JP3546231B2

JP3546231B2 - 新規ペプチド、及び該ペプチドを用いた組成物

Info

Publication number: JP3546231B2
Application number: JP2000374207A
Authority: JP
Inventors: 浩樹二川
Original assignee: 広島大学長
Priority date: 2000-12-08
Filing date: 2000-12-08
Publication date: 2004-07-21
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: JP2002179699A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なペプチドに関し、特に、殺菌及び／又は発育阻止作用を有する、新規なペプチド及び該ペプチドを用いた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトに病原性を有する真菌の多くは二相性であり、即ち、環境条件に応じて酵母形と、菌糸形の両者を取り得る。一部は二相性でないものもある。酵母形は卵円形の単細胞の状態であり、出芽により分裂増殖する。菌糸形は、円筒形の細胞が縦に連なったり、あるいは多核性の1個の細胞が長く延びて菌糸と呼ばれる糸状の構造が枝分かれした状態を示すものである。
【０００３】
このような真菌として、カンジダ、クリプトコッカス、アスペルギルスなどを挙げることができる。カンジダは、正常人の口腔咽頭、消化器などに常在するし、クリプトコッカスは、はとやネズミなどの糞、土の中などに多く含まれるほか、室内のごとき湿気の多い場所に多く存在し、空気に運ばれて人と接触している。アスペルギルスも昔から鳥の糞や土の中などに見つかっているが、最近では病院内のエアコンダクト、フィルタなどに多く見つかっている。これらの真菌は、正常人に対する感染能力は低いが、感染すると外毒素、内毒素、プロテアーゼなどの組織破壊物質を放出する。これらの真菌の多くは、抗癌剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、広域抗生剤などの投与を受けている患者に発生し、日和見感染としての性格を有している。正常人ではこれら真菌に対して細胞性免疫が十分に働き、感染防御に役立っているが、上記患者ではそれが低下しているために感染を許すことになる。特に、悪性疾患患者、臓器移植患者あるいは集中治療室で治療を受ける患者等では深在性カンジダ症をはじめとする深在性真菌症あるいはカンジダ血症などを招き、重篤な転記をとることが多い。
【０００４】
このような真菌によって引き起こされる真菌症の治療薬としては、ポリエン系のアンホテリシンBが知られている。また、フルシトシン、イミダゾール系のケトコナゾール、ミコナゾールなどの抗真菌剤も知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの抗真菌剤は、用量依存的な腎毒性などの副作用が強いという問題点がある。特に、カンジダなどの真菌のエルゴステロールに作用起点を持つ抗真菌剤があり、該抗真菌剤が生体細胞膜のコレステロールなどのステロール類と類似しているために、副作用を生じるという問題がある。また、臓器機能の低下した患者に対しては、抗真菌剤の正常細胞に及ぼす影響が大きすぎて、従来の抗真菌剤の使用が困難である。また、特に、non‐albicans カンジダ属による感染には、抗真菌剤の効果が非常に低いことが報告されている。さらに、アズール系の抗真菌剤に対する耐性機構が存在する耐性菌が存在することが明らかとなった。したがって、臓器機能の低下した患者に対しても、副作用が問題とならず、かつ有効に抗菌効果を奏する抗真菌剤があれば望ましい。しかし、このような抗真菌剤はこれまで知られていない。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、臓器機能の低下した患者に対しても、副作用が問題とならず、かつ有効に抗菌効果を奏するような作用を有するペプチドを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、生体や牛乳に存在する抗菌性ペプチドを鋭意研究した結果、抗真菌剤として有力な機能を有する新規ぺプチドを見出した。
【０００８】
本発明の新規ペプチドは、Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrからなることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の組成物は、Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrからなる新規ペプチドを、殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物として有効量含有することを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の組成物の好ましい実施態様としては、前記殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物が、抗真菌剤であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の組成物の好ましい実施態様としては、前記殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物が、洗浄剤であることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の組成物の好ましい実施態様としては、前記殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物が、薬剤であることを特徴とする。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の新規ペプチドは、Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrからなるペプチドであり、ペプチド合成法などの常套手段を用いて製造することができる。上記でいうLysはリシン、Argはアルギニン、Leuはロイシン、Pheはフェニルアラニン、Serはセリン、Metはメチオニン、Tyrはチロシンを示す。本発明の新規ペプチドは、殺菌及び／又は発育阻止作用を有する。
【００１４】
本発明のペプチドは、ぺプチド合成法で取得することができる。ペプチド合成には、液相法及び固相法が存在するが、本発明のペプチドは、液相法及び固相法のいずれの方法も使用することができる。
【００１５】
液相法は、反応を溶液状態で行い反応混合物から生成物を単離精製し、この生成物を中間体として次のペプチド伸長反応に用いる方法である。一方、固相法は、反応溶媒に不溶の固相担体にアミノ酸を結合させ、このアミノ酸に準じ縮合反応を行いペプチド鎖を伸長させていく方法である。
【００１６】
ペプチドの化学合成は、カルボキシル基を保護したアミノ酸にアミノ基を保護したアミノ酸を脱水縮合させ、ペプチド結合を形成させ、次にアミノ保護基を除去後、遊離したアミノ基に次のアミノ基保護アミノ酸を順次、C末端からN末端に向かって一つずつ延長していく方法が基本である。脱水縮合反応では、カルボキシル基を活性化して、結合させようとするアミノ基と反応させる。この活性化には、ジシクロへキシカルボジイミド(DCC)法、活性エステル法、酸無水物法、アジド法等があるがその反応性の高さとラセミ化その他の副反応を考慮して選ばれる。縮合反応時の副反応を防止するためにアミノ酸のアミノ基、カルボキシル基、側鎖(R)の官能基には保護基が導入される。これらの保護基は、縮合反応の条件で安定であり、必要なときには速やかに除去されるものが好ましい。また、アミノ基の保護基とカルボキシル基の保護基とは互いに選択的に除去されることが好ましい。
【００１７】
アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル(Bz)、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、p-ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)等が挙げられる。カルボキシ基の保護基としては、たとえばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられる。但し、固相法の場合は、C末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、P−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下、あるいはN−保護アミノ酸活性エステル又はペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１８】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相の場合はさらにペプチドのC末端と樹脂との結合を切断する。さらに、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
【００１９】
合成したペプチドは、エドマン分解法でC-末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、GC−MS等で分析される。
【００２０】
次に、本発明を組成物として用いる場合について説明する。即ち、本発明の新規ペプチドは、その作用から殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物として使用することができる。本発明の組成物は、Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrからなる新規ペプチドを、殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物として有効量含有する。
【００２１】
本発明の組成物を薬剤として使用する場合には、本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。本発明のペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、血液量が成人で約5Lと仮定すると、通常1回１〜１０mg／kg、好ましくは、５〜１０mg／kgを1日当たり１回〜複数回(約５〜７回)である。本発明のペプチドを含有する組成物は、製剤用担体と結合して調整した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００２２】
具体的には、たとえば、乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、でん粉、ショ糖、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軟質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ろう、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００２３】
剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、適用に際して、水又は他の適当な溶媒に溶解又は懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤を、周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２４】
これらの製剤に対して、本発明のペプチドを０．００１〜０．０１％、好ましくは、０．００５〜０．０１％の割合で含有させることができる。かかる範囲としたのは、０．００１未満とする本発明のペプチドの効果を得られない場合があり、０．０２以上では、溶血が起こらないからである。
【００２５】
次に、本発明の組成物を抗真菌剤として使用する場合について説明する。抗真菌剤としての他の用途としては、抗菌性コンタクトレンズ、洗浄剤、抗かび剤、うがい薬などを挙げることができる。
【００２６】
例えば、本発明のペプチドを洗浄剤、抗かび剤等の抗真菌剤として使用する場合には、洗浄する対象の医療機器、真菌による汚染の程度等により、本発明のペプチドの最適量が異なる。洗浄剤などに添加して使用する場合、洗浄剤中に含まれる本発明のペプチドの濃度を、0.1〜10μMの範囲とすることができる。このような低濃度であっても十分抗菌効果を発揮することができるからである。本発明のペプチドの濃度は、好ましくは、0.3〜5μMの範囲であり、更に好ましくは、0.6〜2.5μMの範囲である。もっとも、この範囲に特に限定されることはない。なぜなら、本発明のペプチドの作用機序から、生体内での体液などと等張の溶液中では作用がなくなるため、生細胞に対して安全性を維持することができるからである。
【００２７】
うがい薬に関しても、うがい薬中に含まれる本発明のペプチドの濃度を、0.1〜10μMの範囲とすることができる。このような低濃度であっても十分抗菌効果を発揮することができるからである。本発明のペプチドの濃度は、好ましくは、0.3〜5μMの範囲であり、更に好ましくは、0.6〜2.5μMの範囲である。
【００２８】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の趣旨を逸脱することなく、本発明を適宜変更して実施することが可能である。
【００２９】
実施例１
本発明者等は、まず、抗菌性ペプチドとして知られているラクトフェリシンＢに着目した。ラクトフェリシンＢは、大腸菌、黄色ブドウ球菌、クロストリジウム菌に対して抗菌性を有するのに、人体に良性のビフィズス菌に対しては抗菌性を有しない。
【００３０】
一方、最近開発されたDhvar４という人工の抗菌性ペプチドについても着目した。その結果、Dhvar4の抗菌性ペプチドのアミノ酸配列と類似性を有する部分を、ラクトフェリシンB中に見出した。この類似する部分は、アミノ酸が一致しているわけではないが、性質の似たアミノ酸が繰り返し現れることに着目した。
【００３１】
そして、性質の似たアミノ酸をペプチド合成法により、実際にペプチドを合成した。ペプチド合成は、常法のアミノ酸合成法により、島津製のペプチドシンセサイザーを使って行った。
【００３２】
合成したペプチドは、Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrであった。本ペプチドの抗菌効果を確認するために、カンジダに対する抗菌作用を調べた。カンジダの菌株は、イギリスのグラスゴーデンホスピタルによって、患者の口腔内から分離されたものを供与された。このカンジダ菌を対象として、本ペプチドの抗菌効果を調べた。
【００３３】
結果を図１に示す。図の縦軸は、代表的なカンジダ菌の致死率を示す。横軸は、本ペプチドの濃度を示す。図１から明らかなように、本ペプチドは、0.63μMという非常に低濃度で70％の致死率を示した。さらに、1.25μMで92％の致死率を示し、2.5μＭで100％の致死率を示した。
【００３４】
これに対して、既存の物質であるHST-5（ヒスタチン５）では、0-50μMの範囲で100％の致死率を得られなかった。
【００３５】
これらの結果から、本発明のペプチドは、低濃度でさえも、真菌に対して優れた抗菌効果を有することが分かる。
【００３６】
実施例２
次に、本発明を義歯洗浄剤として用いた場合の効果を調べた。1.5μM、2μM及び2.5μMの濃度の本発明のペプチドを、市販の洗浄剤に添加して洗浄後の義歯の抗菌効果を調べた。
その結果、いずれの濃度においても、良好な抗真菌効果を示した。
【００３７】
実施例３
次に、抗真菌剤の濃度と溶血率との関係について、本発明のペプチドと他の抗真菌剤との比較を行った。
【００３８】
まず、等張溶液中で種々の濃度のペプチドと赤血球を混ぜ、2時間37℃にてインキュベーションして、上清中に出てくるヘモグロビンの量を測定した。赤血球は、0型の25歳健常男性より採取した新鮮血である。
【００３９】
結果を図２に示す。図２中、縦軸は溶血率を、横軸は各組成物及び抗菌剤の濃度を示す。Hist 5（ヒスタチン５）、及びAmpho B（アンホテリシンB）は既存の抗真菌剤を示す。
【００４０】
通常、経口投与を考えた場合、体表若しくは、種々の組織の表面の抗真菌剤の影響が問題となる。また、血中投与した場合も同様に血管の抗真菌剤の影響が問題となる。ところが、これらの体表若しくは種々の組織の表面は、何らかの上皮細胞で覆われており、血管内は、血管上皮細胞で覆われている。このような上皮細胞は、外来物質に対して特殊な性質（角化や錯角化の重層）でバリアーとして作用するので、上皮細胞の抗真菌剤に対する耐性を調べる必要がある。
【００４１】
赤血球は、裸の細胞であり、このような上皮細胞と比較すると非常に脆弱な細胞である。したがって、赤血球に対して為害作用がないことは、他の組織細胞に対しても安全であるといえる。
【００４２】
図2に示すように、抗真菌剤の濃度と溶血率との関係について、本発明のペプチドと他の抗真菌剤との比較を行った結果、本発明のペプチドにおいては、赤血球の溶血が起こらず、生体内で十分に安定で、安全に使用できることが分かる。また、本ペプチドが血中に移行した場合でも溶血反応が引き起こされることなく安全に使用できると考えられる。
【００４３】
【発明の効果】
本発明の新規ペプチドによれば、真菌に対して非常に低濃度で致死的効果を与える一方で、このような低濃度では、生細胞に対して影響がないという有利な効果を奏する。
【００４４】
配列表
出願人氏名：
発明の名称：新規ペプチド、及び当該ペプチドを用いた組成物
配列の数：
配列の数：
配列の長さ：
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：ペプチド
起源：牛乳

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のペプチドと従来の抗真菌剤との抗菌作用を示す図である。
【図２】図２は、抗真菌剤の濃度と溶血率との関係について、本発明のペプチドと他の抗真菌剤との比較を示す図である。

Claims

Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrからなる新規ペプチド。
Lys-Arg-Leu-Phe-Arg-Arg-Leu-Leu-Phe-Ser-Met-Lys-Lys-Tyrからなる新規ペプチドを、殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物として有効量含有することを特徴とする組成物。
前記殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物が、抗真菌剤である請求項2記載の組成物。
前記殺菌及び／又は発育阻止作用を有する組成物が、洗浄剤である請求項２記載の組成物。