JP4633055B2 - ペプチド及び有利に疎水性の抗菌剤からなる特にグラム陰性菌を制御するための抗菌組成物 - Google Patents
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Description
本発明の上記ペプチドは、このように、感染症、より特異的にはグラム陰性菌による感染症の治療を意図する薬剤組成物の調製に特に適しており、上記組成物中で、上記ペプチドは細菌膜を通過して、上記組成物中で上記ペプチドが会合している抗菌組成物を細菌内部へ搬送する。
非疎水性であって、例えば、グルタミン酸、セリン、グリシン及びグルタミンから成るグループから選ばれたアミノ酸、或いは、ロイシン(疎水性アミノ酸)である。
・DPV3.10: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His
Leu (配列番号:2)
・DPV6: Gly Arg Pro
Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys
Arg Lys Arg Leu Lys Pro (配列番号:3)
・DPV7: Gly Lys Arg
Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys
Lys Arg Asp Pro (配列番号:4)
・DPV7b: Gly Lys
Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly
Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg (配列番号:5)
・DPV15: Leu Arg Arg Glu
Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (配列番号:6)
・DPV15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu
Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (配列番号:7)
・DPV1047: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (配列番号:8)
・DPV11: Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gly (配列番号:9)
・DPV1121: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met
Asp Tyr (配列番号:11)
・Arg Pro Arg (配列番号:14)
・Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys (配列番号:15) 3 0
・Arg Arg Glu Arg (配列番号:16)
・Arg Arg Arg Glu
Arg (配列番号:17)
・Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg (配列番号:18)
・Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys (配列番号:19)
・Lys Lys Arg (配列番号:20)
・Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg (配列番号:21)
・Arg Leu Arg Arg Glu Arg (配列番号:22)
・Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg (配列番号:23)
(A-)m(X)p(-P)n (I)
式(I)において、先に定義されたように、Aは抗菌組成物の残基であり、Pはペプチドの残基であり、XはAとPとの間の共役結合、又は少なくともA残基を少なくとも1つのP残基に結合するスペーサーアームを表し、mは1から3の整数であり、nは1から3の整数であり、又、pはゼロ或いは多くて数値m及びnのより大きな方に等しい。確かに、1つ以上のA及び/或いはP残基を単一のスペーサーアームに接木する、或いは1つ以上のA-XグループをP残基に接木する(それによってmはpに等しく、nは1に等しい)、又は1つ以上のX-PグループをA残基に接木する(それによってnはpに等しく、mは1に等しい)ことが可能である。pがゼロに等しい場合には、1つ以上のA残基が直接P残基に結合し(そしてnは1に等しい)、或いは1つ以上のP残基が直接A残基に結合する(そしてmは1に等しい)。
・経肺経路(例えば、エアゾル用の加圧瓶内の溶液)、
・直腸経路(坐薬)、
・同時経路(例えば、クリーム、軟膏又は経皮製剤、所謂貼り薬)、
・経粘膜経路、例えば、舌下経路(加圧瓶内の溶液、或いは経口崩壊用の錠剤)。
・潤滑剤、例えば、シリカ、タルク(滑石)、ステアリン酸、そのマグネシウム又はカルシウム塩及び/或いはポリエチレングリコール、
・結合剤、例えば、マグネシウムとアルミニウムの珪酸塩、デンプン糊、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/或いはポリビニールピロリドン、ならびに、もし必要ならば、
・崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩、或いは飽和剤混合物、及び/或いは吸収剤、着色料、矯味剤及び甘味剤。
・賦形剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム及び薬事法等級の類似体であってもよい。
I.1)蛍光トレーサー
・ボディピー(登録商標) FL N-(2-アミノエチル)マレイミド(ボディピー)(分子探索カタログ番号#B-10250)は、その分子式はC20H21BF2N4O3であり、その分子量は414.22Da(ダルトン)であり、吸光極大は504nmで、発光波長は510nm(緑色蛍光)であり、その展開構造式は図1に示されている。
以下の配列のペプチドが使用された。
・DPV3.10: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu (配列番号:2)で、そのC最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV6: Gly Arg Pro
Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys
Arg Lys Arg Leu Lys Pro (配列番号:3)で、そのC最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV7: Gly Lys Arg
Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys
Lys Arg Asp Pro (配列番号:4)で、そのC最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV7b: Gly Lys
Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly
Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg (配列番号:5)で、そのC最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV15: Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln
Ser Arg (配列番号:6)で、そのC最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg
Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (配列番号:7)で、そのN最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV1047: Val Lys
Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val
Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (配列番号:8)で、そのN最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV11: Ala Lys
Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gly
(配列番号:9)で、そのC最末端にCys(システイン)残基を持つ、
・DPV12: Gln Gly
Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe (配列番号:10)で、そのC最末端にCys Cys 配列を持つ、
・DPV1121: Val Lys
Arg Gly Leu Lys Leu Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala Met Asp Tyr (配列番号:11)で、そのN最末端にCys residue
Cys 残基 Cysを持つ、
DPV19: Asn Pro Gly
Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp
Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (配列番号:12)で、そのN最末端にCys残基を持つ。
ボディピー及びTMRはシステイン残基に化学共役して内部化の負の標識として作用する。
ボディピー又はTMR溶液は30ジメチルホルムアミド(DMF)中で50mMの最終濃度で調製された。DVP溶液はDMF中で10mMの最終濃度で調製された。ボディピー又はTMR溶液200μlが、DVP溶液700μlと混合された。混合物を外界温度、暗所で2時間保温した後、2mlの水と8mlのジクロロメタン(DCM)を添加した。上記溶液をボルテックス・ミキサーで混合して3000Gで2分間遠心した。水相を取り出して貯蔵した。DCM抽出を4回連続して行った。水相をガラス瓶に集め、−80℃に1時間放置した後、最小限18時間凍結乾燥した。得られた粉末はアルゴン中、−20℃で光を遮って貯蔵された。
DPV〜ボディピー及びDPV-TMR抱合体は水で3mMに希釈し、−20℃で光を遮って保存した。
・ボディピー抱合体に対して:
100Å 3μ C18
100x4.6mmのルナカラム
溶媒A: 水中で0.1% TFA
溶媒B: アセトニトリル(CAN)中で0.1%TFA
勾配: 10分間で5%Bから60%、1分間で60%Bから90%、3分間90%B、2分間5%B
流れ: 1.2ml/分、注入容量: 10μl、注入サンプルの濃度は0.1%TFA中で1mg/mlであった。
検出器: DAD: 214nm、300nm
100Å 3μ C18
100x4.6mmのルナカラム
溶媒A: 水中で0.1%TFA
溶媒B: アセトニトリル(CAN)中で0.1%TFA
勾配: 10分間で5%Bから60%、1分間で60%Bから90%、3分間90%B、2分間5%B
流れ: 1.2ml/分、注入容量: 20μl、注入サンプルの濃度は0.1%TFA中で1mg/mlであった。
検出器: DAD: 220nm
・大腸菌 ATCC 25922
・緑膿菌 ATCC 27853
I.8.a)37℃における抱合体の細菌への浸透の評価
培養の指数増殖期にある細菌を遠心して10mMでpH7.4のリン酸ナトリウム緩衝液(NAPB緩衝液)で3回洗浄した。細菌濃度をNAPB緩衝液で1x106cfu/ml(コロニー形成単位)に調整した。細菌懸濁液(50μl)をポリ-L-リジンスライドに滴下した。湿潤室37℃で30分間保温した後、スライド上に固定化された細菌をNAPBで3回洗浄した。DPV〜ボディピー又はDVP-TMR抱合体或いは対照物質の溶液(50μl)を細菌上に滴下した。湿潤室内37℃で光を遮って30分間インキュベーションした後、スライドをNAPBで3回洗浄した。37℃で光を遮って20分間インキュベーションすることによって、細菌をスライド上に固定することが可能である。50%PBS/グリセロールを1滴スライド上に滴下し、カバーガラスで覆った。カバーガラスをスライド上に密封した後、細菌の蛍光をライカエピ蛍光光学顕微鏡下で観察した(40X又は63X 液浸レンズ)。顕微鏡像を最大限ズーム及び0.63Xアダプターを装着したデジタルニコンクールピイックスカメラで撮影した。より詳細な分析を、倒立光学顕微鏡とX100の液浸レンズを装備した共焦点Bio-rad600顕微鏡(BIO-RADミクロサイエンス社、Hemel、Hempstead、英国)を用いて行った。細菌はクリプトン/アルゴンレーザーで励起した後、それらの蛍光で視覚化された。細菌の0.1-0.2μmの切片が幾つか作製された。
上述の方法(1.8.a)を以下のように改変した。ポリ-L-リジンのスライド上に固定化され、NAPBで3回洗浄された細菌を+4℃で24時間インキュベーションした後、予め+4℃で前培養されたDPV蛍光抱合体を添加した。爾後の段階はすべて冷溶液を用いて+4℃で行われた。
ポリ-L-リジンのスライド上に固定化された細菌をNAPBで3回洗浄して、30分間実験室の温度で0.05%のNAPB/SAB(ウシ血清アルブミン)溶液とインキュベーションした。細菌を30分間実験室の温度で、NAPB/SABで0.05%に希釈されたマウスの抗エンドトキシンモノクローナル抗体(バイオバレー、カタログ番号C555157、バッチ番号212529)とインキュベーションし、0.05%のNAPB/SABで数回洗浄し、次いで30分間実験室の温度で、光を遮ってもう1つの抗体:テトラメチルローダミン(TRITC)(ジャクソン イムノリサーチ カタログ番号315−026−003、バッチ番号47511)又はフルオレッセイン(FITC)(ジャクソン イムノリサーチ カタログ番号715−095−150、バッチ番号51038)と抱合したウサギの抗マウスポリクローナル抗体とインキュベーションした。NAPB緩衝液で数回洗浄した後、50%のPBS/グリセロールを1滴スライド上に滴下してカバーガラスで覆った。カバーガラスをスライドに密封した後、細菌の蛍光を、上述のように(1.8.a節)、共焦点顕微鏡で観察した。
最小阻害濃度(CMI)は、96-ウエルのポリスチレン盤上で細菌株のセットに対し液体培地(NCCLS M7A5)中ミクロ希釈法によって決定された。
II.1)グラム陰性菌におけるDPV〜ボディピー抱合体の内部化
II.1.a)DPV〜ボディピー抱合体の内部化の定性的評価
・大腸菌の定性的評価
図3は大腸菌におけるDPV〜ボディピー抱合体の内部化を示す。
図5は緑膿菌におけるDPV〜ボディピー抱合体の内部化を示している。
図3と5に示すように、DPV〜ボディピー抱合体の細菌の細胞質における集積レベルは、DPV及び細菌株に従って変動する。全般的にDPVの内部化は検討された2つの細胞株については殆ど同一である。DPVペプチドは三つの主要なグループに分割されることが可能である。
・DPV6、DPV7、DPV7b、DPV15:中等度の内部化
・DPV15b、DPV1047、DPV1121:弱い内部化
前述の結果を確認してポリ-L-リジンの抱合体内部化に対する潜在的干渉を評価するために、大腸菌をDPV〜ボディピーと30分間37℃でインキュベートし、次いで固定化する前にNAPB緩衝液で徹底的に洗浄して、ポリ-L-リジンスライド上に固定し、又は固定しなかった。抱合体の局在はエピ蛍光或いは共焦点光学顕微鏡で視覚化した。種々のDPVの内部化の特性は以前に得られた結果とは異なっていなかった。ポリ-L-リジンはDPVが細菌膜を通過して細菌に浸透する能力に対して何ら影響を持っていない。
以前に観察された内部化の機構を説明するために、DPVの+4℃における内部化能力を分析した。指数増殖期にある大腸菌をポリ-L-リジンスライド上に固定化し、次いで、細菌のエネルギー代謝を除外するために24時間+4℃で培養した。上記細菌は続いて、I.8.b)節に記載のように、3μMのDPV7〜ボディピー又はCyst-ボディピー(対照)と30分間+4℃で培養して、エピ蛍光及び共焦点顕微鏡で視覚化する前に大々的に洗浄した。37℃と+4℃における内部化のレベルを比較するために、同じ実験を、I.8.a節に記載のように、37℃で実施した。
一定のDPVペプチドがグラム陰性菌の外膜を通過し、細菌内に浸透して通常はこの外膜によって排除されるボディピーのような疎水性組成物を内部化することが示された。
DPV抱合体の内部化が上記細菌の死を誘導しないことを決定するために、12種のDPV〜ボディピー及びDPV3-TMR抱合体を、1.10)節に記載のように、それらの抗菌活性について検定した。検定されたこれらの抱合体は何れも大腸菌に対して、内部化実験に使用された濃度において何ら抗菌活性を示さなかった。この実験はこれら抱合体の内部化が細菌の生存度に何ら影響を持たないことを示した。本細菌における内部化の機構は細胞障害性ではない。
III.1)DPV-抗菌抱合体の合成
III.1.a)異種二価性架橋剤によるエリスロマイシンの活性化
マレイミドカプロン酸(MIC)(2.8当量)とジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(2.8当量)のジメチルホルムアミド溶液を0℃でアルゴン中、光を遮って一晩攪拌した。形成された沈殿(ジシクロヘキシル尿素)を濾過して除き、DMFで洗浄し、次いで再濾過した。抗生物質(1.0当量)とピリジン(5.0当量)のDMF溶液を完全に溶解するまで攪拌した。上記の得られた濾液をこの溶液に加えて外温で1時間攪拌した。
浸透性ペプチド(1.0当量)のリン酸ナトリウム緩衝液(NaH2PO4/Na2PO4)(10mM、pH7.1)溶液を5分間、外界温でアルゴン中、光を遮って攪拌した。次いで、最少限のDMFに溶解した活性化抗生物質(1.5から2.0当量)を添加した。溶液は上記ペプチドが完全に形質転換するまで攪拌された(HPLCで追跡)。蒸留水を続いて加え、水相を同量のジクロロメタンで3回抽出して過剰の活性化抗生物質を除去した。水相を次いで分取用HPLCのために凍結乾燥した。それ故、浸透性の抗生物質が45と100%の間の得量と90%以上の純度で単離された。
抱合体の最小阻害濃度(CMI)は、細菌株のセットに対するNCCLS-M7A5(臨床実験室基準国家委員会−文書M7A5)基準に従い液性培地中でミクロ希釈法を用いて96ウエルのポリスチレンプレート内で決定した。
細菌(例えば大腸菌又は緑膿菌)によって分離されたプレート上のウエルの列(の内容)を3から5mlのミュラー-ヒントン(MH)培養培地に懸濁して攪拌しながら37℃で一晩培養した。この一晩培養から、上記細菌株の指数増殖期にある培養を実現する。即ち、MH培地に上記一晩培養を2パーセントの割合で接種して、攪拌しながら37℃で2時間培養した。細菌濃度はMH培地中で1×106cfu/ml(コロニー形成単位)に調整した。50μlの細菌接種原を、適当な培養培地で半分ずつ混ぜて希釈した抱合体溶液に等しい容量を含むウエルに分配した(0.5μg/mlで512)。培養物は37℃で外気中、16から20時間培養した。
IV−1)物質と方法
選ばれたペプチド:DPV3及びDPV3.10
抗菌組成物:エリスロマイシン(シグマ E0774)
細菌株:大腸菌 ATCC 25922及び緑膿菌 ATCC 27853
大腸菌及び緑膿菌のようなグラム陰性菌は、マクロライド系の抗生物質に、これら抗生物質が細菌の外膜を通って浸透しないために耐性である。以前に確認されたDPVペプチドの内部化性及びそれらがマクロライド系の抗生物質の細胞内浸透を容易にする能力を評価するために、エロスロマイシンの大腸菌及び緑膿菌に対する抗菌活性をDPV3或いはDPV3.10ペプチドとの会合において所謂チェス盤法に従って評価した。
Claims (10)
- グラム陰性菌による感染症の治療用薬剤組成物を調製するためのペプチドの使用であって、該ペプチドが抗菌剤に共有結合的に結合され、そして配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9及び配列番号11からなる群より選択される配列番号で特定されるアミノ酸配列からなることを特徴とする前記使用。
- 前記ペプチドは、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択される配列番号で特定されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項1に記載の使用。
- 前記抗菌剤は、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン及びテリスロマイシンからなる群より選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載の使用。
- 前記ペプチドは、リンカーを介して共有結合的に抗菌剤に結合され、該リンカーがエステル、アミド、チオエステル又はチオアミドから選択される1つ以上の官能基を有することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記リンカーは、マレイミドカプロン酸から誘導されることを特徴とする請求項4に記載の使用。
- グラム陰性菌による感染症の治療用薬剤組成物であって、該薬剤組成物は少なくとも1種のペプチドと少なくとも1種の抗菌剤を含み、前記ペプチドが抗菌剤に共有結合的に結合され、そして配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9及び配列番号11からなる群より選択される配列番号で特定されるアミノ酸配列からなることを特徴とする前記薬剤組成物。
- 前記ペプチドは、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群より選択される配列番号で特定されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項6に記載の薬剤組成物。
- 前記抗菌剤は、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン及びテリスロマイシンからなる群より選択されることを特徴とする請求項6又は7に記載の薬剤組成物。
- 前記ペプチドは、リンカーを介して共有結合的に抗菌剤に結合され、該リンカーがエステル、アミド、チオエステル又はチオアミドから選択される1つ以上の官能基を有することを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載の薬剤組成物。
- 前記リンカーは、マレイミドカプロン酸から誘導されることを特徴とする請求項9に記載の薬剤組成物。
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