CN114096848A - 治疗性肽 - Google Patents

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Abstract

本文提供了治疗性肽。在一些方面中，提供了可改变EphB4/EFNB2信号传导并且可用于治疗癌症的治疗性肽。在一些实施方案中，该肽包含在纳米颗粒例如核交联聚合物胶束(CCPM)中。

Description

治疗性肽
背景技术
本申请要求于2019年5月8日提交的美国临时专利申请No.62/844,986的权益，其全部内容通过引用并入本文。
本发明在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号CA217685的政府支持下完成。政府在本发明中具有一定的权利。
1.发明领域
本发明一般性地涉及分子生物学和医学领域。更具体地，其涉及可用于成像和/或治疗癌症和其他疾病的治疗性非天然肽。
2.相关技术的描述
癌症仍然是重要的临床问题。酪氨酸激酶受体EphB4在卵巢、乳腺和其他实体肿瘤中频繁过表达，并参与肿瘤细胞和肿瘤微环境之间的相互作用，促进转移。EphB4与其膜结合配体肝配蛋白B2(EFNB2)之间的反式相互作用介导双向信号传导：正向EFNB2至EphB4信号传导抑制肿瘤细胞增殖，而反向EphB4至EFNB2信号传导刺激内皮细胞的侵袭和血管生成特性。
已经进行了努力以产生EphB4信号传导调节剂来治疗癌症。例如，先前的工作报道了使用单克隆抗体、可溶性融合蛋白和小分子激酶抑制剂抑制促进血管生成的反向EphB4至EFNB2信号传导(Kertesz et al.，2006；Abéngozar et al.，2012；Stephenson et al.，2015；Martiny-Baron et al.，2004)。然而，目前没有可用的基于小分子、双功能的EphB4结合肽。清楚的是，需要用于癌症治疗的新治疗。
发明内容
在一些方面中，本发明通过提供可例如用于癌症治疗的新治疗性肽克服了现有技术中的限制。在一些方面中，本文提供了称为双向肝配蛋白激动剂肽的非天然肽BIDEN-AP(TN(dY)LFSPNGPIARAW；SEQ ID NO：1))。如以下实例所示，BIDEN-AP通过受体介导的内吞作用被选择性内化，并抑制卵巢癌细胞的侵袭和EMT。BIDEN-AP也抑制内皮的迁移和管的形成。在体内，BIDEN-AP及其纳米缀合物CCPM-BIDEN-AP显著降低了原位卵巢肿瘤的生长，其中CCPM-BIDEN-AP展示出比BIDEN-AP更强的抗肿瘤效力。BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP二者均通过下调EMT和血管生成途径损害血管生成。治疗性肽(例如，BIDEN-AP)可包含在较大的肽或多肽中，表达为融合蛋白，与纳米载体缀合，或与细胞毒性药物缀合，例如用于将治疗性载荷靶向递送至表达或过表达EphB4的癌细胞。由于基于本文公开的治疗性肽(例如，BIDEN-AP)的药剂可被肿瘤细胞内化，因此治疗性肽携带的治疗性载荷可用于提高载荷进入细胞内空间的细胞摄取。本文所述的治疗性肽可任选地包含在脂质体或纳米颗粒中，并用于治疗多种癌症，例如如卵巢癌和表达或过表达EphB4的癌症。
本发明的一个方面涉及非天然肽，其包含序列TNd(Y)LFSPNGPIARAW(SEQ ID NO：1)或相对于SEQ ID NO：1具有1、2、3或4个氨基酸替换并在SEQ ID NO：1的第3位处保留D-氨基酸的序列或序列。肽可以包含在胶束、纳米颗粒或脂质体中。在一些实施方案中，胶束是核交联聚合物胶束(core-crosslinked polymeric micelle，CCPM)。肽可包含在所述胶束、纳米颗粒、脂质体或优选CCPM中或者与所述胶束、纳米颗粒、脂质体或优选CCPM共价结合。在一些实施方案中，所述肽通过马来酰亚胺键共价结合或通过使胶束、纳米颗粒或脂质体和所述肽与N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)(GMBS)反应而共价结合。胶束、纳米颗粒或脂质体的直径可为约15nm至约300、约15nm至约200、约15nm至约100、约20nm至约70nm、约15nm至约50nm、约20nm至约70nm、约20nm至约60nm或约20nm至约30nm，或本文公开的任何范围。胶束、纳米颗粒或脂质体可包含聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、甲氧基-聚(乙二醇)-嵌段-聚(D，L-丙交酯)、聚(乙二醇)-嵌段-聚(天冬氨酸)、聚(乙二醇)-b-聚(甲基丙烯酸)、胺封端的两亲性嵌段共聚物、聚(PEG-甲基丙烯酸酯)-b-聚(三乙氧基甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙二醇)-嵌段-聚(谷氨酸)。胶束、纳米颗粒或脂质体还可包含化学治疗剂、抗血管生成剂或免疫治疗。在一些实施方案中，胶束、纳米颗粒或脂质体包含成像剂。在一些实施方案中，成像剂是荧光团或放射性同位素。在一些实施方案中，所述胶束是核交联聚合物胶束(CCPM)并且其中所述胶束用荧光团，优选近红外荧光团标记。在一些实施方案中，所述胶束是核交联聚合物胶束(CCPM)并且其中所述胶束用荧光团(优选近红外荧光团)和放射性同位素(优选111In、99mTc、64Cu或89Zr)二者标记。所述肽可与细胞毒性部分或药物部分缀合或共价连接。细胞毒性部分可以是化学治疗剂或细胞毒性多肽。在一些实施方案中，细胞毒性部分是美登素(maytansinoid)、澳瑞他汀(auristatin)、紫杉烷(taxoid)、加利车霉素(calicheamicin)、CC-1065类似物、倍癌霉素(duocarmycin)、蛋白质毒素(例如如假单胞菌(Pseudomonas)外毒素或白喉毒素(diphtheria toxin))或鹅膏毒素(amatoxin)。所述肽可与放射性核素缀合，例如在将肽与螯合剂或放射性螯合剂缀合或不缀合的情况下。在一些实施方案中，所述肽不与螯合剂共价连接。在一些实施方案中，所述肽与放射性金属螯合剂共价连接，放射性金属螯合剂例如1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸酸酐(DTPA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)、经膦酸基团(NOTP)或次膦酸基团(TRAP)取代的1，4，7-三氮杂环壬烷大环、双(2-羟基苄基)乙二胺二乙酸(HBED)、4，11-双(羧甲基)-1，4，8，11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷(CB-TE2A)或去铁敏-B(DFO)。在一些实施方案中，放射性核素是90Y、86Y、111In、67Ga、68Ga、89Zr、64Cu、67Cu、177Lu、188Re、186Re、153Sm、89Sr、186Er、47Sc、223Ra、166Ho、161Tb、149Tb、212Pb/212Bi、225Ac、213Bi、211At、117mSn、123I、131I或18F。在一些实施方案中，接头将所述肽与所述细胞毒性载荷分开。接头可以是可切割接头或不可切割接头。在一些实施方案中，肽与细胞靶向部分缀合或共价连接。细胞靶向部分可包含抗体、scfv或靶向配体或者由抗体、scfv或靶向配体组成。在一些实施方案中，肽与成像剂缀合或共价连接。在一些实施方案中，成像剂为荧光染料、荧光蛋白或酶缀合物。肽可与接头，例如可切割接头缀合或共价连接。在一些实施方案中，肽与药物载荷缀合。在一些实施方案中，药物载荷是澳瑞他汀、美登素、tubulysin、加利车霉素、倍癌霉素、苯二氮
Figure BDA0003459985360000031
喜树碱类似物、多柔比星、非临床阶段细胞毒性载荷或其组合。肽可包含在肽同二聚体、肽同三聚体、肽同四聚体、肽异二聚体、肽异三聚体、肽异四聚体或肽多聚体(例如同多聚体或异多聚体)中。在一些实施方案中，肽包含在药物组合物中。所述药物组合物可被配制用于注射、肠胃外施用、皮下注射、静脉内施用或腹膜内注射。
本发明的另一个方面涉及在哺乳动物对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗相关量的本实施方案或如本文或上文所述的肽。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、胰腺癌、头颈癌、转移癌、食管癌或肺癌。在一些实施方案中，对象是人。肽可包含在药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物静脉内、肠胃外、瘤内、动脉内或腹膜内施用。该方法还可包括向所述对象施用第二抗癌治疗。第二抗癌治疗可以是化学治疗、免疫治疗、抗血管生成治疗、放射治疗或手术。在一些实施方案中，第二抗癌治疗是抗VEGF治疗、检查点抑制剂或抗血管生成剂。
本发明的又一个方面涉及本实施方案或如上所述的用于在哺乳动物对象(优选人)中治疗癌症的肽。在一些实施方案中，癌症是卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、胰腺癌、头颈癌、转移癌、食管癌或肺癌。
本发明的另一个方面涉及本实施方案或如上所述的用于在哺乳动物对象中治疗心脏病的肽。本发明的又一个方面涉及本实施方案或如上所述的用于在哺乳动物对象中治疗骨病的肽。
本发明的另一个方面涉及在哺乳动物对象中治疗心脏病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗相关量的本实施方案或如上所述的肽。在一些实施方案中，心脏病是缺血性心脏病。在一些实施方案中，对象是人。
本发明的又一个方面涉及在哺乳动物对象中治疗骨病或者促进骨愈合或骨重塑的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗相关量的本实施方案或如本文或上文所述的肽。在一些实施方案中，对象是人。
如本文所用的术语“治疗性肽”或“诊断性肽”指包含以下或由以下组成的氨基酸序列：TN(dY)LFSPNGPIARAW(SEQ ID NO：1)，或者具有相对于SEQ ID NO：1的1个、2个或3个氨基酸替换并在SEQ ID NO：1的第3位处保留D-氨基酸的序列。治疗性肽可包含在治疗性或非天然多肽中。在一些实施方案中，治疗性肽与细胞穿透肽(cell penetrating peptide，CPP)、抗体、靶向部分、毒素、scFv或其他氨基酸序列共价连接或表达为与其的融合蛋白。在一些实施方案中，治疗性肽包含在长度小于或等于50、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17或16个氨基酸的肽中。治疗性肽可包含天然和非天然氨基酸。在一些实施方案中，治疗性肽可包含一个或更多个化学修饰以在体内抵抗降解或延长药代动力学效应。
在一些实施方案中，治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)可与成像剂或标记(例如荧光标记)缀合或共价结合。可使用多种标记，包括例如荧光染料(例如得克萨斯红、罗丹明、氨基甲基香豆素(aminomethylcoumarin，AMCA)、FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、IRDyes、DyLightTM染料、Alexa FlourTM染料)，荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)、蓝色荧光蛋白(bluefluorescent protein，BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)、B-藻红蛋白(B-Phycoerythrin，BPE)、R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin，R-PE)、PerCP或R-藻蓝蛋白(R-Phycocyanin，RPC))，和/或酶缀合物(例如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOx)或辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP))。如果需要，可以用放射性同位素(例如3H-或14C-甲基基团)标记蛋白质。在一些实施方案中，治疗性肽与纳米载体共价连接，该纳米载体包括但不限于核交联聚合物胶束(CCPM)，并且可以用荧光染料和/或放射性核素(例如铟-111(111In)、64Cu或89Zr)标记该纳米载体。
在另一个实施方案中，提供了治疗性肽(例如，包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成)，其中该治疗性肽与细胞靶向部分缀合或融合。例如，治疗性多肽可通过硫酯键联(例如，使用包含在肽或多肽中或定位在治疗性蛋白质编码序列末端的Cys残基)与细胞靶向部分缀合。在一些方面中，细胞结合部分与治疗性肽(例如包含SEQ ID NO：1)共价连接。在一些实施方案中，细胞靶向部分可与在细胞上表达(例如，在癌细胞上特异或优先表达)的蛋白质、碳水化合物或脂质结合。细胞靶向部分的实例在下文中进一步详述和举例说明，并且包括但不限于与GP240、5T4、HER1、HER2、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14或HER3结合的部分。
在又一些方面中，治疗性肽，任选地与细胞靶向构建体连接的治疗性肽，还与成像剂缀合。例如，成像剂可以是放射性核素、MRI造影剂或超声造影剂。因此，在一些方面中，提供了用于在对象中对靶细胞进行成像的方法，该方法包括向对象施用与成像剂缀合的细胞靶向构建体并在对象中对靶细胞进行成像。
将理解，在某些情况下，融合蛋白可包含定位于治疗性肽和另一治疗性肽或多肽之间的另外的氨基酸。一般来说，这些序列可互换地称为“接头序列”或“接头区域”。本领域技术人员将认识到，接头区域的长度可以是一个或更多个氨基酸，并且经常包含一个或更多个赋予接头以灵活性的甘氨酸残基。在一些具体实例中，用于当前实施方案的接头包括但不限于218(GSTSGSGKPGSGEGSTKG；SEQ ID NO：2)、HL(EAAAK；SEQ ID NO：3)SSG和G4S(GGGGS；SEQ ID NO：4)接头。可以重复这样的接头序列1、2、3、4、5、6或更多次，或将其与一个或更多个不同接头组合以形成接头序列的阵列。例如，在一些应用中，接头区域可包含蛋白酶切割位点，例如由内源性细胞内蛋白酶识别的切割位点。在这种情况下，当细胞靶向构建体被内化到靶细胞中时，蛋白水解切割可从细胞靶向部分和/或其他多肽结构域分离治疗性肽。因此，根据该实施方案的细胞靶向构建体可具有增强的被靶向治疗性肽的胞内活性的优点，因为将降低来自细胞靶向多肽的潜在干扰。
在一些实施方案中，另外的氨基酸与治疗性肽连接。例如，可以包括另外的氨基酸以帮助产生或纯化。可连接的氨基酸序列的一些具体实例包括但不限于纯化标签(例如T7、MBP.GST、HA或polyHis标签)、蛋白水解切割位点(例如凝血酶或弗林蛋白酶切割位点)、胞内定位信号或分泌信号。
如果需要，可将实施方案的治疗性肽与细胞穿透肽(CPP)共价连接。如本文所用，可互换使用术语CPP和膜易位肽(membrane translocation peptide，MTP)，以指增强蛋白质被细胞内化的能力的肽序列。根据实施方案使用的CPP的实例包括但不限于来源于以下的肽区段：HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角足同源异型框基因产物、protegrin I，以及T1、T2、INF7和26肽。在某些方面中，CPP与治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)通过接头序列分开。在一些实施方案中，治疗性肽与细胞靶向部分和CPP二者共价连接。
可将治疗性肽与另外的抗癌化合物或多肽共价连接。例如，预期多种抗肿瘤或化学治疗化合物可与治疗性肽共价连接。这样，治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)与EphB4的相互作用可使另外的抗癌化合物或多肽更接近细胞群(例如癌细胞)，从而使得另外的抗癌化合物(例如放射性化合物或化学治疗剂)或多肽可发挥另外的临床优势。
在一些实施方案中，实施方案的治疗性肽包含在脂质体或纳米颗粒中。脂质体可以是单层的、多层的或多囊的。在一些实施方案中，脂质体在组合物中包含聚乙二醇(PEG)(例如隐形脂质体(stealth liposome))。在一些实施方案中，脂质体可抗体以将脂质体靶向特定细胞，或癌细胞，群(例如，Sofou et al.，2008)。在一些实施方案中，治疗性肽包括在脂质体制剂或纳米颗粒制剂中，以引导脂质体选择性地靶向表达EphB4的细胞。在一些实施方案中，治疗性肽包含在聚合物胶束、核交联聚合物胶束、核-壳-纳米水凝胶或聚合物囊泡(polymersome)中(例如，Talelli et al.，2015)。
就特定组分而言，如本文中所用的“基本上不含”在本文中用于意指没有指定组分被有目的地配制成组合物和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何不期望的污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％。最优选地是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。
如本文在说明书中所用的，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文中在权利要求书中所使用的，当与词语“包含/包括”结合使用时，没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。
除非明确地指出仅指替代方案或者替代方案相互排斥，否则权利要求书中术语“或/或者”的使用用于意指“和/或”，但是本公开内容支持指仅替代方案和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可意指至少第二个或更多个。
贯穿本申请中，术语“约”用于表示值包括用于装置、用来确定所述值的方法的固有误差变异，或者所述研究对象之间存在的变异。
从以下详细描述中，本发明的其他目标、特征和优点将变得明显。然而，应理解，虽然指示了本发明的优选实施方案，但是详细描述和具体实施例仅以示例说明的方式给出，因为对本领域技术人员而言，根据该详细描述，本发明的精神和范围内的多种变化和修改将变得明显。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文中给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个可以更好地理解本发明。
图IA至D：新EphB4激动剂BIDEN-AP具有高受体结合亲和力。(图1A)BIDEN-AP的结构。D-Tyr-P3以红色高亮显示。(图1B)BIDEN-AP的SPR传感图。垂直轴以响应单位(responseunit，RU)表示肽与固定化EphB4的结合。(图1C)BIDEN-AP与EFNB2-Fc对EphB4结合的竞争。将浓度为2nM至1000nM的BIDEN-AP与人EphB4(30nM)混合，并注射到包被有EFNB2-Fc的传感器芯片上。(图1D)BIDEN-AP与EFNB2-Fc在细胞水平上对EphB4结合的竞争。将A2780cp20细胞与EFNB2-Fc(20nM)和BIDEN-AP(以0至100μM的浓度)在25℃下共孵育1小时。用藻红蛋白标记的抗Fc抗体探测与细胞结合的EFNB2-Fc，并通过流式细胞术进行分析。(图1E)结合EFNB2-Fc作为BIDEN-AP浓度的函数。在每个条件下进行单独重复。数据以平均值±SD呈现。
图2A至C：BIDEN-AP充当EphB4激动剂。(图2A)BIDEN-AP诱导EphB4和相关的MAPK14(Crk1)的磷酸化。在16小时血清饥饿之后，将A2780cp20细胞与EFNB2-Fc(20nM)、TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)(50μM)或BIDEN-AP(50μM)孵育30分钟或2小时。未裁剪的印迹可在补充图11处获得。(图2B)与未经处理的对照(CTL)相比，BIDEN-AP抑制A2780cp20细胞侵袭。使用包被有人限定的基质胶(matrigel)的改良Boyden transwell区室。实验一式三份进行。数据呈现为平均值±SD。***p＜0.001。(图2C)Alexa647-BIDEN-AP通过受体介导的内吞作用被内化。将A2780cp20细胞在37℃下与Alexa647-BIDEN-AP(0.05μM)、Alexa647-TNYL-RAW(SEQID NO：12)(0.05μM)或Alexa647-BIDEN-AP(0.05μM)加未标记的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)(5μM，阻断(blocking))孵育。Alexa647-BIDEN-AP而非Alexa647-TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)被内化到A2780cp20细胞中。
图3A至C：CCPM-BIDEN-AP纳米缀合物的合成与表征。(图3A)用于合成CCPM-BIDEN-AP的反应方案。(图3B)SPR传感图示出CCPM-BIDEN-AP与rhEphB4包被的传感器芯片的高亲合力结合。未缀合的CCPM用作对照。在这两种情况下，以与CCPM-BIDEN-AP中的等效BIDEN-AP浓度相对应的浓度使用CCPM，浓度范围为0.16nM至20nM。对每个浓度运行一式两份。RU，响应单位。(图3C)CCPM-BIDEN-AP的TEM。纳米颗粒的平均尺寸为24±3nm。
图4A至D：基于BIDEN-AP的药剂抑制微管形成，并使抗性内皮细胞对抗VEGF抗体敏感。(图4A，图4B)与未经处理的对照(CTL)相比，经EFNB2-Fc(2nM)或BIDEN-AP(15μM)处理的RF24细胞中微管的形成。以×100放大倍数拍摄五张图像/孔。每个条件一式三份进行；数据表示为平均值±SD。与对照相比，*p＜0.05，**p＜0.01。(图4C，图4D)BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP诱导贝伐单抗(Bev)抗性RF24细胞的细胞死亡。示出了使用SYTOX-green的来自流式细胞术分析的代表性图表。与Bev相比，用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP处理之后，SYTOX阴性活Bev抗性RF24细胞的数量显著减少。数据表示为平均值±SD(n＝6)。*p＜0.05，**p＜0.01。
图5：BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP在原位卵巢癌模型中的高效抗肿瘤活性。(图5A)用于体内原位A2789cp20-Luc模型和处理的方案。向雌性裸鼠腹膜内(i.p.)接种A2789cp20-Luc肿瘤细胞。从接种之后第7天开始，每只小鼠每隔一天以13mg/kg/注射的剂量接受10次腹膜内注射BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP(粗箭头)，共10次给药。通过生物发光成像(IVIS)监测肿瘤生长。(图5B至C)荷有原位A2780cp20-Luc肿瘤的小鼠(n＝4)的肿瘤细胞接种之后第28天的代表性生物发光图像(图5B)和信号强度的相应定量(图5C)。(图5D至E)每个处理组(n＝8)的肿瘤重量(图5D)和肿瘤结节数(图5E)。数据表示为平均值±SD。*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。CTL，未经处理的对照。
图6A至E：BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP诱导内皮凋亡，损害血管生成，并降低肿瘤细胞增殖。(图6A)对CD31(红色)和TUNEL(绿色)染色的肿瘤切片的代表性免疫荧光图像。细胞核用Hoechst(蓝色)复染。较高放大倍数图像(底行)显示出双染色的凋亡内皮细胞。比例尺，20μm。(图6B至C)微血管密度(MVD)(图6B)和凋亡(TUNEL阳性)细胞计数作为细胞总数的百分比(图6C)。(图6D)来自每个处理组的代表性苏木精和伊红(H&E)染色和Ki67染色的切片的显微照片。(图6E)Ki67阳性细胞作为细胞总数的百分比。数据源自来自三个肿瘤的10个高倍视野，并表示为平均值±SD。与未经处理的对照(CTL)相比，*p＜0.05。
图7A至D：基于BIDEN-AP的药剂对EMT信号传导的抑制。(图7A)来自未经处理的对照(CTL)和经BIDEN-AP处理的小鼠的A2789cp20-Luc肿瘤中EMT核心转录因子Twist和Snail1以及EMT效应物波形蛋白(vimentin)的相对mRNA水平表达的qRT-PCR验证。从每组的三个单独肿瘤收集用于qRT-PCR的样品。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。(图7B)来自未经处理的小鼠和经BIDEN-AP处理的小鼠的代表性波形蛋白染色肿瘤的显微照片。(图7C)最显著地受BIDEN-AP调节所选因子的热图。数据获取自来自未经处理小鼠(对照)和经BIDEN-AP处理小鼠的A2780cp20-Luc肿瘤的反相蛋白阵列。(图7D)建议的BIDEN-AP作用机制。
图8A至D：针对卵巢癌PDX模型的抗肿瘤活性。(图8A)肿瘤生长曲线。(图8B)28天研究结束时的肿瘤重量散点图。数据表示为平均值±标准偏差。(图8C)EphB4和CD31染色的肿瘤切片的代表性免疫荧光显微照片，其示出了EphB4在肿瘤细胞和肿瘤血管二者中的表达。(图8D)Ki67染色的肿瘤切片的代表性免疫荧光显微照片，其示出了用BIDEN-AP处理降低了肿瘤增殖。Ki67染色的荧光强度表示为10个随机观察视野的平均值±标准偏差。原始载片的放大倍数：×200。比例尺，50μm。***p＜0.001。
图9：建议的BIDEN-AP作用机制。基于BIDEN-AP的治疗干扰EphB4及其膜结合配体EFNB2之间双向信号传导活动的作用机制示意图，该机制导致抑制肿瘤细胞的增殖和转移，并包括周围内皮细胞的血管生成。
图10：截短肽与固定化rhEphB4的结合的BIACore传感图。通过响应单位(RU)在180秒注射间隔随后210秒洗涤间隔期间内的变化表明肽在传感器芯片上的保留。将浓度为1.6nM至800nM的肽注射到rhEphB4传感器芯片上，并记录与固定化EphB4结合的肽量。(TNYLFSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：15；TNYLFSPNGPIARA＝SEQ ID NO：11；TNYLFSPNGPIAR＝SEQ ID NO：16；NYLFSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：17；YLFSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：18；LFSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：19)
图11：所选的D替换的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)肽与固定化rhEphB4的结合的BIACore传感图。将浓度为1.6nM至800nM的肽注射到rhEphB4传感器芯片上，并以响应单位(RU)记录与固定化EphB4结合的肽量。(T(dN)YLFSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：20；TN(dY)LFSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：1；TNY(dL)FSPNGPIARAW＝SEQ ID NO：8；TNYL(dF)SPNGPIARAW＝SEQ ID NO：9；TNYLF(dS)PNGPIARAW＝SEQ ID NO：10；TNYLFSPNG(dP)IARAW＝SEQ ID NO：21；TNYLFSPNGP(dI)ARAW＝SEQ ID NO：22；TNYLFSPNGPIA(dR)AW＝SEQ ID NO：6；TNYLFSPNGPIAR(dA)W＝SEQ ID NO：23；TNYLFSPNGPIARA(dW)＝SEQ ID NO：24；TNYLFS(dP)NG(dP)IARAW＝SEQ ID NO：25；TNYLFSPNGPI(dA)R(dA)W＝SEQ ID NO：26)
图12：BIDEN-AP诱导EphB4磷酸化。使HeyA8卵巢癌细胞在6孔板中生长至75％汇合。洗涤细胞并用血清剥夺培养基孵育12小时。然后在完全培养基中用每种测试化合物以50nM的浓度处理细胞12小时。使用10μL(5μg)小鼠抗EphB4受体抗体和18μL蛋白G珠对细胞裂解物进行免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)。用4％至20％Nu-PAGE凝胶进行解离(resolve)之后，用抗磷酸化酪氨酸和抗EphB4抗体进行免疫印迹。包括小鼠IgG作为免疫沉淀的同种型对照。未裁剪的印迹可在补充图11处获得。
图13：Alexa647-BIDEN-AP在4℃下未被内化到卵巢癌细胞中。将A2780cp20细胞在4℃下用Alexa647-BIDEN-AP(0.05μM)孵育。化合物在低温下未被肿瘤细胞吸收，表明对于Alexa647-BIDEN-AP的受体介导的能量依赖性内吞过程。
图14A至B：EphB4结构的叠置。(图14A)绿色色带显示在天然配体EFNB2存在下的EphB4构象(PDB：2HLE)，红色色带显示在拮抗剂的存在下的构象(PDB∶2BBA)，和蓝色色带显示与BIDEN-AP结合的建模的EphB4构象。拮抗剂肽TNYLA-RAW(SEQ ID NO：14)显示为浅粉色，BIDEN-AP显示为青绿(teal)色。(图14B)TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)和BIDEN-AP与EphB4的相互作用。EphB4的Leu95可通过与Leu-P4、Phe-P5、Ile-P11和Trp-P15的疏水相互作用来容纳这两种肽。其他EphB受体会与这两种肽产生空间冲突，因此不会与这些肽结合。
图15：对EphB类受体的ELISA结合测定。BIDEN-AP选择性地与EphB4结合，但不与EphB受体家族中的其他成员结合。数据表示为平均值±SD(n＝3)。
图16A至B：BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP二者均在人卵巢癌细胞或来自原位卵巢肿瘤的裂解物中激活EphB4和相关的Crk1(图16A)将A2780cp20细胞在无血清培养基中培养16小时之后，将其用BIDEN-AP(50nM)、CCPM-BIDEN-AP(对于BIDEN-AP的50nM等效浓度)或TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)(50nM)孵育24小时。收获总蛋白质裂解物并使其经受Nupage-SDS分离，然后进行免疫印迹。(图16B)免疫沉淀和免疫印迹用于分析用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP处理的小鼠中的原位A2780cp20肿瘤中磷酸化EphB4和Crk1水平。CTL，未经处理的对照。未裁剪的印迹可在补充图11处获得。
图17：BIDEN-AP抑制内皮细胞的迁移能力。RF24细胞用BIDEN-AP(50μM)或TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)(50μM)处理，并使其经受划痕测定以获得细胞迁移。比例尺，200μm。确定各组的平均伤口闭合。CTL，未经处理的对照。*p＜0.05(与CTL相比；n＝7)。
图18：表示从反相蛋白质阵列获得的263个阵列点的热图。在分析中使用了来自未经处理小鼠(对照)和经BIDEN-AP处理小鼠(BIDEN-AP)的三个单独A2780cp20-Luc肿瘤。在该热图中绘制了在每种条件下来自三个单独复制品的表达倍数变化的中位数。
图19A至B：BIDEN-AP针对皮下移植的卵巢癌PDX模型的抗肿瘤活性。(图10A)28天研究期结束时切除的肿瘤的照片。(图10B)研究过程中体重的变化。数据表示为平均值±标准偏差。
图20：原始western印迹数据。(TNYL-RAW(SEQ ID NO：12))
图21：64Cu标记的BIDEN-AP的合成。(SEQ ID NO：1)
图22：荷有s.c.A2780cp20或MDA-MB-468肿瘤的小鼠的微正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(μPET/CT)经轴成像。在静脉内注射64Cu-NOTA-BIDEN-AP之后1小时时获取图像。
图23：A2780cp20肿瘤的放射自显影。对荷有原位A2780-CP20肿瘤的雌性裸鼠注射单独的64Cu-NOTA-BIDEN-AP(200μCi，0.2mL)或与大量过量的冷BIDEN-AP肽(200倍摩尔比)一起的64Cu-NOTA-BIDEN-AP。在注射放射示踪剂之后24小时，取出肿瘤并进行放射自显影。BIDEN-AP特异性阻断肿瘤对64Cu-NOTA-BIDEN-AP的摄取。
图24A至E：BIDEN-AP的抗肿瘤活性。(图24A)体内原位4T1乳腺肿瘤模型和处理的方案。将4T1-Luc细胞(1x106/部位)接种在雌性Balb/c小鼠的乳腺脂肪垫中。从接种之后第6天开始，每只小鼠以13mg/kg/注射的剂量接受8次BIDEN的i.p.注射(黑色箭头)，持续2周。在最后一次注射之前一天进行生物发光成像(IVIS-BLI)，并且在最后一次给药之后一天收获肿瘤并称重。(图24B)肿瘤细胞接种之后第19天的代表性BLI图像。(图24C)研究结束时(第21天)时的肿瘤重量(n＝10)。(图24D，图24E)CD31的免疫组织化学染色和每个视野CD31+面积的相应定量(n＝8)。数据表示为平均值±SD。*p＜0.05，***p＜0.001。CTL，未经处理的对照，未配对student t检验。
图25A至B：BIDEN-AP的抗转移活性。(图25A)来自不同处理组的肺的代表性照片。正常肺组织用蓝墨水染色。(图25B)通过目视检查肺中表面转移性结节的计数。数据表示为平均值±SD。**p＜0.01(n＝10)。
具体实施方式
I.治疗性肽
本发明部分基于可选择性结合EphB4的新治疗性肽的鉴定。在一些方面中，发明人已经发现，在特定位置处用D-氨基酸替换L-氨基酸可导致肽功能的出乎预料和未预期的变化。如以下实例所示，发明人出乎预料地发现，用D-Tyr-P3替换L-Tyr-P3(例如，如SEQ IDNO：1所示)导致从EphB4拮抗剂向EphB4激动剂的功能性转换。与EphB4的天然配体EFNB2不同，EFNB2与B亚类内的数个受体结合(Chrencik et al.，2006；Himanen et al.，2001)，EphB4激动剂肽TN(dY)LFSPNGPIARAW(SEQ ID NO：1)专一地与EphB4结合。进一步的实验表明，BIDEN-AP及其纳米缀合物CCPM-BIDEN-AP二者在体外和体内都促进了正向、肿瘤抑制性EphB4信号传导，通过在内皮细胞中干扰EphB4及其天然配体EFNB2的相互作用阻断了反向信号传导，从而抑制了其血管生成特性，并使Bev抗性内皮细胞对细胞死亡敏感。此外，用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP的单一治疗在体外和体内动物模型二者中均表明了显著的抗肿瘤作用和抗血管生成活性。本文还提供了使用治疗性肽治疗癌症的方法。
在另外的方面中，可选择性结合EphB4的治疗性肽可在维持其活性的同时通过一个或更多个其他氨基取代被进一步修饰；在一些优选实施方案中，治疗性肽在第3位处具有D-氨基酸(例如，如SEQ ID NO：1所示)。通常，可在一个或更多个位置处进行氨基酸替换，其中替换是对于具有类似亲水性的氨基酸。亲水氨基酸指数或亲水性在赋予蛋白质以相互作用生物学功能中的重要性是本领域中通常了解的。已接受的是，氨基酸的相对亲水特性或亲水性有助于所得蛋白质的二级结构，其转而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。因此，这样的保守替代可在治疗性蛋白质中进行，并且可能对其活性仅具有轻微影响。如在美国专利4,554,101中详细描述的，已将以下亲水性值赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(0.5)；组氨酸-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。这些值可用作指导，因此亲水性值在±2之内的氨基酸的替换是优选的，在±1之内的那些是特别优选的，并且在±0.5之内的那些是甚至更特别优选的。因此，本文所述的任何治疗性肽都可通过用例如在1、2、3或4个不同位置处具有类似亲水性值的不同但同源的氨基酸替换氨基酸来修饰。亲水性在+/-1.0或+/-0.5点内的氨基酸被认为是同源的。预期治疗性肽可包含相对于SEQID NO：1的1、2或3个缺失突变，尽管优选SEQ ID NO：1第3位处的氨基酸为D-氨基酸。
B.D-氨基酸肽的合成
在一些优选实施方案中，本实施方案的治疗性肽包含至少一个D-氨基酸(例如，SEQ ID NO：1)。天然丰富的L-氨基酸的对映体D-氨基酸具有独特的立体化学性质，其导致对大多数内源性酶的抗性。本领域已知用于产生或合成D-氨基酸肽的多种方法。例如，固相肽合成(solid-phase peptide synthesis，SPPS)经常用于合成肽，包括包含一个或更多个D-氨基酸的肽。
SPPS已经被使用了一段时间，并且允许通过氨基酸衍生物在不溶性多孔支持物上的连续反应快速组装肽链(例如，(Merrifield，1963；Chan和White，2000)。Fmoc SolidPhase Peptide Synthesis：A Practical Approach.Oxford，UK：OUP.ISBN 978-0-19-963724-9.)通常，该固体支持物包含可以与所合成的肽链连接的用反应性基团(例如胺或羟基基团)官能化的小聚合物树脂珠。试剂和副产物可通过洗涤和过滤来添加和去除。SPPS使用交替的N端脱保护和偶联反应的重复循环来合成地使肽变长(grow)。可使用的肽偶联剂包括例如：可用于酰胺键形成的碳二亚胺，例如二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)或二异丙基碳二亚胺(diisopropylcarbodiimide，DIC)；胺/脲(uronium)(例如HATU(HOAt)、HBTU/TBTU(HOBt)和HCTU(6-ClHOBt))或非亲核阴离子的膦盐(例如四氟硼酸盐或六氟磷酸盐)(El-Faham和Albericio，2011)；或丙烷膦酸酐。固体支持物包括凝胶型支持物、表面型支持物和复合材料(Albericio，2000)。可使用的保护基团包括例如：可使用三氟乙酸去除的叔丁氧羰基保护基团(也称为“Boc”)；芴基甲氧基羰基保护基团(也称为“Fmoc”)和碳苄基(carbobenzyl)基团。包含D-氨基酸的肽的定制合成也可从多个商业制造商处获得。
在一些实施方案中，固相合成可用于合成包含D-氨基酸的治疗性肽，如下。可在自动肽合成仪(例如Prelude；PTI，Tucson，AZ)上使用Rink树脂(例如Novabiochem)进行固相合成。可用约5×1.5mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)/二氯甲烷(CH2Cl2)溶胀并洗涤树脂(0.05至0.1g)。可使用3×1.5mL的20％哌啶/DMF去除芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团，每次5分钟。对于偶联，可使用在3mL的DMF/CH2Cl2中的三倍过量的Fmoc-氨基酸、二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑。此过程可重复一次。在偶联和脱保护步骤之后，用3×3mL的DMF/CH2Cl2洗涤树脂。在完成肽链延伸之后，用3×3mL的CH2Cl2洗涤树脂，并用三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶H2O(95∶2.5∶2.5)每次处理15分钟。可在室温下静置合并的滤液约1至2小时，并可在真空中减少体积。然后，可在冰冷的乙醚中使肽沉淀，通过离心收集，用乙醚洗涤两次，然后进行离心。干燥之后，可通过反相高效液相色谱(HPLC)例如使用Agilent 1200系统(C-18，Vydac，10×250mm，10μm；Santa Clara，CA)纯化肽。Alexa647偶联的治疗性肽(例如BIDEN-AP)可通过相应肽与Alexa647-N-羟基琥珀酸酯(Alexa647-NHS)的溶液相反应然后进行HPLC纯化获得。
C.缀合物
治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)可与肽、多肽(例如抗体、scFv或者另外的抗炎或抗癌多肽)或化合物(例如化学治疗或抗癌化合物)共价偶联。例如在Vrettos et al.，2018中讨论了肽药物缀合物的设计策略。本领域技术人员已知的连接/偶联的药剂和/或机制可用于修饰本实施方案的治疗性肽，例如如抗体-抗原相互作用、亲和素生物素键联、酰胺键联、酯键联、硫酯键联、醚键联、硫醚键联、磷酸酯键联、磷酰胺键联、酸酐键联、二硫键联、离子和疏水相互作用、双特异性抗体和抗体片段、或其组合。在一些实施方案中，本实施方案的治疗性肽可与化学治疗剂缀合以促进向表达EphB4的细胞或癌细胞的递送；例如，治疗性肽(例如SEQ ID NO：1)可与细胞毒性剂和生物可降解连接接头共价连接以形成肽-药物缀合物(例如Vrettos et al.，2018)。
考虑可采用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知多种类型含二硫键的接头可成功用于使靶向剂和治疗剂/预防剂缀合。例如，含有空间上受阻的二硫键的接头可在体内导致更大的稳定性。另一种交联试剂是SMPT，这是一种包含二硫键的双官能交联剂，该二硫键由于邻近的苯环和甲基而在空间上受阻。与许多其他已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂也能够使官能团例如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)交联。另一种可能的交联剂类型包括含有可切割二硫键的异-双官能光反应性叠氮基苯，例如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1，3’-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且叠氮基苯(光分解之后)非选择性地与任何氨基酸残基反应。
除了受阻交联剂，非受阻交联剂也可据此使用。不预期包含或产生被保护的二硫化物的其他有用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷。接头可以是双官能接头，例如可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双官能接头(例如美国专利4,680,338)。美国专利5,141,648和5,563,250公开了包含在多种温和条件下可切割之不稳定键的可切割缀合物。
在一些实施方案中，肽包含在异二聚体或多聚体中。例如，肽可包含在肽同二聚体、肽同三聚体、肽同四聚体、肽异二聚体、肽异三聚体、肽异四聚体或肽多聚体中。异二聚体和其他多聚体构建体可通过例如如Yan et al.，2011中所公开的方法制备。这样的多聚体构建体在成像方法中可特别有用。例如，这样的多价方法可用于改善肽结合亲和力。肽同二聚体或同多聚体，其中相同类型的肽配体可用合适的接头构建。可使用肽异二聚体，例如用于靶向多受体过表达的肿瘤细胞，并可能导致亲和力增强。例如在Dijkraaf et al.，2008中也描述了产生肽多聚体的方法。
D.药物载荷
在一些实施方案中，治疗性肽与药物载荷(例如细胞毒性载荷(例如，蛋白质或酶)或化学治疗剂)缀合或共价结合。例如，预期可与之连接的广泛多种化学治疗剂或细胞毒性多肽为美登素、澳瑞他汀、紫杉烷、加利车霉素、CC-1065类似物、倍癌霉素、蛋白质毒素(这样的例如假单胞菌外毒素或白喉毒素)、鹅膏毒素。在一些实施方案中，治疗性肽(例如SEQID NO：1)可与药物载荷连接，药物载荷包括例如澳瑞他汀、美登素类、tubulysin、加利车霉素、倍癌霉素、苯二氮
Figure BDA0003459985360000161
喜树碱类似物、多柔比星或其他细胞毒性弹头(例如非临床阶段细胞毒性弹头)、或其组合。任选地，治疗性肽可通过接头与药物载荷或细胞毒性载荷共价连接。接头可以是可切割的接头。
用于肽-药物缀合物(peptide-drug conjugate，PDC)的抗癌药物，与已用于增强现有小分子量抗癌药物抗肿瘤效力的抗体-药物缀合物(antibodV-drug conjugate，ADC)的方式大致相同(Beck et al.，Strategies and challenges for the next generationof antibody-drug conjugates.Nat Rev Drug Discov.2017May；16(5)：315-337.doi：10.1038/nrd.2016.268.)。可与BIDEN-AP(SEQ ID NO：1)缀合的抗癌药物包括但不限于临床阶段ADC中所使用的弹头，例如：澳瑞他汀、美登素类、tubulysin、加利车霉素、倍癌霉素、苯二氮
Figure BDA0003459985360000171
喜树碱类似物、多柔比星和其他非临床阶段细胞毒性弹头。
E.成像剂
在一些实施方案中，治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)与成像剂或可检测标记缀合或共价结合。例如，在一些实施方案中，治疗性肽可与可检测标记共价结合。治疗性肽还可包含在纳米颗粒、脂质体或胶束中或者与纳米颗粒、脂质体或胶束共价连接，其中纳米颗粒、脂质体或胶束包含可检测标记。
本文中使用的“可检测标记”是由于其特定的功能特性和/或化学特征而可以被检测的化合物和/或元素，其的使用允许其连接的肽被检测和/或如果需要的话进一步被量化。
在一些实施方案中，可检测标记是光致发光探针，例如荧光团或纳米颗粒，例如铝酸锶纳米颗粒(例如，参见Paterson et al.，2014)。示例性标记包括但不限于颗粒标记例如胶体金，放射性同位素例如211砹、57钴、58钻、67铜、67铜、152Eu、67镓、18氟、碘123、碘125、碘131、111铟、59铁、32磷、186铼、188铼、75硒、35硫、-99锝、-99m锝、89锆或90钇，比色标记例如二硝基苯、丹酰氯(dansyl chloride)、丹磺酰氯(dabsyl chloride)、任何偶氮、花青苷(cyanin)或三嗪染料，或者美国专利5.470,932、5,543,504或6,372,445中公开的生色团，所有这些均通过引用并入本文；顺磁性标记例如铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)，荧光标记例如Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、级联蓝(Cascade Blue)、Cy3、Cy5，6-FAM、Cy7、IRDyes、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、太平洋蓝、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或得克萨斯红或Lucifer黄，酶标记例如脲酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶，或者化学发光标记例如鲁米诺、双酮酞嗪，以及美国专利4,373,932、4,220,450、5,470,723和美国专利申请2007/0264664中任一个所公开的其他，所有这些都通过引用并入本文。
F.接头
多种接头可用于包含实施方案的治疗性肽的构建体中。例如，治疗性肽(例如，SEQID NO：1)可与和药物载荷或细胞毒性载荷共价连接的接头共价连接。在一些实施方案中，接头可在细胞内环境中被切割；以这种方式，在治疗性肽结合EphB4并被内化到细胞内环境之后，药物载荷可以在细胞(例如肿瘤细胞或癌细胞)内释放。在一些方面中，接头可以是一个或更多个氨基酸(例如2、3、4、5、10、15、20或更多个氨基酸)的随机串。根据实施方案使用的一些具体接头包括218(GSTSGSGKPGSGEGSTKG；SEQ ID NO：2)、HL(EAAAK；SEQ ID NO：3)和G4S(GGGGS；SEQ ID NO：4)接头(例如，Robinson和Sauer，1998；Arai et al.，2004和Whitlow et al.，1993，各自通过引用并入本文)。
在进一步的方面中，接头可充当分离多肽构建体的不同结构域的方法，例如通过蛋白水解切割进行分离。例如，接头区域可包含蛋白酶切割位点，例如由内源性胞内蛋白酶识别的切割位点。在更进一步的方面中，蛋白酶切割位点可以是仅在某些细胞类型中被切割的位点。根据实施方案使用的蛋白酶切割位点的实例包括但不限于凝血酶、弗林蛋白酶(Goyal et al.，2000)和半胱天冬酶切割位点。
包含治疗性蛋白质和例如药物载荷或细胞毒性载荷的构建体可通过先前在本领域中描述的多种缀合或键联连接。在一个实例中，可使用生物可释放键，例如选择性可切割接头或氨基酸序列。例如，考虑包括优先位于肿瘤环境内或在肿瘤环境内具有活性的酶的切割位点的肽接头。例如，由尿激酶、纤溶酶、凝血酶、因子IXa、因子Xa或金属蛋白酶(例如胶原酶、明胶酶或溶基质蛋白酶(stromelysin))切割的接头。在一个优选实施方案中，被胞内蛋白酶切割的接头是优选的，因为这将允许构建体在切割之前完整地内化到所靶向的细胞中。
上文描述了例如选择性可切割接头、合成接头的氨基酸，或者例如富含甘氨酸的接头的其他氨基酸序列，并且其可用于分离构建体的不同区域。此外，尽管已知多种类型的含有二硫键的接头可成功用于将dGel与细胞靶向部分缀合，但基于不同的药理学特征和能力，某些接头通常会优于其他接头。例如，在一些实施方案中，含有空间上“受阻”的二硫键的接头可以是优选的，因为它们在体内具有更大的稳定性，这可降低或阻止细胞毒性载荷或药物载荷在结合到作用位点之前的释放。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(例如，单链抗体)的肽接头。接头的长度为多至约50个氨基酸；包含出现至少一次的带电荷氨基酸(优选精氨酸或赖氨酸)接着是脯氨酸；并且以更高的稳定性和聚集降低为特征。美国专利No.5,880,270公开了含氨基氧基的接头，其可用于多种免疫诊断和分离技术。
G纳米颗粒、脂质体和胶束
在一些实施方案中，治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)以脂质体、纳米颗粒或胶束施用。例如，在一些实施方案中，治疗性肽与核交联聚合物胶束(CCPM)缀合。脂质体、纳米颗粒或胶束(例如CCPM)可任选地包含可检测标记，例如如荧光团(例如荧光染料)和/或放射性核素(例如铟-111或铜-64)。在一些实施方案中，治疗性肽包含在脂质体或纳米颗粒中，并且可用于将脂质体或纳米颗粒靶向表达或过表达EphB4的细胞。
在一些实施方案中，通过中性或不带电荷脂质体(例如使用如美国专利8,895,717中所述的脂质体)施用治疗性肽。在一些实施方案中，可通过中性或不带电荷脂质体(例如，使用如美国专利8,734,853中所述的脂质体)施用治疗性肽。例如，在一些实施方案中，脂质体包含一种或更多种中性磷脂，例如磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺磷脂。脂质体可以例如是单层的、多层的或多囊的脂质体。脂质体中可包含多种化合物，例如如蛋磷脂酰胆碱(“EPC”)、二月桂酰磷脂酰胆碱(“DLPC”)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(“DSPC”)、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“MPPC”)，1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“PMPC”)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(“PSPC”)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(“SPPC”)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DAPC”)、1，2-二花生酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DBPC”)、1，2-dieicosenoyl-sn-甘油-3-磷酸胆碱(“DEPC”)、棕榈酰氧基磷脂酰胆碱(“POPC”)、二亚油酰磷脂酰胆碱二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(“DSPE”)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(“DMPE”)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(“DPPE”)、棕榈酰氧基磷脂酰乙醇胺(“POPE”)、二油酰磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)或二油酰磷脂酰胆碱(“DOPC”)。治疗性肽可肠胃外、静脉内、经动脉、肝内门静脉、肌内、腹膜内或瘤内施用。
脂质体可例如通过在脂质体中包括靶向蛋白质或肽以靶向特定细胞类型。已知多种将抗体与脂质体缀合的方法，例如，如Manjappa et al.，2011；Ansell，2000；或Aryasomayajula，2017中所述。
在一些实施方案中，胶束是生物可降解的核交联聚合物胶束(CCPM)。例如，胶束可包含聚乙二醇(PEG)、甲氧基-聚(乙二醇)-嵌段-聚(D，L-丙交酯)、聚(乙二醇)-嵌段-聚(天冬氨酸)、聚(乙二醇)-b-聚(甲基丙烯酸)或聚(乙二醇)-嵌段-聚(谷氨酸)。其他产生CCPM的方法是已知的，并且可以在多种实施方案中使用，例如，如Zhou et al.，2017；Talelliet al.，2015；Hu et al.，2016中所述。CCPM可通过多种途径施用，包括肠胃外、静脉内、皮下等。
CCPM也可以用荧光团或成像剂标记，并可用于成像(例如，如Shi et al.，2015所述)。在一些实施方案中，治疗性肽与CCPM胶束缀合，例如如(Koolpe et al.，2005)所述；通常，可合成具有胺官能化表面的CCPM，并将其与包含末端Cys的治疗性肽(例如Cys-BIDEN-AP)反应，以形成用治疗性肽官能化的胶束或脂质体。CCPM也可使用成像剂(例如荧光染料或近红外荧光剂)进行标记，或使用荧光染料和放射性同位素(例如铟-111)二者进行双重标记，并且标记的CCPM可用于体内成像应用(例如如Yang et al.，2007；Zhang et al.，2011a；Zhang et al.，2011b；Zhao et al.，2012所述)。图中示出了用于产生与可检测标记(例如铜-64)缀合的治疗性肽的另外的合成方法。
可以使用多种脂质体直径。例如，在一些实施方案中，脂质体(例如CCPM)直径为约5至100、10至50、15至35、10至25、15至25、或5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30nm，或其中可推导出的任何范围。
II.疾病治疗
在一些方面中，包含如本文所述的治疗性肽(例如，包含SEQ ID NO：1)的组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症表达或过表达EphB4。在其他实施方案中，本文公开的治疗性肽可用于促进骨重塑或治疗骨质丢失(例如由骨质疏松症、遗传性病症引起或由癌症治疗例如激素治疗、化学治疗等引起)。在一些实施方案中，治疗性肽可用于治疗心脏病，例如缺血性心脏病。
酪氨酸激酶EphB4是Eph受体家族的成员，与肿瘤血管生成、生长和转移相关(例如Chen et al.，Semin Cancer Biol.2017 Oct 6.pii：S1044-579X(17)30162-1.)，并且EphB4表达与多种癌症相关，包括，例如结直肠癌(Kuppen et al.，2017)、胃癌(Yin etal.，2017)、前列腺癌(Mertens-Walker et al.，2015)、乳腺癌(Li et al.，2017)、肉瘤(Becerikli et al.，2015)包括横纹肌肉瘤(Randolph et al.，2017)、白血病包括慢性髓细胞白血病(Zhao et al.，2017)、胰腺癌(Li et al.，2014)，肺癌(Ferguson et al.，2015)、头颈癌(Bhatia et al.，2016)、食管癌(Hasina et al.，2013)或卵巢癌。由于观察到BIDEN-AP肽(SEQ ID NO：1)调节EphB4信号传导，因此预期治疗性肽对于治疗表达或过表达EphB4的癌症可特别有用。
具有突变的磷酸化位点的EphB4突变体仍可促进肿瘤细胞生长和迁移(Hu etal.，2014)。相反，越来越多的证据支持配体依赖性EphB4/EFNB2信号传导是肿瘤抑制性的观点。例如，EFNB2-Fc介导的EphB4磷酸化激活了肿瘤细胞中的AbI家族酪氨酸激酶和Crk衔接蛋白，这导致显著的肿瘤抑制活性(Hu et al.，2014；Tognolini et al.，2013；Noren etal.，2006；Rutkowski et al.，2012；Barneh et al.，2013)。在一些实施方案中，癌症在EphB4中具有一个或更多个突变。
EFNB2主要在肿瘤脉管系统的内皮细胞表面表达(Noren et al.，2004)。数个组已经显示，内皮细胞中反向EphB4向EFNB2信号传导在引发血管生成和淋巴管生成中起着至关重要的作用，血管生成和淋巴管生成是支持肿瘤生长和转移的重要过程(Sawamiphak etal.，2010；Wang et al.，2010；Heroult et al.，2006)。EphB4的可溶性胞外结构域，其扰乱EphB4-EFNB2相互作用，减弱血管生成并抑制肿瘤生长(Kertesz et al.，2006)。EFNB2通过激活血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)作为血管生成的重要调节因子发挥作用(Wang et al.，2010)。因此，激活正向EphB4信号传导并干扰反向EFNB2信号传导的EphB4激动剂可提供独特的治疗机会。
预期本文公开的治疗性肽可用于治疗多种癌症。可用根据一些实施方案的细胞靶向构建体治疗的癌细胞包括但不限于来自以下的细胞：膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳房、结肠、食管、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫。此外，癌症可具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；黏液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳房佩吉特病(paget’sdisease，mammary)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌W/鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；sertoli细胞癌；恶性莱迪希细胞瘤(leydig cell tumor)；恶性脂质细胞瘤；恶性神经节细胞瘤；恶性乳房外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣内黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤(mullerian mixed tumor)；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳瘤(brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺肿；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi’s sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤(ewing’s sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病(hodgkin’s disease)；霍奇金；副肉芽肿；小淋巴细胞性恶性淋巴瘤；大细胞弥散性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样霉菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
除癌症之外，预期本文公开的治疗性肽还可用于治疗多种疾病。例如，通过成骨细胞的正向EphB4信号传导可增强成骨分化并增加骨量(Zhao et al.，2006)。因此，治疗性肽可用于治疗骨质丢失和/或促进骨重塑。
在一些实施方案中，治疗性肽用于治疗心脏病。EphB4正向信号传导还可以在小鼠胚胎干细胞中调节心脏祖细胞发育(Chen et al.，2015)。此外，报道了腹膜内施用肝配蛋白-B2 Fc在梗死小鼠心肌中增加毛细血管密度(Mansson-Broberg et al.2008)。细胞培养中的研究表明EphB4在心肌细胞间隙连接通讯和同步收缩中的作用(Ishii et al.，2011)。因此，由治疗性肽(例如，SEQ ID NO：1)介导的正向信号传导可用于治疗心脏病，例如缺血心肌。
II.药物组合物
本实施方案的药物组合物包含有效量的本实施方案的一种或更多种化合物，例如治疗性肽(例如，包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成，任选地与细胞毒性载荷或化学治疗缀合，或任选地包含在纳米颗粒、脂质体或胶束中)，或者溶解或分散在可药用载体中的另外的药剂。治疗性肽可任选地与药物载荷共价连接(例如直接连接或通过可切割或不可切割的接头连接)，或治疗性肽可包含在如本文所述的纳米颗粒、脂质体或胶束中、与如本文所述的纳米颗粒、脂质体或胶束缀合或者与如本文所述的纳米颗粒、脂质体或胶束共价连接。
短语“可药用或药理学上可接受的”是指当适当地向动物(例如如人)施用时不产生不利的、变应性或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员将知晓含有至少一种化合物或治疗性肽或另外的活性成分的药物组合物的制备，如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams andWilkins，2005所举例说明，其通过引用并入本文。此外，对于动物(例如，人)施用，应理解，制剂通常应符合FDA生物学标准办公室(FDA Office of Biological Standards)所要求的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。
如本文中所用，“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂、吸收延迟剂、盐类、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶剂、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、类似物质及其组合，如本领域普通技术人员所知(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329页，其通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在药物组合物中的用途。
治疗性肽可包含不同类型的载体，这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及其对于例如注射的施用途径是否需要是无菌的。如本领域普通技术人员已知的，本发明可如下施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、黏膜、局部、吸入(例如，气雾剂吸入)、注射、输注、持续输注、直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在奶油中(in cremes)、在脂质组合物(例如，脂质体、胶束或纳米颗粒)中、或者通过其他方法或前述方法的任意组合(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，其通过引用并入本文)。
进一步根据本发明，适合于施用的本实施方案的组合物可在具有或不具有惰性稀释剂的可药用载体中提供。载体应是可吸收的，并且包括液体、半固体即糊剂，或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对于接受者或对于其中所含组合物的治疗效果是有害的，否则其在用于实施本实施方案的方法的可施用的组合物中的使用是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、黏合剂、填充剂等，或其组合。组合物还可包含多种抗氧化剂以延迟一种或更多种组分的氧化。此外，通过防腐剂可产生对微生物作用的防止，所述防腐剂例如多种抗细菌剂和抗真菌剂，其包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
根据本发明，以任何方便和实用的方式，即通过溶液剂、混悬剂、乳化、混合、包封、吸收等将组合物与载体组合。这样的操作对于本领域技术人员而言是常规的。
在一个具体实施方案中，组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任意方便的方式进行，例如，研磨。也可在混合过程中添加稳定剂，以保护组合物免于损失治疗活性，即在胃中变性。用于组合物的稳定剂的一些实例包括缓冲剂、氨基酸(例如甘氨酸和赖氨酸)、碳水化合物(例如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等)。
在另一些实施方案中，本发明可以涉及使用包含化合物或治疗性肽、一种或更多种脂质和水性溶剂的药物脂质载剂组合物。本文中使用的术语“脂质”将被定义为包括特征性地不溶于水并且可用有机溶剂提取的宽范围物质中的任一种。这种宽泛类别的化合物是本领域技术人员公知的，并且在本文中使用术语“脂质”时，其不限于任何特定的结构。一些实例包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成(即，由人设计或产生)的。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域中是公知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质，和可聚合的脂质，及其组合。当然，除本文中具体描述的那些之外的被本领域技术人员理解为脂质的化合物也被本实施方案的组合物和方法涵盖。
本领域普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在脂质载剂中的一系列技术。例如，通过本领域普通技术人员已知的任何方式，本实施方案的化合物或治疗性肽可分散在包含脂质的溶液中，用脂质溶解，用脂质乳化，与脂质混合，与脂质组合，与脂质共价键合，作为混悬剂包含在脂质中，与胶束或脂质体包含或复合，或其他方法与脂质或脂质结构缔合。分散可以或可以不导致形成脂质体。
向动物患者施用的本实施方案组合物的实际剂量可由物理和生理因素决定，例如体重、病症的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时治疗干预、患者的特发病和施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可根据对象的响应而变化。在任何情况下，负责施用的实践者将确定组合物中活性成分的浓度和个体对象的合适剂量。
在一些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在另一些实施方案中，活性化合物可例如包含单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及其中可推导出的任何范围。自然地，每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以这样的方式制备：在任何给定的单位剂量的化合物中将获得合适的剂量。制备这样的药物制剂领域的技术人员将考虑例如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑的因素，并且因此多种剂量和治疗方案可以是理想的。
在另一些非限制性实例中，剂量还可包含每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重，至约1000mg/kg/体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文中所列数字可推导出的范围的非限制性实例中，基于上述数字，可施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等。
A.肠胃外组合物和制剂
在进一步的实施方案中，本实施方案的治疗性肽可经由肠胃外途径施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括绕过消化道的途径。具体而言，本文所公开的药物组合物可例如(但不限于)静脉内、真皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内施用美国专利No.6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158；5,641,515；和5,399,363(每个都特别地通过引用整体并入本文)。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可在适当地与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散体也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适于注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468，特别地通过引用整体并入本文)。在所有情况下，形式必须是无菌的并且必须存在为达到易注射性之程度的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须被保护以免于微生物，例如细菌和真菌的污染行为。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油。可维持适当的流动性，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来进行。微生物作用的防止可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等)来产生。在许多情况下，可优选地包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来产生。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等张。这些特定的水性溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可将一个剂量溶解在等张NaCl溶液中，然后添加皮下灌注流体或注射在建议的输注部位(参见例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页，1990)。根据所治疗对象的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员决定用于个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应满足FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
通过将活性化合物以需要的量并入到根据需要具有多种以上列举的其他成分的合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常来说，通过将多种经灭菌的活性成分引入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和需要的来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术由其经预先无菌过滤溶液产生活性成分加上任何另外期望成分的粉末。将粉末状组合物与液体载体(例如如水或盐水溶液)在使用或不使用稳定剂的情况下组合。
III.组合治疗
在某些实施方案中，将本实施方案的治疗性肽与至少一种另外的治疗组合施用于对象(例如人对象)。另外的治疗可以是放射治疗、手术(例如，肝切除术和肝移植)、化学治疗、微波消融、酒精消融、化疗栓塞、基因治疗、DNA治疗、病毒治疗、RNA治疗、免疫治疗、骨髓移植、纳米治疗(nanotherapy)、单克隆抗体治疗，或前述的组合。
在一些实施方案中，另外的治疗是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的治疗是施用副作用限制剂(例如，旨在降低治疗副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的治疗是放射治疗、手术或放射治疗(例如，γ辐射)和手术的组合。在一些实施方案中，另外的治疗是使用以下进行的治疗：抗血管生成剂(例如贝伐单抗或贝伐单抗与吉西他滨和奥沙利铂)、酪氨酸激酶抑制剂(例如索拉非尼(sorafenib)、厄洛替尼(erlotinib))、手术(例如部分肝切除术)、局部消融治疗(例如瘤内注射乙醇或乙酸、射频消融、微波消融、激光消融、纳米刀或用液氮进行的冷冻消融)、局部化学治疗(例如化学栓塞)、局部金属离子调节(例如铁或铜螯合等)、基因治疗、免疫治疗(例如，检查点抑制剂，例如选择性结合PD1或PD-L1的免疫治疗或抗体)或饮食治疗。
治疗性肽可在相对于另外的癌症治疗之前、期间、之后或以多种组合施用。施用以以同时至数分钟至数天至数周的间隔进行。在其中将治疗性肽与另外的治疗剂分开提供给患者的一些实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间相当长的一段时间内不会失效，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合作用。在这样的情况下，考虑在彼此相隔约12至24或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6至12小时内，可以为患者提供抗体治疗和抗癌治疗。在一些情况下，可期望将治疗时间段显著延长，其中分开施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
IV.实施例
包含以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，在随后实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中工作良好的技术，并因此可被认为构成用于实践本发明的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应理解，可在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对所公开的一些具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相同或类似的结果。
实施例1-在TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)肽中用D-Tyr替换L-Tyr导致从EphB4拮抗剂转化为EphB4激动剂
表面等离子体共振(SPR)用于测量TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)类似物小文库与经纯化的EphB4的结合亲和力。产生的数据揭示，C端Trp-P15和Ala-Trp(P14-P15)基序的截短逐渐降低肽与EphB4的结合亲和力(图10)。这与先前的报道一致，即RAW基序对于匹配到EphB4的EFNB2结合口袋至关重要(Chrenick et al.，2006b)。然而，N端Thr-P1和Thr-Asn(P1-P2)基序可被截短而不影响肽的结合亲和力，这表明两个N端氨基酸Thr-Asn不直接参与受体结合，因此可在诊断和治疗性应用中用作成像探针或药代动力学修饰剂的缀合位点。
接下来，进行了D-氨基酸扫描，发现用其相应的D-氨基酸替换Phe-P5或Ser-P6显著降低了所得肽与EphB4的结合亲和力。相应D-氨基酸对Pro-P10或Ile-P11的替换以及对Pro-P7/Pro-P10或Ala-P12/Ala-P14的双重替换完全消除了所得肽与EphB4的结合亲和力(图11)。这些数据表明，这些P5至P12氨基酸含有与EphB4受体的重要接触点，并且是维持高受体结合亲和力所必需的。
在研究具有高EphB4结合亲和力的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)类似物的功能活性时，发现了一种这样的类似物TNd(Y)LFSPNGPIARAW(SEQ ID NO：1)(其中L-Tyr-P3被D-Tyr替换)在人HeyA8卵巢癌细胞中诱导EphB4磷酸化(图1A、图12、表1)。将该肽命名为BIDEN-AP，在SPR测定中，该肽显示出快速缔合然后从EphB4包被的传感器芯片缓慢解离。将数据集拟合到1∶1传质相互作用模型之后，估计解离常数(KD)为7.0nM(图1B)。通过SPR研究了BIDEN-AP和EFNB2与EphB4的相互作用关系，其中将BIDEN-AP的连续稀释液与固定浓度的EphB4混合，并将其注射到EFNB2-Fc包被的CM-5芯片上。传感图显示，与EFNB2-Fc结合的EphB4量随着BIDEN-AP浓度的增加而减少。BIDEN-AP的50％抑制浓度(IC50)估计为4nM(图1C)。因此，BIDEN-AP高效抑制EphB4-EFNB2相互作用。在细胞水平上，BIDEN-AP可有效替换A2780cp20细胞表面上EFNB2-Fc和EphB4之间的结合，IC5o值为约1μM(图1D，1E)。基于细胞的测定中IC50值高于基于蛋白质的测定，这反映了EFNB2-Fc也与其他肝配蛋白B类受体结合的事实(Pasquale，1997；Himanen et al.，2001)，因此不能完全被BIDEN-AP替换。总的来说，这些数据表明BIDEN-AP和EFNB2共享相同的EphB4结合位点。
表1.在EphB4磷酸化筛选中使用的肽
Figure BDA0003459985360000291
Figure BDA0003459985360000301
*YSA＝YSAYPDSVPMMS(SEQ ID NO：13)
接下来，发明人通过使用抗EphbB4和抗Crk1抗体进行免疫沉淀，然后使用磷酸特异性抗体进行免疫印迹，测试了来自人卵巢癌细胞A2780cp20裂解物中的EphB4及其下游衔接蛋白Crk1(MAPK14)的磷酸化。与用EFNB2处理类似，BIDEN-AP(但不是TNYL-RAW(SEQ IDNO：12))提高了EphB4和Crk1二者的磷酸化(图2A)。功能上，与未经处理的对照相比，用BIDEN-AP处理显著降低了A2780cp20细胞的侵袭特性(图2B)，表明BIDEN-AP的肿瘤抑制特性。如共聚焦显微图像所显示的，在37℃下，Alexa647标记的BIDEN-AP容易地被A2780cp20细胞内化，其中Alexa647标记的BIDEN-AP与内溶酶体(endo-lysosome)标志物Lysotracker共定位。相比之下，排除了Alexa647标记的拮抗剂TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)。A2780cp20肿瘤细胞对Alexa647-BIDEN-AP的内化被过量的未标记TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)肽阻断，表明这两种肽竞争相同的EphB4结合位点(图2C)。内化实验也在4℃下进行，并且未观察到细胞内化(图13)，表明BIDEN-AP的细胞摄取是由能量依赖性内吞作用介导的。总的来说，这些数据表明BIDEN-AP是通过磷酸化和受体内化激活EphB4的EphB4激动剂。
为了分析用其对应的D-氨基酸替换单个L-氨基酸之后从拮抗剂向激动剂的功能性转换的结构基础，进行了计算机模拟，以基于TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)/EphB4复合物的已知晶体结构对BIDEN-AP和EphB4之间的相互作用建模。不希望受到任何理论的约束，该模型表明Asn-P2与受体的相互作用最小，并且Asn-P2构型的改变不显著改变肽结合。L-Tyr-P3到D-Tyr-P3的构型变化导致失去Tyr-P3侧链与受体D、E和M链之间形成的口袋的相互作用。这使得受体的DE环更加灵活，并向激动剂构象移动，以与配体形成范德华相互作用(图14A)。Leu-P4构型的改变不影响肽结合模式，因为L和D构象异构体二者均占据相同的结合口袋。当Phe-P5构型从L变为D时，观察到Phe-P5的取向发生显著变化。Phe-P5的侧链向EphB4中的Leu95残基相反的方向移动，并向Tyr-P3的侧链移动。为了容纳Phe-P5，Tyr-P3稍微远离口袋，但保持与D、E和M链的范德华相互作用，导致结合亲和力的丧失。Ser-P6构型的改变导致与Tyr-P3的空间冲突和结合亲和力的丧失。此外，Pro-P7和Pro-P10的构型变化导致TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)和BIDEN-AP肽二者的N端残基和C端残基的骨架发生巨大构象变化，其导致肽与受体的相互作用丧失。肽的Ile-P11与受体的Leu95相互作用。这种氨基酸的构型改变在这个位点处引入了空间冲突。这可能解释了用D-Ile-P11修饰之后观察到的几乎没有到没有结合亲和力的现象。由于Trp-P15是末端残基，侧链具有自由旋转并以类似的位姿(pose)与受体结合，表明结合亲和力以及活性的最小变化。这些建模分析与对含有D-氨基酸的肽的详细SPR结合研究一致(图11)。
计算机建模揭示，BIDEN-AP与TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)具有相同的取向，以匹配到EphB4结合槽中(图14A)。用D-Tyr-P3替换L-Tyr-P3降低BIDEN-AP肽和受体之间在该位点处的空间冲突，导致EphB4构象的变化，这可能有助于肽从拮抗功能转换为激动功能。计算数据也支持BIDEN-AP的结合对EphB4具有特异性的观点，因为类似于TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)的肽紧密地匹配到受体的结合槽中(图14B)，而其他EphB受体在Leu95位点(即EphB2和其他EphB受体中的Arg103)处会存在空间限制(Chrencik et al.，2006)，限制了肽与其结合口袋的匹配。为了支持这些建模结果，观察到BIDEN-AP仅与EphB4结合，而不与其他B类Eph受体结合(图15)。
实施例2-BIDEN-AP与核交联聚合物胶束(CCPM)的缀合维持其与EphB4的结合和激动活性
对于体内成像应用，CCPM已用于改善药代动力学和增强肽稳定性(Yang et al.，2007；Zhang et al.，2011a；Zhang et al.，2011b；Zhao et al.，2012)。CCPM的交联核防止胶束过早解体，而刷状聚乙二醇在胶束表面形成致密的保护层，其使单核吞噬系统器官对胶束的摄取最小化。CCPM-TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)展示出是TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)4倍高的全身暴露(时间曲线下面积[AUC]＝138％ID小时/mL与29.1％ID小时/mL)，主要是由于全身清除显著减缓(Zhang et al.，2011b)。因此，使用两步反应方案合成了CCPM-BIDEN-AP(图3A)。所得缀合物保留与EphB4的结合亲和力(图3B)。通过透射电子显微术(TEM)确定CCPM-BIDEN-AP的平均直径为24±3nm(图3C)。如CCPM-BIDEN-AP在体外在A2780cp20细胞中(图16A)和在体内在原位A2780cp20肿瘤中(图16B)诱导EphB4和Crk1磷酸化的能力所表明的，与BIDEN-AP类似，CCPM-BIDEN-AP表现出高效的激动剂活性。
实施例3-基于BIDEN-AP的药剂降低内皮细胞的血管生成特性，并使对抗VEGF药剂具有抗性的内皮细胞对细胞死亡敏感
接下来，确定了BIDEN-AP在内皮细胞中阻断反向EFNB2信号传导中的潜力。使用RF24内皮细胞，从划痕测定得出的结果表明，与未经处理的对照相比，BIDEN-AP而非TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)(均为50μM)显著抑制细胞迁移(图17)。此外，BIDEN-AP和EFNB2-Fc二者均显著抑制来自RF24细胞的毛细血管样管的形成(图4A至B)。因此，数据显示了BIDEN-AP通过干扰反向EphB4至EFNB2信号传导而损害内皮细胞血管生成特性的潜力。
鉴于内皮在抗血管生成治疗的适应性变化中的重要作用(Bergers et al.，2008)，进一步测试了BIDEN-AP在RF24细胞中克服对抗VEGF治疗的抗性中的作用。为此，首先建立了贝伐单抗(Bev)抗性RF24细胞系，该细胞系通过低剂量(5μg/μL)下的持续Bev处理选择了2周。将Bev抗性RF24细胞维持在1.0μg/μL的Bev浓度下。在用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP处理之后，使用流式细胞术并用SYTOX绿色染色，对活(SYTOX阴性)vs.死(SYTOX阳性)群进行定量。结果显示，用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP干扰EphB4至EFNB2信号传导使这些细胞对Bev处理重新敏感(图4C至D)。
实施例4-BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP在原位人A2789cp20-Luc卵巢癌异种移植模型中展示出对肿瘤生长和EMT的高效抑制作用
接下来使用原位、萤光素酶标记的A2780cp20-Luc卵巢癌模型检查BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP的抗肿瘤活性。在初次接种之后第28天，这两种药剂显著降低了A2780cp20-Luc的生物发光信号强度(图5A至C)。根据肿瘤接种之后第31天时的肿瘤重量和转移性结节数量，与对照相比，两种药剂均显著降低了腹膜中的肿瘤生长(图5D)。此外，CCPM-BIDEN-AP比BIDEN-AP在更大程度上减少转移性结节(图5E)。与未经处理的对照肿瘤相比，使用抗小鼠CD31抗体和TUNEL对切除的A2780cp20肿瘤进行免疫荧光共染色揭示，BIDEN-AP和CCPM-BIDEN-AP二者均诱导肿瘤基质内CD31+内皮脉管系统中的凋亡细胞死亡；抑制肿瘤中血管生成，如微血管密度(MVD)降低所示(图6A至C)；以及显著降低肿瘤细胞增殖，如Ki67阳性细胞数量减少所证明(图6D至E)。由于EMT的特征是上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)表达下调以及波形蛋白和神经钙黏着蛋白(N-cadherin)表达上调(Yang和Weinberg，2008)，并且EMT导致细胞侵袭、转移和药物抗性提高(Lamouille et al.，2014)，还从切除的肿瘤确定了关键的EMT因子，并观察到BIDEN-AP在A2780cp20肿瘤中显著降低了波形蛋白、Twist和Snaill在mRNA水平的表达和波形蛋白在蛋白质水平的表达(图7A至B)。
为了更好地理解BIDEN-AP的作用机制，比较了从经BIDEN-AP处理的小鼠或未经处理的对照收获的所得A2780cp20-Luc肿瘤的蛋白质表达谱。反相蛋白阵列数据的综合途径分析显示：1)EMT的调节是被BIDEN-AP下调最多的途径之一，和2)参与肿瘤相关血管生成的重要调节因子，包括EGFR、VEGFR2、GAB2和JAK2，被BIDEN-AP显著下调，表明受体酪氨酸激酶介导的信号转导途径EGFR/MAPK14(Crk1)/JAK2的活性被基于BIDEN-AP的治疗降低。促凋亡蛋白p53、Bax和Bid以及自噬相关蛋白Atg7和Rictor被显著上调(图7C、图18和表2)，这暗示了其抗肿瘤作用的潜在机制。
表2.被BIDEN-AP调节的主要途径和因子
Figure BDA0003459985360000331
Figure BDA0003459985360000341
这些结果是通过比较来自经BIDEN-AP处理的A2780cp20-Luc肿瘤与未经处理组(对照)的反相蛋白阵列数据，从综合途径分析获得的。使用右尾Fisher精确检验计算Ingenuity Pathway Analysis中与每条途径相关的p值，并将最显著的展示在本表中。
实施例5-BIDEN-AP在卵巢癌的患者来源的皮下异种移植(PDX)模型上展示抗肿瘤和抗血管生成作用
BIDEN-AP作为单一药剂延缓来自患高级别浆液性癌(HGSC)患者的成熟的、皮下植入的MDA-HGSC-1PDX肿瘤的生长(图8A)。在研究结束时(处理开始之后28天)，经PBS和BIDEN-AP处理的小鼠的肿瘤重量分别为461±286mg3和220±164mg3(p＝0.10，Student t检验)(图8B；图19A)。另一方面，与对照组中的小鼠相比，BIDEN-AP未导致体重变化(图19B)。免疫荧光共定位分析显示，在MDA-HGSC-1PDX模型中，EphB4在肿瘤脉管系统和肿瘤细胞中均表达(图8C)。通过BIDEN-AP处理显著降低了肿瘤细胞增殖(p＜0.001)(图8D)。因此，BIDEN-AP作为单一治疗针对临床相关的HGSC-PDX肿瘤显示出重要的潜力。
EphB4作为肿瘤启动子或抑制子与其EFNB2配体相关的双重功能打开了调节肿瘤细胞中EphB4活性的治疗窗口(Rutkowski et al.，2012)。在探索结构修饰对EphB4拮抗剂TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)肽的结合亲和力的影响时(Koolpe et al.，2005；Riedl和Pasquale，2015)，发明人意外地发现，用D-Tyr-P3替换L-Tyr-P3导致从EphB4拮抗剂到EphB4激动剂的功能性转换。与EphB4的天然配体EFNB2不同，EphB4的天然配体EFNB2与B亚类内的数个受体结合(Chrencik et al.，2006；Himanen et al.，2001)，EphB4激动剂肽BIDEN-AP唯一地与EphB4结合。进一步的实验表明，BIDEN-AP及其纳米缀合物CCPM-BIDEN-AP二者在体外和体内都促进了正向、肿瘤抑制性EphB4信号传导，通过干扰EphB4及其天然配体EFNB2在内皮细胞中的相互作用阻断了反向信号传导，从而抑制了其血管生成特性，并使Bev抗性的内皮细胞对细胞死亡敏感。此外，用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP的单一治疗在原位人卵巢癌模型中表明了显著的抗肿瘤作用和抗血管生成活性，并且在HGSC-PDX模型中对抗肿瘤生长具有活性。
功能性研究显示，BIDEN-AP的内化被大量过量的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)肽阻断，这表明两种肽竞争相同的EphB4结合口袋。进一步的研究显示，BIDEN-AP也与EFNB2-Fc竞争结合EphB4。鉴于X射线晶体学研究已显示TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)和EFNB2的受体结合位点匹配到EphB4中的相同结合口袋(Chrencik et al.，2006a；Chrencik et al.，2006b)，得出结论，BIDEN-AP与TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)一样也匹配到EphB4中的相同结合口袋。
使用与人EphB4结合的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)的X射线结构作为结构指导(Chrencik et al.，2006)，为EFNB2和TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)二者产生了在EphB4的结合口袋中的BIDEN-AP的结合模式(Chrencik et al.，2006a；Chrencik et al.，2006b)。在比较EphB4-TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)和EphB4-BIDEN-AP时，发明人观察到整个受体环区域的结构的显著偏差。BIDEN-AP结合模式的动力学建模揭示了与在EphB4-EFNB2晶体结构中观察到的非常相似的氢键网络。基于这些计算建模研究，认为Tyr-P3侧链与受体D、E和M链相互作用的丧失可能是功能活性的这种急剧变化的原因。计算模型还支持DE环构象的变化可能参与确定配体的活性和受体的响应(Chrencik et al.，2006b)。这些结果突出了结构修饰可如何影响功能活性，因为将单个氨基酸从L型替换为D型导致转化为具有完全不同的功能性响应的15聚体肽。
拮抗剂肽的N端Tyr-P3可能是高亲和力结合以及有效拮抗特性所需的，而残基例如Leu-P4、Phe-P5和C端残基Ile-P11和Trp-P15可能与EphB4受体的Leu95形成良好的相互作用，并在特异性方面发挥重要作用(Chrencik et al.，2006a)。肽与受体的Leu95的相互作用是对EphB4独特的。EphB受体亚类其他成员中相应的严格保守残基Arg-103会与配体原子形成空间冲突。因此，计算数据与实验结论一致，即BIDEN-AP选择性地与EphB4结合。
先前的工作报道了使用单克隆抗体、可溶性融合蛋白和小分子激酶抑制剂抑制反向EphB4至EFNB2信号传导，从而促进血管生成(Kertesz et al.，2006；Abéngozar et al.，2012；Stephenson et al.，2015；Martiny-Baron et al.，2004)。目前，基于重组可溶性EphB4-人血清白蛋白融合蛋白(sEphB4-HSA)的靶向EphB4-EFNB2蛋白-蛋白相互作用的药物已进入I期临床试验(NCT02495896)(Tognolini et al.，2013；Djokovic et al.，2010)。sEphB4-HAS可抑制VEGF的活性(Scehnet et al.，2009)，并且不激活正向EphB4信号传导。先前的知识表明，在缺乏功能性正向信号传导的情况下，配体独立的机制可能在EphB4高水平表达的肿瘤中诱导肿瘤发生(Mertens-Walker et al.，2015；Herington et al.，2014)。例如，激酶缺陷型EphB4突变体仍然能够提高乳腺癌细胞的生长(Noren和Pasquale，2007)。总的来说，BIDEN-AP及其纳米缀合物CCPM-BIDEN-AP代表了一类新的药剂，其可通过促进肿瘤细胞中配体依赖的正向EphB4信号传导来有效抑制肿瘤生长，并通过抑制肿瘤相关内皮细胞中的反向EFNB2信号传导来降低血管生成(图9)。
总之，这些研究为支持使用BIDEN-AP用于靶向双向EphB4/EFNB2信号传导以降低肿瘤生长、转移和/或克服获得的对抗血管生成治疗的抗性提供了全面的证据。这些结果说明了调节EphB4/EFNB2蛋白的相互作用面(interface)及其相互作用模式的潜力。
实施例6-BIDEN-AP肽在体内的抗肿瘤和抗转移活性
在实验中使用乳腺癌的小鼠模型来测试BIDEN-AP肽(TNd(Y)LFSPNGPIARAW；SEQID NO：1)是否会在体内展示抗癌作用。在原位鼠4T1 TNBC模型中，BIDEN-AP作为单一药剂显著延迟了肿瘤生长(图24A至C)。BIDEN-AP也显著降低了微血管密度(图24D、图24E)。这些结果表明，使用该乳腺癌模型，BIDEN-AP展示了体内高抗肿瘤和抗转移活性。
为了研究BIDEN-AP是否展示出抗转移活性，将4T1细胞静脉内(i.v.)注射到雌性Balb/c小鼠中。以与图24A中相同的剂量和相同的方案给予BIDEN-AP。与未经处理的对照相比，用BIDEN-AP处理显著减少了肺中转移性结节的数量(图25A至B)。因此，BIDEN-AP具有高抗转移性。BIDEN-AP也具有良好的耐受性：在所有这些体内研究中，没有与处理相关的死亡或体重变化的案例。这些结果表明BIDEN-AP在体内导致抗转移和抗癌作用，并且这些数据支持临床施用BIDEN-AP来治疗癌症。
实施例7-材料和方法
细胞系。将细胞维持在37℃下5％CO2、95％空气中。如前所述，将卵巢癌HeyA8和顺铂抗性A2780Cp20细胞维持在含有15％热灭活胎牛血清(FBS)加0.5％庆大霉素的RoswellPark Memorial Institute(RPMI)1640培养基中(Sood et al.，2001；Thaker et al.，2004)。对所有细胞系进行常规测试，以确认不存在支原体(Gen-Probe检测试剂盒；ThermoFisher Scientific，Carlsbad，CA)，并由MD Anderson癌症中心表征细胞系核心设施(MDAnderson Cancer Center Characterized Cell Line Core Facility)进行验证。所有体外实验均用60％至80％汇合培养物进行。
RF24内皮细胞是Arjan W.Griffioen(Maastricht University Hospital，Maastricht，The Netherlands)的惠赠，并通过短串联重复序列谱分析进行验证(vanBeijnum et al.，2008)。将RF24细胞维持在补充有10％FBS、丙酮酸钠、MEM维生素、L-谷氨酰胺和MEM非必需氨基酸的改良必需培养基(MEM)中。
基于细胞的结合测定。将A2780cp20卵巢癌细胞(1×106个细胞/mL)与EFNB2-Fc(20nM)和0至100μM的浓度范围的BIDEN-AP在25℃下孵育1小时。在洗涤之后，用PE标记的抗Fc抗体探测与细胞结合的EFNB2-Fc，并通过流式细胞术进行分析。BIDEN-AP与A2780cp20细胞的结合通过其替换EFNB2-Fc与肿瘤细胞结合的能力来确定，通过PE荧光信号的降低来测量。在Cellquest荧光细胞仪(BD Bioscience，San Jose，CA)中分析细胞。实验一式两份运行。
对EphB类受体的ELISA结合测定。根据制造商提供的方案进行ELISA测定。简而言之，将生物素化的BIDEN-AP以10μM的浓度固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce，Waltham，MA)上。在洗涤之后，将孔用在结合缓冲液(PBS中0.5％牛血清白蛋白[BSA])中的与Fc融合的Eph胞外结构域蛋白EphB1、EphB2、EphB3、EphB4或EphB6(2.5μg/mL)在室温下孵育1小时。用结合缓冲液再次洗涤板，并使用与碱性磷酸酶偶联的抗Fc抗体(Promega，Madison，WI)检测结合受体，然后添加对硝基苯基磷酸酯作为底物(Pierce)。在405nm处测量信号。减去作为背景的来自无EphB-Fc孔的碱性磷酸酶活性。所有信号均归一化为用EphB4-Fc测量的值。
建模BIDEN-AP-EphB4结合。与EphB4(蛋白质数据库ID：2BBA)结合的肽拮抗剂(TNYL-RAW(SEQ ID NO：12))的晶体结构被导入分子操作环境(Molecular OperatingEnvironment，MOE)2016软件(Chemical Computing Group，Montreal，Canada)中。使用结构准备向导与默认设置以添加缺失的原子和部分电荷。通过使用默认设置使能量最小化。使用MOE的蛋白质构建工具将拮抗剂肽的每个氨基酸的构型从L连续更改为D。使用默认设置将产生的复合物能量最小化。
侵袭测定。膜侵袭培养系统区室(改良的Boyden transwell区室)用于测量本研究中使用的所有细胞系的侵袭潜力。将经BIDEN-AP或TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)处理或未经处理的A2780cp20肿瘤细胞(7.5×104)悬浮在100μL无血清培养基中，并将其添加至预包被有由IV型胶原(Sigma C6745)、人层黏连蛋白(Sigma L6274)、明胶(Sigma G1393)和PBS构成的人限定基质的上部区室中(Landen et al.，2005)。将含有10％FBS的完全培养基(500μL)作为化学引诱剂添加至底部区室。将区室在37℃下在5％CO2中孵育24小时。在孵育之后，用棉签去除上部区室内侧的细胞。在上部区室外侧的细胞(侵袭的细胞)被固定、染色并通过光学显微术计数。对来自五个随机视野的细胞进行计数。
内皮细胞迁移测定。将RF24细胞接种在6孔板(Corning Inc.，Corning，NY)中，在2.5mL补充有10％FBS的改良必需培养基(MEM)中2.5×105个细胞/孔。当细胞达到约90％的汇合时，进行血清饥饿24小时。用无菌移液管尖划伤细胞单层以形成“伤口”。然后去除生长培养基，并用无血清培养基洗涤细胞层三次，以去除脱离的细胞。将单独的MEM培养基(0.5％FBS)(对照)或培养基加浓度为50μM的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)或BIDEN-AP添加至每个预先设计的孔，并孵育细胞。在6小时时，通过显微照片记录划痕的宽度。通过使用ImageJ版本1.51(National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)测量和计算受伤区域的百分比。实验以7个重复进行。数据表示为平均值±SD。
永生化内皮细胞小管形成的测定。基质胶(Becton Dickinson，Bedford，MA)用于评估由基底膜上RF24细胞形成毛细血管样结构的情况。根据制造商的说明，用基质胶(10mg/mL)包被12孔Costar板(Corning，Corning，NY)。将RF24(1.0×104个细胞/孔)接种在基质胶包被的板上，并在37℃下孵育60分钟。添加EFNB2-Fc(2nM)或BIDEN-AP(15μM)，并在37℃下孵育培养物24小时。如前所述(Pecot et al.，2013)，观察并在24小时之后拍摄体外内皮小管形成。每次处理均以100倍放大拍摄5张图像。对每个图像中的节点(node)(定义为当至少三个细胞形成一个单点时)进行计数。通过计数节点的数量来确定小管的形成程度。数据以未经处理的对照孔中管数量的百分比表示。
原位卵巢癌模型。按照美国实验动物护理认证协会(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care)和美国公共卫生服务局关于人护理和使用实验动物的政策(US Public Health Service Policy on Human Care and Use ofLaboratory Animals)制定的指导方针对小鼠进行护理。雌性无胸腺裸鼠(NCr-nu)在4至6周龄时从Harlan实验室(Indianapolis，IN)获得，并保持在无菌条件下。对于所有治疗实验，对各组小鼠(n＝8至10)腹膜内接种A2780cp20-Luc细胞。从肿瘤细胞接种之后第7天开始，每隔一天以每次注射13mg等效药物/kg的剂量用BIDEN-AP或CCPM-BIDEN-AP处理小鼠，共10次给药。未经处理的小鼠用作对照。在第31天，对所有小鼠进行安乐死和尸检，并收获它们的肿瘤。记录肿瘤重量以及肿瘤结节数量和位置。将肿瘤组织固定在福尔马林中用于石蜡包埋，在最佳切割温度下在培养基中冷冻用于制备冷冻载片，或快速冷冻用于制备裂解物。
高级别浆液性卵巢癌(HGSC)的PDX模型。在Texas大学MD Anderson癌症中心的机构审查委员会(Institutional Review Board)(IRB协议PA15-0441)和IACUC批准下，在MDAnderson癌症中心进行治疗的患高浆液性卵巢癌的患者同意进行这项研究。通过在每只小鼠的背部部分处植入一个PDX 3×3×3mm肿瘤立方体(MDA-HGSOC-1高级别浆液性卵巢癌；第9代)，在4至6周龄雌性Balb C无胸腺裸鼠(Harlan Laboratories，Indianapolis，IN)中建立皮下HGSC-PDX模型。通过测径器(caliber)监测肿瘤尺寸，并使用公式V(cm3)＝(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。一旦肿瘤尺寸达到约100mm3(植入之后21天)，将小鼠随机分配到PBS载剂对照组或BIDEN-AP处理组，每组6只小鼠。以300μg/注射(100μL/注射)腹膜内注射PBS或BIDEN-AP，隔天一次，共14次给药。在研究结束时(第49天)，对所有小鼠进行安乐死，然后收集肿瘤，称重，并在最佳切割温度中与液氮混合快速冷冻，然后冷冻切片为5μm切片，用于CD31和Ki67标志物的IHC染色。
生物发光成像。在肿瘤接种之后第7天、第14天、第21天和第28天，小鼠接受了D-萤光素尾静脉注射(4mg/kg)。使用Xenogen IVIS-200成像系统(Perkin Elmer，Shelton，CT)评估由萤光素酶活性评估的肿瘤负荷。使用Living Image V2.11软件和IGOR图像分析软件(V.4.02A；WaveMetrics，Portland，OR)对小鼠中产生的生物发光成像信号进行定量。手动选择目标区域，并以光子数/s/cm2表示信号强度。
统计学分析。一般来说，所有体外实验，包括细胞增殖、生存力、迁移和侵袭，除非另有说明，否则均以一式三份进行。对于所有体内实验，通过单因素方差分析来分析肿瘤重量和转移性结节数量，并且各组之间通过独立样品t检验进行比较。使用SPSS统计学软件(IBM，Armonk，NY)。除非另有说明，否则所有数据均以平均值±标准偏差(SD)呈现。如果p＜0.05，则认为差异是统计学显著的。
材料所有氨基酸衍生物和偶联试剂均购自Novabiochem(San Diego，CA)、Bachem(Torrance，CA)或Chem-Impex International(Wood Dale，IL)。所有其他化学品均购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。除非另有规定，否则使用试剂级溶剂时无需进一步纯化。重组EphB4/Fc嵌合体、藻红蛋白(PE)缀合的大鼠抗人EphB4单克隆抗体和兔抗EphB4抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。BIACore传感器芯片CM5、胺偶联试剂盒、HBSEP运行缓冲液(0.01M[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸][HEPES]pH 7.4、0.15M NaCl、3mM乙二胺四乙酸[EDTA]和0.005％[v/v]表面活性剂P20溶液)和再生缓冲液购自BIACore，Inc.(Piscataway，NJ)。人EphB4以及鼠EphB4、EphB1、EphB2、EphB3和EphB6购自R&DSystems(Minneapolis，MN)。藻红蛋白标记的抗Fc抗体和EFNB2-Fc获自Sino Biological(Beijing，China)。
肽合成。在自动肽合成仪Prelude(PTI，Tucson，AZ)上使用Rink树脂(Novabiochem)进行固相合成。将树脂(0.05至0.1g)用5×1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷(CH2Cl2)溶胀和洗涤。用3×1.5mL的20％哌啶/DMF去除芴基甲氧基羰基(Fmoc)基团，每次5分钟。对于偶联，使用在3mL的DMF/CH2Cl2中的三倍过量的Fmoc-氨基酸、二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑。这个过程重复了一次。在偶联和脱保护步骤之后，用3×3mL的DMF/CH2Cl2洗涤树脂。在完成肽链延伸之后，用3×3mL的CH2Cl2洗涤树脂，并用三氟乙酸∶三异丙基硅烷∶H2O(95∶2.5∶2.5)每次处理15分钟。将合并的滤液在室温下放置1至2小时，并在真空中减少体积。将肽在冰冷的乙醚中沉淀，通过离心收集，用乙醚洗涤两次，并进行离心。在干燥之后，通过反相高效液相色谱(HPLC)在Aglient 1200系统(C-18，Vydac，10×250mm，10μm；Santa Clara，CA)上纯化肽。Alexa647偶联的TNYL-RAW(SEQ ID NO：12)或BIDEN-AP通过相应肽与Alexa647-N-羟基琥珀酸酯(Alexa647-NHS)的溶液相反应然后进行HPLC纯化而获得。
CCPM-BIDEN-AP缀合。根据报道的程序(Koolpe et al.，2005)合成了具有胺官能化表面的CCPM。为了向CCPM中引入马来酰亚胺基团，将DMF中的N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)(GMBS)的等分试样(22.5mL，7mmol/mL，0.16mmol)添加至1.2mL的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS，pH 8)中的CCPM(250mL，2.6nmol纳米颗粒)。在37℃下搅拌混合物3小时。使用PD-10柱纯化产物，以去除未反应的GMBS。为了将巯基基团引入BIDEN-AP，将氨基酸半胱氨酸与BIDEN-AP的N端胺缀合。将所得含巯基的Cys-BIDEN-AP与CCPM-马来酰亚胺(0.16mmol当量马来酰亚胺)在PBS中的2mL溶液混合，Cys-BIDEN-AP与马来酰亚胺基团(CCPM)的摩尔比为2∶1。将溶液在4℃下搅拌12小时，然后使用配备G200柱和紫外光检测器(254nm)的快速蛋白质液相色谱系统(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行纯化。用PBS洗脱柱以去除未反应的Cys-BIDEN-AP。未反应的Cys-BIDEN-AP在配备VydacC18柱的Aglient 1100系列LC/MSD-TOF仪器上进行定量。BIDEN-AP与CCPM的摩尔比根据消耗的Cys-BIDEN-AP(总Cys-BIDEN-AP减去剩余Cys-BIDEN-AP)计算得出。通过透射电子显微术(TEM)确定了CCPM-BIDEN-AP的尺寸。简而言之，将一滴水性样品溶液放置在包被有0.5％聚(乙烯醇缩甲醛)水性溶液(w/w)的400目铜网格上。加入一滴1％乙酸铀酰(uranylacetate)溶液用于阴性染色。将样品风干并在80kV加速电压下用JEM 1010透射电子显微镜(JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)检查。使用AMT成像系统(Advanced Microscopy TechniquesCorp.，Danvers，MA)获得数码图像。
表面等离子体共振(SPR)结合和竞争测定。使用10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)将PBS中的EphB4储备溶液(100μg/mL)稀释至25μg/mL，并根据制造商提供的程序(BIACore)使用胺偶联反应将其固定化至CM5传感器芯片。简而言之，通过将芯片暴露于200mM N-乙基-N’-二甲基氨基丙基碳二亚胺和50mM N-羟基琥珀酰亚胺的混合物中7分钟来激活流动池(FC)-1和FC-2中芯片的表面。将FC-1用作参考表面，并通过在pH 8.5下注射1M乙醇胺7分钟直接失活。对FC-2注射25μg/mL人或鼠EphB4，然后注射1M乙醇胺以封闭表面上剩余的活化酯基。允许芯片在HBSEP运行缓冲液中稳定化至少2小时，然后注射测试分析物。
在25℃下在HBSEP运行缓冲液中一式两份进行结合测定。肽在HBSEP缓冲液中稀释测试，过滤、脱气，并以1.6nM至800nM的连续加倍浓度，以30μL/分钟的流量注射。将测试肽注射入HBSEP缓冲液的时间为7分钟，随后为3分钟的解离期。在每个结合周期之后，使用10mM甘氨酸(pH 2.2)的30秒脉冲使芯片再生。每个周期包括2分钟的等待期以允许监测基线结合稳定性。进行双重参考程序以减去由缓冲液成分变化或非特异性结合引起的体积效应。因此，将所有被分析的样品(包括运行缓冲液的样品)另外注射到未包被的参考表面上。通过使用具有1∶1Langmuir结合模型的BIACore评价软件拟合结合色谱图数据来计算结合速率(Kon)和解离速率(Koff)。结合常数KD计算为Koff/Kon。单独的缓冲液和EFNB2分别用作阴性和阳性对照。
BIDEN-AP抑制EFNB2与EphB4结合的能力在竞争结合测定中进行评估。将EFNB2-Fc在PBS中的储备溶液(100μg/mL)用10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)稀释至25μg/mL，并如已经描述的固定到CM5传感器芯片上。将BIDEN-AP的连续稀释液(范围为2至1000nM)与人EphB4(30nM)混合，并注射到EFNB2-Fc包被的CM5芯片上。每次注射之后，减去来自控制流量池的信号，并将与EFNB2-Fc结合的EphB4的相对量记录为注射前基线水平上的净响应。进行双重参考程序以减去由缓冲液成分变化或非特异性结合引起的体积效应。
免疫印迹、免疫沉淀和免疫共沉淀。对于免疫印迹，使用改良的放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.4]、150mM NaCl、1％Triton、0.5％脱氧胆酸盐)加25μg/mL亮抑酶肽、10μg/mL抑肽酶、2mM EDTA和1mM原钒酸钠来制备来自经培养细胞的裂解物。为了制备来自小鼠的快速冷冻组织的裂解物，用组织匀浆器破坏约30mm3的组织切片，并在改良RIPA缓冲液中以13,000rpm进行离心30分钟。通过使用BCA蛋白质测定试剂盒(PierceBiotechnology，Rockford，IL)确定蛋白质浓度。裂解物通过8％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行上样和分离。通过半干电泳(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)将蛋白质转移到硝化纤维素膜上过夜，用3％BSA封闭1小时，然后在4℃下用一抗孵育过夜。在用tris缓冲盐水和吐温20(TBST)溶液的混合物洗涤之后，将膜用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的马抗小鼠IgG(1∶2000，GE Healthcare，Amersham Place，UK)孵育2小时。通过增强的化学发光检测试剂盒(Pierce)使HRP可视化。为了确认相等的样品上样量，用β-肌动蛋白特异性抗体(0.1μg/mL；Sigma-Aldrich)探测印迹。使用ImageJ软件进行密度测定法。对于免疫沉淀和免疫共沉淀，使细胞在非变性NP40细胞裂解缓冲液(CellSignaling Technology，Boston，MA)中经受裂解。将提取物与A/G缀合的抗体在4℃下孵育2小时，并且对于免疫沉淀，将珠用RIPA缓冲液洗涤两次，一次使用0.1m Tris(pH 8.0)中的0.5m LiCl，一次使用PBS。将反应在样品缓冲液中煮沸，然后对蛋白质进行10％SDS-PAGE和免疫印迹。
免疫荧光成像。A2780cp20卵巢癌细胞(5×105个细胞/孔)被接种在4孔区室载片中，并用Alexa647标记的BIDEN-AP(50μM)处理1小时或2小时。将细胞用1×PBS洗涤三次，并在新鲜制备的在PHEMO缓冲液(0.068M PIPES、0.025M HEPES、0.015M EGTA、0.003M MgCl2和10％v/v二甲基亚砜[DMSO])中含有3.7％甲醛、0.05％戊二醛和0.4％Triton-X-100的固定剂中在室温下固定10分钟。LysoTracker Green(目录号L7526；Invitrogen，Carlsbad，CA)用作溶酶体的标志物。将细胞核在室温下用Hoechst 33342(300nM)染色10分钟，然后在Gel Mount封固培养基(Vector Laboratories，Burlingame，CA)进行封固。使用ZeissLSM510Meta激光扫描共聚焦系统(Zeiss，Dublin，CA)对经固定和免疫荧光染色的细胞进行成像，该系统配置为具有CFI Plan Apo Lambda 20×物镜的Zeiss Axioplan 2正置显微镜。图像获取自三个独立的生物学重复。
对5μm厚的新鲜冷冻组织样品进行CD31的免疫荧光分析。在用丙酮、丙酮-氯仿(1∶1)和丙酮解阻断5分钟之后，用PBS中的4％鱼明胶(Biotium Inc，Hayward，CA)阻断非特异性结合30分钟。将一抗兔多克隆抗小鼠CD31(ab28364；Abcam，Cambridge，MA)以在4％鱼明胶中1∶500稀释度(100至200μL)施加于每个载片，并在4℃下孵育该载片过夜。在洗涤之后，将载片与Alexa488缀合的山羊抗兔二抗孵育60分钟。在通过将载片浸入PBS中的4％甲醛中15分钟进行CD31染色之后，通过使用DeadEnd荧光TUNEL系统测定试剂盒(Promega)对载片进行重组末端脱氧核苷酸转移酶(rTdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)。将20μg/mL蛋白酶K溶液(Promega)添加至每个载片(100μL/载片)，并将载片在室温下孵育8至10分钟。用PBS洗涤载片两次，向每个载片添加100μL平衡缓冲液(Promega)，然后再次孵育载片5至10分钟。然后通过添加50μL的荧光素-12-dUTP作为底物来标记载片，并添加rTdT。用塑料盖玻片覆盖每张载片，以确保标记溶液的均匀分布，并在37℃下在增湿区室内孵育60分钟。通过将载片浸入2×SSC溶液(87.7g NaCl、44.1g柠檬酸钠，pH 7.0，在500mL中)中15分钟来中止反应。在用PBS洗涤之后，用Hoechst(Sigma-Aldrich)对载片进行复染15秒。为了获得组织切片的免疫荧光图像，将载片封固并在Zeiss Axiovert Z.1荧光显微镜(Zeiss，Jena，Germany)下观察。微血管密度通过计算在×200放大倍数下从三个肿瘤样品中的每个随机选择的十个肿瘤区域中CD31阳性微血管的平均数量来评价。凋亡指数计算为在×200放大倍数下从三个肿瘤样品随机选择的十个区域中TUNEL阳性细胞/细胞总数。
同样，对来自所得PDX肿瘤的样品进行免疫荧光染色。对于EphB4染色，使用兔抗人EphB4多克隆抗体(Abcam，Cambridge，MA)作为一抗，和Alexa Fluor 594缀合的山羊抗兔免疫球蛋白(Abcam)作为二抗对载片进行探测。对于CD31染色，用大鼠抗小鼠CD31抗体(Clone390，Biolegend，San Diego，CA)和Alexa Fluor 488缀合的驴抗大鼠抗体(Abcam)对载片进行染色。Ki67用兔抗Ki67抗体(Clone SP6，Cell Marque，Rocklin，CA)和Alexa Fluor 594缀合的山羊抗兔抗体(Abcam)染色。用DAPI对细胞核进行复染。
免疫组织化学(IHC)分析。对于Ki67的IHC分析，对经福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤切片进行脱蜡和再水化。在抗原回收之后，将载片用PBS中10％山羊血清封闭，并在4℃下用一抗抗Ki67(1∶400稀释度；Abcam)孵育过夜。将载片洗涤并用生物素化山羊抗兔IgG(1∶200；Vector Laboratories)和链霉亲和素缀合的HRP(DAKO，Carpinteria，CA)孵育30分钟。通过暴露于3，3’-二氨基联苯胺检测到阳性反应。载片用苏木精复染并在显微镜下可视化。在至少10个随机选择的20×观察视野中对阳性染色的细胞核进行计数。
反相蛋白质阵列的整合途径分析。使来自每组的尺寸相当的三个单独肿瘤经受蛋白质裂解物的制备。简而言之，将小片肿瘤组织放入冰上的5ml管中，并添加冰冷裂解缓冲液(1％Triton X-100、50mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、100mMNaF、10mM焦磷酸钠、1mM Na3VO4、10％甘油，其含有新鲜添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)。裂解缓冲液的体积计算为40mg肿瘤/mL。用手动匀浆器将组织匀浆8秒，然后转移至微离心管，并在4℃、14,000rpm下离心10分钟。收集上清液并稀释至1.5μg/μL的蛋白质浓度。将细胞裂解物与4×SDS混合并呈递用于RPPA测定。RPPA在MD Anderson的工艺核心设施(ProcessCore Facility)处进行。简而言之，将这些裂解物排列在硝酸纤维素包被的FAST载片(Whatman，Inc.，Sanford，ME)上。然后对载片进行扫描和分析，以定量测量点密度，为每种情况生成拟合曲线。拟合曲线用log2-蛋白质浓度相对于点密度绘制。处理组中呈现的数据反映了与基线(即未经处理的对照组)相比的倍数变化，并通过Ingenuity PathwayAnalysis(IPA，Qiagen)进行分析。通过将每个线性值＞1.0除以每种受试抗体的平均对照线性值来计算阳性倍数变化，同时也计算阴性倍数变化(对于线性值＜1.0)(通过使用以下公式：[-1/线性倍数变化])。在热图中绘制了来自每种条件下三个单独复制品的表达倍数变化的中位数。使用右尾Fisher精确检验计算与IPA分析中的途径相关的p值。
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根据本公开内容，本文中公开和要求保护的所有方法均可在不进行过度实验的情况下做出和执行。虽然已根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下对本文中所述方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，将明显的是，在化学和生理学两方面均相关的某些试剂可替代本文中所述的试剂而将实现相同或类似的结果。对本领域技术人员来说明显的是所有这样的类似替代和改变被认为是在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
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<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成肽
<400> 15
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<220>
<223> 合成肽
<400> 16
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 17
Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp
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<220>
<223> 合成肽
<400> 18
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<220>
<223> 合成肽
<400> 19
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<220>
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<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
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<400> 22
Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> D-氨基酸
<400> 23
Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> D-氨基酸
<400> 24
Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp
1 5 10 15
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> D-氨基酸
<400> 25
Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp
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<210> 26
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> D-氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> D-氨基酸
<400> 26
Thr Asn Tyr Leu Phe Ser Pro Asn Gly Pro Ile Ala Arg Ala Trp
1 5 10 15

Claims (53)

1.非天然肽，其包含序列TNd(Y)LFSPNGPIARAW(SEQ ID NO：1)或者相对于SEQ ID NO：1具有1、2、3或4个氨基酸替换并在SEQ ID NO：1的第3位处保留D-氨基酸的序列或序列。
2.权利要求1所述的肽，其中所述肽包含在胶束、纳米颗粒或脂质体中。
3.权利要求2所述的肽，其中所述胶束是核交联聚合物胶束(CCPM)。
4.权利要求2至3中任一项所述的肽，其中所述肽包含在所述胶束、纳米颗粒、脂质体或优选CCPM中或者与所述胶束、纳米颗粒、脂质体或优选CCPM共价结合。
5.权利要求4所述的肽，其中所述肽通过马来酰亚胺键共价结合或通过使所述胶束、纳米颗粒或脂质体和所述肽与N-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)-琥珀酰亚胺酯)(GMBS)反应而共价结合。
6.权利要求2至5中任一项所述的肽，其中所述胶束、纳米颗粒或脂质体具有约15nm至约300nm的直径。
7.权利要求6所述的肽，其中所述胶束、纳米颗粒或脂质体具有约20nm至约70nm的直径。
8.权利要求2至7中任一项所述的肽，其中所述胶束、纳米颗粒或脂质体包含聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇单甲醚(mPEG)、甲氧基-聚(乙二醇)-嵌段-聚(D，L-丙交酯)、聚(乙二醇)-嵌段-聚(天冬氨酸)、聚(乙二醇)-b-聚(甲基丙烯酸)、胺封端的两亲性嵌段共聚物、聚(PEG-甲基丙烯酸酯)-b-聚(三乙氧基甲硅烷基丙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙二醇)-嵌段-聚(谷氨酸)。
9.权利要求2至8中任一项所述的肽，其中所述胶束、纳米颗粒或脂质体还包含化学治疗剂、抗血管生成剂或免疫治疗。
10.权利要求2至8中任一项所述的肽，其中所述胶束、纳米颗粒或脂质体包含成像剂。
11.权利要求10所述的肽，其中所述成像剂是荧光团或放射性同位素。
12.权利要求11所述的肽，其中所述胶束是核交联聚合物胶束(CCPM)并且其中所述胶束用荧光团标记，所述荧光团优选近红外荧光团。
13.权利要求11所述的肽，其中所述胶束是核交联聚合物胶束(CCPM)并且其中所述胶束用荧光团和放射性同位素二者标记，所述荧光团优选近红外荧光团，所述放射性同位素优选111In、99mTc、64Cu或89Zr。
14.权利要求1所述的肽，其中所述肽与细胞毒性部分或药物部分缀合或共价连接。
15.权利要求14所述的肽，其中所述细胞毒性部分是化学治疗剂或细胞毒性多肽。
16.权利要求15所述的肽，其中所述细胞毒性部分是美登素、澳瑞他汀、紫杉烷、加利车霉素、CC-1065类似物、倍癌霉素、蛋白质毒素(例如假单胞菌外毒素或白喉毒素)或鹅膏毒素。
17.权利要求1所述的肽，其中所述肽与放射性核素缀合。
18.权利要求17所述的肽，其中所述肽不与螯合剂共价连接。
19.权利要求17所述的肽，其中所述肽与放射性金属螯合剂共价连接。
20.权利要求19所述的肽，其中所述放射性金属螯合剂是1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)、二亚乙基三胺五乙酸酸酐(DTPA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)、经膦酸基团(NOTP)或次膦酸基团(TRAP)取代的1，4，7-三氮杂环壬烷大环、双(2-羟基苄基)乙二胺二乙酸(HBED)、4，11-双(羧甲基)-1，4，8，11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷(CB-TE2A)或去铁敏-B(DFO)。
21.权利要求17至20中任一项所述的肽，其中所述放射性核素是90Y、86Y、111In、67Ga、68Ga、89Zr、64Cu、67Cu、177Lu、188Re、186Re、153Sm、89Sr、186Er、475c、223Ra、166Ho、161Tb、149Tb、212Pb/212Bi、225Ac、213Bi、211At、117mSn、123I、131I或18F。
22.权利要求14至16中任一项所述的肽，其中接头将所述肽与细胞毒性载荷分开。
23.权利要求22所述的肽，其中所述接头是可切割接头。
24.权利要求1所述的肽，其中所述肽与细胞靶向部分缀合或共价连接。
25.权利要求24所述的肽，其中所述细胞靶向部分包含抗体、scfv或靶向配体或者由抗体、scfv或靶向配体组成。
26.权利要求1所述的肽，其中所述肽与成像剂缀合或共价连接。
27.权利要求26所述的肽，其中所述成像剂是荧光染料、荧光蛋白或酶缀合物。
28.权利要求14至24中任一项所述的肽，其中所述肽与接头缀合或共价连接。
29.权利要求28所述的肽，其中所述接头是可切割接头。
30.权利要求1至29中任一项所述的肽，其中所述肽与药物载荷缀合。
31.权利要求30所述的肽，其中所述药物载荷是澳瑞他汀、美登素、tubulysin、加利车霉素、倍癌霉素、苯二氮
Figure FDA0003459985350000031
喜树碱类似物、多柔比星、非临床阶段细胞毒性载荷或其组合。
32.权利要求1至31中任一项所述的肽，其中所述肽包含在肽同二聚体、肽同三聚体、肽同四聚体或肽多聚体中。
33.权利要求1至31中任一项所述的肽，其中所述肽包含在肽异二聚体、肽异三聚体、肽异四聚体或肽多聚体中。
34.权利要求1至33中任一项所述的肽，其中所述肽包含在药物组合物中。
35.权利要求35所述的肽，其中所述药物组合物被配制用于注射、肠胃外施用、皮下注射、静脉内施用或腹膜内注射。
36.在哺乳动物对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗相关量的权利要求1至35中任一项所述的肽。
37.权利要求36所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、胰腺癌、头颈癌、转移癌、食管癌或肺癌。
38.权利要求36至37中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
39.权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述肽包含在药物组合物中。
40.权利要求39所述的方法，其中静脉内、肠胃外、瘤内、动脉内或腹膜内施用所述药物组合物。
41.权利要求36至40中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述对象施用第二抗癌治疗。
42.权利要求41所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是化学治疗、免疫治疗、抗血管生成治疗、放射治疗或手术。
43.权利要求41所述的方法，其中所述第二抗癌治疗是抗VEGF治疗、检查点抑制剂或抗血管生成剂。
44.用于在哺乳动物对象中治疗癌症的权利要求1至30中任一项所述的肽。
45.权利要求44所述的肽，其中所述哺乳动物对象是人。
46.权利要求44至45中任一项所述的肽，其中所述癌症是卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、白血病、胰腺癌、头颈癌、转移癌、食管癌或肺癌。
47.用于在哺乳动物对象中治疗心脏病的权利要求1至30中任一项所述的肽。
48.用于在哺乳动物对象中治疗骨病的权利要求1至30中任一项所述的肽。
49.在哺乳动物对象中治疗心脏病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗相关量的权利要求1至35中任一项所述的肽。
50.权利要求49所述的方法，其中所述心脏病是缺血性心脏病。
51.权利要求49至50中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
52.在哺乳动物对象中治疗骨病或者促进骨愈合或骨重塑的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗相关量的权利要求1至35中任一项所述的肽。
53.权利要求52所述的方法，其中所述对象是人。
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