JP2009525055A - 腫瘍および前癌性病変におけるリンパ管のジップコード - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2006年2月1日に出願された米国仮特許出願第60/764,175号に対する優先権を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金POl CA 82713、POl CA 104898、P30 CA 30199、ROl CA 115410および米国国立癌研究所によって授与された助成金DAMD 17−02−1−0315、助成金T32 CA77109−05および米国国防総省によって授与されたDAMD 17−02−0309の元、政府支援を受けて行われた。米国政府は、本発明における特定の権利を有する。
血管の内膜は高度に多様化している。多数の、おそらくは、すべての、正常組織は、組織特異的「サイン」をその脈管構造に付しており、腫瘍血管は、形態および分子組成の両方において正常血管とは異なっている(Ruoslahti、2002)。腫瘍は血管新生を誘導して腫瘍の増殖に適応し(HanahanおよびWeinberg、2000)、腫瘍血管における変化の多くは、血管新生に関連している(Brooksら、1994;Christianら、2003;FerraraおよびAlitalo、1999;Pasqualiniら、2000)。さらに、腫瘍血管は、腫瘍の種類に特異的な、またいくつかの病期では、病期特異的な特徴を有し、臓器特異的腫瘍形成の2種のトランスジェニックマウスモデルにおいて、ファージライブラリーのin vivoスクリーニングによって、血管新生サインを選択的に認識するホーミングペプチドの別個のセットが得られた。ホーミングペプチドはまた、同一腫瘍モデルにおいて、前癌性病変の血管新生血管を、完全に悪性の病変のものと区別することができ(Hoffmanら、2003;Joyceら、2003)、このことは、血管変化が腫瘍成長の病期を映すことを示す。
Mandriotaら、(2001)Embo J 20.672−682 Skobeら、(2001)Nat Med 7,192−198 Saharinenら、(2004)Trends Immunol 25,387−395
本発明の目的に従って、本明細書において実施され、広く記載されるように、本発明は、腫瘍リンパ管および/または腫瘍ならびに腫瘍細胞を選択的に標的化するための、また腫瘍リンパ管および/または腫瘍ならびに腫瘍細胞を選択的に標的化することを含む、ペプチド、組成物、コンジュゲート、核酸および方法に関する。
開示される方法および組成物は、特定の実施形態およびそれに含まれる実施例の以下の詳細な説明ならびに図およびそれらの前記の説明および以下の説明を参照することによって、より容易に理解され得る。
腫瘍リンパ管を選択的に標的化する、新規ペプチドおよびコンジュゲートに関する組成物および方法が本明細書に開示される。
腫瘍リンパ管、例えば、腫瘍中および腫瘍の周りのリンパ管(腫瘍関連リンパ管と呼ばれ得る)および/またはリンパ管新生管を標的化し、それと結合し、かつ/またはそれにホーミングするペプチドが本明細書に開示される。開示されるペプチドは、腫瘍リンパ管と選択的に結合することが好ましい。開示されるペプチドは、種々の構造を有し得る。例えば、いくつかの形では、開示されるペプチドのアミノ酸配列は、CLSDGK(配列番号2)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGK(配列番号2)、1つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGK(配列番号2)、1つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCLSDGK(配列番号2)または少なくとも4個の連続するアミノ酸を有するこれらの形のいずれかの断片であり得る。また、アミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、CLSDGK(配列番号2)と少なくとも70%の配列同一性を有する、単離ペプチドも提供される。
また、任意の1種以上の本明細書において開示されるペプチドと、1以上の部分とを含むコンジュゲートも本明細書において提供される。通常、部分は、標的細胞(複数の細胞)または組織に対して、所望の効果をもたらすよう作用する物質であり得る。いくつかの態様では、開示されるコンジュゲートは、腫瘍リンパ管、例えば、腫瘍中および腫瘍の周りのリンパ管、および/またはリンパ管新生管を標的化し、それと結合し、かつ/またはそれにホーミングできる。開示されるペプチドは、腫瘍リンパ管と選択的に結合することが好ましい。したがって、例えば、効果は、標的細胞(複数の細胞)または組織の標識化、活性化、抑制または死滅であり得る。
JC−1;JO JO−1;JO−PRO−1;レーザープロ(LaserPro);ラウロダン(Laurodan);LDS 751(DNA);LDS 751(RNA);ロイコホール(Leucophor)PAF;ロイコホール(Leucophor)SF;ロイコホール;(Leucophor)WS;リサミンローダミン;リサミンローダミンB;カルセイン/エチジウムホモダイマー;LOLO−1;LO−PRO−1;ルシファーイエロー;リソトラッカーブルー;リソトラッカーブルーホワイト;リソトラッカーグリーン;リソトラッカーレッド;リソトラッカーイエロー;リソセンサー(LysoSensor)ブルー;リソセンサー(LysoSensor)グリーン;リソセンサー(LysoSensor)イエロー/ブルー;マググリーン(Mag Green);マグダラレッド(フロキシン B);マグ−フラ(Mag−Fura)レッド;マグ−フラ(Mag−Fura)−2;マグ−フラ(Mag−Fura)−5;マグ−インド(Mag−Indo)−1;マグネシウムグリーン;マグネシウムオレンジ;マラカイトグリーン;マリナブルー;Iマキシロンブリリアントフラビン(Maxilon Brilliant Flavin)10 GFF;マキシロンブリリアントフラビン(Maxilon Brilliant Flavin)8 GFF;メロシアニン;メトキシクマリン;マイトトラッカーグリーンFM;マイトトラッカーオレンジ;マイトトラッカーレッド;ミトラマイシン;モノブロモビマン;モノブロモビマン(mBBr−GSH);モノクロロビマン;MPS(メチルグリーンピロニンスチルベン);NBD;NBDアミン;ナイルレッド;ニトロベンゾキセジドール(Nitrobenzoxedidole);ノラドレナリン;ヌクレアファストレッド;iヌクレアイエロー;ニロサンブリリアントラビン(Nylosan Brilliant lavin)E8G;オレゴングリーン(商標);オレゴングリーン(商標)488;オレゴングリーン(商標)500;オレゴングリーン(商標)514;パシフィックブルー;パラローザニリン(フォイルゲン);PBFI;PE−Cy5;PE−Cy7;PerCP;PerCP−Cy5.5;PE−テキサスレッド(レッド613);フロキシンB(マグダラレッド);ホルワイト(Phorwite)AR;ホルワイト(Phorwite)BKL;ホルワイト(Phorwite)Rev;ホルワイト(Phorwite)RPA;ホスフィン(Phosphine)3R;フォトレジスト;フィコエリトリンB[PE];フィコエリトリンR[PE];PKH26(Sigma);PKH67;PMIA;ポントクロム(Pontochrome)ブルーブラック;POPO−1;POPO−3;PO−PRO−1;PO−IPRO−3;プリムリン;プロシオンイエロー;プロピジウムヨーダイド(Propidium lodid)(PI);PyMPO;ピレン;ピロニン;ピロニンB;ピラゾール(Pyrozal)ブリリアントフラビン7GF;QSY7;キナクリンマスタード;レゾルフィン;RH 414;Rhod−2;ローダミン;ローダミン110;ローダミン123;ローダミン5GLD;ローダミン6G;ローダミンB;ローダミンB200;ローダミンBエクストラ;ローダミンBB;ローダミンBG;ローダミングリーン;ローダミンファリシジン(Phallicidine);ローダミン:ファロイジン;ローダミンレッド;ローダミンWT;ローズベンガル;R−フィコシアニン;R−フィコエリトリン(PE);rsGFP;S65A;S65C;S65L;S65T;サファイアGFP;SBFI;セロトニン;セブロン(Sevron)ブリリアントレッド2B;セブロン(Sevron)ブリリアントレッド4G;セブロン(Sevron)IブリリアントレッドB;セブロン(Sevron)オレンジ;セブロン(Sevron)イエローL;sgBFP(商標)(スーパーグロウ(super glow)BFP);sgGFP(商標)(super glow GFP);SITS(プリムリン;スチルベンイソチオスルホン酸);SNAFLカルセイン;SNAFL−1;SNAFL−2;SNARFカルセイン;SNARF1;ナトリウムグリーン;スペクトラムアクア(SpectrumAqua);スペクトラムグリーン(SpectrumGreen);スペクトラムオレンジ(SpectrumOrange);スペクトラムレッド(Spectrum Red);SPQ(6−メトキシ−N−(3スルホプロピル)キノリニウム);スチルベン;スルホローダミンBおよびC;スルホローダミンエクストラ;SYTO11;SYTO12;SYTO13;SYTO14;SYTO15;SYTO16;SYTO17;SYTO18;SYTO20;SYTO21;SYTO22;SYTO23;SYTO24;SYTO25;SYTO40;SYTO41;SYTO42;SYTO43;SYTO44;SYTO45;SYTO59;SYTO60;SYTO61;SYTO62;SYTO63;SYTO64;SYTO80;SYTO81;SYTO82;SYTO83;SYTO84;SYTO85;SYTOXブルー;SYTOXグリーン;SYTOXオレンジ;テトラサイクリン;テトラメチルローダミン(TRITC);テキサスレッド(商標);テキサスレッド−X(商標)コンジュゲート;チアジカルボシアニン(DiSC3);チアジンレッドR;チアゾールオレンジ;チオフラビン5;チオフラビンS;チオフラビンTON;チオライト(Thiolyte);チアゾールオレンジ;チノポール(Tinopol)CBS(カルコフロールホワイト(Calcofluor White));TIER;TO−PRO−1;TO−PRO−3;TO−PRO−5;TOTO−1;TOTO−3;トリカラー(Tricolor)(PE−Cy5);TRITCテトラメチルローダミンイソチオシアネート;トゥルーブルー(True Blue);トゥルーレッド(Tru Red);ウルトラライト(Ultralite);ウラニンB;ユビテックス(Uvitex)SFC;wtGFP;WW781;X−ローダミン;XRITC;キシレンオレンジ;Y66F;Y66H;Y66W;イエローGFP;YFP;YO−PRO−1;YO−PRO3;YOYO−l;YOYO−3;Sybrグリーン;チアゾールオレンジ(インターキレート色素);半導体ナノ粒子、例えば、量子ドット;またはケージドフルオロフォア(caged fluorophore)(光またはその他の電磁エネルギー供給源で活性化され得る)またはそれらの組合せが挙げられる。
i.タンパク質変異体
タンパク質変異体および誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列修飾を含み得る。例えば、アミノ酸配列修飾は、通常、3つのクラスのうち1以上に該等する:置換変異体、挿入変異体または欠失変異体。挿入としては、単一または複数のアミノ酸残基のアミノおよび/またはカルボキシル末端融合ならびに配列内挿入が挙げられる。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシル末端融合のものよりも小さい挿入、例えば、1〜4個程の残基である。免疫原性融合タンパク質誘導体、例えば、実施例に記載されるものは、in vitroで架橋することによって、または融合物をコードするDNAで形質転換された組換え細胞培養によって、免疫原性を付与するのに十分なほど大きいポリペプチドを標的配列に融合することによって作製する。欠失は、タンパク質配列からの1個以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。通常、タンパク質分子内の任意の1部位で、わずか約2〜6個の残基が欠失されている。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするDNAにおける、ヌクレオチドの部位特異的変異、それによる変異体をコードするDNAの生成およびその後の組換え細胞培養物におけるDNAの発現によって調製する。既知配列を有するDNA中の所定の部位で置換突然変異を作製する技術は、周知であり、例えば、M13プライマー突然変異誘発およびPCR突然変異誘発がある。アミノ酸置換は、通常、単一残基のものであるが、いくつかの異なる位置で一度に起こる場合もあり、挿入は、通常、約1〜10個程のアミノ酸残基であり、欠失は、約1〜30個の残基の範囲である。欠失または挿入は、隣接対で作製されること、すなわち、2個の残基の欠失または2個の残基の挿入が好ましい。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終構築物に達することができる。突然変異は、配列を読み取り枠から外してはならず、二次mRNA構造を生じ得る相補領域を作製しないことが好ましい。置換変異体とは、少なくとも1個の残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されているものである。このような置換は、通常、以下の表2に従って作製され、保存的置換と呼ばれる。
7.核酸
本明細書において開示されるペプチドのうちいずれかをコードする単離核酸も、本明細書において提供される。内在化配列をコードする核酸をさらに含む本明細書において開示されるペプチドのうちいずれかをコードする単離核酸も、本明細書において提供される。例えば、細胞内在化は、アンテナペディア、TAT、HIV−Tat、Penetratin、Antp−3A(Antp突然変異体)、ブフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K−FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep−1、SynB1、Pep−7、HN−1、BGSC(ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロールおよびBGTC(ビス−グアニジニウム−Tren−コレステロールからなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。
i.ヌクレオチドおよび関連分子
開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはヌクレオチド代用物で構成され得る。これらおよびその他の分子の限定されない例が、本明細書に論じられている。例えば、ベクターが細胞において発現される場合には、発現されたmRNAは、通常、A、C、GおよびUからなるということは理解されている。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因的な送達によって細胞または細胞環境中に導入される場合には、アンチセンス分子が、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類似体からなることが有利であるということも理解される。
8.細胞送達系
また、本明細書において開示されるポリペプチドをコードする核酸を含み、核酸が、発現制御配列と機能し得る形で連結しているベクターも提供される。核酸を、in vitroまたはin vivoのいずれかで細胞に送達するために使用できるいくつかの組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、大部分は、2つのクラスに分けられる:ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系。例えば、核酸は、いくつかの直接送達系、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドによって、または細胞もしくは陽イオン性リポソームなどの担体における遺伝物質の移動によって送達できる。トランスフェクションのための適当な手段、例えば、ウイルスベクター、化学的トランスフェクタントまたは物理的−機械的方法、例えば、エレクトロポレーションおよびDNAの直接拡散は、例えば、Wolff,J.A.ら、Science、247、1465−1468、(1990)およびWolff,J.A.Nature、352、815−818、(1991)によって記載されている。このような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載される組成物および方法とともに使用するために容易に適用可能である。特定の場合には、本方法は、大きなDNA分子を用いて特別に機能するよう改変される。さらに、これらの方法を用い、担体の標的化特徴を用いることによって特定の疾患および細胞集団を標的化することができる。
i.核酸ベースの送達系
トランスファーベクターは、遺伝子を細胞に送達するために(例えば、プラスミド)、または遺伝子を送達するための遺伝子戦略の一環として、例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一環として使用される任意のヌクレオチド構築物であり得る(Ramら Cancer Res.53:83−88、(1993))。
a.レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意の種類、サブファミリー、属または指向性を含む、レトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的に、Verma,I.M.、Retroviral vectors for gene transfer.In Microbiology−1985、American Society for Microbiology、229−232、Washington、(1985)によって記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子療法にレトロウイルスベクターを用いる方法の例は、米国特許第4,868,116号および同4,980,286号;PCT出願WO90/02806およびWO89/07136;およびMulligan、(Science260:926−932(1993))に記載されており、それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。
b.アデノウイルスベクター
複製に欠陥のあるアデノウイルスの構築は、記載されている(Berknerら、J.Virology61:1213−1220(1987);Massieら、Mol.Cell.Biol.6:2872−2883(1986);Haj−Ahmadら、J.Virology57:267−274(1986);Davidsonら、J Virology61:1226−1239(1987);Zhang「Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome−mediated transfection and PCR analysis」BioTechniques15:868−872(1993))。ベクターとしてこれらのウイルスを用いる利益は、初期感染細胞内において複製できるが、新規感染性ウイルス粒子を形成できないので、その他の細胞種に広がる範囲が制限されているということである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質およびいくつかのその他の組織部位への直接的な、in vivo送達後に高効率の遺伝子導入を達成することがわかっている(Morsy,J.Clin.Invest.92:1580−1586(1993);Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381−387(1993);Roessler,J.Clin.Invest.92:1085−1092(1993);Moullier,Nature Genetics4:154−159(1993);La Salle、Science259:988−990(1993);Gomez−Foix,J.Biol.Chem.267:25129−25134(1992);Rich,Human Gene Therapy4:461−476(1993);Zabner,Nature Genetics6:75−83(1994);Guzman、Circulation Research73:1201−1207(1993);Bout、Human Gene Therapy5:3−10(1994);Zabner、Cell75:207−216(1993);Caillaud、Eur.J.Neuroscience5:1287−1291(1993);およびRagot,J.Gen.Virology74:501−507(1993))。組換えアデノウイルスは、野生型または複製に欠陥のあるアデノウイルスと同様の方法で、特異的な細胞表面受容体と結合し、その後、ウイルスが受容体媒介性エンドサイトーシスによってインターナライズされることによって遺伝子形質導入を達成する(ChardonnetおよびDales、Virology40:462−477(1970);BrownおよびBurlingham,J.Virology12:386−396(1973);SvenssonおよびPersson,J.Virology55:442−449(1985);Sethら、J.Virol.51:650−655(1984);Sethら、Mol.Cell.Biol.4:1528−1533(1984);Vargaら、J.Virology65:6061−6070(1991);Wickhamら、Cell73:309−319(1993))。
c.アデノ随伴ウイルスベクター
もう1つの種類のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づいている。この欠陥パルボウイルスは、多数の細胞種に感染でき、ヒトにとって非病原性であるために、好ましいベクターである。AAV種のベクターは、約4〜5kbを輸送でき、野生型AAVは、染色体19に安定に挿入されることがわかっている。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この種のベクターの特に好ましい実施形態は、Avigen、San Francisco、CAによって製造されるP4.1Cベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、HSV−tkおよび/またはマーカー遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質、GFPをコードする遺伝子を含み得る。
d.大きな負荷量のウイルスベクター
大きなヒトヘルペスウイルスを用いる分子遺伝学的実験によって、大きな異種DNA断片をクローニングし、増殖させ、ヘルペスウイルスの感染に関して許容状態の細胞において確立することができる手段が提供された(Sunら、Nature genetics8:33−41、1994;CotterおよびRobertson、Curr Opin Mol Ther5:633−644、1999)。これらの大きなDNAウイルス(単純ヘルペスウイルス(HSV)およびエプスタイン・バーウイルス(EBV)は、ヒト異種DNA>150kbの断片を特定の細胞に送達する可能性を有する。EBV組換え体は、エピソームDNAとして感染B細胞中にDNAの大きな断片を維持することができる。個々のクローンによって担持された最大330kbのヒトゲノムインサートは、遺伝的に安定であるようであった。これらのエピソームの維持には、EBVの感染の間、構成的に発現される特定のEBV核タンパク質、EBNA1が必要である。さらに、これらのベクターを、トランスフェクションに使用でき、これでは多量のタンパク質をin vitroで一時的に作製できる。ヘルペスウイルスアンプリコン系はまた、DNA>220kbの断片をパッケージングし、エピソームとしてDNAを安定に維持できる細胞に感染させるためにも用いられている。
ii.非核酸ベースの系
開示される組成物は、種々の方法で標的細胞に送達することができる。例えば、組成物は、エレクトロポレーションによって、またはリポフェクションによって、またはリン酸カルシウム沈殿によって送達できる。選択される送達機構は、幾分かは、標的化される細胞の種類、送達が、例えば、in vivoまたはin vitroで起こるかどうかに応じて変わる。
iii.In vivo/ex vivo
上記のように、本組成物は、薬学的に許容される担体において投与でき、当技術分野で周知の種々の機構(例えば、裸のDNAの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるDNAの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど)によって、対象の細胞にin vivoおよび/またはex vivoで送達できる。
iv.発現系
細胞に送達される核酸は、通常、発現制御系を含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御に役立つプロモーター、および/またはエンハンサーを含む。一般に、プロモーターとは、転写開始部位に対して、相対的に固定された位置にある場合に機能する、DNAの配列または複数の配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
a.ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの好ましいプロモーター制御転写は、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび最も好ましいサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳類プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから得ることができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含むSV40制限断片として好都合に得られる(Fiersら、Nature、273:113(1978))。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、HindIII E制限断片として好都合に得られる(Greenway,P.J.ら、Gene18:355−360(1982))。もちろん、宿主細胞または関連する種に由来するプロモーターも本明細書において有用である。
b.マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、送達されると発現されているかどうかを調べるために用いられる。好ましいマーカー遺伝子として、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌lacZ遺伝子がある。
9.配列類似性
本明細書において用いる場合、用語相同性および同一性は類似性と同様のことを意味するということは理解される。したがって、例えば、2種の非天然配列間で単語相同性の使用が用いられる場合には、必ずしも、これら2種の配列間の進化上の関係を示すものではなく、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関連性に注目しているということが理解される。2種の進化上関連のある分子間の相同性を調べるための多数の方法が、進化上関連しているかどうかに関わらず、配列類似性を調べる目的で任意の2種以上の核酸またはタンパク質に日常的に適用されている。
10.ハイブリダイゼーション
用語ハイブリダイゼーションは、通常、少なくとも2種の核酸分子、例えば、プライマーまたはプローブおよび遺伝子間の配列によってもたらされる相互作用を意味する。配列によってもたらされる相互作用とは、2種のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体間にヌクレオチド特異的に生じる相互作用を意味する。例えば、Cと相互作用するGまたはTと相互作用するAは、配列によってもたらされる相互作用である。通常、配列によってもたらされる相互作用は、ヌクレオチドのWatson−Crick面またはHoogsteen面で生じる。2種の核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知のいくつかの状態およびパラメータによって影響を受ける。例えば、塩濃度、pHおよび反応の温度は、2種の核酸分子がハイブリダイズしようともしなくとも、すべて影響を及ぼす。
11.抗体
また、本明細書に開示されるペプチドまたはポリペプチドのいずれかと特異的に結合する抗体も本明細書に開示される。用語「抗体」は、本明細書において広い意味で用いられ、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。用語「抗体」には、無傷の免疫グロブリン分子に加え、それらが本明細書に開示されるポリペプチドと相互作用するその能力について選択される限り、それらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマーおよびヒトおよびヒト化型の免疫グロブリン分子またはその断片も含まれる。
12.薬剤担体
開示される組成物は、薬学的に許容される担体と組合せて治療上使用できる。「薬学的に許容される」とは、生物学的にか、または別の点で、望ましくないものでない材料を意味し、すなわち、材料を、何らかの望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、または材料が含まれる薬学的組成物のその他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、対象に、核酸またはベクターとともに投与できる。担体は、当業者には周知であるが、対象における有効成分のいかなる分解も最小にするよう、またいかなる副作用も最小にするよう当然選択される。
B.方法
1.標的化
対象において、1種以上の部分を、腫瘍リンパ管に標的化する方法が本明細書に提供される。本方法は、対象に、本明細書に開示されるペプチドの任意の1種以上と、1種以上の部分とを含むコンジュゲートを投与することを含み得る。1種以上の部分は、本明細書に開示されるものなどの検出部分であり得る。したがって、本方法は、対象のリンパ管におけるコンジュゲートの存在を検出することによって対象において腫瘍を検出することをさらに含み得る。
癌を検出する方法も提供される。本方法はまた、生体サンプルを、本明細書に開示されるペプチドのうち任意の1種以上と、1種以上の部分とを含むコンジュゲートと接触させることと、サンプルのリンパ管におけるコンジュゲートの存在を検出することとを含み得る。開示される方法のいくつかの態様では、参照または対照量よりも、リンパ管におけるコンジュゲートの存在を1種以上多く検出することが、癌の存在を示す。
癌を治療する方法も提供される。本方法は、対象に、本明細書に開示されるペプチドのうち任意の1種以上と、1種以上の部分とを含むコンジュゲートを投与することを含み得る。1種以上の部分は、治療部分であり得る。したがって、いくつかの態様では、コンジュゲートは、対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害する。コンジュゲートは、腫瘍リンパ管のアポトーシスを誘導する。いくつかの態様では、コンジュゲートは、腫瘍のアポトーシスを誘導する。
対象において、正常、前癌性および悪性前立腺状態を調べる方法も提供する。本方法は、対象由来の生体サンプルを、ポリペプチドが、アミノ酸配列CREAGRKAC(配列番号6)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCREAGRKAC(配列番号6)、CSMSAKKKC(配列番号7)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSMSAKKKC(配列番号7)、CKTRVSCGV(配列番号8)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCKTRVSCGV(配列番号8)、CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1つもしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1つもしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)、CSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)を含む、本明細書において開示されるコンジュゲートと接触させることを含み得る。
腫瘍リンパ管を標的とする薬剤を同定する方法も提供される。この方法は、例えば、
(a)薬剤の非癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、非癌性組織を、候補薬剤のライブラリーと接触させることと、
(b)ステップ(a)から非癌性組織と結合しない候補薬剤を集めることと、
(c)薬剤の、癌性または前癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、癌性または前癌性組織を、ステップ(b)において集められた候補薬剤と接触させることと、
(d)癌性または前癌性組織由来のリンパ管内皮細胞と結合している候補薬剤を集めることと
を含み得、候補薬剤の、癌性または前癌性組織のリンパ管内皮細胞との結合によって、候補薬剤が腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定される。
本明細書において開示される組成物、例えば、開示されるペプチドおよびコンジュゲートは、局所治療が望まれるか、全身治療が望まれるかに応じて、また治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与できる。例えば、組成物は経口によって、非経口によって(例えば、静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射)、吸入によって、体外で、局所に(例えば、経皮、眼部に、経膣的に、経直腸的に、鼻腔内に)などで投与できる。
上記の材料ならびにその他の材料は、開示された方法を実施するのに、または実施を補助するのに有用なキットとして任意の適した組合せで一緒にパッケージングできる。所与のキット中のキット成分を、開示される方法において一緒に使用するよう設計、および適応されている場合には有用である。例えば、ペプチドと、ペプチドを部分と連結するための手段とを含む、コンジュゲート、例えば、本明細書に開示されるものを製造するためのキットが開示される。キットはまた、コンジュゲートを調製するためのプロトコルを含み得る。
開示される組成物は、研究手段として種々の方法で使用できる。その他の用途は開示されており、開示内容から明らかであり、および/または当業者によって理解される。
本明細書に開示される組成物および開示される方法を実施するのに必要な組成物は、特に断りのない限り、その個々の試薬または化合物について当業者に公知の任意の方法を用いて作製できる。
例えば、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドなどの核酸は、標準的な化学合成法を用いて作製してもよいし、酵素法または任意のその他の公知の方法を用いて製造してもよい。このような方法は、標準酵素消化と、それに続く、ヌクレオチド断片単離(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989)第5、6章参照のこと)から、例えば、MilligenまたはBeckman System 1Plus DNAシンセサイザー(例えば、Milligen−Biosearch、Burlington、MAのモデル8700自動化シンセサイザーまたはABIモデル38OB)を用いるシアノエチルホスホラミダイト法による純粋に合成的な方法に及び得る。オリゴヌクレオチドを作製するのに有用な合成法はまた、Ikutaら、Ann.Rev.Biochem.53:323−356(1984)、(ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法)、およびNarangら、Methods Enzymol.、65:610−620(1980)、(ホスホトリエステル方法)に記載されている。タンパク質核酸分子は、公知の方法、例えば、Nielsenら、Bioconjug.Chem.5:3−7(1994)によって記載されるものを用いて作製できる。
開示されるタンパク質を製造する1つの方法は、タンパク質化学技術によって2以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Fmoc(9−フルオレニルメチルオキシカルボニル)またはBoc(tert−ブチルオキシカルボニル)化学のいずれかを用い、現在利用可能な実験装置を用いて化学的に合成できる。(Applied Biosystems、Inc.、Foster City、CA)。当業者ならば、開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドは、例えば、標準的な化学反応によって合成できることは容易に理解される。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成でき、合成樹脂から切断されないのに対し、ペプチドまたはタンパク質のその他の断片は、合成でき、続いて、樹脂から切断され、それによって、その他の断片では官能基によってブロックされている末端基が曝露される。これら2種の断片は、ペプチド縮合反応によって、そのカルボキシルおよびアミノ末端で、それぞれペプチド結合を介して共有結合によって結合し抗体またはその断片を形成できる(Grant GA(1992)Synthetic Pepitides:A User Guide.W.H.Freeman and Co.、N.Y.(1992);Bodansky MおよびTrost B.編(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer−Verlag Inc.、NY(少なくともペプチド合成に関連する材料について参照することによって本明細書に組み込まれる)。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書に記載されるように、in vivoで独立に合成される。これらの独立したペプチドまたはポリペプチドは、単離すると、同様のペプチド縮合反応によって、連結させてペプチドまたはその断片を形成することができる。
特に断りのない限り、本明細書に用いられるすべての技術用語および科学用語は、開示される方法および組成物が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法および材料を、本方法および組成物の実施または試験において使用できるが、特に有用な方法、装置および材料は、記載されるとおりである。本明細書に引用される刊行物およびそのために引用される材料は、参照により、具体的に本明細書に組み込まれる。本明細書において、本発明が、先行発明によって、このような開示内容に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきものはない。いずれの参照文献も先行技術を構成するという承認は行われていない。参照文献についての議論は、その著者が主張することを提示し、出願人は、引用される文書の正確度および妥当性を厳密に調べる権利を留保する。
以下の実施例は、当業者に提供するために出されており、本明細書において特許請求される化合物、組成物、製品、装置および/または方法がどのように製造され、評価されるかの完全な開示および説明を含み、純粋に例示しようとするものであって、開示内容を制限しようとするものではない。数(例えば、量、温度など)に関して正確さを確保しようとする努力を行ったが、いくらかの誤差および偏差が考慮されなければならない。特に断りのない限り、パーセントは重量によるパーセントであり、温度は℃においてまたは周囲温度であり、圧力は大気圧か大気圧付近である。
i.実験手順
細胞株、マウスおよび腫瘍:以下の細胞株は、10% FCSで補給されたDMEMで維持された:C8161ヒトメラノーマ、MDA−MB−435ヒト乳癌、KRIBヒト骨肉種およびヒト前立腺癌細胞PPCl、DU145。LNCaPヒト前立腺癌細胞株は、10% FCSを補給した、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1.5g/L重炭酸ナトリウムを含む、10mM HEPESを含むRPMI1640培地で増殖させた。M12ヒト前立腺癌細胞株は、5μg/mlインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム(ITS)、2.5μg/mlファンギゾン、50μg/mlゲンタマイシン、0.2μMデキサメタゾン、10ng/ml上皮成長因子(EGF)および5%FCSを含むRPMI1640で培養した(Baeら、1998)。腫瘍を作製するために、1×106個の腫瘍細胞を、ヌードBALB/cおよびC56BL/6マウスに、皮下(C8161、KRIBおよびPPCl)または同所に(MDA−MB−453、PPC1、DU145、M12およびLNCaP)注入した。トランスジェニックマウス腫瘍モデルは、TRAMP前立腺癌、MMTV−PyMT乳癌およびK14−HPV16子宮頸癌を含んでいた。
ii.結果
C8161メラノーマにおけるリンパ管のファージ標的化:第1の標的としてC8161ヒトメラノーマを選択したが、これはヌードマウスにおいて、この細胞株を用いて作製した腫瘍の異種移植片が、乳癌ではリンパ管内皮細胞と結合する(Laakkonenら、2002)ホーミングペプチド、LyP−1によって認識されないリンパ管を含むためである。実験計画は、メラノーマ関連リンパ管に関して類似の特異性を有するリンパ管ホーミングペプチドが、同定され得るかどうかを調べることを目的とした。プロトコルは、腫瘍リンパ管を認識するペプチドを得る可能性を増大するよう改変した。ファージディスプレイライブラリーを、全C8161腫瘍組織の細胞懸濁液とともにインキュベートし、ファージが結合するのを可能にし、次いで、免疫磁性ビーズを用い、これらの細胞と結合している任意のファージに沿って運ばれるリンパ管内皮細胞を単離した。この濃縮ステップによって、非組換えファージよりも、単離細胞と250倍より効率的に結合するファージプールが得られた(図9A)。濃縮されたファージプールを、その後のinvivoラウンドに用いて、C8161異種移植片腫瘍にホーミングするファージを選択した。in vivoでの2ラウンドの選択によって、ファージの40倍濃縮物が生じた(図9B)。試験された、それぞれの対照臓器では濃縮がなかった。
LSDファージの、その他の種類の癌、例えば、先に記載されたリンパ管ホーミングペプチド、LyP−1によって認識されるMDA−MB−435ヒト乳癌異種移植片(Laakkonenら、2002)へのホーミングをさらに調べた。静脈注射されたLSDファージは、MDA−MB−435腫瘍に感知できるほどにはホーミングしなかった(下記参照のこと)。これらのデータは、LSD−ペプチドが、C8161メラノーマにおいてリンパ管に選択的にホーミングするということを示す。
Claims (32)
- 腫瘍リンパ管と選択的に結合し、アミノ酸配列を含む単離ペプチドであって、前記アミノ酸配列は以下:
(a)CLSDGK(配列番号2)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGK(配列番号2)、1つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGK(配列番号2)または1つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCLSDGK(配列番号2)、
(b)CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)または1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)、
(c)CLDGGRPKC(配列番号5)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCLDGGRPKC(配列番号5)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCLDGGRPKC(配列番号5)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCLDGGRPKC(配列番号5)、
(d)CREAGRKAC(配列番号6)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とをCREAGRKAC(配列番号6)、
(e)CSMSAKKKC(配列番号7)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSMSAKKKC(配列番号7)、
(f)CKTRVSCGV(配列番号8)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCKTRVSCGV(配列番号8)、
(g)CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、
(h)CSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)、および
(i)XRTX(配列番号60)(式中、Xは、RまたはK(配列番号12〜15)であり、このアミノ酸配列はCGNKRTRGC(配列番号16)、CNRRTKAGC(配列番号17)またはCNKRTRGGC(配列番号18)ではない)、
からなる群から選択される、単離ペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、CLSDGK(配列番号2)と少なくとも70%の配列同一性、CASLSCR(配列番号10)と65%の配列同一性、CLDGGRPKC(配列番号5)と65%の配列同一性、CREAGRKAC(配列番号6)と65%の配列同一性、CSMSAKKKC(配列番号7)と65%の配列同一性、CKTRVSCGV(配列番号8)と65%の配列同一性、CAGRRSAYC(配列番号9)と65%の配列同一性、CSGGKVLDC(配列番号11)と65%の配列同一性、CGNKRTRGC(配列番号16)と65%の配列同一性、CNRRTKAGC(配列番号17)と65%の配列同一性、CNKRTRGGC(配列番号18)と65%の配列同一性、CLSDGKRKC(配列番号4)と65%の配列同一性またはCLSDGKPVS(配列番号3)と65%の配列同一性を有する、請求項1に記載のペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、
(a)1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCGNKRTRGC(配列番号16)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCGNKRTRGC(配列番号16)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCGNKRTRGC(配列番号16)と、
(b)1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCNRRTKAGC(配列番号17)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCNRRTKAGC(配列番号17)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCNRRTKAGC(配列番号17)と、
(c)1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCNKRTRGGC(配列番号18)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCNKRTRGGC(配列番号18)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCNKRTRGGC(配列番号18)と、
(d)CLSDGKRKC(配列番号4)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKRKC(配列番号4)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKRKC(配列番号4)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCLSDGKRKC(配列番号4)と、
(e)CLSDGKPVS(配列番号3)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKPVS(配列番号3)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKPVS(配列番号3)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCLSDGKPVS(配列番号3)と
からなる群から選択される、請求項1に記載のペプチド。 - 前記アミノ酸配列が、CLSDGK(配列番号2)、CASLSCR(配列番号10)、CLDGGRPKC(配列番号5)、CREAGRKAC(配列番号6)、CSMSAKKKC(配列番号7)、CKTRVSCGV(配列番号8)、CAGRRSAYC(配列番号9)、CSGGKVLDC(配列番号11)、CLSDGKRKC(配列番号4)またはCLSDGKPVS(配列番号3)からなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチド。
- 最大25個のアミノ酸の長さを有する、請求項1から4のいずれか一項に記載のペプチド。
- 4〜25個のアミノ酸の長さを有する、請求項5に記載のペプチド。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドと、部分とを含み、腫瘍リンパ管に選択的にホーミングするコンジュゲート。
- 前記部分が、治療用部分、検出可能部分、細胞傷害性薬剤、抗リンパ管新生剤、癌化学療法薬、アポトーシス促進性ポリペプチド、グラフト化ポリペプチド、ウイルス、細胞およびリポソームからなる群から選択される、請求項7に記載のコンジュゲート。
- 前記部分が細胞傷害性薬剤であって、前記細胞傷害性薬剤がD(KLAKLAK)2(配列番号19)である、請求項8に記載のコンジュゲート。
- 前記部分が検出可能部分であって、前記検出可能部分がフルオロフォア、酵素、ビオチン、金属またはエピトープタグである、請求項8に記載のコンジュゲート。
- 対象において、部分を腫瘍リンパ管に標的化する方法であって、前記対象に、請求項7から11のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与するステップを含む方法。
- 前記対象のリンパ管においてコンジュゲートの存在を検出することによって、前記対象において癌を検出することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記対象が癌を有しており、前記対象のリンパ管への前記部分の標的化が、前記対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害する、請求項11に記載の方法。
- 癌を検出する方法であって、生体サンプルを、請求項7から10のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることと、前記サンプルのリンパ管における前記コンジュゲートの存在を検出することとを含む方法。
- リンパ管において、参照または対照量よりも多い前記コンジュゲートの存在を検出することが、癌の存在を示す、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 対象において癌を治療する方法であって、前記対象に、請求項7から10のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与することを含み、前記コンジュゲートが前記対象において腫瘍におけるリンパ管新生を阻害する方法。
- 前記癌が乳癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列XRTX(配列番号60){式中、XはRまたはK(配列番号12〜15)である}、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCGNKRTRGC(配列番号16)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCGNKRTRGC(配列番号16)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCGNKRTRGC(配列番号16)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCNKRTRGGC(配列番号18)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCNKRTRGGC(配列番号18)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCNKRTRGGC(配列番号18)を含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が子宮頸癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列XRTX(配列番号60){式中、XはRまたはK(配列番号12〜15)である}、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCNRRTKAGC(配列番号17)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCNRRTKAGC(配列番号17)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCNRRTKAGC(配列番号17)を含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が皮膚癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列CLSDGK(配列番号2)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGK(配列番号2)、1つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGK(配列番号2)、1つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含む、CLSDGK(配列番号2)、CLSDGKRKC(配列番号4)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKRKC(配列番号4)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKRKC(配列番号4)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCLSDGKRKC(配列番号4)、CLSDGKPVS(配列番号3)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKPVS(配列番号3)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCLSDGKPVS(配列番号3)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCLSDGKPVS(配列番号3)、CLDGGRPKC(配列番号5)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCLDGGRPKC(配列番号5)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCLDGGRPKC(配列番号5)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCLDGGRPKC(配列番号5)を含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が前立腺癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列CREAGRKAC(配列番号6)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCREAGRKAC(配列番号6)、CSMSAKKKC(配列番号7)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSMSAKKKC(配列番号7)、CKTRVSCGV(配列番号8)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCKTRVSCGV(配列番号8)、CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)、CSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)を含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が前癌性前立腺癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)、CSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)を含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記癌が悪性前立腺癌であり、前記ポリペプチドが、アミノ酸配列CREAGRKAC(配列番号6)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCREAGRKAC(配列番号6)、CSMSAKKKC(配列番号7)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSMSAKKKC(配列番号7)、CKTRVSCGV(配列番号8)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCKTRVSCGV(配列番号8)を含む、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
- 対象において、正常、前癌性および悪性前立腺状態を決定する方法であって、前記対象由来の生体サンプルを、請求項7から10のいずれか一項に記載のコンジュゲートと接触させることを含み、前記ポリペプチドがアミノ酸配列CREAGRKAC(配列番号6)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCREAGRKAC(配列番号6)、CSMSAKKKC(配列番号7)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSMSAKKKC(配列番号7)、CKTRVSCGV(配列番号8)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCKTRVSCGV(配列番号8)、CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)、CSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)を含む方法。
- CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)もしくはCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)の選択的結合が、前癌性前立腺状態の指標である、請求項23に記載の方法。
- CREAGRKAC(配列番号6)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCREAGRKAC(配列番号6)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCREAGRKAC(配列番号6)、CSMSAKKKC(配列番号7)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSMSAKKKC(配列番号7)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSMSAKKKC(配列番号7)もしくはCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCKTRVSCGV(配列番号8)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCKTRVSCGV(配列番号8)の選択的結合が、悪性前立腺状態の指標である、請求項23に記載の方法。
- CAGRRSAYC(配列番号9)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCAGRRSAYC(配列番号9)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCAGRRSAYC(配列番号9)、CASLSCR(配列番号10)、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換を含むCASLSCR(配列番号10)、1もしくは2つの非保存的アミノ酸置換と、1、2もしくは3つの保存的アミノ酸置換とを含むCASLSCR(配列番号10)もしくはCSGGKVLDC(配列番号8)、CREAGRKAC(配列番号3)、CSMSAKKKC(配列番号4)もしくはCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換を含むCSGGKVLDC(配列番号11)、または1、2もしくは3つの非保存的アミノ酸置換と、1、2、3もしくは4つの保存的アミノ酸置換とを含むCSGGKVLDC(配列番号11)の選択的結合がないことが、正常前立腺状態の指標である、請求項23に記載の方法。
- 腫瘍リンパ管を標的とする薬剤を同定する方法であって、前記方法が、
(a)薬剤の、非癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、非癌性組織を、候補薬剤のライブラリーと接触させることと、
(b)ステップ(a)から非癌性組織と結合しない候補薬剤を集めることと、
(c)薬剤の、癌性または前癌性組織との選択的結合を可能にするのに十分な条件下で、癌性または前癌性組織を、ステップ(b)において集められた前記候補薬剤と接触させることと、
(d)前記癌性または前癌性組織由来のリンパ管内皮細胞と結合している候補薬剤を集めることと
を含み、前記候補薬剤の、前記癌性または前癌性組織のリンパ管内皮細胞との結合によって、前記候補薬剤が腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定される方法。 - 腫瘍リンパ管を標的とする薬剤として同定された候補薬剤を製造することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
- 内在化配列をコードする核酸をさらに含む、請求項29に記載の単離核酸。
- 前記細胞内在化が、アンテナペディア、TAT、HIV−Tat、Penetratin、Antp−3A(Antp突然変異体)、ブフォリンII、トランスポータン、MAP(モデル両親媒性ペプチド)、K−FGF、Ku70、プリオン、pVEC、Pep−1、SynB1、Pep−7、HN−1、BGSC(ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロールおよびBGTC(ビス−グアニジニウム−Tren−コレステロールからなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の単離核酸。
- 前記核酸が発現制御配列と機能し得る形で連結している、請求項30または31に記載の単離核酸を含む発現ベクター。
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