JP2007529194A - 対象物質の細胞および/または細胞核中への侵入を促進するアミノ酸配列 - Google Patents
対象物質の細胞および/または細胞核中への侵入を促進するアミノ酸配列 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有しする:(X1)p[(X)o(B)nX B X X B]m(X2)q(I)。ここで、X1およびX2は、1〜20個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、pおよびqは、0〜5の自然数であり、Bは塩基性アミノ酸であり、Xは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、nは2または3であり、mは1〜4であり、oは0または1である。0と5との間;Bは塩基性アミノ酸であり、Xは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、nは2または3であり、mは1〜4であり、oは0または1である。
【選択図】図1
Description
(X1)p[(X)o(B)nX B X X B]m(X2)q(I)
ここで、
X1およびX2は、1〜20個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、
pおよびqは、0〜5の自然数であり、
Bは塩基性アミノ酸であり、
Xは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、
nは2または3であり、
mは1〜4であり、
oは0または1である。
・oは1、かつ/または、
・pまたはqは0、かつ/または、
・X1またはX2は2〜5個のアミノ酸の配列であり、かつ/または、
・nは2または3であり、かつ/または、
mは2である。
X B B X B X X B X B B X B X X B(II)
(X1)p X B B B X B X X B X B B B X B X X B(III)
ここで、X1、X、Bおよびpは、上記と同一の意味を持つ、
DPV15:Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg(SEQ ID NO.1)
DPV15b:Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg(SEQ ID NO.2)である。
DPV3:NH2−R K K R R R E S R K K R R R E S−COOH
DPV3/10:NH2−R K K R R R E S R R A R R S P R H L−COOH
DPV6:NH2−G R P R E S G K K R K R K R L K P−COOH
DPV7:NH2−G K R K K K G K L G K K R D P−COOH
DPV7bNH2−G K R K K K G K L G K K R P R S R−COOH
DPV10:NH2−S R R A R R S P R H L G S G−COOH
DPV10/6:NH2−S R R A R R S P R E S G K K R K R K R−COOH
それぞれ、SEQ IDはNo4、5、6、8、9、3、7である。
2)マウスベクターに比べ、DNAとの反応性が非常に弱い;
3)侵入能力は、細胞内に輸送しようとする分子により、有意に影響されない;
4)ヒト由来細胞は、他の由来細胞に比べて容易に侵入する。
a)上記で述べた本発明によるアミノ酸配列、ベクター、または運搬体へ物質を結合させる工程、及び
b)上記細胞の能動代謝を可能にする培養温度において、上記結合産物と細胞をインキュベーションする工程。
1.1)リガンドの性質
中規模サイズのタンパク質(40000Da)のインターナリゼーションを行うため、DPV15およびDPV15bの能力を表すのにペルオキシダーゼを選択した。事前活性化された形態のタンパク質を用いることにより、同一共役(PO分子あたり1DPVのみ)の作製が可能となる。HCT116(結腸直腸癌)細胞系およびHeLa(頸腺癌)細胞系双方において、DPV−POコンジュゲートの侵入を試験した。
ペルオキシダーゼコンジュゲートの作製を容易にするため、EZリンクマレイミドホースラディシュペルオキシダーゼ(PO)(M.W=40.000)を用いる。これは、事前活性化されかつ安定したPO誘導体であり、スルフヒドリル(−SH)基と反応する。この生成物を用いて、遊離SH基を含む任意のリガンドとPOとの共役を行うことができる。
DPV15:対象物質との結合のためにC末端にシステイン残基が設けられた、Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ IDNO.1)
500μgのDIATOSペプチドを、50μlの共役緩衝液に溶解させる(NaCl0.5M、リン酸ナトリウム50mM、EDTA5mM、pH7)。
43μlのDIATOSペプチドを、1mg(200μl)のマレイミド活性化ペルオキシダーゼ(モル比:5pept/PO−マレイミド)に付加する。
混合し、室温で3時間培養する。
1mlの0.5MのNaClを追加する。
ビバスピンでDPV−POを濃縮する。遠心分離を10〜15分間、3300g、20℃で行う。
2mlの0.15MのNaClをビバスピンに再注入し、コンジュゲートを再度濃縮する。
この最終工程をもう一度繰り返す。
システインにリンクされたPOからなる制御が行われた。
DPV−POコンジュゲートを凍結させておき(−20℃)、0.15MのNaCl中で希釈する。
a)SDS−PAGE
15μgの各サンプルを、10%アクリルアミドSDS−PAGEゲル上に載せる。
移動(100Vで1時間)。
このゲルを、ブリリアントブルークマシー溶液で1時間染色する。
H2O/エタノール/酢酸中で1時間脱染(6V/3V/1V)。
DPV−POサンプルの1/160000の希釈後、希釈。
96ウェルのElisaプレートのウェル中に50μlの溶液を入れる。
PO基板(OPD)を追加。
9分後、50μlのH2SO4 2Nを追加することによって反応を停止させる。
490nmにおけるO.D.を読み取り、遊離POについて得られたものと比較する。
HCT116培地:Me Coy’s 5a(Gibco BRL)+1.5mM L−グルタミン+10%SVF
HeLa培地:DMEM(GibcoBRL)+2mML−グルタミン+1mMNa ピルビン酸塩+10%SVF
0日目において、8ウェルLabtekスライドガラス(0.7cm2/ウェル)中に、定期的に以下を供給した:すなわち、HeLa細胞の場合3.6.104細胞/cm2を、または、HCT116細胞の場合7.104細胞/cm2を供給した。侵入調査を1日目に行った。
DMEM+10%FCS中のコンジュゲートを75μg/ml中で希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、37℃で4時間、5%CO2−100μl/ウェル(すなわち、7.5μg/ウェル)で培養する。
細胞をPBS中で3回洗浄する。
細胞を100μlのトリプシン−EDTA中で37℃で30分間培養する。
150μlの完全培地中で細胞を再度懸濁する。
細胞をカウントする。
細胞を遠心分離機にかけ、良く冷えたPBS中で2回洗浄する。
220μlの冷却溶解物バッファ(0.1Mのトリス(pH8)、0.5%のNP40)中で再度懸濁する。
4℃で15分間培養する。
細胞溶解物を遠心分離機にかける。
96ウェルプレート中において、1つのウェルに100μlずつ分配する。
溶解バッファ(10ng/mlから。PBS中で希釈。10ポイント)におけるペルオキシダーゼ標準曲線を作成する。試験後の溶液をカウントし、インターナリゼーション%を計算する。
可溶性ペルオキシダーゼ基板(5mgのOPD(シグマ)の1個の丸薬+10mlのクエン酸塩−クエン酸バッファ(0.1M)、pH5.5+100μlの3%H202)を追加する。
9分後、50μlのH2SO4 2Nを追加することにより、反応を停止させる。
490nmにおいて吸光度を読み取る。
適切な濃度のDMEM+10%SVF中でコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを適切な条件下で培養する。
細胞をPBS中で3回洗浄する。
室温(RT)において、3.7%PFA中で20分間固定する。
室温(RT)において、PBS中で洗浄する。
適切な抗体で免疫染色を行い、第2は蛍光色素と共役される。
Dapiの存在下のもとでマウントする。
2.1)定量的な細胞内蓄積
図3は、DPV−POコンジュゲートのHCT116細胞への定量的侵入を示す。濃度75μg/ml(およそ1.8μMに対応する)の初期DPV−POコンジュゲートにおいて4時間培養後、細胞溶解を行った。結果を、3つの独立した実験(これらは全て正副2個実現した)において平均値として得る。
ガラスLabtekスライド上で培養されたHeLa細胞で、DPV−POコンジュゲートを培養した(DMEM+10%FCSの75μg/ml溶液で37℃で4時間の培養)。この実験は、上述した定量的実験において用いられたペプチド−POコンジュゲートと同一のもので、全く同一条件において実現した。
DPV−POコンジュゲートのインターナリゼーションに関する全ての予備実験は、初期コンジュゲート濃度75μg/mlで実現されてきた。インターナリゼーションメカニズムが飽和し得るか否かを確認するために、コンジュゲート細胞内蓄積レベルに対する初期コンジュゲート濃度の影響について調査した。
DPV−POコンジュゲートのインターナリゼーションがエネルギー依存現象であるか否かを判定するため、37℃または4℃のいずれかで定量的実験を行った。
図9は、DPV−POコンジュゲートのインターナリゼーションレベルに対する温度の影響を示す。ガラスLabtekスライド上で24時間培養されたHeLa細胞を、初期濃度25μg/mlで、DPV−POコンジュゲートの存在下で4時間37℃または4℃のいずれかで培養した。トリプシンでの広範囲処理によって表面結合材料の除去およびその後の細胞溶解を行った後、インターナリゼーションされたPOを定量化した。結果は、細胞1000個あたりのPOをピコグラムで表した。
DPVは、ヒトヘパリン結合タンパク質から由来し、結果的に対外でヘパリンに結合する。体内でのGAG結合工程の必要性を確認するため、CHO−K1細胞およびPgsA−745細胞双方においてインターナリゼーション実験を行った。これは、キシロシルトランスフェラーゼを欠失したCHOのクローンであるため、検出可能レベルのプロテオグリカンは生成されなかった(Eskoら、1985;RostandおよびEsko、1997)。
コンジュゲートのインターナリゼーションのための必要条件としてのDPVのGAGへの結合を確認するため、培養媒地中のヘパリンの存在下で、インターナリゼーション実験を実現した。ヘパリンはDPVに結合すべきであり、細胞表面への自身の結合およびその後のインターナリゼーションを回避すべきである。
グリコスアミノグリカン合成における欠陥を示す細胞中のDPV−POインターナリゼーションの抑制(CHO−K1細胞と比較したPgsA−745細胞)と、細胞培地におけるヘパリン存在下のDPVコンジュゲートのインターナリゼーション抑制とは、細胞結合型ヘパラン−硫酸塩プロテオグリカンが、細胞外DPVインターナリゼーションのための細胞表面結合部位として機能することを示す。
1)材料および方法
1.1)リガンドの性質
分子量の非常に高いタンパク質(150000Da)をインターナリゼーションするためのDPV15およびDPV15bの能力を示すために、抗ペルオキシダーゼ免疫グロブリン(抗PO−IgG)を選択した。
−架橋剤:サクシニミジル4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボン酸塩(SMCC、Pierce)
−ペプチドベクター:DPV15、DPV15b
−ビバスピン(ビバサイエンス):IgGの濃縮および精製および過剰試薬の除去のための限外ろ過細胞膜(カットオフ閾値=10000または30000ダルトン)
−溶液およびバッファ:
・リン酸塩0.1M(pH7.4)(リン酸カリウム)
・ジメチルホルムアミド(DMF)
・共役緩衝液:0.5MのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのEDTA(この3つのpHは7)
・NaCl:0.15M
・NaCl:0.5M
架橋剤(SMCC、Pierce)によるIgG活性化
活性化されたIgGのビバスピン上での濾過
DIATOSペプチドとの共役
遊離ペプチドの除去
・1mLのリン酸塩バッファ(0.1M、pH:7.4)中に、2mgのIgGを溶解させる。
・200μgのSMCCを、20μLのジメチルホルムアミド(DMF)中に溶解させる。
・11.1μLのSMCCを、IgG溶液(比:25SMCC/IgG)に付加する。
・混合し、室温で30〜40分間培養する。
活性化されたIgG作成物中に1−2mLの共役緩衝液を追加し、ビバスピン中での遠心分離に3300g、20℃で10〜15分かける。
・2mLの共役緩衝液を追加する。
・再度遠心分離を行い、この工程を2回繰り返す。
・60μLの共役緩衝液中に、600μgのDIATOSペプチドを溶解させる。
・54.5μLのDIATOSペプチドをIgG−SMCCに付加する(比:12pept/IgG−SMCC)。
・混合し、3時間培養する。
・1mLの0.5MのNaClを、共役したIgG作製物中に付加する。
・ビバスピン中で、IgG−SMCC−ペプチドを濃縮する。3300gおよび20℃で、遠心分離に10〜15分間かける。
・2mLの0.15MのNaClを追加し、コンジュゲートを再度濃縮する。
・この最終工程をもう一度繰り返す。
システインにリンクされた抗PO IgGからなる制御が行われた。
DPV−抗PO IgGは、0.15MのNaClで希釈された100μlの凍結アリコート中で保持される。
a)SDS−PAGE.
12μgの各サンプルを、10%アクリルアミドSDS−PAGEゲル上に載せる。
移住(100Vで1時間)。
このゲルを、ブリリアントブルークマシー溶液で1時間染色する。
H2O/エタノール/酢酸中で1時間脱染(6V/3V/1V)。
レーン2:抗PO IgG
レーン3:DPV15−抗PO IgGコンジュゲート
レーン4:DPV15b−抗PO IgGコンジュゲート
DPV−抗POコンジュゲートおよび制御(遊離抗PO IgGおよびCys−抗PO IgG)を、5μg/mlのヘパリンで事前コーティングされたELISAプレート上に担わせる(これにより、共役化合物のみが結合し、POと反応する)。
プレート上でコンジュゲートを37℃で1時間培養し、PBS−Tween中で3回洗浄する。
各ウェル中でPOを1μg/mlで37℃で1時間培養し、その後、0.1%Tweenを含むPBS中で5回洗浄する。
その後、PO基板を追加する(5mgOPD(シグマ)の1個の丸薬+10mlのクエン酸塩−クエン酸バッファ、0.1M、pH5.5+100μlH2023%)。
5分後、50μlのH2042Nによって、反応を停止させる。
490nmにおいてODを読みとる。
インターナリゼーション実験を、HCT116(結腸直腸癌)細胞系およびHeLa(子宮頸部腺癌)細胞系双方において実現した。細胞内蓄積を、単一時点において評価した(4時間)。
0日目において、細胞を定期的に供給した:すなわち、2ウェルLabtekスライドガラス(4cm2/ウェル)において、HeLa細胞の場合3.6.104細胞/cm2、またはHCT116細胞の場合7.104細胞/cm2を供給した。侵入調査を1日目に行った。
DMEM+10%SVF中において、コンジュゲートを100μg/mlで希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、37℃で4時間、5%CO2−100μl/ウェル(すなわち、40μg/ウェル)で培養する。
細胞をPBS中で3回洗浄する。
細胞を200μlのトリプシン−EDTA中で37℃で30分間培養する。
400μlの完全培地中で細胞を再度懸濁する。
細胞をカウントする。
細胞を遠心分離機にかけ、良く冷えたPBS中で2回洗浄する。
220μlの冷却溶解物バッファ(0.1Mのトリス(pH8)、0.5%のNP40)中で再度懸濁する。
4℃で15分間培養する。
細胞溶解物を遠心分離機にかける。
抗マウスIgG(100μlで2回)で事前コーティングされた96ウェルプレート中に細胞溶解物を分配する。10ng/mlからの抗PO IgGについて、標準曲線を作成する。
PBS−Tween中の細胞溶解物 を希釈し、10ng/mlにおける抗PO IgGについて標準曲線を作成する。
37℃で1時間培養し、4℃で一晩放置する。
PBS−Tween中で3回洗浄する。
ペルオキシダーゼをPBS−Tween中で1μg/ml、37℃で1時間培養する。
PBS−Tween中で3回洗浄する。
ペルオキシダーゼ基板(1丸薬OPD+10mlのクエン酸塩−クエン酸バッファ(0.1M)、pH5.5+100μlの3%H2O2)を追加する。
9分後、50μlのH2SO4 2Nを追加することにより、反応を停止させる。
490nmにおいて吸光度を読み取り、標準曲線の値と比較する。
・PO−ペルオキシダーゼ基板の染色
0日目において、8ウェルガラスlabteckスライド(0.7cm2)上に、定期的に以下を供給した。すなわち、HeLa細胞の場合3.6.104細胞/cm2を、またはHCT116細胞の場合7.104細胞/cm2を供給した。侵入調査を1日目に定期的に行った。
完全培地中において100μg/mlでコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
5%CO2−100μl/ウェル(すなわち、10μg/ウェル)で37℃で4時間コンジュゲートを培養する。
細胞をPBS中で3回洗浄する。
冷却エタノール中で−20℃で5分間固定する。
RTにおいてPBS中で洗浄する。
PO(完全培地中で10μg/ml)を室温で1時間追加する。
PBS中で3回洗浄する。
ペルオキシダーゼ基板(ジアミノベンジジン、10mlH20+330plH2023%中の1錠剤)を追加する。
PBS中で3回洗浄する。
写真を撮影する。
0日目において、細胞を定期的に供給した:すなわち、8ウェルLabtekスライドガラス(0.7cm/ウェル)において、HeLa細胞の場合3.6.104細胞/cm2を供給し、またはHCT116細胞の場合7.104細胞s/cmを供給した。侵入調査を1日目に行った。
コンジュゲートを、完全培地において100μg/mlで希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、37℃で4時間、5%CO2−100μl/ウェル(すなわち、10μg/ウェル)で培養する。
細胞をPBS中で3回洗浄する。
冷却メタノール/アセトン(1/1)中でー20℃で5分間固定する。
RTにおいてPBS中で洗浄する。
RTにおいて、PBS+5%ロバ血清(solA)中において30分間ブロックする。
溶液A中においてTRITC−共役抗マウス7μg/mlで、30分間RTで暗所において培養する。
溶液A中で洗浄後、PBS中で洗浄する。
平衡緩衝液中で平衡化させ、DAPIによるSlow Fade Light Antifade Kit中にマウントする(分子プローブS−24636)。
2.1)定量的侵入
図14は、DPV−抗PO IgGコンジュゲートのHCT116細胞中への定量的侵入を示す。濃度100μg/mlの初期DPV−抗PO IgGコンジュゲートにおける4時間の培養後、細胞溶解を行った。結果を、3つの独立した実験(これらは全て正副2個実現した)において平均値として得る。
ガラスLabtekスライド上で成長させたHeLa細胞により、DPV−抗POコンジュゲートを培養した(細胞培地中での100μg/ml溶液の37℃での4時間の培養)。この実験は、上述した定量的実験において用いられたものと同一のペプチド−抗PO IgGコンジュゲートによって実現した。
1)材料および方法
1.1)リガンドの性質
DPV15およびDPV15bの能力を表すためにテトラメチルローダミンを選択し、小分子(500ダルトン)をインターナリゼーションした。
テトラメチルローダミン−5−マレイミド(分子プローブT−6027)
TMR−5−マレイミド5mgをジメチルホルムアミド(DMF)207.7μl中に溶解させる(最終濃度50mM)。
DPV15b30mgまたはDPV1515.4mgをDMF700μl中に溶解させる(最終濃度10mM)。
TMR溶液200μlおよびDPV溶液700μlを混合し、暗所にて室温で2時間培養する。
H2O2mlおよびジクロロメタン(DCM)8mlを追加(Ad)する。
混合し、3000gでの遠心分離に2分間かける。
水相(上相)を取る。
工程4〜6を2回繰り返す。
DPV−TMRコンジュゲートをドライパウダーとしてアルゴン下で−20℃で4時間保持した。
a)定量分析
0日目において、細胞を定期的に供給した:すなわち、2ウェルLabtekスライドガラス(4cm2/ウェル)において、HeLa細胞の場合1.105細胞/cm2を、HCT116細胞の場合2.105細胞s/cm2を供給した。侵入調査を1日目に行った。
完全培地(+10%SVF)中で、20μMでコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、37℃で2時間、5%CO2−600μl/ウェルで培養する。
完全培地中で2回、PBS中で2回洗浄する。
細胞を、400μlのトリプシン−EDTA中で37℃で30分間培養する。
600μlの完全培地(+10%SVF)中で細胞を再度懸濁する。
細胞をカウントする。
細胞を遠心分離機にかけ、PBS中で2回洗浄する。
1mlの冷却溶解物RIPAバッファ中で再度懸濁する。
4℃で30分間培養する。
システイン−TMRについて200nMにおける標準曲線を作成する。
BioRad蛍光測定器上で蛍光を測定する(励起480nmおよび放射590nm)。
0日目において、細胞を定期的に供給した:すなわち、8ウェルLabtekスライドガラス(0.7cm2/ウェル)において、HeLa細胞の場合1.105細胞s/cm2を、またはHCT116細胞の場合2.105細胞s/cm2を供給した。侵入調査を1日目に行った。
完全培地(+10%SVF)中、20μMにおいてコンジュゲートを希釈する。
細胞を培地から除去する。
コンジュゲートを、37℃で2時間、5%CO2−100μl/ウェルで培養する。
完全培地中で2回、PBS中で2回洗浄する。
4%PFA中中で20分間室温で固定する。
PBS中で3回洗浄する。
2.1)定量的細胞内蓄積
図20は、DPV15−およびDPV15b−TMRのHeLa細胞中への定量的侵入を示す。初期DPV−TMRコンジュゲート濃度20μMでの培養を2時間行った後に、細胞溶解を行った。結果を、2つの独立した実験において平均値として得る。
図23は、HeLa細胞中でのインターナリゼーション後のDPV15b−TMRの細胞質強調染色を示す。初期濃度20μMで37℃で2時間、HeLa細胞でコンジュゲートを培養した。
図25は、DPV15b−TMRコンジュゲートのインターナリゼーションレベルへの温度の影響を示す。DPV15b−TMRコンジュゲートの存在下で、初期濃度25μMでHeLa細胞を37℃または4℃のいずれかで2時間培養した。その後、細胞をトリプシン処理した後、RIPAバッファ中で溶解させ、蛍光を定量化した。各値を、3つの独立した実験(これらは全て正副2個実現した)の結果として得る。
図26は、CHO−K1細胞およびPgsA−745細胞中でのインターナリゼーションのDPV15b−TMRコンジュゲートの定量化を示す。培養を37℃で2時間行った後、トリプシン処理およびRIPAバッファ中での溶解を30分間4℃で行った。各値を、3つの独立した実験の結果として得る。
1)リガンドの性質
クロラムブシル(Chl)は、DNAおよびRNA合成の阻害物質であり、DNA分子中での内部架橋または相互架橋を生じさせるアルキル化作用物質である。反応基は、2つのCl基である。その化学式を図27に示す。
2.1)材料
DPV15−E−Chlコンジュゲートを非共役Chlと比較した(Fluka、Cat#23125)。
[モル濃度]=OD258nm/17.900
図28および29に示すように、CO2H基上のエステル結合(E)により、クロラムブシルをDPV15と共役する。この共役は、Ecole Nationale Superieure de Chimie de Paris(ENSCP)におけるLaboratoire de Chimie Bioorganique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire(LCBBMC)によって行われた。
核局在(DPV15−PO&DPV15−mAb、抗PO)
DPV15−E−クロラムブシル:
1バッチ:11/10/2001 70mg(水中で10mg/mlで可溶性)、分子量=2825.15
HPLC純度〜90%、正味ペプチド内容=60%(対イオン=TFA)
HPLC分析では、吸光度スペクトルが異なると、調合液は90%のDPV15−E−Chlおよび10%の「変性」DPV15−E−Chlが見られた。この変性は、エステル結合のタンパク質分解に起因するものではなく、前述したようなChlの不安定性に起因する可能性が最も高い(Bosanquet AG.、1986、Cancer Chemother. Pharmacol.、18:176)。これは、(i)Chlの芳香核の変性または(ii)H20分子と共にChl中に含まれる2Cl原子の相互作用に起因し得る。この成分を識別するため、質量分析を行う必要があった。
3.1)ヒト細胞系
HCT116:ヒト結腸癌(由来:ATCC#CCL−247)
HT29:ヒト結腸癌、低P−gp発現(由来:ATCC#HTB−38)K562:ヒト慢性骨髄性白血病(CML)(由来:ATCC#CCL−243)
生死判別試験を行った。簡潔に述べると、96ウェルプレート中に細胞を供給し、薬物濃度を上げて1時間培養した(i)その後、細胞を洗浄し、薬物無しで新鮮培地で48時間の培養、または、(ii)48時間行う。WST−1試験(Rocheから)を行って、シグモイダル回帰からIC50値(50%の細胞生存を抑制する薬物濃度)を推定した。
ヒト細胞癌および白血病細胞の対外細胞増殖抑制について、DPV15−E−Chlコンジュゲートを非共役Chlおよび5Furaと比較した。IC50値s=50%の細胞生存を抑制する薬物濃度を計算した。
5.1)可溶化について
DPV15をクロラムブシルに共役すると、水溶性コンジュゲートが得られた。
・K562白血病において、DPV15−E−Chlコンジュゲートは、Chlよりもずっと高効率である(短時間露出後に≧16倍、および長時間露出後に8倍)。
1)リガンドの性質
タキサンは、βチューブリン脱重合の抑制を通じて細胞分裂の間の紡錘体を抑制する細胞毒性薬である(Nogales E.、1999、Cell.Mol.LifeSci.56:133)。臨床においては、パクリタキセル(Taxol(登録商標))およびドセタキセル(Taxotere(登録商標))の2つのタキサンが用いられている。パクリタキセルは、1960後半においてPacific Yew、Taxus brevifoliaの樹皮から抽出された(Wall ME.、1995、Cancer Res.55:753)。ドセタキセルは、1980中頃において、10−deacetyl baccatinIII(これは、European Yew treen Taxus baccataの針状葉から抽出された前駆物質である(Gueritte−VoegeleinF.、1991、J.Med.Chem.、34:992)を用いたパクリタキセルおよび相似器官を得るための半合成プロセスを開発する重大な化学的研究過程の一部として得られたものである。
−DPVは、P−gp発現によりMDR表現型に耐え得る。
−DPVは、パクリタキセルの水溶性を増加し得る。
そのため、DPV−PTXコンジュゲートは、より可溶性が高く、かつ、腫瘍に対する耐性がより活発であり得る。
パクリタキセル(PTX)およびDPVを共役した。
DPV15/DPV3−E−PTXコンジュゲートを以下のものと比較した。
−非処方パクリタキセル(Hauserから)(Lot#Tech−6−00600−A)
−臨床グレード処方タクソール(登録商標)(Bristol−Myers Squibbから)(Lot#01H25−A)
パクリタキセルは、水溶性ではないが、ポリオキシエチル化ヒマシ油に対して可溶性である(cremophor EL、Sigma cat#C5135)。
NH2−L R R E R Q S R L R R E R Q S R−Cys−COOH(16+1aa)
核局在:DPVペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査およびDPV抗体抗ペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査において報告された通り。
NH2−R K K R R R E S R K K R R R ES−Cys−COOH(16+1aa)
細胞質局在化:DPVペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査およびDPV抗体抗ペルオキシダーゼコンジュゲートのインターナリゼーションに関する調査において報告された通り。
理論分子量:3331.73
溶解性:水溶性(≧10mg/ml)
対イオン:TFA
DPV15の場合2ロット。
DIAT0049(ALL0050)55mg(06/12/2001)HPLC純度>99%、正味ペプチド内容量=80%
DIAT0050(ALL0050bis)15mg(06/12/2001)HPLC純度>99%、正味ペプチド内容量=88%
DPV3:DIAT0057、HPLC純度>99%
OVCAR−3:ヒト卵巣癌(由来:ATCC#HTB−161)
NCI−H1299:ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)(由来:ATCC#CRL−5803)
MES−SA/Dx5:ヒト子宮肉腫が、パクリタキセルに対して耐性を持ち、高P−gpを発現する(由来:ATCC#CCL−1977)。
生死判別試験を行った。簡潔に言うと、96ウェルプレート中に細胞を付加し、薬物濃度を上げて1時間培養し、その後、細胞を洗浄し、薬物無しで新鮮培地で72時間培養する。WST−1試験(Rocheから)を行って、シグモイダル回帰からIC50値(50%の細胞生存を抑制する薬物濃度)を推定した。
DPV15−E−PTXコンジュゲートおよびDPV3−E−PTXコンジュゲートを、非処方パクリタキセル(Hauserから)、臨床グレード処方のタクソール(登録商標)(BMSから)、ドキソルビシン(Dox)およびDPV1047−E−Doxコンジュゲート(このコンジュゲートについては、WO01/64738DPV1047として公開されているPCT特許出願中に記載され、核局在が報告されている)と比較した。
DPV1047:
NH2−Cys−V K R G L K L R H V R P R V T R M DV−COOH(19+1アミノ酸)(共役のため、DPVアミノ酸配列にシステイン(Cys)を追加している)。
エステル結合によるDPV15およびDPV3とパクリタキセルとの共役により、水溶性コンジュゲートが得られた。
アンホテリシンB(AmB)は、ストレプトマイシスノドーサス(Streptomyces nodosus)によって産生されるヘプタンマクロライドであり、その毒性にもかかわらず、系統真菌感染症と戦うために用いられる最も有力かつ効果的な抗生物質の1つである。AmBは、細胞膜内のステロールに結合することにより、生物学的細胞膜に対して毒作用を施す。AmBは、水素結合およびファンデルワールス力を介して、真菌細胞膜中においてエルゴステロールに結合し、哺乳類細胞(よってその毒性)中においてコレステロールに結合する。
エステル結合により、アンホテリシンB(AmB)をDPV15に共役させる。
DPV15:NH2−L R R E R Q S R L R R E R Q SR−Cys−COOH(共役のため、システインを追加する)。
水(3.4ml)中の溶液DPV15(112mg)に、水素化ホウ素ナトリウム(12mg;0.34mmol)を付加し、この溶液を22℃で20分間攪拌した。酢(acetic)(0.037ml、0.68mmmol)を付加することにより、過剰NaBH4を崩壊させた。固形NaHCO3を追加して、溶液のpHを5.5に調節した。ジメチルホルムアミド(1.5ml)中のアンホテリシンB maleimidocaproyl amide(40mg、0.034mmol)の溶液を滴下方向において還元ペプチドに追加し、その結果得られた混合物を室温で2.5時間攪拌した。HPLCによる精製後liophylisationを行って、DPV15−AmBコンジュゲートのトリフルオロ酢酸塩(trifluoroacetate salt)を得た。
DPV15−AmBコンジュゲートの対外抗真菌活性を4つの真菌種(すなわち、Candida parapsilosis(ATCC22019)、Candida albicans(ATCC90028)、Aspergillus fumigatus(IP2001/183.02)およびCryptococcus neoformans(NIH52D))上で評価し、アンホテリシンBおよびDPV15.MIC80(薬物遊離制御と比較して株成長を80%だけ低減させる最低薬物濃度)との比較を、MOPSで緩衝されたRPMI 1640中でにおいて、NCCLS M27A基準(National Committee for Clinical Laboratory Standards、文書M27A)に従ってNCCLS M27A基準のマイクロタイター変性を用いて行う。この最低抑制濃度は、48時間および培養温度37℃後で決定される。
DPV15−AmBおよびコンパレータの真菌種に対する対外活性を以下の表12中にて示す。
致死的マウスカンジダ症モデル(AmB感受性株)において、DPV15−AmBコンジュゲートの体内抗真菌活性を評価する。LD100(100%致死量)のCandida albicans(ATCC 90028)をマウスに静脈接種(i.v.)した。.試験物質(DPV15−AmBおよびAmB(ファンギゾン))ならびにビヒクル(vehicule)制御を投与した(i.v.真菌接種3時間後の試験動物に相当する0.25mg/kg〜2.5mg/kgAmBの量)。1日1回の死亡記録を8日間行った。
5−a)溶血性活性
DPV15のAmBへの共役は、分子の溶解性を大幅に向上させることを示した。静脈注射が最も好適なものであり、ヒト赤血球上のコンジュゲートの細胞毒活性を試験する。試験された濃度は、0〜4μg/mlであった。コンジュゲートの溶血性活性は、AmBおよびAbelce(登録商標)(AmBの脂質処方)と比較する。
DPV15−AmBコンジュゲートの単回投与毒性を、静脈注射による単回投与の後の死亡および/または体重減少によって評価した。DPV15−AmB(2.57、3.68、5.52、7.36、9.2、18.4および36.8mg/kg)を溶媒(NaCl/H2O 9/1v/v)と共に用いて、マウスを治療した。これらの異なる投与量は、0.7、1、1.5、2、2.5、5および10mg/kgのAMBにそれぞれ対応する。1mg/kgの投与量は、文献に記載されているAmBのMTDに対応する(Tabosa Do Egito etal.、対外 and 体内 evaluation of a new amphothericin B emulsion−based delivery system.J Antimicrob Vhemother.1996 Sep;38(3):485−97)。
癌胎児性抗原(CEA)は、(ほとんど全ての結腸直腸腫瘍における過剰発現(>95%)、高抗原濃度の発現(細胞1個あたり1×106CEA分子まで)、および細胞表面における極めて長い滞留時間に起因する)胃腸腫瘍の免疫ターゲティングのための基準抗原である。しかし、ラジオイムノアッセイ治療(RIT)において、CEAの非インターナリゼーションにより、極小腫瘍小結節の治療にとって魅力的な低範囲のラジオアイソトープ(例えば、オーガーエミッタ)の使用が除外される。この限定を無くすため、抗体抗CEAMAb35A7(37A7として示す)のインターナリゼーションを誘発するためにDPV15が用いられ、オージェ電子治療のためにコンジュゲート125I−35A7−DVP15の可能性が分析されている。
実施例2について述べた基本計画に従って、共役を行っている。サクシニミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン(cyclohexana)−1−カルボキシレート(SMCC)を用いて、抗体分子あたり3〜5個のペプチド分子を含む抗体−DPVコンジュゲートを作製する。
DPV15:NH2−L R R E R Q S R L R R E R Q SR−Cys−COOH(共役のため、システインを追加している)。
免疫蛍光顕微鏡法を用いて、LS174Tヒト結腸腺癌細胞中のインターナリゼーションをを分析した。
3.1)第1の調査:単回投与
SWISSヌードマウス上で、LS174T腫瘍をNaClと比較して、125I−35A7−DPVl53について調査した。LS174T腫瘍は、1日目でのマウスへの(by mouse)皮下注射2×106によって確立した。125I−35A7−DPV15の単回投与は、細胞移植後8日後において静脈(i.v.)経由で注射した。125I−35A7−DPV15を0.125mCi、0.25mCi、0.5mCiおよび1mCiに注射した。移植後45日間が経過するまで、腫瘍量、延髄毒性およびマウス体重を観察および制御した。
第2の調査において、LS174T腫瘍を持つSWISSヌードマウスを、NaClとの比較として、125I−35A7−DPV15を2回注射することで治療した。細胞移植後8〜12日後、コンジュゲートを静脈(iv)経由で注射した。用いた投与量は、2×NaCl、2×0.5mCiおよび2×1mCiであった。移植後60日が経過するまで、腫瘍量、延髄毒性およびマウス体重を観察および制御した。
1)ペプチドのドキソルビシンへの結合
抗腫瘍作用物質であるドキソルビシンを、WO04/011033として公開されたPCT特許出願中に記載の方法に基づいて、DPV15およびDPV15bに共役させた。
DPV15:NH2−L R R E R Q S R L R R E R Q SR−Cys−COOH
DPV15b:NH2−CyS−G A Y D L R R R E R Q S R L R R R E R Q S R−COOH
共役のため、システインを追加した。
マウス:無胸腺(nu/nu)ヌードマウス、メス、NMRI−nu(nu/nu)−ヌード
腫瘍モデル:HCT116ヒト結腸直腸癌(ATCC番号:Cl−247)
Q2D3×3W投与スケジュールに従って(1週間に3回注射、各注射を2日間間隔で行い、これを3週間行う)、これらの溶液を静脈内(静脈)(i.v)経由で側尾静脈に注射した(ドキソルビシンの場合3.5、5および6.5μmol/kgならびにDPV15−Doxの場合15μmol/kg)。
Q2D3×3W投与スケジュールに従って、これらの溶液を側尾静脈経由で注射した(ドキソルビシンの場合5、6および7μmol/kgおよびDPV15b−Doxコンジュゲートの場合10μmol/kg)。
第1の実験:
図35は、DPV15−ドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。腫瘍量(mm3)を、細胞移植後の時間(日)関数として表す。
図36は、DPV15bドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。腫瘍量(mm3)を、細胞移植後の時間(日)関数として表す。グラフ中、DPV15bドキソルビシンをDPV15b−E−doxoとして示す。
ドキソルビシンとDPV15またはDPV15bとの共役は、ドキソルビシン毒性低減を誘発し、その抗腫瘍活性の増加を可能にする。
1)ペプチドのドキソルビシンへの結合
PCT特許出願(公開番号WO04/011033)中に記載の方法に従って、ドキソルビシンをDPV7bと共役させる。
DPV7b:NH2−G K R K K K G K L G K K R P R SR−Cys−COOH(共役のため、システインを追加している)。
方法
ヌードマウスの右側腹に、107HCT116細胞(HCT116ヒト結腸直腸癌細胞系)を皮内注射する。3日目において、確立された固形腫瘍(腫瘍サイズは80〜90mm3)上に治療を行った。異なる群中のマウス(腫瘍サイズは同等)を無作為化した(1つの群に6匹のマウス)。3つのマウス群を治療する(200μl/マウス(20g)のMicro−fine+による注射、U−100インスリン(0.5ml)、0.33×12.7mm/29Gl/2:Becton Dickinson)。すなわち、制御群(NaCl)、治療群(DPV7b−ドキソルビシン:15μmol/kg)、および治療制御群(ドキソルビシン:3.5、5および6.5μmol/kgを治療する。
図37は、DPV7bドキソルビシンコンジュゲートの抗腫瘍活性を示す。腫瘍量(mm3)を、細胞移植後の時間(日)関数として表す。
基本計画(実施例1を参照)に従って、コンジュゲートDPV3−RNAseを作製した。
DPV3:NH2−R K K R R R E S R K K R R R ES−Cys−COOH(共役のため、システインを追加している)。
方法
NMriヌードマウスの右側腹に、HCT116ヒト結腸直腸癌細胞を皮内注射する。
Q2D3×2W投与スケジュールに従って、溶液(H2O/NaCl(v/v:1/9)、RNAse(100g、0、5mg/ml)およびDPV3−RNAse(100μg、0、5mg/ml))腫瘍周辺注射により、マウスを治療した。
結果を図38に示す:腫瘍量(mm3)を、細胞移植後の時間(日)関数として表す。
DPVを以下のものと比較した。
DPV3:NH2−R K K R R R E S R K K R R R E S C−COOH
DPV3/10:NH2−R K K R R R E S R R A R R S P R H L C C−COOH
DPV6:NH2−G R P R E S G K K R K R L K P C−COOH
DPV7:NH2−G K R K K K G K L G K K R D P C−COOH
DPV7b:NH2−G K R K K K G K L G K K R P R S R C−COOH
DPV10:NH2−S R R A R R S P R H L G S G C−COOH
DPV3:NH2−S R R A R R S P R E S G K K R K R K R C−COOH
HCT116細胞中へのDPV−POコンジュゲートの定量的侵入を図39中に示す。初期DPV−POコンジュゲート濃度75μg/ml(およそ1.8μMに相当)における4時間培養後、細胞溶解を行った。結果を、3つの独立した実験(これらは全て正副2個実現した)において平均値として得る。
DPV−抗PO IgGコンジュゲートのHCT116細胞中への定量的侵入を図41中に示す。コンジュゲートの存在下で、初期濃度100μg/mlで細胞を4時間培養した。結果を、3つの独立した実験(これらは全て正副2個実現した)において平均値として得る。
HeLa細胞およびHCT116細胞中のDPV−TMRコンジュゲートのインターナリゼーションレベルを図43に示す。
Claims (28)
- 細胞および/または細胞核内部への対象物質の侵入およびを促進することが可能なアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有し、
(X1)p[(X)o(B)nX B X X B]m(X2)q(I)
ここで、
X1およびX2は、1〜20個のアミノ酸のアミノ酸配列であり、
pおよびqは、0〜5の自然数であり、
Bは塩基性アミノ酸であり、
Xは、非塩基性、好適には疎水性のアミノ酸であり、例えば、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリンまたはチロシンであり、
nは2または3であり、
mは1〜4であり、
oは0または1である、
アミノ酸配列。 - ・oは1であり、かつ/または
・pまたはqは0であり、かつ/または
・X1またはX2は、2〜5個のアミノ酸の配列であり、かつ/または
・nは2または3であり、かつ/または
・mは2である、
請求項1に記載のアミノ酸配列。 - 前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有する:
X B B X B X X B X B B X B X X B(II)
(X1)p X B B B X B X X B X B B B X B X X B(III)
ここで、X1、X、Bおよびpは、請求項1におけるものと同一の意味を持つ、
請求項1または2のいずれかに記載のアミノ酸配列。 - 100個未満のアミノ酸を有する、請求項1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 7〜25個のアミノ酸を有する、請求項1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 7〜15個のアミノ酸を有する、請求項1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 15〜25個のアミノ酸を有する、請求項1〜3のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 前記アミノ酸配列は、以下の化学式を有する:
・Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg(SEQ ID NO.1)
・Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg(SEQ ID NO.2)、
請求項1〜5のいずれかまたは請求項7に記載のアミノ酸配列。 - 前記細胞膜上の成分に結合し、前記成分を介して上記細胞膜を横断することによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 前記アミノグリカンと反応可能なことによって特徴付けられる、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 前記グリコアミノグリカンと反応可能なことによって特徴付けられる、請求項10に記載のアミノ酸配列。
- ヘパリン、コンドロイチン硫酸塩およびその誘導体と反応可能なことによって特徴付けられる、請求項10または11のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 抗体フラグメント、有利には多反応性抗体フラグメントに由来する少なくとも1つの第2のアミノ酸配列に結合される、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 前記第2のアミノ酸配列は、抗体の超可変領域の全体または一部である、請求項13に記載のアミノ酸配列。
- 前記第2のアミノ酸配列は、抗体の重鎖の断片である、請求項13または14のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 前記第2のアミノ酸配列は、ヒト抗DNA抗体またはその一部である、請求項13〜15のいずれかに記載のアミノ酸配列。
- 前記抗体は、IgMおよびIgGを含む群から選択される、請求項16に記載のアミノ酸配列。
- 前記第2のアミノ酸配列は、抗体のCDR2、CDR3領域の全体または一部を含む群において選択される、請求項16に記載のアミノ酸配列。
- 対象物質を持つ、請求項1〜18のいずれかに記載のアミノ酸配列の組み合わせ。
- 対象物質を細胞中に運搬するための組成を作製するための、請求項1〜18のいずれかに記載のアミノ酸配列の使用。
- 対象物質の細胞質内および/または細胞質内および/または細胞核内体内運搬のためのベクターであって、請求項1〜18のいずれかに記載の少なくとも1つのアミノ酸配列によって構成されるかまたは請求項1〜18のいずれかに記載の少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、ベクター。
- 細胞および/または前記細胞の細胞核中に自然的ににまたは非自然的に取り入れることが可能な少なくとも1つの対象物質に結合される請求項21に記載のベクター。
- 前記対象物質は、前記アミノ酸配列のN末端またはC末端において結合される、請求項22に記載のベクター。
- 前記対象物質は、核酸、タンパク質、薬物、抗原、抗体、ポリマー、蛍光色素などのマーカーを含む群から選択される、請求項21〜23のいずれかに記載のベクター。
- 前記対象物質(単数または複数)は、前記対象物質について強い自然親和性を有する少なくとも1つの固定分子を介して前記ベクターに結合される、請求項21〜24のいずれかに記載のベクター。
- 前記対象物質(単数または複数)は、遺伝子工学または化学、生化学的、酵素的結合によって前記ベクターに結合される、請求項21〜24のいずれかに記載のベクター。
- 請求項1〜18のいずれかに記載のアミノ酸配列または請求項21〜26のいずれかに記載のベクターを含む真核細胞。
- 請求項1〜18のいずれかに記載のアミノ酸配列、請求項21〜26のいずれかに記載のベクター、または請求項27に記載の真核細胞を有効成分として含む、生物学的、薬学的、整形外科的、農業食品、診断的またはトラッキング組成。
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