KR20090092752A - 말라리아 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리포단백질 입자, 상기 입자를 제조 및 정제하는 방법, 의약으로서 이의 용도, 특히 말라리아 감염증의 예방에 있어서의 이의 용도, 상기 입자 또는 상기 단백질 입자에 대한 항체, 예컨대 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 함유한 조성물/백신 및 이의 용도, 특히 치료법에서의 이의 용도와 관련이 있다. 특히, 본 발명은 다음 단량체를 포함하는 면역원성 단백질 입자와 관련이 있다: a. 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질과 B형 간염바이러스의 S 항원에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(CSV-S), b. 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질 및 B형 간염바이러스의 S 항원에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(RTS), 및 c. 선택적으로 B형 간염바이러스에서 유래된 S 항원.
Description
본 발명은 신규한 리포단백질 입자, 상기 입자를 제조 및 정제하는 방법, 의약으로서 이의 용도, 특히 말라리아 감염증(infections)의 예방에 있어서의 이의 용도, 상기 단백질 또는 상기 단백질 입자에 대한 항체, 예컨대 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 함유한 조성물/백신 및 이의 용도, 특히 치료법에서의 이의 용도와 관련이 있다.
말라리아는 전세계의 주요한 건강 문제 중 하나인데, 이 질병으로 매년 2 내지 4백만 명 이상의 사람들이 사망하고 있다. 이 질병의 가장 만연한 형태 중의 하나는 원생생물 기생충 삼일열원충(P. vivax)에 의해 유발되는데, 상기 삼일열원충은 열대 및 아열대 지역에서 발견된다. 흥미롭게도, 이 기생충은 섭씨 15도 정도의 낮은 온도에서 이의 모기 주기(mosquito cycle)를 완성할 수 있는데, 모기는 온화한 기후에서 이 질병을 퍼트린다.
이 질병의 가장 급성 형태 중 하나는 원생생물 기생충인 열대열원충(Plasmodium falciparum)에 의해 유발되며 상기 기생충은 말라리아로 인한 대부분의 사망에 관여한다.
플라스모디움(Plasmodium)의 생활 주기(life cycle)는 복잡하며, 이의 완성을 위해 2가지 숙주, 인간과 모기를 필요로 한다. 인간에 대한 감염은 감염된 모기의 타액내 종충(sporozoites)의 도입으로 개시된다. 이 종충은 간으로 이동하고 간세포에 감염되는데, 여기서 이들은, 적혈구외 세포내 단계(exoerythrocytic intracellular stage)를 통해, 낭충(merozoite) 단계로 분화되며, 이 낭충 단계에서 적혈구 세포(RBC)를 감염시켜 무성생식 혈액 단계에서 주기적 복제를 개시한다. RBC내 수많은 종충이 유성생식 단계 생식모세포(gametocytes)로 분화됨으로써 상기 주기가 완성되는데, 상기 생식모세포는 모기에 의해 섭취되며, 이들 생식모세포는 중장(midgut)내에서 일련의 단계를 거쳐 침샘으로 이동하는 종충을 생산하게 된다.
삼일열원충(P. vivax)에 의해 유발되는 질병이 거의 치명적이지 않다는 사실로 인해, 말라리아를 예방 및 치료하려는 노력은 열대열원충(P. falciparum)에 의해 유발된 더욱더 치명적인 형태의 질병에 집중되어 왔다.
삼일열원충(P. vivax)에 의해 유발된 질병이 일반적으로 환자의 사망을 초래하지는 아니할지라도, 증가 일로에 있는 것으로 생각되는, 환자의 규모, 환자의 삶의 질에 대한 심각한 손상, 빈혈과 사망을 초래하는 질병의 심각한 발병률에 대한 보고의 증가, 및 경제적 손실로 인해, 이 질병에 대한 효과적인 예방접종(vaccination)이 여전히 요구된다. 또한, 이 질병의 두 가지 원인에 대한 예방을 제공할 수 있는 단일 백신이 유익할 것이다.
삼일열원충(P. vivax)의 특징은 일부 종들이 말초 순환 내에 출현하여 임상 증상을 나타내기 전에 간(liver) 내에서 잠복기를 유지함으로써 지연된 감염을 유발할 수 있다는 것이다. 따라서, 예를 들어, 감염 지역을 통과하여 여행할 때, 개체들은 감염될 수 있으나 수개월 동안 증상을 나타내지 아니할 수 있다. 이것은 질병의 전파를 초래할 수 있는 잠재력을 지니며, 이러한 이유로 감염 지역을 여행한 사람들은 상기 감염 지역을 여행한 후, 규정된 기간 동안 수혈용 혈액을 제공하는 것이 허용되지 않는다.
삼일열원충(P. vivax) 말라리아 감염은 이 기생충이 전-적혈구성(pre-erthrocytic) 무성생식(shizogony)을 겪는 동안 간 내부에서 잠복 상태로 유지된다. 간을 벗어나기 전에, 상기 단계에서 이 기생충이 조절되는 경우, 환자에서 질병의 임상 증상은 관찰되지 아니한다.
플라스모디움(Plasmodium)의 종충 단계는 말라리아 백신의 잠재적 표적으로서 확인되었다. 불활성화된(방사선 조사된) 종충을 이용한 예방접종은 실험 인간 말라리아에 대한 예방을 유도하는 것으로 드러났다(Am. J. Trop. Med. Hyg 24: 297-402, 1975). 그러나, 방사선 조사된 종충을 이용하는, 이러한 방법에 기초하여 대중을 위한 말라리아 백신을 제조하는 것은 실제적으로 또한 논리적으로 불가능하다.
종충의 주요 표면 단백질은 포자소체(circumsporozoite) 단백질(CS 단백질)로 알려져 있다. 상기 단백질은 모기에 의한 초기 접종 부위에서 순환으로 종충의 통과가 진행되는 동안 종충의 운동성 및 침입(invasion)에 관여하는 것으로 생각되며, 여기서 상기 종충은 간으로 이동한다.
플라스모디아(Plasmodia) 균주(strain)의 CS 단백질은 비-반복성 아미노(N-말단) 및 카르복시(C-말단) 단편이 플랭킹(flanking)되어 있는 중심부(central) 반복 도메인(반복부 영역)에 의해 특징지어진다. 삼일열원충(P. vivax)의 중심부 도메인은 일반적으로 9개의 탠덤(tandem) 아미노산으로 구성된, 반복 단위의 수개의 블록으로 이루어져 있다.
특정 아시아 균주에서, 중심부 반복 영역 다음에, 대략 12개 아미노산의 추가 서열이 존재한다(서열번호 11 참조). 상기 추가 서열의 기능은 알려져 있지 않다. 그러나, 일부에 의해, 비록 조사가 이루어진 것은 아니지만, 상기 아미노산이 질병의 임상적 증상의 지연된 발병과 연관되어 있을 것으로 가정되고 있다. N-말단은 영역 I로 공지된 5개 아미노산의 서열에 의해 특징지워진다고 여겨지고 있다(서열번호 1 참조). 또한 C-말단은 영역 II로 공지된 18개 아미노산의 서열을 포함함으로써 특징지워지는 것으로 생각되고 있다. C-말단은 세포-부착 모티프를 함유하는데, 이 모티프는 모든 말라리아 CS 단백질에서 고도로 보존되어 있다(서열번호 2 참조).
몇몇 그룹은 포자소체 단백질에 기초한 소단위체 백신을 제안하였다. 이러한 백신들 중 2개의 백신에 대해 임상 시험이 진행되었다; 한 백신은 합성 펩티드이고, 다른 한 백신은 재조합 단백질이다(Ballou et al Lancet: i 1277 (1987) 및 Herrington et al Nature 328:257 (1987)). 이러한 백신은 항-종충 반응을 성공적으로 자극시켰다. 그럼에도 불구하고, 반응의 규모는 실망스러웠는데, 일부 백신은 전혀 반응을 나타내지 아니하였다. 더욱이, 후속 주입후 항체 수준의 "부스팅(boosting)" 부재 및 시험관내 림프구 증식 검정 결과는 이러한 자원자 대부분의 T-세포가 면역-우성 반복부(immuno-dominant repeat)를 인지하지 못하였음을 제시한다. 그럼에도 불구하고, 각 연구에서 예방접종된 한 자원자에서는 기생충병이 발병되지 아니하였다.
WO 93/10152호 및 WO 98/05355호는 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질에서 유래된 백신에 대해 기재하고 있으며 상기 특허공개공보에 기재된 접근법을 이용한 열대열원충(P. falciparum)에 대한 예방접종에서 일부 진척이 있는 것으로 생각된다(문헌[Heppner et al. 2005, Vaccine 23, 2243-50]도 참조하라).
열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질은 보존된 중심부(central) 반복 영역을 지닌다. 대조적으로, 적어도 2가지 형태(VK210 또는 타입 I 및 VK247 또는 타입 II로 지정됨)의 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질이 공지되어 있다. 이것은, 타입 I의 중심 반복 영역으로 유도되는 항체가 반드시 타입 II의 상응하는 영역의 에피토프를 인지하는 것은 아니며 반대의 경우도 그러하기 때문에, 특이적인 CS 단백질 유형에 관계없이 삼일열원충(P. vivax)에 대한 일반적인 보호를 제공하는, 면역원성(immogenicity)과 같은 모든 요망되는 특성을 지닌 CS 단백질의 작제물을 식별하는 것을 더 어렵게 만든다.
재조합 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질이 발현되었으며 1980-1990년대의 백신으로 시험되었으며 제한적인 성공을 거두었다(Collins et al, 1989. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40, 455-64). 일부 연구는 교차-결합된 하나 이상의 에피토프를 이용한 복수 항원 펩티드(Multiple Antigen Peptides; MAPs)에 기초한 백신 개발을 수행하였다(Nardelli and Tarn, 1995, Pharm. Biotechnol. 6, 803-19).
도면
도 1 효모 에피솜 벡터인 pRIT15546에 관한 플라스미드 개열지도.
도 2 B형 간염바이러스로부터의 S 항원과 요망되는 항원의
"융합(fusing)"시 사용된 GSK에 의해 제조된 플라스미드
pGF1-S2의 플라스미드 개열지도. SmaI 부위 사이에 이종성 DNA
서열의 클로닝(12bp SmaI DNA 단편의 절단후)은 S 유전자와
인-프레임(in-frame) 융합을 생성시킨다.
도 3 pRIT15582의 플라스미드 개열지도
XhoI 절단은 CSV-S 발현 카세트와 함께 LEU2 선별 마커를
지니는 8.5kb 선형 DNA 단편을 생성(liberation)시키며,
이 단편은 효모 염색체내로의 삽입에 사용된다.
도 4 CSV-S 카세트를 통합시키는데 사용된 선형 XhoI 단편의
제한효소 지도
도 5 Y1835 균주(strain)에서 발현된 재조합 단백질의 웨스턴 블랏.
패널 A: 항-S 항체에 의해 드러난 WB.
로딩된 샘플(총 단백질 lOOμg/웰):
1: Y1631(RTS,S 생산 균주, 대조군)
2: Y1835
3: Y1835
4: Y1834
패널 B: 항-CSV 항체에 의해 드러난 WB.
로딩된 샘플(총 단백질 lOOμg/웰):
1: Y1631(RTS,S 생산 균주, 대조군)
2: Y1295
3: Y1835
4: Y1834
5: nr(또 다른 작제물 CSV-S)
6: nr(또 다른 작제물-S 항원 만)
도 6 Y1835 균주에서 생산된 CSV-S,S 혼합 입자에 대한
전자 현미경사진.
CSV-S,S 입자를 가용성 세포 추출물에서 정제하고(RTS,S 정제
방법에 기초함) 이를 전자 현미경으로 분석하였다. 입자를
포스포퉁스트산(phosphotungstic acid)으로 네가티브 염색후
촬영(visulalization)하였다. 스케일은 1OOnm에 상당한다.
도 7 Y1845 균주에서 발현된 재조합 단백질에 대한 웨스턴 블랏.
항-S 항체에 의해 드러난 WB.
로딩된 총 단백질 양은 괄호안에 제시되어 있다.
l: Y1835(100μg)
2: Y1631(lOOμg - RTS,S 생산 균주, 대조군)
3: Y1845(100μg)
4: Y1845(50μg)
5: Y1845(25μg)
도 8 Y1845 균주에서 제조된 무세포 추출물에 대한 CsCl 밀도 분석.
따라서, 본 발명에 이용되는 융합 단백질 CSV-S는 하기를 포함한다: 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질(CSV)에서 유래된 부분. 이 CSV 항원은 삼일열원충(P. vivax)의 타입 I CS 단백질로 발견된 것과 같은 천연 단백질 및/또는 삼일열원충(P. vivax)의 타입 II 단백질로 발견된 것과 같은 천연 단백질일 수 있다. 달리, CSV 단백질은 상기 타입 I과 타입 II CS 단백질로부터의 엘리먼트(elements)를 포함하는 하이브리드 단백질 또는 키메라 단백질일 수 있다. 상기 하이브리드 단백질 또는 키메라 단백질이 S 항원에 융합된 경우, 이것은 본원에서 하이브리드 융합 단백질로 지칭될 것이다.
CSV-S는 본원에서 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질로부터의 서열/단편 및 B형 간염바이러스의 S-항원으로부터의 서열/단편을 포함하는 융합 단백질을 포괄하기 위한 포괄적 용어로서 사용된다.
RTS는 본원에서 본원에서 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질로부터의 서열/단편 및 B형 간염바이러스의 S-항원으로부터의 서열/단편을 포함하는 융합 단백질을 포괄하기 위한 포괄적 용어로서 사용된다.
하이브리드/키메라 단백질은 일반적으로 다음 성분들을 포함할 것이다: 삼일열원충(P. vivax)의 타입 I 포자소체 단백질의 중심 반복 부분(section)에서 유래된 하나 이상의 반복 단위, 및 삼일열원충(P. vivax)의 타입 II 포자소체 단백질의 중심부 반복 부분에서 유래된 하나 이상의 반복 단위.
일반적으로 하이브리드 단백질은 또한 삼일열원충(P. vivax)과 같은 플라스모디움(Plasmodium)의 CS 단백질로부터의 N-말단 단편, 예를 들어, 서열번호 1로 제시된 아미노산과 같은 영역 I을 포함하는 단편을 함유할 것이다.
일반적으로 하이브리드 단백질은 또한 삼일열원충(P. vivax)과 같은 플라스모디움(Plasmodium)의 CS 단백질로부터의 C-말단 단편, 예를 들어, 서열번호 2로 제시된 모티프와 같은 영역 II를 포함하는 단편을 함유할 것이다.
이론에 의해 국한하려는 의도는 아니지만, N 및 C 말단 단편은 수개의 T 및 B 세포 에피토프를 포함하고 있는 것으로 생각된다.
본 발명에 사용될 수 있는 삼일열원충(P. vivax)의 임의의 적당한 균주는 하기 균주를 포함한다: 라틴 아메리카(Latina, America)(즉, Sal 1, Belem), 한국, 중국, 태국, 인도네시아, 인도, 및 베트남. 서열번호 13의 작제물은 한국 균주(보다 더 구체적으로 남한 균주)에 기초한 것이다.
타입 I CS 단백질을 지니는 삼일열원충(P. vivax)은 타입 II CS 단백질을 지니는 삼일열원충(P. vivax)보다 더 널리 퍼져있다. 따라서, 한 양상에서, 본 발명은 타입 I으로부터의 CS 단백질을 이용한다. 대안적 양상에서, 본 발명은 타입 I으로부터의 반복 단위 및 타입 II로부터의 반복 단위를 포함하는 하이브리드 단백질을 제공한다. 예를 들어, 타입 I으로부터의 반복 단위가 타입 II의 반복 단위보다 하이브리드내에 더 많이 포함된다.
보다 구체적으로 본 발명의 하이브리드 단백질은 1 내지 15개의 반복 단위, 예컨대 타입 I으로부터의 9개의 반복 단위를 포함할 수 있다.
타입 I CS 단백질으로부터의 적당한 반복 단위의 예는 서열번호 3 내지 9로 제시된다.
한 구체예에서, 본 발명은 서열번호 3 내지 9에 나열된 각각의 반복 단위들 중 어느 하나와 같이, 타입 I의 상이한 반복 단위들의 혼합물을 지니는 하이브리드를 제공한다.
하나 이상의 반복 단위들이 하이브리드내에서 중복될 수 있는데, 예를 들어, 서열번호 3 및/또는 4의 2개의 반복 단위가 작제물에 통합될 수 있다.
a) 한 양상에서 CS 단백질은 서열번호 3의 단위를 포함한다.
b) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a)에 기재된 것과 같은 단위와 조합되거나 비조합된, 서열번호 4의 단위를 포함한다.
c) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 또는 b)에 기재된 것과 같은 단위들과 조합되거나 비조합된, 서열번호 5의 단위를 포함한다.
d) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 c)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, 서열번호 6의 단위를 포함한다.
f) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 d)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, 서열번호 7의 단위를 포함한다.
g) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 f)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, 서열번호 8의 단위를 포함한다.
h) 한 양상에서 CS 단백질은 바로 위의 단락 a) 내지 g)에 기재된 것과 같은 하나 이상의 단위들과 조합되거나 비조합된, 서열번호 9의 단위를 포함한다.
타입 II CS 단백질로부터의 적당한 반복 단위 구성성분의 예는 서열번호 10 및 14(예컨대 10)로 제시된다.
본 발명의 한 양상에서 타입 II에서 유래된 5개 이하의 반복 단위(예를 들어, 서열번호 10으로 제시된 것과 같은, 1개의 반복단위)를 지니는 하이브리드 단백질이 제공된다.
하이브리드는, 예를 들어, 서열번호 11로 제시된 것과 같은, 삼일열원충(P. vivax)의 특정 아시아 균주에서 발견된 반복 영역의 말단에서 확인된 12개의 아미노산 삽입을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 하이브리드 단백질은 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질에서 유래된 약 257개의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 CSV 유래 항원 성분은 일반적으로 S 단백질의 아미노 말단에 융합된다.
B형 간염바이러스로부터의 표면 항원의 존재가 CS 단백질 부분의 면역원성을 부스팅(boosting)하고, 단백질의 안정성에 도움이 되고/거나 단백질의 재생산가능한(reproducible) 제조를 보조한다고 여겨진다.
한 구체예에서, 하이브리드 융합 단백질은 약 494개의 아미노산을 포함하며, 상기 아미노산들 중, 257개는, 예를 들어, 삼일열원충(P. vivax) CS 단백질에서 유래된 아미노산이다.
하이브리드 융합 단백질은 또한 추가로 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래한 항원를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 여기서 상기 항원은 DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA1 및 RBP 또는 이의 단편 중에서 선택된다.
다른 일예로, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 PfEMP-1, Pfs 16 항원, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-1 및 TRAP을 포함한다. 다른 플라스모디움(Plasmodium) 항원은 열대열원충(P. falciparum) EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시퀘스트린(Sequestrin), Pf332, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 및 기타 플라스모디움종(Plasmodium spp.)내의 이들의 유사체(analogues)를 포함한다.
한 구체예에서, 하이브리드 융합 단백질(CSV-S)은 서열번호 17로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열에서, 위치 6 내지 262의 아미노산은 CSV에서 유래된 것이고 위치 269 내지 494의 아미노산은 S에서 유래된 것이다. 나머지 아미노산들은 유전자 작제물로서 도입된다(특히, 이들은 적절하게 변형될 수 있다). 이러한 아미노산 4개(Met, Met, Ala, Pro)는 구체적으로 플라스미드 pGF1-S2에서 유래된다(도 4 참조).
서열번호 17의 CSV-S 융합 단백질의 특성은 하기 표에 제시된다.
서열번호 17의 단백질에 대한 뉴클레오티드 서열은 서열번호 16으로 제시된다.
RTS(열대열원충(P. falciparum)에서 유래됨)로 명명된 본 발명의 단백질 입자의 구성성분은 WO 93/10152호에 기재된 대로 제조될 수 있는데, 상기 국제공개공보는 RTS*(열대열원충(P. falciparum) NF54/3D7 균주에서 유래됨)에 대한 설명을 포함하고 있다.
본 발명의 하나 이상의 구체예들에서, 융합 단백질에 사용된 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 실질적으로 이의 전체 CS 단백질일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 전장 길이 S-항원이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 상기 S-항원의 단편이 사용된다.
한 구체예에서, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 중심부 반복 영역의 반복 단위를 4개 이상 포함한다. 더 구체적으로, 이 항원은 160개 이상의 아미노산을 함유한 서열을 포함하는데, 상기 서열은 CS 단백질의 C-말단 부분과 상당히 상동성이 있다. CS 단백질은 C-말단으로부터 마지막 12 내지 14개(예컨대 12개) 아미노산이 제거될 수 있다.
특히, 프레임내에서 선형 링커를 통해 S 항원의 N-말단에 융합된 열대열원충(P. falciparum)(NF54[3D7] 균주) 7G8의 CS 단백질의 아미노산 207-395에 실질적으로 상응하는 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질 부분을 포함하는 융합 단백질이 입자에 사용된다. 링커는 S-항원으로부터의 preS2의 일부를 포함할 수 있다.
더 구체적으로 사용된 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 융합 단백질은 RTS 발현 카세트에 관한 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되며, 상기 서열은 서열번호 18로 제공된다.
적당한 S 항원은 preS2를 포함할 수 있다. 적당한 혈청형의 예는 adw이다(Nature 280:815-819, 1979).
한 양상에서, 본 발명의 하이브리드 융합 단백질은 예를 들어, 공개된 US 특허출원 제 2006/194196호(또한 WO 2004/113369호에 공개됨)에 기재된 것과 같은, 돌연변이 S 단백질에서 유래된 부분을 포함한다. 이 문서는 HDB05로 명명된 돌연변이에 대해 소개하고 있다. 특히, 이 문헌은 도 1과 6에서 돌연변이 단백질과 야생형 단백질의 비교 및 도 4와 5에서 돌연변이에 대한 유전자에 대해 기재하고 있다. 상기 문헌은 서열번호 12 내지 22로 돌연변이 S 단백질의 특정 폴리펩티드에 대해 소개하고 있다. 상기 각각의 문헌은 참고문헌으로서 본원에 포함된다.
융합 단백질 CSV-S는, 예를 들어, 플라스미드 pGF1-S2를 이용하여 제조될 수 있는데(더 상세한 사항에 대해서는 도 2 및 실시예를 참조), 상기 플라스미드는, SamI 클로닝 부위에 CSV에 상응하는 적절한 서열이 삽입될 때, 적당한 조건하에서 융합 단백질 CSV-S를 생산할 수 있다.
본 발명의 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열은, 한 구체예에서 전사 조절 엘리먼트, 바람직하게는 효모 유전자에서 유래된 엘리먼트에 의해 플랭킹되며 발현 벡터내로 통합된다.
예를 들어, 하기 특징들을 포함하는 본 발명의 하이브리드 단백질을 위한 발현 카세트가 제작될 수 있다:
- 예를 들어, 사카로미세스 세래비시애(S. cerevisiae) TDH3 유전자에서 유래된 프로모터 서열.
- 적절한 융합 단백질을 엔코딩하는 서열.
- 예를 들어, 사카로미세스 세래비시애(S. cerevisiae) ARG3 유전자에서 유래된 서열내부에 포함된 전사 종결 서열.
특이 프로모터의 예는 사카로미세스 세래비시애(S. cerevisiae) TDH3 유전자로부터의 프로모터이다(Musti et al.).
본 발명은 또한 하이브리드 융합 단백질의 제조에 사용되는 벡터까지 확장된다.
적당한 플라스미드는 추후 하이브리드 융합 단백질을 엔코딩하는 서열을 합성을 위한 적당한 숙주내로 삽입시키는데 사용될 수 있다. 적당한 플라스미드의 예는 적합한 발현 카세트를 지니는 2 미크론-기반 벡터인 pRIT15546이다(더 상세한 사항에 대해서는 도 1 및 실시예를 참조하라).
플라스미드는 일반적으로 선별을 보조하기 위한 내장(in-built) 마커(예를 들어, 항생제 내성 또는 LEU2 또는 HIS 영양요구성(auxotrophy)에 관해 엔코딩하는 유전자)를 함유할 것이다.
일반적으로, 숙주는 입자내 각각의 융합 단백질을 위한 발현 카세트를 지닐 것이고 또한 이의 게놈내에 통합된 S 항원을 위한 하나 이상의 발현 카세트를 지닐 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터로 형질변화된 숙주 세포와 관련이 있다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있으나, 바람직하게는, 효모, 예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, RIT DC5 cir(o)라는 명칭으로 ATCC 데이터 베이스에 등재된 DC5(수탁 번호 20820)와 같은 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 기탁자: Smith Kline-RIT) 및 비-사카로미세스(Saccharomyces) 효모이다. 이들은 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces)(예를 들어, 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 클루이베로미세스(Kluyveromyces)(예를 들어, 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis)), 피치아(Pichia)(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)), 한세눌라(Hansenula)(예를 들어, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)), 야로이(Yarrowia)(예를 들어, 야로이 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)) 및 쉬반니오미세스(Schwanniomyces)(예를 들어, 쉬반니오미세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis))를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 융합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 효모 균주 Y1834(및 이의 용도)와 관련이 있다(상기 효모의 제조에 관한 실시예 참조).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 발현시키기 위한 재조합 효모 균주 Y1835 또는 Y1845(및 상기 효모의 용도)와 관련이 있다(더 상세한 사항에 대해서는 실시예를 참조).
본원에 사용된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분(예컨대, CS/하이브리드 단백질을 엔코딩하는 부분이나 선택적으로 단백질 S를 엔코딩하는 부분은 아닌, 부분)은 숙주, 예컨대 효모내에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 사용된, 입자의 2개 이상의 구성성분을 엔코딩하는 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주까지 확장된다.
한 구체예에서, 숙주 세포는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 융합 단백질을 위한 발현 카세트 및 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 융합 단백질을 위한 발현 카세트를 포함한다.
효모 세포와 같은, 특정 숙주에서, 일단 발현된 융합 단백질(S 항원을 포함함)은 자연스럽게 상기 융합 단백질의 다수의 단량체로 구성된 단백질 구조/입자로 조립된다. 효모가 2개의 상이한 융합 단백질을 발현시킬 때, 입자로 동시-조립(co-assembly)된다고 생각된다.
선택된 수령체 효모 균주가 이미 이의 게놈내에 수개의 통합된 B형 간염바이러스 S 발현 카세트의 복제본을 지닌 경우, 이후 조립된 입자는 또한 비융합된 S 항원의 단량체를 포함할 수 있다.
이러한 입자는 또한 바이러스 유사 입자(Virus Like Particles; VLPs)로 지칭될 수 있다. 이 입자는 또한 다량체성(multimeric) 리포단백질 입자로 기술될 수 있다.
대안적으로, 이러한 입자들은 수많은 방법으로 제조될 수 있는데, 예를 들어, 플라스모디움(Plasmodium) 유래 항원 각각을 또 다른 융합 파트너(예를 들어, B형 간염바이러스 바이러스의 항원 또는 바이러스 구조 단백질)에 융합시키고 효모 또는 박테리아와 같은 적당한 숙주내에서 상기 융합체를 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
따라서, 하기 단량체를 포함하는 면역원성 단백질 입자가 제공된다:
a. 삼일열원충의 CS 단백질에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질, 및
b. 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질.
추가 양상에서, 본 발명은 하기 서열을 포함하는 융합 단백질을 제공한다:
a) 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질에서 유래된 서열(예컨대, 타입 I 및/또는 타입 II의 반복 영역으로부터의 서열)
b) 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질에서 유래된 서열(예컨대, 이의 반복 영역으로부터의 서열), 및
c) B형 간염바이러스의 S-항원으로부터의 서열.
따라서, 본 발명은 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질에서 유래된 융합 단백질 및 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질에서 유래된 융합 단백질을 포함하는 단백질 입자까지 확장되는데, 여기서 상기 플라스모디움(Plasomdium) 항원과 융합된 항원은 상기 융합 단백질이 적당한 숙주 세포 내에서 발현될 때, 지질입자(lipopaticles)의 형성/조립을 유발하도록 선택된다.
따라서, 본 발명은 CSV-S 및 RTS 단위를 포함하는 VLP를 제공한다. 한 양상에서, 본 발명은 필수적으로 CSV-S 및 RTS 단위로 이루어진 입자를 제공한다. 대안적 양상에서, 생산된 입자는 CSV-S, RTS 및 S 단위를 포함하거나 필수적으로 이러한 단위들로 이루어진다.
다양한 접근법이 상기 입자의 제조를 위해 효모를 조작하는데 사용될 수 있는데, 예를 들어, 상기 융합 단백질을 위한 발현 카세트는 요구되는 융합 단백질 및/또는 S 항원 중 어느 하나를 위한 발현 카세트를 이미 함유한 효모의 게놈내로 삽입될 수 있다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따른 입자의 제조를 위한 적당한 숙주를 용이하게 준비할 수 있다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 CSV-S, RTS 및 임의로 S를 엔코딩하는 DNA를 포함하는 효모와 같은 적당한 숙주를 제공한다. 대안적인 양상에서, 적당한 숙주는, CSV-S, RTS 및 임의로 S를 발현할 수 있는 하나 이상의 플라스미드이다. 예를 들어, 이 플라스미드는, 예를 들어, 효모와 연계하여 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다.
이론에 의해 제한하려는 의도는 아니지만, 세포로부터 단백질을 유리시키는데 사용되는 계면활성제가 또한 리포단백질 입자의 안정화에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
본 발명의 리포단백질 입자는 항원성 단백질(들)에 대한 생체내 면역 반응을 추가로 자극시키는데 기여할 수 있을 것으로 가정된다.
한 양상에서, 본 발명은 예를 들어, 본 발명에 따른 입자에 포함된 하나 이상의 CS 단백질에 상응하는, 하나 이상의 CS 단백질을 엔코딩하는 복제 결함 바이러스 벡터를 제공한다.
적당한 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(AAVs), 홍역, 렌티바이러스, 알파바이러스, 배큘로바이러스, 단순 포진 바이러스, 폭스바이러스, 예컨대, 우두, 계두, 구두(pigeonpox), 카나리폭스(canarypox), 수이폭스(suipox) 및 면양두/산양두(sheeppox/goatpox)에서 유래될 수 있다. 말라리아 항원을 엔코딩하는 아데노 바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어, WO 2004/055187호에 기재되어 있다.
벡터에 의해 엔코딩된 단백질은, 예를 들어, 발현이 진행되는 동안 단백질의 당화를 막도록 변형될 수 있는데, 예를 들어, 당화를 감소시키기 위해 특정 세린이 알라닌 잔기로 대체될 수 있다.
본 발명에 이용된 바이러스 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
아데노바이러스
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 면역원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 하나 이상의 이종성 폴리뉴클레오티드(DNA)를 포함한다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 소정 범위의 포유류 숙주에서 유래될 수 있다.
아데노바이러스(본원에서 "Ad" 또는 "Adv"로 지칭됨)는 다수의 기타 부 단백질, VI, VIII, IX, IIIa 및 IVa2와 더불어, 3가지 주요 단백질, 헥손(II), 펜톤 염기(III) 및 노브형 섬유(knobbed fibre)(IV)로 구성된 정이십면체(icosohedral) 캡시드를 지니는 특유한 형태를 갖는다(Russell W.C. 2000, Gen Viriol, 81 :2573-2604). 바이러스 게놈은 반전 말단 반복부(inverted terminal repeats; ITRs)를 지니는, 5' 말단에 공유적으로 연결된 말단 단백질을 갖는 선형, 이중-가닥 DNA이다. 바이러스 DNA는 고 염기성 단백질 VII 및 mu로 명명된 소 펩티드와 밀접하게 연관되어 있다. 또 다른 단백질, V는 이 DNA-단백질 복합체를 패키징하고, 단백질 VI를 통해 상기 캡시드에 구조적 연결을 제공한다. 바이러스는 또한 성숙 감염성 바이러스를 생산하기 위해 구조 단백질의 일부를 가공하는데 필요한 바이러스에 의해 엔코딩되는 프로테아제를 포함한다.
100개 이상의 독특한 아데노바이러스의 혈청형이 동정되었는데, 이들은 다양한 포유류 종에 감염하며, 이들 중 51개는 인간에서 기원한 것이다. 따라서, 하나 이상의 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스에서 유래될 수 있다. 그러한 인간-유래 아데노바이러스의 예로서 Ad1, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Ad11, Ad24, Ad34, Ad35, Ad50/51가 있으며, 특히 Ad5, Ad11 및 Ad35가 바람직하다. 인간 혈청형은 수많은 생물학적, 화학적, 면역학적 및 구조적 기준에 기초하여 6개의 아속(subgenera)(A-F)로 분류되었다.
Ad5-기반 벡터가 수많은 유전자 치료법 시도에서 광범위하게 사용되어 왔으나, 천연 감염으로 인한 일반 개체군내 기존 면역성 때문에 Ad5와 다른 그룹 C 아데노바이러스 벡터의 사용에 제약이 있을 수 있다. Ad5와 다른 그룹 C 구성원들은 혈청유행성(seroprevalent)이 가장 높은 혈청형 중에 해당하는 경향이 있다. 기존 벡터에 대한 면역성은 처치가 진행되는 동안 벡터에 대한 노출의 결과로 발생할 수 있다. 이러한 유형의 유행성 벡터에 대한 기존 또는 발달(developed) 면역원성은 유전자 치료법 또는 예방접종 노력에 대한 유효성(effectiveness)을 제한시킬 수 있다. 대안적인 아데노바이러스 혈청형은, 따라서 숙주 면역 반응을 회피할 수 있는 유전자 전달 시스템을 추구하는 경우, 매우 중요한 표적을 구성한다.
이와 같은 대안적인 혈청형의 한 범위에는 비인간 영장류, 특히 침팬지 아데노바이러스에서 유래된 혈청형이 있다. 2가지 침팬지 아데노바이러스의 게놈에 대해 기재하고 있는 US 특허 6,083,716호를 참조하라.
침팬지("Pan" 또는 "C") 아데노바이러스 벡터가 인간 아데노바이러스 벡터 만큼 효율적으로 유전자도입(transgenic) 생성물에 대해 강한 면역 반응을 유도한다는 것이 밝혀졌다(Fitzgerald et al. J. Immunol. 170:1416).
비인간 영장류 아데노바이러스는 침팬지의 장간막(mesenteric) 림프절에서 분리될 수 있다. 침팬지 아데노바이러스는 인간 서브타입 C와 충분히 유사하여 HEK 293 세포내에서 El 결실된 바이러스의 복제가 가능하다. 그러나 침팬지 아데노바이러스는 더 흔한 인간 혈청형(Ad2 및 Ad5)과는 계통분류학적으로 구분된다. Pan 6는 Pans 5, 7 및 9와 덜 밀접하게 관련되어 있고 혈청학적으로 이들과 구분된다.
따라서, 하나 이상의 아데노바이러스 벡터는 비인간 영장류 아데노바이러스, 예를 들어, 침팬지 아데노바이러스, 예컨대, 혈청형 Pan5, Pan6, Pan7 및 Pan9 중에서 선택된 어느 하나에서 유래될 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 또한 하나 이상의 아데노바이러스 혈청형에서 유래될 수 있으며, 각각의 혈청형은 동일하거나 상이한 공급원에서 나올 수 있다. 예를 들어, 이들은 하나 이상의 인간 혈청형 및/또는 하나 이상의 비인간 영장류 혈청형에서 유래될 수 있다. 키메라 아데노바이러스 벡터를 제작하기 위한 방법은 WO2005/001103호에 소개되어 있다.
아데노바이러스내로의 이종성 DNA 삽입과 관련된 특정 크기 제한이 존재한다. 인간 아데노바이러스는 야생형 게놈 길이의 최대 105%까지 패키징할 수 있는 능력을 지닌다(Bert et al 1993, J Virol 67 (10), 5911-21). 인간 아데노바이러스의 패키징 하한은 야생형 게놈 길이의 75%인 것으로 밝혀졌다(Parks et al 1995, J Virol 71(4), 3293-8).
본 발명에 유용한 아데노바이러스의 한 예는 Ad2와 Ad5와 같이 인간 개체군에서 천연적으로 생성되는 유행성 혈청형과는 구별되는 아데노바이러스이다. 이 아데노바이러스는 중화 항체를 통한 벡터 섭취(uptake)를 차단하고 독성에 영향을 미침으로써 동일 혈청형의 후속 투여 효능을 제한하는 벡터에 대한 효능있는 면역 반응 유도를 회피한다.
따라서, 아데노바이러스는 천연적으로 생성되는 유행성 인간 바이러스 혈청형이 아닌 아데노바이러스일 수 있다. 동물에서 분리된 아데노바이러스는 면역학적으로 독특한 캡시드, 헥손, 펜톤 및 섬유 구성성분을 지니나 계통발생학적으로 밀접하게 관련되어 있다. 구체적으로, 바이러스는 비인간 아데노바이러스, 예컨대 시미안(simian) 아데노바이러스 및 특히 침팬지 아데노바이러스, 예컨대 Pan 5, 6, 7 또는 9일 수 있다. 이와 같은 종의 예는 WO 03/000283호에 기재되어 있으며 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection)[10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209] 및 기타 공급원으로부터 입수할 수 있다. 바람직한 침팬지 아데노바이러스 종은 Pan 5[ATCC VR-591], Pan 6[ATCC VR-592], 및 Pan 7[ATCC VR-593]이다.
침팬지 아데노바이러스의 사용은 표적 개체군내 아데노바이러스에 대한, 기존 면역성의 결여, 특히 교차-중화(cross-neutralising) 항체의 결여 때문에 인간 아데노바이러스 혈청형의 사용을 능가하는 이점이 있을 것으로 생각된다. 기존 중화 항체 반응과 함께 침팬지 아데노바이러스의 교차 반응은 특정 후보 인간 아데노바이러스 벡터의 경우에서의 35%와 비교하여 2%의 표적 개체군에서만 존재한다. 침팬지 아데노바이러스는 더 일반적인 인간 서브타입 Ad2와 Ad5와 구별되나, 유행성 서브타입이 아닌, 서브그룹 E의 인간 Ad4와 더 밀접하게 관련되어 있다. Pan 6는 Pan 5, 7 및 9과의 덜 밀접하게 관련되어 있다.
본 발명의 아데노바이러스는 복제 결함이 있을 수 있다. 이것은 이 바이러스가 야생형 바이러스와 비교하여 비보완(non-complementing) 세포내에서 복제하는 능력이 감소되어 있다는 것을 의미한다. 이것은 바이러스에 돌연변이를 발생시킴으로써, 예를 들어, 복제에 관여하는 유전자를 결실시킴으로써(예를 들어, EIa, EIb, E3 또는 E4 유전자의 결실) 초래될 수 있다.
본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 기능적인 E1 결실을 포함하는 복제 결함 아데노바이러스에서 유래될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 E1a와 E1b를 발현시키는 능력의 부재로 인해, 즉, E1a와 E1b에 기능적 결실이 존재하기 때문에 복제 결함이 있을 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 또한 다른 유전자내에 기능적 결실[WO 03/000283호 참조], 예를 들어, E3 또는 E4 유전자(또는 E3의 일부분과 같은 이의 일부분)에 결실을 내포할 수 있다. 아데노바이러스 지연(delayed) 초기 유전자 E3가 재조합 바이러스의 일부분을 형성하는 아데노바이러스 서열로부터 제거될 수 있다. E3의 기능은 재조합 아데노바이러스 입자의 생산에 반드시 필요하지는 않다. 따라서, 본 발명에 유용한 재조합 아데노바이러스를 패키징하기 위해 이 유전자 생성물의 기능를 대체하는 것은 불필요하다. 한 특정 구체예에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적으로 결실된 El 및 E3 유전자를 가졌다. 이와 같은 벡터의 제작은 문헌[Roy et al., Human Gene Therapy 15:519-530, 2004]에 기재되어 있다. 한 양상에서, 아데노바이러스는 결실된 E1 및 E4와 결실된 E3의 일부를 지닌다.
E4 ORF6 기능이 유지되는 것이 요망될 수 있으나, E4 유전자의 기능적 결실을 지니는 재조합 아데노바이러스가 또한 제작될 수 있다. 본 발명에 따른 아데노바이러스 벡터는 또한 지연된 초기 유전자 E2a에 결실을 내포할 수 있다. 결실은 또한 아데노바이러스 게놈의 후기(late) 유전자 L1 내지 L5 중 임의 유전자에서 이루어질 수 있다. 유사하게 중기(intermediate) 유전자 IX와 IVa에서의 결실이 유용할 수 있다.
다른 결실이 기타 구조 또는 비구조 아데노바이러스 유전자내에서 일어날 수 있다. 상기 결실은 개별적으로 사용될 수 있는데, 즉, 본 발명에서의 사용을 위한 아데노바이러스 서열은 E1의 결실만을 함유할 수 있다. 대안적으로, 유전자의 생물학적 활성을 파괴하는데 효과적인 전체 유전자 또는 이의 일부분의 결실이 임의로 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 대표적인 벡터에서, 아데노바이러스 서열은 E1 유전자 및 E4 유전자의 결실, 또는 E1, E2a 및 E3 유전자의 결실, 또는 E1 및 E3 유전자의 결실(예컨대, E1a 및 E1b에서의 기능적 결실, 및 E3의 적어도 일부분의 결실), 또는 E1, E2a 및 E4 유전자(E3의 결실과 함께 또는 없이)의 결실 및 기타의 결실을 지닐 수 있다. 이와 같은 결실은 이러한 유전자의 부분적 결실 또는 완전한 결실일 수 있으며 다른 돌연변이, 예컨대 요망되는 결과를 달성하기 위한 온도 민감성 돌연변이와 조합되어 이용될 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 이 바이러스가 복제될 수 있는 임의의 적당한 세포주에서 생산될 수 있다. 특히, 손상되지 않은 복제 특성을 초래하는 바이러스 벡터에서 소실된 엘리먼트(예컨대 E1 및/또는 E4)를 제공하는 보완 세포주가 사용될 수 있다. 이와 같은 세포주는 HeLa[ATCC Accession No. CCL 2], A549[ATCC Accession No. CCL 185], HEK 293, KB[CCL 17], Detroit[예를 들어, Detroit 510, CCL 72] 및 WI-38[CCL 75] 세포, 기타 세포주일 수 있으며, 이로만 국한되는 것은 아니다. 이러한 세포주는 모두 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)(10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209)에서 입수가능하다. 다른 적당한 모 세포주는 다른 공급원, 예컨대, 응용 미생물학 및 연구 센터(Centre for Applied Microbiology and Research)(CAMR, UK)에 소재한 유럽 동물 세포 배양물 보존 센터(European Collection of Animal Cell Cultures, ECACC)에 기탁번호 ECACC 제 96022940호로 기탁된 세포에 의해 대표되는 것과 같은, PER.C6ⓒ 세포 또는 Her 96 세포(Crucell)에서 획득될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 단백질을 엔코딩하는 바이러스 벡터의 제조를 위한 공지된 세포주의 용도까지 확장된다.
면역원성 CS 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 포유류 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 이와 같은 코돈-최적화는 WO 05/025614호에 상세히 기재되어 있다.
본 발명은 또한 적당한 희석제 또는 담체와 혼합하여 면역보호량(immunoprotective amount)의 본 발명에 따른 단백질 입자를 포함하는 백신과 관련이 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 입자 및 말라리아 항원, 특히 상기 입자와 공통되는 말라리아 항원을 포함하는 바이러스 벡터, 및 임의로 애주번트를 포함하는 조성물까지 확장된다.
본 명세서의 문맥에서, 부형제는 그 자체로 치료 효과를 갖지 아니하면서 약제 제형내에 존재하는 성분을 의미한다. 희석제 또는 담체는 부형제의 정의내에 포함된다.
본 명세서의 문맥에서 면역원성은 면역 반응을 개시시키는 능력을 지칭하려는 의도이다. 이러한 반응은, 예를 들어, 리포단백질 입자가 적당한 애주번트를 포함/요구할 수 있는 적절한 제형으로 투여되는 경우에 존재할 수 있다. 본래 용량(original dose)과 유사 또는 더 적은 용량을 포함하는 부스터는 요구되는 면역원성 반응을 얻기 위해 요구될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물/약제 제형은 또한 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 것과 같은 하나 이상의 추가 항원과 혼합하여 포함할 수 있는데, 예를 들어, 여기서 상기 항원은 DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA1 및 RBP 또는 이의 단편 중에서 선택될 수 있다.
다른 일예로, 열대열원충(P. falciparum)에서 유래된 항원은 PfEMP-1, Pfs 16 항원, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-1 및 TRAP을 포함할 수 있다. 기타 플라스모디움(Plasmodium) 항원은 열대열원충(P. falciparum) EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시퀘스트린(Sequestrin), Pf332, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 및 다른 플라스모디움종(Plasmodium spp.)의 이들의 유사체를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물/약제 조성물은 또한 본 발명에 따른 입자와 혼합하여 RTS,S의 입자(WO 93/10152호에 기재됨)를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 바이러스 벡터 작제물은 WO 2004/055187호에 기재되어 있다.
본 발명의 백신에서, 입자의 수성 용액이 직접적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 동결건조(lyophilisation)되거나 되지 아니한 단백질이 공지의 애주번트 중 임의의 것과 혼합되거나 이에 흡착될 수 있는데, 상기 애주번트는 명반(alum), 뮤라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 사포닌, 예컨대 퀼(Quil) A를 포함하나 이로만 국한되지 아니한다.
특정 애주번트는 금속 염, 수중유 에멀젼, 톨 유사 수용체 효능제(특히, 톨 유사 수용체 2 효능제, 톨 유사 수용체 3 효능제, 톨 유사 수용체 4 효능제, 톨 유사 수용체 7 효능제, 톨 유사 수용체 8 효능제 및 톨 유사 수용체 9 효능제), 사포닌 또는 이의 조합물의 그룹 중에서 선택된 것들인데, 단, 금속 염은 오직 또 다른 애주번트와 조합되어 사용되며 약 60% 이하의 항원이 상기 금속 염에 흡착되는 방식으로 제형화되지 아니하는 경우 이들 금속 염은 단독으로 사용되지 아니한다. 더 구체적으로, 약 50% 이하, 예를 들어, 40%의 항원이 상기 금속 염에 흡착되고, 한 구체예에서, 약 30% 이하의 항원이 상기 금속 염에 흡착된다. 금속 염에 흡착된 항원의 수준은 당업계에 널리 공지된 기술로 결정될 수 있다. 유리 항원의 수준은, 예를 들어, 포스페이트 이온, 예컨대, 포스페이트로 완충된 염수 존재하에 조성물을 제형화하거나, 항원대 금속 염의 비를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 한 구체예에서, 애주번트는 유일한 애주번트로서 금속 염을 포함하지 아니한다. 한 구체예에서, 애주번트는 금속 염을 포함하지 아니한다.
한 구체예에서, 애주번트는 톨 유사 수용체(TLR) 4 리간드, 바람직하게는, 지질 A 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A 또는 더 바람직하게는 탈아실화된(Deacylated) 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)와 같은 효능제이다.
3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A는 미국 특허 제 4,912,094호 및 UK 미국 특허출원 제 2,220,211호(Ribi)에 공지되어 있으며 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem, Montana, USA) 사(社)로부터 구매가능하다.
3D-MPL은 코리사 코포레이션(Corixa corporation)에 의해 상표명 MPL®로 판매되고 있으며 주로 IFN-g(Th1) 표현형과 함께 CD4+ T 세포 반응을 촉진한다. 이것은 GB 2 220 211 A호에 소개된 방법에 따라 생산될 수 있다. 화학적으로 이것은 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6 아실화된 쇄의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서, 작은 입자 3D-MPL이 사용된다. 작은 입자 3D-MPL은 0.22μm 필터를 통해 멸균-여과될 수 있을 정도의 입자 크기를 갖는다. 이와 같은 제조물은 국제 공개 공보 제 WO 94/21292호에 소개되어 있다. 지질 A의 합성 유도체는 공지되어 있고 이로만 국한되는 것은 아니나, 하기를 포함하는 TLR 4 효능제인 것으로 여겨진다:
OM174 (2-데옥시-6-0-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트)(WO 95/14026호)
OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테르라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트)(WO 99/64301호 및 WO 00/0462호)
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127호).
전형적으로 3D-MPL이 사용될 때, 항원과 3D-MPL은 알룸(명반)과 함께 전달되거나 수중유 에멀젼 또는 다수의 수중유 에멀젼으로 제공된다. 3D-MPL의 통합(incorporation)은 유익한데, 이것이 이펙터 T-세포 반응의 자극자이기 때문이다.
사용될 수 있는 다른 TLR4 리간드는 WO 9850399호 또는 US 6303347호(AGP의 제조 공정이 또한 개시됨)에 소개된 것과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(alkyl glucosaminide phosphates, AGPs), 또는 US 6764840호에 소개된 것과 같은 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 효능제이고, 일부는TLR4 길항제이다. 둘 모두가 애주번트로서 유용한 것으로 여겨진다.
본 발명에 사용하기 위한 또 다른 면역자극제는 퀼 A 및 이의 유도체이다. 퀼 A는 남 아메리카산 나무 퀼라자 사포나리아(Quilaja Saponaria Molina)에서 분리된 사포닌 제조물이며 달스가르드 등의 논문[Dalsgaard et al., "Saponin Adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254 (1974)]에 애주번트 활성을 지니는 것으로 최초로 개시되었다. 퀼 A의 정제된 단편은 HPLC에 의해 분리되었는데, 이것은 퀼 A(EP 0 362 278호), 예를 들어, QS7와 QS21(QA7와 QA21로도 공지됨)와 연관된 독성없이 애주번트 활성을 보유한다. QS-21은 퀼라자 사포나리아(Quilaja Saponaria Molina)의 수피(bark)에서 유래된 천연 사포닌인데, CD8+ 세포독성 T 세포(CTLs), Th1 세포 및 전우성(predominant) IgG2a 항체 반응을 유도한다.
스테롤을 추가로 포함하는 QS21의 특정 제형이 소개된 바 있다(WO 96/33739호). QS21:스테롤의 비율은 전형적으로 1:100 내지 1:1 w/w(weight to weight)의 비율(order)로 존재할 것이다. 일반적으로 과량의 스테롤이 존재하며, QS21:스테롤의 비율은 적어도 1:2 w/w일 것이다. 전형적으로, 인간 투여의 경우 QS21과 스테롤은 백신내에서 용량당 약 1㎍ 내지 약 100㎍의 범위 이내, 예컨대, 용량당 약 10㎍ 내지 약 50㎍으로 존재할 것이다.
리포좀은 일반적으로 천연 지질, 예를 들어, 일반적으로 실온에서 비-결정성인 포스파티딜콜린, 예를 들어, 난황 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린 또는 디라우릴 포스파티딜콜린을 함유한다. 리포좀은 또한 포화 지질로 구성된 지질의 경우 리포좀-Q21 구조의 안정성을 증가시키는 하전된 지질을 함유할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 하전된 지질의 양은 흔히 1-20% w/w, 예컨대 5-10%이다. 스테롤 대 인지질의 비는 1-50%(mol/mol), 예컨대 20-25%이다.
이러한 조성물은 MPL(3-탈아실화된 모노-포스포릴 지질 A, 3D-MPL로도 공지됨)을 함유한다. 3D-MPL은 3 타입의 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6 아실화된 쇄의 혼합물로서 GB 2 220 211호(Ribi)에 소개되어 있으며 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem, Montana) 사(社)에 의해 제조된다.
사포닌은 미셀, 혼합된 미셀(일반적으로, 담즙산염과 혼합되나 이로만 국한되는 것은 아님)의 형태로 분리되거나 ISCOM 매트릭스(EP 0 109 942호), 리포좀 또는 관련 콜로이드(colloidal) 구조의 형태, 예컨대 웜-유사(worm-like) 또는 링-유사(ring-like) 다량체(multimeric) 복합체 또는 콜레스테롤 및 지질과 함께 제형화될 경우 지질성/계층성(lipidic/layered) 구조 및 라멜라(lamellae)로 존재하거나,수중유 에멀젼(예를 들어, WO 95/17210호에 기재된 것)의 형태로 존재할 수 있다. 사포닌은 종종 금속성 염, 예컨대 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄(WO 98/15287호)과 결합될 수 있다.
일반적으로, 사포닌은 리포좀, ISCOM 또는 수중유 에멀젼의 형태로 제공된다.
면역자극성(Immunostimulatory) 올리고뉴클레오티드가 또한 사용될 수 있다. 애주번트 또는 본 발명의 백신에 사용하기 위한 대표적인 올리고뉴클레오티드는 일반적으로, 3개 이상, 더 바람직하게는 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유하는 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. CpG 모티프는 시토신 뉴클레오티드 다음에 구아닌 뉴클레오티드가 뒤따른다. CpG 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 데옥시뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 포스포디에스테르 및 다른 뉴클레오티드간 결합이 본 발명의 범위내에 속하기는 하지만, 올리고뉴클레오티드내 뉴클레오티드간 결합은 포스포로디티오에이트, 또는 더 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이다. 본 발명의 영역내에는 혼합된 뉴클레오티드간 연결을 지니는 올리고뉴클레오티드도 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생산하는 방법은 US 5,666,153호, US 5,278,302호 및 WO 95/26204호에 소개되어 있다.
올리고뉴클레오티드의 예는 다음과 같다:
TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456),
상기 서열들은 변형된 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 함유한다.
대안적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 이들이 중요치 않은 결실 또는 부가를 지닌다는 점에서 상기 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법(예를 들어, EP 468520호를 참조하라)에 의해 합성될 수 있다. 간편하게, 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 자동화된 합성기를 이용하여 합성될 수 있다.
TLR 2 효능제의 일예는 펩티도글리칸(peptidoglycan) 또는 리포단백질을 포함한다. 이미다조퀴놀린, 예컨대, 이미퀴모드(Imiquimod) 및 레시퀴모드(Resiquimod)가 공지된 TLR7 효능제이다. 단일 가닥 RNA가 또한 공지된 TLR 효능제(인간에서 TLR8 및 마우스에서 TLR7)인 반면, 이중 가닥 RNA 및 폴리 IC(폴리이노신산-폴리시티딜산 - 바이러스 RNA의 상업적 합성 모방체)는 대표적인 TLR 3 효능제이다. 3D-MPL은 TLR4 효능제의 일예이며, 한편 CpG는 TLR9 효능제의 일예이다.
면역자극제는 대안적으로 또는 부가적으로 포함될 수 있다. 한 구체예에서, 이 면역자극제는 3-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)일 것이다.
한 양상에서, 애주번트는 3D-MPL을 포함한다.
한 양상에서, 애주번트는 QS21을 포함한다.
한 양상에서, 애주번트는 CpG를 포함한다.
한 양상에서, 애주번트는 수중유 에멀젼으로 제형화된다.
한 양상에서, 애주번트는 리포좀으로 제형화된다.
애주번트 배합물은 3D-MPL 및 QS21(EP 0 671 948 B1호), 3D-MPL 및 QS21를 포함하는 수중유 에멀젼(WO 95/17210호, WO 98/56414호), 또는 기타 담체와 함께 제형화된 3D-MPL(EP 0 689 454 B1호)를 포함한다. 다른 바람직한 애주번트 시스템은 US 6558670호 및 US 6544518호에 기재된 것과 같은 3D-MPL, QS21 및 CpG 올리고뉴클레오티드의 배합물을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 3D-MPL 및 담체와 배합된, 본원에 기재된 것과 같은 입자를 포함하는 백신이 제공된다. 전형적으로 담체는 수중유 에멀젼 또는 명반일 것이다.
본 발명의 단백질 입자는 또한 리포좀과 같은 미세입자내로 캡슐화될 수 있다.
백신 제조법은 일반적으로 볼러(Voller) 등에 의해 편집된, 백신의 신경향 및 개발(New Trends and Developments in Vaccines)[University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978]에 기재되어 있다. 리포좀내 캡슐화는, 예를 들어, 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877호에 기재되어 있다.
각각의 백신 용량내에 존재하는 본 발명의 단백질 입자의 양은 전형적인 백신에서의 유의한, 나쁜 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 분량으로써 선택된다. 이와 같은 양은 어떠한 특이적 면역원이 사용되는지와 백신이 애주번팅되는지 여부에 좌우될 것이다. 일반적으로, 각각의 용량은 1-1000μg의 단백질, 바람직하게는 1-200μg, 가장 바람직하게는 10-100μg을 포함할 것으로 예상된다. 특정 백신의 최적 분량은 항체 타이터(titres) 및 환자내 기타 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 검증될 수 있다. 초기 예방접종후, 피검체는 바람직하게는 약 4주이내에 부스터를 투여받고, 후속하여 감염의 위험이 존재하는한 매 6개월마다 부스터를 반복하여 투여받을 것이다. 본 발명의 단백질에 대한 면역 반응은 애주번트 또는 면역자극제의 사용에 의해 증강된다.
사용된 3D MPL의 양은 일반적으로 소량이나, 백신 제형에 따라서 용량당 1-1000μg의 범위, 예를 들어, 용량당 1-500μg, 및 예컨대, 용량당 1-lOOμg 사이일 것이다.
본 발명의 애주번트 또는 백신내의 CpG 또는 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 양은 일반적으로 소량이나, 백신 제형에 따라서 용량당 1-1000μg의 범위, 바람직하게는, 용량당 1-500μg, 및 더 바람직하게는 용량당 1-lOOμg 사이일 것이다.
본 발명의 애주번트내의 사포닌의 양은 용량당 1-1000μg의 범위, 바람직하게는, 용량당 1-500μg, 및 더 바람직하게는 용량당 1-25Oμg, 및 가장 바람직하게는 용량당 1-100μg 사이일 것이다.
본 발명의 제형은 예방적 및 치료적 목적 둘 모두를 위해 사용될 수 있다. 치료법은 예방적 치료를 포함한다. 따라서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한, 예를 들어, 말라리아의 치료(예방을 포함함)를 위한, 본원에 기재된 바와 같은 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가 양상은 본 발명의 하이브리드 단백질의 제조를 위한 공정을 제공하는데, 상기 공정은 적당한 숙주, 바람직하게는 효모내에서 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 발현시키는 단계, 및 생성물을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 상기에 기재한 것과 같은 유효량의 백신을 투여함으로써 플라스모디움(Plasmodium) 감염에 민감한 환자를 치료하는 방법과 관련이 있다.
추가 양상에서, 본 발명에 따른 면역원성 입자 및 말라리아 항원, 예컨대 상기 하이브리드 항원을 엔코딩하는 바이러스 벡터를 포함하는 치료용 배합물이 제공된다.
예를 들어, 상기 입자 및 상기 바이러스 벡터가 동시적으로(concomitantly) 투여될 수 있는데, 예를 들어, 이들은 동시 투여를 위해 혼합되거나 대안적으로 순차 투여를 위해 제형화될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "동시적으로"는 상기 배합 성분들이 12시간 이하의 기간내에, 예를 들어, 1시간 이하의 기간내에, 전형적으로 때때로, 예를 들어, 건강 전문가에 대한 동일한 방문 과정에서, 투여되는데, 예들 들어, 여기서 이들은 순차적으로 또는 동시적으로 투여된다.
본 발명은 또한 본 발명에 소개된 다양한 성분들을 이용한 프라임 부스트 섭생(prime boost regimes)을 포함하는데, 예를 들어, 바이러스 벡터로 프라이밍하고 상기 입자로 부스팅하거나, 그 반대의 경우를 포함한다.
본 명세서의 문맥에서, "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"으로 해석되어야 한다.
특정 엘리먼트를 포함하는 본 발명의 양상은 상기 적절한 엘리먼트로 이루어지거나 필수적으로 이루어진 상기 양상까지 확장하려는 의도이다.
하기 실시예들은 본 발명의 입자를 제조하는데 이용될 수 있는, 방법학을 설명하기 위해 제시된다. 실시예들은 본 발명의 양상을 이루거나 그렇지 않을 수 있다.
본 발명은 말라리아 백신으로 사용하기 위한 항원성 입자를 제공하는데, 상기 입자는 체액성(humoral) 반응 및 또한 세포성(cellular) 면역 반응을 제공할 것으로 믿어진다. 이 항원성 입자는 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질과 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질(타입 I 및 타입 II)에 대한 항체의 생성을 유도할 것으로 믿어진다. 이 항원은 또한 T 헬퍼 세포, 예를 들어 Th1 및/또는 Th2 세포를 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 단량체를 포함하는 면역원성 단백질 입자를 제공한다:
a. 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질과 B형 간염바이러스의 S 항원에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(CSV-S),
b. 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질 및 B형 간염바이러스의 S 항원에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(RTS), 및 선택적으로
c. B형 간염바이러스에서 유래된 S 항원.
서열 목록
서열번호 1 N-말단내 영역 I
서열번호 2 C-말단내 영역 II
서열번호 3-9 타입 I CS 단백질의 다양한 반복 단위
서열번호 10 타입 II CS 단백질로부터의 주(major) 반복 단위
서열번호 11 아시아 균주에서 발견된 추가 아미노산
서열번호 12 하이브리드 단백질 CSV의 뉴클레오티드 서열
(E. Coli에서 발현을 위해 최적화됨)
서열번호 13 하이브리드 단백질 CSV의 아미노산 서열
서열번호 14 타입 II CS 단백질로부터의 부(minor) 반복 단위
서열번호 15 하이브리드 단백질 CSV의 뉴클레오티드 서열
(효모에서 발현을 위해 최적화됨)
서열번호 16 하이브리드 융합 단백질 CSV-S의 뉴클레오티드 서열
서열번호 17 하이브리드 융합 단백질 CSV-S의 아미노산 서열
서열번호 18 RTS 발현 카세트에 대한 뉴클레오티드 서열 및
예상된 RTS,S 단백질.
실시예 1
Y1834 균주에 대한 설명
융합 단백질을 발현시키기 위해 효모 재조합 균주 Y1834을 사용할 수 있다. 상기 균주는 재조합 발현 벡터 pRIT15546로 형질전환된 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 숙주 DC5 균주로 이루어진다.
DC5는 하기 유전자형을 갖는 실험실 효모 균주(ATCC No: 20820)이다: leu2-3, leu2-112, his3, can1-11. 이중 leu-2 돌연변이는 기능성 LEU-2 유전자 복사본(copy)을 지니는 pRIT15546 벡터의 흡수(uptake) 및 유지에 대한 선별을 가능케한다. LEU-2 유전자와 함께 벡터를 지니는 그러한 세포들만이 류신이 성장 배지에 존재하지 아니할 때 성장할 수 있다.
벡터 pRIT15546은 발현 카세트를 지니는 효모 에피솜 발현 벡터(2μ-기반 벡터)이다. 재조합 발현은 효모 TDH3 유전자(항시(constitutive) 발현)에서 유래된 프로모터에 의해 유도된다. pRIT15546 벡터의 제작방법은 아래에 상세히 기술되어 있다.
pRIT15546 벡터의 제작.
효모 발현을 위한 적절한 코돈 사용빈도(usage)를 지닌 합성 유전자를 제작하고 pUC57 벡터로 서브-클로닝하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드 pUC57/CSV와 효모 발현 벡터 pGf1-S2 둘 모두를 적절한 효소로 절단하였다. 벡터 pGf1-S2를 다단계 클로닝 절차에 의해 제작하였다(GSK에서 제작). S 발현 카세트를 이미 지니고 있는, 이 벡터는 B형 간염바이러스의 S 유전자의 N-말단에 인-프레임 융합체로서, 융합 유전자의 제작을 가능케하였다. 서열 확증후, 최종 발현 벡터를 pRIT15546로 명명하였다(도 3).
DC5 균주의 형질전환.
leu- 및 his-영양요구성 DC5 균주를 효모 표준 프로토콜을 사용함으로써, 재조합 플라스미드 pRIT15546로 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 아가 선택 플레이트에 플레이팅하였다. 한 형질전환체를 선별하고 공식 명칭 Y1834를 부여하였다.
재조합 단백질의 발현 :
30℃에서, 8μg/ml의 히스티딘이 보충된 YNB[크락커 사이언티픽 사(社)(Kracker Scientific Inc)로부터 구매가능한 효모 질소 염기(Yeast Nitrogen Base)] 최소 배지내에서, O.D.(620nm) 0.5에 도달될 때까지 Y1834를 성장시켰다. 이후 세포를 수확하고 세포 추출물을 제조하였다.
추출물 제조 :
세포를 파쇄 완충액(Breaking Buffer)에 재현탁시키고 기계적으로 분쇄하였다(유리 구슬). 추출물을 5000rpm에서 15분동안 원심분리하였다. 상청액 분획을 4-20% SDS-PAGE 상에서 러닝시켰다.
파쇄 완충액: 5OmM 포스페이트 Na 완충액(PH: 7.5)
4mM EDTA
Tween-20 0.5%
+ 프로테아제 억제제 칵테일(Complete/ROCHE)
세포 농도: 5 ml 파쇄 완충액 중의 100ml 배양물(OD: 0.5)
= 농도 10 OD 단위/ml.
미정제 추출물 정제: 추출물을 원심분리함(15분/5000rpm)
재조합 단백질의 검출
정제된 추출물을 4-20% SDS-PAGE 상에서 러닝시키고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 면역염색을 실시하였다.
웨스턴 블랏 분석:
시약 = 마우스 모노클로날 항체 항-S(GSK 바이올로지칼즈
에 의해 제조됨)-(희석비: 1/500)
시중에서 구매가능한 항-S 항체는 본 방법에서 사용된
그러한 항체를 대신할 수 있다. 대안적으로 항-CSV
항체, 예를 들어, NIH로부터 획득가능한 MR4로 공지된
그러한 항체가 사용될 수 있다.
실시예 2:
Y1835 균주에 대한 설명
효모 재조합 균주 Y1835는 동시에 CSV-S 융합 단백질과 S 항원을 발현시킨다. CSV-S 및 S 단백질을 동시-발현시키는 균주를 획득하기 위해, 이미 5개의 통합된 S 발현 카세트의 복사본을 지니는, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 Y1295를 재조합 통합(integrative) 발현 벡터 pRIT15582로 형질전환시켰다.
Y1295 균주를 다단계 형질전환 절차에 의해 GSK에서 제작하였다. Y1295 균주의 제작방법은 WO 93/10152호에 소개되어 있다. Y1295 균주는 다음 유전자형을 갖는다: leu2-3, leu2-112, gal1. leu-2 돌연변이는 CSV-S 카세트 및 기능성 LEU-2 유전자를 운반하는 pRIT15582-유래 선형 DNA 단편의 흡수에 대한 선별을 가능케한다.
벡터 pRIT15582는 CSV-S 발현 카세트를 운반하는 효모 통합 발현 벡터(Ty-기반 벡터)이다. 재조합 발현은 효모 TDH3 유전자(항시 발현)에서 유래된 프로모터에 의해 유도된다. pRIT15582 벡터의 제작방법은 아래에 상세히 기술되어 있다.
pRIT15582 통합 벡터의 제작.
pRIT15582 벡터를 제작하는데 사용된 출발 물질은 발현 플라스미드 pRIT15546이었다(도 1). 이 플라스미드의 제작은 실시예 1에 기재되어 있다. HindIII 엔도뉴클레아제로 pRIT15546의 절단하여 완전한 CSV-S 발현 카세트 (pTDH3 + CSV-S + tARG3)에 해당하는 3706bp 길이의 긴 DNA 단편을 생성시켰다. 이 HindIII DNA 단편(T4 DNA 중합효소로 충진(filling)후)을 Ty-기반 통합 벡터 pRIT13144 상의 독특한 SalI 클로닝 부위(SalI 절단/T4 처리)에 삽입하였다. 그 결과 얻어진 플라스미드 pRIT15582는 발현 카세트 뿐만 아니라, 선별 마커로서 효모 LEU2 유전자를 포함하였다(도 3). XhoI 엔도뉴클레아제로 pRIT15582를 절단하여 도 4에 도시된 8500bp 길이의 선형 단편을 생성시켰는데, 이 단편은 내재성(resident) Ty 엘리먼트를 지닌 유리(free) 말단의 상동성 재조합에 의해 효모 게놈내로 통합될 수 있다.
Y1295 균주의 형질전환.
S와 CSV-S 단백질 둘 모두를 발현시키는 균주를 획득하기 위해, Y1295 균주를 8500bp 길이의 선형 XhoI 단편으로 형질전환시키고(도 4) Leu+ 콜로니를 선별하였다. 다양한 비율로 게놈내에 존재하는 두 발현 카세트의 세트를 함유하는 수개의 통합체(integrants)를 획득하였다. CSV-S 카세트 복사본 4개를 지니는 한 형질전환체를 선별하였고 공식 명칭 Y1835를 부여하였다.
재조합 단백질의 발현
:
Y1835를 30℃, YNB(크랙커 사이언티픽 인크 사로부터 획득가능한 효모 질소 염기) 최소 배지에서 O.D(620nm) 약 0.5(0.8)에 도달될 때까지 성장시켰다. 이후 세포를 수확하고 세포 추출물을 준비하였다.
면역블랏팅에 의한 발현 생성물의 분석 :
추출물 제조:
세포를 파쇄 완충액에 재현탁시키고 기계적으로 분쇄하였다(유리 구슬). 추출물을 5000rpm에서 5-10분 동안 원심분리하였다. 상청액 분획을 12.5% SDS-PAGE 상에서 러닝시켰다.
파쇄 완충액: 5OmM 포스페이트 Na 완충액(PH: 7.5)
4mM EDTA
Tween-20 0.5%
+ 프로테아제 억제제 칵테일(Complete/ROCHE)
세포 농도: 2.5ml 파쇄 완충액 중의 100ml 배양물(OD: 0.5)
= 농도 20 OD 단위/ml.
미정제 추출물 정제: 추출물을 원심분리함(5-10분/5000rpm)
재조합 단백질의 검출
정제된 추출물을 12.5% SDS-PAGE 상에서 러닝시키고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 면역염색을 실시하였다.
웨스턴 블랏 분석(도 5):
시약: 1/마우스 모노클로날 항체 항-S(GSK 바이올로지칼즈에
의해 제조됨)-(희석비: 1/250)
2/래빗 폴리클로날 항체 항-CSV(WRAIR가 기꺼이 제공함) - 희석비 1/20,000
시중에서 구매가능한 항-S 항체를 비롯한 항-삼일혈원충(P. vivαx)/CSP 항체는 본 방법에 사용된 항체들을 대신할 수
있다.
실시예 3:
Y1845 균주에 대한 설명
효모 재조합 균주 Y1845는 동시에 CSV-S 융합 단백질, RTS 융합 단백질 및 S 항원을 발현시킨다. CSV-S, RTS 및 S 단백질을 동시-발현시키는 균주를 획득하기 위해, 이미 5개의 통합된 S 발현 카세트의 복사본을 지니는, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 Y1295를 pRIT13540 및 pRIT15582 통합 벡터에서 각각 유래된, RTS 및 CSV-S 선형 DNA 단편의 동일몰농도 용액으로 형질전환시켰다.
Y1295 균주를 다단계 형질전환 절차에 의해 GSK에서 제작하였다. Y1295 균주의 제작은 WO 93/10152호에 소개되어 있다. Y1295 균주는 다음 유전자형을 갖는다: leu2-3, leu2-112, gal1. leu-2 돌연변이는 CSV-S 카세트 및 기능성 LEU-2 유전자를 운반하는 pRIT15582-유래 선형 DNA 단편의 흡수에 대한 선별을 가능케한다.
벡터 pRIT13540과 pRIT15582는 각각 RTS와 CSV-S 발현 카세트를 지니는 효모 통합 발현 벡터(Ty-기반 벡터)이다. 두 벡터의 경우, 재조합 발현은 효모 TDH3 유전자(항시 발현)에서 유래된 프로모터에 의해 유도된다. pRIT15582 벡터의 제작법은 실시예 2에 상세히 기재되어 있다. pRIT13540 벡터의 제작법은 WO 93/10152호에 기재되어 있다.
선형 통합 DNA 단편의 제조.
통합 벡터 pRIT13540과 pRIT15582 둘 모두를 XhoI 엔도뉴클레아제로 절단하여, 각각 8200bp와 8500bp 길이의 DNA 단편을 생성시켰다. 이러한 단편들은 내재성 Ty 엘리먼트를 지닌 유리 말단의 상동성 재조합에 의해 효모 게놈내로 통합될 수 있다.
Y1295 균주의 형질전환.
RTS, CSV-S 및 S 단백질 세개 모두를 발현시키는 균주를 획득하기 위해, Y1295 균주를 8200bp 및 8500bp 길이의 선형 XhoI 단편의 동일몰농도 용액으로 형질전환시키고, Leu+ 콜로니를 선별하였다. 다양한 비율로 게놈내에 존재하는 두 발현 카세트의 세트를 함유하는 수개의 통합체를 획득하였다. CSV-S 카세트 복사본 4개와, RTS 복사본 2개(S 카세트의 복사본 5개와 함께)를 지니는 한 형질전환체를 선별하였고 공식 명칭 Y1845를 부여하였다.
재조합 단백질의 발현
:
Y1845를 30℃, YNB(크랙커 사이언티픽 인크 사로부터 획득가능한 효모 질소 염기) 최소 배지에서 O.D(620nm) 0.5에 도달될 때까지 성장시켰다. 이후 세포를 수확하고 세포 추출물을 준비하였다.
면역블랏팅에 의한 발현 생성물의 분석 :
추출물 제조:
세포를 파쇄 완충액에 재현탁시키고 기계적으로 분쇄하였다(유리 구슬). 추출물을 5000rpm에서 5-10분 동안 원심분리하였다. 상청액 분획을 12.5% SDS-PAGE 상에서 러닝시켰다.
파쇄 완충액: 5OmM 포스페이트 Na 완충액(PH: 7.5)
4mM EDTA
Tween-20 0.5%
+ 프로테아제 억제제 칵테일(Complete/ROCHE)
세포 농도: 5ml 파쇄 완충액 중의 100ml 배양물(OD: 0.5)
= 농도 10 OD 단위/ml.
미정제 추출물 정제: 추출물을 원심분리함(5-10분/5000rpm)
재조합 단백질의 검출
정제된 추출물을 12.5% SDS-PAGE 상에서 러닝시키고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 면역염색을 실시하였다.
웨스턴 블랏 분석(도 5):
시약: 마우스 모노클로날 항체 항-S(GSK 바이올로지칼즈에
의해 제조됨)-(희석비: 1/500)
CsCl 밀도 구배 원심분리
:
Y1845 균주에서 입자의 형성을 CsCl 밀도 구배 원심분리로 분석하였다. 미정제 추출물(~20mg의 총 단백질)을 12ml의 1.5M CsCl 구배(벡크만(Beckman) 70.1 Ti 로터(rotor)에서 88시간 동안, +8℃, 40,000rpm)로 분석하였다. 분획(~0.6ml)을 취합하고 항-S 항체를 이용한 면역블랏에 의해 분석하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 부유밀도(buoyant density) 1.21 및 1.20g/㎤에 해당하는 구배의 동일한 분획(번호 10과 11)에서 웨스턴 블랏 피크가 나타났다. 구배 분석에 의해 3중(triple) 입자 형성이 뒷받침된다.
참고문헌
(1) Harford N, Cabezon T, Colau B, et al., "Construction and Characterization of a Saccharomyces Cerevisiae Strain (RIT4376) Expressing Hepatitis B Surface Antigen", Postgrad Med J 63, Supp. 2: 65-70, 1987.
(2) Jacobs E, Rutgers T, Voet P, et al., "Simultaneous Synthesis and Assembly of Various Hepatitis B Surface Proteins in Saccharomyces cerevisiae", Gene 80: 279-291, 1989.
(3) Vieira J and Messing J, "The pUC plasmids, an M13mp7-Derived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers", *_Gene 19: 259-268, 1982.
(4) Hinnen A, Hicks JB, and Fink GR, "Transformation of Yeast", Proc Natl Acad Sci USA 75: 1929-1933, 1980.
(5) Broach JR, Strathern JN, and Hicks JB, "Transformation in Yeast Development of a Hybrid Cloning Vector and Isolation of the CAN 1 Gene", Gene 8: 121-133, 1979.
(6) Zhang H, et al., "Double Stranded SDNA Sequencing as a Choice for DNA Sequencing", Nucleic Acids Research 16: 1220, 1988.
(7) Dame JB, Williams JL. Mc Cutchan TF, et al., "Structure of the Gene Encoding the Immunodominant Surface Antigen on the Sporozoites of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum", Science 225: 593-599, 1984.
(8) Valenzuela P, Gray P, Quiroga M, et al., "Nucleotide Sequences of the Gene Coding for the Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen", Nature 280: 815-819, 1979.
(9) In SS, Kee-Hoyung L, Young RK, et al., "Comparison of Immunological Responses to Various Types of Circumsporozoite Proteins of Plasmodium vivax in Malaria Patients of Korea", Microbiol. Immunol. 48(2): 119-123, 2004;Microbiol. Immunol. 2004; 48(2): 119-123.
(10) Rathore D, Sacci JB, de Ia Vega P, et al., "Binding and Invasion of Liver Cells by Plasmodium falciparum Sporozoites", J. Biol. Chem. 277(9): 7092-7098, 2002. Rathore et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, 7092-8.
서열목록
Claims (20)
- 하기 단량체를 포함하는 면역원성 단백질 입자:a. 삼일열원충(P. vivax)의 CS 단백질과 B형 간염바이러스의 S 항원에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(CSV-S), 및b. 열대열원충(P. falciparum)의 CS 단백질 및 B형 간염바이러스의 S 항원에서 유래된 서열을 포함하는 융합 단백질(RTS), 및c. 선택적으로 B형 간염바이러스에서 유래된 S 항원.
- 제 1항에 있어서, 상기 B형 간염바이러스 항원이 adw 혈청형에서 유래됨을 특징으로 하는 입자.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 하나 이상의 추가 항원을 추가로 포함함을 특징으로 하는 입자.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼일열원충(P. vivax) 성분이 DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMA1 및 RBP 중에서 선택된 하이브리드 폴리펩티드임을 특징으로 하는 입자.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 13으로 제시된 하이브리드 포자소체(circumsporozoite) 단백질 서열을 포함함을 특징으로 하는 입자.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 입자와 애주번트(adjuvant)를 포함하는 조성물.
- 제 6항에 있어서, 상기 애주번트가 하기 물질들을 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물:- 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 같은 금속 염,- 수중유 에멀젼,- 톨 유사 수용체 효능제(toll like receptors agonist)(예컨대, 톨 유사 수용체 2 효능제, 톨 유사 수용체 3 효능제, 톨 유사 수용체 4 효능제, 톨 유사 수용체 7 효능제, 톨 유사 수용체 8 효능제 및 톨 유사 수용체 9 효능제),- 사포닌, 예를 들어, 퀼(Quil) A와 이의 유도체(예컨대, QS7 및/또는 QS21),- CpG 함유 올리고뉴클레오티드,- 3D-MPL,- (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트),- DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트),- MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트), 및이들의 조합물.
- 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 애주번트가 하기 물질들을 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 조성물:- 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄과 같은, 금속성 염과 결합된 사포닌,- 예를 들어, 수중유 제형으로써, 3D-MPL, QS21 및 CpG 올리고뉴클레오티드,- 예를 들어, QS21과 스테롤과 같은 스테롤을 추가로 포함하는, 리포좀 형태의 사포닌, 및- ISCOM.
- 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합된 열대열원충(P. falciparum) 및/또는 삼일열원충(P. vivax)에서 유래된 하나 이상의 추가 항원을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 비경구(parental) 투여용 백신인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 치료에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 정의된 입자 또는 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 정의된 조성물.
- 말라리아의 치료/예방을 위한 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 정의된 단백질 또는 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 정의된 조성물의 용도.
- 제 1항 내지 제 5항에 정의된 단백질 또는 제 6항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 정의된 조성물의 유효량을, 바람직하게는 백신으로서, 투여하는 단계를 포함하는 플라스모디움(Plasmodium) 감염에 걸리기 쉬운 환자를 치료하는 방법.
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 정의된 입자의 구성성분인 DNA 서열을 엔코딩하는 숙주(벡터/플라스미드)로서, 여기서 상기 벡터/플라스미드가 상기 DNA를 적절한 입자를 제조하기 위한 숙주내로 삽입시키는데 적합하거나 상기 플라스미드가, 적당한 조건하에서, 적절한 입자로 조립되는, 구성성분을 제조할 수 있음을 특징으로 하는 숙주(벡터/플라스미드).
- 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 정의된 입자의 생산 방법으로서, 적당한 숙주내에서 상기 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계 및 상기 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 생산 방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 숙주가 효모인 생산 방법.
- 제 16항에 있어서, 상기 효모가 사카로미세스(Saccharomyces), 스키조사카로미세스(Schizosaccharomycees), 클루베로미세스(Kluveromyces), 피치아(Pichia)(예를 들어, 피치아 파스토리아(Pichia pastoria), 한세눌라(Hansenula)(예를 들어, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이(Yarowia), 쉬반니오미세스(Schwaniomyces), 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces), 자이고아카로미세스(Zygoaccharomyces), 예컨대, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 칼스베로엔시스(S. carlsberoensis), 클루베로미세스 락티스(K. Lactis), Y1834 및 DC5로 구성된 군에서 선택되는 생산 방법.
- 제 16항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 계면활성제를 포함하는 적당한 조성물의 처리에 의한 숙주 세포의 용해에 의해 회수됨을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 계면활성제가 Tween(예컨대, Tween 20), 브리지(briji), 폴리에틸렌 및 글리콜을 포함하는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 생산 방법.
- 제 14항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 획득가능한 생성물.
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