JP6074686B2 - ペプチド含有ポリマー、及び繊維へのペプチド固定化方法 - Google Patents
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Description
本発明のペプチド含有ポリマーを用いれば、簡易な方法によりペプチドを繊維に固定化することができる。より具体的には、本発明のポリマーを用いることにより、繊維を煩雑な前処理することなく、また、繊維上でペプチド合成をすることなく、繊維にペプチドを固定化することができる。
本発明はまた、ペプチドを繊維に固定化する方法に関する。本発明の方法を用いることにより、簡便な方法で繊維にペプチドを固定化することができる。
本発明の一つの態様においては、抗菌性を有するカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチドをポリマー中のリンカー、例えばマレイミド基と結合させてペプチド含有ポリマーを調製し、それを繊維にコーティングすることにより抗菌ペプチドを繊維に固定化できる。
本発明の別の態様においては、上記のようにして提供された抗菌性を有するカブトムシディフェンシン由来の改変ペプチドが固定化された抗菌性繊維が提供できる。
(1)下記式(1)
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle、Leu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6はArg又はLysであり、X7はArg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)
で表される反復単位を含む抗菌性ペプチド含有ポリマー。
で表される反復単位のうちの少なくとも一つを含む上記(1)に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
(3)前記式(1)〜(3)において、−W−が、下記式:
(4)前記式(1)の−W−Peptideが、以下に表される式(11)〜(27):
からなる群から選ばれる、前記(2)に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
式(11)−式(31);式(12)−式(31);式(13)−式(32);式(14)−式(32);式(15)−式(33);式(16)−式(33);式(17)−式(34);式(18)−式(35);式(19)−式(33);式(20)−式(31);式(21)−式(32);式(22)−式(36);式(23)−式(37);式(24)−式(38);式(25)−式(39);式(26)−式(39);式(27)−式(33);式(28)−式(33)。
式(1)中、U1がOで、−V−W−Peptideが、−PEG−S−Cys−Peptide(ここで、PEGは、重量平均分子量が10〜2000のポリエチレングリコールである。)又は-CH2CHOHCH2−S-Cys-Peptide、又は、U1がNHで、−V−W−Peptideが、-Peptide、−(CH2)3−S−Cys−Peptide、−CH2−(C2H4O)3−C3H6−NH−COCH2−S−Cys−Peptide、及び下記式:
式(3)中、U3がOで、−Y−Hが、−(CH2)11−CH3、又は−PEG−R3(ここで、PEGは、重量平均分子量が10〜2000のポリエチレングリコールであり、R3はOH又はCH3である。)、又はU3がNHで、−Yが単結合である、請求項2に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
(10)前記ポリマー中に、前記Peptide含有単位を、0.4〜20モル%(より好ましくは、0.4〜2モル%)の割合で含有する前記(9)に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
−HN−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−CONH2、−HN−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CONH2、−HN−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Val−Arg−Arg−Arg−CONH2、−HN−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CONH2、H2N−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Val−Arg−Arg−Arg−CO−、及びH2N−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CO−からなる群より選ばれるペプチドである前記(1)〜(10)のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
(13)前記抗菌性ペプチド含有ポリマーが、ペプチド存在量で、布1cm2あたり0.001μモル以上0.3μモル以下存在する、前記(12)に記載の抗菌性繊維。
(14)医療用用途またはサニタリー用途における前記(11)または(12)に記載の抗菌性繊維。
(15)前記(1)〜(11)のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマーを繊維上にコーティングすることにより、抗菌性ペプチドを繊維に固定化する方法。
(16)前記(1)〜(11)のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマーを含有するポリマーエマルジョン。
で表される反復単位を含むポリマーに、下記式(10):
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基(例えば、アジド基、スルフヒドリル基、ハロゲン基、アルキン基、カルボニル基、ヒドロキシルアミノ基)を有する分子量50〜500の分子である。)
で表されペプチド又はその誘導体を反応させることにより、抗菌性ペプチド含有ポリマーを作製する方法。
で表される反復単位を含むポリマーに、下記式(10):
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基(例えば、アジド基、スルフヒドリル基、ハロゲン基、アルキン基、カルボニル基、ヒドロキシルアミノ基)を有する分子量50〜500の分子である。)
で表されペプチド又はその誘導体を反応させることにより、抗菌性ペプチド含有ポリマーを作製する方法。
工程(1):下記式(9)
で表される反復単位を含むポリマーを含む溶液を繊維にコーティングする工程、及び
工程(2):下記式:
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基(例えば、アジド基、スルフヒドリル基、ハロゲン基、アルキン基、カルボニル基、ヒドロキシルアミノ基)を有する分子量50〜500の分子である。)
で表される抗菌性ペプチド又はその誘導体を含む溶液に、前記ポリマー溶液をコーティングした繊維を浸漬する工程、及び
工程(3):1〜10時間放置することによりポリマーにペプチドを結合させた後、該繊維を洗浄して未反応のペプチド又はその誘導体を除去するする工程、
からなる抗菌性繊維の製造方法。
工程(1):下記式(9)および(3)
で表される反復単位を含むポリマーを含む溶液を繊維にコーティングする工程、及び
工程(2):下記式(10):
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基(例えば、アジド基、スルフヒドリル基、ハロゲン基、アルキン基、カルボニル基、ヒドロキシルアミノ基)を有する分子量50〜500の分子である。)
で表される抗菌性ペプチド又はその誘導体を含む溶液に、前記ポリマー溶液をコーティングした繊維を浸漬する工程、及び
工程(3):1〜10時間放置することによりポリマーにペプチドを結合させた後、該繊維を洗浄して未反応のペプチド又はその誘導体を除去するする工程、
からなる抗菌性繊維の製造方法。
下記式(1a):
下記式(4a):
工程(1);下記式(1b):
で表されるペプチド又はその誘導体を反応させることにより、抗菌性ペプチド含有ポリマーを作製する方法。
下記式(1b):
で表されるポリマーを含む溶液を繊維にコーティングする工程、及び
工程(2);下記式(10):
本発明の別の態様に従って、抗菌性ペプチド含有ポリマーを用いて、比較的容易な工程により、ペプチドがその活性を保持したまま固定化された繊維が提供できる。
本発明の他の一つの態様に従って、比較的容易なペプチドの固定化方法により、ペプチド、特には抗菌性ペプチドが固定化された繊維が提供できる。
このようにして提供される繊維は、ペプチドの活性を維持でき、特に、抗菌ペプチドを用いた場合は、提供される繊維は、抗菌活性を有し繰り返しの洗浄及び/又はオートクレーブによる滅菌処理を行っても抗菌活性を維持できる。
本発明の繊維はまた安全性に優れているので、医療用用途、例えば、医療用包帯、シート、衣類等にも用いることができる。
本明細書において「繊維」とは、特に断りのない限り、糸または布地の原料としての繊維、その繊維から作られた糸、その糸から作られた布地あるいは繊維から作られた不織布のいずれも含む意味に用いられるが、「ポリマーを繊維にコーティングする」という場合は、糸または布地の原料としての繊維を意味する。一方、「ポリマーがコーティングされた繊維」という場合は、ポリマーがコーティングされた糸または布地の原料としての繊維、そのポリマーがコーティングされた繊維から作られた糸、その糸から作られた布地のいずれも含む。
本明細書において、ポリペプチド及びペプチドは、特に断りのない限りは同じ意味で用いられ、互いに変更可能である。
本明細書において、−S−Cys−Peptideと表記する場合は、Sはシステイン中のSを意味する。
本明細書において、ペプチドを表記する場合は、例えば、Leuは、ロイシン残基を意味する。
本明細書において、例えば、A及びBをポリマー内にランダムに有するポリマーを表す場合は、以下の何れの様式で表すこともできる。
下記式:
で表される抗菌性ペプチド含有ポリマー。
Yは、単結合又は分子量10〜3000、好ましくは100〜2000の置換基を有してもよい直鎖又は分岐状のアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖である。Yの長さや種類を適宜選択することにより、ポリマーの物性を変更することができる。
H2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)。
ペプチド末端及びスペーサー末端の両者にリンカーを導入する場合は、一方にリンカーを構成する一部(リンカーパーツWX)を導入し、他方にリンカーを構成する他の一部(リンカーパーツWY)を導入し、両リンカーパーツを反応させることにより、ペプチドをスペーサーに結合できる。その結果、Wx及びWyからリンカーWが作られる。
上記においてスペーサーを用いない場合は、ポリマー鎖の側鎖末端にリンカー又はリンカーパーツを導入して、ポリマー鎖の側鎖末端に直接ペプチドを結合することもできる。
リンカー部位は、ペプチドのN末端又はC末端、或いはスペーサー末端のいずれかに導入してリンカーとしての機能を果たすことができるが、ペプチド末端及びスペーサー末端の両者に導入して、それぞれのリンカー部位が反応してリンカーとしての機能を果たすこともできる。例えば、ペプチド末端及びスペーサー末端のいずれかにチオールを導入し、他方にマレイミド基を導入して、チオールとマレイミド基の反応により、チオエーテル基を有するリンカーを介してペプチドをスペーサーに結合することもできる。
ペプチドのN末端のスペーサーへの結合は、N末端にリンカー部位としてチオール基、例えば、システインやチオグリコール酸等を導入し、SH基と反応するマレイミド基、ハロゲン、チオエステル基、ブロモアセチル基等の官能基を有するスペーサーと反応させてスペーサーに結合することもできる。これにより、チオエーテル基を含むリンカーによりペプチドとスペーサーが結合される。SH基とこれらの官能基との反応は、常法により行うことができるが、例えば、マレイミド基との反応はマイケル付加反応により行うことができる。また、ハロゲンとの反応は求核置換反応により行うことができ、チオエステルとの反応は、エステル交換反応による。
また、ペプチドのN末端にリンカー部位としてアルコキシアミノ基を持つ、3-オキシアミノプロピオン酸、4−オキシアミノ酪酸等を導入し、アルコキシアミノ基と反応するケトンを有するスペーサーと反応させてスペーサーに結合することもできる。アルコキシアミノ基とケトンとの反応は、常法により行うことができるが、例えば、オキシム化反応により行うことができる。
また、これらのリンカー部位はスペーサーとペプチドの部位を各々逆に導入し、結合させることも可能である。
ペプチドのC末端のスペーサーへの結合は、C末端にリンカー部位としてチオール基、例えば、システインや2−アミノ−1−エタンチオール等を導入し、SH基と反応するマレイミド基、ハロゲン、チオエステル基、アルデヒド基、ブロモアセチル基等の官能基を有するスペーサーと反応させてスペーサーに結合することもできる。SH基とこれらの官能基との反応は、上記のような常法により行うことができる。
スペーサーA:
[Ls-A]:
[Lp-A]
Cysteine:
リンカー導入法:ペプチド製造時に、ペプチドN末又はC末に導入。
[Lp-B]
また、本発明で用いるポリマーの重量平均分子量は、3,000以上が好ましい。重量平均分子量を3,000以上とすることにより、モノマーとの分離が容易になり、さらに繊維への固着力がより高まる。より好ましくは10,000以上である。
ポリマーへのマレイミド基の導入は、1分子内にアミノ基と反応できる官能基とマレイミド基を持つ化合物を用いて行うことができる。例えば、マレイミドプロピオン酸N-スクシンイミジル、N−(α−マレイミドアセトキシ)スクシンイミドエステル、N−(4−マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド、N−(4−マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド、N−(8−マレイミドカプリルオキシ)スクシンイミド、N−(8−マレイミドカプリルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩、N−(11−マレイミドウンデカノイルオキシ)スクシンイミド、N−(11−マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩などがあげることができる。これらの試薬は、単独または2種以上の組み合わせで用いても良い。
また 繊維の形態としては、ステープル、フィラメント糸ならびにその加工糸などからなる織物、編物を言うが、さらには繊維ウエブ形態でも良い。繊維ウエブとは、不織布やティッシュペーパー、ウエットティッシュ、食品包装紙などの紙類などを言う。
本発明においては、例えば、固定化されたペプチドを有する疎水性のポリマー(ペプチド含有ポリマー)を単独又は界面活性剤などを用いて乳化し、繊維の加工剤であるエマルジョンとすることができる。また、ポリマーエマルジョンは、従来公知の乳化重合法でも作製できる。例えば、モノマーを界面活性剤により水中に分散し、重合開始剤、キレート剤、酸素捕捉剤、分子量調整剤等が加えて乳化重合できる。使用する、界面活性剤、重合開始剤、キレート剤、酸素捕捉剤、分子量調整剤は従来公知のものを用いることができる。
工程(1);下記式(1b):
工程(2);下記式:
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するポリペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基(例えば、アジド基、スルフヒドリル基、ハロゲン基、アルキン基、カルボニル基、ヒドロキシルアミノ基)を有する分子量50〜500の分子である。)
で表され抗菌性ポリペプチド又はその誘導体を含む溶液中に、ポリマーを含む溶液をコーティングした繊維を浸漬する工程、及び
工程(3);1〜10時間放置することによりポリマーにポリペプチドを結合させた後、繊維を洗浄して未反応のペプチド又はペプチド誘導体を除去する工程、
からなる抗菌性繊維の製造方法。
ペプチドの合成
ペプチドA(RLYLRIGRR)、ペプチド1(CRLYLRIGRR)及びペプチド2(RLYLRIGRRC)を、常法に従い固相合成法により合成した。
モノマー1の合成
滴下ロートを備えた二口フラスコ(100ml)に(3−{2−[2−(3−アミノプロピル)−エトキシ]−エトキシ}−プロピル)カルバミン酸−t−ブチルエステル(1060mg、3.31mmol)とトリエチルアミン(401mg、3.97mmol)、テトラヒドロフラン(25mL)を加え、氷冷下で攪拌した。ここにメタクリル酸クロリド(913mg、3.97mmol)とテトラヒドロフラン(25mL)の混合溶液を滴下し、氷冷下で3時間攪拌した。その後、8時間室温で攪拌した。反応終了後、沈殿物を除去し、展開溶媒に酢酸エチルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて目的物を単離した。Rf値=0.39 (シリカゲル、酢酸エチル) 収率59%。
1H-NMR; (CDCl3, 400MHz)δ:1.4-1.5 (9H, br, CH3), 1.7-1.8 (2H, m, NHCH2 CH 2 ), 1.8-1.9 (2H, m, NHCH2 CH 2 ), 2.05 (3H, s, OCCH 3 ), 3.20-3.25 (2H, q, J=6.24, NHCH 2 ), 3.42-3.47 (2H, q, J-5.56, NHCH 2 ), 3.51-3.54 (2H, t, J=5.96, OCH 2 ), 3.55-3.65 (12H, m, OCH 2 ) 5.29 (1H, s, CH3CCH 2 ), 5.71 (1H, s, CH3CCH 2 )
ポリマー1の合成
窒素置換したシュレンク管(30mL)にモノマー1(900mg、2.32mmol)とAIBN(7.6mg、0.046mmol)とテトラヒドロフラン(1ml)を加え、還流攪拌した。反応終了後、ゲル浸透クロマトグラフィーにて低分子量物質を除去した。得られたポリマーをジクロロメタン(10ml)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(5ml)を加え、室温で8時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去した。再びポリマーをジクロロメタン(10ml)に溶解させ、3-マレイミドプロピオン酸N-スクシンイミジル(122.4mg、0.46mmol)とトリエチルアミン(46.5mg、0.46mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応終了後、ゲル浸透クロマトグラフィーにて精製し、下記のポリマー1を得た。
1H-NMR; (CDCl3, 400MHz)δ:0.8-1.0 (3H, br, CH3), 1.4-1.9 (8H, br, CH2 ), 2.4-2.6 (2H, br, COCH 2 ), 3.1-3.4 (4H, br, NHCH 2 ), 3.4-3.7 (12H, br, OCH 2 ), 3.75-3.85 (2H, br, CONCH 2 ) 6.7-6.8 (2H, br, COCH)
(水、DMF、クロロホルム、THFに可溶)
ポリマー2(ペプチド含有ポリマー)の合成
実施例3で合成したポリマー1(15.8mg)をDMF(250μl)に溶解させた。ペプチド1(CRLYLRIGRR)(11.7mg、9.0mmol)を水1mlに溶解させ、これをポリマー1のDMF溶液と混合し、反応させた。ペプチドユニット:マレイミドユニット=1:4
ポリマー3(ペプチド含有ポリマー)の合成
反応させるペプチドにペプチド2(RLYLRIGRRC)を用いたこと以外は、ポリマー2と同様にして合成した。ペプチドユニット:マレイミドユニット=1:4
ポリマー4(ペプチド含有ポリマー)の合成
ポリマー1(3.5mg、マレイミドユニット8μmol)を水(1.0ml)に溶解させた。ペプチド2 (RLYLRIGRRC)(21mg, 16μmol)を水1mlに溶解させ、これをポリマー1水溶液と混合し、反応させた。これを透析チューブ(分画分子量8000)で、一晩透析し、過剰のペプチドを除去した。
加工布1〜3の作製
ポリマー2DMF-水混合溶液を綿のJIS添付白布にコーティングし、減圧下で乾燥させ、加工布1〜3を作製した。
加工布1は、ペプチドの存在量が布1cm2あたり0.3μmol存在するように調整した。
加工布2は、ペプチドの存在量が布1cm2あたり0.1μmolになるように調整したこと以外は加工布1と同様にして作製した。
加工布3は、ペプチドの存在量が布1cm2あたり0.03μmolになるように調整したこと以外は加工布1と同様にして作製した。
加工布4〜6の作製
コーティングするポリマーにポリマー3を用いたこと以外は、加工布1と同様にして作製した。ペプチドの存在量は、加工布4が布1cm2あたり0.3μmolであり、加工布5が布1cm2あたり0.1μmolであり、加工布6が布1cm2あたり0.03μmolであった。
加工布7〜9の作製
コーティングするポリマーにポリマー1を用いたこと以外は、加工布1と同様にして作製した。マレイミドユニットの存在量は、加工布7が布1cm2あたり1.2μmolであり、加工布8が布1cm2あたり0.4μmolであり、加工布9が布1cm2あたり0.12μmolであった。
加工布10の作製
コーティングするポリマーにポリマー4を用いたこと以外は、加工布1と同様にして作製した。ペプチドの存在量は、1cm2あたり0.3μmolであった。
抗菌活性試験
上記の如くして作製した加工布1〜10について、抗微生物活性試験を行った。加工布(1 cm×1 cm)および標準布をそれぞれ黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus NBRC 12732)を含む培養液(0.8% NB培地で一昼夜培養した菌液を、新たな培養液に1%容量で加え、37℃で3時間培養した後、波長600nmにおける吸光度が0.01となるように希釈した培養液200μl)中に入れ、37℃で18時間培養した後、生菌数を測定し、18時間培養後の標準布の生菌数を18時間培養後の加工布の生菌数で除した対数値として示した。結果を表1に示す。抗菌試験を実施した後、布を40ml超純水でボルテックス洗浄(最大スピード10秒間振とう×3回)及びオートクレーブによる滅菌操作(121℃、20分)を行い、同じ加工布を用いて抗菌試験を行った。更に、この洗浄−滅菌操作−抗菌試験を繰り返し行った。結果を以下の表2に示す。
ポリマー5の合成
窒素置換したシュレンク管(30mL)にモノマー1(54mg、0.14mmol)とN−オクタデシルアクリルアミド(931mg、2.88mmol)とAIBN(7.6mg、0.046mmol)とクロロホルム(1ml)を加え、還流攪拌した。反応終了後、ゲル浸透クロマトグラフィーにて低分子量物質を除去した。得られたポリマーをジクロロメタン(10ml)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(5ml)を加え、室温で8時間攪拌した。反応終了後、溶媒を減圧下で留去した。再びポリマーをジクロロメタン(10ml)に溶解させ、3-マレイミドプロピオン酸N-スクシンイミジル(38mg、0.14mmol)とトリエチルアミン(14.1mg、0.14mmol)を加え、室温で3時間攪拌した。反応終了後、ゲル浸透クロマトグラフィーにて精製した。NMRの結果、マレイミドユニット:オクタデシルユニットの物質比は1:14であった。
加工布11及び12の作製
マレイミドユニットの物質量が布1cm2あたり0.03μmolになるようにして、実施例11で作製したポリマー5を綿のJIS添付白布にコーティングし、減圧下で乾燥させた。この布を、マレイミドユニットと同モルのペプチド1(CRLYLRIGRR)を含む水溶液中(ペプチド濃度 3.6mM)に浸し、5時間放置した。その後、布をイオン交換水で洗浄し、未反応のペプチドを除去し、加工布11を作製した。
マレイミドユニットに結合させるペプチドとしてペプチド2(RLYLRIGRRC)を用いたこと以外は、加工布11と同様にして、加工布12を作製した。
加工布13の作製
マレイミドユニットに結合させるものとして、マレイミドユニットと同モルのシステインを含む水溶液を用いたこと以外は、加工布11と同様にして作製した。
実施例10と同様にして、加工布11〜13の抗菌活性を測定した。結果を以下の表3に示す。
また、ポリマーを塗布した後ペプチドを反応させてペプチドを結合した加工布11及び12では活性が認められたが、ペプチドを結合していない加工布13では活性が認められなかった。
Cysリンカー付ペプチドの合成
Cysリンカーが末端についたペプチド3(CRLLLRVGRR-NH2)を常法に従い固相合成法により合成した。
モノマー2の合成
3-ブロモプロピルアミン臭化水素酸塩(2.15g, 9.8mmol)をピリジン50mLに溶解させ、氷冷下で攪拌した。ここにメタクリル酸クロライド(1.54g, 14.7mmol)をTHF(30mL)に溶解させたものを滴下し、一晩攪拌した。反応終了後、ピリジンを乾固しない程度に留去し、水とクロロホルムで分離した。クロロホルム相を濃縮し、ゲル浸透クロマトグラフィーにて精製し、N-(3-ブロモプロピル)-2-メタクリルアミドを得た。収率30%
1H-NMR; (CDCl3, 400MHz)δ:2.22 (3H, s, CH3), 2.22-2.30 (2H, quin, J=7.7, CH 2 ), 3.86-3.90 (2H, t, J=8.0, CH 2 ), 4.66-4.69 (2H, t, J=7.4, CH 2 ), 5.91 (1H, s, CH3CCH 2 ), 6.55 (1H, s, CH3CCH 2 )
モノマー3の合成
3-ブロモ-1-プロパノール(1.39g, 10mmol)を脱水したトルエン10mlに溶解させ、窒素雰囲気下で攪拌した。ここにメタクリル酸2-イソシアナトエチル(1.55g, 10mmol)を滴下し、60℃で一晩攪拌した。得られた副生成物をろ過で除去し、モノマー2を得た。
収率95%
1H-NMR; (CDCl3, 400MHz)δ:1.95 (3H, s, CH3), 2.17 (2H, br, CH 2 ), 3.45-3.54 (4H, br, BrCH 2 , NCH 2 ), 4.20-4.25 (4H, br, OCH 2 ), 5.60 (1H, s, CH3CCH 2 ), 6.13 (1H, s, CH3CCH 2 )
ポリマー6の合成
N-(3-ブロモプロピル)-2-メタクリルアミド(モノマー2)(82mg, 0.4mmol)とポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリラートMn300(6.0g, 20mmol)をエタノール20mLに溶解させ、開始剤のAIBN(67mg, 0.4mmol)を添加した。容器内を窒素置換した後、6時間還流攪拌を行った。透析チューブ(分画分子量3500)で、48時間透析し、未反応のモノマーを除去し、ポリマー6を得た。バイルシュタイン反応で、ハロゲン由来の炎色反応が認められた。
モノマー3(305mg, 1.04mmol)とポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリラートMn300(15.6g, 52mmol)をエタノール50mLに溶解させ、開始剤のAIBN(174mg, 1.06mmol)を添加した。容器内を窒素置換した後、6時間還流攪拌を行った。透析チューブ(分画分子量3500)で、48時間透析し、未反応のモノマーを除去し、ポリマー7を得た。
ポリマー8(ペプチド含有ポリマー)の合成
ポリマー6(8928mg, Br換算0.587mmol)とCysリンカー付きペプチド3(CRLLLRVGRR)(1062mg,0.587mmol)をDMF58.7mlに溶解させ、ターシャリーブトキシカリウム(395.2mg,3.522mmol)を添加した。40℃で4時間30分加熱撹拌した。TLCで原料ペプチドが消失したことを確認した。DCM500mlで希釈し、析出した塩をセライトろ過し取り除いた。ろ液をエバポレータで濃縮し、真空乾燥し、ポリマー6にペプチド3が結合したポリマーであるポリマー8を得た。
ポリマー7(2.04g,Br換算0.13mmol)とCysリンカー付きペプチド3(CRLLLRVGRR)(235.4mg,0.13mmol)をDMF10mlに溶解させ、ターシャリーブトキシカリウム(87.5mg,0.78mmol)を添加した。40℃で7時間加熱撹拌した。TLCで原料ペプチドが消失したことを確認した。DCM50mlで希釈し、析出した塩をセライトろ過し取り除いた。ろ液をエバポレータで濃縮し、真空乾燥し、ポリマー7にペプチド3が結合したポリマーであるポリマー9を得た。
ペプチド含有ポリマー加工剤A及びBの調整
実施例18で作製したポリマー8(4.8g)に水を加え全量を121gとした。一晩攪拌し完全に分散させ、加工剤Aを調整した。
加工剤Aを蒸留水で10倍希釈し、加工剤Bを得た。
なお、ポリマー7(346mg)に水を加え全量を17.3gとし、一晩攪拌し完全に分散させ、加工剤C(ペプチド非含有ポリマー加工剤)を得た。これを参照実験用として用いた。
ペプチド含有ポリマー加工剤Dの調整
ポリマー9(2.08g)に水を加え全量を500gとした。一晩攪拌し完全に分散させ、加工剤Dを調整した。
加工布14〜16の作製
綿のJIS添付白布に対し、1.5〜2.0倍の質量の加工剤Aを生地全体に浸透するように加え、マングルで余分な加工剤を除去し、室温で乾燥させ、加工布14を作製した。ペプチドの存在量は、1cm2あたり0.03μmolであった。加工剤は生地に対して4%であった。ニンヒドリン反応では生地が紫色に呈色することを確認した。
綿のJIS添付白布に対し、1.5〜2.0倍の質量の加工剤Bを生地全体に浸透するように加え、マングルで余分な加工剤を除去し、室温で乾燥させ、加工布15を作製した。ペプチドの存在量は、1cm2あたり0.006μmolであった。加工剤は生地に対して0.4%であった。
綿のJIS添付白布に対し、1.5〜2.0倍の質量の加工剤C(参照例)を生地全体に浸透するように加え、マングルで余分な加工剤を除去し、室温で乾燥させ、加工布16(参照例)を作製した。加工剤は生地に対して6.8%であった。
加工布17の作製
綿のJIS添付白布に対し、1.5〜2.0倍の質量の加工剤Dを生地全体に浸透するように加え、マングルで余分な加工剤を除去し、室温で乾燥させ、加工布17を作製した。ペプチドの存在量は、1cm2あたり0.006μmolであった。加工剤は生地に対して0.8%であった。
抗菌性試験
実施例10と同じ方法で加工布17について試験した。その結果を以下の表4に示す。
抗菌活性試験
上記の如くして作製した加工布14〜16について、抗微生物活性試験を行った。JIS L 1902 の定量試験方法に準拠して行った。培養後の生菌数測定法には、混釈平板培養法(コロニー法)を用いた。また、耐久性評価のための繰り返し洗濯試験は、JIS L 0217の洗い方103に規定する方法(40℃で5分間洗い、30℃で2回すすぎ洗いを2分間行う。脱水後、直射日光の当たらない場所でスクリーン乾燥)で、10回、20回、50回の繰り返し試験を行った。洗濯時には、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを洗剤として用いた。ただし、静菌活性値は、(18時間培養後の標準布の生菌数の常用対数値−試験菌接種直後の標準布の生菌数の常用対数値)−(18時間培養後の加工布の生菌数の常用対数値−試験菌接種直後の加工布の生菌数の常用対数値)として示した。結果を以下の表5に示す。
抗菌性ペプチド含有ポリマーの安全性試験
実施例18で作製した、ポリマー8を用いて、以下のそれぞれの項目について、安全性試験を行った。
1.急性経口毒性試験
ポリマー8を、供試動物のマウス雌雄各五頭に対して投与したが、二週間の試験期間中生存し、その間の生育にも異常は見られず、解剖をしても異常は認められなかった。
2.変異原生試験
ポリマー8を試料として用い、労働安全衛生法における変異原性試験に準拠して行った。試験菌株は、ネズミチフス菌がTA1535、TA100、TA1537、TA98、大腸菌はWP2uvrAを用いた。結果は陰性であった。また、この濃度で更に、5菌株に対して行った復帰突然変異試験でも変異原性は陰性であった。
3.皮膚刺激性試験
ポリマー8を含む加工剤Aを用いて試験を行った。「ウサギにおける生体材料の一時皮膚過敏症試験に関する標準実施基準ASTM F719-81-1996」に準じた方法で行った。PII 値が2.00(弱刺激)未満であった。
4.皮膚感作性試験
ポリマー8を用い、「医療機器の生物学的安全性評価のための試験方法について」(厚生労働省、発翰番号事務連絡医療機器審査No.36)に準じ、モルモットを用いたマキシミゼーション法により実施した。感作率は0%であった。
Claims (22)
- 下記式(1)
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle、Leu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6はArg又はLysであり、X7はArg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)
で表される反復単位、ならびに、
下記式(2)および(3)
で表される反復単位のうちの少なくとも一つ、
を含む抗菌性ペプチド含有ポリマー。 - 前記式(1)の−W−Peptideが、以下に表される式:
(ここで、Peptideは前記と同じである。),
からなる群から選ばれ、かつ、
前記式(2)の−W1が、以下に表される式(31)〜(38):
からなる群から選ばれる、請求項1に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。 - 前記スペーサーVが、重量平均分子量が50〜1000の置換基を有してもよい直鎖又は分岐状のポリエチレングリコール、又は分子量が10〜500の置換基を有してもよい直鎖又は分岐状のアルキレン鎖、或いはそれらの組合せである、請求項1〜4のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
- 下記式(1)、(2)及び(3)
式(1)中、U1がOで、−V−W−Peptideが、−PEG−S−Cys−Peptide(ここで、PEGは、重量平均分子量が10〜2000のポリエチレングリコールである。)又は-CH2CHOHCH2−S-Cys-Peptide、又は、U1がNHで、−V−W−Peptideが、-Peptide、−(CH2)3−S−Cys−Peptide、−CH2−(C2H4O)3−C3H6−NH−COCH2−S−Cys−Peptide、及び下記式:
式(3)中、U3がOで、−Y−Hが、−(CH2)11−CH3、又は−PEG−R3(ここで、PEGは、重量平均分子量が10〜2000のポリエチレングリコールであり、R3はOH又はCH3である。)、又はU3がNHで、−Yが単結合である、請求項1に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。 - 前記ポリマー中に、前記Peptide含有単位を1〜100モル%の割合で含有する請求項1〜7のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
- 前記ポリマー中に、前記Peptide含有単位を、0.4〜20モル%の割合で含有する請求項8に記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。
- 前記ペプチドが、
−HN−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−CONH2、−HN−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CONH2、−HN−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CONH2、−NH−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Val−Arg−Arg−Arg−CONH2、−HN−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CONH2、H2N−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Ile−Arg−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Ile−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Tyr−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Arg−Leu−Arg−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CO−、H2N−Ala−Leu−Tyr−Leu−Ala−Val−Arg−Arg−Arg−CO−、及びH2N−Arg−Leu−Leu−Leu−Arg−Val−Gly−Arg−Arg−CO−からなる群より選ばれるペプチドである請求項1〜9のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマー。 - 請求項1〜10のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマーが繊維上にコーティングされた抗菌性繊維。
- 前記抗菌性ペプチド含有ポリマーが、ペプチド存在量で、布1cm2あたり0.001μモル以上0.3μモル以下存在する、請求項11に記載の抗菌性繊維。
- 医療用用途またはサニタリー用途における請求項11または12に記載の抗菌性繊維の使用。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマーを繊維上にコーティングすることにより、抗菌性ペプチドを繊維に固定化する方法。
- 下記式(1)
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH 2 、又はH 2 N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle、Leu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6はArg又はLysであり、X7はArg又はLysである。ここで、Arg−CONH 2 又はLys−CONH 2 は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)
で表される反復単位を含む抗菌性ペプチド含有ポリマーを含有するポリマーエマルジョン。 - 請求項1〜10のいずれかに記載の抗菌性ペプチド含有ポリマーを含有するポリマーエマルジョン。
- 下記式(9)
で表される反復単位を含むポリマーに、下記式(10):
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基を有する分子量50〜500の分子である。)
で表されるペプチド又はその誘導体を反応させることにより、抗菌性ペプチド含有ポリマーを作製する方法。 - 下記式(9)および(3)
で表される反復単位を含むポリマーに、下記式(10):
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基を有する分子量50〜500の分子である。)
で表されるペプチド又はその誘導体を反応させることにより、抗菌性ペプチド含有ポリマーを作製する方法。 - 以下の工程:
工程(1):下記式(9)
で表される反復単位を含むポリマーを含む溶液を繊維にコーティングする工程、及び
工程(2):下記式:
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基を有する分子量50〜500の分子である。)
で表される抗菌性ペプチド又はその誘導体を含む溶液に、前記ポリマー溶液をコーティングした繊維を浸漬する工程、及び
工程(3):1〜10時間放置することによりポリマーにペプチドを結合させた後、該繊維を洗浄して未反応のペプチド又はその誘導体を除去するする工程、
からなる抗菌性繊維の製造方法。 - 以下の工程:
工程(1):下記式(9)および(3)
で表される反復単位を含むポリマーを含む溶液を繊維にコーティングする工程、及び
工程(2):下記式:
−NH−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CONH2、又はH2N−X1−Leu−X2−Leu−X3−X4−X5−X6−X7−CO−(式中、X1はArg又はAlaであり、X2はTyr、Arg又はLeuであり、X3はArg又はAlaであり、X4はIle又はLeu又はValであり、X5はGly又はArgであり、X6は、Arg又はLysであり、X7は、Arg又はLysである。ここで、Arg−CONH2又はLys−CONH2は、Arg又はLysのカルボキシル基がアミド化していることを示す。)より選ばれる抗菌活性を有するペプチドである。)より選ばれ、Zは、水素原子、水酸基、Cys又はWoと反応しリンカーを形成する官能基を有する分子量50〜500の分子である。)
で表される抗菌性ペプチド又はその誘導体を含む溶液に、前記ポリマー溶液をコーティングした繊維を浸漬する工程、及び
工程(3):1〜10時間放置することによりポリマーにペプチドを結合させた後、該繊維を洗浄して未反応のペプチド又はその誘導体を除去するする工程、
からなる抗菌性繊維の製造方法。
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