 정확한 원인은 불명이지만, 바람, 태양, 또는 모래에의 과다한 노출과 관련된다. 측면까지 가리는 보호 선글라스 및/또는 차양이 넓은 모자를 착용하고 하루 종일 인공 눈물을 사용하는 것이 이들의 형성을 예방하거나 더 이상의 성장을 중단시키는데 도움이 될 수 있다. 서퍼와 다른 수상 스포츠 경기자들은 물로부터 UV 선을 100% 차단하는 눈 보호대를 착용해야 한다.
때때로 이것은 태양 아래서 많은 시간을 보내는 중년의 환자들에서 우연치 않게 발견된다. 또한, 익상편은 물로부터 되튀는 UV 선에의 과도한 노출로 인해 서핑, 웨이크보드, 및 카이트보드를 즐기는 젊은 남녀에서도 발견된다. 스키와 스노우보드를 타는 사람들이 눈 위에서 눈을 보호하는 것과 마찬가지로 수상 스포츠에 참여하는 경기자들도 UV 선을 조심하고 눈을 보호할 필요가 있다.
환자들은 인공 눈물로 증상을 치료할 수는 있지만, 익상편 진행을 감소시키거나 심지어 예방할 수 있는 신뢰할 만한 의학적 치료는 존재하지 않는다. 최후의 치료는 수술적 제거에 의해서만 달성된다. 완전한 수술적 교정 후에도 익상편이 재발될 수 있기 때문에 장기간의 추적조사가 필요하다.
c. 갑상선 안질환
또한, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 눈에 투여하는 단계, 및 눈에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 피험자에서 중증의 갑상선 안질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
갑상선 안질환은 과활성 갑상선이 발생한 사람들에서 흔히 발생한다. 안와 근육 및 다른 조직의 팽윤에 의해 눈을 앞쪽으로 밀려 나와 더 돌출되게 된다. 눈은 주로 더 응시하는 듯한 외형을 띄게 된다. 더 심한 경우에는 팽윤이 눈을 움직이는 근육을 강직시킬 수 있다. 이것은 "사시"로 발전될 수 있으며, 그 결과 이중 시야가 될 수 있다. 때때로, 안구 뒤쪽의 팽윤에 의해 눈에서 뇌로 이어진 신경이 눌려서 시야가 막힐 수 있다. 갑상선 안질환은 또한 갑상선 눈병증, 그레이브스 안질환 또는 갑상선 기능장애 안질환이라고도 한다.
갑상선의 과활성은 일반적으로 "자가면역 상태"에 의해 야기된다. 이것은 정상적으로는 감염으로부터 신체를 보호하는 세포가 "오류"를 범하여 갑상선을 이물질로 인식해서 그것을 공격하기 시작한다는 의미이다. 이것은 갑상선을 자극하여 가외의 갑상선 호르몬을 생성한다. 공격 과정은 눈 뒤쪽의 세포 전체에 미쳐서 팽윤을 일으킬 수 있다.
방사선요법은 안구 뒤쪽의 조직에 제공될 수 있다. 이것은 일반적으로 2주에 걸쳐 제공되는 10회 용량을 포함한다. 환자의 2/3에서는 상당한 개선이 발견되지만, 유감스럽게도 1/3에서는 그렇지 못해서 안와(眼窩) 감압술과 같은 다른 치료요법이 필요하다. 이런 치료요법은 흔히 스테로이드 및 면역억제제와 병용된다.
d. 켈로이드
또한, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 켈로이드 흉터에 투여하는 단계, 및 켈로이드 흉터에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 피험자에서 켈로이드 흉터를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
켈로이드는 치유된 피부 손상 부위에서 조직의 과성장으로 인해 생기는 일종의 흉터이다. 켈로이드는 단단한 탄력적 병소 또는 윤이 나는 섬유성 마디이며, 분홍색에서부터 살색 또는 적색에서 암갈색까지 다양한 색을 가질 수 있다. 켈로이드 흉터는 양성, 비전염성이며, 일반적으로 심한 가려움, 얼얼한 통증 및 질감의 변화가 동반된다. 심한 경우 이것은 피부의 움직임에 영향을 미칠 수 있다. 원래 상처의 경계를 넘어서는 성장하지 않으며 시간이 지남에 따라 줄어들 수 있는 융기형 흉터인 비후성 흉터와 켈로이드를 혼동해서는 안 된다.
켈로이드는 정상 피부 위의 성장물과 비슷하게 발톱까지도 확장된다. 이것은 바늘처럼 찌르는 통증이 있는 상처를 내거나, 경고 없이 가려움을 유발할 수 있으며, 느끼는 정도는 환자마다 다르다. 켈로이드가 감염될 경우에는 궤양이 생길 수 있다. 유일한 치료는 흉터를 완전히 제거하는 것이다.
켈로이드는 흉터조직 내에 형성된다. 상처 수선에 사용되는 콜라겐은 이런 부위에서 과성장하려는 경향이 있으며, 때때로 원래 흉터보다 수배 더 큰 덩어리를 만들기도 한다. 이것은 일반적으로 손상 부위에서 발생하지만, 켈로이드는 또한 자연적으로 생기기도 한다. 이것은 피어싱 부위에서 발생할 수 있으며, 여드름이나 생채기와 같은 단순한 것으로부터 생길 수도 있다. 이것은 심한 여드름이나 수두 흉터, 상처 부위의 감염, 어떤 부위의 반복적인 외상, 상처 폐쇄 동안의 과도한 피부 긴장 또는 상처 내의 이물질로 인해 발생할 수 있다.
내부 기관에 영향을 미칠 만큼 신체에 깊이 침투하지 않는 레벨의 전자 빔 방사선이 사용될 수 있다. 관용전압 방사선이 좀 더 침투되며 약간 더 효과적이다. 수술 상처가 치유되는 동안 수술 후 곧바로 사용된다면 방사선 치료는 흉터 형성을 줄인다.
e. 이소성 골화
또한, NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 조직에 투여하는 단계, 및 조직에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 피험자에서 이소성 골화를 예방하는 방법이 본원에 제공된다.
이소성 골화(HO)는 외골격 연조직 내에 진짜 뼈가 비정상적으로 형성되는 것이다. 종래에는 이런 공통의 특징을 공유하는 많은 질환들이 통틀어서 근육염 골화의 범주에 들어갔는데, 원발성 근육 염증이 필수적인 전구물질이 아니고, 골화가 항상 근육조직에서만 발생하는 것이 아니라, 근막, 힘줄, 및 다른 중간엽 연조직에서도 빈발하여 나타나기 때문에 이 용어는 이제 선호되지 않는다.
종래에 HO의 여러 형태는 임상 환경 및 병소 위치와 병소가 진행성인지 또는 고립되어 발생하는지에 따라서 분류되었다. 근육염 골화 외상성 전신장애라는 용어는 무딘 상처, 수술, 또는 화상과 같은 회생 가능한 외상 후에 발생하는 HO에 적용된다. 논리적으로, 자극성 외상을 확인할 수 없는 경우 병소는 무외상적 근육염 골화라고 명명된다. 병소가 피하 지방에 국한되는 경우에는 지방층염 골화로, 내전근 근육에서 발견되는 경우에는 라이더 본으로, 그리고 삼각근에 위치된 경우에는 슈터 본으로 명명된다.
HO와 척수 손상 간에 강한 관련성이 존재하는데, 이 경우 병소는 여러 부위에서 발생하고, 강한 재발 경향을 나타낸다. 유사하게, 외상성 뇌손상 환자들에서 관절주위 HO가 보이는데, 이 경우 HO의 정도 및 기능 관련 중증도는 두개 내 손상의 중증도와 직접적으로 관련된다. 또한, 파상풍, 폴리오, 기앵-바레 증후군, 및 기계적 호흡 동안의 연장된 약리학적 마비를 비롯한 신경성 손상의 많은 다른 원인들이 HO 형성과 관련된다.
진행성 골화성 섬유형성이상(FOP), 또는 뮌치미어 질환은 상염색체 우성 질환으로서, 근막면, 근육, 힘줄, 및 인대의 진행성 골화를 야기하여 심한 불구의 상태로 만드는 질환이다. 엄지발가락의 선천적 이상형성이 FOP와 관련된다. HO는 알브라이트 유전성 골형성장애, 진행성 골질 이종조직형성, 및 원발성 피부골종을 포함하는 몇 가지 다른 질환의 특징이다.
HO는 침범된 연조직 내에 잠복해 있는 골선조 줄기세포에서 기원한다. 적절한 자극에 의하여 줄기세포가 골모세포로 분화되고, 골 형성 과정을 시작하여 결국에는 성숙한 이소성 뼈가 만들어진다. 연조직에 실험적으로 침착되었을 때 여러 가지의 뼈 형태형성 단백질(BMP)이 HO를 자극할 수 있는데, 이것은 BMP가 HO의 개시에서 어떤 역할을 한다는 것을 암시한다. 신경 제어 정도가 관련되지만, 아직은 잘 이해되지 않는다.
iii. 방사선요법
방사선요법은 악성 세포의 DNA를 손상시킴으로서 작용하는 국소 치료 방식이다. 정상 세포는 종양 세포에 비해 이런 손상을 수선하는 능력이 더 크다. 방사선요법은 이런 차이를 이용한다. 손상된 세포가 치료 직후 죽는 것이 아니므로, 방사선요법이 성공적으로 완료된 후에도 종양이 흔히 지속된다는 점을 유념하는 것이 중요하다.
치료 처방은 치료 목표와 가능한 부작용을 기준으로 한다. 치료 과정은 1일 정도의 단기 과정과 10주 정도의 장기 과정이 있을 수 있으며, 전형적인 기간은 2 내지 7주이고, 일반적으로 매주 5일의 치료로 구성된다. 환자는 가장 일반적으로 치료 빔으로서 사용되거나 또는 치료 빔으로서 사용되는 x-선을 생성하는 전자를 가속하는 선형 가속장치를 통해 방사선을 받는다. 치료는 통증이 없고, 주로 5분 미만으로 지속된다.
치료 목표는 치유 또는 완화일 수 있다. 방사선요법이 잠재적으로 치유를 목표로 하는 경우, 치료기간이 대체로 더 길고, 일반적으로 장기간의 치료기간에 걸쳐서 소량의 일일 용량으로 구성된다. 이 접근법은 후기 부작용을 최소화한다. 치료가 엄밀히 완화를 목표로 하는 경우, 짧은 기간에 걸쳐서 다량의 일일 치료 용량으로 구성된 단기간의 치료 일정이 사용된다. 이러한 경우, 환자의 일생 동안 후기 부작용이 일어나지 않을 수 있다. 더욱이, 단기간의 치료 프로그램은 환자의 남은 삶에 부정적인 영향을 덜 미친다.
방사선 요법은 국소 요법의 형태이므로, 일반적으로 부작용은 치료된 부위에 제한된다. 그러나, 공통된 전신 증상으로서 피로감이 있다. 방사선의 부작용은 일반적으로는 온건하지만, 때로 심각한 경우도 있다. 부작용은 초기 부작용과 후기 부작용으로 나눌 수 있다. 초기 부작용은 치료 동안 또는 치료 직후 발생하며, 전형적으로 치료 후 3 내지 6주 이내에 해결된다. 후기 부작용은 치료 후 수개월에서 수년까지 발생하며, 대체로 영구적이다. 이런 부작용들은 괴사나 흉터, 드물게는 암 발생을 초래하는 조직 손상의 결과이다. 방사선요법에 수반되는 악성질환의 발생은 잘 알려져 있다. 많은 유전적 요인들이 일부 환자에서 2차 암의 소인이 되는 것이 사실이지만, 방사선 또한 관련 위험의 증가에 기여한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 방사선의 필요량을 감소시킴으로써 이러한 부작용을 줄일 수 있다.
방사선요법은 많은 가능한 구체적인 처방을 가진다. 이것은 1차적 종양 치료로서, 수술 전 또는 수술 후 요법으로서, 또는 조합요법이나 병용요법의 성분으로서 주어질 수 있다.
방사선 요법은 암 환자의 거의 2/3에서 적합하며, 치유 및 완화 목적으로 사용된다. 전립선암, 유방암, 두부와 경부암, 폐암, 뇌종양, 위장관 종양, 간암, 연조직육종, 자궁경부암, 림프종 등과 같은 많은 종양에서 치료 섭생의 일부로서 방사선요법을 수용할 것이다. 방사선요법은 외부 빔 방사선(x-선, γ-선, 양성자 및 중성자), 근접요법 및 방사선 활성 물질 이식을 포함한다. 방사선요법은 2-D, 3-D, 공초점, 강도-변조(IMRT) 및 이미지-가이드(IGRT) 접근법에 의해 투여될 수 있다. 대부분의 고형 종양에 적합한 표준 방사선요법은 약 60Gys(50-70Gys)의 총 용량으로 2Gy/일로 제공된다. 그러나, 특정 피험자, 장치, 및 종양 타입에 기초하여 당업자가 바람직한 방사선 용량을 선택하는 것이 일반적이다. 본 방법은 방사선에 대한 암세포의 민감도를 증가시킴으로써 기존의 방사선 요법에 대한 개선을 구성한다. 예를 들어, 제공된 방법은 암세포로 하여금 방사선에 대해 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 이 이상의 민감도를 가지게 한다. 본원에서 사용된 용어 '민감도' 및 '방사선 민감도'는 방사선 용량에 기초한 생존하는 세포수를 말한다. 따라서, 방사선 민감도의 증가는 어떤 방사선 용량에서 생존하는 세포수의 감소, 치사량에 필요한 방사선 용량의 감소, 또는 이들의 조합을 야기할 수 있다.
밀봉 선원 방사선요법 또는 근접방사선요법(endocurietherapy)이라고도 알려진 근접요법은 방사선 활성 선원을 치료가 필요한 영역 내부에 또는 그 옆에 배치하는 방사선요법의 형태이다. 반대로, 외부 빔 방사선요법, 또는 원격요법은 선형 가속장치에 의해 외부에 생성된 방사선이 적용된다. 근접요법은 국소 전립선암 및 두부와 경부암의 치료에 일반적으로 사용된다.
근접요법은 몰드 근접요법, 스트론튬 판 요법, 간극내 근접요법, 공동내 근접요법, 및 혈관내 근접요법을 포함한다. 몰드 근접요법에서, 표피에 가까운 종양이 피부 가까이 배치된 밀봉된 선원을 사용하여 치료될 수 있다. 맨체스터 시스템과 관련하여 선량측정이 주로 수행된다; 표적 체적의 전체 부분에 대한 용량이 처방 용량의 10% 이내가 되도록 설계된 규칙-기반 접근법. 일반적으로 스트론튬 판 요법이라고 하는 표면 적용장치는 1mm 두께 미만의 매우 표피에 매우 가까운 병소에 사용된다. 판은 중공의 얇은 은 케이싱으로서, 방사선 활성인 스트론튬-90 분말 염을 밀봉한다. 스트론튬의 방사선 활성 붕괴로 인해 생성된 베타(전자) 입자는 매우 얕게 침투한다. 전형적으로, Sr90 판은 절제된 익상편 층 위에 놓인다. 약 10-12Gy의 일정 용량이 접촉 타이밍에 송달된다. 전자는 단지 공기 중 수 mm를 침투하므로, 방사선 보호 문제가 약간 줄어들며, 이것은 다른 방사선 선원과 매우 큰 차이이다. 눈 공막에 배치된 판의 청소가 필요한데, 은 케이싱이 얇고 쉽게 파손되기 때문에 이것은 어렵지 않다. 스트론튬은 칼슘과 동일한 화학 부류, 즉 알칼리 토금속에 속하며, 따라서 어떤 스트론튬염이 눈과 접촉되어 흡수될 경우 뼈 안에 동시에 배치될 것이다. 적용장치를 신체로부터 멀리 고정함으로써 오퍼레이터의 베타선 노출을 방지할 수 있다. 간극내 근접요법에서, 선원은 조직에 삽입된다. 최초의 이런 종류의 치료에서는 맨체스터 시스템에 따라서 배치된 라듐-226을 함유하는 바늘을 사용했지만, 현대의 방법은 이리듐-192 와이어를 사용하는 경향이다. 이리듐 와이어는 맨체스터 또는 파리 시스템을 사용하여 배치될 수 있다; 후자는 새로운 핵종을 이용하여 특수 설계되었다. 또한, 요오드-125 종자를 사용한 전립선암 치료가 간극내 근접요법으로 분류된다. 감마 방사체의 상세한 사항은 일반적으로 사용되는 감마선 방출 동위원소를 참조한다. 공동내 근접요법은 기존의 체내 공동 안에 선원을 배치한다. 사실 이 방법은 가장 일반적으로 부인과에서 적용되지만, 이것은 또 코인두 상에서도 수행될 수 있다. 혈관내 근접요법은 공급원을 가진 카테터를 혈관 내부에 배치한다. 이 방법의 가장 일반적인 적용은 관상동맥 스텐트내 재협착의 치료이지만, 이 요법은 또한 말초혈관 협착의 치료에의 사용도 조사되었다.
고선량율(HDR) 근접요법이 일반적인 근접요법 방법이다. 카테터 형태의 적용장치가, 일반적으로 맨체스터 또는 파리 시스템에 따라서, 또는 환자 내에 배치된다. 다음에, 고선량율 선원(주로 이리듐 192, Ir-192)이 기계에 의해 와이어 끝의 카테터를 따라서 조종되며, 이 동안 환자는 방에 격리된다. 선원을 미리 계획된 위치에 미리 설정된 시간 동안 체류시킨 다음, 카테터를 따라 앞으로 나아가고, 필요한 용량 분포가 달성되도록 이것을 반복한다. 방사선 활성 선원을 직접 이식하는 것을 능가하는 이 치료의 이점은 스태프의 방사선에 노출이 더 적다는 것과, 더 적은 스태프 노출로 인해 더 활성인 선원을 사용할 수 있어서 치료 시간이 빨라진다는데 있다.
고선량율(HDR)과 마찬가지로, 저선량율(LDR)은 방사선 활성 물질의 이식을 포함하며, 이것은 일시적으로 또는 영구적으로 이식될 수 있다. 기계를 사용한 LDR 근접요법은 유사한 방식으로 작동한다. 또 다른 변형은 선원이 활성 및 불활성 볼 형태인 것으로서, 이것 역시 기계를 사용하여 환자에서 조종된다.
어떤 측면에서, 개시된 방법은 피험자의 건강한 조직에 방사선 보호제를 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 방사선 보호제는 자유 라디칼을 포획하여 산화성 손상을 방지하는 조성물을 포함할 것이다.
iv. 화학요법
대부분의 화학치료 약물은 알킬화제, 항대사물질, 안트라시클린, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 억제제, 모노클로날 항체, 및 다른 항종양 제제로 나눌 수 있다. 이들 약물은 모두 세포분열이나 DNA 합성에 영향을 미친다. 일부 더 새로운 제제들은 DNN를 직접적으로 간섭하지 않는다. 이들은 새로운 티로신 키나제 억제제 이마티닙 메실레이트(Gleevec® 또는 Glivec®)를 포함하며, 이것은 어떤 종류의 암(만성 골수성 백혈병, 위장관 기질 종양)에서의 분자 이상성을 직접 표적으로 한다. 이에 더하여, 이들 세포를 직접 공격하지 않으면서 종양 세포 거동을 조정하는 어떤 약물이 사용될 수 있다. 호르몬 치료는 이 범주의 보조제 요법에 속한다.
개시된 방법의 화학치료제는 알킬화제일 수 있다. 알킬화제는 세포에 존재하는 조건 하에서 많은 전기음성기에 알킬기를 부가할 수 있는 능력으로 인해 이름 붙여진 것이다. 옥살리플라틴뿐만 아니라 시스플라틴과 카르보플라틴이 알킬화제이다. 다른 제제로서 메클로에타민, 시클로포스파미드, 클로람부실이 있다. 이것들은 세포의 DNA를 화학적으로 변형함으로써 작동한다.
개시된 방법의 화학치료제는 항대사물질일 수 있다. 항대사물질들은 DNA의 빌딩 블록이 되는 퓨린(아자티오프린, 메르캅토퓨린)이나 피리미딘으로 가장하고 있다. 이것은 이 물질들이 'S' 기(세포 사이클의) 동안 DNA에 통합되는 않도록 하여 정상적인 발달 및 분열을 중단시킨다. 또한, 이것들은 RNA 합성에 영향을 미친다. 이들의 효능으로 인해, 이런 약물들은 가장 광범하게 사용되는 세포증식 억제제이다.
개시된 방법의 화학치료제는 식물 알칼로이드 또는 테르페노이드일 수 있다. 이런 알칼로이드류는 식물로부터 유래되며, 미세소관 기능을 방지함으로써 세포분열을 차단한다. 미세소관은 세포분열에 필수적이며, 이것 없이는 세포분열이 일어나지 않는다. 주된 예로서 빈카 알칼로이드와 탁산이 있다.
개시된 방법의 화학치료제는 빈카 알칼로이드일 수 있다. 빈카 알칼로이드는 튜불린의 특정 부위에 결합하여 튜불린이 미세소관으로 조립되는 것을 억제한다(세포 사이클의 M 기). 이것은 마다가스카르 협죽도과 식물, 카타란투스 로세우스(이전에는 빈카 로세아로 알려짐)로부터 유래된다. 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈오렐빈, 빈데신, 및 포도필로톡신을 포함한다. 포도필로톡신은 두 가지 다른 세포증식 억제성 약물인 에토포시드와 테니포시드의 생성에 사용되는 식물-유래 화합물이다. 이것은 세포의 G1 기로의 진입(DNA 복제의 시작)과 DNA의 복제(S 기)를 방해한다. 이것의 정확한 작용 메커니즘은 밝혀져야 한다. 이 물질은 주로 미국 포도필룸속 식물(포도필룸 펠타툼)으로부터 얻어지고 있다. 최근에, 희귀한 히말라야 포도필룸속 식물(포도필룸 헥산드룸)이 이것을 훨씬 다량 함유한다는 것이 발견되었지만, 이 식물은 멸종 위기에 있는 식물이어서 공급이 제한적이다. 이 물질의 생성에 연관되는 유전자를 분리하기 위한 연구들이 수행되고 있으며, 이렇게 되면 이 물질을 재조합에 의해 얻을 수 있을 것이다.
개시된 방법의 화학치료제는 탁산일 수 있다. 프로토타입 탁산은 태평양 주목나무의 껍질에서 최초로 유래된 원래 탁솔이라고 알려진 천연 산물 파클리탁셀이다. 도세탁셀은 파클리탁셀의 반-합성 유사체이다. 탁산은 미세소관의 안정성을 증진시켜 핵분열 후기 동안 염색체의 분리를 방지한다.
개시된 방법의 화학치료제는 토포이소머라제 억제제일 수 있다. 토포이소머라제는 DNA의 지형을 유지하기 위한 필수 효소이다. 타입 I 또는 타입 II 토포이소머라제의 억제는 적합한 DNA 수퍼코일링을 전복시킴으로써 DNA의 전사와 복제를 모두 방해한다. 일부 타입 I 토포이소머라제 억제제는 캄프토테신 이리노테칸 및 토포테칸을 포함한다. 타입 II 억제제의 예는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 테니포시드를 포함한다. 이것들은 미국 포도필룸속 식물(포도필룸 펠라툼)의 뿌리에서 자연 발생하는 알칼로이드인 에피포도필로톡신의 반-합성 유도체이다.
개시된 방법의 화학치료제는 항종양 항생물질(항신생물제)일 수 있다. 이 그룹의 가장 중요한 면역억제제는 신장 이식에 사용되는 닥티노마이신이다.
개시된 방법의 화학치료제는 (단클론성) 항체일 수 있다. 단클론성 항체는 종양 특이적 항체를 표적화함으로써 작동하며, 이로써 이 제제가 공격하는 종양 세포에 대한 숙주의 면역반응을 증진시킨다. 예로서 트라스투주맵(Herceptin), 세툭시맵, 및 리툭시맵(Rituxan 또는 Mabthera). 베바시주맵은 종양 세포를 직접 공격하지는 않지만, 대신에 새로운 종양 혈관의 형성을 차단하는 단클론성 항체이다.
개시된 방법의 화학치료제는 호르몬요법일 수 있다. 몇몇 악성질환이 호르몬요법에 반응한다. 엄밀히 말해서 이것은 화학요법은 아니다. 유선이나 전립선을 포함하는 어떤 조직에서 발생한 암은 호르몬 균형의 적합한 변화에 의해 억제 또는 자극될 수 있다. 스테로이드(주로 덱사메타손)는 종양 성장 또는 관련된 부종(조직 팽윤)을 억제할 수 있으며, 림프절 악성질환의 퇴화를 일으킬 수 있다. 전립선암은 테스토스테론의 디히드로테스토스테론으로의 말초적 전환을 차단하는 제제인 피나스테라이드에 주로 민감하다. 유방암 세포는 주로 에스트로겐 및/또는 프로게스테론 수용체를 다량 발현한다. 이런 호르몬들의 생성(아로마타제 억제제 사용) 또는 작용(타목시펜 사용)을 억제하는 것이 보조 요법으로서 흔히 사용될 수 있다. 고세렐린과 같은 고나도트로핀-방출 호르몬 작동제(GnRH)는 모순된 네거티브 피드백 효과를 지니며, 연속적으로 제공될 경우 FSH(여포-자극 호르몬) 및 LH(황체 형성 호르몬)의 방출을 억제가 이어진다. 또한, 일부 다른 종양들도 호르몬 의존성이지만, 특이적 메커니즘은 아직 명확하지 않다.
개시된 방법의 조성물은 본원에 설명된 NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 펩티드, 예를 들어 분리된 폴리펩티드 또는 NBS1의 카르복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 보존성 변이체(예를 들어, NTP)를 포함할 수 있다. 본 방법의 조성물은 분리된 폴리펩티드 또는 ATM의 NBS1-결합 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이들의 보존성 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 NBS1과 결합하는 ATM의 열 반복부 서열, 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 폴리펩티드는 NBS1의 카르복시-최말단 아미노산을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 가장 C-말단의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 아미노산, 또는 이들의 단편을 포함하여, NBS1의 가장 C-말단의 4개 내지 30개 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 아미노산 734-754(SEQ ID NO:1)를 포함할 수 있다. 제공된 폴리펩티드는 NBS1의 아미노산 734-754(SEQ ID NO:1)를 포함하여, 가장 C-말단의 4 내지 30개 아미노산 안에 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 펩티드는 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 폴리펩티드는, 예를 들어 가장 C-말단의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산을 포함하지 않는다.
추가의 측면에서, 폴리펩티드는 ATM의 NBS1-결합 도메인을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 ATM의 열 반복부 2 및/또는 7을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 이에 따라서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 ATM의 아미노산 248-522(SEQ ID NO:51)을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 이에 따라서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 ATM의 아미노산 1436-1770(SEQ ID NO:51)을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 따라서, 본원에서 제공된 폴리펩티드는 SEQ ID NO:57을 포함하는 어떤 폴리펩티드일 수 있다. 제공된 폴리펩티드는 ATM의 열 반복부 2 및/또는 7 안에 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 펩티드는 1, 2 또는 3개의 보존성 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 ATM의 아미노산 248-522(SEQ ID NO:51) 또는 ATM의 아미노산 1436-1770(SEQ ID NO:51)과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:56과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 SEQ ID NO:57과 적어도 95% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
2. 스크리닝 방법
NBS1 및 ATM 폴리펩티드를 포함하는 샘플과 후보 제제를 접촉시키는 단계, 및 NBS1과 ATM 폴리펩티드 간의 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 방사선 민감화 제제를 확인하는 방법이 본원에 개시되며, 대조군과 비교하여 NBS1과 ATM 폴리펩티드 간의 상호작용의 감소가 후보 제제가 방사선 민감화 제제임을 시사한다. 한 측면에서, 상기 방법은 고-처리량 스크리닝 분석과 같은 스크리닝 분석법이다. 따라서, 접촉 단계는 세포-베이스 또는 세포-프리 분석일 수 있다. 예를 들어, NBS1과 ATM 폴리펩티드 간의 상호작용은 형광 편광을 이용하여 검출될 수 있다. 따라서, NBS1 및/또는 ATM 폴리펩티드는 형광단을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 NBS1 폴리펩티드는 양성 대조군으로서 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 제제는 본 분야에 공지된 방법에 따라서 천연 산물 또는 합성(또는 반-합성) 추출물의 대량 라이브러리 또는 화학 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 약물 발견 및 개발 분야의 전문가들은 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 출처는 본 발명의 스크리닝 과정(들)에 중요하지 않다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 실제로 많은 화학 추출물 또는 화합물이 본원에 설명된 예시적인 방법을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 추출물 또는 화합물의 예는, 제한은 없지만, 식물-, 진균-, 원핵생물-, 또는 동물-베이스 추출물, 발효 육즙, 및 합성 화합물, 뿐만 아니라 기존 화합물의 변형을 포함한다. 또한, 많은 방법이, 제한은 없지만, 당류-, 지질-, 펩티드-, 폴리펩티드-, 및 핵산-베이스 화합물을 포함하는 많은 화학 화합물의 무작위 또는 지정 합성(예를 들어, 반-합성 또는 총 합성)에 이용될 수 있다. 합성 화합물 라이브러리는, 예를 들어 Brandon Associates(Merrimack, NH) 및 Aldrich Chemical(Milwaukee, WI)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 또는 달리, Biotics(Sussex, UK), Xenova(Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft. Pierce, FIa.), 및 PharmaMar, U.S.A.(Cambridge, Mass.)를 포함하는 많은 출처로부터 박테리아, 진균, 식물, 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물 라이브러리가 상업적으로 입수될 수 있다. 이에 더하여, 천연 및 합성 생산 라이브러리는 원한다면 본 분야에 공지된 방법에 따라서, 예를 들어 표준 추출 및 분별법에 의해서 생산된다. 더욱이, 원한다면, 어떤 라이브러리 또는 화합물은 표준 화학, 물리, 또는 생화학적 방법을 이용하여 쉽게 변성된다. 이에 더하여, 약물 발견 및 개발 분야의 전문가들은 NBS1-ATM 상호작용에 대한 효과가 이미 공지된 물질의 복제방지 방법(예를 들어, 분류학적 복제방지, 생물학적 복제방지, 및 화학적 복제방지, 또는 이들의 어떤 조합) 또는 복제물 또는 반복물의 제거가 가능하다면 사용되어야 한다는 것을 쉽게 이해한다.
미정제 추출물이 원하는 활성을 가진다고 밝혀진 경우, 관찰된 효과를 일으키는 화학적 구성요소를 분리하기 위해 포지티브 리드 추출물의 추가 분별이 필요하다. 이와 같이, 추출, 분별, 및 정제 과정의 목표는 NBS1-ATM 상호작용을 자극 또는 억제하는 활성을 가진 미정제 추출물 내의 화학적 실체의 주의 깊은 특성화 및 확인이다. 화합물의 혼합물에서 활성을 검출하기 위해 본원에 설명된 동일한 분석법을 사용하여 활성 화합물을 정제하고 이들의 유도체를 시험할 수 있다. 이러한 이종성 추출물의 분별 및 정제 방법은 본 분야에 공지되어 있다. 원한다면, 치료에 유용한 제제라고 밝혀진 화합물이 본 분야에 공지된 방법에 따라서 화학적으로 정제된다. 치료적 가치가 있다고 확인된 화합물은 이어서 질환 또는 상태의 동물 모델을 사용하여 분석될 수 있다.
3. 투여 방법
조성물은 국소, 경구, 또는 비경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 체외, 두개내, 질내, 항문내, 피하, 진피내, 심장내, 위내, 정맥내, 근육내, 복강내 주사, 경피, 비강내, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 본원에 설명된 '두개내 투여'는 물질을 뇌로 직접 송달하는 것을 의미하며, 예를 들어 카테터나 바늘을 통한 수막공간내, 수조내, 뇌실내 또는 나비-경유 송달을 포함한다.
조성물이 비경구 투여에 사용될 경우에는 일반적으로 주사에 의한 투여를 특징으로 한다. 주사는 액체 용액 현탁액, 주사 전에 액체에 현탁액 용액을 만들기에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼으로 종래의 형태로 제조될 수 있다. 더욱 최근에 개선된 비경구 투여 접근법은 일정한 용량이 유지되는 서방형 또는 지속방출형 시스템의 사용을 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고자료로 인용되는 U.S. Patent No. 3,610,795를 참조한다.
본원에서 사용된 '국소 비강내 투여'는 조성물을 한쪽 또는 양쪽 콧구멍을 통해 코와 코 통로로 송달하는 것을 의미하며, 스프레이 메커니즘 또는 점적 메커니즘에 의한 송달이나, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 송달을 포함한다. 흡입에 의한 조성물의 투여는 스프레이 또는 점적 메커니즘에 의한 송달을 통해 코나 입을 통하여 투여하는 것일 수 있다. 또한, 삽관에 의해 호흡 시스템(예를 들어, 폐)의 어떤 부위로 직접 송달될 수도 있다.
필요한 조성물의 정확한 양은 종, 나이, 체중 및 피험자의 일반적 상태, 치료될 알러지성 장애의 중증도, 사용된 특정 핵산 또는 벡터, 투여 방식 등에 따라서 피험자마다 다를 것이다. 따라서, 모든 조성물에 대해서 정확한 양을 특정하는 것은 불가능하다. 그러나, 본원에 교시된 통상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 적절한 양은 결정될 수 있다.
물질은 용액 또는 현탁액(예를 들어, 마이크로입자, 리포솜, 또는 세포와 통합된) 형태일 수 있다. 이것들은 항체, 수용체, 또는 수용체 리간드에 의해 특정 세포 타입을 표적으로 할 수 있다. 다음의 참고문헌들은 이런 기술을 이용하여 특정 단백질을 종양 조직에 표적화하는 예이다(Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451 (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281 (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703 (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9 (1993); Battelli et al., Cancer Immunol. Immunother. 35:421-425 (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80 (1992); 및 Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)). 부형제, 예를 들어 '스텔스' 및 다른 항체 포합체 리포솜(결장암종을 표적으로 하는 지질 매개 약물을 포함한다), 세포 특이적 리간드를 통한 DNA의 수용체 매개 표적화, 림프구 지정 종양 표적화, 및 뮤린 신경교종 세포의 고도 특이적 치료 레트로바이러스 표적화가 생체내에서 사용된다. 다음의 참고문헌들은 이런 기술을 이용하여 종양 조직에 특이적 단백질을 표적화하는 예이다(Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220 (1989); 및 Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187 (1992)). 일반적으로, 수용체는 구성성 또는 리간드 유도성 엔도사이토시스의 경로에 연관된다. 이런 수용체들은 클라트린-코팅 오목부에서 클러스터를 이루고, 클라트린-코팅 소낭을 통해 세포로 진입하여, 수용체들이 정렬되는 산성화된 엔도솜을 통과한 다음, 세포 표면으로 재순환되거나, 세포내 저장되거나, 또는 리소좀에서 변성된다. 내제화 경로는 영양물 흡수, 활성화 단백질 제거, 거대분자 청소, 바이러스 및 독소의 기회감염적 진입, 리간드의 해리 및 변성, 그리고 수용체-레벨 조절과 같은 다양한 기능을 제공한다. 대부분의 수용체들은 세포 타입, 수용체 농도, 리간드 타입, 리간드 원자가, 및 리간드 농도에 따라서 하나 이상의 내제화 경로를 따른다. 수용체-매개 엔도사이토시스의 분자 메커니즘과 세포 메커니즘이 검토되었다(Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)).
적합한 담체들과 그것의 제제들이 Remington: The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)(ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995)에 설명된다. 전형적으로, 약제학적으로 허용되는 염의 적절한 양을 제제 중에 사용하여 제제를 등장성으로 만든다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예는, 제한은 없지만, 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 약 5 내지 약 8, 약 7 내지 약 7.5일 수 있다. 추가의 담체들은 항체를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속방출형 제조물을 포함하며, 이 매트릭스는 필름과 같은 성형 물품, 리포솜 또는 마이크로입자의 형태일 수 있다. 투여 경로 및 투여될 조성물의 농도 등에 따라서 어떤 담체가 더 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
약제학적 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 이것들은 가장 전형적으로는 인체에의 약물 투여를 위한 표준 담체로서, 멸균수, 식염수, 및 생리학적 pH로 완충된 용액과 같은 용액들을 포함한다. 조성물은 근육내 또는 피하 투여될 수 있다. 다른 화합물들은 당업자에 의해 사용되는 표준 과정에 따라서 투여될 것이다.
약제 조성물은 선택 분자에 더하여 담체, 농축제, 희석제, 완충제, 보존제, 표면활성제 등을 포함할 수 있다. 또한, 약제 조성물은 항균제, 항염제, 마취제 등과 같은 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다.
약제 조성물은 국소 치료가 바람직한지 아니면 전신 치료가 바람직한지에 따라서, 그리고 치료될 부위에 따라서 여러 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적으로(안구, 질, 직장, 비강내 경로), 경구적으로, 흡입에 의해, 또는 비경구적으로, 예를 들어 정맥내 드립, 피하, 복강내 또는 근육내 주사에 의해 이루어질 수 있다.
비경구 투여용 제조물은 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일 같은 식용 기름, 및 에틸올레에이트 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 식염수와 완충 매질도 포함된다. 비경구 부형제는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트 링거액, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 부형제는 유체 및 영양물 보충제, 전해질 보충제(예를 들어, 링거 덱스트로스에 기반한 것들) 등을 포함한다. 또한, 보존제 및 기타 첨가제들은, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 기체 등일 수 있다.
국소 투여용 제제는 연고, 로션, 크림, 겔(예를 들어, 폴록사머 겔), 점적약, 좌약, 스프레이, 리퀴드 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 약제 담체, 수성 용액, 분말 또는 유성 베이스, 농축제 등은 필수적일 수도 바람직할 수도 있다. 개시된 조성물은, 예를 들어 마이크로파이버, 중합체(예를 들어, 콜라겐), 나노스피어, 에어로졸, 로션, 크림, 패브릭, 플라스틱, 조직 가공 스캐폴드, 매트릭스 물질, 정제, 이식 용기, 분말, 오일, 수지, 상처 드레싱, 비드, 마이크로비드, 서방형 비드, 캡슐, 주사, 정맥내 드립, 펌프 장치, 실리콘 임플란트, 또는 어떤 생체-가공 재료로서 투여될 수 있다.
한 측면에서, 약제학적으로 허용되는 담체로서 폴록사머가 제공된다. 상품명 Pluronics®로 알려진 폴록사머류는 물에서 투명한 열가역성 겔을 형성하는 비이온성 계면활성제이다. 폴록사머류는 폴리에틸렌 옥시드-폴리프로필렌 옥시드-폴리에틸렌 옥시드(PEO-PPO-PEO)의 트리-블록 공중합체이다. 2개의 폴리에틸렌 옥시드 사슬은 친수성이지만, 폴리프로필렌 사슬은 소수성이다. 이런 소수성 및 친수성 특성으로 인해 수성 용액에 두어졌을 때 전하를 띄게 된다. PEO-PPO-PEO 사슬은 소수성 중심들이 함께 미쉘을 형성할 경우 작은 스트랜드 형태를 취한다. 미쉘은 계속해서 겔화 특성을 가지려는 경향이 있는데, 이것은 친수성 말단 근처에 물이 아주 약간만 존재해도 그룹 안에서 이들이 함께 고체(겔)를 형성하기 때문이다. 냉각될 경우에는 액체로 되지만, 가온될 경우에는 경화된다. 이런 특성으로 인해 냉각된 상태에서 정확한 용량을 측정하여 주사기에 넣을 수 있기 때문에 이들은 약제 컴파운딩에 유용하다. 체온으로 가온되면(피부에 도포된 경우) 이것은 완전한 컨시스턴시까지 증점되어(특히 대두 레시틴/이소프로필 팔미테이트와 조합된 경우) 적절한 도유 및 부착이 용이하게 된다. 쉽게 입수되는 Pluronic® F127(F127)가 광범위하게 사용되며, 약제 용도에서도 사용된다. F127의 EO:PO:EO 비는 100:65:100이고, 중량에 따른 PEO:PPO 비는 2:1이다. Pluronic 겔은 수성 용액으로서, 전형적으로 20-30% F-127을 함유한다. 따라서, 제공된 조성물은 F127 중에서 투여될 수 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 샤쉐, 또는 정제를 포함한다. 농축제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.
일부 조성물은 염산, 브롬화수소산, 과염소산, 질산, 티오시안산, 황산, 및 인산과 같은 무기산, 및 포름산, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 및 푸마르산과 같은 유기산과의 반응에 의해, 또는 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨과 같은 무기염기, 및 모노-, 디-, 트리알킬 및 아릴아민 및 치환된 에탄올아민과 같은 유기염기와의 반응에 의해 형성되는, 약제학적으로 허용되는 산- 또는 염기-부가 염으로서 비경구적으로 투여될 수 있다.
조성물의 효과적인 투여 용량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자의 기술 범위 내이다. 조성물의 투여 용량 범위는 장애의 증상에 유효한 바람직한 효과를 야기하기에 충분히 넓은 범위이다. 용량은 원치 않는 교차-반응, 과민성 반응 등의 부작용을 일으킬 만큼 크지는 않아야 한다. 일반적으로, 용량은 나이, 상태, 성별 및 환자의 질환 정도, 투여 경로, 또는 다른 약물이 섭생에 포함되는지의 여부에 따라 다르며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 용량은 어떤 대응처방의 결과로서 의사에 따라 조정될 수 있다. 용량은 변할 수 있으며, 1일 또는 수일 동안 하루 1회 이상의 용량 투여 방식으로 투여될 수 있다. 주어진 부류의 약제 제품에 대한 적합한 용량의 안내는 문헌에서 찾을 수 있다. 용량 범위는 본원의 조성물의 용도, 상태의 중증도, 및 투여 경로에 크게 의존한다.
예를 들어, 조사를 위한 연구 도구로서의 용도에서, NBS1 펩티드 조성물은 0.01% w/v 정도의 낮은 용량으로 사용될 수 있다. 이 용량은 0.02% w/v 정도로 낮을 수 있으며, 아마 국소 치료에서는 2% w/v 정도로 높을 수도 있을 것이다. 암/종양 치료요법과 같은 용도에서는 또는 급성 조직 손상 직후에 조기 농축 볼루스로서 사용되는 경우에는 그 자체만으로 또는 다른 화합물과 조합하여 상당히 높은 조성물 농도가 사용될 수 있다. 이에 따라서, 제공된 폴리펩티드의 상한은, 예를 들어 종양 덩어리에 직접 초기 볼루스로서 송달되는 경우에는, 2-5% w/v 또는 v/v까지일 수 있다. 근육내, 대뇌내, 심장내 및 척추관내 등의 비경구 투여 경로에서 권장되는 용량 상한은 손상의 중증도에 따라서 1% w/v 또는 v/v일 수 있다. 이런 용량 상한은, 예를 들어 폴리펩티드(들)가 폴리펩티드의 작용을 촉진하거나 또는 폴리펩티드(들)와 합동해서 작용하는 다른 제제들과 어떻게 조합되느냐에 따라서 제제마다 다를 수 있다.
제공된 폴리펩티드의 연속 송달을 위하여, 예를 들어 정맥내 드립과 조합된 경우, 상태의 개선에 기초하여 의사에 의해 결정되는 시간 과정에 따라서 0.01g/Kg 체중의 상한이 사용될 수 있다. 다른 예로서, 국소 송달되는 제공된 핵산 농도의 상한은, 예를 들어 핵산이 핵산의 작용을 촉진하거나 또는 핵산과 합동해서 작용하는 다른 제제들과 어떻게 조합되느냐에 따라서, 5-10μg/㎠일 것이다. 이것은 개선 상황에 기초하여 의사에 의해 결정되는 빈도로 반복될 수 있다. 다른 예로서, 근육내, 대뇌내, 심장내 및 척추관내 등, 내부적으로 송달되는 제공된 핵산 농도의 상한은 50-100μg/ml이다. 이 경우에도 빈도는 개선 상황에 기초하여 의사에 의해 결정될 것이다.
또한, 수술 전에 제공된 폴리펩티드로 수술 부위를 예비-컨디셔닝하는 것이 개시된다. 폴리펩티드의 농도는 10-200μM일 수 있으며, 해당 부위 내에 펩티드(들)의 침투를 가능하게 하는 10-30% Pluronic 겔 또는 어떤 이러한 담체와 혼합하여 수술 전 적어도 3-6시간 동안 놓아둔다. 이런 예비-절차로서의 컨디셔닝은 염증 반응 감소를 비롯한 후속되는 수술에 대한 치유 반응을 개선할 수 있다.
바이러스 벡터는 임상 용도에서 상당한 잠재력을 나타냄에도 불구하고 여전히 훌륭한 실험 도구이다. 이와 같은 바이러스 벡터에 대한 예상 용량 섭생의 계산에는 주의가 필요하며, 이것은 사용되는 벡터의 타입에 상당히 의존할 것이다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 암세포와 같은 분열중인 세포를 효과적으로 감염시키고, 숙주세포 게놈에 삽입되어 암호화된 단백질을 계속해서 무한정으로 발현한다. 동물 모델 환경에서 레트로바이러스의 전형적인 용량은 mL 당 107 내지 109 감염 유닛의 범위 내이다. 반면에, 아데노바이러스는 유사분열 후 세포를 가장 효과적으로 표적화하지만, 세포는 숙주 면역시스템에 의해 신속히 제거되거나, 감염된 세포가 증식을 다시 시작하고, 계속해서 바이러스 에피솜 DNA를 희석할 경우에는 바이러스가 결국은 상실된다. 실제로, 감염에서 이런 과도기적 시간 과정은 어떤 임상 상황에서, 예를 들어 작은 손상을 낫게 하는 경우, 본원에 설명된 조성물을 단기적으로 송달하는데 유용할 수 있다. 조사를 위한 동물 모델에서, 아데노바이러스는 mL 당 108-1011 감염 유닛의 농도로 전형적으로 사용된다. 동물 모델 데이터에 기초한 벡터의 용량 범위는 최종적으로 임상 환경(들)에서 사용되도록 계획되고 있으며, 약제학적으로 허용되는 제제(들)의 개발이 진행 중이다.
방사선 민감화를 촉진하기 위한 폴리펩티드 등의 개시된 조성물의 투여 후, 치료 조성물의 효능이 숙련된 전문의에게 잘 알려진 다양한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 조직 손상 후에 피험자에서 조성물이 흉터조직 형성을 감소시키거나, 섬유조직 형성을 감소시키거나, 조직 재생을 개선하거나, 또는 피험자에서 염증을 감소시킬 수 있다는 것을 관찰함으로써, 본원에 개시된 조성물, 예를 들어 폴리펩티드가 피험자에서 방사선 민감화를 촉진하는데 효과가 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이런 기준을 측정하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 본원에서 논의된다.
4. 조성물의 제조 방법
본원에 개시된 조성물 및 개시된 방법을 수행하는데 필요한 조성물은 다른 구체적인 언급이 없다면 그 특정 시약 또는 화합물에 대해 당업자에게 공지된 어떤 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
예를 들어, 제공된 핵산은 표준 화학 합성법을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 효소 방법 또는 어떤 다른 공지의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 방법은 표준 효소 소화와 그에 이어지는 뉴클레오티드 단편 분리(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Chapters 5, 6)에서부터 순수 합성 방법, 예를 들어 Milligen 또는 Beckman System 1Plus DNA 합성장치(예를 들어, Milligen-Biosearch(Burlington, MA) 사의 Model 8700 자동 합성장치 또는 ABI Model 380B)를 이용한 시아노에틸 포스포라미다이트 방법에 의한 합성 방법에까지 이른다. 또, 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 합성 방법이 Dcuta et al. Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)(포스포트리에스테르 및 포스파이트-트리에스테르 방법), 및 Narang et al. Methods Enzymol. 65:610-620 (1980)(포스포트리에스테르 방법)에 개시되어 있다. 단백질 핵산 분자는 Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)에 의해 설명된 것들과 같은 공지의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
개시된 폴리펩티드, 예를 들어 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10을 생성하는 한 방법은 단백질 화학 기술에 의해 2개 이상의 펩티드 또는 폴리펩티드를 함께 연결하는 것이다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카르보닐) 또는 Boc(tert-부틸옥시카르보닐) 화학을 이용하여 현재 이용 가능한 실험 장치에서 화학적으로 합성될 수 있다(Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA). 당업자는 개시된 단백질에 상응하는 펩티드 또는 폴리펩티드가, 예를 들어 표준 화학 반응에 의해서 합성될 수 있다는 것을 쉽게 인정할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드는 합성된 다음, 그것의 합성 수지로부터 절단되지 않을 수 있는 반면, 펩티드 또는 단백질의 나머지 단편은 합성된 다음, 수지로부터 절단되어 나머지 단편 상에 기능적으로 차단된 말단기가 노출될 수 있다. 펩티드 축합반응에 의해 이들 두 단편이 각각의 카르복실 및 아미노 말단에서 펩티드 결합을 통해 공유 결합됨으로써 단백질, 또는 그것의 단편이 형성될 수 있다(Grant G.A. (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky M. and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY(펩티드 합성과 관련된 재료에 관한 참고자료로서 본원에 인용된다)). 또는 달리, 펩티드 또는 폴리펩티드는 본원에 설명된 대로 생체내에서 독립적으로 합성된다. 일단 분리한 후, 유사한 펩티드 축합반응에 의해 이들 독립적인 펩티드 또는 폴리펩티드들을 연결하여 펩티드, 또는 그것의 단편을 형성할 수 있다.
예를 들어, 클로닝된 또는 합성된 펩티드 세그먼트의 효소 리게이션을 사용하면 비교적 짧은 펩티드 단편들을 결합시켜 더 큰 펩티드 단편, 폴리펩티드 또는 전체 단백질 도메인을 생성할 수 있다(Abrahmsen L. et al., Biochemistry 30:4151 (1991)). 또는 달리, 합성 펩티드의 자생적 화학 리게이션을 이용하여 짧은 펩티드 단편들로부터 거대 펩티드 또는 폴리펩티드를 합성적으로 구축할 수 있다. 이 방법은 두 단계의 화학 반응으로 구성된다(Dawson et al., Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776-779 (1994)). 첫 번째 단계는 미보호 합성 펩티드-티오에스테르와 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하는 또 다른 미보호 펩티드 세그먼트의 화학선택적 반응으로서, 초기 공유 산물로서 티오에스테르-연결 중간체가 얻어진다. 반응 조건을 변화시키지 않은 상태에서 이 중간체에서 자발적인 분자내 반응이 신속하게 일어나서 리게이션 부위에 자생 펩티드 결합이 형성된다(Baggiolini M., et al. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; Clark-Lewis I. et al., J. Biol. Chem. 269:160-75 (1994); Clark-Lewis I. et al., Biochemistry 30:3128 (1991); Rajarathnam K. et al., Biochemistry 33:6623-30 (1994)).
또는 달리, 미보호 펩티드 세그먼트가 화학적으로 연결되는데, 이 경우 화학적 리게이션의 결과로서 펩티드 세그먼트들 간에 형성된 결합은 비천연(비-펩티드) 결합이다(Schnolzer, M. et al., Science 256:221 (1992)). 이 기술은 단백질 도메인의 유사체들을 합성하는데 뿐만 아니라, 완전한 생물학적 활성을 지닌 비교적 순수한 단백질을 다량으로 합성하는데도 사용되었다(deLisle Milton R.C., et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267, (1992)).
조성물뿐만 아니라 이 조성물을 만드는 중간체를 제조하는 과정이 개시된다. 합성 화학 방법 및 표준 분자생물학 방법 등, 이런 조성물을 제조하는데 다양한 방법이 사용될 수 있다. 이들 및 다른 개시된 조성물의 제조 방법이 구체적으로 개시된다는 것이 이해된다. 본원에 개시된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 핵산의 발현을 제어하는 서열을 작동 가능한 방식으로 연결하는 것을 포함하는 과정에 의해 생성된 핵산 분자가 개시된다. 본원에 개시된 핵산 중 어느 것으로 세포를 형질전환하는 과정에 의해 생성된 세포가 개시된다. 본원에 개시된 핵산 중 어느 것을 발현하는 과정에 의해 생성된 개시된 펩티드 중 어느 것이 개시된다. 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 것으로 동물 내의 세포를 트랜스펙션하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시된다. 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 것으로 동물 내의 세포를 트랜스펙션하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시되며, 이때 동물은 포유동물이다. 또한, 본원에 개시된 핵산 분자 중 어느 것으로 동물 내의 세포를 트랜스펙션하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시되며, 이때 동물은 마우스, 래트, 토끼, 소, 양, 돼지, 또는 영장류이다. 또한, 본원에 개시된 세포 중 어느 것을 동물에 부가하는 과정에 의해 생성된 동물이 개시된다.
C. 용도
개시된 조성물은 연구 도구로서 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10을 포함하는 분리된 폴리펩티드와 같은 개시된 조성물을 사용하여, 예를 들어 결합 억제제로서 작용함에 따른, NBS1과 ATM 간의 상호작용을 연구할 수 있다. 개시된 내용으로부터 자명하며, 및/또는 당업자에게 이해될 수 있는 다른 용도들도 개시된다.
D. 정의
본원 및 첨부된 청구항에 사용된 단수형태 '어떤', '한', 및 '그'가 맥락상 분명히 다른 의미를 나타내지 않는다면 복수의 언급을 포함한다는 것을 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어 '펩티드'라는 언급은 복수의 이러한 펩티드를 포함하며, '그 펩티드'라는 언급은 하나 이상의 펩티드 및 당업자에게 공지된 그 동등물 등에 대한 언급이다.
'선택적인' 또는 '선택적으로'는 계속해서 설명되는 사건, 환경, 또는 재료가 일어날 수도 또는 존재할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것과, 그 설명이 사건, 환경, 또는 재료가 일어나거나 존재하는 경우와 일어나지 않거나 존재하지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 범위는 '약' 한 특정 값에서부터, 및/또는 '약' 다른 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이와 같이 범위가 표현되는 경우, 또 다른 구체예는 한 특정 값에서부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 범위가 선행어 '약'을 사용하여 근사값으로서 표현되는 경우, 이 특정 값이 또 다른 구체예를 형성한다는 것이 이해될 것이다. 더 나아가, 범위의 각 종점은 나머지 종점과 관련하여, 그리고 나머지 종점에 독립적으로 모두 중요하다. 또한, 많은 값들이 본원에 개시되며, 각 값은 또한 값 자체에 더하여 '약' 특정 값으로서 본원에 개시된다는 것이 이해된다. 예를 들어, '10'이 개시된 경우, '약 10'도 개시된다. 또한, 값이 개시되는 경우, '이하의' 값, '이상의' 값 및 이들 값 사이의 가능한 범위도 개시된다는 것이 당업자에게 잘 이해된다. 예를 들어, '10'이 개시된 경우, '10 이하의'뿐만 아니라 '10 이상의'도 개시된다. 또한, 본 출원 전체에서, 데이터는 많은 상이한 형식으로 제공되며, 이 데이터가 종점 및 시작점을 나타내고, 데이터 포인트의 어떤 조합을 범위로 한다는 것이 이해된다. 예를 들어, 특정 데이터 포인트 '10'과 특정 데이터 포인트 '15'가 개시된 경우, 10 및 15보다 큰, 10 및 15 이상의, 10 및 15보다 작은, 10 및 15 이하의, 그리고 10 및 15와 동등한 값들이 고려되고, 또한 10 내지 15의 값들이 개시된다. 또한, 두 특정 단위 사이의 각 단위가 개시된다는 것이 이해된다. 예를 들어, 10과 15가 개시된 경우, 11, 12, 13 및 14가 또한 개시된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 개시된 방법 및 조성물이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료가 본 방법 및 조성물의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특히 유용한 방법, 장치, 및 재료는 설명된 바와 같다. 본원에 인용된 간행물 및 여기 인용된 재료들은 참고자료로서 본원에 구체적으로 포함된다. 어느 것도 선행 발명으로 인하여 본 발명이 이러한 개시된 내용들에 선행하여 권리를 받지 못한다는 것을 시인하는 것은 아니어야 한다. 어떤 참고자료로 선행기술의 구성을 시인하는 것은 아니다. 참고자료에 관한 논의는 그것의 저자가 주장하는 것과 출원인이 인용된 문헌의 정확성 및 타당성에 도전할 권리를 예비한다는 것을 말한다. 많은 간행물들이 본원에 언급되었지만, 이러한 참고자료가 이들 문헌 중 어느 것도 본 분야의 공통 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 시인하는 것은 아니라는 점이 명확히 이해될 것이다.
본 명세서의 설명 부분 및 청구항 부분 전체에서, '포함한다(복수)'라는 단어와 '포함하는' 및 '포함한다(단수)'와 같은 이 단어의 변형태들은 '제한 없이 포함한다'라는 의미이며, 예를 들어 다른 첨가제, 성분, 완전체 또는 단계를 배제하는 것을 의도하지 않는다.
본원에서 사용된 '억제한다', '억제하는', 및 '억제'는 활성, 반응, 상태, 질환, 질병, 또는 다른 생물학적 변수를 저하시키는 것을 의미한다. 이것은, 제한은 없지만, 활성, 반응, 상태, 또는 질환의 완전한 상실을 포함할 수 있다. 또한, 이것은 자생 또는 대조군 레벨과 비교하여, 예를 들어 활성, 반응, 상태, 또는 질환의 10% 감소를 포함할 수 있다. 이와 같이, 감소는 자생 또는 대조군 레벨과 비교하여, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 이들 사이의 어떤 감소량일 수 있다.
E. 실시예
1. 실시예 1. 모세관확장증 돌연변이 운동실조(ATM)-중재된 DNA 손상 반응을 억제시키고 방사선민감성을 강화시킬 수 있는 NBS1 C-말단 펩티드의 특성확인
i. 재료 및 방법
세포 배양: 사람의 암 셀 라인 HeLa와 DU-145(ATCC, Manassas, VA), 및 사람의 SV-40 변형시킨 섬유아세포 셀 라인 GM9607(Corriell Cell Repositories, Camden, NJ)를 5% CO2 습도조절시킨 대기하에 DMEM-10% FBS 중에서 급격성장으로 유지시켰다.
펩티드 합성: 모든 펩티드는 Abgent(산디에고, CA)로 합성하고 생체내 검출을 위해 N-말단에 비오틴 태그로 라벨을 붙였다. 폴리아르기닌(R9) 내부이행 서열만을 함유한 펩티드, 사람 NBS1의 아미노산 735-744에 상응하는 야생형 NBS1 억제 펩티드(wtNIP) 그리고 사람 NBS1의 아미노산 735-744가 스크램블된 무작위 서열 펩티드(scNIP)의 3가지 펩티드가 산출되었다. 이들 펩티드들은 DMSO 중에 용해시켜 -20℃에 저장하였고 사용 전에 DMEM-10% 중에서 환원시켰다.
방사선 조사: X-RAD 320 방사선조사 캐비넷(정밀 X-선, East Haven, CT)을 20cm TSD의 0.8mm Sn + 0.25mm Cu + 1.5mm Al(HVL3.7 Cu) 필터로 320KV 및 160mA에서 3.4Gy/분 방사량으로 사용하였다. 모든 방사선조사는 표준 대기압 및 온도하에서 수행하였다.
면역침전 및 웨스턴 블롯팅: ATM, NBS1 및 MRE11의 공동-면역침전을 위해, 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 5mM EDTA, 0.5% NP-40, 5mM Na3VO4, 1mM NaF 및 1mM PMSF로 구성된 냉각 분해 완충액 중에서 셀을 1시간 동안 용해시켰다. 원심분리시킨 후, 상징물을 지시 항체로 인큐베이션시켰다. 분해 완충액으로 수차례 세정후, 특이 항체를 사용한 면역블롯으로 분석하였다. 웨스턴 블롯팅 분석을 위해, 4-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 샘플(셀 분해물 또는 면역침전물)을 분리하여 니트로셀룰로오스 막 위에 옮기고 여러 가지 항체들로 프로브하였다.
면역형광 현미경 검사: 세포가 급격하게 성장되는 배양액을 무균, 22cm2 커버슬립상에 플레이팅시키고, 실온에서 NIP 펩티드로 처리하여 5% CO2 습도조절시킨 공기중 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 커버슬립을 PBS로 세정하고 4% 파라포름알데히드-0.25% 트리톤 X-100으로 실온에서 15분 동안 고정시켜, 실온에서 30분동안 차단시키고, FITC-포합된 스트렙타비딘 또는 안티-H2AX 및 인산-NBS1 항체(Rockland Immunochemicals. Gilbertsville, PA)로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그리고나서 벡타쉴드 엘리트(Vector Labs. Burlingame, CA)를 이용하여 커버슬립을 세우고 레이카 형광 현미경으로 관찰하였다. 큐 이미징 레티가 엑시 카메라를 사용하여 40 배율로 상을 캡쳐해서 이미지 프로-플러스 5.1 소프트웨어로 분석하였다.
MTT 분석: 세포독성을 연구하기 위해, HeLa 또는 DU-145 셀을 급격하게 성장시키는 배양액을 포획하여, 완전 배지 중에서 96-웰 플레이트(5000 셀/웰)내에 플레이팅하여 밤새 인큐베이션시켰다. 다음날 포지티브 대조군으로서 NIP 펩티드(0, 5, 10, 20, 50 또는 100μM) 또는 택솔(0, 10, 50 또는 100μM)로 셀을 처리하였다. 마지막 과정으로, MTT 셀 생육성 분석(Promega Corp., Madison, WI)은 제조 가이드라인에 따라 수행하여 펩티드 세포독성을 결정하였다.
콜로니 형성 분석: 방사선민감성을 결정하기 위해, 콜로니 형성 분석을 병행하였다. 트리판 블루 중에서 혈구계를 카운팅하기에 앞서, 0.125% 트립신-0.05% EDTA로 세포를 포획하고, 펠렛화하여 1ml 신선배지 중에서 22g 니들로 재-현탁시켜 분산 응집시켰다. 그리고나서 셀을 극한 희석률로 6-웰 플레이트내에 플레이팅시키고 밤새 점착시켰다. PBS, R9, wtNIP 또는 scNIP 로 배양액을 1시간 동안 처리하고 방사선조사시켰다(0-6Gy). 방사선조사 후, 24시간까지 4시간마다 신선한 펩티드를 첨가하였다, 이때 배지는 펩티드-프리 배지로 대처하였다. 배양액을 10-12일동안 인큐베이션시키고, 포획하여 메탄올 중에서 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 정밀 현미경으로 콜로니 숫자를 결정하였다. ＞50 셀의 개체군을 하나의 콜로니로 카운팅하여, 그 콜로니 숫자를 비처리 모의 방사선조사 대조군 셀에 대한 백분율 값으로 나타내었다. 잔존 곡선은 선형회귀분석으로 플롯팅하였으며 D0 값은 방사량을 나타내고 37% 잔존율을 보였다. 다른 작은 분자 억제제에 대한 펩티드의 방사선 민감성 전위를 측정하기 위해, scNIP 또는 wtNIP 존재하에 잔존율을 37%로 감소시키는데 요구되는 방사량을 기준으로 민감성 강화율(SER)을 계산하였다. 계산식은 다음과 같다:
scNIP 처리세포에 대한 D0
SER =
wtNIP 처리세포에 대한 D0
통계: 통계치의 유효성을 확립하기 위해, 스튜던트 t-테스트를 병행하였다. 그 데이터를 0-60Gy의 방사량 범위에 걸쳐서 각 실험그룹과 먼저 맞춰보았다. 유효 범위는 p＜0.05이다.
i. 결과
C-말단 NBS1 억제 펩티드(NIP 융합 단백질)의 내재화 및 세포독성: C-말단 NBS1 도메인은 ATM에 대한 그 바인딩이 임계점이고, C-말단 20 잔기 부재 NBS1 절단 유도체는 생체내에서 ATM과 연계되지 않는다(Cerosaletti 및 Concannon, 2003, 2004; Falck et al., 2005; Cerosaletti et al., 2006). 게다가, NBS 셀중의 ATM 바인딩 도메인 부재 NBS1 변형유전자의 발현은 ATM 활성에 있어 극적 환원을 유도한다(Difilippantonio et al., 2005). ATM과 연계된 NBS1 억제가 방사선조사 후 적정치 이하의 ATM 활성을 유도하기 때문에, NBS1-ATM 상호작용은 방사선 민감성 증강물질을 발전시키는 새로운 목표가 될 수 있다. NBS1-ATM 상호작용을 억제시키기 위한 하나의 접근은 보존 C-말단 서열을 함유하는 작은 펩티드에 적용되며, 이것은 내인성 NBS1-ATM 상호작용에 필적될 수 있다(도면 1A). 따라서, 펩티드는 2개의 작용성 도메인을 함유하도록 설계된다: 하나는 NBS1-ATM 연계를 억제할 간섭 도메인이고, 다른 하나는 간섭 펩티드를 세포내로 이송시킬 내재화 도메인이다. 간섭 도메인으로, NBS1의 보존 C-말단 모티프를 함유하는 아미노산 서열이 사용되며 도면 1B에 나타냈다. 이 서열은 생체내 데이터에 있어 가장 짧은 ATM 바인딩 모티프를 함유한다. 내재화 도메인으로, 폴리아르기닌(R9) 서열이 사용된다. 폴리아르기닌 서열은 작은 펩티드와 단백질을 플라즈마 막을 가로질러 이송되는데 있어서 현저한 효과를 보이고 있다(Fuchs and Rains, 2004; Deshayes et al., 2005). R9-단독 및 사람 NBS1의 아미노산 735-744에 상응하는 wtNIP를 포함하여 3가지 펩티드를 생성하였다. 세 번째 펩티드는, 네거티브 대조군으로서 설계하였다. 무작위 서열 형성체를 사용하여 NBS1의 아미노산 735-744가 스크램블된 펩티드(scNIP)가 산출되도록 설계하였다. 이들 펩티드를 그 N 말단에 비오틴 태그로 레벨을 붙여 생체 내에서 검출하였다.
먼저, 펩티드의 내재화를 평가하였다. 펩티드로 처리한 세포는 플루오레신-포합된 스트렙타비딘 항체로 프로브하여 비오틴화된 펩티드의 존재를 측정하였다. 10μM 농도로 1시간 동안 처리한 HeLa 셀은 펩티드의 세포 흡수를 현저히 나타냈다(도면 2). R9, wtNIP, 및 scNIP 내재화는 세포질과 핵 칸막이로 국한되는 반면, DMEM만으로 처리한 대조군은 형광 신호를 나타냈다.
펩티드를 방사선 연구에 이용하여 옴으로써, 펩티드가 세포 중에 남는 시간을 측정하여 방사선조사 후에 DNA 복구 과정에 펩티드가 존재함을 확신하게 되었다. 도면 7에 나타낸 바와 같이, 펩티드로 인큐베이션시킨 직후, 모든 샘플 그룹에 펩티드가 존재함이 명백하다. 처리 2시간 내에, 세포는 R9, wtNIP 및 scNIP의 분포가 계속해서 강하게 나타나지만 wtNIP 및 scNIP의 형광 강도 레벨은 4시간 내에 줄어들기 시작하여 8시간까지 대폭 줄어든다. wtNIP 및 scNIP 강도가 더 약해지는 동안 R9 은 8 시간에서 조금씩 상승하였다. 이것은 R9 서열이 보다 더 쉽게 전위되고 분자 또는 펩티드와 커플링시키지 않을 때보다 더 오랫동안 남게 된다고 제안한 문헌과 일치된다(Jones et al., 2005). 12시간 후, R9 펩티드로 처리한 세포가 염색을 유지하고 있는 반면, wtNIP 또는 scNIP로 처리한 세포는 세포질 염색이 더 약해서 핵 염색도 관찰되지 않았다. 24시간 내에, R9로 처리한 세포는 세포질 염색을 보였지만 핵 시그날은 더 이상 볼 수 없었고, wtNIP 또는 scNIP로 처리한 세포는 펩티드 존재가 검출되지 않았다. 이러한 데이터는 NIP 펩티드가 최소한 4시간 동안 세포 내에 머무를 수 있음을 나타낸다. 이들 데이터는 방사선조사 처리 후 바로, 그리고 처음 24시간 동안 매 4-6시간에 NIP 펩티드를 첨가함으로써 최대 억제 효과를 성취할 수 있음을 보여준다.
다음으로, R9, wtNIP 및 scNIP의 시험관내 세포독성을 측정하였다. 96-웰 플레이트에 성장시킨 HeLa 셀을 펩티드(0, 5, 10, 50,또는 100μM) 또는 팩리탁셀(0, 10, 20, 50,또는 100μM)로 24시간 처리하였다. 처리 후, MTT 분석을 사용하여 세포 증식의 신진대사 지시제인 포름아잔 용해물을 측정하였다. 처리 후 72시간까지 성장 억제 또는 세포독성 효과가 보이지 않았으며(도면 2B), 이때 펩티드 양은 20μM 이하였다. MTT 분석으로 관찰된 세포독성을 기준으로, 이하 모든 실험에 10μM 농도를 선택하였다. 콜론 생존에 있어 10μM R9, wtNIP 및 scNIP의 효과는 처리 그룹들간에 뚜렷한 차이가 없었다(p＜0.05). 투여량 및 시간 경과 실험을 여러 개의 다른 셀 라인에 수행하였으며, 그 데이터로부터 상기 펩티드들이 빠르게 내재화되고 최소한의 세포독성을 나타내었음을 주목할 만하다.
NBS1-ATM 상호작용을 파기시키는 wtNIP: R9-포합된 NIP 펩티드가 NBS1-ATM 상호작용을 억제시킬 수 있는지 조사하기 위해, NIP 펩티드로 세포를 처리하여 공동면역침전 실험을 수행하였다. 펩티드 처리 후 4시간, HeLa 셀을 포획하여 항-NBS1 항체를 사용한 면역침전을 실시하였다. 그리고나서 항-ATM, NBS1 및 MRE11 항체로 면역침전물을 블롯팅하였다. 대조 세포에 비해 R9-처리 세포에서 정상 레벨의 ATM-NBS1 연계가 관찰되었다. 그러나, wtNIP-처리 세포에 있어, NBS1은 ATM 감소를 더 이상 가져올 수 없었다(도면 3). 더욱이, wtNIP는 오직 NBS1-ATM 상호작용에만 영향을 미쳤고 MRE11에 바인딩시킨 NBS1은 간섭하지 않았다. 반대로, scNIP는 NBS1-ATM 상호작용에 영향을 미치지 않았다. 방사선조사 처리한 세포에 있어, wtNIP는 방사선 조사하지 않는 세포에서와 유사한 효과를 나타냈다. 이러한 결과는 wtNIP가 DNA 손상의 존재 또는 부재하에서 NBS1-ATM 상호작용을 파기시킬 수 있음을 보여준다.
wtNIP는 IR-유도 -H2AX 및 NBS1 pSer343 초점 형성을 억제시킨다: IR-유도 DNA 손상에 대한 초기 반응 중 하나는 -H2AX 초점 형성이며, 이것은 작용성 ATM을 필요로 한다(Burma et al., 2001; Furuta et al., 2003). wtNIP는 NBS1-ATM 상호작용을 효과적으로 억제시키기 때문에, IR-유도 -H2AX 초점 형성이 펩티드에 의해 억제되어지는지 조사하였다. 면역형광 현미경검사는 R9, wtNIP 또는 scNIP 존재하에서 모의-방사선조사 또는 방사선조사 세포 중의-H2AX 초점의 존재를 검출하기 위해 사용하였다. R9이 -H2AX 초점 형성 억제를 나타내지 않았지만, wtNIP는 6Gy IR로 처리 후 30분에 -H2AX 초점 형성을 억제할 수 있다(도면 4). HeLa 셀 중의 -H2AX 초점/핵의 평균 수는 R9(42 초점/핵) 또는 scNIP(41 초점/핵)으로 처리한 세포 중에서 IR후 현저히 증가된 반면, wtNIP로 처리한 세포는 모의-방사선조사한 세포와 유사하게 평균 6.9 -H2AX 만을 나타내었다(도면 4). 유사한 결과가 DU-145 세포에서 관찰된 반면, R9 또는 scNIP 노출은 IR-유도 초점 형성에 영향을 미치지 않았으며 wtNIP는 H2AX 초점/핵을 현저히 감소시켰다(도면 8). 따라서, IR-유도 -H2AX 초점 형성은 wtNIP에 의해 억제될 수 있다.
더욱이 wtNIP가 ATM-배지된 DNA 손상 경로를 억제할 수 있다는 아이디어를 지지하기 위해, IR-유도 NBS1 초점 형성이 DSBs의 사이트에서 ATM-의존 프로세스로 고려될 수 있음(Lim et al.,)이 조사되었다. NBS1 초점은 세린 343상의 ATM-배지된 NBS1 포스포리레이션의 결과이다. 항-포스포-Ser343 NBS1 항체를 사용하여,R9 또는 scNIP로 처리된 것에 비해 wtNIP로 처리된 세포 중에서 NBS1 포스포리레이션을 현저히 억제시켰음이 관찰되었다(도면 5A 및 9A). 모의-방사선조사된 HeLa 셀 중의 초점평균 수는 R9, wtNIP 및 scNIP 각각 6, 8 및 6이었다. R9 또는 scNIP로 처리된 세포는 핵당 25 및 31 초점을 나타낸 반면, wtNIP로 처리된 세포는 6Gy IR로 처리한 후 핵당 6 초점만을 나타내었다(도면 5B).
NBS1과 -H2AX 포스포리레이션 둘다에 대한 백그라운드 초점 형성 수준이 낮았고, 이것은 정상적으로 성장하는 포유류 세포 성장중의 유사핵분열에 상관되어져 왔음을 주목하는 것이 중요하다(McManus and Hendzel, 2005).
wtNIP는 방사선 민감성을 증가시킨다: NIP 펩티드에 노출이 세포 방사선민감성을 증가시키는지의 여부는 콜로니 형성 분석을 사용하여 시험하였다. 도면 6A는 0 내지 6Gy의 투여 범위에 걸쳐 R9, wtNIP 또는 scNIP로 처리한 HeLa 셀에 대한 생존 곡선을 묘사한다. R9 이나 scNIP 둘 다 방사선민감성에 영향을 미치지 않는 반면, wtNIP는 IR-유도 생존을 현저히 감소시킬 수 있다.
2Gy로 처리 한 후, wtNIP로 처리한 세포의 생존율은 R9과 scNIP 처리 세포에 대한 52% 및 49.7%에 비해 31.4%였다. 4Gy에서, wtNIP로 처리한 세포의 생존율은 R9과 scNIP 처리 세포에 대한 11.8% 및 11.2%에 비해 4.5%로 감소한다. 투여량을 6Gy로 증가시킬 때 R9 또는 scNIP 처리 세포에 대한 5.3% 및 6.9%에 비해 wtNIP 처리 세포의 생존율이 1.7%로 적당히 감소되었다. wtNIP 처리 세포에 대한 강화제의 상대 효과 즉 민감제 강화율은 2, 4 및 6Gy에서 각각 1.66, 2.61 및 3.12이었다.
방사선 생존 곡선은 방사선민감성에 대한 NIP 효과의 효과를 나타내는 D0를 기준으로 특정 지웠다. D0는 37% 생존율에 요구되는 평균 치사량을 나타내며 세포의 고유 방사선민감성의 측정치이다. wtNIP로 처리한 HeLa에 대한 D0 값는 scNIP로 처리한 세포에 대한 3.0에 비해 1.9이었다. wtNIP-유도 방사선민감성의 통계 중요성을 확립하기 위해, 스튜던트 t-테스트(2개 샘플 쌍의 평균)를 병행하였다.데이터는 0 내지 6Gy 투여 범위에 걸쳐 각각 실험 그룹에 맞췄다. 콜론 생존에 있어 현저한 차이(p＜0.05)가 wtNIP 처리 세포와 DMEM, R9, 또는 scNIP 처리 세포 사이에서 관찰되었다. SER은 1.58이었다. 이것은 겜시타빈, 5-플루오로우라실, 펜톡시필린, 비노렐빈 그리고 일부 ATM-특이 방사선민감제를 포함한 다른 시험된 방사선민감제와 비교된다(Zhang et al., 1998; Lawrence et al., 2001; Rovinson and Shewach, 2001; Strunz et al., 2002; Collis et al., 2003; Zhang et al., 2004). 상기 관찰들은 1.46 SER을 갖는 전립선 암 셀 라인 DU-145에 있어 확실히 되어져 왔다. 전체적으로 볼때, wtNIP 펩티드의 방사선민감성 전위에 대한 강력한 증거를 제공한다.
wtNIP가 NBS1의 보존된 ATM 바인딩 서열을 함유하고, 그리고 이러한 서열은 또한 KU80의 ATR-상호작용 단백질, ATR과 DNA-PKcs 의 상호작용 단백질 각각에 보존되어 있기 때문에, ATR 또는 DNA-PKcs 도 억제할 수 있다(Abraham, 2001). 이러한 가능성을 시험하기 위해서, 결손 ATM(GM9607) 또는 DNA-PKcs(M059J)를 이용하여 셀 라인 중에서 콜로니형성 분석을 수행하였다. wtNIP 처리물이 1.83 SER을 갖는 M059J중의 방사선민감성을 증가시킬지라도, GM9607(도면 6D)는 방사선민감성 변화를 일으키지 않았다. GM9607 세포가 ATM-결손체이고 작용성 ATR과 DNA-PKcs를 갖기 때문에, 이러한 관찰은 wtNIP가 방사선민감성을 달성하기 위해 ATR이나 DNA-PKcs가 아닌 ATM을 특이적으로 목표할 수 있다는 점을 강력히 제시한다.
2. 실시예 2. 동물 연구
상기 펩티드의 생체 내 방사선민감성 효과를 마우스 종양 이종이식 모델 및 제브라피쉬 태아 모델로 시험한다. 종양 세포 중에 특이적으로 축적할 수 있는 종양-표적 NIP 펩티드를 투여하였다. 게다가 마우스 유방암 및 전립선암 이종이식 모델상에서 wtNIP 펩티드와 그들의 보존변종의 방사선민감성 효과를 확인하면서, 다음과 같은 질문을 다룬다: 1) NIP들이 어떻게 종양 세포에 특이적으로 방사선민감성을 갖는가; 2) 펩티드는 또한 어떻게 정상 조직에 방사선민감성을 갖는가; 3) 종양 소-혈관 밀도가 어떻게 방사선민감성 강화율에 영향을 미치는가; 그리고 4) 제브라피쉬 태아상에서 wtNIP 펩티드의 방사선민감성 효과는 무엇인가?
i. 마우스 모델
이종이식을 위한 NGR(종양 귀소 모티브) 포합된 융해 펩티드의 적정 레벨을 얻기 위해 필요한 경과 시간을 결정한다. 그리고나서 생쥐 이종이식 성장에 대한 방사선민감성 펩티드의 효과를 측정한다. 이를 달성하기 위해, 사람의 유방 및 전립선 종양 이종이식을 생쥐에게 전개시키고, 그 생쥐에게 펩티드를 주입시켜, 상기 펩티드가 적당한 시간 동안 이종이식 세포를 표적하도록 한다.
NGR-종양 귀소 모티프: 폴리아르기닌 서열은 융해된 NIP 펩티드에 대해 효과적인 내재화를 달성시킬 수 있다. 그러나, 상기 목표를 달성하기 위한 다른 접근법이 내재화와 종양 특이성 표적화 능력을 갖는 서열에 유용하다. 상기 펩티드 중 하나는 사이클릭 종양-귀소 펩티드, CNGRC(SEQ ID NO:11)을 포함한 NGT 모티프이다. NGT-함유 펩티드는 세포독성 제제, 프로-아폽톡틱 펩티드 및 종양 괴사 인자 를 종양 혈관계로 전달하는데 유용한 것으로 증명되어 왔다(Ellerby et al., 1999'; Arap et al., 2002; Curnis et al., 2002). 더욱 흥미롭게도, NGT 펩티드가 일차적으로 전립선 그리고 전이성 종양에 결합될 수 있지만, 정산 전립선 조직에는 결합하지 않는 것으로 보여져왔다(Pasqualini et al., 2000). 따라서 NGR 서열은 동물 연구에 있어 사용된다. NGR-단독, NGR-wtNIP 및 NGR-scNIP 3가지의 NGR-NIP 융해 펩티드를 합성하였다. NGR 서열은 종양 귀소 및 내재화 능력을 증명하는데 성공적으로 활용되어져 왔다.
MCF-7 및 PC-3 이종이식의 정착: MCF-7 유방암 및 PC-3 전립선암 이종이식을 정착시킨다. 특이 병원체를 갖지 않는 4-6 주 늙은 수컷 생쥐를 확보하여 박층 흐름 격리를 유지시킨 무균 필터가 탑재된 우리에서 키웠다. 생쥐에게 리비툼이 첨가된 음식과 물을 자동공급해주었다. 생쥐는 연구 프로토콜에 사용하기에 앞서 1주일 동안 순응시켰다. 동물을 포함한 모든 과정은 박층 흐름 후드 안에서 무균 조건하에 수행하였다. MCF-7 또는 PC-3 종양 세포(PBS중 마우스당 2×106 )는 의식을 잃은 누드 생쥐의 옆구리 내로 주입시켰다. 모든 실험에 있어서, 처리를 시작하기에 앞서 종양이 정착하여 성장하도록 하였다.
펩티드의 생체내 분포: 종양이 일단 약 100mm3에 달하게 되면, NGR-단독, NGR-wtNIP, 또는 NGR-scNIP 펩티드 0.5-2mg/kg 투여량으로 다음 2가지 경로 중 하나로 동물을 무작위 처리하였다: 복강내(ip) 또는 종양내 주입(it). 주입하고 0, 6, 12 또는 24시간 후에, 생쥐를 안락사시키고, 종양 조직 및 종양 조직을 둘러싸고 있는 정상 조직을 취하였다. 펩티드 주입 후 24시간 이상 혈액을 분리시켰다. FITC-포합된 스트렙타비딘 항체로 염색하여 유동-활성화 셀 소팅(FACS) 분석법으로 샘플을 검사하였다. 생쥐에게 펩티드를 주입하고 24시간 후에 비절제술을 시행하여 비장 세포를 분석하였다. 상기 실험은 얼마나 빨리 종양조직에 도달할 수 있고, 종양에 어느정도 머무를 수 있으며 또한 펩티드가 정상 조직에 축적될지의 여부에 따른 정보를 제공해준다. 종양 조직내에 펩티드의 국소화는 펩티드 주입 24시간 후에 종양 조직을 절제하여 분석하였다. 종양 조직편을 FITC-포합된 스트렙타비딘으로 여색하고, 면역형광 현미경 검사를 수행하였다.
방사선 전달: 이종이식은 PBS 함유 2×106 사람 MCF-7 또는 PC-3 암종 세포 0.1mg을 s.c. 주입으로 23G 바늘을 사용하여 생쥐의 옆구리에 심는다. 종양이 100mm3에 달하게 되면, 생쥐에게 펩티드를 복강내 또는 종양내 주입을 통해 무작위로 주입한다. 펩티드 노출 양 및 시간을 결정한다. 복강내 주입의 경우, 펩티드 부피는 20ml/kg 보다 적게 한다. 종양내 주입의 경우, 그 부피는 10ml/kg 보다 적게 한다. 다음으로 펩티드가 종양에 표적되도록 짧은 간격을 두고, 생쥐를 필터가 탑재된 케이지에 넣어 동물센터에서 방사선 방으로 이송시킨다. 방사선조사 단위는 정밀 X-RAD 320 방사선조사 시스템이다. 50cm 거리에서 방사선 조사 속도는 2.8Gy/분이며, 25cm 거리에서는 5.6Gy/분으로 한다. 단일 조사(10 또는 20Gy) 및 분할 조사(2Gy로 5회 또는 2Gy로 10회)를 수행한다. 분활 조사의 간격은 24시간이고 방사선조사 지속시간은 4분 미만으로 한다. 방사과정 동안에, 생쥐를 플라스 랩(Lansing, MI)의 깨끗한 플라스틱 마우스-제제 장치(튜브) 중에 잠깐 동안(5분 미만) 억제하여 방사에 의해 종양에 표적화될 수 있게 한다.
종양 방사선 반응 측정: 방사 후, 종양 부피를 일주일에 2차례 8주 미만으로 다이얼 캘리퍼를 사용하여 모니터링한다. 종양은 1000mm3이상 성장하거나 피부를 통해 발진되거나 궤양을 일으키지 않도록 한다. 상기 증세가 나타나면 안락사시킨다.종양 성장은 평균 종양 부피로 기록하고,π*( w*l*h)/2로 계산하며, 여기서 w는 폭, l은 길이, 그리고 h는 높이로 단위는 mm이다. 시간에 따른 종양 부피를 플롯팅하여 방사선치료후에 펩티드의 민감성 효고를 비교한다.
정상 조직 반응 측정: NGR-wtNIP 펩티드는 종양 세포에 특이적으로 표적화하려는 경향이 있으며, 임상에 있어 유용한 치료제로 평가되는 임계 도달점은 정상 조직 방사 반응에 어떻게 영향을 미치느냐에 달려있다. 방사 반응은 정상 조직에 반응하는 초기(피부) 및 후기(폐)를 조사한다. 이러한 조직은 수 은 암 타입, 특히 유방암 치료를 위한 방사 영역이기 때문에 선택하는 것이다. 두번째 이유는 피부 및 폐 방사 반응 평가를 위한 방법 및 표준을 세우기 위해서 선택하였다. 생쥐는 10Gy 방사선을 조사하기 전에 NGR-융합 펩티드로 처리한다. 피부 손상을 연구하기 위해서, 생쥐를 마취시키지 않고, 묶은 상태에서 오른쪽 발 뒤에 부분적으로 방사선을 조사한다. 마취를 피하기 위해서(혈액 흐름에 영향을 미칠 수 있으므로), 처치하는 동안 바른 자세에서 다리를 고정시키고 다리의 가장 윗부분에 억압 지그를 장치하고 히스토아그릴릭 글루를 소량 떨어뜨린다. 다리를 간단히 처치한 후 고통이 없도록 지그를 제거해준다. 생쥐는 11에서 30일 동안 매일 관찰하고 처치한 발에서 습윤 박리를 나타내는 각각의 치료 그룹에 있어 동물에 대한 백분율을 기록한다(Horsman et al., 1997). 폐 방사선 조사의 경우, 생쥐의 왼쪽 폐에 방사선을 조사할 때 흡입 일반 마취(이소플로오레인) 시킨다. 오른쪽 폐는 방사선 조사로부터 보호하여 네거티브 대조군으로 이용한다. 폐 손상을 추정하기 위해, 8개월 동안 생존해 있는 생쥐의 폐질환 조직구조 왼쪽 폐에 방사선 조사시킨 펩티드와 관련하여 연구한다. 양쪽 폐를 떼어내어 10% 포르말린에 24시간 동안 고정시키고 5-㎛-두께 편으로 절제하여, 유리판 위에 세워서 염색시킨다. 마손의 3색 염색법으로 염색하여 섬유증을 검출한다(Dileto and Travis. 1996).
ii. 제브라피쉬 태아 모델
제브라피쉬(Danio rerio)를 유일한 척추동물 모델로 이용하여 빠르고 효과적으로 치료제를 스크린 할 수 있는데, 왜냐하면 그들의 유전자 관계가 사람과 유사한 관계를 가지고 있으며, 번식력이 있고 소통성이 있으며, 태아기가 짧고, 관찰이 용이하고 직접 볼 수 있어서 이용하였다(Stern and Zon, 2003). 사람의 유전자와 관련된 2개의 제브라피쉬 유전자를 클론시킨다. 제브라쉬 ATM(zATM)(Garg et al., 2004) 및 제브라피쉬 NBS1(zNBS1, NCB1#AAW50708)은 사람의 파트너 hATN 및 hNBS1과 최소한 70% 상동하다. 제브라피쉬 태아 생육성의 시간에 따른 발전 및 투여량 의존성에 대한 몇몇 연구가 이온화 방사에 의해 조사되어졌다(Geiger et al.m 2006; Traver et al., 2004; Berghmans et al., 2005). 이들 연구는 제안된 NIP 펩티드의 방사선민감성 효율을 평가하기 위한 상기 시스템에 유용한 정보를 제공해준다.
태아 수확 및 유지: 와일드-타입 성인 제브라피쉬를 구하여 표준 조작 과정에 따라 유지시킨다. 제브라피쉬를 14시간 낮/10시간 밤 주기로 28.5℃에서 지내게 한다. 성인 물고기를 성별에 따라 격리시키고 태아 콜렉션 탱크에서 교미시킨다(Aquatic Habitats, Apopka, FL). 이렇게 양식시킨 태아를 모아서 곧바로 빛 주기로 돌리고 탱크 물 중에서 1mM NaCl로 페트리 접시로 옮긴다. 메틸렌블루를 무균상태에서 정기적으로 첨가한다(최종 0.5mg/L). 생존가능한 태아를 세정하고 1개 내지 2개-셀 스테이지(수정 후 약 0.5-1시간［hpf］)로 2ml 태아 배지 중에 분류(표준 12-웰 배양 플레이트에 10 배아/웰)하여, 보통의 여건하에서 25℃로 유지시켜 천천히 정상 전개시킨다. EM은 24-48 그리고 다시 72-96 hpf에서 데코리오네이션한 후 바꾼다.
태아 방사선조사 및 NGR-펩티드 노출: X-선 방사선조사(5, 10 또는 20Gy)를 단일로 실시하기 전에 2, 4, 6, 8 또는 24 hpf에서 태아를 다른 NGR-펩티드 투여량(10-50μM)에 1시간 동안 노출시킨다. 방사선조사 후에, 태아를 25℃에서 24시간 동안 인큐베이션시키고, 데코리오네이션한 후, 25℃에서 144시간 이상 유지시켜 형태 및 생존율을 평가한다. 폴리아르기닌 포합된 펩티드(R9, wtNIP 및 scNIP)와 NGR-포합된 펩티드(NGR-단독, NGR-wtNIP 및 NGR-scNIP) 둘 다를 실험으로 테스트한다는 점을 주목한다.
생존율 검사 및 형태학 분석: 각각의 태아의 생존율을 144 hpf 이상 번식시킨 시점에서부터 각 실험의 종말까지 계속해서 검사한다. 모든 관찰은 빛 현미경검사로 수행한다. 처음 24 hpf 동안, 생존율은 킴멜 등이 제시한 방법을 이용하여 적정 세포 분리 검정을 통해 결정한다(Kimmel et al., 1995). 24 hpf 후 심장 수축성으로 계속해서 생존해 있음을 정의한다. 생존율은 각 처리 그룹에 대한 태아의 전체 숫자에 대한 생육성 태아의 백분율로 계산하고 생존곡선은 3개의 다른 실험의 평균을 나타낸다. 방사선민감성 강화율은 분자에 NIP-펩티드 전처리된 태아 그리고 분모에 비-NIP-펩티드 전처리된 태아와의 생존율로서 계산한다. 조직구조 평가를 위해, 태아를 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 파라핀 중에 꽂아둔다. 샘플을 단편시켜서 조직 슬라이스(5㎛)를 H&E로 염색하고, 레이카 현미경 배율 ×40으로 평가하고, 큐 이미징 레티가 엑시 디지탈 카메라로 현상하여 이미지 프로 플러스 5.1 소프트웨어로 분석한다. 각 처리 그룹으로부터 최소한 20개의 태아를 평가하고, 실험은 3회 이상 반복한다.
3. 실시예 3. 높은 처리량 스크리닝(HTS)
높은 처리량 스크리닝(HTS)는 제제 발견 분야에 있어서 현저한 진보성을 가져오며, 화학 합성을 위한 거대한 라이브러리를 스크리닝할 수 있도록 만듦으로써 단백질-단백질 상호작용을 분열시키고 효소 활성을 억제할 수 있다(Fernandes, 1998; Sittampalam et al., 1997). HTS 분석 전개를 위한 실행가능한 접근법의 하나는 형광 분극(FP)으로, 거대한 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 세포-프리 기초 분석법이다(Roehrl et al., 2004). 형광 분극(FP) 분석은 분극 빛에 의해 여기되는 형광단을 이용하게 되며, 여기서 빛에 평형인 형광단만이 여기된다(Nasir and Jolley, 1999; Silverman et al., 1998). 분자의 회전 속도는 분자의 크기에 따라 다르며, 5000 Da 미만의 리간드가 현저하게 분극되어, 분자회전을 빠르게 하여 분극된 형광 신호를 방출한다. 매우 큰 사이즈(＞5000 Da) 분자의 경우, 빛을 소극시키기 위한 형광단의 성질이 현저히 감소되어, 분극 시그날의 증가를 초래한다(도면 10)(Sportsman et al., 2003; Thompson et al., 2002). FP HTS를 사용하여, 유유방암 관련된 유전자 BRCA1, Hsp90 및 Bcl-xL의 BRCT 도메인을 표적화하기 위해 억제제를 식별해 왔다(Howes et al., 2006; Kim et al., 2004; Qian et al., 2004).
FP 분석은 Southern Research Institute에서 전개시킨 화합물들(20K 화합물)의 라이브러리 및 CB2 라이브러리(100K) 그리고 상기 라이브러리로부터의 다양한 세트(10K 및 3K)를 스크리닝하는데 이용되어, NBS1-ATM 상호작용을 차단시킬 수 있는 화합물을 식별해낸다. NBS1 보존된 C-말단이 ATM중의 열 반복제(HR 2, a.a. 248-522 및 HR 7, a.a. 1436-1770) 시리즈에 바인딩하는 것이 증명되어진 이래(도면 1), GST-ATM 펩티드(수용체로서)와 NBS1 펩티드(추적체로서) 혼합물을 이용한 셀-프리 분석에 있어서 형광 분극 시그날 중의 변화가 검출됨으로써 FP 분석이 이루어진다. 통계적 실험 설계는 분석 확증에서 소개하겠다. 수용체 농도, 추적체 농도, 플레이트 타입, DMSO 내성 및 인큐베이션 시간을 포함한 몇몇 매개변수는 유효하고 최적이다.
i. 분석법 개발 및 최적화
GST-ATM 펩티드의 생성 및 정제: ATM의 HR2와 HR7을 함유하고 있는 정제된 GST 융합 단백질을 제조한다. GST-ATM 구성물을 생성하기 위해, 잔기 248 내지 1770 (GST-ATM)을 함유하는 글루타티온 S-트란스페라제 (GST)를 코드화하는 발현 벡터를, 사람 ATM cDNA의 상응하는 PCR 생성된 BamH10EcoR1 단편을 pGEX-2T (Amersham Bioscience)에 삽입함으로써 제조한다. GST-ATM 융합 단백질은 표준 GST-융합 펩티드 제조 방법에 의해 정제하고, 단백질 상동성을 SDS-PAGE에 의해 분석한다.
NBS1-ATM 결합에 미치는 텍사스 레드 표지화의 효과: 두 번째 단계는 NBS1 C-말단 펩티드 (a.a. 734-754)에 대한 텍사스 레드 (TR) 표지화에 대한 최적의 위치를 결정하는 것이다. TR을 플루오레신 대신에 선택하여 화합물 자체-형광으로 인해 발생할 수 있는 진위를 제거하였다. 먼저 N-말단 또는 C-말단에 대한 TR 표지화가 NBS1-ATM 결합에 영향을 미칠 수 있는지를 시험한다. ATM에 대한 3개의 결정적인 결합 부위 (736-737(EE), 7414-742(DD), 및 745-746(RY))를 포함하는 NBS1의 보존된 C-말단 서열 (QHAKEESKADDKFRYNPYLKRR, SEQ ID NO:3)을 결합 분석에 사용한다. TR 표지화가 ATM 결합을 파괴하지 않는 부위를 확인하기 위하여, 두 개의 펩티드를 펩티드의 N-말단 (TR-NBS1) 또는 C-말단 (NBS1-TR) 중 어느 한쪽에서 TR 표지를 사용하여 아래의 표 3에 나타내는 것과 같이 합성하였다. 그런 다음 해리 상수 K d를 각각의 표지된-펩티드에 대하여, GST-ATM 단백질의 농도를 증가시키면서 일정한 농도의 TR-표지된 펩티드 (100μM)를 적정함으로써 측정한다. GST 태그를 왼쪽에 두는데, 왜냐하면 편광화가 직접적으로는 단백질의 분자량에 관련되기 때문이다. 분석의 범위는 결합된 펩티드와 유리 펩티드 사이의 편광화의 차이에 의해 규정하고, K d값을 사용하여 TR 표지에 대한 최상의 위치를 측정한다.
표 3. FP-HTA 분석 개발에 사용된 펩티드
펩티드 서열 SEQ ID NO
TR-NBS1 TR-QHAKEESLADDLFRYNPYLKRR SEQ ID NO: 3
NBS1-TR QHAKEESLADDLFRYNPYLKRR-TR SEQ ID NO: 3
미표지된 wtNBS1 QHAKEESLADDLFRYNPYLKRR SEQ ID NO: 3
미표지된 mtNBS1 QHAKAASLAAALFAANPYLKRR SEQ ID NO: 13
NBS1-ATM 결합 친화력, FP 분석 안정성, 및 FP DMSO 내성: ATM에 결합하는 표지된 NBS1 펩티드의 능력을 측정하기 위하여, 경합을 토대로 한 분석을 표지된 펩티드 (표 1)와 동일한 길이를 가지는 미표지된 wtNBS1 펩티드를 사용하여 수행한다. 미표지된 NBS1 펩티드를 미표지된 NBS1 펩티드의 존재하에 ATM에 결합하는 표지된 NBS1 펩티드의 능력을 측정하기 위해 GST-ATM과 표지된 NBS1의 최적 농도 (상기에서와 같이 규정된다)로 적정(滴定)한다. 분석의 안정성은 FP 스크린의 결과를 결정하는 중요한 매개변수이다. NBS1-ATM 결합의 시간 경과 연구를 신호의 안정성을 측정하기 위해 통합시킨다. 결합 분석을 실온에서 12시간에 걸쳐 인큐베이션하는데, 그 시간 주기 동안 분석 플레이트를 4시간 간격으로 판독한다. 이 연구 결과, NBS1-ATM 복합체의 결합시간에 대한 식견이 생겼다. 선별 라이브러리에 있는 모든 화학적 화합물이 DMSO에 녹기 때문에, DMSO의 내성 (즉 펩티드-GST 융합 단백질 상호작용을 억제하지 않고 용액 중에 화합물을 유지하는 데 필요한 농도)을 시험하는 것은 고처리량 선별을 위한 FP 분석에서 최종 DMSO 농도를 측정하는 데 중요하다. 최종 농도가 0 내지 8% 범위인 DMSO를 각 웰에 첨가한 후 표지된 NBS1 펩티드와 GST-ATM을 첨가한다.
분석 성능 표시자의 생물통계학 분석: Z' 인자는 분석의 질과 적합성을 평가하고 (0 내지 1.0, 1.0은 최상의 분석이지만, 0.5 내지 1.0은 인내를 필요로 하는 분석으로 간주한다), 포지티브(p) 대조표준 및 네거티브(n) 대조표준 두 가지의 평균(μ) 및 표준편차 (σ)(μρ, μη, σρ, ση)를 토대로 한다. Z' 인자를 수립하기 위하여 FP 분석을 사용하는 경합 억제를 사용하여 효소 억제제 상수 K i를 수립할 것이다. K i값을 수립하기 위하여, 증가하는 농도 (0 내지 500μM)의 미표지된 NBS1 펩티드와 2μM의 표지된 NBS1 펩티드를 적절한 농도의 GST-ATM에 첨가한다. GST-ATM의 농도는 선행 실험에서 K d값으로부터 수립하는데 그 값은 최소한 1이어야 하며, 수용체 (ATM)와 표지된 NBS1 펩티드의 K d 사이의 비율을 토대로 한다. 이들 값으로부터, Z' 인자는 다음 식에 따라 계산한다:
Z' 인자=1-(3×(σρ-ση))/│μρ-μη│.
0.5보다 크거나 같은 Z' 인자는 FP 고처리량 선별을 허용할 수 있는 것으로 고려된다.
신호-대-잡음 비율 (S/N)은 또 다른 중요한 성능 표시이다. S/N은 10 또는 그것보다 큰 신호 대 잡음 비율이 허용되는 성능 수준인 경우의 비-특이적 결합 (NSB)의 크기를 정량하는 데 사용된다. 그러나 FP에서, S/N은 잡음이 비-특이적 결합의 크기에 의해 정량될 수 없기 때문에 사용할 수 없다. FP 분석에서는 미결합 트레이서가 존재하고 전체 NSB 신호가 그것을 NSB 신호 단독보다 더 크게 만드는데 기여한다. 그러므로 S/N 값은 미결합 트레이서가 제거되거나 결합된 트레이서와 구별되어야 하는 경우의 다른 분석과 비교하여 더 작다.
ii. HTS 및 히트의 타당화
Southern Research Institute에서 수립된 다양성 라이브러리 (20,000 화합물)와 캠브리지 라이브러리 (이 라이브러리에는 100,000 화합물+30,000 및 20,000 다양성 세트가 있다)를 10μμM TR-표지된 NBS1 펩티드와 최적 농도 (선행 실험에서 규정됨)의 GST-ATM이 첨가된 DMSO 용액 중의 10μM에서 15분 동안 실온에서 인큐베이션하여 선별하였다. 분석을 포지티브 억제 대조표준으로서 미표지된 wtNIP 펩티드를 사용하여 384 또는 1536-웰 플레이트에서 수행한다. 이 실험에서 확인된 히트를 연속적으로 희석하고, 분석을 반복한 후 K i값을 수립한다. 가장 낮은 K i값을 가지는 10개의 화합물을 선택하여 추가의 평가에 사용한다.
iii. 히트 화합물의 시험관 내 평가
일단 NBS1-ATM 상호작용을 가장 잘 억제할 수 있는 화합물이 확인되면, 이들 화합물을 조직 배양 모델로 시험한다. 먼저, 세포독성 및/또는 방사선 민감성 증강물질인 것으로 이미 알려져 있는 그런 화합물들을 확인하다. 공지된 이들 화합물은 추가의 시험관 내 연구에서 배제한다. 나머지 화합물들을 먼저, Hela, MCF-7 및 PC-3을 포함한 여러 종양 셀라인에서 MTT 분석과 콜로니 형성을 사용하여 세포독성에 대해 평가한다. 방사선 민감화 연구에 대해 세포독성을 나타내지 않는 화합물들을 선택한다. 방사선 민감화 분석은 방사선 유도된 생존을 평가하기 위하여 콜로니 형성 분석을 사용하여 수행한다. IR-유도된 γH2AX 및 NBS1 병소 형성을 화합물의 존재하에 평가한다.
4. 실시예 4. 방사선 민감성 증강펩티드의 유전자 전달
저산소증 종양 세포는 방사선에 극도로 내성을 나타내는 것으로 간주되므로, 방사선요법이 실패하도록 유도한다. 만약 wtNIP 방사선 민감성 펩티드가 저산소증 종양 조직에서 특이하게 발현될 수 있다면 그때에는 방사선요법에 의한 종양 제어의 극적인 증가가 예상된다. 이 목표를 이루기 위하여, 저산소증이 유발한 아데노바이러스 벡터가 제공되는데, 그 벡터는 저산소증 조직에서 wtNIP를 발현한다. 바이러스의 효능을 조직배양물에서나 동물 모델에서나 평가한다.
먼저 저산소증-반응 프로모터가 wtNIP 발현을 구동하는 발현 카세트를 제조한다. 두 개의 합성 올리고뉴클레오티드의 상보하는 쌍을 쥐의 포스포글리세레이트 키나제 I 5' 플랭킹 서열 (-307 에서 -290)로부터의 저산소증 반응 인핸서 요소를 토대로 NheI 부합성 단부를 사용하여 제조한다:
5' CTAGAGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGCATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGCATC 3' (SEQ ID NO:14)
3'TCAGCACGTCCTGCACTGTAGATCACAGCACGTCCGTAGATCACAGCACGTCCTGCACTGTAGGATC 5' (SEQ ID NO:15)
두 개의 올리고를 아닐링하여 이중가닥의 DNA를 형성하고 직접 pGL3-프로모터 벡터 (Promega, Madison, WI)의 NheI 부위에 클론한다. pGL3-프로모터 벡터는 SV40 염기성 프로모터를 가지며, SV40 염기성 프로모터와 조합된 저산소증 반응 인핸서의 구조는 리포터 유전자와 종양 자살 유전자를 저산소증 종양에서 특이하게 발현되게 한다. 그런 다음 또 다른 쌍의 올리고를 5' NcoI과 3' Xbal 부합성 부위들을 가지는 작은 펩티드 서열을 토대로 만들었다. 작은 펩티드 발현의 용이한 검출을 위해서 펩티드의 3' 단부에 연결된 His tag 서열을 고안한다. 올리고 서열은 다음과 같다:
5' CATGGAAGGAGGAAGCAGCCAAGGAGAAG/ACCACCACCACCACCACCAC/-3' (SEQ ID NO:16).
3' CTTCCTCCTTCGTCGGTTCCTCTTCT/GGTGGTGGTGGTGGTGGTG/GATC-5' (SEQ ID NO:17).
슬래쉬 사이의 서열은 6개의 히스티딘이 랜덤하게 반복된다. 이것을 이중 가닥 DNA에 아닐링한 후 단편을 직접 pGL-3 프로모터 벡터의 Nco I 및 Xbal 부위에 클론하여 원래의 루시페라제 리포터 유전자를 대체하였다. 그 결과의 구성물을 서열에 의해 확인한다. KpnI과 BamH1에 의해 방출된 전체 발현 카세트를 아데노바이러스 벡터 셔틀 플라스미드 (Plasmib, CA) 안에 결찰시킨다. 그런 다음 TU틀 벡터를 동종 재조합에 의하여 E1- 및 E3-결실된 pAdEasy-1 아데노바이러스 골격 벡터를 사용하여 재조합하여 패키지 가능한 Ad 유전자를 생성한다. 효율적인 재조합을 이루기 위하여, BJ5183 경합 박테리아를 일렉트로포레이션에 의해 형질전환하고, 정확한 클론 플라스미드, pAd5-저산소증-SIP2를 아데노바이러스 벡터 생성을 위해 선택한다. 아데노벡터를 제조하기 위해서는, 911개의 아데노바이러스 패키징 셀라인을 사용하고, 인산칼슘 침전에 의해서 형질전환한다. 생성된 벡터는 911 세포에서 증식한다. 세슘 클로라이드 구배 원심분리와 세파로스 CL-6B 칼럼 탈염을 수행하여 벡터 제제를 농축하고 정제한다.
벡터가 생성된 후에는 그것들이 NIP를 발현하는지의 여부를 시험하기 위하여 저산소증 사람 암세포 배양물에서 그것을 발현시킨다. 발현이 확인된 후에는 방사선 민감화 효과를 조사한다. 또한 바이러스를 마우스 이종이식편 모델에 주사하고, 생체 내에서의 방사선 민감화 효과를 평가한다.
B. 참고문헌
C. 서열 목록
본 발명은 방사선요법과 화학요법에 대해 암세포를 민감하게 하는 데 사용 하기 위한 조성물과 방법을 제공함으로써, 피부암, 유방암을 포함한 여러 암을 치료하는데 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> SOUTHERN RESEARCH INSTITUTE BO XU MICHAEL J. CARIVEAU <120> TARGETING NBSI - ATM INTERACTION TO SENSITIZE CANCER CELLS TO RADIOTHERAPY AND CHEMOTHERAPY <130> 19044.0065P1 <140> PCT/US07/022886 <141> 2007-10-30 <150> 60/863,457 <151> 2006-10-30 <160> 57 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 754 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 1 Met Trp Lys Leu Leu Pro Ala Ala Gly Pro Ala Gly Gly Glu Pro Tyr 1 5 10 15 Arg Leu Leu Thr Gly Val Glu Tyr Val Val Gly Arg Lys Asn Cys Ala 20 25 30 Ile Leu Ile Glu Asn Asp Gln Ser Ile Ser Arg Asn His Ala Val Leu 35 40 45 Thr Ala Asn Phe Ser Val Thr Asn Leu Ser Gln Thr Asp Glu Ile Pro 50 55 60 Val Leu Thr Leu Lys Asp Asn Ser Lys Tyr Gly Thr Phe Val Asn Glu 65 70 75 80 Glu Lys Met Gln Asn Gly Phe Ser Arg Thr Leu Lys Ser Gly Asp Gly 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Val Phe Gly Ser Lys Phe Arg Ile Glu Tyr Glu Pro 100 105 110 Leu Val Ala Cys Ser Ser Cys Leu Asp Val Ser Gly Lys Thr Ala Leu 115 120 125 Asn Gln Ala Ile Leu Gln Leu Gly Gly Phe Thr Val Asn Asn Trp Thr 130 135 140 Glu Glu Cys Thr His Leu Val Met Val Ser Val Lys Val Thr Ile Lys 145 150 155 160 Thr Ile Cys Ala Leu Ile Cys Gly Arg Pro Ile Val Lys Pro Glu Tyr 165 170 175 Phe Thr Glu Phe Leu Lys Ala Val Glu Ser Lys Lys Gln Pro Pro Gln 180 185 190 Ile Glu Ser Phe Tyr Pro Pro Leu Asp Glu Pro Ser Ile Gly Ser Lys 195 200 205 Asn Val Asp Leu Ser Gly Arg Gln Glu Arg Lys Gln Ile Phe Lys Gly 210 215 220 Lys Thr Phe Ile Phe Leu Asn Ala Lys Gln His Lys Lys Leu Ser Ser 225 230 235 240 Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Glu Ala Arg Leu Ile Thr Glu Glu Asn 245 250 255 Glu Glu Glu His Asn Phe Phe Leu Ala Pro Gly Thr Cys Val Val Asp 260 265 270 Thr Gly Ile Thr Asn Ser Gln Thr Leu Ile Pro Asp Cys Gln Lys Lys 275 280 285 Trp Ile Gln Ser Ile Met Asp Met Leu Gln Arg Gln Gly Leu Arg Pro 290 295 300 Ile Pro Glu Ala Glu Ile Gly Leu Ala Val Ile Phe Met Thr Thr Lys 305 310 315 320 Asn Tyr Cys Asp Pro Gln Gly His Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Thr 325 330 335 Thr Pro Gly Pro Ser Leu Ser Gln Gly Val Ser Val Asp Glu Lys Leu 340 345 350 Met Pro Ser Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Tyr Val Ala Asp Thr Glu 355 360 365 Ser Glu Gln Ala Asp Thr Trp Asp Leu Ser Glu Arg Pro Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Val Ser Lys Met Glu Gln Lys Phe Arg Met Leu Ser Gln Asp Ala 385 390 395 400 Pro Thr Val Lys Glu Ser Cys Lys Thr Ser Ser Asn Asn Asn Ser Met 405 410 415 Val Ser Asn Thr Leu Ala Lys Met Arg Ile Pro Asn Tyr Gln Leu Ser 420 425 430 Pro Thr Lys Leu Pro Ser Ile Asn Lys Ser Lys Asp Arg Ala Ser Gln 435 440 445 Gln Gln Gln Thr Asn Ser Ile Arg Asn Tyr Phe Gln Pro Ser Thr Lys 450 455 460 Lys Arg Glu Arg Asp Glu Glu Asn Gln Glu Met Ser Ser Cys Lys Ser 465 470 475 480 Ala Arg Ile Glu Thr Ser Cys Ser Leu Leu Glu Gln Thr Gln Pro Ala 485 490 495 Thr Pro Ser Leu Trp Lys Asn Lys Glu Gln His Leu Ser Glu Asn Glu 500 505 510 Pro Val Asp Thr Asn Ser Asp Asn Asn Leu Phe Thr Asp Thr Asp Leu 515 520 525 Lys Ser Ile Val Lys Asn Ser Ala Ser Lys Ser His Ala Ala Glu Lys 530 535 540 Leu Arg Ser Asn Lys Lys Arg Glu Met Asp Asp Val Ala Ile Glu Asp 545 550 555 560 Glu Val Leu Glu Gln Leu Phe Lys Asp Thr Lys Pro Glu Leu Glu Ile 565 570 575 Asp Val Lys Val Gln Lys Gln Glu Glu Asp Val Asn Val Arg Lys Arg 580 585 590 Pro Arg Met Asp Ile Glu Thr Asn Asp Thr Phe Ser Asp Glu Ala Val 595 600 605 Pro Glu Ser Ser Lys Ile Ser Gln Glu Asn Glu Ile Gly Lys Lys Arg 610 615 620 Glu Leu Lys Glu Asp Ser Leu Trp Ser Ala Lys Glu Ile Ser Asn Asn 625 630 635 640 Asp Lys Leu Gln Asp Asp Ser Glu Met Leu Pro Lys Lys Leu Leu Leu 645 650 655 Thr Glu Phe Arg Ser Leu Val Ile Lys Asn Ser Thr Ser Arg Asn Pro 660 665 670 Ser Gly Ile Asn Asp Asp Tyr Gly Gln Leu Lys Asn Phe Lys Lys Phe 675 680 685 Lys Lys Val Thr Tyr Pro Gly Ala Gly Lys Leu Pro His Ile Ile Gly 690 695 700 Gly Ser Asp Leu Ile Ala His His Ala Arg Lys Asn Thr Glu Leu Glu 705 710 715 720 Glu Trp Leu Arg Gln Glu Met Glu Val Gln Asn Gln His Ala Lys Glu 725 730 735 Glu Ser Leu Ala Asp Asp Leu Phe Arg Tyr Asn Pro Tyr Leu Lys Arg 740 745 750 Arg Arg <210> 2 <211> 4406 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 2 ttcggcacga ggcgcggttg cacgtcggcc ccagccctga ggagccggac cgatgtggaa 60 actgctgccc gccgcgggcc cggcaggagg agaaccatac agacttttga ctggcgttga 120 gtacgttgtt ggaaggaaaa actgtgccat tctaattgaa aatgatcagt cgatcagccg 180 aaatcatgct gtgttaactg ctaacttttc tgtaaccaac ctgagtcaaa cagatgaaat 240 ccctgtattg acattaaaag ataattctaa gtatggtacc tttgttaatg aggaaaaaat 300 gcagaatggc ttttcccgaa ctttgaagtc gggggatggt attacttttg gagtgtttgg 360 aagtaaattc agaatagagt atgagccttt ggttgcatgc tcttcttgtt tagatgtctc 420 tgggaaaact gctttaaatc aagctatatt gcaacttgga ggatttactg taaacaattg 480 gacagaagaa tgcactcacc ttgtcatggt atcagtgaaa gttaccatta aaacaatatg 540 tgcactcatt tgtggacgtc caattgtaaa gccagaatat tttactgaat tcctgaaagc 600 agttcagtcc aagaagcagc ctccacaaat tgaaagtttt tacccacctc ttgatgaacc 660 atctattgga agtaaaaatg ttgatctgtc aggacggcag gaaagaaaac aaatcttcaa 720 agggaaaaca tttatatttt tgaatgccaa acagcataag aaattgagtt ccgcagttgt 780 ctttggaggt ggggaagcta ggttgataac agaagagaat gaagaagaac ataatttctt 840 tttggctccg ggaacgtgtg ttgttgatac aggaataaca aactcacaga ccttaattcc 900 tgactgtcag aagaaatgga ttcagtcaat aatggatatg ctccaaaggc aaggtcttag 960 acctattcct gaagcagaaa ttggattggc ggtgattttc atgactacaa agaattactg 1020 tgatcctcag ggccatccca gtacaggatt aaagacaaca actccaggac caagcctttc 1080 acaaggcgtg tcagttgatg aaaaactaat gccaagcgcc ccagtgaaca ctacaacata 1140 cgtagctgac acagaatcag agcaagcaga tacatgggat ttgagtgaaa ggccaaaaga 1200 aatcaaagtc tccaaaatgg aacaaaaatt cagaatgctt tcacaagacg cacccactgt 1260 aaaggagtcc tgcaaaacaa gctctaataa taatagtatg gtatcaaata ctttggctaa 1320 gatgagaatc ccaaactatc agctttcacc aactaaattg ccaagtataa ataaaagtaa 1380 agatagggct tctcagcagc agcagaccaa ctccatcaga aactactttc agccgtctac 1440 caaaaaaagg gaaagggatg aagaaaatca agaaatgtct tcatgcaaat cagcaagaat 1500 agaaacgtct tgttctcttt tagaacaaac acaacctgct acaccctcat tgtggaaaaa 1560 taaggagcag catctatctg agaatgagcc tgtggacaca aactcagaca ataacttatt 1620 tacagataca gatttaaaat ctattgtgaa aaattctgcc agtaaatctc atgctgcaga 1680 aaagctaaga tcaaataaaa aaagggaaat ggatgatgtg gccatagaag atgaagtatt 1740 ggaacagtta ttcaaggaca caaaaccaga gttagaaatt gatgtgaaag ttcaaaaaca 1800 ggaggaagat gtcaatgtta gaaaaaggcc aaggatggat atagaaacaa atgacacttt 1860 cagtgatgaa gcagtaccag aaagtagcaa aatatctcaa gaaaatgaaa ttgggaagaa 1920 acgtgaactc aaggaagact cactatggtc agctaaagaa atatctaaca atgacaaact 1980 tcaggatgat agtgagatgc ttccaaaaaa gctgttattg actgaattta gatcactggt 2040 gattaaaaac tctacttcca gaaatccgtc tggcataaat gatgattatg gtcaactaaa 2100 aaatttcaag aaattcaaaa aggtcacata tcctggagca ggaaaacttc cacacatcat 2160 tggaggatca gatctaatag ctcatcatgc tcgaaagaat acagaactag aagagtggct 2220 aaggcaggaa atggaggtac aaaatcaaca tgcaaaagaa gagtctcttg ctgatgatct 2280 ttttagatac aatccttatt taaaaaggag aagataactg aggattttaa aaagaagcca 2340 tggaaaaact tcctagtaag catctacttc aggccaacaa ggttatatga atatatagtg 2400 tatagaagcg atttaagtta caatgtttta tggcctaaat ttattaaata aaatgcacaa 2460 aactttgatt cttttgtatg taacaattgt ttgttctgtt ttcaggcttt gtcattgcat 2520 ctttttttca tttttaaatg tgttttgttt attaaatagt taatatagtc acagttcaaa 2580 attctaaatg tacgtaaggt aaagactaaa gtcacccttc caccattgtc ctagctactt 2640 ggttcccctc agaaaaaaat tcatgatact catttcttat gaatctttcc agggattttt 2700 gagtcctatt caaattccta tttttaaata atttcctaca caaatgatag cataacatat 2760 gcagtgttct acaccttgct tttttactta gtagattaaa aattatagga atatcaatat 2820 aatgttttta atattttttc ttttccatta tgctgtagtc ttacctaaac tctggtgatc 2880 caaacaaaat ggcttcagtg gtgcagatgt cacctacatg ttattctagt actagaaact 2940 gaagaccatg tggagacttc atcaaacatg ggtttagttt tcaccagaat ggaaagacct 3000 gtaccccttt ttggtggtct tactgagctg ggtgggtgtc tgttttgagc ttatttagag 3060 tcctagtttt cctacttata aagtagaaat ggtgagattg ttttcttttt ctaccttaaa 3120 gggagatggt aagaaacaat gaatgtcttt tttcaaactt tattgacaag tgattttcaa 3180 gtctgtgttc aaaaatatat tcatgtacct gtgatccagc aagaagggag ttccagtcaa 3240 gagtcactac aactgattag ttgtttagag aatgagaaat ggaacagtga ggaatggagg 3300 ccatatttcc atgacttccc ttgtaaacag aagcaacaga agggacaaga ggctggcctc 3360 tacatcactc tcaccttcca aatcttgtgg aagtgcatct acttgccaga accaaattaa 3420 cttacttcca agttctggct gcttgcaggt ggaactccag ctgcaaggga gttagggaaa 3480 tgaaggtctt tttttaaaag cttctcagcc ttcctaggga acagaaattg ggtgagccaa 3540 tctgcaattt ctactacagg cattgagacc agttagatta ttgaaatatt atagagagtt 3600 atgaacactt aaattatgat agtggtatga cattggatag aacatgggat actttagaag 3660 tagaattgac agggcatatt agttgatgaa atggagtcat ttgagtctct taatagccat 3720 gtatcataat taccaagtga agctggtgga acatatggtc tccattttac agttaaggaa 3780 tataatggac agattaatat tgttctctgt catgcccaca atccctttct aaggaagact 3840 gccctactat agcagttttt atatttgtca atttatgaat ataatgaatg aggagttctg 3900 gtacctcctg tctttacaaa tattgggtgt tgtccagtat ttttcccttt ttaaccattc 3960 caatcggtgt gtagtgatgt ttcattttgg ttttaatttg tatatccctg atagctataa 4020 ttgggtcata gaaattcttt atacattcta gatgcaagtc tcttgtcgga tatatgtatt 4080 gagatattac acctagtctg tggcttgact gttttcttta tgtcttttga tgaatagaag 4140 ttttaaattt tgacaaggtc aaatttattt ttttcttttg tttgatattt tttctctcca 4200 atttaacccc aagatttcag atattctgct ctattatata aactttatat ttttatattt 4260 gtgatctacc ttgaattgat atgtatgttg tgaattatgg atcagggttc tttttttccc 4320 ccatacaagt atccagtcat tgtaacactg tttattgaaa gaattatcct ttcctcatta 4380 aattaccttg ccaattagtc tcgtgc 4406 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 3 Gln His Ala Lys Glu Glu Ser Leu Ala Asp Asp Leu Phe Arg Tyr Asn 1 5 10 15 Pro Tyr Leu Lys Arg Arg 20 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 4 Glu Glu Ser Leu Ala Asp Asp Leu Phe Arg Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 5 Glu Glu Asp Asp Arg Tyr 1 5 <210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 17 ctaggtggtg gtggtggtgg tggtcttctc cttggctgct tcctccttc 49 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 18 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 19 Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Lys Pro Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 20 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 21 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 22 Arg Gln Ile Ala Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Ala Ala 1 5 10 15 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 23 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 24 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 25 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 25 Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Lys 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 26 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 1 5 10 15 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Arg Arg Arg Arg Arg Val Phe Glu Glu Gly Gly Asp 1 5 10 15 Val Asp Asp Leu Leu Asp Met Ile 20 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 41 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Val Phe Glu Glu Gly Gly Asp 1 5 10 15 Val Asp Asp Leu 20 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 42 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Glu Glu Gly Gly Asp Val Asp 1 5 10 15 Asp Leu <210> 43 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 43 caacatgcaa aagaagagtc tcttgctgat gatcttttta gatacaatcc ttatttaaaa 60 aggagaagat aa 72 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 44 gaagagtctc ttgctgatga tctttttaga tac 33 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 45 gaagaggatg atagctac 18 <210> 46 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 46 tgtgaagagg cagccctgga tgacctctgt gccgcggaa 39 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 47 tgtgaagagg cagccctgga tgacctc 27 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 48 gtatttgaag aaggtggtga tgtggacgat ttattggaca tgata 45 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 49 gtatttgaag aaggtggtga tgtggacgat tta 33 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 50 gaagaaggtg gtgatgtgga cgattta 27 <210> 51 <211> 3056 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Cys Glu Val Lys Thr Asp Phe Cys Gln Thr 1825 1830 1835 1840 Val Leu Pro Tyr Leu Ile His Asp Ile Leu Leu Gln Asp Thr Asn Glu 1845 1850 1855 Ser Trp Arg Asn Leu Leu Ser Thr His Val Gln Gly Phe Phe Thr Ser 1860 1865 1870 Cys Leu Arg His Phe Ser Gln Thr Ser Arg Ser Thr Thr Pro Ala Asn 1875 1880 1885 Leu Asp Ser Glu Ser Glu His Phe Phe Arg Cys Cys Leu Asp Lys Lys 1890 1895 1900 Ser Gln Arg Thr Met Leu Ala Val Val Asp Tyr Met Arg Arg Gln Lys 1905 1910 1915 1920 Arg Pro Ser Ser Gly Thr Ile Phe Asn Asp Ala Phe Trp Leu Asp Leu 1925 1930 1935 Asn Tyr Leu Glu Val Ala Lys Val Ala Gln Ser Cys Ala Ala His Phe 1940 1945 1950 Thr Ala Leu Leu Tyr Ala Glu Ile Tyr Ala Asp Lys Lys Ser Met Asp 1955 1960 1965 Asp Gln Glu Lys Arg Ser Leu Ala Phe Glu Glu Gly Ser Gln Ser Thr 1970 1975 1980 Thr Ile Ser Ser Leu Ser Glu Lys Ser Lys Glu Glu Thr Gly Ile Ser 1985 1990 1995 2000 Leu Gln Asp Leu Leu Leu Glu Ile Tyr Arg Ser Ile Gly Glu Pro Asp 2005 2010 2015 Ser Leu Tyr Gly Cys Gly Gly Gly Lys Met Leu Gln Pro Ile Thr 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Leu Glu Ile Leu Met Glu Lys Glu Met Asp 2225 2230 2235 2240 Asn Ser Gln Arg Glu Cys Ile Lys Asp Ile Leu Thr Lys His Leu Val 2245 2250 2255 Glu Leu Ser Ile Leu Ala Arg Thr Phe Lys Asn Thr Gln Leu Pro Glu 2260 2265 2270 Arg Ala Ile Phe Gln Ile Lys Gln Tyr Asn Ser Val Ser Cys Gly Val 2275 2280 2285 Ser Glu Trp Gln Leu Glu Glu Ala Gln Val Phe Trp Ala Lys Lys Glu 2290 2295 2300 Gln Ser Leu Ala Leu Ser Ile Leu Lys Gln Met Ile Lys Lys Leu Asp 2305 2310 2315 2320 Ala Ser Cys Ala Ala Asn Asn Pro Ser Leu Lys Leu Thr Tyr Thr Glu 2325 2330 2335 Cys Leu Arg Val Cys Gly Asn Trp Leu Ala Glu Thr Cys Leu Glu Asn 2340 2345 2350 Pro Ala Val Ile Met Gln Thr Tyr Leu Glu Lys Ala Val Glu Val Ala 2355 2360 2365 Gly Asn Tyr Asp Gly Glu Ser Ser Asp Glu Leu Arg Asn Gly Lys Met 2370 2375 2380 Lys Ala Phe Leu Ser Leu Ala Arg Phe Ser Asp Thr Gln Tyr Gln Arg 2385 2390 2395 2400 Ile Glu Asn Tyr Met Lys Ser Ser Glu Phe Glu Asn Lys Gln Ala Leu 2405 2410 2415 Leu Lys Arg Ala Lys Glu Glu Val Gly Leu Leu Arg Glu His Lys Ile 2420 2425 2430 Gln Thr Asn Arg Tyr Thr Val Lys Val Gln Arg Glu Leu Glu Leu Asp 2435 2440 2445 Glu Leu Ala Leu Arg Ala Leu Lys Glu Asp Arg Lys Arg Phe Leu Cys 2450 2455 2460 Lys Ala Val Glu Asn Tyr Ile Asn Cys Leu Leu Ser Gly Glu Glu His 2465 2470 2475 2480 Asp Met Trp Val Phe Arg Leu Cys Ser Leu Trp Leu Glu Asn Ser Gly 2485 2490 2495 Val Ser Glu Val Asn Gly Met Met Lys Arg Asp Gly Met Lys Ile Pro 2500 2505 2510 Thr Tyr Lys Phe Leu Pro Leu Met Tyr Gln Leu Ala Ala Arg Met Gly 2515 2520 2525 Thr Lys Met Met Gly Gly Leu Gly Phe His Glu Val Leu Asn Asn Leu 2530 2535 2540 Ile Ser Arg Ile Ser Met Asp His Pro His His Thr Leu Phe Ile Ile 2545 2550 2555 2560 Leu Ala Leu Ala Asn Ala Asn Arg Asp Glu Phe Leu Thr Lys Pro Glu 2565 2570 2575 Val Ala Arg Arg Ser Arg Ile Thr Lys Asn Val Pro Lys Gln Ser Ser 2580 2585 2590 Gln Leu Asp Glu Asp Arg Thr Glu Ala Ala Asn Arg Ile Ile Cys Thr 2595 2600 2605 Ile Arg Ser Arg Arg Pro Gln Met Val Arg Ser Val Glu Ala Leu Cys 2610 2615 2620 Asp Ala Tyr Ile Ile Leu Ala Asn Leu Asp Ala Thr Gln Trp Lys Thr 2625 2630 2635 2640 Gln Arg Lys Gly Ile Asn Ile Pro Ala Asp Gln Pro Ile Thr Lys Leu 2645 2650 2655 Lys Asn Leu Glu Asp Val Val Val Pro Thr Met Glu Ile Lys Val Asp 2660 2665 2670 His Thr Gly Glu Tyr Gly Asn Leu Val Thr Ile Gln Ser Phe Lys Ala 2675 2680 2685 Glu Phe Arg Leu Ala Gly Gly Val Asn Leu Pro Lys Ile Ile Asp Cys 2690 2695 2700 Val Gly Ser Asp Gly Lys Glu Arg Arg Gln Leu Val Lys Gly Arg Asp 2705 2710 2715 2720 Asp Leu Arg Gln Asp Ala Val Met Gln Gln Val Phe Gln Met Cys Asn 2725 2730 2735 Thr Leu Leu Gln Arg Asn Thr Glu Thr Arg Lys Arg Lys Leu Thr Ile 2740 2745 2750 Cys Thr Tyr Lys Val Val Pro Leu Ser Gln Arg Ser Gly Val Leu Glu 2755 2760 2765 Trp Cys Thr Gly Thr Val Pro Ile Gly Glu Phe Leu Val Asn Asn Glu 2770 2775 2780 Asp Gly Ala His Lys Arg Tyr Arg Pro Asn Asp Phe Ser Ala Phe Gln 2785 2790 2795 2800 Cys Gln Lys Lys Met Met Glu Val Gln Lys Lys Ser Phe Glu Glu Lys 2805 2810 2815 Tyr Glu Val Phe Met Asp Val Cys Gln Asn Phe Gln Pro Val Phe Arg 2820 2825 2830 Tyr Phe Cys Met Glu Lys Phe Leu Asp Pro Ala Ile Trp Phe Glu Lys 2835 2840 2845 Arg Leu Ala Tyr Thr Arg Ser Val Ala Thr Ser Ser Ile Val Gly Tyr 2850 2855 2860 Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Val Gln Asn Ile Leu Ile Asn Glu 2865 2870 2875 2880 Gln Ser Ala Glu Leu Val His Ile Asp Leu Gly Val Ala Phe Glu Gln 2885 2890 2895 Gly Lys Ile Leu Pro Thr Pro Glu Thr Val Pro Phe Arg Leu Thr Arg 2900 2905 2910 Asp Ile Val Asp Gly Met Gly Ile Thr Gly Val Glu Gly Val Phe Arg 2915 2920 2925 Arg Cys Cys Glu Lys Thr Met Glu Val Met Arg Asn Ser Gln Glu Thr 2930 2935 2940 Leu Leu Thr Ile Val Glu Val Leu Leu Tyr Asp Pro Leu Phe Asp Trp 2945 2950 2955 2960 Thr Met Asn Pro Leu Lys Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Arg Pro Glu Asp 2965 2970 2975 Glu Thr Glu Leu His Pro Thr Leu Asn Ala Asp Asp Gln Glu Cys Lys 2980 2985 2990 Arg Asn Leu Ser Asp Ile Asp Gln Ser Phe Asp Lys Val Ala Glu Arg 2995 3000 3005 Val Leu Met Arg Leu Gln Glu Lys Leu Lys Gly Val Glu Glu Gly Thr 3010 3015 3020 Val Leu Ser Val Gly Gly Gln Val Asn Leu Leu Ile Gln Gln Ala Ile 3025 3030 3035 3040 Asp Pro Lys Asn Leu Ser Arg Leu Phe Pro Gly Trp Lys Ala Trp Val 3045 3050 3055 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 52 Ala Lys Glu Glu Ser Leu Ala Asp Asp Leu Phe Arg Tyr Asn 1 5 10 <210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 53 Lys Glu Glu Ser Leu Ala Asp Asp Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 54 Ser Asp Ala Asp Leu Glu Glu Leu Lys 1 5 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <220> <221> VARIANT <222> 1, 4-6, 10 <223> Xaa = any amino acid <400> 55 Xaa Glu Glu Xaa Xaa Xaa Asp Asp Leu Xaa 1 5 10 <210> 56 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 56 Arg Val Cys Glu Leu Gly Asp Glu Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Ile 1 5 10 15 Trp Thr Gln His Arg Leu Asn Asp Ser Leu Lys Glu Val Ile Ile Glu 20 25 30 Leu Phe Gln Leu Gln Ile Tyr Ile His His Pro Lys Gly Ala Lys Thr 35 40 45 Gln Glu Lys Gly Ala Tyr Glu Ser Thr Lys Trp Arg Ser Ile Leu Tyr 50 55 60 Asn Leu Tyr Asp Leu Leu Val Asn Glu Ile Ser His Ile Gly Ser Arg 65 70 75 80 Gly Lys Tyr Ser Ser Gly Phe Arg Asn Ile Ala Val Lys Glu Asn Leu 85 90 95 Ile Glu Leu Met Ala Asp Ile Cys His Gln Val Phe Asn Glu Asp Thr 100 105 110 Arg Ser Leu Glu Ile Ser Gln Ser Tyr Thr Thr Thr Gln Arg Glu Ser 115 120 125 Ser Asp Tyr Ser Val Pro Cys Lys Arg Lys Lys Ile Glu Leu Gly Trp 130 135 140 Glu Val Ile Lys Asp His Leu Gln Lys Ser Gln Asn Asp Phe Asp Leu 145 150 155 160 Val Pro Trp Leu Gln Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser Lys Tyr Pro Ala 165 170 175 Ser Leu Pro Asn Cys Glu Leu Ser Pro Leu Leu Met Ile Leu Ser Gln 180 185 190 Leu Leu Pro Gln Gln Arg His Gly Glu Arg Thr Pro Tyr Val Leu Arg 195 200 205 Cys Leu Thr Glu Val Ala Leu Cys Gln Asp Lys Arg Ser Asn Leu Glu 210 215 220 Ser Ser Gln Lys Ser Asp Leu Leu Lys Leu Trp Asn Lys Ile Trp Cys 225 230 235 240 Ile Thr Phe Arg Gly Ile Ser Ser Glu Gln Ile Gln Ala Glu Asn Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ile Gln Gly Ser Leu Val Glu Val Asp Arg 260 265 270 Glu <210> 57 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence = Synthetic Construct <400> 57 His Arg Ile Leu Lys Ile Tyr His Leu Phe Val Ser Leu Leu Leu Lys 1 5 10 15 Asp Ile Lys Ser Gly Leu Gly Gly Ala Trp Ala Phe Val Leu Arg Asp 20 25 30 Val Ile Tyr Thr Leu Ile His Tyr Ile Asn Gln Arg Pro Ser Cys Ile 35 40 45 Met Asp Val Ser Leu Arg Ser Phe Ser Leu Cys Cys Asp Leu Leu Ser 50 55 60 Gln Val Cys Gln Thr Ala Val Thr Tyr Cys Lys Asp Ala Leu Glu Asn 65 70 75 80 His Leu His Val Ile Val Gly Thr Leu Ile Pro Leu Val Tyr Glu Gln 85 90 95 Val Glu Val Gln Lys Gln Val Leu Asp Leu Leu Lys Tyr Leu Val Ile 100 105 110 Asp Asn Lys Asp Asn Glu Asn Leu Tyr Ile Thr Ile Lys Leu Leu Asp 115 120 125 Pro Phe Pro Asp His Val Val Phe Lys Asp Leu Arg Ile Thr Gln Gln 130 135 140 Lys Ile Lys Tyr Ser Arg Gly Pro Phe Ser Leu Leu Glu Glu Ile Asn 145 150 155 160 His Phe Leu Ser Val Ser Val Tyr Asp Ala Leu Pro Leu Thr Arg Leu 165 170 175 Glu Gly Leu Lys Asp Leu Arg Arg Gln Leu Glu Leu His Lys Asp Gln 180 185 190 Met Val Asp Ile Met Arg Ala Ser Gln Asp Asn Pro Gln Asp Gly Ile 195 200 205 Met Val Lys Leu Val Val Asn Leu Leu Gln Leu Ser Lys Met Ala Ile 210 215 220 Asn His Thr Gly Glu Lys Glu Val Leu Glu Ala Val Gly Ser Cys Leu 225 230 235 240 Gly Glu Val Gly Pro Ile Asp Phe Ser Thr Ile Ala Ile Gln His Ser 245 250 255 Lys Asp Ala Ser Tyr Thr Lys Ala Leu Lys Leu Phe Glu Asp Lys Glu 260 265 270 Leu Gln Trp Thr Phe Ile Met Leu Thr Tyr Leu Asn Asn Thr Leu Val 275 280 285 Glu Asp Cys Val Lys Val Arg Ser Ala Ala Val Thr Cys Leu Lys Asn 290 295 300 Ile Leu Ala Thr Lys Thr Gly His Ser Phe Trp Glu Ile Tyr Lys Met 305 310 315 320 Thr Thr Asp Pro Met Leu Ala Tyr Leu Gln Pro Phe Arg Thr Ser 325 330 335

Claims (37)

  1. NMS1의 카르복시-말단 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드, 또는 그것의 보존성 변이체로서, 그 폴리펩티드는 전 길이의 NBS1을 포함하지 않는 것이 특징인 분리된 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1에 대해 최소한 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NBS1의 카르복시-말단에 ATM이 결합하는 것을 억제하는 것인 폴리펩티드.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NBS1의 카르복시-말단의 4 내지 30개의 연속적인 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NBS1 (SEQ ID NO:1)의 아미노산 734 내지 744를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 NBS1의 아미노산 734 내지 754 내에 보존성 아미노산 치환을 포함하는 것일 폴리펩티드.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3에 대해 최소한 95%의 서열 동일성을 나타내는 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 세포 내재화 서열을 더 포함하는 것인 폴리펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포 내재화는 폴리아르기닌, 안테나페디아, TAT, HIV-Tat, 페네트라틴, Antp-3A (Antp 돌연변이), Buforin II, 트란스포탄, MAP (모델 양친매성 펩티드), K-FGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC (비스-구아니디늄-스퍼미딘-콜레스테롤) 및 BGTC (비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단백질의 아미노산을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, 및 SEQ ID NO:42로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 종양 특이적 표적화 서열을 더 포함하는 폴리펩티드.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 종양 특이적 표적화 서열은 RGD, NGR, 또는 GSL 모티프를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO:12에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  15. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드화하는 분리된 핵산.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 코드화된 폴리펩티드가 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, 및 SEQ ID NO:10으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 분리된 핵산.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 분리된 핵산이 핵산 서열 SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, 및 SEQ ID NO:50을 포함하는 것인 분리된 핵산.
  18. 제 15 항 또는 제 17 항에 있어서,
    상기 핵산이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 것인 분리된 핵산.
  19. 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 벡터가 바이러스 벡터인 것인 벡터.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 벡터가 아데노바이러스 벡터인 것인 벡터.
  22. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 세포.
  23. 제 19 항의 벡터를 포함하는 세포.
  24. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 유기체.
  25. 제 19 항의 벡터를 포함하는 유기체.
  26. 약제학적으로 허용되는 담체에 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  27. 약제학적으로 허용되는 담체에 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 조성물.
  28. 약제학적으로 허용되는 담체에 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  29. 방사선요법에 대해 조직의 민감성을 증가시키는 방법에 있어서,
    상기 방법은
    a) NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 조직에 투여하는 단계와
    b) 조직에 방사선을 조사하는 단계로 이루어지는, 방사선요법에 대해 조직의 민감성을 증가시키는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 조직은 양성 성장물을 포함하는 것인 방사선요법에 대해 조직의 민감성을 증가시키는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서,
    상기 조직은 암을 포함하는 것인 방사선요법에 대해 조직의 민감성을 증가시키는 방법.
  32. 환자의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 암에 투여하는 단계와
    b) 암에 방사선을 조사하는 단계로 이루어지는, 환자의 암을 치료하는 방법.
  33. 방사선 민감성 제제를 확인하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) NBS1과 ATM 폴리펩티드를 포함하는 샘플을 후보 제제와 접촉시키는 단계와,
    b) NBS1과 ATM 폴리펩티드 사이의 반응을 검출하는 단계를 포함하고,
    대조표준과 비교하여 NBS1과 ATM 폴리펩티드 사이의 반응이 감소하는 것을 후보 제제가 방사선에 민감한 것을 나타내는 것으로 검출하는 것이 특징인 방사선 민감성 제제를 확인하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    상기 NBS1과 ATM 폴리펩티드 사이의 반응이 형광 편광화를 사용하여 검출되는 것인 방사선 민감성 제제를 확인하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 NBS1 또는 ATM 폴리펩티드가 형광단(fluorophore)을 포함하는 것인 방사선 민감성 제제를 확인하는 방법.
  36. 제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 폴리펩티드가 포지티브 대조표준으로서 사용되는 것인 방사선 민감성 제제를 확인하는 방법.
  37. 환자의 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) NBS1과 ATM의 상호작용을 억제하는 조성물을 암에 투여하는 단계와
    b) 암에 항-신생물 약물을 투여하는 단계로 이루어지는, 환자의 암을 치료하는 방법.
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