CN102231952A - 用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质 - Google Patents

用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质 Download PDF

Info

Publication number
CN102231952A
CN102231952A CN2009801459229A CN200980145922A CN102231952A CN 102231952 A CN102231952 A CN 102231952A CN 2009801459229 A CN2009801459229 A CN 2009801459229A CN 200980145922 A CN200980145922 A CN 200980145922A CN 102231952 A CN102231952 A CN 102231952A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substituted
compound
nhc
nanoparticle
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2009801459229A
Other languages
English (en)
Inventor
赵洪
彦魏丽
史连军
马克西姆·瑞真
乌德春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Enzon Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Enzon Pharmaceuticals Inc filed Critical Enzon Pharmaceuticals Inc
Publication of CN102231952A publication Critical patent/CN102231952A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J51/00—Normal steroids with unmodified cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not provided for in groups C07J1/00 - C07J43/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于核酸运载的可释放阳离子脂质和纳米粒子组分以及用其调整目标基因表达的方法。特别地，本发明涉及阳离子脂质含有酸易变连接基及含有其的纳米粒子组分。

Description

用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质
相关申请的交叉引用
本申请要求序列号为61/115,287，61/115,365，61/115,348的美国临时专利申请优先权，其递交日为2008年11月17日，该申请的全部内容纳入本申请的范围。
背景技术
目前，已经推荐运用核酸进行各种疾病的治疗。这样的一种核酸治疗方法是反向治疗方法，其中治疗基因可以选择性地调控与疾病有关的基因表达，并尽量减少其他治疗方法可能造成的副作用。
然而，这种核酸治疗方法，受限于用于此种治疗方法的核酸的传递和稳定性所带来的挑战。有几种基因传递系统推荐出来用于克服上述挑战，有效地将治疗基因植入体内或体外的癌细胞或其他细胞组织等目标区域。为了改良传递并提高治疗基因的细胞摄取量做了采用脂质作为运载媒介的尝试。不幸的是，尽管在脂质传递上取得了一些进展，但目前可用的脂质仍不能有效地将寡核苷酸传递到体内。
尽管有了一些尝试及进展，但仍需提供一个更好的核酸运载系统。本发明解决了这一需要。
发明内容
本发明提供一种含有易变酸交联剂的可释放阳离子脂和含有核酸传递功能的纳米粒子成分。诸如寡核苷酸的核酸，以聚合有阳离子脂质、致融类脂质和PEG-脂质的纳米粒子组合物封存起来。
与此项发明内容相关，用于核酸传递的可释放可释放阳离子脂质(即寡核苷酸)的结构式(I)：
Figure BPA00001372549100011
其中
R1是胆固醇或其类似物；
Y1是O、S或NR4；
Y2和Y5是独立的O，S或NR5；
Y3-4是独立的O、S或NR6；
L1-2是独立的选择双功能链接基；
M是一个易变酸链接基；
(a)，(d)和(f)是独立的0或1；
(b)，(c)是(e)是独立的0或正整数；
X是C，N或P；
Q1是H、C1-6烷基、NH2，或-(L11)d1-R11；
Q2是H、C1-6烷基、NH2，或-(L12)d2-R12；
Q3是一个孤电子对、(＝O)、H、C1-6烷基、NH2或-(L13)d3-R13；
如果
(i)当X是C，Q3不是一个孤电子对或(＝O)；
(ii)当X是N，Q3是一个孤电子对；而且
(iii)当X是P，Q3是(＝O)，而且(f)是0，
其中
L11、L12和L13是独立的已选的双选择功能间隔；
(d1)，(d2)和(d3)是独立的0或正整数；
R11，R12和R13是独立的氢、NH2，
Figure BPA00001372549100021
其中
Y’4是O、S或NR’6；
Y’5是独立的O、S或NR’5；
(d’)和(f’)是独立的0或1；
(e’)是0或一个正整数；
X’是C、N或P；
Q’1是H、C1-6烷基、NH2或-(L’11)d’1-R’11；
Q’2是H、C1-6烷基、NH2或-(L’12)d’2-R’12；
Q’3是一个孤电子对、(＝O)、H、C1-6烷基、NH2或-(L13)d’3-R’13；
如果
(i)当X’是C，Q’3不是一个孤电子对或(＝O)；
(ii)当X’是N，Q’3是一个孤电子对；而且
(iii)当X’是P，Q’3是(＝O)，而且(f’)是0，
其中
L’11、L’12和L’13是独立的选择双功能间隔；
(d’1)、(d’2)和(d’3)是独立的0或正整数；
R’11、R’12和R’13是独立的氢、NH2，
Figure BPA00001372549100031
R2-6，R’2-3和R’5-6是从以下物质中独立地选取出来的：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂芳基，和C1-6取代杂芳基，并且
R7，和R’7是从以下物质中独立地选取出来的：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基的、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂芳基和取代C1-6杂环基，
假设Q1-3和Q’1-3中至少一个包括：
本发明也提供用于运载核酸的纳米粒子组份。
根据本发明，用于运载核酸的纳米粒子组份(如寡核苷酸)包含：
(i)结构式(I)的化合物；
(ii)致融类脂质和
(iii)PEG脂质。
本发明的另一方面是，提供了在体内或体外运载核酸(特别是寡核苷酸)至的细胞或细胞组织的方法。所述的方法中介绍的寡核苷酸可以调节目标基因表达。
本发明的另一方面是提供了抑制目标基因表达的方法，如致癌基因和与哺乳动物特别是人类患病相联系的基因。该方法包括含有从所述纳米粒子组合物中提取的一种和细胞，如癌细胞或细胞组织相接触。封存在纳米粒子中的寡核苷酸被释放，然后调整被治疗的细胞或组织中的mRNA或蛋白质的反向调节。在治疗恶性疾病中，纳米粒子的治疗允许调整目标基因表达(和其附随的益处)，如抑制癌细胞的生长。这样的治疗可以作为一个独立的治疗或与一个或更多的有益的和/或已被认可的治疗方法进行联合治疗的一部分。
更深层的方面是，本发明提供了制备结构式(I)的化合物同包含相同物质的纳米粒子的方法。
所述的可释放阳离子脂质可以中和核酸的阴离子基，并且促进含有所述核酸的纳米粒子的细胞摄取量。所述阳离子脂质提供每个胆固醇多样的阳离子单元，在以下方面产生高效：(i)中和核酸的阴离子基；(ii)同核酸形成紧密的离子化合物。这项技术有益于治疗性寡核苷酸的运载和，对哺乳动物，如人类运用治疗性寡核苷酸进行治疗。
所述的化合物提供了一种通过与核酸形成多重离子化合物控制纳米粒子大小的方法。
所述的化合物稳定了生物体液内所述的纳米粒子化合物和核酸。没有被任何理论束缚的情况下，认为纳米粒子化合物能够提高所封存核酸的稳定性，至少部分上保护分子免受核酸酶分解，以此避免降解。
与公知的中性或阴离子脂质负载核酸(寡核苷酸)一般低于10％相比，所述阳离子脂质拥有负载核酸(寡核苷酸)的高效(例如高于50％，70％，更好的情况高于80％)。没有被任何理论束缚的情况下，在某种程度上能够达到高负荷，基于这样的事实：在所述的结构式(I)的可释放阳离子脂质中含有高pKa(13-14)的胍盐组大多数形成紧凑的氢键有核酸磷酸基组的两性离子，从而促成更多的核酸有效地压缩至纳米粒子内部。
所述纳米粒子比中性或负电荷纳米粒子有了进一步的优势，因为在中性或负电荷纳米颗粒中不太可能发生聚集或沉淀。没有被任何理论束缚的情况下，期望的特征要部分地归因于这样的事实：形成氢键或者与压缩在纳米粒子内的核酸进行相互静电作用的阳离子脂质封存在纳米粒子中，并且非阳离子/致融类脂和PEG-脂质包围着可释放阳离子脂质和核酸。
纳米粒子的制备可以在宽的pH范围如约2～12内进行。所述纳米粒子也可以在一个理想的生理pH值，如约7.2～7.6临床使用。
所述纳米粒子，在没有转染基因的协助下，能使在体外和体内形成细胞转染。纳米粒子的高转染效率也提供了一种运载治疗性核酸至细胞的方法。
结构式(I)的化合物包括一个不稳定的核酸连接。这样的连接有利于酸性环境中的纳米粒子和内核体的破坏/扰动。酸性环境可以包括细胞外和细胞内环境。细胞内酸性环境包括，例如，在细胞质中的内核体。因此，所述化合物帮助释放封存在纳米粒子中的治疗药物，脱离内核体进入细胞质。
所述纳米粒子运载系统还允许根据目标区域的需要选择足够数量的治疗性寡核苷酸，例如癌细胞电子顺磁共振(增强渗透和保留)效果。因此，所述纳米粒子组合物改善了癌症细胞或细胞组织中特定的mRNA的下调。
根据本发明，所述纳米粒子可以运载一个或多个相同或不同的治疗药物(例如，反义寡核苷酸)，从而达到治疗疾病中的协同作用。
其他更多的益处由下述内容反映。
基于本发明的目的，术语“残基”应该被理解为化合物的一个基，它是指，例如胆固醇等，是在经与可选地一个化合物发生置换反应后的剩余物。
基于本发明的目的，术语“烷基”指的是饱和脂肪烃，包括直链、支链、环式烷基组。术语“烷基”还包括烷基硫代烷基，烷氧基烷基，环烷基烷基，杂环烷基和C1-6烷酰基烷基团。优选，烷基组有1～12个碳。更优选，是一个从含有1～7个碳的低烷基，最优选含有1～4个碳的。烷基组可以被取代或不被取代。当被取代时，替代组(们)，最好包括卤素、氧、叠氮、硝基、氰基、烷基、烷氧基、硫代烷基、烷基硫代烷基、烷氧基烷基、烷胺基、三氯甲烷、羟基、巯基、羟基、氰基、烷基矽、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烃基、芳基、氨基组。
基于本发明的目的，术语“替代”是指从以下物质组中增加或更换一个功能基或化合物组成中的一个或多个原子。此物质组包括卤素、氧、叠氮、硝基、氰基、烷基、烷氧基、硫代烷基、烷基硫代烷基、烷氧基烷基、烷胺基、三氯甲烷、羟氢氧基、巯基、羟基、氰基、烷基矽、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烷酰基烷基、芳基、胺基组。
基于本发明的目的，术语“烯基”是指含有至少一个碳碳双键的组，并包括直链、支链和环形组。优选，烯基组拥有大约2～12个碳的。更优选，是一个含有约2～7个碳的低烯基，最优选含有2～4个碳。烯基组可以被替代代或不被替代。当被替代时，替代组(们)，最好包括卤素、氧、叠氮、硝基、氰基、烷基、烷氧基、硫代烷基、烷基硫代烷基、烷氧基烷基、烷胺基、三氯甲烷、羟氢氧基、巯基、羟基、氰基、烷基矽、环烷基、环烷基烷基、杂环烷、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烃基、芳基、胺基组。
基于本发明的目的，术语“炔基”是指至少含有一个碳碳三键的组，包括直链、支链和环形组。优选，炔基组拥有约2至12个碳。更优选，一个含有约2至7个碳的低炔基，但更优选的含有约2至4个碳的。该炔基组可以被取代或不被取代。当被取代时，取代组(们)，优选地包括卤素、氧、叠氮、硝基、氰基、烷基、烷氧基、硫代烷基、烷基硫代烷基、烷氧基烷基、烷胺基、三氯甲烷、羟氢氧基、巯基、羟基、氰基、烷基矽、环烷基、环烷基烷基、杂环烷基、杂芳基、烯基、炔基、C1-6烃基、芳基、胺基组。“炔基”的实施例包括炔丙基，丙炔和3-己炔。
基于本发明的目的，术语“芳基”是指含有至少一种芳香环的芳烃环系统。芳香环可以有选择地融合或以其他方式连接到其他芳香族碳氢化合物环芳香族碳氢化合物环或非芳烃环。芳基组的实施例包括苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基和联苯基。芳基更优选的实施例包括苯基和萘基。
基于本发明的目的，术语“环烷基”是指一个C3-8环状碳氢化合物。环烷基的实施例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛炔。
基于本发明的目的，术语“环烯烃基”是指至少含有一个碳碳双键的C3-8环状碳氢化合物。环烯烃基的实施例包括环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、1，3-环己二烯基、环庚烯、环庚三烯和环辛烯。
基于本发明的目的，术语“环烷基烷基”是指被一个C3-8环烷基取代的烷基组。环烷基烷基组的实施例包括环丙基溴甲烷和次环戊基。
基于本发明的目的，术语“烷氧基”是指一个含有指定数量的碳原子通过氧桥附着到母分子基上的烷基组。烷氧基的实施例的包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。
基于本发明的目的，“烷基”组是指一个被一个含烷基组取代的芳基。
基于本发明的目的，“芳烷基”组是指被一个芳基组取代的烷基组。
基于本发明的目的，术语“烷氧基烷基”组是指被烷氧基取代的烷基组。
基于本发明的目的，术语“烷基硫代烷基”是指一个alkyl-S-alky硫醚，例如，二甲硫醚或者氯化甲硫基乙烷。
基于本发明目的，术语“氨基”是指一个氮组，本领域公知，是以一个或多个有机自由基替换氢自由基的方式从氨中获取的。例如，术语“酰胺基”和“烷胺基”是指分别为带有酰基和烷基取代基的特定的N-取代有机自由基。
基于本发明的目的，术语“烷羰基”指的是被烷基组取代的羰基组。
基于本发明的目的，术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴、碘。
基于本发明的目的，术语“杂环烷基”是指非芳香环系统，其中包含至少一个从氮、氧和硫中选中的杂原子。该杂环烷基环可以选择性地融合或连接到其他杂环烷基环和/或非芳烃环。优选的杂环烷基有3至7名成员。杂环烷基的实施例包括哌嗪、吗啉、哌啶、四氢呋喃、吡咯烷和吡唑。更优选的的杂环烷基组包括哌啶、哌嗪、吗啉和吡咯。
基于本发明的目的，术语“杂芳基”是指一个芳香环系统，其包含了至少一个从氮、氧、硫中选择的杂原子。该杂芳基环可以被融合或连接到一个或多个杂芳基环，芳香族或非芳烃环或杂环烷基环。杂芳基组的实施例包括吡啶、呋喃、噻吩、5，6，7，8-四氢和嘧啶。杂芳基组优选的实施例包括噻吩、苯、吡啶、喹啉、吡嗪基、嘧啶、咪唑、苯并咪唑、苯并呋喃、噻唑、苯并噻唑、异恶唑基、二唑、异噻唑基、苯并异噻唑基、三唑、四唑、吡咯、吲哚、吡唑和苯并吡唑基。
基于本发明的目的，术语“杂原子”是指氮、氧和硫。
在一些实施方式中，取代的烷基包括羧烷基、胺烷基、二烷基、羟烷基和巯烷基；取代烯基包括羧烷基、胺烯基、二烯氨基、羟烯基和疏基；取代炔基包括羧炔基、氨炔基、二炔氨基、氢氧基和巯炔基；取代的环烷基包括一些基，如4-氯环己基；芳基包括一些基，如萘基；取代的芳基包括一些基，如三溴苯基；芳烷基包括一些基，如甲苯基；杂烷基包括一些基序，如乙基噻吩；取代的杂芳基包括一些基，如3-甲氧基噻吩；烷氧基包括一些基，如基甲氧基；苯氧基包括一些基，如包括3-硝基酚。卤素应理解为包括氟、氯、碘和溴。
基于本发明的目的，术语“正整数”应被理解为包括等于或大于1的整数，也可被本领域的一般技术人员在合理的范围内所理解。
基于本发明的目的，术语“连接的”应被理解为包括共价键(优选地)或一组非共价连接到另一个，即作为一个化学反应的结果。
术语“有效量”和“足够数量”基于本发明的目的，应指数量达到了预期的效果或治疗效果，如本领域的一般技术人员所认为。
术语“纳米粒子”和/或“纳米复合物”由本文所述的纳米粒子组份，是指一种以脂质为基础的纳米复合物。纳米粒子包含核酸，如压缩在阳离子脂质、致融类脂、和PEG-脂质混合物的寡核酸。可选地，纳米粒子可以在没有核酸的条件下生成。
基于本发明的目的，术语“治疗性寡核苷酸”，是指一种用在药物或诊断药物的寡核苷酸。
基于本发明的目的，与不论给药途径，在没有所述纳米粒子治疗中观察出的基因表达相比，“基因表达调控”应被广泛理解，包括下调或上调任何类型的基因，优选是与癌症和炎症有关的类型。
基于本发明的目的，“抑制目标基因表达”应理解为与没有所述纳米粒子治疗中观察出的基因表达相比，mRNA的表达或蛋白质数量减少或减弱。这种抑制合适的检测包含了，如检测蛋白质或mRNA等级，用本领域公知的一般技术，如斑点杂交，RNA印迹杂交，原位杂交，酶联免疫吸附试验ELISA，免疫沉淀反应，酶的功能，以及本领域公知的表型检测。经过处理的条件可以得到证实，例如，在细胞中，优选癌症细胞或组织，在mRNA等级下降。
概括地说，在获得期望的反应时抑制或治疗视为成功。例如，抑制或治疗视为成功，通过获得如10％或更高(如20％，30％，40％)的与抑制肿瘤生长相关的下调量。可选地，对比于治疗中没有使用所述纳米粒子观察到的情况，治疗视为成功，通过获得在癌细胞或癌细胞组织中致癌基因的mRNA水平减少量为，至少20％，优选30％以上，最优选40％或更高(即50％或80％)，包括本领域技术人员能够想到的其他临床指标。
此外，为了叙述方便没有办法限制术语的单一使用。因此，举例来说，提及组成包括寡核苷酸，胆固醇类似物，阳离子脂质，致融类脂，可释放的结构式(I)的聚合脂质和PEG-脂质等的组合物，是指寡核苷酸，胆固醇类似物，阳离子脂质，致融类脂和PEG-脂质等的一个或多个分子构成。也可认为寡核苷酸是由相同或不同类型的基因构成。由于构成，工艺步骤和原料可以略有不同，可认为本发明不限于特定的构成，工艺步骤和所批露的原料。
附图说明
图1说明制备化合物12的反应方案，如实施例6-12所述。
图2说明制备化合物29的反应方案，如实施例13-18所述。
图3说明制备化合物31的反应方案，如实施例19-20所述。
图4说明制备化合物49的反应方案，如实施例21-26所述。
图5说明制备化合物54的反应方案，如实施例27-30所述。
具体实施方式
本发明的一个方面，是提供包含多个阳离子基的可释放脂质。据本发明，提供了用于运载核酸的相同成分的纳米组合物。纳米粒子组合物可以包括(i)结构式(I)的化合物；(ii)致融类脂质；和(iii)PEG-脂质。可以想的核酸包括寡核苷酸或质粒，优选寡核苷酸。使用所述纳米粒子组合物制备的纳米粒子包括封存在脂质运载媒介中的核酸。
A.结构式(I)的可释放的阳离子脂质
1.概述
根据本发明，有提供了结构式(I)的化合物：
Figure BPA00001372549100081
其中
R1是胆固醇或其类似物；
Y1is O、S或NR4，最好O；
Y2和Y5是独立的O、S或NR5，最好O；
Y3-4是独立的O、S或NR6，最好O或NR6；
L1-2是独立的选择双功能链接基；
M是一个易变酸链接基；
(a)、(d)和(f)是独立的0或1；
(b)、(c)和(e)是独立的0或正整数，最好是0或从1-10的正整数(例如，1，2，3，4，5，6)；
X是C、N或P；
Q1是H、C1-6烷基(例如，甲基、乙烷基、丙基)、NH2或-(L11)d1-R11；
Q2是H、C1-6烷基(例如，甲基、乙烷基、丙基)、NH2或-(L12)d2-R12；
Q3是一个孤电子对、(＝O)、H、C1-6烷基(例如，甲基、乙基、丙基)、NH2或-(L13)d3-R13；
如果provided that
(i)当X是C，Q3不是一个孤电子对或(＝O)；
(ii)当X是N，Q3是一个孤电子对；而且
(iii)当X是P，Q3是(＝O)，而且(f)是0，
其中
L11、L12和L13独立选择的双功能间隔；
(d1)、(d2)和(d3)是独立的0或正整数，较好是0或从1-10的正整数(例如，1，2，3，4，5，6)，最好0、1、2、3、4；
R11、R12和R13是独立的氢、NH2，
Figure BPA00001372549100091
其中
Y’4是O、S或NR’6，最好O或NR’6；
Y’5是独立的O、S或NR’5，最好O；
(d’)和(f’)是独立的0或1；
(e’)是0或正整数，最好0或从1-10的正整数(例如，1、2、3、4、5和6)；
X’是C、N或P；
Q’1是H、C1-6烷基(例如，甲基、乙烷基、丙基)、NH2或-(L’11)d’1-R’11；
Q’2是H、C1-6烷基(例如，甲基、乙烷基、丙基)、NH2或-(L’12)d’2-R’12；
Q’3是一个孤电子对、(＝O)、H、C1-6烷基(例如，甲基、乙烷基、丙基)、NH2或-(L13)d’3-R’13；
如果
(i)当X’是C，Q’3不是一个孤电子对或(＝O)；
(ii)当X’是N，Q’3是一个孤电子对；而且
(iii)当X’是P，Q’3是(＝O)并且(f’)是0；
其中
L’11、L’12和L’13是独立选择双功能间隔基；
(d’1)、(d’2)和(d’3)是独立的0或正整数，最好0或从1-10的正整数(例如，1、2、3、4、5、6)；
R’11、R’12和R’13是独立的氢、NH2，
R2-3和R’2-3是从以下物质中独立地选取出来的：氢、胺、羟氢氧基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂芳基和取代C1-6杂环基，优选地为氢、羟氢氧基、胺、甲基、乙烷基和丙基；并且
R4-7，和R’5-7是从以下物质中独立地选取出来的：氢、C1-6烷基C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂芳基C1-6杂烷基和取代C1-6杂环基，优选为氢、甲基，乙烷基和丙基。
如果Q1-3和Q’1-3中至少一个或一个以上(如1个，2个，3个)包括
Figure BPA00001372549100102
在(b)或(c)等于或大于2时，L1和L2在每次出现时都独立地相同或不同。
在(e)或(e′)等于或大于2时，-C(R2R3)-和-C(R2R3)-在每次出现时都独立地相同或不同。
在(d1)、(d2)或(d3)等于或大于2时，L11、L12和L13在每次出现时都独立地相同或不同。
在(d’1)、(d’2)或(d’3)等于或大于2时，L’11、L’12和L’13在每次出现时都独立地相同或不同。
在本发明的范围内所设想的双官能单体链接基和功能间隔的结合，包括那些变量和取代的链接基和间隔组的结合被容许使用，以至于这样的结合导致结构式(I)的稳定化合物。例如，价值和取代基的结合不容许氧，氮或羰基被直接定位于S-S或亚胺的邻近之处。
优选的方面是，M是-S-S-、-CR16R17-O-CR14R15-O-CR18R19-或-N＝CR10-或-CR10＝N-。
具体来说，可释放的阳离子脂质有结构式(Ia)：
Figure BPA00001372549100111
具体来说，可释放的阳离子脂质有结构式(Ib)：
Figure BPA00001372549100112
式中
R14-15是从以下物质中独立地选取出来的：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂烷基、
取代C1-6杂环基、C1-6烷基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳酰基、C2-6烷氧羰、芳氧酰基、C2-6烷酰氧基、芳酰基、C2-6取代烷酰基、取代芳酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代的和芳酰基；优选，R14和R15是以下物质中选取出来的：氢、C1-6烷基、C3-8支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基和芳烷基，最好是氢、甲基、乙烷基或丙基；并且
R16-19是从以下物质中独立地选取出来的：氢、羟氢氧基、胺、替代胺基、叠氮、羧基、氰基、卤素、羟氢氧基、硝基、硅醚、砜基、巯基、C1-6烷巯基、芳巯基、取代芳巯基、取代的C1-6硫基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳酰基、C2-6烷氧羰、芳氧酰基、C2-6烷酰氧基、芳酰基、C2-6取代烷酰基、取代芳酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代和芳酰基，优选氢、甲基、乙烷基或丙基。
优选，R14和R15不能同时是氢。
优选的实施方式是，R14和R15独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-8支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基和芳烷基。
更优选地，R14和R15独立地选自：C1-6烷基(甲基、乙基、丙基)和C3-8支链烷基。在特定的实施方式中，R14和R15是甲基。
在某些实施方式中，可释放阳离子脂质有结构式(Ic)或(Ic’)：
其中，
R10是氢、C1-6烷基、C3-8支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、或取代芳基，优选氢、甲基、乙烷基或丙基。
优选的方面是，结构式(I)的化合物包括两个或两个以上的：
另一个优选的方面是，结构式(I)的复合物包括R11、R12和R13中的两个或两个以上。
一个优选的实施方式中，Y1是氧。
另一个优选的实施方式中，Y2和Y5是氧。
一个实施方式中，(d1)和(d2)不同时为零。
另一个实施方式中，(d1)、(d2)、(d3)、(d’1)、(d’2)和(d’3)不同时为零。
在此所述的结构式(I)的可释放阳离子脂质可以携带在选定的pH值阳性或中性的净电荷，如pH＜13(如pH 6-12，pH值6-8)。
2.双功能链接基：L1和L2组
根据本发明，L1包括但不限于：
-(CR21R22)t1-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22)t1Y17-(CR23R24)t2-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22CR23R24Y17)t1-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22CR23R24Y17)t1(CR25R26)t4-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-[(CR21R22CR23R24)t2Y17]t3(CR25R26)t4-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22)t1-[(CR23R24)t2Y17]t3(CR25R26)t4-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3(CR23R24)t2-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3Y14(CR23R24)t2-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3(CR23R24)t2-Y15-(CR23R24)t3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3Y14(CR23R24)t2-Y15-(CR23R24)t3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3(CR23R24CR25R26Y19)t2(CR27CR28)t3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3Y14(CR23R24CR25R26Y19)t2(CR27CR28)t3-，and
Figure BPA00001372549100131
其中，
Y16是O、NR28，或S，优选地是O；
Y14-15和Y17-19独立为O、NR29或S，优选地是O或NR29；
R21-27是从以下物质中独立选取出来：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基，优选氢、甲基、乙烷基或丙基；
R28-29是从以下物质中独立选取出来：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷基、苯氧基和C1-6杂烷氧基，优选氢、甲基、乙烷基或丙基；
(t1)、(t2)、(t3)和(t4)各自独立地为零或正整数，最好是零或从约1至10的正整数(如，1、2、3、4、5、6)；并且
(a2)和(a3)各自独立地为零或1。
在本发明范围内设想的双功能L1链接基、其中包括那些替代物和变量的结合、允许这种结合存在、所以这种结合导致了结构式(I)中稳定复合物。例如，当(a3)是零的时候、Y17没有直接地与Y14相连.
基于本发明的目的、当双功能链接基的值为等于或大于2的正整数时、可以采用相同或不同的双功能链接基。
当(t1)、(t2)、(t3)或(t4)独立地等于或大于2时，R21-R28在每次出现时都独立地相同或不同。
在一个实施方式中，Y14-15和Y17-19是O或NH；并且R21-29独立地为氢或甲基。
在另一个实施方式中，Y16是O；Y14-15和Y17-19是O或NH；并且R21-29是氢。
在某些实施方式中，L1是从下列物质中独立地选自：
-(CH2)t1-[C(＝O)]a3-，
-(CH2)t1Y17-(CH2)t2-(Y18)a2-[C(＝O)]a3-，
-(CH2CH2Y17)t1-[C(＝O)]a3-，
-(CH2CH2Y17)t1(CH2)t4-(Y18)a2-[C(＝O)]a3-，
-[(CH2CH2)t2Y17]t3(CH2)t4-(Y18)a2-[C(＝O)]a3-，
-(CH2)t1-[(CH2)t2Y17]t3(CH2)t4-(Y18)a2-[C(＝O)]a3-，
-(CH2)t1(Y17)a2[C(＝O)]a3(CH2)t2-，
-(CH2)t1(Y17)a2[C(＝O)]a3Y14(CH2)t2-，
-(CH2)t1(Y17)a2[C(＝O)]a3(CH2)t2-Y15-(CH2)t3-，
-(CH2)t1(Y17)a2[C(＝O)]a3Y14(CH2)t2-Y15-(CH2)t3-，
-(CH2)t1(Y17)a2[C(＝O)]a3(CH2CH2Y19)t2(CH2)t3-，并且
-(CH2)t1(Y17)a2[C(＝O)]a3Y14(CH2CH2Y19)t2(CH2)t3-，
其中，
Y14-15和Y17-19独立为O，或NH；
(t1)、(t2)、(t3)和(t4)各自独立地位零或正整数，优选地是零或从约1至10的正整数(如，1、2、3、4、5、6)；并且
(a2)和(a3)各自独立地为零或1。
当(t1)或(t3)等于或大于2时，Y17在每次出现时都独立地相同或不同。
当(t2)等于或大于2时，Y19在每次出现时都独立地相同或不同。
在更深入的实施方式和/或可替代的实施方式中，L1组的示范例选自：
-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，-NH(CH2)-，
-CH(NH2)CH2-，
-(CH2)4-C(＝O)-，-(CH2)5-C(＝O)-，-(CH2)6-C(＝O)-，
-CH2CH2O-CH2O-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)2-C(＝O)-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(＝O)-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(＝O)-，
-(CH2)4-C(＝O)NH-，-(CH2)5-C(＝O)NH-，-(CH2)6-C(＝O)NH-，
-CH2CH2O-CH2O-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-C(＝O)-NH-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(＝O)-NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-，-CH2CH2O-CH2O-.
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-，-CH2-O-(CH2CH2O)2-，
Figure BPA00001372549100151
Figure BPA00001372549100161
-C(＝O)NH(CH2)2-，-CH2C(＝O)NH(CH2)2-，
-C(＝O)NH(CH2)3-，-CH2C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)NH(CH2)4-，-CH2C(＝O)NH(CH2)4-，
-C(＝O)NH(CH2)5-，-CH2C(＝O)NH(CH2)5-，
-C(＝O)NH(CH2)6-，-CH2C(＝O)NH(CH2)6-，
-C(＝O)O(CH2)2-，-CH2C(＝O)O(CH2)2-，
-C(＝O)O(CH2)3-，-CH2C(＝O)O(CH2)3-，
-C(＝O)O(CH2)4-，-CH2C(＝O)O(CH2)4-，
-C(＝O)O(CH2)5-，-CH2C(＝O)O(CH2)5-，
-C(＝O)O(CH2)6-，-CH2C(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)5-，并且
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)6-.
在某些实施方式中，L2包括但不限于：
-(CR’21R’22)t’1-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’2-，
-(CR’21R’22)t’1Y’14-(CR’23R’24)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’3-，
-(CR’21R’22CR’23R’24Y’14)t’1-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’2-，
-(CR’21R’22CR’23R’24Y’14)t’1(CR’25R’26)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’3-，
-[(CR’21R’22CR’23R’24)t’2Y’14]t’1(CR’25R’26)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1-[(CR’23R’24)t’2Y’14]t’2(CR’25R’26)t’3-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’4-
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3(CR’23R’24)t’2-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3Y’15(CR’23R’24)t’2-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3(CR’23R’24)t’2-Y’15-(CR’23R’24)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3Y’14(CR’23R’24)t’2-Y’15-(CR’23R’24)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3(CR’23R’24CR’25R’26Y’15)t’2(CR’27CR’28)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3Y’17(CR’23R’24CR’25R’26Y’15)t’2(CR’27CR’28)t’3-，并且
Figure BPA00001372549100171
其中，
Y’16是O，NR’28，或S，优选地是O；
Y’14-15和Y’17独立地为O，NR’29，或S，优选地是O或NR’29；
R’21-27独立选自以下物质：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基、优选氢、甲基、乙烷基或丙基；
R’28-29独立选自以下物质：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基、优选氢、甲基、乙烷基或丙基；
(t’1)，(t’2)，(t’3)and(t’4)各自独立地位零或正整数，最好是零或从约1至10的正整数(如1，2，3，4，5，6)；并且
(a’2)和(a’3)各自独立地为零或1.
在本发明范围内设想的双功能L2链接基、其中包括那些链接基组的替代物和变量的结合合、允许这种结合存在、所以这种结合导致了结构式(I)中稳定复合物。例如，当(a’3)是零的时候、Y′14没有直接地与Y′14或Y’17相连.
基于本发明的目的、当双功能链接基L2的值为等于或大于2的正整数时、可以采用相同或不同的双功能链接基。
在一个实施方式中，Y’14-15和Y’17是O或NH；并且R’21-29独立地为氢或甲基。
在另一则实施方式中，Y’16是O；Y’14-15和Y’17是O或NH；并且R’21-29是氢。
在某些实施方式中，L2是独立地选自：
-(CH2)t’1-[C(＝O)]a’3(CH2)t’2-，
-(CH2)t’1Y’14-(CH2)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝O)]a’3(CH2)t’3-，
-(CH2CH2Y’14)t’1-[C(＝O)]a’3(CH2)t’2-，
-(CH2CH2Y’14)t’1(CH2)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝O)]a’3(CH2)t’3-，
-[(CH2CH2)t’2Y’14]t’1(CH2)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝O)]a’3(CH2)t’3-，
-(CH2)t’1-[(CH2)t’2Y’14]t’2(CH2)t’3-(Y’15)a’2-[C(＝O)]a’3(CH2)t’4-，
-(CH2)t’1(Y’14)a’2[C(＝O)]a’3(CH2)t’2-，
-(CH2)t’1(Y’14)a’2[C(＝O)]a’3Y’15(CH2)t’2-，
-(CH2)t’1(Y’14)a’2[C(＝O)]a’3(CH2)t’2-Y’15-(CH2)t’3-，
-(CH2)t’1(Y’14)a’2[C(＝O)]a’3Y’14(CH2)t’2-Y’15-(CH2)t’3-，
-(CH2)t’1(Y’14)a’2[C(＝O)]a’3(CH2CH2Y’15)t’2(CH2)t’3-，and
-(CH2)t’1(Y’14)a’2[C(＝O)]a’3Y’17(CH2CH2Y’15)t’2(CH2)t’3-，
其中，
Y’14-15和Y’17独立地为O或NH；
(t’1)、(t’2)、(t’3)和(t’4)各自独立地位零或正整数，优选地是零或从约1到10的正整数(如，1、2、3、4、5、6)；并且
(a’2)和(a’3)独立为0或1。
在(t’1)或(t’2)等于或大于2时，Y’14每次出现都相同或不同。
在(t’2)等于或大于2时，Y’15每次出现都相同或不同。
在更深入的实施方式和/或可替代的实施方式中，L2组的示范例选自以下：
-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，-NH(CH2)-，
-CH(NH2)CH2-，
-O(CH2)2-，-C(＝O)O(CH2)3-，-C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)(CH2)2-，-C(＝O)(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-NH(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-，
-(CH2)2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-，
-(CH2CH2O)2-，-CH2CH2O-CH2O-.
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-，-CH2-O-(CH2CH2O)2-，
Figure BPA00001372549100191
-(CH2)2NHC(＝O)-(CH2CH2O)2-，
-C(＝O)NH(CH2)2-，-CH2C(＝O)NH(CH2)2-，
-C(＝O)NH(CH2)3-，-CH2C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)NH(CH2)4-，-CH2C(＝O)NH(CH2)4-，
-C(＝O)NH(CH2)5-，-CH2C(＝O)NH(CH2)5-，
-C(＝O)NH(CH2)6-，-CH2C(＝O)NH(CH2)6-，
-C(＝O)O(CH2)2-，-CH2C(＝O)O(CH2)2-，
-C(＝O)O(CH2)3-，-CH2C(＝O)O(CH2)3-，
-C(＝O)O(CH2)4-，-CH2C(＝O)O(CH2)4-，
-C(＝O)O(CH2)5-，-CH2C(＝O)O(CH2)5-，
-C(＝O)O(CH2)6-，-CH2C(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)5-，并且
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)6-.
在更深入的实施方式和/或可替代的实施方式中、双功能链接基L1和L2可以是有被取代的饱和或不饱和的、支链的或线性的、C3-50烷基(如，C3-40烷基、C3-20烷基、C3-15烷基、C3-10烷基等)的间隔，其中一个或多个碳原子可选择性地被NR6、O、S或C(＝Y)取代，(优选地是O或NH)，但被取代的碳不超过70％(如小于60％、50％、40％、30％、20％、10％)。
3.L11-13和L’11-13的双功能间隔
依据本发明，L11-13和L’11-13的双功能间隔是终端双功能链接基，可以连接到阳离子基，如胍盐、DBU、DBN等。双功能链接基L11-13和L’11-13独立选自以下物质：
-(CR31R32)q1-；和
-Y26(CR31R32)q1-，
其中，
Y26是O、NR33或S，优选地是O或NR33；
R31-32独立选自氢、OH、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基，优选氢、甲基、乙烷基或丙基；并且
R33选自：氢，C1-6烷基，C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基，优选氢、甲基、乙烷基或丙基；并且
(q1)是零或正整数、优选地是零或从约1至10的正整数(如，1、2、3、4、5、6)。
在本发明范围内设想的双功能间隔，其中包括那些替代物和变量的结合，允许这种结合存在，以便结构式(I)中稳定复合物。
在(q1)等于或大于2时，R31和R32每次出现都独立地相同或不同。
在一个优先的实施方式中，R’31-33是氢或甲基。
在更深入的实施方式和/或可替代的实施方式中，L11-13和L’11-13独立选自：
-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，
-O(CH2)2-，-O(CH2)3-，-O(CH2)4-，-O(CH2)5-，-O(CH2)6-，
-(CH2CH2O)-CH2CH2-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2-，
-C(＝O)O(CH2)3-，-C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)(CH2)2-，-C(＝O)(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-NH(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-，and
-(CH2)2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-.
依据本发明，X(Q1)(Q2)(Q3)基的实施例包括：
X’(Q’1)(Q’2)(Q’3)基的一些实施例包括：
Figure BPA00001372549100221
在优选的实施方式中，R11和R12均包括：
优选地，R’11和R’12均包括：
Figure BPA00001372549100223
B.结构式(I)的化合物的制备
具体化合物的典型制备方法在实施例中予以说明。
然而，通常，本发明的化合物，可用几种方式制备完成。所述结构式(I)的化合物制备方法包括使胺功能化胆固醇(功能胆固醇)与1H-吡唑(聚合吡唑)-1-甲脒发生反应、生成胍盐基。与胆固醇连接的胺可以是一个主要和/或二级胺，及在1H-吡唑(聚合吡唑)-1-甲脒的胺可以不被替换或替换掉。
在一个实施方式中、所述结构式(I)的化合物制备方法、包括使含有二硫键的胆固醇衍生物与含胺基发生反应，随即胍盐胺转换后，生成有二硫键阳离子脂质。
在另一实施方式中，所述结构式(I)的化合物制备方法，包括使含有缩酮键的胆固醇衍生物与含胺基发生反应，随即胍盐胺转换后，生成含有缩酮或乙缩醛成分的阳离子脂质。
在另一个实施例中，所述结构式(I)的化合物制备方法，包括使含有乙醛成分的胆固醇衍生物与胺基发生反应，生成成亚胺，随即胍盐胺转换后、生成含有亚胺成分的阳离子脂质。
制备含有二硫键的胆固醇阳离子脂质的一个示例见图1。首先，在偶联剂(二氯乙烷)与基本成分(二甲基氨基吡啶)存在的条件下，胆固醇与含有二硫化物组的胺保护的半胱氨酸发生反应，形成了胆固醇半胱氨酸酯(化合物3)。酯的二硫化物组与含有硫基和氨基保护基团的双功能间隔发生反应，生成二硫键。移除双功能间隔的胺保护基团，随即与含有氨基端的分支基聚合，生成胺功能化的胆固醇。胺功能化胆固醇的氨基端与1H-聚合吡唑-1-甲脒作用，生成含有二硫键阳离子脂质。
制备含有含有缩酮链接基的胆固醇阳离子脂质的另一示例见图2和图3。一个含有缩酮键的双功能连接(化合物23)被制备。用乙烷三氟乙酸保护含有缩酮键的双功能链接基的一个胺。一个活跃的胆固醇碳酸盐，如胆固醇氯甲酸酯、胆固醇NHS碳酸盐或胆固醇PNP碳酸盐，与其他双功能连接中的亲核试剂胺发生反应，在三氟乙酰胺组脱保护后，生成带有胺基端得胆固醇衍生物。该胺基端进一步与赖氨酸反应、生成有分支部分的胆固醇衍生物(化合物30)。胆固醇衍生物分支部分中的胺与1H-吡唑(聚合吡唑)-1-甲脒发生反应，生成含有缩酮组的胆固醇阳离子脂质。
可选地，制备含有胺连接的胆固醇阳离子脂质的另一个示例说明见图4。含有一个胺和保护胺的双功能连接(化合物44)是从化合物41和化合物42中，分两个步骤制备出来的。一种活跃的胆固醇碳酸盐，如胆固醇氯甲酸酯、胆固醇NHS碳酸盐或胆固醇PNP碳酸盐，与一种含有化合物(如3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)的乙醛发生反应，生成包含乙醛的胆固醇衍生物。双功能连接的亲核胺与包含乙醛的胆固醇衍生物发生反应，生成亚胺键，随即在温和的基础条件下脱保护胺之后，生成含有胺基端的胆固醇衍生物。胺基端与1H-吡唑(聚合吡唑)-1-甲脒发生反应、生成含有亚胺组的胆固醇阳离子脂质。
根据本发明，且无不适当实验，可以采用本领域公知技术制备结构式(I)的化合物。
胺基化合于胆固醇的方法，可以在目前的基础条件下通过使用标准的有机合成技术，及使用本技术领域中公知的偶联剂，如1，3-二异丙碳二亚胺(DIPC)、二烃基碳二亚胺、2-卤素-1-烷基吡啶卤化物、1-(3-二甲氨基)-3-乙基、碳二亚胺(二氯乙烷)、丙烷膦酸环酐(PPACA)和二氯化磷酸苯酯二氯化磷酸苯酯得以实现。
在进一步的实施方式中，当胆固醇或胺类化合物激活，用一个如不是必须的NHS、PNP、偶联剂的移除基团实现，反应在目前的基础条件下进行。
通常，所述的结构式(I)的化合物优选通过活性胆固醇与含有胺基的亲核试剂反应制备，在目前的基础如二甲基氨基吡啶或二异丙基乙胺条件下进行。优选地，反应在惰性溶剂中进行，如二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、二甲基甲酰胺二氯甲烷(甲苯)，甲苯或其混合物。反应优选在目前的基础条件下进行，如二甲基氨基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、三乙胺等，反应进行的温度范围-4℃～70℃左右(如-4℃～50℃左右)。在一个优选的实施方式中，反应在0℃～25℃左右或0℃到室温左右的温度范围下进行。
从胺基化合物中去除保护基团，要使用强酸，如三氟醋酸(TFA)、HCl、硫酸等，或直接氢化、强烈反应等。可选地，保护基团的移除可以通过使用一个反应基础如哌啶来实现。在一个实施方式中，Boc基团的脱保护通过使用二氧杂环乙烷中的HCl溶液来实现。在另一实施方式中，Fmoc基团的脱保护是通过使用哌啶实现。脱保护反应可以在-4℃～50℃左右的温度范围下进行。优选温度范围为0℃～25℃左右或至室温。在另一实施方式中，Boc基团的脱保护在室温下进行。
胺基到胍基成分的转化，通过在一个惰性溶剂，如二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基甲酰胺或其混合物中，胆固醇的一个胺连接(如化合物9的胺基)和1H-吡唑(聚合吡唑)-1-甲脒反应来实现。其他试剂，如N-BOC-1H-吡唑-1-羧酸脒或N，N′-Di-(叔丁氧羰基)硫脲和偶联剂，也可以用于胺基到胍基成分的转化。
本技术领域公知的偶联剂，如1，3-二异丙基碳二酰亚胺(DIPC)、二烷基碳二亚胺、2-卤-1-烷基吡啶卤化物、1-(3-二甲氨基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、丙烷膦酸环酐(PPACA)和苯基二氯磷酸盐，可以用于制备所述的阳离子脂质。反应优选在目前的基础条件下进行，如二甲基氨基吡啶、二异丙基乙胺、吡啶、三乙胺等，反应的温度范围-4℃～50℃左右。在一个优选的实施方式中，反应在0℃～25℃左右或至室温左右的温度范围下进行。
所述制备方法中有代表性的实施方式包括，但不限于：
Figure BPA00001372549100251
Figure BPA00001372549100281
C.纳米粒子的组份/结构式
1.概述
本发明的一个方面是，纳米粒子的组份包含了阳离子脂质。
据本发明，纳米粒子组份含有结构式(I)的化合物、致融类脂质，和PEG-脂质。
一个优选方面是，纳米粒子的组份含有胆固醇。
本发明的另一个优选方面是，所述纳米粒子组份可以含有本技术领域内公知的其他的阳离子脂质。可以认为纳米粒子组份含有不同致融类脂质(非阳离子脂质)的混合物和/或不同PEG-脂质的混合物。
另一个方面，纳米粒子组份含有阳离子脂质，该阳离子脂质包括占纳米粒子组合物(药用载体)摩尔比例约10％～99.9％的结构式(I)的化合物。
在纳米粒子组份中，阳离子脂质占脂肪总量的范围约2％～60％、约5％～50％、约10％～45％、约15％～25％，或约30％～40％。
在一个实施方式中，在纳米粒子组份中，阳离子脂质占脂肪总量的范围约15％～25％(例如，15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％)。
据本发明，所述纳米粒子组份可以含有总致融脂质/非阳离子脂质，该总致融脂质/非阳离子脂质含有胆固醇和/或以非胆固醇为基础的致融类脂质，在所述纳米粒子组份中，总致融脂质/非阳离子脂质组份占脂肪总量的摩尔比约为20％～85％、约25％～85％、约60％～80％(如65％、75％、78％，或80％)。在一个实施方式中，在纳米粒子组份中，总致融脂质/非阳离子脂质占脂肪总量约80％。
某些实施方式中，在纳米粒子组份中，以非胆固醇为基础的致融脂质/非阳离子脂质占脂肪总量的摩尔比约25％～78％(25％、35％、47％、60％，或78％)，或约60％～78％。在一个实施方式中，在纳米粒子组份中，以非胆固醇为基础的致融类脂质/非阳离子脂质占脂肪总量约60％。
某些实施方式中，在纳米粒子组份中，除了含有非胆固醇还含有胆固醇的致融类脂质占脂肪总量的摩尔比约0％～60％、约10％～60％、约20％～50％(即20％、30％、40％、50％)。在一个实施方式中，在纳米粒子组份中，胆固醇占脂肪总量约20％。
某些实施方式中，纳米粒子组份中PEG-脂质占脂肪总量的摩尔比约0.5％～20％、约1.5％～18％。在纳米粒子组份的一个实施方式中，PEG-脂质占脂肪总量的摩尔比约2％～10％(如，2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)。例如，PEG-脂质总量占纳米粒子组份中脂肪总量约2％。
2.阳离子脂质
本发明的一方面，纳米粒子组份中含有结构式(I)的化合物。
本发明的另一个方面，所述纳米粒子组合物可以包括本技术领域公知的其他阳离子脂质。其他合适的脂质也可以包括其中，例如：
N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物(DOTMA)；
1，2-二(油酰氧基)-3-3-(三甲铵)丙烷或
N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲铵氯化物(DOTAP)；
1，2-二(二肉豆蔻氧基)-3-3-(三甲铵)丙烷(DMTAP)；
1，2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵或N-(1，2-二肉豆蔻氧基3-丙基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；
二甲基二(十八烷酰)溴化铵或N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)；
3-(N-(N’，N’-二甲基氨基乙烷)氨甲酰基)胆固醇(DC胆固醇)；
3β-[N’，N’-二胍基乙基-氨基乙烷)氨甲酰基胆固醇(BGTC)；
2-(2-(3-(二(3-氨基丙基)氨基)丙基氨基)乙酰胺基)-N，N-二(十四烷基)乙酰胺(RPR209120)；
1，2-二烯酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(即1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱，1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱和1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱)；
四甲基四棕榈酰精胺(TMTPS)；
四甲基四油酰精胺(TMTOS)；
四甲基四月桂基精胺(TMTLS)；
四甲基四肉豆蔻酰精胺(TMTMS)；
四甲基二油酰精胺(TMDOS)；
2，5-二(3-氨丙基氨基)-N-(2-(二(十八烷酰)氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS)；
2，5-二(3-氨丙基氨基)-N-(2-(二(Z)-十八烷基-9-二烯氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DOGS-9-en)；
2，5-二(3-氨丙基氨基)-N-(2-(二(9Z，12Z)-十八烷基-9，12-二烯氨基)-2-氧乙基)戊酰胺(DLinGS)；
N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67)；
(9Z，9’Z)-2-(2，5-二(3-氨丙基氨基)戊胺)丙烷-1，3-二(二(十八烷酰))-9-烯酸酯(DOSPER)；
2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸酯(DOSPA)；
1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲铵-丙烷；1，2-二硬脂酰-3-三甲铵-丙烷；
二(十八烷酰)二甲铵(DODMA)；
二硬脂酰二甲铵(DSDMA)；
N，N-二油酰-N，N-二甲铵氯化物(DODAC)；药学上可接受的盐类及相关混合物。
在专利号为US2007/0293449和专利号为4,897,355；5,279,833；6,733,777；6,376,248；5,736,392；5,686,958；5,334,761；5,459,127；2005/0064595；5,208,036；5,264,618；5,279,833；5,283,185；5,753,613和5,785,992的美国专利文件中，有关于阳离子脂质的详细记载。
在另一个实施方式中，所述纳米粒子组份可以包括专利号为PCT/US09/52396文件中记载的阳离子脂质，该专利文件内容可以作为本发明的参考。例如，所述纳米粒子组份可以包括结构式(I)化合物及下述成份组成的混合物：
Figure BPA00001372549100311
此外，市场上可购得的含有阳离子脂质的制剂被应用于以下产品：例如，LIPOFECTIN
Figure BPA00001372549100312
(含有DOTMA和DOPE的阳离子脂质、购自GIBCO/BRL公司、Grand Island，New York，USA)；LIPOFECTAMINE
Figure BPA00001372549100321
(含有DOSPA和DOPE的阳离子脂质、购自GIBCO/BRL公司、Grand Island，New York，USA)和TRANSFECTAM
Figure BPA00001372549100322
(含有DOGS的阳离子脂质、购自Promega公司、Madison，Wisconsin，USA)。
3.致融类脂质/非阳离子脂质
据本发明，纳米粒子组份可以含有致融脂质。该致融脂质含有诸如中性不带电、两性离子和阴离子脂质的非阳离子脂质。基于本发明目的，“致融脂质”和“非阳离子脂质”两个术语可以相互替换。
许多致融脂质包括通常具有疏水基序和极性头基团的两性脂质，其可在许多水溶液中形成囊泡。
中性脂质包含一种脂质，这种脂质在选定的PH值，最好是在生理PH值，以不带电离子或中性离子的形式存在。此类脂质例子包括二酰基磷酸胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰甘油。
阴离子脂质包含了在生理PH值上带负电的脂质。这些脂质包括但不限于：磷酸甘油、双磷酸甘油、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N十二醯基磷脂酰乙醇胺，N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酸酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷酸甘油、棕榈酰油酰磷酸甘油(POPG)和用其他阴离子组修正过的中性脂质。
许多致融脂质含有一般有一个疏水基和极性端基的两性脂肪，并可以在水溶中形成囊泡。
可以认为，致融脂质包括自然生成及合成的磷脂和相关脂质。
一个非阳离子脂质的非限制清单可以选自磷脂和以非磷脂质为基础的物质，如卵磷脂、溶血卵磷脂、二酰基磷酸胆碱、溶血磷酸胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、神经酰胺、双磷酸甘油、磷脂酸、磷酸甘油、脑苷脂、磷酸二鲸蜡脂；
1，2-二月桂酰-sn-甘油(DLG)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油(DMG)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油(DPG)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油(DSG)；
1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DLPA)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DMPA)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DPPA)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DSPA)；
1，2-二(十八烷酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)；
1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DPePC)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或二棕榈酰磷酸胆碱(DPPC)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)；
1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或二棕榈酰磷脂酰-乙醇胺(DPPE)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺(DSPE)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；
1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DLPG)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)or 1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-sn-1-甘油(DMP-sn-1-G)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油or二棕榈酰磷酸甘油(DPPG)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DSPG)或1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-sn-1-甘油(DSP-sn-1-G)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DPPS)；
1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PLinoPC)；
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或棕榈酰油酰磷酸胆碱(POPC)；
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)；
1-棕榈酰-2-溶血-sn-甘油-3-磷酸胆碱(P-溶血-PC)；
1-硬脂酰-2-溶血-sn-甘油-3-磷酸胆碱(S-溶血-PC)；
二植烷酰磷脂酰乙醇胺(DPhPE)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱或二油酰磷酸胆碱(DOPC)；
1，2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPhPC)，
二油酰磷酸甘油(DOPG)；
棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)；
二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧化物(DOPE-mal)；
16-O-一甲基PE；
16-O-二甲基PE；
18-1-反式PE；1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)；
1，2-dielaidoyl-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)；和药学上可接受的盐类及混合物。有关致融脂质在专利申请公布号为2007/0293449和2006/0051405的美国专利文件中有详细记载。
非阳离子脂质包括甾醇类和固醇类，如胆固醇。
其他非阳离子脂质，如硬脂酰胺、十二烷氨基、十六烷氨基、乙酰棕榈酸酯、蓖麻油酸甘油酯、十六烷酰硬脂酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺月桂酰硫酸酯、烷芳基磷酸酯聚乙氧基化脂肪酸胺，和二(十八烷酰)二甲基溴化铵。
可以认为阴离子脂质包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、卵磷脂、血小板活化因子(PAF)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰-DL甘油、磷脂酰肌醇、双磷酸甘油、心磷脂、溶血磷脂、氢化磷脂、鞘脂、神经节苷脂、植物鞘氨醇、鞘氨醇、药学上可接受的盐及混合物。
所述的适合用于制备纳米粒子组合物的非阳离子脂质包括：二酰基磷酸胆碱(例如，二硬脂酰卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈县磷酸胆碱和二亚油酰磷脂酰-胆碱)、二酰基磷脂酰乙醇胺(如二油酰磷脂酰乙醇胺和棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺)、神经酰胺或(神经)鞘脂类。在这些脂质里的酰基组优选是有饱和及不饱和碳链的脂肪酸，如亚麻酰、异十八醇、油烯基、elaidyl、十八碳酰基、亚麻醇、油硬脂酰(elaeostearyl)、花生甘醇、十四酰、十六酰和十二酰。更优选的酰基组是、十二酰、十四酰、十六酰、硬脂醯基或油酰。可选地，而且/最好地，脂肪酸含有饱和及不饱和的C8-C30(优选C10-C24)的碳链。
所述纳米粒子组合物中各种有用的磷酸胆碱包括：
1，2-二癸酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DDPC，C10:0，C10:0)；
1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC，C12:0，C12:0)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC，C14:0，C14:0)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC，C16:0，C16:0)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC，C18:0，C18:0)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC，C18:1，C18:1)；
1，2-二瓢儿菜酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC，C22:1，C22:1)；
1，2-二(二十碳五烯酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(EPA-PC，C20:5，C20:5)；
1，2-二(二十二碳六烯酰)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DHA-PC，C22:6，C22:6)；
1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MPPC，C14:0，C16:0)；
1-肉豆蔻酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MSPC，C14:0，C18:0)；
1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PMPC，C16:0，C14:0)；
1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PSPC，C16:0，C18:0)；
1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SMPC，C18:0，C14:0)；
1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SPPC，C18:0，C16:0)；
1，2-肉豆蔻酰-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(MOPC，C14:0，C18:0)；
1，2-棕榈酰-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPC，C16:0，C18:1)；
1，2-硬脂酰-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPC，C18:0，C18:1)，和药学上可接受的盐类及相关混合物。
所述纳米粒子组合物中各种有用的溶血磷脂胆碱包括：
1-肉豆蔻酰-2-溶血-sn-甘油-3-磷酸胆碱(M-溶血PC，C14:0)；
1-棕榈酰-2-溶血-sn-甘油-3-磷酸胆碱(P-溶血PC，C16:0)；
1-硬脂酰-2-溶血-sn-甘油-3-磷酸胆碱(S-溶血PC，C18:0)，和药学上可接受的盐类及其混合物。
所述纳米粒子组合物中各种有用的磷酸甘油可以选自下列物质：
氢化大豆磷酸甘油(HSPG)；
非氢化卵磷酸甘油(EPG)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG，C14:0，C14:0)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DPPG，C16:0，C16:0)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DSPG，C18:0，C18:0)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DOPG，C18:1，C18:1)；
1，2-二瓢儿菜酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DEPG，C22:1，C22:1)；
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG，C16:0，C18:1)，和药学上可接受的盐类及相关混合物。
所述纳米粒子组合物中各种有用的磷脂酸包括：
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DMPA，C14:0，C14:0)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DPPA，C16:0，C16:0)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酸(DSPA，C18:0，C18:0)，
和药学上可接受的盐类及相关混合物。
所述纳米粒子组合物中各种有用的磷脂酰乙醇胺包括：
氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)；
非氢化卵磷脂酰乙醇胺(EPE)；
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE，C14:0，C14:0)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE，C16:0，C16:0)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE，C18:0，C18:0)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE，C18:1，C18:1)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE，C22:1，C22:1)；
1，2-二瓢儿菜酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE，C16:0，C18:1)，和药学上可接受的盐类及相关混合物。
所述纳米粒子组合物中各种有用的磷脂酰丝氨酸包括：
1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DMPS，C14:0，C14:0)；
1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DPPS，C16:0，C16:0)；
1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DSPS，C18:0，C18:0)；
1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS，C18:1，C18:1)；
1-棕榈酰-2-油酰-sn-3-磷酸-L-丝氨酸(POPS，C16:0，C18:1)，和药学上可接受的盐类及相关混合物。
在一个优选的实施方式中，所述纳米粒子组合物中各种有用的中性脂质包括：例如
二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，
二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，
棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)，
卵磷酸胆碱(EPC)，
二棕榈酰磷酸胆碱(DPPC)，
二硬脂酰磷酸胆碱(DSPC)，
二油酰磷酸胆碱(DOPC)，
棕榈酰油酰磷酸胆碱(POPC)，
二棕榈酰磷酸甘油(DPPG)，
二油酰磷酸甘油(DOPG)，
二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧化物(DOPE-mal)，胆固醇、药学上可接受的盐和其混合物。
在某些优选实施方式中，此处所述的纳米粒子组合物中包括：双饱和卵磷脂二硬脂酰磷酸胆碱、EPC，DOPE等，及其混合物。
本发明的另一个方面，纳米粒子组成物含有如固醇等的非阳离子脂质。纳米粒子组合物含有胆固醇或类其似物稍佳，含有胆固醇更佳。
4.PEG脂质
据本发明，所述纳米粒子组合物含有PEG脂质。PEG-脂质延长所述纳米粒子的体内循环，并阻止纳米粒子过早的排出体外。PEG-脂质降低免疫原性，提高纳米粒子的稳定性。
在纳米粒子组合物中有益的PEG-脂质，包括膜融合/非阳离子脂质的PEG形式。PEG-脂质包括，例如，偶联在甘油二酯上的PEG、偶联在聚乙烯上的PEG、偶联在二烷氧基丙基上的PEG(PEG-DAA)、偶联在磷脂上的PEG、例如偶联在磷脂酰乙醇胺的PEG(PEG-PE)、偶联在神经酰胺的PEG(PEG-Cer)、偶联在胆固醇衍生物的PEG(PEG-Chol)或相关混合物。见专利号为5885613和5820873和申请公布号为2006/051405的美国专利文件，上述文件的内容可以作为本发明的参考。
PEG(PEG)的结构式通常如下：
-O-(CH2CH2O)n-
其中，(n)是一个大约5～2300的正整数，优选大约5～460的正整数，以便使PEG-脂质的聚合物部分有一个平均约200～10万道尔顿的分子量，优选约200～20,000道尔顿的分子量。(n)代表聚合物的聚合度，并取决于聚合物的分子量。
在优先实施方式中，PEG是一种含有平均约200～20,000道尔顿的分子量的聚乙烯乙二醇，优选分子量范围约500～10000道尔顿，更优选分子量范围约1000～5000道尔顿(即约1500～3000道尔顿)。在一个实施例中，PEG约有2000道尔顿分子量。在另一个实施例中，PEG约有750道尔顿分子量。
此外，作为PEG(PEG)的残基结构式如下：
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71-，
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(＝Y72)-Y71-，
-Y71-C(＝Y72)-(CH2)a12-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a12-C(＝Y72)-Y71-和
-Y71-(CR71R72)a12-Y73-(CH2)b12-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b12-Y73-(CR71R72)a12-Y71-，
其中：
Y71和Y73是相对独立的O、S、SO、SO2、NR73或键；
Y72是O、S或NR74，优选氧；
R71-74是独立选择于氧、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代烯基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂环基、取代C1-6杂环基、C1-6烷基、芳氧基、C1-6heteroalkoxy、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳酰基、C2-6烷氧羰、芳氧酰基、
C2-6烷酰氧基、芳酰氧基、C2-6取代烷酰基、取代芳酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧酰基、C2-6取代烷酰氧基和取代芳酰氧基，优选氧、甲基、乙基或丙基；
(a12)和(b12)是彼此无关的零或正整数，优选零或约1～6的整数(即1、2、3、4、5、6)，更优选1或2，和
(n)是范围约5～2300中的整数、优选范围约5～460。
PEG可以H、NH2、OH、CO2、C1-6烷基(如甲基、乙基、丙基)、C1-6烷基、酰基或芳基作为末端。在一个优选实施方式中、PEG的末端羟氢氧基组被甲氧基或者甲基组取代。在一个优选的实施方式中，在PEG-脂质中采用的PEG是含甲氧基的PEG。
PEG可直接或通过一个链接基结合到脂质。通过运用专利号为5122614和5808096的美国专利文件记载的技术及本领域其他公知技术，无需进行过多的实验，将结合到脂质结构上的聚合物转换成一个合适的活化聚合物。
有益于PEG-脂质制备的活化PEG的例子包括，例如，甲氧基PEG-琥珀酸酯、mPEG-NHS、PEG单甲醚乙二醇丁二酸酯(甲氧基PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯)、甲氧基PEG-乙酸(mPEG-CH2COOH)、PEG单甲醚乙二醇-胺(mPEG-NH2)(甲氧基PEG-胺(mPEG-NH2))和甲氧基PEG-三氟乙基磺酸酯(mPEG-TRES)。
一方面，具有羧基酸组端的聚合物可用于制备PEG-脂质。具有羧基酸端的高纯聚合物的制备方法在专利申请号为11/328,662的美国专利申请文件中有记载，该文件的内容可作为本发明的参考。
另一方面，具有胺组端的聚合物可用于制备PEG-脂质。具有胺组端的制备方法在专利申请号为11/508,507和11/537,172的美国专利申请文件中有记载，上述专利文件的内容可作为本发明的参考。
PEG和脂质通过一个链接基可以连接起来，即含有非酯基或酯基的链接基。合适的含有非酯基的链接基包括但不限于，一个酰胺链接基、一个氨基链接基、一羰基链接基、一个氨基甲酸盐链接基、一个碳酸盐(OC(＝O)O)链接基、一个尿素链接基、一个醚基链接基、一个琥珀酰链接基，及上述链接基的组合。合适的酯基链接基包括，如琥珀酰去端肽胶原、磷酸盐脂(-O-P(＝O)(OH)-O-)、磺酸盐酯及其组合。
在一个实施方式中，所述的纳米粒子组合物含有构成可以包括PEG-甘油二酯(PEG-DAG)或聚乙烯。合适的PEG-甘油二酯PEG-二酰甘油或PEG-聚乙烯。聚合物是包括有烷基链的烷基链或二烷基醇胺基团，且烷基链含有约C4～C30(优选C8～C24)长度的彼此无关的饱和或不饱和碳原子。该烷基链或二烷基醇胺基团可以进而包括一个或多个可取代的烷基组。
所述的术语“甘油二酯”(DAG)是指一种具有两个多脂肪酰基链R111和R112的化合物，R111和R112是用相同或不同长度的约为4～30碳量(优选约8～24)的碳链通过酯链接基结合在甘油上。酰基组可饱和或有不同程度的不饱和度。甘油二酯的结构式通常为：
在一个优选的实施方式中，PEG-甘油二酯聚合物是一种PEG-二月桂基甘油(C12)、一种PEG-二肉豆蔻酰甘油(C14，DMG)、一种PEG-二棕榈酰甘油(C16，DPG)或一种PEG-二油酰甘油(C18，DSG)。本领域的技术人员很容易想到其他的二酰甘油也存在于PEG-二酰甘油(diacylglycol)中。本发明中合适的PEG-二酰甘油聚合物，及其制备和使用方法，在专利申请公布号为2003/0077829的美国专利申请文件、专利申请号为CA 02/00669的PCT专利文件中均有记载，上述文件的内容可作为本发明的参考。
PEG-二酰甘油偶合物的例子可以选自PEG-二月桂基甘油(C12)、PEG-二肉豆蔻酰甘油(C14)、PEG-二棕榈酰甘油(C16)、PEG-二油酰甘油(C18)。PEG-diacylglycamide的例子包括PEG-二月桂基醇胺(C12)、PEG-二肉豆蔻酰醇胺(C14)、PEG-二棕榈酰-醇胺(C16)和PEG-二硬脂酰醇胺(C18)。
在另一实施方式中，所述纳米粒子组合物可以包括一种PEG-二烷氧基丙基聚合物(PEG-DAA)。
所述术语“甘油二酯”(DAG)是指一种具有两个多脂肪酰基链R111和R112的化合物，R111和R112是用相同或不同长度的约为4～30碳量(优选约8～24)的碳链通过酯链接基结合在甘油上。酰基组可饱和或有不同程度的不饱和度。一般地，甘油二酯具有结构式：
所述术语“二烷氧基丙基”指的是有两个烷基R111和R112链化合物，R111和R112烷基组是相同或不同长度的约为4～30碳量(优选约8～24)的碳链。烷基组可饱和或有不同程度的不饱和度。二烷氧基丙基的结构式通常为：
Figure BPA00001372549100392
其中R111和R112是相同或不同长度的约为4～30碳量(优选约8～24)的碳链。烷基组可饱和或有不同程度的不饱和度。合适的烷基包括但不限于，十二烷基(C12)、十四烷基(C14)、十六烷基(C16)、十八烷基(C18)、油酰(C18)和icosyl(C20)。
在一个实施方式中，R111和R112是相同的，即R111和R112是两个十四烷基(C14)、两个十八烷基(C18)或两个油酰(C18)等，在另一实施方式中，R111和R112是不同的，即R111是十四烷基(C14)和R112是十八烷基(C18)。在优选实施方式中，PEG-dialkylpropyl偶合体含有相同的R111和R112。
此外，另一个实施方式中，所述纳米粒子组合物可以包括偶联在磷脂酰乙醇胺上的PEG(PEG-PE)。对于PEG-脂质聚合物有益的磷脂酰乙醇胺可以包括含有碳链长度在约4～30碳量(优选约8～24)的饱和或不饱和多脂肪酸。合适的磷脂酰乙醇胺包括但不限于：二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在另一个实施方式中，所述的纳米粒子组合物可以包括，偶联在神经酰胺上的PEG(PEG-Cer)。神经酰胺只有一个酰基组。神经酰胺可以包括含有碳链长度在约4～30碳量(优选约8～24)的饱和或不饱和多脂肪酸。
在替代实施方案中，所述的纳米粒子组合物可以包括PEG结合胆固醇衍生物。术语“胆固醇衍生物”是指任何含有修改过结构的类胆固醇，即代替物和/或者因此而产生的缺失。此处胆固醇衍生物还包括类固醇激素和胆汁酸。PEG-脂质的说明性例子包括N-(碳酰基-甲氧基PEG)-1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(2kDamPEG-DMPE或5kDamPEG-DMPE)；N-(碳酰基-甲氧基PEG)-1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(2kDamPEG-DPPE或5kDamPEG-DPPE)；N-(碳酰基-甲氧基PEG)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(750DamPEG-DSPE 750，2kDamPEG-DSPE2000，5kDamPEG-DSPE)；及其药物可接受盐(即钠盐)和它们的混合物。
在某些优选实施方式中，所述纳米粒子组合物包括含有PEG-DAG和PEG——神经酰胺的PEG-脂质，其中PEG的分子量范围约200～20,000，优选约500～10000，更优选约1000～5000。
PEG-DAG和PEG神经酰胺的一些说明实施例见表1。
表1
Figure BPA00001372549100401
优选地，所述的纳米粒子组合物，包括选自PEG-乙醇胺、PEG-二棕榈酰醇胺(C16)、PEG-神经酰胺(C16)及其混合物等的PEG-脂质。PEG-乙醇胺mPEG-DSPE、PEG-二棕榈酰醇胺(C16)、mPEG-神经酰胺(C16)的结构如下：
其中，(n)是一个约5～2300的整数，优选范围约5～460。
在一个优选实施方式中，(n)约为45。
在进一步的实施方案中，和作为可替代以烯烃为基础的聚合物，如PEGPEG、一个或多个有效的非抗原性材料，如右旋糖酐、聚乙烯醇、碳水化合物为基础的聚合物、甲基丙烯酸羟基丙基酯(HPMA)、聚亚烷基氧化物和/或者其中的聚合物可以被使用。能够取代PEGPEG的合适的聚合物的例子包括但不限于，聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基唑啉、聚乙基唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚羟基乙酸、纤维素衍生物，如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。参见通常指定的专利号为6、153、655美国专利文件，其内容作为本发明的参考。一般技术人员能够理解所述的关于PAOs如PEG的同类型的活化作用。本技术领域中的一般技术人员，将进一步认识到，上述列举的只是说明性的，可以想到高分子聚合材料具有上述特征。基于本发明的目的，“实质上或有效的非抗原性”是指在本技术领域中对于哺乳动物无毒且不会引起可预料的免疫反应的所有材料。
此外，在进一步的实施方式中，所述的纳米粒子可以包括包含如铜缩醇或亚胺的可释放链接基的PEG-脂质。这种可释放的PEG-脂质允许核酸(寡核苷酸)在运载系统进入细胞后从运载系统分离出去。关于可释放PEG-脂质其他的细节记载在名为“为核酸运载系统所用的以亚胺基为基础的可释放聚合脂质”和“为核酸运载系统所用的以铜缩醇或者醛缩醇基为基础的可释放聚合脂质”的申请号为61/115、379和61/115、371的美国临时专利申请文件中，和申请号为____，在同日提交的名为“为核酸运载系统所用的可释放的聚合脂质”的PCT专利申请文件中、并且上述文件的内容可以作为本发明参考。
5.核酸/寡核苷酸
所述纳米粒子组合物，可被用于运载不同的核酸到细胞或细胞组织中。核酸包括质粒和寡核苷酸。优选，所述纳米粒子组合物用于运载寡核苷酸。
为了更充分理解本发明的保护范围，特界定下列术语的含义。技术人员可以想到，“核酸”或“核苷酸”适用于脱氧核糖核酸(“DNA”)，不论是单股或双股的核糖核酸(“RNA”)，除非另有规定，以及适用于任何化学改良物或类似物，如锁核酸(LNA)。技术人员会容易想到，所谓“核酸”，包括有聚核酸、衍生物、改良物和其它类似物。一个“寡核苷酸”通常是一个相对短的多核苷酸，例如它由大小不等的核苷酸组成，约2～200个核苷酸组成，优选约8～50个核苷，更优选约8～30个核苷酸，最优选约8～20或约15～28的长度。根据该发明，寡核苷酸通常由核酸组成，并且是单链，除非另有规定。所述的术语“多核苷酸”和“聚核酸”作为同义词使用。
寡核苷酸(类似物)不局限于单一品种的寡核苷酸，但是，相反，是被设计成为了与多品种的核酸一起工作，它可以被理解为链接基可以附加到一个或更多的3’-或5’-的末端，通常是核苷酸的PO4或者SO4组。可以认为核酸分子能够包括硫代联动改性、糖改性、基于改性和/或者磷酸主链改良的核酸。寡核苷酸可含有天然磷酸二酯主链或硫代主链或改进的主链类似物，如LNA(锁核酸)、PAN(含肽主链的核酸)主链类似物、CpG低聚物等诸如此类的，如在Tides 2002，Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences，May 6-8，2002，LasVegas，NV and Oligonucleotide & Peptide Technologies，18th & 19th November 2003，Hamburg，Germany公开的内容，上述内容均作为本发明的参考。
可以认为本发明对寡核苷酸的改良包括，例如，添加或替换并入附加部分的功能基、极化性、氢键、静电作用、寡核苷酸的功能。这些改良包括但不限于2’-位置的糖改性、5-位置的嘧啶改性、8-位置的嘌呤改性、环外胺改性、4-硫尿核苷的替代物、5-溴或5-碘尿嘧啶的替代、主链改性、甲基化，如异碱基异胞苷和异胍苷的配对组合及类似组合。在本发明的保护范围还可认为包括寡核苷酸3’和/或5’帽结构。
基于本发明的目的，“帽状结构”应当理解为并入寡核苷酸末端的化学改良。帽状结构可以在5’-末端(5’-cap)或在3’-末端(3’-cap)，也可以存在于两个末端。5’-末端的一个非限制的例子包括反向核苷酸残基、4’，5’-甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃)核苷、4’-硫代核苷酸、核苷酸碳环；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸、核苷酸改性；磷酸酯连接；苏-呋喃戊糖基核苷；无环3’，4‘-连环核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸；3’-3’-反向核苷酸成分；3’-3’-反向核苷酸残基；3’-2’-基倒核苷酸；3‘-2’-反向核苷酸残基；3’-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3’-磷酸、3’-磷酸脂；磷酸酯、桥接或非桥接甲酯成分。详细描述在WO 97/26270、其内容可以作为本发明的参考。3’-末端可包括，例如4’，5’-甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃)核苷；4’-硫核苷；4’-硫代核苷酸、核苷酸碳环；5’-氨基烃基磷酸盐、1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；L-核苷酸；α-核苷酸；核苷酸改性；磷酸酯；苏-呋喃戊糖基核苷；无环3’，4‘-萨科核苷酸；3，4-二氢丁基核苷酸；3，5-二氢戊基核苷酸；5’-5’-反向核苷酸基；5’-5’-反向核苷酸残基；5’-氨基磷酸酯；5’-硫代、1，4丁二醇磷酸盐；5’-氨基酸；桥接和/或非桥接5’-氨基磷酸酯、磷酸和/或磷酸酯、桥接或非桥接甲基和5’-巯基。也参见Beaucage和Iyer，1993年，Tetrahedron 49、1925；在此处内容纳入其中以供参考。
核苷类似物的非限制性清单具有如下结构：
Figure BPA00001372549100431
Figure BPA00001372549100441
更多的描述核苷酸类似物的例子可以参见Freier & Altymann；Nucl.Acid Res.1997，25、4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000、3(2)、293-213、上述文件的内容可以作为本发明的参考。
这里用到的所谓“反义”，是指核苷酸序列是互补的特定DNA或RNA序列，其编码成一个基因产品或者编码成一个控制序列。所谓“反义链”是用来指一种核酸链用来与正义链互补。在细胞代谢的正常运作，一个DNA分子的正义链是用来编码多肽链和/或其他基因的产品。正义链作为属于一个合成mRNA副本(反义链)的模板，反过来，指导任何编码基因产物的合成。反义核酸分子可能用技术领域已知的任何方法来生成，包括合成。一旦进入细胞，这种副本链结合了由细胞产生的自然序形成了一个双链体。这种双链体然后会阻止任何将来的mRNA的副本或者其翻译。这里使用的指称“消极”或(-)也是技术领域所熟知的反义链，而“积极”或(+)也是技术领域所熟知的正义链。
基于本发明的目的，“互补”应理解为一种核酸序列与另一个核酸序列形成氢键。百分比表示的互补性核酸分子中的残基量的百分比，可以和第二个核酸序列，即10中的5、6、7、8、9、10、分别为50％、60％、70％、80％、90％和100％的互补，形成氢键。“完美互补”意味着所有的连续残基氨基酸序列与第二核酸序列相同数量的连续残基形成氢键。
所述的有益于描述纳米粒子的核酸如一个或更多的相同或不同的寡核苷酸或寡核苷酸衍生物)可以包括约5至约1000核酸，最好相对较短核苷酸，如最好是大小不等的8个到约50个核苷酸(例如，约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)。
所述的封存在纳米粒子里的有益的核酸，含有天然主链或硫代主链或任何其他改性主链类似物的寡核苷酸和寡核苷酸类似物包括：
LNA(锁核酸)；
PNA(肽骨架核酸)；
短干扰RNA(siRNA)；
微RNA(miRNA)；
肽骨架核酸(PNA)；
磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)；
三环-DNA；
诱导(decoy)ODN(双链寡核苷酸)；
催化RNA序列(RNAi)；
核酸酶；
适配体；
镜像异构体(L-构象寡核苷酸)；
CpG低聚体等等，这些被披露在：
Tides发表在2002年5月6-8号，在拉斯维加斯内华达州举办的寡核苷酸和多肽技术研讨会，和2003年11月18-19日在德国汉堡举办的核苷酸与肽技术研讨会，其中的内容可以作为本发明的参考。
在另一纳米粒子包裹内的核酸方面，寡核苷酸可以选择包含任何合适的技术领域所知的核苷酸类似物和衍生物，包括由下表2列出的：
表2代表性的核苷酸类似物和衍生物
  4-乙酰胞苷   5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷
  5-(羧基羟基甲基)尿苷   β，D-甘露糖基喹啉
  2′-O-甲基胞苷   5-甲氧基碳酰基甲基-2-硫尿苷
  5-甲氧基碳酰基甲基尿苷   5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷
  5-甲氧基尿苷   5-羧基甲基氨基甲基尿苷
  二氢尿苷   2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷
  2′-O-甲基假尿苷   N-[(9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基硫嘌呤-6-基)氨甲酰]苏氨酸
  D-半乳糖基喹啉   N-[(9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰]苏氨酸
  2′-O-甲基鸟苷   尿苷-5-氧乙酸-甲酯
  2’-卤-腺苷   2’-卤-胞苷
  2’-卤-鸟苷   2’-卤-胸腺嘧啶
  2’-卤-尿苷   2’-卤-甲基胞苷
  2’-氨基-腺苷   2’-氨基-胞苷
  2’-氨基-鸟苷   2’-氨基-胸腺嘧啶
  2’-氨基-尿苷   2’-氨基-甲基胞苷
  肌苷   尿苷-5-氧乙酸
  N6-异戊烯基腺苷   Wybutoxosine
  1-甲基腺苷   假尿苷
  1-甲基假尿苷   喹啉
  1-甲基鸟苷   2-硫胞苷
  1-甲基肌苷   5-甲基-2-硫尿苷
  2，2-di甲基鸟苷   2-硫尿苷
  2-甲基腺苷   4-硫尿苷
  2-甲基鸟苷   5-甲基尿苷
  3-甲基胞苷   N-[(9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-氨甲酰]苏氨酸
  5-甲基胞苷   2′-O-甲基-5-甲基尿苷
  N6-甲基腺苷   2′-O-甲基尿苷
  7-甲基鸟苷   Wybutosine
  5-甲基氨基甲基尿苷   3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷
  锁-腺苷   锁-胞苷
  锁-鸟苷   锁-胸腺嘧啶
  锁-尿苷   锁-甲基胞苷
在一个优先考虑的方面，目标寡核苷酸的纳米粒子包裹包括，例如，但不限于，癌基因、促血管生成通路的基因、有利于细胞增殖通路的基因、病毒感染因子的基因和促进抗炎通路的基因。
在一个优选的实施方式中，与抗癌治疗的肿瘤细胞和/或抗肿瘤细胞有关的目标肿瘤细胞或下调的基因或蛋白质的表达中，包含所述封存在纳米粒子中的寡核苷酸。例如，本发明可以使用反义寡核苷酸，例如BCL-2，来降低任何技术领域所知的与癌症相关的细胞蛋白质。参见美国专利，申请号810/822,205，2004年4月9日提交申请，其内容可以作为本发明的参考。首选治疗性寡核苷酸非限制名单包括：反义bcl-2寡核苷酸、反义HIF-1α寡核苷酸、反义存活寡核苷酸、反义ErbB3寡核苷酸、反义PIK3CA寡核苷酸、反义HSP27寡核苷酸、反义雄激素受体寡核苷酸、反义Gli2寡核苷酸，和反义β-连环蛋白寡核苷酸。
更优选的是，本发明所述的寡核苷酸包括硫代磷酸主链和锁核酸。
在一个优选的实施方式中，寡核苷酸可以是，例如，反义生存素锁核酸、反义ErbB3锁核酸或反义缺氧诱导因子-1α锁核酸。
在另一优先考虑的实施方式中，寡核苷酸可以，例如，一个寡核苷酸具有与Genasense
Figure BPA00001372549100461
相同或实质相似核苷酸序列((a/k/a oblimersen sodium，产自Genta Inc.，Berkeley Heights，NJ))。Genasense
Figure BPA00001372549100471
是一个18-Mer的硫代磷酸反义寡核苷酸(SEQ ID号：4)，这是与人类bcl-2mRNA初始序列的前六个密码因子相辅相成的。(人类bcl-2 mRNA在技术领域被熟知和描述，例如在SEQ NO：19的美国专利，专利号为6、414、134、在此引用以供参考。)
可以想象的到首选的实施方案包括：
(i)反义存活素LNA低聚体(SEQ ID NO：1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c；
其中大写字母表示LNA，“s”表示硫代磷酸酯骨架；
(ii)反义Bcl2 siRNA：
正义5’-gcaugcggccucuguuugadTdT-3’(SEQ ID NO：2)
反义3’-dTdTcguacgccggagacaaacu-5’(SEQ ID NO：3)
其中dT表示DNA；
(iii)Genasense(硫代磷酸酯反义寡核苷酸)：(SEQ ID NO：4)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
其中小写字母表示DNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架；
(iv)反义HIF1α LNA低聚体(SEQ ID NO：5)
TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(v)反义ErbB3 LNA低聚体(SEQ ID NO：6)
TsAsGscscstsgstscsascststs MeCsTs MeCs
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(vi)反义ErbB3 LNA低聚体(SEQ ID NO：7)
Gs MeCsTscscsasgsascsastscsas MeCsTs MeC
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(vii)反义PIK3CA LNA低聚体(SEQ ID NO：8)
AsGs MeCscsaststscsaststscscsAs MeCs MeC
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(viii)反义PIK3CA LNA低聚体(SEQ ID NO：9)
TsTsAststsgstsgscsastscsts MeCsAsG
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(ix)反义HSP27 LNA低聚体(SEQ ID NO：10)
CsGsTsgstsastststscscsgscsGsTsG
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(x)反义HSP27 LNA低聚体(SEQ ID NO：11)
GsGs MeCsascsasgscscsasgstsgsGs MeCsG
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(xi)反义雄激素受体LNA低聚体(SEQ ID NO：12)
MeCs MeCs MeCsasasgsgscsascstsgscsAsGsA
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(xii)反义雄激素受体LNA低聚体(SEQ ID NO：13)
As MeCs MeCsasasgstststscststscsAsGs MeC
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(xiii)反义GLI2 LNA低聚体(SEQ ID NO：14)
MeCsTsMeCscststsgsgstsgscsasgsTsMeCsT
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架.
(xiv)反义GLI2 LNA低聚体(SEQ ID NO：15)
Ts MeCsAsgsaststscsasasascs MeCs MeCsA
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架
(xv)反义β-连环蛋白LNA低聚体(SEQ ID NO：16)
GsTsGststscstsascsascscsasTsTsA
其中大写字母表示LNA和“s”表示硫代磷酸酯骨架。
小写字母表示DNA单位，粗体大写字母表示LNA例如β-D-氧-LNA单元。LNA单体中的所有胞嘧啶碱基是5-甲基胞嘧啶。下标“s”表示硫代磷酸酯链接基。
LNA包括2-O，4’-C亚甲基二环核苷，如下所示：
关于存活素(Survivin)LNA参见专利申请号为11/272,124，名为“LNA Oligonucleotidesand the Treatment of Cancer”和专利申请号为10/776,934，名为“Oligomeric Compounds for theModulation Survivin Expression”的美国专利申请文件中的详细记载，上述文件的内容可作为本发明的参考。关于HIF-1αmodulation也可以参见专利号为7,589,190和专利公布号为2004/0096848的美国专利文件；关于ErbB3 modulation可以参见专利公布号为2008/0318894的美国专利文件和专利号为PCT/US09/063357的专利文件；关于PIK3CA modulation可以参见专利公布号为2009/0192110的美国专利文件；关于HSP27 modulation可以参见专利号为PCT/IB09/052860的专利文件；关于Androgen Receptor modulation可以参见专利公布号为2009/0181916的美国专利文件；关于Beta Catenin modulation可以参见专利申请号为61/081,135的美国专利申请文件、专利申请号为PCT/IB09/006407，名为“RNA AntagonistsTargeting GLI2”的PCT专利申请文件和专利公布号为2009/0005335和2009/0203137的美国专利文件，上述文件的内容可以作为本发明参考。适宜的target genes的其他例子在专利号为WO 03/74654、PCT/US03/05028的专利文件和专利申请号为10/923,536的美国专利申请文件中有记载，上述文件的内容可以作为本发明的参考。
在进一步的实施方案中，本文所述纳米粒子可以包括与促进内体可释放基团可释放链接的的寡核苷酸。胞内释放的促组氨酸，如富含组氨酸肽能动摇/破坏内体膜，从而促进治疗药物的细胞质运载。富含组氨酸肽增强寡核苷酸的内体释放到细胞质中。然后，细胞内释放的寡核苷酸可以转运到细胞核。寡核苷酸-富含组氨酸肽偶联物的其他细节，参见美国临时专利申请、序列号：61/115、350和61/115，于2008年11月17号提交的申请和PCT专利申请号是____，且同日递交的，名为“用于核酸输入系统的可释放性的偶合体”，上述文件的内容可以作为本发明的参考。
6.目标基团
优选的或者任选的，本文所述纳米粒子组份还包括一个针对特定细胞或者细胞类型的目标配合基。使用链接基微粒，如酰胺、氨基、羰基、酯、肽、二硫化物、硅烷、核苷、脱碱核苷、聚醚、多胺、聚酰胺、缩酸胺、碳水化合物、脂质、聚烃、磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸钠、烷基磷酸酯、马来酰亚胺链接基或光敏链接基，将这个目标基团连接到纳米粒子组合物中任何一个成分(最好，致融脂质和PEG-脂质)。且无不适当实验，本领域已知的技术均可用于把目标基团和纳米粒子组成的分子结合到一起。
例如，目标药物可附着在高分子PEG-脂质聚合物上，以指引纳米微粒进入体内的目标区域。所述纳米粒子的目标运载增强了封存治疗性核酸的纳米粒子的细胞吸收，从而提高了治疗的疗效。在某些方面，多种目标肽可以取代细胞穿膜肽，有针对性地运载到肿瘤部位。
在此发明的优选方面中，目标基序列，例如单链抗体(SCA)或单链抗原结合的抗体、单细胞抗体、细胞附着钛，如RGD肽和选择蛋白、细胞穿膜肽(CPPs)，如TAT、穿透肽和(Arg)9Z、受体配基，针对碳水化合物分子或外源凝集素，允许纳米粒子被专门指向目标区域。(见J Pharm Sci.2006 Sep；95(9)：1856-72 Cell adhesion molecules for targeted drug delivery，其内容可以作为本发明的参考。)
优选目标基包括单链抗体(SCAs)或抗体的单链可变片段(sFv)。单链抗体包含抗体域，这种抗体域可以约束或重组目标肿瘤细胞的分子。除了维持一个抗原结合位点，一个单链抗体和一个PEG-脂质PEG-lipid的结合可以降低抗原性，增加血液中的单链抗体的半衰期。
术语“单链抗体”(SCA)、“单链抗原结合分子或抗体”或“单链抗体”(sFv)可以互换使用。单链抗体含有结合亲和力的抗原。单链抗体(SCA)或单链抗体能够并且已经通过多种方式组建，这个理论的描述和单链抗原结合蛋白质的生产可以参见一般指定的美国专利，申请号为10/915,069和6,824,782、其内容可以作为本发明的参考。
通常情况下，单链抗体或FV域可以从已知的单克隆抗体中选择，其缩写为26-10、MOPC315、741F8、520C9、McPC 603 D1.3、murine phOx、human phOx、RFL3.8sTCR、Se155-4，18-2-3，4-4-20、7A4-1、B6.2、CC49、3C2、2C、MA-15C5/K12G0、Ox等。(see，Huston，J.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；Huston，J.S.et al.，SIM News 38(4)(Supp)：11(1988)；McCartney，J.et al.，ICSU Short Reports 10：114(1990)；McCartney，J.E.et al.，unpublished results(1990)；Nedelman，M.A.et al.，J.Nuclear Med.32(Supp.)：1005(1991)；Huston，J.S.et al.，In：Molecular Design and Modeling：Concepts and Applications，Part B，editedby J.J.Langone，Methods in Enzymology 203：46-88(1991)；Huston，J.S.et al.，In：Advances inthe Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology，Epenetos，A.A.(Ed.)，London，Chapman & Hall(1993)；Bird，R.E.et al.，Science 242：423-426(1988)；Bedzyk，W.D.et al.，J.Biol.Chem.265：18615-18620(1990)；Colcher，D.et al.，J.Nat.Cancer Inst.82：1191-1197(1990)；Gibbs，R.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4001-4004(1991)；Milenic，D.E.et al.，CancerResearch 51：6363-6371(1991)；Pantoliano，M.W.et al.，Biochemistry 30：10117-10125(1991)；Chaudhary，V.K.et al.，Nature 339：394-397(1989)；Chaudhary，V.K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066-1070(1990)；Batra，J.K.et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.171：1-6(1990)；Batra，J.K.et al.，J.Biol.Chem.265：15198-15202(1990)；Chaudhary，V.K.et al.，Proc.Natl.AcadSci.USA 87：9491-9494(1990)；Batra，J.K.et al.，Mol.Cell.Biol.11：2200-2205(1991)；Brinkmann，U.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8616-8620(1991)；Seetharam，S.et al.，J.Biol.Chem.266：17376-17381(1991)；Brinkmann，U.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3075-3079(1992)；Glockshuber，R.et al.，Biochemistry 29：1362-1367(1990)；Skerra，A.et al.，Bio/Technol.9：273-278(1991)；Pack，P.et al.，Biochemistry 31：1579-1534(1992)；Clackson，T.et al.，Nature352：624-628(1991)；Marks，J.D.et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Iverson，B.L.et al.，Science 249：659-662(1990)；Roberts，V.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6654-6658(1990)；Condra，J.H.et al.，J.Biol.Chem.265：2292-2295(1990)；Laroche，Y.et al.，J.Biol.Chem.266：16343-16349(1991)；Holvoet，P.et al.，J.Biol.Chem.266：19717-19724(1991)；Anand，N.N.et al.，J.Biol.Chem.266：21874-21879(1991)；Fuchs，P.et al.，Biol Technol.9：1369-1372(1991)；Breitling，F.et al.，Gene 104：104-153(1991)；Seehaus，T.et al.，Gene 114：235-237(1992)；Takkinen，K.et al.，Protein Engng.4：837-841(1991)；Dreher，M.L.et al.，J.Immunol.Methods139：197-205(1991)；Mottez，E.et al.，Eur.J.Immunol.21：467-471(1991)；Traunecker，A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8646-8650(1991)；Traunecker，A.et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)；Hoo，W.F.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4759-4763(1993)).上述出版物的内容可以作为本发明的参考。
目标基团的非限制性清单包括血管内皮细胞生长因子、FGF2、生长抑素及生长抑素类似物、铁传递蛋白、促黑(素细胞)素、载脂蛋白E和载脂蛋白E多肽、血管性血友病的因子和血管性血友病的因子肽、腺病毒纤维蛋白及腺病毒纤维蛋白肽、PD1和PD1肽、表皮生长因子和表皮生长因子肽、RGD肽、叶酸、对甲氧苯甲酰胺等。该领域技术人员可以理解的可选择的目标药物也可以在本文所述纳米粒子中使用。
在一个优选的实施方案中，对于在本文所述对化合物、有益的靶向制剂包括，单链抗体(SCA)、RGD肽、选择蛋白、TAT、穿透膜、(Arg)9、叶酸、对甲氧苯甲酰胺等，这些药物的优选结构如下：
C-TAT：(SEQ ID NO：17)CYGRKKRRQRRR；
C-(Arg)9：(SEQ ID NO：18)CRRRRRRRRR；
RGD可以是线性的或环形的：
Figure BPA00001372549100511
叶酸是如下残基：
Figure BPA00001372549100521
对甲氧苯甲酰胺是p-MeO-Ph-C(＝O)OH.
精氨酸可以包括用来偶联如CRRRRRRRRR的半胱氨酸、TAT可以在钛末添加额外的诸如CYGRKKRRQRRRC的半胱氨酸。
对于当前发明的目的，在说明书和附图中使用的缩写代表以下结构：
(i)C-diTAT(SEQ ID NO：19)＝CYGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR-NH2；
(ii)Linear RGD(SEQ ID NO：20)＝RGDC；
(iii)Cyclic RGD(SEQ ID NO：21and SEQ ID NO：22)＝c-RGDFC or c-RGDFK；
(iv)RGD-TAT(SEQ ID NO：23)＝CYGRKKRRQRRRGGGRGDS-NH2；and
(v)Arg9(SEQ ID NO：24)＝RRRRRRRRR.
可选地，目标基团包括，如半乳糖、半乳糖胺和N-乙酰半乳糖胺；激素，如雌激素、睾酮、孕酮、糖皮质类固醇、肾上腺素、胰岛素、胰高血糖素、皮质醇、维生素D、甲状腺激素、维甲酸、以及生长激素；生长因子，如血管内皮生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子；神经传递素，例如伽马氨基丁酸、谷氨酸盐、乙酰胆碱；NOGO；三磷酸肌醇；肾上腺素；去甲肾上腺素、一氧化氮、肽、维生素，如叶酸和吡哆醇、药物、抗体，以及可与在体内或体外的细胞表面受体相互作用的任何其它分子。
D.纳米粒子的制备
所述纳米粒子可通过本领域公知工序，且无不适当实验加工制备。
例如，纳米粒子通过在第一个容器中诸如寡核苷酸水溶液中(或一种供比较研究的无核酸水溶液中)的核酸，在第二个容器中的含有所述的纳米粒子组份机脂肪溶液中，及混合水溶液和有机脂肪溶液中制备，混合水溶液和有机脂肪溶液用以产生封存核酸的纳米粒子。该工序在专利申请公布号2004/0142025的美国专利文件中有详细记载、其中的内容可以作为本发明的参考。
可选地，所述纳米粒子通过本领域公知的技术制备，如一种洗涤剂透析法或一种利用有机溶剂在混合组份的过程中产生一个单向的改良反向制法。在洗涤剂透析方法中，核酸(即干扰性小核糖酸)与一种阳离子脂质的洗涤剂溶液相溶合、形成一个包有核酸的复合物。
在本发明的一个实施方式中，阳离子脂和诸如寡核苷酸的核酸的结合比例约在20∶1～1∶20的比例范围，优选约在1∶5～5∶1的比例范围，最优选约在1∶2～2∶1的比例范围。
在本发明的一个实施方式中，阳离子脂质和诸如寡核苷酸的核酸结合比例约在1∶1～20∶1的比例范围，优选约在1∶1～12∶1的比例范围，最优选约在2∶1～6∶1的比例范围。可选地，纳米粒子组份中氮与phoshpate(N/P)的比例范围约2∶1～5∶1、(即2.5∶1)。
在另一实施方式中，所述纳米粒子通过使用双泵系统制备。一般来说，这个工序包括在第一个容器中产生一种含有核酸的水溶液及在第二个容器中产生一种含有所述纳米粒子组份的脂肪溶液。这两种溶液通过一个双泵系统混合并产生纳米粒子。混合后的溶液随即被水溶液稀释并且形成的纳米粒子通过透析净化和/或分离出来。纳米粒子通过一个0.22m的过滤器进一步加工进行过滤消毒。
含有核酸的纳米粒子的直径范围约在5～300nm。采用动态光散射技术进行测量，优选的纳米粒子直径的中间值低于150nm(例如，约50-150nm)、更优选的低于100nm。大部分纳米粒子直径的中间值约在30～100nm(例如，59.5、66、68、76、80、93、96nm)，优选的约60～95nm。技术人员可以想到，相比较采用动态光散射技术，使用其他诸如电子透射显微镜的公知技术手段进行测量，可能会得到一个减半的直径数值。本发明的纳米粒子直径分布上大致相同。
或者，纳米粒子的大小可以通过本领域已知的方法测量。纳米粒子的大小可根据技术人员的需要控制。处理纳米粒子的大小是为了达到理想的尺寸范围和纳米粒子大小分布范围相对狭窄的目的。有几项技术对于控制纳米粒子的大小达到理想值是有效的。参见，例如，专利号为4737323的美国专利文件、其中所述内容作为本发明的参考。
本发明提供制备稳定血清纳米粒子的方法，核酸(如锁核酸或干扰性小核糖酸)封装在一个脂质多层结构中(即脂质双层)并且保护不被降解。所述的纳米粒子在水溶液中处于稳定状态。纳米粒子中核酸防止被体内流动核酸酶的降解。
此外，据本发明制备的纳米粒子在生理pH值上优选是中性的或阳性的。
所述的用于纳米粒子组份制备的纳米粒子或纳米粒子复合物包括：(i)一种为结构式(I)的化合物；(ii)一种中性脂质/致融类脂；(iii)一种PEG-脂质和(iv)如寡核苷酸的核酸。
在一个实施方案中，纳米粒子组份包括下述物质的混合物：
一种为结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG(PEG-PE)，和胆固醇；
一种为结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰乙醇胺、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG(PEG-PE)，和胆固醇；
一种为结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与二酰磷脂酰胆碱偶联的PEG(PEG-PE)，和胆固醇；
一种为结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与神经酰胺(PEG-Cer)偶联的PEG，和胆固醇；或
一种为结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与二酰磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)偶联的PEG、与神经酰胺偶联的PEG(PEG-Cer)，和胆固醇。
附加的纳米粒子组份可以通过改良包含本领域公知的阳离子脂质的组份制备。含有结构式(I)的化合物的纳米粒子组份可以通过增加本领域公知的阳离子脂质改良。参见申请号为2008/0020058的美国专利申请文件中的表IV、其内容可以作为本发明的参考。
一种用于制备纳米粒子的纳米粒子组份的非限制名单列于表3。
表3.
Figure BPA00001372549100541
结构式(I)的化合物是：化合物12、31、49和54
在一个实施方式中，结构式(I)的化合物∶DOPE∶胆固醇∶PEG-乙醇胺∶C16mPEG-神经酰胺在纳米粒子组份(样本8)中分别占脂肪总量的摩尔比约为：18％∶60％∶20％∶1％∶1％。
在另一实施方式中，纳米粒子含有结构式(I)的化合物、DOPE、胆固醇和C16mPEG-神经酰胺在纳米粒子组份(样本7)中占脂肪总量的摩尔比约为：17％∶60％∶20％∶3％。
该纳米粒子组合物优选含有可释放阳离子脂质的结构有：
Figure BPA00001372549100551
Figure BPA00001372549100561
所述的摩尔比值为在目前纳米粒子组份相应占脂肪总量的数值比。
E.治疗方法
所述纳米粒子单独或与其他治疗方法相结合应用于预防、抑制、减少或处理与反应细胞或组织的目标基因表达的水平或与其相关的病症或病状。该治疗方法包括对哺乳动物按照其需求对其使用所述的纳米粒子。
本发明一方面提供的治疗方法是在体内或体外将诸如核酸/寡核苷酸的治疗因子引入或输入至哺乳动物细胞。
根据本发明提供的治疗方法包括将一个细胞和所述的化合物接触。这种传输可作为体内合适的药物化合物的一部分，或在体外或体外环境中直接作用于细胞。
本发明有益于将寡核苷酸引入哺乳动物。所述的化合物可以作用于哺乳动物，特别是人类。
根据本发明，本发明更好地提供了抑制或下调(或调制)哺乳动物细胞或组织中基因表达的方法。这种基因表达的下调或抑制在体内、体外和/或体外实现。这种治疗方法包括将人类细胞与封有核酸的纳米粒子接触或者对按照哺乳动物的需求对其施用纳米粒子。一旦发生接触，与不存在所述纳米粒子的观察相比，当在体内、间接体内或体外观察到至少约10％、最好至少约20％或更高(例如，至少约25％、30％、40％、50％、60％)时，诸如mRNA中基因表达或蛋白质水平，即可视为基因表达得到成功地抑制或降低。
基于本发明的目的，与不存在所述纳米粒子的观察相比，“抑制”或“下调”应被理解为意味目标基因表达的减少，或RNAs的水平或相当于RNA编码的一个或多个蛋白质亚单位或其活性降低。
在一个优选的实施方式中，目标基因包括但不限于，例如，癌基因，促血管再生基因，有利于细胞增殖通路基因，病毒感染因子基因和促抗炎通路基因。
更好地，目标基因表达在癌细胞或组织中得到抑制，例如，脑、乳腺、肠、胃、肺、口腔、胰腺、前列腺、皮肤或子宫颈癌细胞中。癌症细胞或组织可以选自下述一个或多个：实体瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、急性淋巴细胞白血病(ALL)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、脑瘤、KB癌、肺癌、结肠癌、表皮癌等。
在一个特定实施方式中，根据所述方法，纳米粒子包括以下几类：例如，反义bcl-2寡核苷酸，反义HIF-1α寡核苷酸，，反义存活素寡核苷酸，反义ErbB3寡核苷酸，反义PIK3CA寡核苷酸，反义HSP27寡核苷酸，反义雄激素受体寡核苷酸，反义Gli2寡核苷酸，和反义β-连环蛋白寡核苷酸。
据本发明，纳米粒子可以包括可使用的寡核苷酸(SEQ ID NO：1，SEQ ID NOs 2 and 3，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：7，SEQID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，和SEQ ID NO：16，其中每一个核酸都是一个天然形成的或改进的核酸。可以认为所述治疗方法采用封存在前述纳米粒子中的核酸。在一个具体实施方式中，治疗中采用含有八个或更多连续的反核苷酸的治疗性核苷酸。
可选地，本发明还提供了哺乳动物的治疗方法。这些方法包括依患者所需施用有效量的含有所述纳米粒子的药用组合物。治疗方法的有效性依赖于据治疗情况使用的核酸的有效性。本发明提供了对于哺乳动物各种不同病情的治疗方法。根据哺乳动物的治疗需要，这些方法包括，施用有效量的含有治疗性核酸的纳米粒子。此外，所述纳米粒子有益于治疗一些诸如(但不限于)癌症、发炎性疾病和自身免疫的疾病。
在一个实施方式中，还提供了治疗患有恶性肿瘤或癌症患者的方法，包括依患者所需施用有效量的含有所述纳米粒子的药用组合物。可以被治疗的癌症包括下列的一个或多个：实体肿瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌、宫颈癌、脑肿瘤、KB癌、肺癌、结肠癌、表皮癌等。通过降解目标基因表达，所述纳米粒子，有益于哺乳动物的肿瘤病的治疗，减轻哺乳动物的肿瘤负担，预防哺乳动物的肿瘤转移和防止哺乳动物的肿瘤/肿瘤的复发。比如，纳米粒子有益于转移性疾病(如癌症向肝脏的转移)的治疗。
另一方面，本发明可以提供抑制癌细胞在体内或体外的生长或扩散的方法。这些方法包括，将癌细胞与所述纳米粒子接触。在一个实施方式中，本发明提供了抑制体内或体外表达为Erb33基因癌细胞生长的方法。
另一方面，本发明可以提供一种运载核酸(例如反义ErbB3 LNA寡核苷酸)至癌细胞的方法，如在细胞核内，核酸可以与ErbB3 mRNA结合。随即，抑制ErbB3蛋白质表达、阻碍癌细胞生长。该方法将寡核苷酸(诸如，含有锁核酸入癌细胞里，并减少癌细胞或细胞组织中目标基因(例如，存活素、HIF-1α或ErbB3)的表达。
可选地，本发明提供了调整癌细胞凋亡的方法。另一方面，还提供了在体内或体外增加癌细胞或细胞组织对化疗药物敏感性的方法。
另一方面，本发明提供了体内或体外杀死肿瘤细胞的方法。该方法包括将所述化合物引入到肿瘤细胞中，以减少诸如ErbB3基因的基因表达，并使癌细胞与可以充分杀死一部分癌细胞的至少一种抗癌药物(如一种化疗药物)的剂量接触。因此，对比使用同样剂量的未含所述纳米粒子的化疗药物，该方法杀死的癌细胞更多。
本发明的另一方面，一个抗癌/化疗药物可以同时或连续地与所述化合物结合使用。所述化合物可以与抗癌药物优先或同时使用，或者在抗癌机药物使用后使用。因此，该纳米粒子可以先于、同时或晚于化疗药物的使用。
其他方面包括，为了彼此互进或增效，结合本发明所述化合物与其他抗癌治疗。
可选地，所述纳米粒子组份可用于药用活性因子的运载，对哺乳动物优选负电或中性的纳米粒子组份。封存有药用活性因子/化合物的纳米粒子可以依哺乳动物的需要施用。该药用活性因子/化合物含有小分子量的分子。通常，药用活性因子的分子量低于1,500道尔顿(如，不到1,000道尔顿)。
在进一步的实施方式中，所述化合物可以用来运载核酸，药用活性因子或上述两者的结合。
在进一步实施方式中，与治疗有关的纳米粒子可以含有一个或更多的治疗性核酸的混合物(相同或者不同，例如，相同或不同的寡核苷酸)，和/或药用活性因子协同使用。
F.纳米粒子的药用组份/化学式制剂
含有所述纳米粒子的药用组份/化学式，可以和一个或多个生理上可接受的由辅助剂和辅助物组成的载体结合配制而成，而辅助剂和辅助物能够促进活性组份进行药用制备的过程。恰当的配制取决于所选治疗方案，即，是选用局部治疗还是全身治疗。
某种程度上，适当的结构取决于注入体内的方法，例如，口服、经皮吸收，或注射的方式。在制备适当的制剂，本领域中需要考虑的要素包括但不限于：有毒或其他会阻碍组份或制剂发挥其作用的不利因素。
所述纳米粒子药用组份的用法可以是口服、肺部使用、局部使用或非肠胃使用。局部使用包括但不限于经由表皮、皮肤、眼部，包括经由粘膜、例如包括经过阴道和直肠运载。可以认为非肠胃使用，包括静脉、动脉、皮下、腹膜、肌肉注射或输液。
在一个优选实施方式中，含有药用寡聚核苷酸的纳米粒子通过静脉(i.v.)或腹膜(i.p.)使用。药物的非肠胃使用方法在本发明的许多方面优先适用。
注射包括但不限于静脉注射、肌肉注射和皮下注射，本发明的纳米粒子可以在水溶液中配制、优选在生理上相容的缓冲剂中，例如，缓冲生理盐水或极性溶剂，该极性溶剂包括但不限于吡咯烷酮或二甲亚砜。
纳米粒子也可以按一次性注射或连续输注进行配制。注射的方式可以按单位剂量配制，如，使用一次剂量的容器或多剂量的容器。有益的组合物包括但不限于，悬浮液，或油性或水性媒介中的乳液，还可包括诸如悬浮剂、稳定剂、分散剂等辅助剂。非肠胃使用的药用化合物包括一种易溶的水溶液形式。水溶注射悬浮液可以含有调整悬浮液浓度的溶剂，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。可选地，悬浮液也可以包含适当的稳定剂，和/或可以增加溶液中纳米粒的浓度的溶剂。此外，使用前，对于和一种适合的媒介如，无菌、无热原水，纳米粒子可以是粉状。
对于口服使用，可以把纳米粒子与本领域公知的药用载体结合起来形成本发明所述的纳米粒子。这些载体能够把所述纳米粒子配制成药片、药物、锭剂、糖衣药丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆、糊剂、浆液、溶液、悬浮液，可稀释在患者饮用水中的高浓度溶液和悬浮液，可稀释在患者进食中的预混物等诸如此类，以便患者口服。口服使用的药物制剂可以用固体辅助剂制备，可以选择研磨得到的混合物和加工混合颗粒，如需要可加入其他合适的辅料，制成药片或糖衣药丸。有用的辅助剂，尤其是，如糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)的填充剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉的纤维素酶制剂，及其他的原料，如凝胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，也可以添加分裂剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或是海藻酸。也可以使用诸如褐藻酸钠的盐类。
为了吸入使用，以使用加压包装或雾化器和合适的推进剂的气溶胶喷雾形式能够方便地运载本发明所述纳米粒子。
使用诸如传统栓剂基体，如可可黄油或其他甘油酯，也可以将纳米粒子配制为适宜直肠的组合物，如栓剂或保留灌肠剂。
除前述制剂外，纳米粒子也可以形成储备药剂。长效药剂可以通过植入(如，皮下或肌肉或肌肉注射使用。本发明所述纳米粒子可以制备，通过和适宜的聚合或疏水原料(例如，含有药用上可接受油的乳状液)、离子交换树脂或例如但不限于微溶盐的微溶性衍生物。
可选地，使用如含有纳米粒子的固态疏水性聚合物的半透明细胞的缓释系统、运载纳米粒子。各种缓释材料已制成，并为本领域一般技术人员所知。
可选地，抗氧化剂和悬浮剂使用在所述纳米粒子的药用组份中。
G.剂量
特别是根据本发明所公开的内容，本领域一般技术人员能够决定抑制一个或多个预选基因表达充分的药物剂量，如临床治疗中的有效剂量。
本发明的方法中所使用的任何治疗性核酸，其治疗效果可以经体外化验进行初步估量。然后，配制对于哺乳动物有效的剂量，并达到一个含有效剂量的循环浓度范围。这些信息可以用于更精准的决定对患者有用的剂量。
含有所述核酸的效力决定药剂的使用量。通常，在治疗中含有核酸的纳米粒子的使用量，是指有效实现对哺乳动物的预期治疗效果的使用量。自然，所述的封存的核酸(或药用活性因子)(如，寡核苷酸)决定不同的纳米粒子剂量略有不同。可选地，当然药物形式和服用方法也决定剂量。不过，一般来说，封装所述纳米粒中的核酸数值范围约0.1-1g/kg/week，优选1-500mg/kg稍佳，更优选1-100mg/kg(如，约3-90mg/kg/dose)。
上述范围是示例性的，本领域技术人员亦能够根据临床经验和治疗症状确定最佳的剂量。可选地，每个医生可以据病人的具体情况精确选择药物，服用方法和有效剂量。除此之外，所述纳米粒子的毒性和疗效，可使用本领域公知的方法在细胞培养阶段或动物实验的标准制药程序确定。
可选地，核酸效力决定治疗中使用的剂量范围约1mg-100mg/kg/dose(0.1-100mg/kg/dose)。寡核苷酸在有效药物中的单位剂量范围约1mg-60mg。
在一个实施方式中，本发明的治疗包括哺乳动物的所述纳米粒子使用量范围约1-60mg/kg/dose(约25-60mg/kg/dose，约3-20mg/kg/dose)，如，60，45，35，30，25，15，5或3mg/kg/dose(在单个或多个剂量使用方式中)。例如，所述纳米粒子可以静脉注射按5，25，30，或60mg/kg/dose的剂量进行q3d x 9使用。再例如，包含使用反义寡核苷酸的治疗方案中，其剂量可以是每周约4-18mg/kg/dose，或者每周约4-9.5mg/kg/dose(例如，在一个6周的疗程中，以每周8mg/kg/dose用药3周)。
可选地，在体内或体外，运载封装于所述纳米粒子中的寡核苷酸时，使约0.1-1000μM、约10-1500μM(如约10-1000μM，或约30-1000μM)的浓缩寡核苷酸剂量与肿瘤细胞或细胞组织接触。
该组合物可作为多周疗程的一部分每天一次或者分多次施用。精准的用量取决于病情所处阶段和严重程度、疾病如肿瘤对核酸的敏感程度，和患者个人体质，此项可以认为是本领域技术人员已知的技能。
本发明中所有提到使用纳米粒子之处，提及的剂量均基于寡核苷酸分子的数量，而使用的纳米粒子的量。
可以认为治疗将要持续一天或数天直到有预期的临床效果出现。封装有药用核酸(或其他药用活性因子)的纳米粒子精确用量、频率及使用周期当然是由主治医师据患者性别、年龄、身体状况、以及疾病的严重程度，发生变化。
本发明更进一步包括，为了互相促进或增加疗效，将本发明所述的纳米粒子与其他抗癌治疗相结合。
实施例
下述实施例供进一步理解本发明，本发明的内容不局限于此。
在实施例中，所有的合成反应均在干氮或氩的环境下进行。N-(3-氨丙基)-1，3-丙二胺)，BOC-ON，LiOCl4，胆固醇和1H-吡唑-1-碳酰脒·HCl从Aldrich购进。所有其他试剂和溶剂无需进一步提纯。LNA Oligo-1目标存活基因和Oligo-2目标ErbB3基因室内制备，并且其序列表4中列出。核苷间连接是硫代磷酸酯，mC代表甲基化胞嘧啶，并且大写字母标示LNA。
表4
  低聚LNA   序列
  Oligo-1(SEQ ID NO：1)   5’-mCTmCAatccatggmCAGc-3’
  Oligo-2(SEQ ID NO：6)   5’-TAGcctgtcacttmCTmC-3’
下述缩写可以在实施例中使用，例如，LNA(锁定的核酸寡核苷酸)，BACC(2-[N，N’-二(2-胍基丙基)]氨基乙基-胆固醇酰-碳酸盐)，Chol(胆固醇)，DIEA(二异丙基乙胺)，DMAP(4-N，N-二甲胺-吡啶)，DOPE(L-α-二油酰磷脂酰乙醇，Avanti Polar Lipids，USA或NOF，日本)，DLS(动态光散射)，DSPC(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)(NOF，日本)，DSPE-PEG(1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(PEG)2000铵盐或钠盐，Avanti PolarLipids，USA和NOF，日本)，KD(knowndown)，EPC(卵磷脂酰胆碱，Avanti Polar Lipids，USA)和C16 mPEG-神经酰胺(N-棕榈酰-鞘氨醇-1-琥珀酰(甲氧基PEG)2000，Avanti PolarLipids，USA)。也可使用其他缩写例如FAM(6-羧基荧光素)，FBS(胎牛血清)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基)，MEM(改良伊格尔培养基)，TEAA(四乙胺乙酸酯)，TFA(三氟乙酸)，RT-qPCR(逆转录定量聚合酶链式反应)。
实施例1常规NMR方法
除非另有规定，使用核磁共振频波谱仪(Varian Mercury 300NMR spectrometer)和溶剂氘氯仿，在300MHz时获得1H NMR光谱，在75.46MHz获得13C NMR光谱。报告从四甲基硅烷(TMS)向低场的部分百万分之一(ppm)化学位移(δ)。
实施例2常规HPLC方法
使用Beckman Coulter System Gold
Figure BPA00001372549100621
的HPLC设备，监控反应混合物、中间产物和生成物的纯度。它采用了带有168二极管阵列紫外探测器(168 Diode Array UV Detector)的ZORBAX
Figure BPA00001372549100622
300SB C8反相柱(150×4.6mm)或者带有168二极管阵列紫外探测器(168Diode Array UVDetector)的Phenomenex Jupiter
Figure BPA00001372549100623
300A C18反相柱(150×4.6mm)，将10-90％梯度的乙腈以1mL/minute的流速注入0.05％的三氟乙酸，或者将25-35％梯度的乙腈以1mL/minute的流速注入50mM醋酸三乙胺缓冲液。在GE healthcare(Amersham Biosciences)中的AKTA探测器100A下运行阴离子交换色谱，使用Applied Biosystems的装在水装AP空玻璃柱中的强阴离子交换树脂。使用Amersham Biosystems的HiPrep 26/10脱盐柱、进行脱盐(对于PEG-Oligo)。
实施例3常规mRNA减量调节程序
将细胞保存在完全培养基中(F-12K或DMEM，并补以10％FBS)。将一组每个孔含有2..5×105个细胞的12个孔板，在整夜37℃的温度下进行培植。用Opti-MEM
Figure BPA00001372549100624
冲洗细胞一次，并向每个孔中加入400μL的Opti-MEM
Figure BPA00001372549100631
然后向每一个孔中加入含寡核苷酸的纳米粒子溶液或Lipofectamine2000
Figure BPA00001372549100632
的溶液。细胞继续被培养4小时，然后向每孔中加入600μL的培养基，再培养24小时。24小时之后，RT-qPCR定量胞内的目标基因mRNA水平，如，人类存活素，和如GAPDH的管家基因测估数量。标准化mRNA的表达水平。
实施例4常规RNA制备过程
为体外mRNA的减量屏幕，根据制造者的指示，使用RNAqueous Kit(Ambion)制备总的RNA。使用定量仪(Nanodrop)，由OD260nm决定RNA的浓度。
实施例5常规RT-qPCR过程
从Applied Biosystems获得的全部试剂：高容量的cDNA逆转录试剂盒(cDNA ReverseTranscription Kit)(4368813)、20倍的PCR扩增组合(4304437)，和TaqMan
Figure BPA00001372549100635
为人类的基因表达分析试剂盒磷酸脱氢酶(Cat.#0612177)和存活素(BIRK5 Hs00153353)。总RNA的2.0μg用于合成最终体积为50μL的cDNA。反应在PCR温度循环器中发生，25℃下进行10分钟，37℃下进行120分钟，85℃下进行5秒钟，最后在4℃温度下储存。实时聚合酶链反应(Real-time PCR)是以50℃-2分钟，95℃-10分钟，95℃-15秒/60℃-1分钟的程序进行40次循环。对于每一个qPCR反应，在30μL终体积中使用1μL cDNA。
实施例6化合物3的制备
将胆固醇(化合物1)与一个被保护的半胱氨酸(化合物2)在有二氯乙烷和二甲基氨基吡啶的条件下发生反应，形成胆固醇半胱氨酸(化合物3)。
实施例7化合物5的制备
将化合物3和一个含有巯基(化合物4)的双功能间隔，在有二异丙基乙基胺的条件下发生反应，生成化合物5，形成二硫键。
实施例8化合物6的制备
化合物5和哌啶及吗啉果糖(二甲基甲酰胺)(1∶1)发生反应以移除化合物5的芴甲氧羰基组(Fmoc基团)，生成化合物6。
实施例9化合物8的制备
化合物6与FmocLys-OH(化合物7)在有二氯乙烷和二甲基氨基吡啶的条件下发生反应，生成化合物8。
实施例10化合物9的制备
化合物8和哌啶及吗啉果糖(二甲基甲酰胺)(1∶1)发生反应以移除化合物8的芴甲氧羰基组(Fmoc基团)，生成化合物9。
实施例11化合物11的制备
将1H-吡唑(聚合吡唑)-1-甲脒.盐酸(化合物10，0.87g，5.9mmol)加入到含有溶质9(1.48mmol)、溶剂无水氯仿(12mL)的溶液中，再在室温下加入二异丙基乙胺(1.03mL，5.9mmol)。反应需回流16小时。溶液冷却至室温。混合物沉淀出15mL乙腈、并且离心机将原固体粒子分离出来。将固体粒子溶解于14mL水/乙腈(1∶1)溶液中。在完全溶解后，在14mL乙腈中加入沉淀物，将固体粒子进行离心和干燥，生成产物。
实施例12化合物12的制备
化合物11和三氟乙酸发生反应移除化合物11中的Boc基团，生成化合物12。
实施例13化合物22的制备
将N-(2-羟乙基)苯邻二甲酰亚胺(21，25g，130.8mmol，1eq)溶于500mL干苯中并共沸1小时，除去125mL的苯，然后将其冷却至室温，并加入对甲苯磺酸(0.240g，1.26mmol，0.0096eq)。将反应混合物冷却到0-5℃后，并在该温度下通过可选地的漏斗加入2-甲氧基丙烯(10.4g，13.8mL，143.8mmol，1.1eq)。在0-5℃的温度下，搅拌反应混合物1小时，然后将其加热至89-95℃，并共沸3小时，除去甲醇MeOH/苯。接下来除去溶剂，将溶液冷却到共沸停止，并加入同等体积的苯。3小时后，反应混合物冷却至室温时，加入30mL的三乙胺和5mL的乙酸酐并且可以在室温下快速地搅拌。在35℃温度下，将反应混合物在真空中浓缩，以除去2/3体积的苯，并用300mL滴状乙烷沉淀原产物。过滤并清洗沉淀物。在65℃的温度下、将固体(8.5g)溶解于70mL甲苯中，并将溶液冷却至0℃。用离心法收集产物，并用己烷清洗，并在真空条件下用CCl4脱水，得到4.9g产物：13C NMR δ24.67，38.09，57.88，100.39，123.05，131.92，133.66，167.88.
实施例14化合物23的制备
将化合物22(4.9g，11.6mmol)溶于6M NaOH溶液(38mL水中含有9.1g NaOH)并将其快速地回流加热。将得到的溶液冷却至室温后，再用40mL的1∶1的三氯甲烷/异丙烯基乙炔进行三次萃取，用无水硫酸钠干燥，并将在35℃温度下将产物真空浓缩。将得到的固体在乙烷中悬浮两次，在CCl4中悬浮一次，并在35℃的真空中干燥，最后得到产物(1.8g，95％)：13CNMR δ24.99，42.08，43.81，62.82，63.58，77.41，99.64.
实施例15化合物25的制备
将化合物23(1.8g，11.1mmol，1eq)溶于36mL无水四氢呋喃中，再将其浸没于干冰/异丙烯基乙炔中冷却至-78℃，然后加入三氟醋酸乙酯。在室温下搅拌反应混合物1.5小时后，在真空条件下用己烷脱水，去除溶剂，得到粗产物。通过去活氧化铝柱色谱，用二氯甲烷和甲醇(100∶0.1to 98∶2，v/v)提纯粗产物，得到1.30g产物：13C NMR δ24.88，40.68，41.11，42.13，57.99，60.26，62.10，99.83.
实施例16化合物27的制备
将化合物26(2.88mmol)和化合物25(15.0mmol)溶于60mL干二氯甲烷和8mL干二甲基甲酰胺中。加入二异丙基乙胺(0.60g，0.82mL.4.61mmol，1.6eq)、并在室温下快速搅拌反应混合物。在室温下，将得到的反应溶液在真空中浓缩，然后加入乙醚，在0-5℃的冰浴中沉淀出固体。通过去活氧化铝柱色谱对得到的固体进行过滤和提纯，得到化合物27。
实施例17化合物28的制备
用K2CO3处理，生成化合物28。
实施例18化合物29的制备
在有二氯乙烷和二甲氨基吡啶的条件下，化合物28与FmocLys-OH(化合物7)化合，生成化合物29。
实施例19化合物30的制备
对化合物29使用1∶1的氮杂环己烷(哌啶)和二甲基甲酰胺，除去芴甲氧羰基群(Fmoc基团)，生成化合物30。
实施例20化合物31的制备
在溶质为化合物30(1.48mmol)、溶剂为12mL无水三氯甲烷的溶液中放入1H-吡唑-1-羧酸脒HCL(化合物10、0.87g，5.9mmol)，在室温下，再加入二异丙基乙胺(1.03mL，5.9mmol)。该反应回流加热持续16个小时。将溶液冷却至室温。用15mL乙腈来沉淀所得到的混合物，并用离心机将滤后的粗固体分离出来。将这些固体溶于14mL水/乙腈(1∶1)溶液中。待充分溶解后，加入14mL乙腈来沉淀固体。将再一次沉淀的固体通过离心方法分离出来，干燥处理，得到化合物。
实施例21化合物43的制备
在有二异丙基乙胺的条件下，化合物41与化合物42发生反应生成化合物43。
实施例22化合物44的制备
将化合物43和三氟乙酸置于二氯甲烷中反应就生成化合物44。
实施例23化合物46的制备
在有N，N-二异丙基乙胺的条件下，氯甲酸胆固醇
胆固醇氯甲酸酯(化合物26)和2-甲氧基-4-羟基苯甲醛(化合物45)，得到化合物46。
实施例24化合物47的制备
化合物44和化合物46，在分子筛的条件下反应，生成化合物47，形成一个亚胺键。
实施例25化合物48的制备
化合物47与氮杂环己烷(哌啶)和二甲基甲酰胺(1∶1)反应，除去Fmoc基团。在反应中，搅拌持续30分钟，然后在Hiprep柱上用水进行脱盐处理，生成化合物48。
实施例26化合物49的制备
将溶质为48(1.48mmol)、溶剂为12mL无水氯甲烷的溶液中，加入1H-吡唑-1-羰基脒HCl(化合物10、0.87g，5.9mmol)，室温下，再添加二异丙基乙胺(1.03mL，5.9mmol)。该反应回流加热持续16个小时。溶液冷却至室温。用15mL乙腈将混合物沉淀，用离心机分离固体粒子。将固体溶于14mL水/乙腈(1∶1)溶液中。待充分溶解后，加入14mL乙腈，使固体沉淀。将固体离心分离，干燥处理，得到产物。
实施例27化合物51的制备
将三乙胺(33.6g，0.033mol)添加到溶质为胆固醇氯甲酸酯(26，5g，0.011mol)和溶剂为CH2Cl2(200mL)和二甲基甲酰胺(100mL)的溶液中，然后添加胱氨二盐酸(50，25g，0.11mol)。将反应混合物在室温下搅拌5天。过滤未溶残余物，洗提液被减压浓缩。快速柱色使用5-10％的甲醇在CH2Cl2净化残余物，生成0.9g(14％)的产物。
实施例28化合物52的制备
在有二氯乙烷和二甲基氨基吡啶的条件下，化合物51与FmocLys-OH(化合物7)发生化合反应生成化合物52。
实施例29化合物53的制备
化合物52与氮杂环己烷(哌啶)和二甲基甲酰胺(1∶1)反应，除去Fmoc基团，生成化合物53。
实施例30化合物54的制备
在溶质为化合物30(1.48mmol)、溶剂为12mL无水三氯甲烷的溶液中放入1H-吡唑-1-羧酸脒盐酸(化合物10、0.87g，5.9mmol)，在室温下，再加入二异丙基乙胺(1.03mL，5.9mmol)。该反应回流加热持续16个小时。将溶液冷却至室温。用15mL乙腈来沉淀所得到的混合物，固体粒子用离心分离机分离。将这些固体溶于14mL水/乙腈(1∶1)溶液中。待充分溶解后，加入14mL乙腈来沉淀固体。将再一次沉淀的固体通过离心方法分离出来，干燥处理，得到化合物。
实施例31核酸-纳米粒子组合物的制备
在本实施例，是封装如含有寡核甘酸的LNA等各种核酸的纳米粒子组合物的制备。例如，将摩尔比为18∶60∶20∶1∶1的化合物54、DOPE、胆酸，DSPE-PEG和C16mPEG-神经酰胺在10mL的90％乙醇中(总脂30μmole)进行混合。将LNA寡核甘酸(0.4μmole)溶解于10mL的20mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4-7.6)。将溶液加热至37℃后，通过duel注射泵将两种溶液混合，然后使用20mL的20mM三氨基甲烷盐酸缓冲液(300mM NaCl，pH 7.4-7.6)来稀释混合溶液。将混合物在37℃的温度下培养30分钟，然后在10mM磷酸缓冲溶液(138mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)中进行透析。从混合物中通过透析除去乙醇，获得稳定粒子。通过离心分离机对纳米粒子溶液进行分离。将纳米粒子溶液移至15mL的离心过滤器(Amicon Ultra-15，Millipore，USA)。离心时，离心速度为3,000rpm，温度为4℃。在限定时间内，收集浓缩悬浮液，并通过0.22μm注射过滤器(Millex-GV，Millipore，USA)的过滤来消毒。
在水(Sigma)介质中，用Plus 90微粒大小分析仪动态光散射设备(Brookhaven，New York)测量出纳米粒子的直径和分布状态。
LNA寡核甘酸的封存的有效性由UV-VIS(Agilent 8453)决定。通过扫描混有磷酸盐缓冲液(250μL)、甲醇(625μL)和三氯甲烷(250μL)的溶液、获得紫外光谱背景。为了确定封装核酸的浓度，将甲醇(625μL)和三氯甲烷(250μL)加入磷酸盐缓冲液纳米粒子悬浮液(250μL)。将上述液体混合后得到净溶液，在260nm处测量吸光率前将其用超声波处理2分钟。封装核酸浓度和运载率通过等式(1)和(2)计算：
Cen(μg/ml)＝A260×OD260unit(μg/mL)×稀释系数(μL/μL)----------------(1)
其中稀释系数为样本stock volume(μL)除以assay volume(μL)。
封存率(％)＝[Cen/Cinitial]×100------------------------(2)
其中Cen是提纯后封存在纳米粒子悬浮液中的核酸(例如，LNA寡核甘酸)浓度、Cinitial是未形成纳米粒子悬浮液时的原始核酸(LNA寡核甘酸)浓度。表5和表6中归纳了各种纳米粒子组合物的实施例。
表5.
Figure BPA00001372549100681
表6.
Figure BPA00001372549100682
*结构式(I)的化合物：化合物12、化合物31、化合物49和化合物54。
实施例32纳米粒子稳定性
纳米粒子稳定性，是指在持续的4℃，在磷酸缓冲溶液中维持纳米结构完整性的能力。通过持续监测平均直径的变化，来评估纳米粒子的胶体稳定性。表6中样本编号NP1中制备的纳米粒子被分散在10mM磷酸缓冲溶液(138mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)，在4℃下进行保存。在特定时间里，将大约20-50μL的纳米粒子悬浮液用纯净水稀释至2mL。在25℃的温度下，用DLS测量纳米粒子的大小。
实施例33体外纳米粒子的细胞摄取
封装在所述纳米粒子中的核酸(LNA寡核甘酸Oilgo-2)的细胞摄取有效性通过在如前列腺癌细胞(15PC3 cell line)等人类癌症细胞中进行评估的。使用实施例31中的方法，制备样本NP2的纳米粒子。为荧光显微镜研究，用FAM标记LNA寡核甘酸(Oligo-2)。
在15PC3细胞系中评估纳米粒子。在完全培养基(DMEM，补充10％的胎牛血清)中维持细胞。将每个孔含有2.5×105个细胞的一个孔盘，整夜37℃的温度下进行培养。用Opti-MEM清洗一次细胞，在各个孔中加入400mL的Opti-MEM。然后，细胞由样本编号为NP2的纳米粒子溶液处理，该溶液装载着核酸(FAM-modified Oligo 2)，或者由不含纳米粒子(nakedFAM-modified Oligo 2)的溶液处理，作为控制样本。在37℃温度下，对细胞培养24小时。用磷酸盐缓冲液清洗细胞5次，然后用300mL的Hoechst溶液(2mg/mL)每个孔stained 30分钟，再用磷酸盐缓冲液清洗5次。将细胞安置在预冷的(-20℃)70％乙醇中，在-20℃下安置20分钟。在荧光显微镜下检查细胞，来评估封存在所述纳米粒子中的核酸细胞摄取的有效性。
实施例34体外纳米粒子在人类各种癌细胞中的mRNA减量调节的有效性
所述纳米粒子的有效性是在人类各种癌细胞中评估的，例如，epideram癌细胞(A431)、人类胃癌细胞(N87)、人类肺癌细胞(A549，HCC827，or H1581)、类前列腺癌细胞(15PC3，LNCaP，PC3，CWR22，DU145)、人类乳腺癌细胞(MCF7，SKBR3)、肠癌细胞(SW480)、胰腺癌细胞(BxPC3)和(恶性)黑素瘤(518A2)。对细胞使用下述之一：封存有反义ErbB3的寡核苷酸(Sample NP1)，或者清空对照剂的纳米粒子(Sample No.NP3)。按照实施例3中的程序测量体外每一个纳米粒子在ErbB3表达减量调节的有效性。
实施例35纳米粒子在移植人类前列腺癌的老鼠实验中对于肿瘤和肝脏的mRNA减量调节方面的影响
所述纳米粒子体内的有效性，是通过对移植人类前列腺癌的老鼠进行评估。向裸鼠中的右辅翼的皮下注入5×106cells/mouse，使其带有15PC3人类前列腺肿瘤。当肿瘤的平均体积达到100mm3时，将老鼠随机分组，每组5只。对每组老鼠使用封装反义ErbB3寡核甘酸(SampleNP1)的纳米粒子或者相应的裸装寡核苷酸(Oligo 2)。静脉注射的纳米粒子剂量是15mg/kg/dose，5mg/kg/dose，1mg/kg/dose或0.5mg/kg/dose以q3d x 4(or q3d x10)使用。纳米粒子中的寡核苷酸量决定药剂的剂量。用腹膜内给药的方式(i.p.)以剂量30mg/kg/dose注入裸装寡核苷酸，或者以剂量25mg/kg/dose或45mg/kg/dose静脉注射的方式注入，以q3d x 4注入12天。在最后一剂药量的24小时后，老鼠死亡。收集老鼠的血浆样品并将其储存于-20℃下。收集老鼠的肿瘤和肝脏样本。样品用于分析肿瘤和肝脏的mRNA KD。分析动物的存活状态。
Figure IPA00001372548600011
Figure IPA00001372548600021
Figure IPA00001372548600041
Figure IPA00001372548600071
Figure IPA00001372548600081
Figure IPA00001372548600091

Claims (55)

1.一种化合物，具有结构式(I)：
Figure FPA00001372549000011
式中：
R1是胆固醇或其类似物；
Y1是O、S或NR4；
Y2和Y5是独立的O，S或NR5；
Y3-4是独立的O、S或NR6；
L1-2是独立的选择双功能链接基；
M是一个易变酸链接基；
(a)，(d)和(f)是独立的0或1；
(b)，(c)是(e)是独立的0或正整数；
X是C，N或P；
Q1是H、C1-6烷基、NH2，或-(L11)d1-R11；
Q2是H、C1-6烷基、NH2，或-(L12)d2-R12；
Q3是一个孤电子对、(＝O)、H、C1-6烷基、NH2或-(L13)d3-R13；
如果
(i)当X是C，Q3不是一个孤电子对或(＝O)；
(ii)当X是N，Q3是一个孤电子对；而且
(iii)当X是P，Q3是(＝O)，而且(f)是0，
式中
L11、L12和L13是独立的已选的双选择功能间隔；
(d1)，(d2)和(d3)是独立的0或正整数；
R11，R12和R13是独立的氢、NH2，
Figure FPA00001372549000012
式中
Y’4是O、S或NR’6；
Y’5是独立的O、S或NR’5；
(d’)和(f’)是独立的0或1；
(e’)是0或一个正整数；
X’是C、N或P；
Q’1是H、C1-6烷基、NH2或-(L’11)d’1-R’11；
Q’2是H、C1-6烷基、NH2或-(L’12)d’2-R’12；
Q’3是一个孤电子对、(＝O)、H、C1-6烷基、NH2或-(L13)d’3-R’13；
如果
(i)当X’是C，Q’3不是一个孤电子对或(＝O)；
(ii)当X’是N，Q’3是一个孤电子对；而且
(iii)当X’是P，Q’3是(＝O)，而且(f’)是0，
式中
L’11、L’12和L’13是独立的选择双功能间隔；
(d’1)、(d’2)和(d’3)是独立的0或正整数；
R’11、R’12和R’13是独立的氢、NH2，
Figure FPA00001372549000022
R2-3，和R’2-3独立地选自：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂芳基，和C1-6取代杂芳基，并且
R4-7，和R’5-7独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19分支烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基的、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂芳基和取代C1-6杂环基，
假如Q1-3和Q’1-3中至少一个包括：
Figure FPA00001372549000031
2.按照权利要求1的化合物，其特征在于：所述M选自：-S-S-、铜缩醇基或醛缩醇基和亚胺基。
3.按照权利要求1的化合物，其特征在于：所述M是-S-S-。
4.按照权利要求1的化合物，其特征在于：所述M是-CR16R17-O-CR14R15-O-CR18R19-，
式中
R14-15独立地选自：氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳酰基、C2-6烷氧羰、芳氧酰基、C2-6烷酰氧基、芳酰基、C2-6取代烷酰基、取代芳酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代的和芳酰基；和
R16-19独立地选自：氢、羟氢氧基、胺、替代胺基、叠氮、羧基、氰基、卤素、羟氢氧基、硝基、硅醚、砜基、巯基、C1-6烷巯基、芳巯基、取代芳巯基、取代的C1-6硫基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C2-6取代烯基、C2-6取代炔基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂环基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳酰基、C2-6烷氧羰、芳氧酰基、C2-6烷酰氧基、芳酰基、C2-6取代烷酰基、取代芳酰基、C2-6取代烷酰氧基、取代芳氧酰基、C2-6取代烷酰氧基，取代和芳酰基。
5.按照权利要求4的化合物，其特征在于：所述R14和R15选自：氢、C1-6烷基、C3-8支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基和芳烷基。
6.按照权利要求1的化合物，其特征在于：所述M是-N＝CR10-或-CR10＝N-，式中R10是氢、C1-6烷基、C3-8支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基和取代芳基。
7.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中Q1和Q2两个含有
8.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中Q1和Q2两个含有
Figure FPA00001372549000042
9.按照权利要求1的化合物，其特征在于：其结构式(Ia)：
Figure FPA00001372549000043
10.按照权利要求1的化合物，其特征在于：其结构式(Ib)：
Figure FPA00001372549000044
11.按照权利要求1的化合物，其特征在于：其结构式(Ic)或(Ic’)：
Figure FPA00001372549000045
12.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中Y1是O。
13.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中Y2是O；和Y5是O。
14.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中L1选自：
-(CR21R22)t1-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22)t1Y17-(CR23R24)t2-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22CR23R24Y17)t1-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22CR23R24Y17)t1(CR25R26)t4-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-[(CR21R22CR23R24)t2Y17]t3(CR25R26)t4-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22)t1-[(CR23R24)t2Y17]t3(CR25R26)t4-(Y18)a2-[C(＝Y16)]a3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3(CR23R24)t2-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3Y14(CR23R24)t2-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3(CR23R24)t2-Y15-(CR23R24)t3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3Y14(CR23R24)t2-Y15-(CR23R24)t3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3(CR23R24CR25R26Y19)t2(CR27CR28)t3-，
-(CR21R22)t1(Y17)a2[C(＝Y16)]a3Y14(CR23R24CR25R26Y19)t2(CR27CR28)t3-，和
Figure FPA00001372549000051
式中：
Y16是O、NR28，或S；
Y14-15和Y17-19是独立地O、NR29或S；
R21-27独立地选自：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
R28-29独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
(t1)、(t2)、(t3)和(t4)独立地为零或正整数，最好是零或从约1至10的正整数(如，1、2、3、4、5、6)；并且
(a2)和(a3)独立地为零或1。
15.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中L1选自：
-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，-NH(CH2)-，
-CH(NH2)CH2-，
-(CH2)4-C(＝O)-，-(CH2)5-C(＝O)-，-(CH2)6-C(＝O)-，
-CH2CH2O-CH2O-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)2-C(＝O)-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(＝O)-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(＝O)-，
-(CH2)4-C(＝O)NH-，-(CH2)5-C(＝O)NH-，
-(CH2)6-C(＝O)NH-，
-CH2CH2O-CH2O-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-C(＝O)-NH-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(＝O)-NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(＝O)-NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(＝O)-NH-，
-(CH2CH2O)2-，-CH2CH2O-CH2O-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，
-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-，
Figure FPA00001372549000071
-C(＝O)NH(CH2)2-，-CH2C(＝O)NH(CH2)2-，
-C(＝O)NH(CH2)3-，-CH2C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)NH(CH2)4-，-CH2C(＝O)NH(CH2)4-，
-C(＝O)NH(CH2)5-，-CH2C(＝O)NH(CH2)5-，
-C(＝O)NH(CH2)6-，-CH2C(＝O)NH(CH2)6-，
-C(＝O)O(CH2)2-，-CH2C(＝O)O(CH2)2-，
-C(＝O)O(CH2)3-，-CH2C(＝O)O(CH2)3-，
-C(＝O)O(CH2)4-，-CH2C(＝O)O(CH2)4-，
-C(＝O)O(CH2)5-，-CH2C(＝O)O(CH2)5-，
-C(＝O)O(CH2)6-，-CH2C(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)5-，和
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)6-。
16.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中L2独立地选自：
-(CR’21R’22)t’1-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’2-，
-(CR’21R’22)t’1Y’14-(CR’23R’24)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’3-，
-(CR’21R’22CR’23R’24Y’14)t’1-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’2-，
-(CR’21R’22CR’23R’24Y’14)t’1(CR’25R’26)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’3-，
-[(CR’21R’22CR’23R’24)t’2Y’14]t’1(CR’25R’26)t’2-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1-[(CR’23R’24)t’2Y’14]t’2(CR’25R’26)t’3-(Y’15)a’2-[C(＝Y’16)]a’3(CR’27CR’28)t’4-
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3(CR’23R’24)t’2-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3Y’15(CR’23R’24)t’2-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3(CR’23R’24)t’2-Y’15-(CR’23R’24)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3Y’14(CR’23R’24)t’2-Y’15-(CR’23R’24)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3(CR’23R’24CR’25R’26Y’15)t’2(CR’27CR’28)t’3-，
-(CR’21R’22)t’1(Y’14)a’2[C(＝Y’16)]a’3Y’17(CR’23R’24CR’25R’26Y’15)t’2(CR’27CR’28)t’3-，和
式中：
Y’16是O，NR’28，或S；
Y’14-15和Y’17独立地为O，NR’29，或S；
R’21-27独立地选自：氢、羟氢氧基、胺、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
R’28-29独立地选自：氢、C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；
(t’1)，(t’2)，(t’3)和(t’4)独立地为零或正整数；并且
(a’2)和(a’3)独立地为零或1。
17.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中L2独立地选自：
-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，-(CH2)NH-
-CH2CH(NH2)-，
-O(CH2)2-，-C(＝O)O(CH2)3-，-C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)(CH2)2-，-C(＝O)(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-NH(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-，
-(CH2)2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-，
-(CH2CH2O)2-，-CH2CH2O-CH2O-.
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-，
-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-，
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-，
-CH2-O-CH2CH2O-，-CH2-O-(CH2CH2O)2-，
Figure FPA00001372549000101
-(CH2)2NHC(＝O)-(CH2CH2O)2-，
-C(＝O)NH(CH2)2-，-CH2C(＝O)NH(CH2)2-，
-C(＝O)NH(CH2)3-，-CH2C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)NH(CH2)4-，-CH2C(＝O)NH(CH2)4-，
-C(＝O)NH(CH2)5-，-CH2C(＝O)NH(CH2)5-，
-C(＝O)NH(CH2)6-，-CH2C(＝O)NH(CH2)6-，
-C(＝O)O(CH2)2-，-CH2C(＝O)O(CH2)2-，
-C(＝O)O(CH2)3-，-CH2C(＝O)O(CH2)3-，
-C(＝O)O(CH2)4-，-CH2C(＝O)O(CH2)4-，
-C(＝O)O(CH2)5-，-CH2C(＝O)O(CH2)5-，
-C(＝O)O(CH2)6-，-CH2C(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)NH(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)5-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)O(CH2)6-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)2-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)3-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)4-，
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)5-，和
-(CH2CH2)2NHC(＝O)(CH2)6-。
18.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中L11-13和L’11-13独立地选自：
-(CR31R32)q1-；和
-Y26(CR31R32)q1-，
式中，
Y26是O、NR33或S；
R31-32独立地选自：氢、OH、C1-6烷基C1-6烷基、C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、C1-6杂烷基、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；和
R33选自：氢，C1-6烷基，C3-12支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代烷基、C3-8取代环烷基、C1-6杂烷基s、取代C1-6杂环基、C1-6烷氧基、苯氧基和C1-6杂烷氧基；和
(q1)是零或正整数。
19.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中L11-13和L’11-13独立地选自：
-CH2-，-(CH2)2-，-(CH2)3-，-(CH2)4-，-(CH2)5-，-(CH2)6-，
-O(CH2)2-，-O(CH2)3-，-O(CH2)4-，-O(CH2)5-，-O(CH2)6-，
-(CH2CH2O)-CH2CH2-，
-(CH2CH2O)2-CH2CH2-，
-C(＝O)O(CH2)3-，-C(＝O)NH(CH2)3-，
-C(＝O)(CH2)2-，-C(＝O)(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-O(CH2)3-，
-CH2-OC(＝O)-NH(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-O(CH2)3-，
-(CH2)2-C(＝O)-NH(CH2)3-，
-CH2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)O(CH2)2-O-(CH2)2-，
-(CH2)2C(＝O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-，
-CH2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-，和
-(CH2)2C(＝O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-。
20.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中X(Q1)(Q2)(Q3)基选自：
Figure FPA00001372549000121
21.按照权利要求20的化合物，其特征在于：式中X(Q1)(Q2)(Q3)基是：
22.按照权利要求1的化合物，其特征在于：式中X’(Q’1)(Q’2)(Q’3)基选自：
Figure FPA00001372549000123
23.按照权利要求22的化合物，其特征在于：式中X’(Q’1)(Q’2)(Q’3)基是：
Figure FPA00001372549000124
24.按照权利要求1的化合物，其特征在于：选自：
Figure FPA00001372549000131
Figure FPA00001372549000141
Figure FPA00001372549000151
Figure FPA00001372549000161
Figure FPA00001372549000171
25.一种纳米粒子组合物包括化学式(I)的化合物。
26.按照权利要求25的纳米粒子组合物，其特征在于：还包括致融类脂质和PEG脂质。
27.按照权利要求25的纳米粒子组合物，其特征在于：其中化学式(I)的化合物选自：
Figure FPA00001372549000181
Figure FPA00001372549000191
28.按照权利要求26的纳米粒子组合物，其特征在于：所述的致融类脂质选自：DOPE，DOGP，POPC，DSPC，EPC，及其组合。
29.按照权利要求26的纳米粒子组合物，其特征在于：所述的PEG脂质选自：PEG-DSPE，聚乙二醇—二棕榈酰醇胺，C16m聚乙二醇—神经酰胺及其组合。
30.按照权利要求26的纳米粒子组合物，其特征在于：还包括胆固醇。
31.按照权利要求30的纳米粒子组合物，其特征在于：所述的化学式(I)的化合物占纳米粒子组分中脂肪总量的摩尔比范围约10％～99.9％。
32.按照权利要求30的纳米粒子组合物，其特征在于：所述的化学式(I)的化合物占纳米粒子组分中脂肪总量的摩尔比范围约15％～25％。
33.按照权利要求30的纳米粒子组合物，其特征在于：其中含有化学式(I)的化合物的阳离子脂质、以非胆固醇为基础的致融类脂质、PEG脂质和胆固醇占纳米粒子组分中脂肪总量的摩尔比例约15-25％∶20-78％∶0-50％∶2-10％。
34.按照权利要求30的纳米粒子组合物，其特征在于：选自：
结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG(PEG-PE)，和胆固醇的混合物；
结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰乙醇胺、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG(PEG-PE)，和胆固醇的混合物；
结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与二酰磷脂酰胆碱偶联的PEG(PEG-PE)，和胆固醇的混合物；
结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与神经酰胺(PEG-Cer)偶联的PEG，和胆固醇的混合物；和
结构式(I)的化合物、二酰磷脂酰胆碱、与二酰磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)偶联的PEG、与神经酰胺偶联的PEG(PEG-Cer)，和胆固醇的混合物。
35.按照权利要求30的纳米粒子组合物，其特征在于：其中化学式(I)的化合物、DOPE、胆固醇和C16m聚乙二醇—神经酰胺占纳米粒子组分中脂肪总量的摩尔比例约17％∶60％∶20％∶3％。
36.按照权利要求30的纳米粒子组合物，其特征在于：其中化学式(I)的化合物、DOPE、胆固醇、PEG-DSPE和C16m聚乙二醇—神经酰胺占纳米粒子组分中脂肪总量的摩尔比例约18％∶60％∶20％∶1％∶1％。
37.一种含有核酸的纳米粒子封存在权利要求30的纳米粒子组合物。
38.按照权利要求37的纳米粒子，其特征在于：所述的核酸是单链或双链的寡核苷酸。
39.按照权利要求37的纳米粒子，其特征在于：所述的核酸选自：脱氧核苷酸，核糖核苷酸锁核酸(LNA)，短干扰RNA(siRNA)，微RNA(miRNA)，适配体，肽骨架核酸(PNA)，磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)，三环-DNA，双链寡核苷酸(诱导ODN)，催化RNA序列(RNAi)，适配体，镜像异构体，CpG低聚体及其组合。
40.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸是一种反义寡核苷酸。
41.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸含有磷酸二酯或硫代磷酸链接基，及其组合。
42.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸含有LNA。
43.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸有8～50的核苷酸。
44.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸抑制基因表达，促进血管再生基因，有利于细胞增殖通路的基因，病毒感染因子基因和促进抗炎通路的基因。
45.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸选自反义bcl-2寡核苷酸，反义HIF-1α寡核苷酸，反义存活素寡核苷酸，反义ErbB3寡核苷酸，反义PIK3CA寡核苷酸，反义HSP27寡核苷酸，反义雄激素受体寡核苷酸，反义Gli2寡核苷酸和反义β-连环蛋白寡核苷酸。
46.按照权利要求38的纳米粒子，其特征在于：所述的寡核苷酸含有在SEQ ID NO：1，SEQID NOs 2和3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，和SEQ ID NO：16中的8个或更多的连续核酸，并且每一个核酸是天然或改良后的核酸。
47.按照权利要求37的纳米粒子，其特征在于：所述的核酸和化学式(I)的化合物的电荷比范围约1∶20至20∶1。
48.按照权利要求37的纳米粒子，其特征在于：所述的纳米粒子的大小范围约50nm～150nm。
49.对于哺乳动物的治疗方法包括依哺乳动物所需对其使用权利要求37的纳米粒子。
50.把寡核苷酸引入细胞的方法包括：使细胞与权利要求37的粒子接触。
51.抑制人类细胞或细胞组织的基因表达的方法包括：使人类细胞或细胞组织与权利要求37的粒子接触。
52.按照权利要求51的方法，其特征在于：所述的细胞或细胞组织是癌细胞或癌细胞组织。
53.哺乳动物基因表达的下调方法包括：依哺乳动物所需对其使用一定有效量的权利要求37的纳米粒子。
54.抑制癌细胞生长或增殖的方法包括：使癌细胞和权利要求37的纳米粒子接触。
55.按照权利要求54的方法，还包括使用抗癌药物。
CN2009801459229A 2008-11-17 2009-11-17 用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质 Pending CN102231952A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11534808P 2008-11-17 2008-11-17
US11528708P 2008-11-17 2008-11-17
US11536508P 2008-11-17 2008-11-17
US61/115,287 2008-11-17
US61/115,365 2008-11-17
US61/115,348 2008-11-17
PCT/US2009/064719 WO2010057155A1 (en) 2008-11-17 2009-11-17 Releasable cationic lipids for nucleic acids delivery systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102231952A true CN102231952A (zh) 2011-11-02

Family

ID=42170406

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009801459229A Pending CN102231952A (zh) 2008-11-17 2009-11-17 用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20110229581A1 (zh)
EP (1) EP2364085A4 (zh)
JP (1) JP2012509272A (zh)
CN (1) CN102231952A (zh)
CA (1) CA2742776A1 (zh)
TW (1) TW201021853A (zh)
WO (1) WO2010057155A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102911252A (zh) * 2012-10-25 2013-02-06 四川大学 含肽类树状分子的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法和应用
CN103906504A (zh) * 2011-11-04 2014-07-02 日东电工株式会社 制备用于药物递送的脂质纳米颗粒的方法
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
CN107406396A (zh) * 2015-01-30 2017-11-28 日油株式会社 阳离子性脂质
WO2018086242A1 (zh) * 2016-11-11 2018-05-17 深圳市声光动力生物医药科技有限公司 pH敏感的轴向取代硅酞菁配合物及其制备方法和在医药上的应用
CN111072504A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 芜湖天道绿色新材料有限公司 一种可降解固化剂的一步制备方法

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012509258A (ja) * 2008-11-17 2012-04-19 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 核酸送達系のための分岐カチオン性脂質
CN101870719B (zh) * 2010-05-21 2013-09-25 中国科学院上海有机化学研究所 一种同时具有二硫化学键和甾体骨架结构的有机功能化合物、制备方法和用途
CN102161688B (zh) * 2011-02-18 2013-09-04 中国科学院上海有机化学研究所 一种含有胆固醇结构片段的生物相容性合成脂质体、制备方法及其应用
JP6234370B2 (ja) 2011-10-11 2017-11-22 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 神経変性障害におけるマイクロｒｎａ
JP6407028B2 (ja) 2011-12-12 2018-10-17 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア ＭＲＳＡのＰＢＰ２ａ及びその断片を含むタンパク質、それをコードする核酸、並びにＭＲＳＡ感染を予防する及び治療するための組成物及びそれらの使用
CA2891911C (en) * 2012-12-07 2023-03-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved nucleic acid lipid particle formulations
PL2992874T3 (pl) 2013-04-30 2019-01-31 Delta-Fly Pharma, Inc. Liposomy do podawania miejscowego i ich zastosowanie
JP5914418B2 (ja) * 2013-06-26 2016-05-11 富士フイルム株式会社 脂質粒子、核酸送達キャリア、核酸送達キャリア製造用組成物、脂質粒子の製造方法及び遺伝子導入方法
US9453060B2 (en) 2013-08-09 2016-09-27 New York University Protein engineered systems for delivery of molecules
US20170112958A1 (en) * 2014-05-20 2017-04-27 Alcare Co., Ltd. Adhesive agent composition for skin and patch material for skin
KR101836877B1 (ko) 2014-10-30 2018-03-09 데루타-후라이 화마 가부시키가이샤 국소 투여용 리포플렉스의 신규 제조 방법 및 상기 리포플렉스를 사용하는 항 종양제
EP3315125A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipid nanoparticle formulation
US11459568B2 (en) 2016-10-31 2022-10-04 University Of Massachusetts Targeting microRNA-101-3p in cancer therapy
PT3864163T (pt) 2018-10-09 2024-04-30 Univ British Columbia Composições e sistemas que compreendem vesículas competentes para transfeção isentas de solventes orgânicos e detergentes e métodos relacionados com as mesmas
JP2022516318A (ja) * 2019-01-04 2022-02-25 オンコラス， インコーポレイテッド カプセル化ポリヌクレオチド及び使用方法
CN114522252B (zh) * 2022-04-24 2023-08-04 天津外泌体科技有限公司 一步法叠氮化修饰细胞外囊泡的方法及修饰试剂
CN114984236B (zh) * 2022-04-29 2023-03-24 深圳近邻生物科技有限公司 一种响应型核酸递送系统及其制备方法、交联聚合物载体

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6071890A (en) * 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US6383814B1 (en) * 1994-12-09 2002-05-07 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
WO1998051278A2 (en) * 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6794499B2 (en) * 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6841537B1 (en) * 1998-04-22 2005-01-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Combination therapy using nucleic acids and conventional drugs
US6169078B1 (en) * 1998-05-12 2001-01-02 University Of Florida Materials and methods for the intracellular delivery of substances
FR2813794B1 (fr) * 2000-09-08 2003-01-24 Pasteur Institut Procede de couplage, en solution, entre un peptide et un vecteur lipophile et ses applications
WO2002087541A1 (en) * 2001-04-30 2002-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid-based formulations for gene transfer
US7514099B2 (en) * 2005-02-14 2009-04-07 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US20070042983A1 (en) * 2001-05-18 2007-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050222064A1 (en) * 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
WO2005026372A1 (en) * 2003-09-15 2005-03-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
WO2006007712A1 (en) * 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
US7404969B2 (en) * 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
WO2007090194A2 (en) * 2006-02-01 2007-08-09 The Burnham Institute For Medical Research Lymphatic zip codes in tumors and pre-malignant lesions
US20070293449A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for delivery of double-stranded rna
WO2008043366A2 (en) * 2006-10-13 2008-04-17 Københavns Universitet Three-domain compounds for transmembrane delivery
JP2012509258A (ja) * 2008-11-17 2012-04-19 エンゾン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 核酸送達系のための分岐カチオン性脂質
CN102215820A (zh) * 2008-11-17 2011-10-12 安龙制药公司 用于核酸输送系统的可释放融合脂质

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103906504A (zh) * 2011-11-04 2014-07-02 日东电工株式会社 制备用于药物递送的脂质纳米颗粒的方法
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
US10155945B2 (en) 2011-11-04 2018-12-18 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
CN102911252A (zh) * 2012-10-25 2013-02-06 四川大学 含肽类树状分子的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法和应用
CN102911252B (zh) * 2012-10-25 2014-07-16 四川大学 含肽类树状分子的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法和应用
CN107406396A (zh) * 2015-01-30 2017-11-28 日油株式会社 阳离子性脂质
CN107406396B (zh) * 2015-01-30 2021-02-26 日油株式会社 阳离子性脂质
WO2018086242A1 (zh) * 2016-11-11 2018-05-17 深圳市声光动力生物医药科技有限公司 pH敏感的轴向取代硅酞菁配合物及其制备方法和在医药上的应用
CN111072504A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 芜湖天道绿色新材料有限公司 一种可降解固化剂的一步制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20110229581A1 (en) 2011-09-22
TW201021853A (en) 2010-06-16
WO2010057155A1 (en) 2010-05-20
JP2012509272A (ja) 2012-04-19
EP2364085A1 (en) 2011-09-14
CA2742776A1 (en) 2010-05-20
EP2364085A4 (en) 2012-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102231952A (zh) 用于核酸运载系统的可释放阳离子脂质
US20110111044A1 (en) Nanoparticle compositions for nucleic acids delivery system
US20110305770A1 (en) Releasable polymeric lipids for nucleic acids delivery system
JP2012509258A (ja) 核酸送達系のための分岐カチオン性脂質
US20110223257A1 (en) Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
KR101762466B1 (ko) 지질, 지질 조성물 및 이의 사용 방법
JP5407862B2 (ja) ｓｉＲＮＡおよび脂質性４，５−二置換２−デオキシストレプタミン環アミノグリコシド誘導体を含む組成物ならびにその用途
JP5872898B2 (ja) 標的遺伝子の発現を抑制する組成物
JP5952197B2 (ja) 標的遺伝子の発現を抑制する組成物
US20120244210A1 (en) Composition for suppressing expression of target gene
US20120207818A1 (en) Composition for suppressing expression of target gene
CN117658848A (zh) 递送治疗剂的脂质化合物及其应用
WO2011084721A2 (en) Cationic molecule and method of use

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20111102