TW200819462A - Vaccines for malaria - Google Patents
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200819462 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種新穎雜交/融合蛋白'製備及純化其 之方法、其在醫學上之用途、尤其在預防例如由間曰瘧原 蟲（户/α㈣知Λ以叫所引起之癌疾感染中之用 达、合有该蛋白質或諸如單株或多株抗體之針對該蛋白質 之抗體的組合物/疫苗及其用途、尤其在治療中之用途： Ο 本叙明亦擴展至該雜交/融合蛋白之脂蛋白顆粒及包含其 之調配物/疫苗及其用途。 /、 【先前技術】 瘧疾為世界主要健康問題之一，且每年超過…百萬人 疾病。該疾病之最普遍形式之一係由常見於熱帶及 '、’、π地區之寄生原蟲間日癔原蟲造成。有趣地是，該寄 生蟲可在低至攝氏15度之溫度下完成其蚊體内週期，從而 使該疾病得以在溫帶氣候中傳播。 間日癔原蟲之生命週期較為複雜，#需要兩種宿主（人 :及：蛾)以便凡成其生命週期。藉由將子孢子引入受感 :蚊虫虫之唾液中來引發人類之感染。該等子抱子遷移至肝 處感染肝細胞，其中該等子抱子經由細胞内紅血 東外^化成感染紅血球⑽c)之裂殖子階段以便於 血内階段中引發循環複製。藉由於咖中將大量裂料分 :成由蚊触攝取之有性階段配子體來完成該週期，其中該 等配子體經由一系列階段中 腺之子孢子。 又Μ腸中“以產生遷移至唾液 122372.doc 200819462 因為由間日瘧原蟲所引起之疾病很少致命，所以預防及 治療瘧疾之努力已集中於由惡性瘧原蟲（户抓謂 falciparum，Ρ· falciparum)所弓}起之I致命形式的疾病。 儘管由間日瘧原蟲所引起之疾病通常並不導致患者死 亡，但由於大量似乎漸增之案例、對患者生活品質之顯著 影響、對導致貧血及死亡之疾病嚴重發病率的漸增報導及 經潸影響，故仍需要針對該疾病之有效疫苗接種。 Ο Ο 間曰瘧原蟲之特徵為，一些菌株能夠藉由在呈現於外周 循環中以表現臨床症狀之前保持潛伏於肝臟中而造成延遲 感染。因此個體例如當旅行經過受感㈣區時可能受感染 且可能數月内不顯示症狀。其使疾病傳播成為可能且因此 通過受感染地區之個體不允許在通過受感染區域之後一段 規定時間内捐獻用於輸血之血液。 間日癔原蟲癔疾感染保持潛伏於肝臟内，同時癔原蟲經 歷紅血球前期裂體增殖。若癔原蟲在其逃至肝臟之前的此 ί1 “又時文到控制’則在患者中觀察不到疾病臨床症狀。 間曰癌原蟲之子孢子階段已鑑別為瘧疾疫苗之潛在標 革巴。使用滅活（受輕昭1石了^上 (又粞舨）子孢子之疫苗接種已展示對抗實驗 加人類癔疾的誘導保護（Am. Trop_ Med. Hyg 24: 297_ 4〇2，1975)。然而，實際 邏輯上不可能基於該方法採 “子抱子製造用於-般人群的癔疾疫苗。 ::子之主要表面蛋白稱為環子孢子 為该蛋白質與子孢子在其藉助於蚊蟲 ）; 至循環中之期甘一 触目接種初始部位轉移 月間（其中該子孢子遷移至肝臟）的運動性及侵 122372.doc 200819462 染有關。 瘧原触物種之cs蛋白特徵在於侧接有非重複胺基（N-末 知）及缓基（C-末端）片段之中心重複域（重複區域）。間曰瘧 原触之中“域包含若干塊重複單元，通常包含9個串聯胺 基酸。 - 在一些亞洲菌株中，在中心重複區域之後存在約12個胺 • 基酸之額外序列（參見SEQ ID N。11)。後者之功能未知。 f、 然而，儘管並未對該等胺基酸加以研究，但一些人假設其 可能與疾病臨床症狀之延遲發作有關。認為N_末端之特徵 在於稱為區域I之5個胺基酸之序列（參見SEQ ID No 1)。亦 認為c-末端之特徵在於包含稱為區域11之18個胺基酸之序 . 列。後者含有在所有瘧疾CS蛋白中高度保守之細胞黏附基 元（參見 SEQ ID No. 2)。 多個組織已提出基於環子孢子蛋白之亞單位疫苗。該等 疫苗中之兩者已經受臨床測試；一者為合成肽，另一者為 (J 重組蛋白（Ball〇u等人，Lancet: i 1277 (1987)及 Herrington 等人，Nature 328:257 (1987))。該等疫苗在激發抗子孢子 反應上獲得成功。儘管如此，該反應之程度令人失望且對 - 於一些接種疫苗者完全不產生反應。此外，對後續注射不 一 存在抗體含量之π增強’’及活體外淋巴細胞增殖檢定的結果 表明大多數該等志願者之Τ細胞並不識別免疫優勢重複。 儘管如此，但於各研究中接種之一志願者並不產生寄生蟲 血症。 WO 93/1 01 52及WO 98/05355描述衍生自惡性瘧原蟲之 122372.doc 200819462 蛋白的疫田且使用其中所述之方法似乎獲得-些針對惡 ^生瘧原触進仃疫苗接種的進展（亦參見只邛叩以等人，2〇〇5,
Vaccine 23, 2243-50)。 ， 惡性瘧原蟲中之CS蛋白具有保守之中心重複區域。相比 至夕、兩種形式（命名為VK21 〇或I型及VK247或π 型）之間日#原、蟲CS蛋白。此使其更難以鑑別具有諸如免 疫原性之所有所需特性之cs蛋白之構築體，該構築體在不 考慮CS蛋白特定類型之情況下提供對抗間曰癌原蟲的一般 性保護，因為針對ί型之中心重複區域的抗體未必識別_ 之相應區域上的抗原決定基且反之亦然。 十世、、、己八十年代至二十世紀九十年代，表現且測試了 作為疫苗之重組間日瘧原蟲cs蛋白並獲得有限成功 (Collins等人，1989· Am· j Tr〇p Med 咖 4〇, 455-64)。 已進行一些工作以便採用一或多個交聯之抗原決定基產生 基於多抗原肽（MAP)之疫苗（Narde出及Tam，1995，pharm
Biotechnol. 6，803-19)。 【發明内容】 本發明提供一種用於瘧疾疫苗之新穎改良型抗原，咸信 其產生體液反應以及細胞免疫反應。咸信抗原/顆粒誘導 產生針對I型及II型之cS蛋白的抗體。抗原/顆粒亦可誘導丁 輔助細胞，例如Thl及/或Th2細胞。 因此，本發明提供一種包含以下各部分之免疫原性雜交 融合蛋白： a·至少一個衍生自間日瘧原蟲之丨型環子孢子蛋白之中 122372.doc .〇 200819462 心重複部分的重複單元； b. 至少一個衍生自間日瘧原蟲之11型環子孢子蛋白之中 心重複部分的重複單元丨及 c. 衍生自B型肝炎病毒之表面抗原S。 序列表 SEQ. ID. No. 1 SEQ. ID. No. 2 SEQ· ID. No. 3-9 SEQ. ID. No. 10 SEQ. ID. No. 11 SEQ. ID. No. 12 SEQ. ID. No. 13 SEQ. ID. No. 14 SEQ. ID. No. 15 SEQ. ID. No. 16 SEQ. ID. No. 17 SEQ. ID No. 18 SEQ. ID No. 19 SEQ. ID No. 20
SEQ ID No· 21 N-末端之區域I(如上所述） 來自C-末端之區域II的基元(如上所述） I型CS蛋白之各種單體 來自II型CS蛋白之主要單體 存在於亞洲菌株中之額外胺基酸 雜交蛋白之核苷酸序列(經優化以在EColi中表現） 雜交蛋白CSV之胺基酸序列 來自II型CS蛋白之次要單體 雜交蛋白CSV之核苷酸序列(經優化以在酵母中表現） 雜交融合蛋白CSV-S之核苷酸序列 雜交融合蛋白CSV-S之胺基酸序列 RTS表現卡匣及所預測RTS，S蛋白之核苷酸序列 雜交融合基因CSV-S之核苷酸序列(選殖於PHIL-D2整 合型巴斯德畢赤酵母表現載體中） 表現於巴斯德畢赤酵母中之雜交融合蛋白CSV-S之胺基 酸序列 展示於圖12中，為全長重組CSV-S蛋白與截短蛋白 (CSVtr-S)之序列對比
【實施方式】 本文中雜交蛋白係指衍生自間日瘧原蟲I型及π型之蛋白 質。 本文中雜交融合蛋白係指與另一蛋白質或其片段融合衍 生自間日癔原蟲I型及π型的蛋白質。 在一態樣中’本發明之雜交融合蛋白包含衍生自間日瘧 原蟲之CS蛋白的雜交蛋白（csv)及來自Β型肝炎之表面抗 原，該表面抗原通常為稱為S抗原之主要表面蛋白，諸如 衍生自adw血清型之s抗原。 122372.doc -10- 200819462 本發明之CSV衍生抗原組份（亦即雜交蛋白）通常與s蛋白 之胺基末端融合。更特定言之’ csv片段之c末端與該城 原之N末端融合。
. 咸托來自B型肝炎之表面抗原的存在增強雜交蛋白之CS / 蛋白部分的免疫原性，有助於穩定性且/或辅助蛋白質之 ’ 複製製造。 ' ‘ 雜父蛋白通常亦將含有來自諸如間日癔原蟲(I型或㈣) 之癔原蟲之CS蛋白的^^末端片段，例如包含諸如展示於 SEQIDNo 1中之胺基酸之區域1的片段。 或者雜交蛋白可含有來自惡性瘧原蟲之CS蛋白的N末端 片段。 卜 在悲樣中，雜父蛋白可包含一或多個惡性瘧原蟲之中 • 心區域的重複單元。舉例而言，包含1、2、3、4、5、6、 7、8、9個或更多個重複單元。 雜父蛋白通常含有來自諸如間日瘧原蟲（I型或II型）之瘧
Ci 原棘之Cs蛋白的C末端片段，例如包含諸如展示於SEQ ID
No 2中之區域η的片段。 或者雜交蛋白可含有來自惡性瘧原蟲之CS蛋白的c末端 片段。 ·- 仏言不希望叉理論約束，但認為Ν及C末端片段包括若 干丁及B細胞抗原決定基。 在重組蛋白中，通常將非天然胺基酸引入選殖過程中且 ;表、、、ς所表現之蛋白質中觀察到。舉例而言，可將若干個 (諸如1、2、3、4或5個）胺基酸插入蛋白質之起始端⑺末 122372.doc -11 - 200819462 端)中。若將4個胺基酸插入蛋白質之起始端，則其可例如 為ΜΜΑΡ。此外或或者可將！、2或3個（諸如工個）胺基酸插 入蛋白質之主體/中部之例如約胺基酸259、26〇、261或 262處。插人之胺基酸可為具有符號Ρ之胺基酸。在-態樣 中，所用蛋白質在蛋白質之主體/令部並不包括經由選殖 過程插入之任何胺基酸。 Γ、 Ο 本發明亦擴展至稱為，，截短”形式之雜交蛋白，例如_ 中所示且標記為CSVtr_S。 ^此本發明提供其中至少存在於CS蛋白之N末端之精胺 酉夂田木區域（在胺基酸6〇附近）被移除/缺失的截短雜交蛋 白0 在一悲樣中，本發明提供其中至少胺基酸丨至”（或丨至 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 8 69或70)缺失之截短雜交蛋白。該截短雜交蛋白可包 括至多4個插人蛋白質之起始端的胺基酸，諸如MMAP。匕 在樣中，本發明係關於排除全長重組蛋白之胺基5 至64(包括在内）的雜交蛋白。 忒/。亥等截紐雜父蛋白可用於如下所述之本發 態樣。 ，、他 間日瘧原蟲之任何合適菌株可用於本發明，其包括：拉 :美洲/南美洲菌株(亦即Sal u Belem)、朝鮮菌株、中 :株、泰國菌株、印度尼西亞菌株、印度菌 株。剛mN。13之構築體係基㈣鮮菌株（ : 之，南朝鮮菌株）。 口 122372.doc -12- 200819462 具有I型CS蛋白之間日濟疮虫， 瘧原虫虫比具有II型CS蛋白之間曰 癌原虫虫更普遍。因此為士 … 纟本發明之-態樣中，在雜交蛋白 中包括比Π型之重複單元爭玄认十A 艾曰 星早70更夕的來自I型之重複單元。 更特疋5之，本發明之雜六 > 乏雜父蛋白可包括1至15個重複單 凡，諸如9個來自I型之重複單元。 I型CS蛋白之合適單體之杳 早餸之實例提供於SEQ ID No.s 3至9 中0 〇 在本^明之—貫施例中，提供包含I型之不同重複單元 (諸如彼等列於SEQIDNo.3至9中之每一者中之一者)之混 合物的雜交蛋白。 一或多個重複單元可於雜交中重複，例如兩個seqid No3及/或4之單體可併入該構築體中。 a) 在—態樣中，以蛋白包含SEQIDNGk單元。 b) 在-態樣中，cs蛋白包含SEQ ID N。4之單元，其視情 況與如以上緊接段落a)中所述之單元組合。 〇 G)在—態樣中，以蛋白包含卿IDN。5之單元，其視情 况14如以上緊接段落a)或b)中所述之單元組合。 d)在-態樣中，CS蛋白包含_ m N。6之單元，其視情 " %與如以上緊接段落&)至e)中所述之單元組合。 0在-態樣巾，CS蛋白包含_ ID N0 7之單元，其視情 況與如以上緊接段落幻至d)中所述之單元組合。 g) 在-態樣中，CS蛋白包含_ ID N。8之單元，其視情 況與如以上緊接段落a)至f)中所述之單元組合。 h) 在一態樣中，CS蛋白包含SEQ ID N〇 9之單元，其視情 122372.doc •13- 200819462 況與如以上緊接段落a)至g)中所述之單元組合。 合適組份II型CS蛋白之重複單元之實例提供於SEQ ID No.s 10及14中，諸如10。 - 在本發明之一態樣中，提供具有5個或更少衍生自II型 . 之重複單元（諸如一個單體）的雜交蛋白，例如SEQ ID No. ~ 1 0中所示。 •雜交蛋白亦可包括見於某些間日癔原蟲之亞洲菌株中存 在於重複區域末端之12個胺基酸插入物，例如SEQ ID No. Π 11中所示。 在一實施例中，雜交蛋白包含衍生自間日瘧原蟲CS蛋白 之257個胺基酸。 在一實施例中，雜交融合蛋白包含494個胺基酸，例如 其中25 7個衍生自間日瘧原蟲CS蛋白。 在一態樣中，CS蛋白包含全長蛋白質。 在一態樣中，所用CS蛋白為截短形式，例如圖12中所示 I , 或其中缺失約1至約67個胺基酸之相應截短形式。 在一實施例中，由於選殖處理而將1至5個額外胺基酸插 入序列之起始端中，例如插入之ΜΜΑΡ或MMAPG。 • 雜交蛋白及/或片段亦可進一步包括衍生自惡性癔原蟲 及/或間日瘧原蟲之抗原，例如其中該抗原係選自DBP、 PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5 、PvMSP6、 PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMAl 及 RBP或其片段。 在一實施例中，雜交融合蛋白（csv-s)大體上具有展示 於SEQ ID No· 17中之胺基酸序列。在該序列中，胺基酸6 122372.doc -14- 200819462 至262係衍生自CSV且269至494係衍生自S。剩餘胺基酸藉 由遺傳構建引入（必要時其可尤其不同）。 SEQ ID No. 17之CSV-S融合蛋白之特性提供於下表中：
分析 完整蛋白質 分子量 51794.75 m.w. 長度 494 1微克= 19.307皮莫耳 莫耳消光係數 90780+/-5% 1 A(280)= 0.57 mg/ml 等電點 7.33 pH 7.4下電荷 1.05 完整蛋白質組成分析 胺基酸 計數 重量％ 頻率％ 帶電(RKHYCDE) 106 26.35 21.46 酸性(DE) 38 8.82 7.69 鹼性(KR) 39 10.68 7.89 極性(NCQSTY) 134 167 28.15 34.68 27.13 33.81 疏水性(AILF W V) A Ala 52 7.14 10.53 CCys 18 3.58 3.64 D Asp 24 5.33 4.86 EGlu 14 3.49 2.83 FPhe 17 4.83 3.44 GGly 64 7.05 12.96 HHis 4 1.06 0.81 I lie 17 3.71 3.44 KLys 20 4.95 4.05 L Leu 42 9.18 8.50 M Met 8 2.03 1.62 N Asn 32 7.05 6.48 PPro 40 7.50 8.10 QGIn 21 5.20 4.25 RArg 19 5.73 3.85 S Ser 30 5.04 6.07 TThr 26 5.08 5.26 VVal 25 4.78 5.06 WTrp 14 5.03 2.83 YTyr 7 2.21 1.42 B Asx 0 0.00 0.00 ZGlx 0 0.00 0.00 XXxx 0 0.00 0.00 .Ter 1 0.00 0.20 122372.doc -15- 200819462 SEQ ID No· 20之CSV-S融合蛋白之特性提供於下表中： Nishikawa及 Ooi 1987 分析 完整蛋白質 分子量 51762.69 m.w. 長度 494 1微克= 19.319皮莫耳 莫耳消光係數 90780 ± 5% 1 A(280)= 0.57 mg/ml 等電點 7.33 pH 7.4下電荷 1.05 完整蛋白質組成分析 胺基酸 計數 重量％ 頻率％ 帶電(RKHYCDE) 106 26.37 21.46 酸性(DE) 38 8.83 7.69 鹼性CKR) 39 10.69 7.89 極性(NCQSTY) 134 168 28.17 34.89 27.13 34.01 疏水性(AILFWV) A Ala 52 7.14 10.53 C Cys 18 3.59 3.64 D Asp 24 5.34 4.86 EGlu 14 3.49 2.83 FPhe 17 4.83 3.44 GGly 64 7.05 12.96 HHis 4 1.06 0.81 I lie 17 3.72 3.44 KLys 20 4.95 4.05 L Leu 42 9.18 8.50 M Met 7 1.77 1.42 N Asn 32 7.05 6.48 PPro 40 7.50 8.10 QGIn 21 5.20 4.25 RArg 19 5.73 3.85 SSer 30 5.05 6.07 TThr 26 5.08 5.26 VVal 26 4,98 5.26 WTrp 14 5.04 2.83 YTyr 7 2.21 1.42 B Asx 0 0.00 0.00 ZGlx 0 0.00 0.00 XXxx 0 0.00 0.00 .Ter 1 0,00 0.20 雜交融合蛋白CSV-S可（例如）採用質體pGFl-S2(參見圖4 及進一步詳述實例）來製備，該質體當相應於CSV之適當序 122372.doc -16- 200819462 列插入Smal選殖位點時處理插入物以驗證融合蛋白c S 〇 _ SEQ ID N。17之雜交融合蛋白之㈣酸序列提供於剛 ID No 16中。該序列之csv部分經密碼子優化以優 母中之表現。 Ο 或者雜交融合蛋白CSV-S可（例如）如實例2中所述製備。 本發明之雜交融合蛋白之替代性核㈣序列提供 ID No 19中且其胺基酸序列提供於SEq N〇 2〇中。 本發明亦提供編碼本發明之蛋白質的核苷酸序 DNA。 在-實施例中，編碼本發明之蛋白質之核㈣序列由較 佳衍生自酵母基因且併人表現载體中之轉錄控制元件側 接。 可（例如）構建本發明之雜交蛋白之表現卡厘， 列特徵： 八匕3下 Ο • 啟動子序列，其衍生自 TDH3基因。 (例如）釀酒酵母认 編碼適當CSV-S雜交融合蛋白之序列。 終止序列 •含於衍生自（例如）釀酒酵母A R G 3基因之序列内的轉錄 因之啟動 特異f生啟動子之貫例為來自釀酒酵母丁〇出基 子（Musti等人）。 入用 本發明亦擴展至用於製備雜交融合蛋白之载體。 合適質體可隨後用於將編碼雜交融合蛋白之序列引 122372.doc 200819462 於合成之合適宿主中。合適質體之實例spRIT15546，一 種具有CSV-S表現卡匣之2微米級載體，參見其於圖3中之 質體圖。 或者’質體為熟習此項技術者所已知且/或描述於實例 中0 質體將通常含有幫助選擇之嵌入式標記，例如編碼抗生 素抗性或LEU及/或HIS營養缺陷型之基因。 在一態樣中，質體為游離型質體，亦即蛋白質之基因並 不整合於宿主之DNA中。 本發明亦係關於經本發明之載體轉形的宿主細胞。宿主 細胞可為原核或真核細胞，但較佳為酵母，例如酵母屬酵 母例如釀酒酵母（〜cc/mromya ，諸如ATCC資料庫中之DC5(寄存編號20820)， 名稱為RIT DC5 cir(o)。寄存者：Smith Kline-RIT)及非酵 母屬酵母。該 等酵母 包括 裂 殖 酵 母 {Schizosaccharomyces){ 例 如 粟 酒 裂 殖 酵 母 {Schizosaccharomyces pombe)) 、 刻 魯 維 酵 母 例如乳酸刻魯維酵母
Mdb))、畢赤酵母（Pk/ni)(例如巴斯德畢赤酵母（ρζ·Μζ·β paWorzi))、漢森酵母⑽/α)(例如多形漢森酵母 {Hansenula polymorpha))-耶氏酵母（rarrow/a)(例如解脂 耶氏酵母（hrawk 及許旺酵母 (Schwanniomyces)( ^lJ ^ ^ ^ B£ -f： (Schwanniomyces occidentalis)) 〇 122372.doc -18 - 200819462 在一態樣中，本發明係關於表現（^¥-8雜交融合蛋白及/ 或其免疫原性顆粒之重組酵母菌株Y1834(及其用途），表 見其製備實例。 y 在一態樣中，本發明係關於表現以¥_8雜交融合蛋白及/ 或其免疫原性顆粒之重組酵母菌株Υ1835(及其用途），參 見其製備實例。 在一替代性態樣中，本發明係關於表現以乂_8雜交融合
Ο 蛋白及/或其免疫原性顆粒之重組酵母菌株γΐ84〇(及其用 途）。 ' X月係關於包含、娜，+ %、明t融合蛋白 ^亥苦酸序列的該酵母（或另—酵母），該等酵母用於製備 忒嘁合蛋白之用途及製備該融合蛋白所涉及之方法。 核苷酉夂序列(或其部分，諸如編碼雜交蛋白之部分，但 視情況非編碼蛋白質S之部分）可絲宓派工反儿 一 母之相關宿主中表現。’碼子優化以於諸如酵 二：：：文中，經密碼子優化意欲意謂該等密碼子經修 八適合於在相關宿主中表 碼子選擇，例如4甘生 /、j次了不為最佳密 - 欠最件Μ 於最佳形式之表現，則可選擇 人取仏之優化形式。 在酵母細胞中， 表現後该雜交融合蛋白（包含 夠天然組裝於包含㈣I⑼ Β蛋白（U抗原）能 顆粒中。 Α、 貝之大I單體之脂蛋白結構體/ 該等顆粒亦可稱為病毒 述為多聚體脂蛋白顆粒。―。肖專顆粒亦可描 122372.doc -19- 200819462 藉由各自使癔原蟲衍 肝炎病毒之抗原或病 或細菌之合適宿主中 該等顆粒可以多種方法製備，例如 生性抗原與另—融合搭配物（例如Β型 毒結構蛋白）融合且使其在諸如酵母 表現來製備。 斤&又體酵母囷株亦在其基 肝^ @r U、、且甲具有一或多個β型 肝火S表現卡匣之整合複本 J,, 斤件卤株&成融合蛋白形 式雜交蛋白以及非融合S抗原。該等雜$ 胩认4人， 唸寻雜父蛋白可天然組
衣於已§雜交融合蛋白之單辦 早體及S抗原之單體的脂蛋白顆 粒中。 儘管不希望受理論約束， Υ1 834中時，儘管顆粒組合物 受化，但遇為其基本上由雜 成0 但該等顆粒例如當表現於 可能根據所用特異性酵母而 交融合蛋白之單元/單體組 因此在一些情況下，脂蛋白顆粒亦可含有未融合之城 原之單體’例如在作為於酵母丫1835中之製備結果的顆粒 Ο 中〇 因此在-態樣中’本發明提供包含本發明之雜交融合蛋 白的免疫原性顆粒。 因此在-態樣中，該顆粒為由於其基本上由雜交融合蛋 白之單元組成而稱為單純顆粒的顆粒。在本發明之一替代 性態樣中’免疫原性脂蛋白顆粒在所謂之雙重或混合顆粒 中包含一或多種雜交融合蛋白及一或多個未融合蛋白S單 元。 圖1及7為根據本發明之該態樣之脂蛋白顆粒的電子顯微 122372.doc -20- 200819462 圖(儘管在不同酵母中製備)。 該等展示於顯微圖中之 蔗糖梯度進行純化，尤^猎㈣統技術使用氯化絶及 特定二 一吏用連績氯化鉋及蔗糖梯度，更 特二次嚴糖梯度接著3次連續⑽梯度。 本叙明包括純化該等顆粒 糖梯度。 之方法，例如採用氯化鉋及薦 有二卜’假定用以自細胞中釋出蛋白質之界面活性劑亦可 有助於穩定脂蛋白顆粒。在 t ^了 X恶樣中，脂蛋白顆粒包含 吐、、W 20彳古4丨丄 J如k自吐溫（Tween)(諸如 土’皿 20)、布利吉、 — Λ 一醇。該顆粒可（例如）包含1 重里或更少界面活性齊丨，諸如0·5重量％或 面活性劑。 里/0之界 ::::明之脂蛋白顆粒可有助於進一步激發活 5亥雜父融合蛋白之免疫反應。 j發明亦係關於包含與合適稀釋劑或載劑混合之免疫保 護量之本發明之蛋白質或顆粒的疫苗。 又 本發明亦擴展至包含本發明之雜交/融合蛋白或顆粒及 包含癔疾抗原u其通常具有該顆粒之瘧疾抗原）之病毒載 體及（視情況）佐劑的組合物。 在本况明書之上下文中，賦形劑係指醫藥調配物中其自 身無治療作用之組份。稀釋劑或載劑屬於賦形劑之^義 内。 在態樣中’本發明之組合物包含如本文所述之雜交融合 蛋白及/或顆粒及佐劑。 口 122372.doc -21 - 200819462 在一 κ細例中’病毒載體構築體係如W〇 2004/055 187中 所述。 在一貝她例中，該等融合蛋白係為混合物且因此可以單 . —_配物形式獲得。在-替代性實施例中，融合蛋白以獨 • 立調配物形式製備且向患者分別投與。 ^ 在另一悲樣中，本發明係關於針對惡性瘧原蟲及間曰瘧 . 原蟲之組合治療，其包含： (、 包含衍生自間日癔原蟲之CS蛋白之抗原的免疫原性融合 蛋白；及 包含何生自惡性癔原蟲之CS蛋白之抗原的免疫原性融合 蛋白。 • 在本發明之該態樣中，衍生自融合體之間日瘧原蟲組份 • 之以蛋白的抗原可為天然存在（天然）cs蛋白，諸如I型及 或π型或其片段。或者該抗原可為如上所述之雜交（嵌合） 蛋白，諸如於SEQ ID No 13及/或15中所鑑別之蛋白質。 Ο 衍生自惡性癔原蟲之融合蛋白抗原組份可根據wo 93/10152製備（例如^^RTS，s(其中，，^表示未融合單體）或 RTS ’其中兩者皆適用於本發明之該態樣。 h 在一實施例中，衍生自惡性癔原蟲之抗原包含至少4個 中心重複區域之重複單元。更特定言之，該抗原包含含有 至少160個胺基酸之序列，該序列大體上與cs蛋白之c末 端部分同源。cs蛋白可能缺少c末端之最後12至14個胺基 酸。 ， 更特定言之，包含惡性瘧原蟲之CS蛋白之一部分的相關 122372.doc -22- 200819462 融合蛋白可大體上相應於經由線性連接子與S抗原之N末端 同框融合之惡性癔原蟲7G8的胺基酸207-395。該連接子可 包含來自S抗原之preS2的一部分。 更特定言之，衍生自所用惡性癔原蟲之融合蛋白為由如 SEQ ID No 18中所提供之RTS表現卡匣核苷酸序列所編碼 的融合蛋白。 合適S抗原可包含preS2。合適血清型之實例為adw (Nature 280:815-819，1979) 〇 在一悲樣中，本發明之雜交融合蛋白包含衍生自例如公 開之美國申請案第2006/194196號（亦如W0 2004/1 13369所 公開）中所述之突變型S蛋白的一部分。 。δ亥文獻描述經標記
其中序列12至22描述突變型8蛋白之特 一者皆以引入的方式併入本文中。 本發明亦係關於該治療組合之用
其包含： b.至 ，更特定言之作為用 瘧原蟲感染之患者的 效量之該等組份中之 曰瘧原蟲之I型環子孢子蛋 重複部分的重複單元；
白之中 環子孢子蛋白之中 I22372.doc -23· 200819462 心重複部分的重複單元；及 免疫原性融合蛋白，龙 抗原。 〃匕3何生自惡性瘧原蟲之cs蛋白的 舉例而言’其中該雜交抗原 例如其可以混合物形々η * 贪曰係件Ik技與， 在 工δ時投與或者可經調配依次投與。 在另1樣中，提供-種治療組合，其包含： 免疫原性雜交抗原，其包含： a·至少^個衍生自pq α ^ 、— 自間日瘧原蟲之I型環子孢子蛋白之中 心重複部分的重複單元； b ·至少一個衍生自ρ气 . 間日瘧原蟲之π型環子孢子蛋白之中 心重複部分的重複單元；及 編碼諸如該雜交抗原之癔疾抗原㈣ 舉例而言’其中該雜交抗原及該病毒載體係伴隨投與， 例如其可以混合物形式同時 、j f彳又與或者可經調配依次投與。
L 如本文中所用，術語"伴隨”意謂其中在不超過12小時之 期限内(例如在不超過1小時之期限内），通常在一場合中 (例如在同一次健康專家就診期間)投與該組份組合，例如 其中連續或同時投與該組合。 本發明亦包括包含該等實施例中之每-者之該等要素的 疫苗組合物。 本發明亦包括包含該蓉用A、、二& + 3々寺用於治療瘧疾之要素的疫苗套 組。 本發明亦擴展至包含該等要素之初始增強療法，例如使 用來自惡性癔原蟲之抗原及/或顆粒引發且使用來自間日 122372.doc -24- 200819462 瘧原蟲之抗原及/或顆粒增強且反之亦然。 初:增強療法可（例如）包含單獨或僅衍生自間日瘧原蟲 之組份。 在另一實施例中，引發可以質體/裸DNA來實現且使用 / 本發明之抗原來增強且或反之亦然。 • 或者，引發可以適當病毒載體來實現且使用本發明之抗 原來增強或反之亦然。 (、 一般初始增強療法描述如下。 舉例而言： •可使用包含至少一個來自間日癌原蟲之cs蛋白的工型 重複單元及至少一個來自間曰瘧原蟲之cs蛋白的11型 * 重複單70之抗原（諸如辅助抗原）進行引發且可使用編 • 碼相同/相應抗原之病毒載體進行增強； •可使用包含至少一個來自間日瘧原蟲之重複單元或抗 原決定基及至少一個來自惡性瘧原蟲之cs蛋白的重複 〇 單元或抗原決定基之抗原（諸如辅助抗原）進行引發且 可使用編碼相同/相應抗原之病毒蛋白進行增強； •可使用編碼包含至少一個來自間日癔原蟲之cs蛋白的 I型重複單元及至少一個來自間日瘧原蟲之cs蛋白的Η ^ 型重複單元或包含至少一個來自間日癔原蟲之重複單 元或抗原決定基及至少一個來自惡性瘧原蟲之c S蛋白 的重複單元或抗原決定基之抗原的病毒載體進行引發 且可使用呈蛋白質及/或免疫原性顆粒形式之相同/相 應辅助抗原進行增強。 122372.doc -25 - 200819462 ’抗原包括本發明之雜交融合蛋白及/或 在忒荨初始增強療法中，抗原通常將為辅 在本發明之該/該等態樣中，如上所述對於衍生自間曰 癔原蟲之雜交蛋白的選擇亦適用。因此在—態樣中，雜交 蛋白具有SEQ ID No 13之序列。
來自惡性癔原蟲之RTS，S及抗原（呈減原性顆粒形式） 可如WO 93/10152中所述製備。 在〜樣中本兔明&供編碼本發明之雜交蛋白（或者 雜交融合蛋白）的複製缺陷型病毒載體。合適病毒載體可 何生自腺病毒载體、腺相關病毒載體（aav)、麻疹病毒、 慢病毒、《病#、桿狀病#、疱疹單純型病毒及諸如牛 禮、禽痘、鹤痘、金絲雀痘、豬痘及綿羊痘/山羊疫之疫 病毒。舉例而言’ wo 2004/055187中描述用於製備編碼癔 疾抗原之腺病毒載體的方法。
在此上下文中 免疫原性顆粒。 助抗原。 由載體所編碼之蛋白質可（例如）經修飾以防止蛋白質在 表現期間之糖基化作用，例如可將某些絲胺酸置換為丙胺 酸殘基以減少糖基化作用。 腺病毒 本發明之腺病毒載體包含一或多個編碼一或多個免疫原 性多肽之異源聚核苷酸（DNA)。 本發明所用之腺病#載體可衍生自—系列$乳動物宿 主。 腺病毒（本文中稱為’’Ad，，或 nAdv”）具有由三種主要蛋白 122372.doc •26- 200819462 質（六位體蛋白（π)、五位體鹼性蛋白（m)及多節纖維蛋白 (IV))以及大量其他次要蛋白質（VI、vm、ιχ、Iiia及 IVa2)組成之二十面體衣殼的特徵形態（RusseU wc· - Gen Viri〇1，81:2573_2604)。病毒基因組為具有與5,末端共 / 價連接之末端蛋白質的線性雙股DNA，其具有反轉末端重 ' 複（ITR)。病毒DNA與強鹼性蛋白VII及稱為mu之小肽緊密 、、” a。另蛋白質V以該DNA·蛋白質複合體封裝且提供經 由蛋白質VI與衣殼之結構性連接。該病毒亦含有病毒編碼 之蛋白酶，該蛋白酶為加工某些結構性蛋白質以產生成熟 感染性病毒所必需。 已分離出超過1〇〇種感染各種哺乳動物物種之不同腺病 • 毋血清型，其中51種具有人類起源。因此腺病毒載體中之 一或多者可衍生自人類腺病毒。該等人類衍生型腺病毒之 貫例為 Adi、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、
Ad34、Ad35、Ad5 0/51，尤其為 Ad5、Adll 及 Ad35。已基 〇 於大量生物學、化學、免疫學及結構性標準將人類血清型 分類成6種亞屬（A-F)。 儘官基於Ad5之載體已廣泛用於大量基因治療試驗中， ·. 但可能歸因於一般人群中由於自然感染而導致先前存在免 ·· 疫性從而存在對Ad5及其他C組腺病毒載體使用之限制。
Ad5及其他C組成員趨向於成為最流行血清型之一。可由 於在治療期間暴露於载體而產生對現存載體之免疫性。對 血清流行型載體之該等類型之先前存在或已產生的免疫性 可限制基因治療或疫苗接種嘗試之有效性。因此替代性腺 122372.doc -27- 200819462 病毒血清型在尋求能夠規避宿主免疫反應之基因傳遞系統 方面構成極其重要的目標。 替代性血清型之一該區域為彼等衍生自非人類靈長類 - (尤其黑猩猩）腺病毒之區域。參見美國專利6,〇83,71ό，其 描述兩種黑猩猩腺病毒之基因組。 已展示黑猩猩（"Pan”或”C”）腺病毒載體與人類腺病毒載 ： 體同樣有效誘導對轉基因產物之強烈免疫反應（Fitzgerald .、 等人，J· Immunol. 170:1416)。 \ 非人類靈長類腺病毒可自黑猩猩之腸系膜淋巴結中分 離。黑猩猩腺病毒十分類似於人類腺病毒c亞型以允許ei 缺失型病毒在HEK 293細胞中複製。黑猩猩腺病毒在種系 务生學上仍與較常見人類血清型（Ad2及Ad5)不同。pan6與 Pan5、7及9相關性降低且在血清學上與Pan5、7及9不同。 因此腺病毒載體中之一或多者可衍生自非人類靈長類腺 病毒’例如黑猩猩腺病毒，諸如選自血清型Pan5、、 Pan7及Pan9之腺病毒。 腺病毒載體亦可衍生自一種以上腺病毒血清型且各血清 型可來自相同或不同來源。舉例而言，其可衍生自一種以 ·_ 上人類血清型及/或一種以上非人類靈長類血清型。w〇 ，， 2〇〇5/〇01103中揭示構建嵌合腺病毒載體之方法。 存在某些與將異源DNA插入腺病毒中相關之大小限制。 人類腺病毒具有封裝至多105%之野生型基因組長度的能 力（Bett等人 1993，J Vir〇i 67 (10)，5911-21)。已展示人類 腺病毒之封裝下限為75%之野生型基因組長度（Parks等人 122372.doc -28- 200819462 1995, J Virol 71 (4)，3293-8)。 適用於本發明之腺病毒之一實例為與人群中普遍天然存 在血清型（諸如Ad2及Ad5)不同的腺病毒。其避免誘導針對 ‘ 載體之有效免疫反應，該等免疫反應藉φ經纟中和抗體而 . 阻斷載體吸收且影響毒性來限制隨後投與同一血清型之功 - 效。 : 因此，該腺病毒可為並非普遍天然存在之人類病毒血清 (： 型的腺病毒。自動物中分離之腺病毒在免疫學上具有不同 衣殼蛋白、六位體蛋白、五位體蛋白及纖維蛋白組份，但 該等腺病毒在種系發生學上緊密相關。特定言之，該病毒 可為非人類腺病毒，諸如猿腺病毒，且尤其為黑猩猩腺病 • 毒，諸如Pan 5、6、7或9。該等病毒株之實例描述於w〇 03/000283中且可自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection), 10801 University Boulevard, Manassas，Virginia 201 10-2209及其他來源獲得。所需黑猩 Q 獲腺病毒病毒株為 Pan 5[ATCC VR-591]、pan 6[ATCC VR_ 592]及 pan 7[ATCC VR-593]。 因為在目標群體中缺乏對腺病毒之預先存在免疫性，尤 ·. 其缺乏交又中和抗體，所以認為使用黑猩猩腺病毒比使用 人類腺病毒血清型有利。黑猩猩腺病毒與預先存在中和抗 體反應之交叉反應與在某些備選人類腺病毒載體之情況下 的35%相比僅存在於2%之目標群體中。該等黑猩猩腺病毒 與較常見人類亞型Ad2及Ad5不同，但其與並非為普遍亞 型之人類子群E之Ad4更緊密相關。pan 6與pan 5、7及9相 122372.doc -29- 200819462 關性較低。 本發明之腺病毒可為複製缺陷型❶其意謂其在非互補細 胞中與野生型病毒相比具有較低複製能力。其可藉由使病 毒突變，例如藉由使與複製有關之基因缺失（例如使^&、 Elb、E3或E4基因缺失）來實現。
U 、—根據本發明之腺病#載體可衍生自包含功能性ei缺失之 複製缺陷型腺病毒。因此本發明之腺病毒載體可歸因於缺 乏表現腺病毒Ela及Elb之能力（亦即在功能上缺失ει&及 Elb)而為稷製缺陷型。重組腺病毒亦可具有其他基因之功 能性缺失[參見w〇 G3/_283]，例如Ε3*Ε4基因之缺失。 y將腺病毒遲早期基因Ε3自形成重組病毒之—部分的腺病 毒序列中排除。Ε3之功能並不為產生重組腺病毒顆粒所必 需。因此不必置換該基因產物之功能以便封裝適用於本發 明之重組腺病毒。在一特定實施例中，重組腺病毒在功能 上已缺失Ε1及Ε3基因。該等載體之構建描述於_等人，
Human Gene Therapy 15:519-530, 2004 中。 儘管可能需要保留E4 〇RF6功能，但亦可構造具有⑽ 口功此性缺失之重組腺病毒。本發明之腺病毒載體亦可含 有遲早期基因E2a之缺失。亦可於腺病毒基因組之晚期基 =1二5广—者中造成缺失。中期基因IX及1Va之類似 缺失可能適用。 可於其他結構性或非結 失。上述缺失可單獨使用， 可僅含有E1之缺失。或者， 構性腺病毒基因中產生其他缺 亦即用於本發明之腺病毒序列 王口P基因或其對破壞其生物活 122372.doc -30- 200819462 性有效之部分的缺失可以任意組合使用。舉例而言，在一 例示性載體中，腺病毒序列可具有E1基因及E4基因之缺失 或El、E2a及E3基因之缺失或E1及E3基因之缺失（諸如Ela 及E lb之功能性缺失及至少部分E3之缺失）或在有或無E3缺 失之情況下El、E2a及E4基因之缺失等等。該等缺失可為 該等基因之部分或完全缺失且可為與其他突變（諸如溫度 敏感性突變）組合使用以獲得所需結果。 可於其中該病毒能夠複製之任何合適細胞株上產生該等 腺病毒載體。詳言之，可使用提供導致其複製特徵減弱之 病毒載體中所缺少之該等因子（諸如E1及/或E4)的互補細胞 株。其中該細胞株可為HeLa[ATCC寄存編號CCL 2]、 A549 [ATCC 寄存編號 CCL 185]、HEK 293、KB [CCL 17]、Detroit [例如 Detroit 510、CCL 72]及 WI-38 [CCL 75] 細胞，但不限於此。該等細胞株可全部獲自美國典型培養 物保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201 10-2209。其他合適親本細胞株可由其它來源 獲得，諸如在應用微生物學及研究中心（Centre for Applied Microbiology and Research)(CAMR，UK)之歐洲動物細胞培 養物保藏中心（European Collection of Animal Cell Cultures)(EC ACC)中以EC ACC編號96022940寄存之細胞所 代表的PER.C6©細胞或Her 96細胞（Crucell)。 本發明擴展至已知細胞株用於製備編碼本發明之蛋白質 的病毒載體的用途。 編碼免疫原性多肽之聚核苷酸序列可為經優化以用於哺 122372.doc -31 · 200819462 乳動物細胞之密踩； _ ^ ^ 山碼子。该密碼子優化詳細描述於w〇 05/025614中，例如由第37頁開始。 /本發明之—實施例中中病毒載體包含聚核芽酸構 築體其中4等構築體包含N末端前導序列。信號序列、 跨膜域及細胞質域獨立地全部視情況存在或缺失。在本發 明之-實施例中，所有該等區域存在但經修飾。
U ;本土月之腺病母載體的啟動子可為來自HCMv正基 動子例如其中包括包含外顯子1之HCMV IE基因 之5’非轉譯區且内含子心购灿⑽中所述經完全或部 分排除。 當若干抗原融合成融合蛋白時，該蛋白質將由在單個啟 動子控制下之聚核苷酸編碼。 在本發明之—替代性實施财，若干抗原可單獨經由單 個啟動子表現’該等啟動子中之每一者可相同或不同。在 本發明之另—實施例中’―些抗原可形成與第-啟動子相 關之W合蛋白且其他抗原可與第二啟動子相關，該第二啟 動子可與第一啟動子相同或不同。 因此’腺病毒載體可包含一或多個表現卡匿，其中每一 者編碼在-個啟動子控制下之一個抗原。或者或另外其可 。3或夕個表現卡匣’其中每一者編碼在一個啟動子控 制下之-種以上之抗原’該等抗原藉此表現成融合體。各 表現卡E可存在於腺病毒載體之—個以上基因座中。 可將、、扁碼右人表現之免疫原性多狀的該（等）聚核苦酸插入 腺病毒缺失區域中之任—者中，例如Ει缺失區域中。 122372.doc -32- 200819462 儘管兩個或兩個以上編碼免疫原性多肽之聚核苷酸可以 融合體形式連接，但所得蛋白質可表現成融合蛋白，或其 可表現成獨立蛋白質產物，或其可表現成融合蛋白且隨後 分解為較小亞單元。 在本說明書之上下文中，免疫原性意欲指禁止免疫反應 之能力。該反應可在以包括/需要合適佐劑之適當調配物 投與該蛋白質時產生。可需要包含類似或低於初始劑量之 劑量的增強劑以便獲得所需免疫原性反應（包括以不同實 體增強，亦即異源增強）。 本發明之組合物/醫藥調配物亦可以混合物形式包括一 或多種其他抗原，諸如彼等衍生自惡性瘧原蟲及/或間曰 癔原蟲之抗原，例如其中該抗原係選自DBP、PvTRAP、 PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、 PvMSP8、PvMSP9、PvAMAl 及 RBP或其片段。 其他實例，衍生自惡性瘧原蟲之抗原，包括PfEMP-1、 Pfs 16抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1 及 TRAP。其他瘧原蟲抗原包括惡性瘧原蟲EBA、GLURP、 RAP1、RAP2、钳合蛋白（Sequestrin)、Pf332、STARP、 SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、 Pfs230及其於其他瘧原蟲中之類似物。 在本發明之疫苗中，可直接使用雜交抗原之水溶液。或 者，可將經或未經預先冷凍乾燥之蛋白質與佐劑混合或以 佐劑吸附，該等佐劑包括（但不限於）明礬、胞壁醯二肽、 諸如Quil A之皂苷。 122372.doc -33- 200819462 特定佐劑為彼等選自金屬鹽、水包油乳液、鐘樣受體促 效劑（尤其鐘樣受體2促效劑、鐘樣受體3促效劑、鐘樣受 體4促效劑、鐘樣受體7促效劑、鐘樣受體8促效劑及鐘樣 又體9促效诏）' 皂苷或其組合之群的佐劑，其限制條件為 / 金屬鹽僅與另一佐劑組合使用且不單獨使用，除非其以使 ' 得不超過約6〇%之抗原吸附於金屬鹽上之方式調配。更特 ： 定言之，不超過約50%(例如40%之抗原）吸附於金屬鹽上 ( 且在一實施例中不超過約30%之抗原吸附於金屬鹽上。吸 附於金屬鹽上之抗體量可由在此項技術中所熟知之技術測 定。可藉由（例如）在磷酸根離子（諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽 水）存在下调配組合物或藉由提高抗原與金屬鹽之比率來 _ 提高游離抗原量。在一實施例中，佐劑並不包括金屬鹽作 為唯一佐劑。在一實施例中，佐劑並不包括金屬鹽。 在一實施例中，佐劑為鐘樣受體（TLR) 4配位體，例如 諸如脂質A衍生物之促效劑，尤其單麟醯基脂質a或更特 (j 定言之3去醯化單磷醯基脂質A (3D-MPL)。 3去醯化單磷醯基脂質a由美國專利第4,912,〇94號及英 國專利申請案第2,220,21 1號（Ribi)獲知且可自Ribi ·* Immunochem，Montana，USA獲得。 ' 3D-MPL係以商標]VIPL®自Corixa公司講得且主要促進 CD4+ T細胞與IFN-g (Thl)表型之反應。其可根據GB 2 22〇 211 A中所揭示之方法製備。在化學上，其為3-去醯化單 磷醯基脂質A與3、4、5或6醯化鏈之混合物。在本發明之 組合物中通常使用小微粒3D-MPL。小微粒3D-MPL具有使 122372.doc -34- 200819462 得其可經由0·22 μιη過濾器無菌過濾之粒徑。該等製劑描 述於國際專利申請案第WO 94/21292號中。 已知脂質Α之合成衍生物且認為其為tlr4促效劑，其包 括（但不限於）： OM 174 (2_去氧-6-0-[2·去氧-24(11)-3-十二醯氧基四-癸醯 基胺基]-4-0-膦酸基- 葡糖吡喃糖基]-2_[(κ)·3_羥基四 癸醯基胺基]-α-D-葡糖吡喃糠基二氫磷酸酯），（w〇 95/14026) 〇 OM 294 DP (SSJW-S-KR)-十二醯氧基四癸醯基胺基]_4_ 側氧基-5-氮雜- 9(R)-[(R)-3-經基四癸酸基胺基]癸_1，1〇_二 醇，1，1〇-雙（二氫磷酸酯）（W〇 99/64301 及 WO 00/0462) ° OM 197 MP-Ac DP (3S-，9R)-3-[(R)_十二醯氧基四癸醯基 胺基]-4-側氧基-5·氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸醯基胺基]癸_ 1，10-二醇，1-二氫磷酸酯10-(6_胺基己酸酯）（w〇 01/46127) 〇 當使用3D-MPL時抗原及3D-MPL通常與明釁一起傳遞戍 存在於水包油乳液或水包多油乳液中。因為3D-MPL為效 應T細胞反應之刺激物，所以併入其係有利的。或者3D_ MPL可以脂質體形式調配。 其他可使用之TLR4配位體為烧基葡萄胺糖礙酸酯 (AGP)’諸如彼等揭示於WO 9850399或US 6303347(亦揭 示製備AGP之方法）中之烷基葡萄胺糖磷酸酯，或如 6764840中所揭示之AGP之醫藥學上可接受之鹽。一些 122372.doc -35- 200819462 AGP為TLR4促效劑且一些為TLR4拮抗劑。認為其皆適用 作佐劑。 用於本發明之另一免疫刺激物為Quil A及其衍生物。 * QuU A為自南美樹種石驗木（Quiiaja Saponaria Molina)中分 _之皂芽製劑且首先由於具有佐劑活性而由Dalsgaard等人 - 於 1974 ( Saponin adjuvants** 5 Archiv. fur die gesamte Virusf〇rschung，第 44卷，Springer Verlag，Berlin，第 243- 254頁）加以描述。已藉由HPLC分離Quil A之純化片段，該 (h 々 等片段保留佐劑活性且無與Quil Α相關之毒性（ΕΡ 0 362 278)，例如QS7及QS21(亦稱為QA7及QA21)。QS21為一種 衍生自石驗木樹皮之天然皂苷，其誘導CD8 +細胞毒性T細 胞（CTL)、Thl細胞及主要IgG2a抗體反應。 已描述進一步包含固醇之特定qS21調配物（w〇 96/33 739)。QS21··固醇之比率通常為約為ι:1〇〇至ι:1之重 量比。 (J 通常存在過量固醇，QS21··固醇之比率為至少1:2 w/w。 通常用於人類投藥時，QS21及固醇將以每劑量約1叫至約 100 (諸如每劑量約1〇 至約50 Kg)之範圍存在於疫苗 «. 中。 - 脂質體通常含有中性脂質，例如在室溫下通常為非晶體 狀之磷脂醯膽鹼，例如蛋黃磷脂醯膽鹼、二油醯基磷脂醯 膽鹼或二月桂基碟脂醯膽鹼。 脂質體亦可含有增強由飽和脂質組成之脂質體之脂質 體-QS21結構穩定性的帶電脂質。在該等情況下，帶電脂 122372.doc -36- 200819462 質之量通常為1-20% w/w，諸如5-10%。固醇與磷脂之比率 為 l-50%(mol/mol)，諸如 20-25%。 該等組合物可含有MPL(3_去醯化單磷醯基脂質a，亦稱 為3D-MPL)。3D-MPL作為去-〇-醯化單粦醯基脂質a之3型 與4、5或6醯化鏈的混合物由GB 2 220 21 1 (Ribi)獲知且由 Ribi Immunochem，Montana製造。 在本發明之組合物中通常使用具有使得其可經由〇.22 μιη過濾器無菌過濾之粒徑的小微粒3D-mpl。該等製劑描 述於 WO 94/2 1292 中。 該等皂苷可以微胞、混合微胞（通常如此，但不僅僅與 膽汁鹽混合）形式分離或當與膽固醇及脂質調配時可呈 ISCOM基質（EP 0 109 942 B1)、脂質體或相關膠狀結構（諸 如續蟲樣或環樣多聚體複合體或脂類/層狀結構及薄片）形 式，或呈水包油乳液形式（例如WO 95/17210中所述）。該 等皂苷可通常與諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之金屬鹽結合（w〇 98/15287) 〇 該皂苷通常以脂質體、ISCOM或水包油乳液形式存在。 亦可使用免疫刺激性募核苷酸。用於本發明之佐劑或疫 苗之募核苷酸的實例包括含CpG寡核苷酸，其通常含有兩 個或兩個以上由至少三個、更通常至少6個或更多個核芽 酸分開之二核苷酸CpG基元。CpG基元為其後接著為鳥嗓 呤核苷苷酸之胞嘧啶核苷酸。CpG募核苷酸通常為脫氧核 苷酸。在一實施例中，儘管磷酸二酯鍵及其他核苷酸間鍵 在本發明之範疇内，但募核苷酸中之核苷酸間鍵為二硫代 122372.doc -37- 200819462 磷酸酯鍵或更佳為硫代磷酸酯鍵。具有混合型核苷酸間鍵 聯之寡核苷酸亦包括於本發明之範疇内。製備硫代磷酸酯 募核苷酸或二硫代磷酸酯之方法描述於US 5,666，153、US 5,278,302及 WO 95/26204 中。 募核苷酸之實例如下： TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826) TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG r x TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006) TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668) TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)， 該等序列可含有經硫代磷酸酯修飾之核苷酸間鍵聯。 由於替代性CpG募核苷酸於其中具有無價值缺失或添 加，故其可包含一或多種上述序列。
CpG寡核苷酸可由在此項技術中已知之任何方法合成（例 f、 如參見EP 468520)。便利地，該等寡核苷酸可使用自動合 成儀合成。 TLR2促效劑之實例包括肽聚醣或月旨蛋白。 • 諸如咪啥莫特（Imiquimod)及雷西喧莫特（Resiquimod)之 、 咪唑幷喹啉為已知TLR7促效劑。單股RNA亦為已知TLR促 效劑（人類之TLR8及小鼠之TLR7)，而雙股RNA及多聚 1C(多聚肌苷酸多聚胞苷酸-一種商用合成病毒RNA擬似物） 為例示性TLR3促效劑。3D-MPL為TLR4促效劑之實例，而 CpG為TLR9促效劑之實例。 122372.doc -38- 200819462 可或者或另外包括免疫刺激物。在一實施例中，該免疫 刺激物為3去醯化單磷醯基脂質A(3D-MPL)。 佐劑組合包括3D_MPL及QS21(EP 〇 671 948 B1)、包含
• 3D MPL 及 QS21 之水包油乳液（WO 95/17210、WO / 98/56414)或用其他包括脂質體之載劑調配之3D-MpL(Ep 〇
689 454 B1)。其他較佳佐劑系統包含如us 6558670及US 65445 1 8中所述之3D_MPL、QS21及CpG寡核苷酸的組合。 p 在一悲樣中’該佐劑包含3D-MPL。 在一怨樣中’該佐劑包含qS2 1。 在一態樣中，該佐劑包含CpG。 在一態樣中’該佐劑包含qS21&3d_mpl。 - 在一悲樣中，該佐劑包含QS21、3D-MPL及CpG。 • 在一態樣中’該佐劑係調配成水包油乳液。 在一恶樣中，該佐劑係調配成脂質體。 在本發明之一實施例中，提供包含如本文中所述之雜交 I 蛋白（諸如與3D_MPL及載劑組合之CSV-S)的疫苗。該載劑 通常為水包油乳液或明礬。更特定言之，雜交蛋白以如本 文中所述之顆粒或混合顆粒形式存在。 - 本發明之蛋白質亦可囊封成諸如脂質體之微粒。 • 疫苗製劑通常描述於New Trends and Developments in
VaCCineS，由 等人所編，University park 化％
Baltimore，Maryland，U S A·，1978 中。脂質體内之封裝例 如由Fullerton，美國專利4,235,877描述。 存在於各疫苗劑量中之本發明之蛋白質的量經選擇為在 122372.doc -39- 200819462 Ο
典型疫苗中誘導免疫保護反應且無顯著不良副作用的量。 該量將視所用特異性免疫原及疫苗是否經輔助而變化。通 常預期各劑量將包含ι-1〇〇〇盹蛋白質，例如叫，諸 如HMOO吨，更特定言之10_40 。特定疫苗之最適量可 由/y及觀測文檢者之抗體效價及其他反應的標準試驗來確 定。根據初始接種疫苗，受檢者較佳接受約4週之增強， 接著只要感染風險存在，則每6個月進行重複增強。藉由 使用佐劑及或免疫刺激物增強對本發明之蛋白質的免疫反 所用3D-MPL之量通常較小，但視疫苗調配物而定可在 每劑量1-1000 範圍内，通常為每劑量吨及更多， 諸如每劑量1與1〇〇吨之間（每劑量1〇、2〇、3〇、4〇、5〇、 6〇、70、80或 90 pg)。 本赉明之佐劑或疫苗中CpG或免疫刺激性募核苷酸的量 通系杈小，但視疫苗調配物而定可在每劑量㈣範圍 内，通常為每劑量^⑽叫及更多，諸如每劑量丨與丨⑽㈣ 之間(每劑量1〇、20、30、4〇、5〇、6〇、7〇、8〇或9〇叫)。 用於本I明之佐劑之專苦的量可在每劑量卜1〇〇〇叫範圍 内為母剤畺1-500 pg及更多，諸如每劑量丨_25〇吨 且更特定言之每劑量1與1〇〇叩之間（每劑量1〇、2〇、％、 40 、 50 、 60 、 70 、 80或90 μβ)。 在另一態樣中，本發明提供提供對抗由惡性瘧原蟲及/ 或間日瘧原蟲所引起之瘧疾之免疫保護的疫苗組合，其包 含衍生自諸如本文令所述之間日瘧原蟲之CS蛋白的雜交蛋 122372.doc 200819462 白。 在-態樣巾，提供包含如本文所述之免㈣性顆粒且視 情況進-步以混合物形式包含卿之免疫原性顆粒(如 WO 93/10152中所述）及適當免疫刺激性佐劑的疫苗。 本發明之調配物可用於為達預防性目的及治療性目的之 治療。 因此本發明提供本文中所述之本發明之任何態樣用於治 療（尤其如本文所述之疫苗組合物用於醫學）的用途。 本發明之另一態樣提供製備本發明之雜交蛋白的方法， 該方法包含在合適宿主（較佳酵母）中表現編碼該蛋白質之 核苷酸序列並回收產物。 本發明亦擴展至製備醫藥組合物（諸如採用—或多個本 文中所述之態樣的疫苗）之方法。 本發明之另-態樣為藉由投與有效量之如在上文中所述 之疫苗來治療易受瘧原蟲感染之患者的方法。 疫苗包括非經腸疫苗。 因此本發明擴展至諸如本發明之雜交融合蛋白及/或脂 蛋白顆粒的抗原及包含其之組合物用於治療且尤其用於製 造用以治療/預防癔疾(諸如由間日癔原蟲及/或惡性癔原蟲 所引起之瘧疾）之藥物的用途。 可在初始增強療；去中投與蛋白質及/或編石馬其之病毒载 體’例如尤其如WO 2004/037189中所述。 在本說明書之上下文中，，，包含，，解釋為”包括，，。 包含某些要素之本發明之態樣亦意欲擴展至該等”由相 122372.doc -41 · 200819462 關要素組成’’或’’基本上由相關要素組成”之態樣。 實例 實例1 菌株Y1834之描述 酵母重組菌株Y1834表現CSV-S融合蛋白。其由經重組 表現載體PRIT15 546轉形之釀酒酵母宿主菌株〇(：：5組成。 DC5為具有下列基因型之實驗室酵母菌株（Atcc編號： 20820) : leu2-3、leu2_112、his3、canl-ΙΙ。雙重 leu_2 突 變允許選擇吸收及維持具有功能性LEU_2基因複本之 pRITl 5546載體。當生長培養基中缺少白胺酸時僅彼等攜 帶具有LEU-2基因之載體的細胞可生長。 載體PRIT1 5 546為具有CSV-S表現卡匣之酵母游離型表 現載體（2μ基載體）。重組表現係由得自酵母丁〇1^3基因之啟 動子驅動（組成性表現）。pRIT15546載體之構建詳述如 下。 構建PRIT15546載體。 構建具有用於酵母表現之適當密碼子使用率的CSV合成 基因且次選殖於PUC57載體（GenBank/EMBL寄存編號 Y14837)中。用適當酶限制消化所得質體pUC57/csv及 酵母表現載體pGfl-S2。由多步驟選殖程序構建載體 pGfl-S2(於GSK)。已具有S表現卡匣之該載體允許以n 末端舁B型肝炎病毒之8基因同框融合方式構建融合基 因。在序列驗證之後將最終表現載體稱為pRITi5546(圖 3)。 122372.doc -42- 200819462 轉形菌株DC5。 將leu及his營養缺陷型dc5 用重組質體pRIT15546轉形 脂選擇性板上。選擇一轉形 表現重組蛋白： 菌株藉由使用酵母標準方案 。將經轉形之細胞塗鋪於瓊 體且接受正式名稱Y1 834。 使Y1834在30°C下在補夯δ畀故、曲& 〇 至取、、S /辰度8 gg/mi組胺酸之 彻（自^ker Seientifie In靖得之酵母氮基質）基本培養 基中生長至aD(62G nm則Q.5(此時G 77g)。隨後收集細 胞且製備細胞提取物。 提取物製備： 將細胞再懸浮於裂解緩衝液中且進行機械破壞（玻璃 珠）。將提取物在5000 rpm下離心5_1〇分鐘。將上清液部分 於 SDS-PAGE 4-20%上電 裂解緩衝液： 50 泳。 mM磷酸鈉緩衝液（pH:7.5) 4 mM EDTA 吐溫-20 0.5% +蛋白酶抑制劑混合物（完全/ROCHE) 細胞濃度： 5 ml裂解緩衝液中之1 〇〇 ml培養物 (OD : 0.5)= 10 OD單位/毫升之濃度。 粗提物澄清： 離心提取物5-10分鐘/5000 rpm 偵測重組蛋白 將經澄清之提取物於SDS-PAGE 4-20%上電泳，將蛋白 質轉移至硝化纖維素膜上且經受免疫染色。參見 圖2 122372.doc -43- 200819462 西方墨點分析： 試劑=小鼠單株抗體抗S抗體（由GSK Biological^ 備）-(稀釋度：1/500) 可市面上購得之抗S抗體可由彼等本方法中所用之 抗體取代。或者可使用抗CSV抗體，例如彼等自 NIH購得之稱為MR4的抗體。 C S V - S融合蛋白： MW理論值：51794道爾頓 MW表觀值：55 kDa 實例2 : 菌株Y1840之描述 巴斯德畢赤酵母菌株Y1840表現CSV-S融合蛋白。菌株 Y1 840含有四個整合於基因組中之CSV-S融合基因的複 本。為獲得表現csv-s融合蛋白之菌株，以具有csv-s + 匣及功能性HIS4基因之整合型線性DNA片段轉形巴斯德畢 赤酵母菌株GS115。 GS115為具有基因型his4之實驗室酵母菌株（ATCC編 號：20864)。his4突變允許選擇吸收具有CSv_S+ E及功 能性HIS4基因之pRIT15607衍生之線性DNA片段。 載體PRIT1 5607為具有CSV-S表現卡匣之巴斯德畢赤酵 母整合型表現載體。重組表現由強的緊密調節型曱醇誘導 性AOX1啟動子驅動。pRIT156〇7載體之構建詳述如下。 構建PRIT15607載體 藉由PCR擴增存在於PRIT15546上之CSV-S融合基因且選 122372.doc -44- 200819462 殖於pGEM-T Easy中間載體（promega，目錄編號A1360) 中。在序列驗證之後，以適當限制酶消化重組質體且選 殖於PHIL-D2巴斯德畢赤酵母整合型載體中。在序列驗 - 證之後將最終表現載體稱為pRIT15607(圖5)。由 • PRIT15607質體所編碼之CSV-S融合蛋白除甲硫胺酸2置 換為纈胺酸以外幾乎與SEQ ID No 17中詳述之序列相同 : (參見 SEQ ID No 19 及 SEQ ID No 20)。以 Notl核酸内切 ( 酶消化卩111丁156〇7而釋放68166卩線性片段，其可藉由於 固有AOX1基因座同源重組而整合入酵母基因組中。 轉形菌株GS 115 以重組質體pRITl 5607轉形GS 115宿主菌株。在轉形之 、 前，以N〇tI限制消化整合型載體以便釋放具有表現卡匣 及HIS4選擇性標記之線性DNA片段。NotI限制消化將有 利於AOX1基因座之整合。將經轉形之細胞塗鋪於緩脂 選擇性板上。藉由定量點潰墨點法分析選擇多複本整合 純系。在該等具有高複本數之整合CSV-S表現卡匣的所 選純系之中，選擇其中展示CSV-S重組蛋白之最高表現 量者且給予正式名稱Y1840。該純系具有四個以又_8融 - 合基因複本。 ,, 表現重組蛋白質： 使Υ1840在30°C下在補充有1%甘油作為碳源之γΝΒ(自 Kracker Scientific Inc購得之酵母氮基質）基本培養基中生 長至O.D. (62〇 nm)為約〇.5(在該情況下為〇·7〇9)。隨後收 集細胞且再懸浮於相同體積之補充有1%甲醇作為碳源（作 122372.doc -45- 200819462 為誘導物）之YNB培養基中且在30°C下培育約16小時。 提取物製備： 將甲解誘導型細胞離心’將細胞小球再懸浮於裂解緩種_ - 液中且進行機械破壞（玻璃珠或弗氏壓碎器（French press))。將提取物在5000 rpm下離心5-10分鐘。將上清夜 部分於8081八0丑12.5%上電泳。 裂解緩衝液 60 mM Na2HP〇4 40 mM NaH2P04 1 mM MgS04 10 Mm KC1 吐溫-20 0.5%
2 Mm PMSF 細胞濃度： 2.5 ml裂解緩衝液中之1〇〇⑹培 養物（OD:0.5)= 20 〇D單位/毫升 之濃度。 粗提物澄清： 偵測重組蛋白 Ο 離心提取物5-10分鐘/5000 rpm 將經澄清之提取物於SDS-PAGE 12.5%上電泳，將蛋白 質轉移至硝化纖維素膜上且經受免疫染色。參見圖6。 西方墨點分析： 試劑=小鼠單株抗體抗S抗體（由GSK Bi〇l〇gical^j 備）-(稀釋度：1/250) 可市面上購得之抗S抗體可由彼等本方法中所用之 抗體取代。或者可使用抗CSV抗體，例如彼等自 122372.doc -46- 200819462 NIH購得之稱為MR4的抗體。 CSV-S融合蛋白： MW理論值：51762道爾頓 MW表觀值：55 kDa 實例3 : 菌株Y1835之描述 酵母重組菌株Y1 83 5同時表現CSV-S融合蛋白與s抗原。 為獲得共表現CSV-S與S蛋白之菌株，以重組整合型表現 載體PRIT15582轉形已具有5個整合之S表現卡匣複本的釀 酒酵母菌株Y1295。 於GSK藉由多步驟轉形程序構建菌株γ1295。Y1295菌 株之構建描述於WO 93/10152中。菌株Y1295具有下列基 因型：leu2-3、leu2-l 12、gall。leu-2突變允許選擇吸收具 有CSV-S卡匣及功能性LEU2基因之pRIT1 5582衍生之線性 DNA片段。 載體pRIT1 5 5 82為具有CSV-S表現卡匣之酵母整合型表 現載體（Ty基載體）。由衍生自酵母TDH3基因之啟動子驅 動重組表現（組成性表現）。pRITl 5 582載體之構建詳述如 下。 構建pRITl 55 82整合型載體 用以構建PRIT15582載體之起始物質為表現質體 pRITl 5546(圖3)。該質體之構建描述於實例1中。以 Hindlll核酸内切酶消化pRITl 5546以釋放3706 bp長相應 於完整CSV-S表現卡匣（pTDH3 + CSV-S+tARG3)的DNA片 122372.doc -47· 200819462 段。將该HmdIII DNA片段（在經T4 DNA聚合酶填滿之 後）插入Ty基整合型載體pRlT13144之唯一 “^選殖位點 (經Sail限制性消化/經丁4處理）。所得質體pRITl 5582除 ^ 表現卡匣之外還含有作為選擇標記的酵母LEU2基因（圖 • 8)。以Xho1核酸内切酶消化PRIT15582釋放展示於圖4中 ' 之8500 4線性片段，其可藉由游離端與固有Ty元件之 • 同源重組而整合入酵母基因組中。 轉形菌株Y1295 ( 、卜 為獲得表現S與CSV-S蛋白之菌株，以8500 ^線性又“工 片段（圖9)轉形菌株Y1295且選擇Leu+菌落。獲得含有以 各種比率存在於基因組中之兩個表現卡匣之組的若干整 - 合體。選擇具有四個CSV-S卡匣複本的一個轉形體且給 予正式名稱Y1 835。 表現重組蛋白： 使 Y1 835 在 30C 下在 YNB (自 Kracker Scientific Inc 購得 〇 之酵母氮基質）基本培養基中生長至〇.D(620 nm)為約 〇·5(0·8)。隨後收集細胞且製備細胞提取物。 藉由免疫印跡法分析表現產物： ^ 提取物製備： - 將細胞再懸浮於裂解緩衝液中且進行機械破壞（玻璃 珠）。將提取物在5000 rpm下離心5-10分鐘。將上清液部分 在 SDS-PAGE 12.5%上電泳。 裂解緩衝液： 50 mM填酸鈉緩衝液（ρΗ:7·5)
4 mM EDTA 122372.doc -48- 200819462 - 細胞濃度： 吐溫-20 0.5% +蛋白酶抑制劑混合物（完全/ ROCHE) 於2.5 ml裂解緩衝液中之100 ml 培養物（〇D:0.5)= 20 OD單位/毫 升之濃度。 : 粗提物澄清： 離心提取物5-1 0分鐘/5000 rpm 偵測重組蛋白 將經澄清之提取物在SDS-PAGE 12.5%上電泳，將蛋白 質轉移至硝化纖維素膜上且經受免疫染色。 西方墨點分析（圖10): , 試劑： 1/小鼠單株抗體抗S抗體（由GSK 1 Biologicals製備）-(稀釋度： 1/250) 2/兔多株抗體抗CSV抗體（由 WRAIR善意提供）-稀釋度 1/20,000。 可市面上購得之抗S抗體以及抗間日瘧原蟲/CSP抗體可 由彼等本方法中所用之抗體取代。 參考文獻 (1) Harford N, Cabezon T，Colau B等人，’’Construction and Characterization of a Saccharomyces Cerevisiae Strain (RIT4376) Expressing Hepatitis B Surface Antigen”，Postgrad Med J 63，增子丨J 2: 65-70，1987 o 122372.doc -49- 200819462 (2) Jacobs E，Rutgers T，Voet P 等人，’’Simultaneous
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Sporozoites丨，，J· Biol. Chem. 277(9): 7092-7098, 2002. Rathore等人，2002, J. Biol· Chem· 277, 7092-8。 【圖式簡單說明】 圖1展示產生於酵母菌株釀酒酵母（S. cere vis iae)(具有組 成性啟動子）中之本發明之雜交蛋白之多聚體脂蛋白顆粒 的電子顯微圖。 圖2為本發明之雜交蛋白與比較蛋白（凝膠部分）之西方 墨點圖。 圖2a為本發明之雜交蛋白與比較蛋白之西方墨點圖（圖2 之全部凝膠，其中圖2中之泳道1、2及3為圖2a中之泳道 1、2及 8) 〇 圖3用於將編碼CSV-S融合蛋白之序列引入酵母宿主細 胞中之pRIT 15546重組載體的質體圖（游離型載體）。 圖4 PGF1-S2之質體圖，其為一種由用於形成所需抗原 122372.doc -51 - 200819462 與來自B型肝炎之s抗原的融合蛋白之GSK所製備的質體。 通殖Smal位點間的異源DNA序列（在切除12 bp Smal DNA片段之後）產生與s基因之同框融合。 圖5用於形成所要抗原與來自B型肝炎之s抗原的融合蛋 白之Prit 15607的質體圖。 用Notl消化釋出6.8 kb具有CSV-S表現卡匣加HIS4選擇 標記之線性DNA片段，該片段用於插入酵母染色體中。
圖6展示表現於γι 840中之重組蛋白的西方墨點圖。 圖7展示產生於巴斯德畢赤酵母（户化心，一種 非習知’’酵母，甲基營養酵母，其中重組表現由甲醇誘導 性啟動子驅動）中之本發明之雜交蛋白之多聚體脂蛋白顆 粒的電子顯微圖。 CSV-S顆粒自可溶性提取物中純化（基於RTS，S純化法）且 提父至電子顯微鏡分析。在使用磷鎢酸負染色之後使顆粒 顯現。標尺等於1〇〇 nm。 圖8 pRIT1 5582之質體圖。 用Xhol消化釋出8·5 kb具有csv_s表現卡匣加leu2選擇 標記之線性DNA片段，該片段用於插入酵母染色體中。 圖9用以整合esv-s卡匡之線性Xh〇u段的限制性圖 譜。 ° 圖1 〇表現於菌株Υ1 8 3 5中之重組蛋白之西方墨點圖 圖A :使用抗S抗體所顯示之WB 所加載之樣本（100 pg總蛋白質/孔）： 1:Y1631(產生RTS，S之菌株，作為對比） 122372.doc •52· 200819462 2:Υ1835 3:Y1835 4:Y1834
- 圖B :使用抗CSV抗體所顯示之WB . 所加載之樣本（100 pg總蛋白質/孔）： * 1:Y1631(產生RTS，S之菌株，作為對比） 2:Y1295 3:Y1835 Γ、 4:Υ1834 5: nr(另一構築體CSVS) 6: nr(另一構築體-僅s抗原） 圖11產生於菌株Y1835中之CSV-S，S混合型顆粒的電子 顯微圖。 CSV_S，S顆粒自可溶性細胞提取物中純化（基於RTS，S純 化法）且提交至電子顯微鏡分析。在使用磷鎢酸負染色之 U 後使顆粒顯現。標尺等於1〇〇 nm。 圖12展不重組全長CS蛋白與CS蛋白之截短形式（CSVtr-S)的對比。 122372.doc -53- 200819462 序列表 SEQ ID NO: 1
區域I KLKQP SEQ ID NO: 2
附加區域11 CSVTCG SEQ ID NO: 3
VK210重複 GDRAAGQPA SEQ ID NO: 4
VK210重複 GDRADGQPA SEQ ID NO: 5
VK210 重複 GDRADGQAA SEQ ID NO: 6
VK210 重複 GNGAGGQPA SEQ ID NO: 7
VK210 重複 GDGAAGQPA SEQ ID NO: 8
VK210 重複 GDRAA GQAA SEQ ID NO: 9
VK210 重複 GNGAGGQAA SEQ ID NO: 10
主要VK247重複 ANGAGNQPG SEQ ID NO: 11
12個胺基酸之插入 GGNAANKKAEDA SEQ ID NO: 12
Pv-CS核苷酸序列
Acacattgcggacataatgtagatttatctaaagctataaatttaaatggtgtaaac ttcaataacgtagacgctagttcactcggggctgcg 122372.doc 200819462 cacgtaggtcagtctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaa gaaggt ga tgc taaaaagaaaaaggacg gtaaaaaagcggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatc gcgcggatggtcaagcggcgggtaatggg gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcg gctggtcagccagcgggggatggtgc ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagccagcgggggatcgcgcgga tggtcaaccagccggtgatcgcgcggct ggccaagcggccggtaatggggcggggggtcaagcggccgcgaacggagcggggaac cagccaggcggcggtaacgctgcga ataaaaaagcggaagatgcgggtggtaacgcgggcggtaatgcgggcggccaaggtc agaacaacgaaggggctaatgcaccaaa cgaaaaatctgtcaaagaatatctcgataaagtccgcgctacagtagggacagaatg gacgccatgctctgtaacatgtggtgtcggggt acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaa tgatctcgaaacggatgtctgcaca
SEQ ID NO: 13
Pv-CS蛋白之胺基酸序列
THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGEN
PDDEEGDAKKKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGG
QPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG
QPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG
NAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVT
CGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCT SEQ ID NO: 14
次要2型重複 ANGAGDQPG SEQ ID No 15 CSV雜交基因 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 771 ϋ
ACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTGAACGGTGTTAATTTC
AACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAATCTGCTTCAAGAGGT
AGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAGAAGAAGAAGGACGGT
AAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAACCAGGTGACAGAGCC
GACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGTGACAGAGCTGCCGGT
CAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGTGCCGCCGGTCAACCT
GCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGACGGACAGCCAGCCGGC
GATAGOGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAAGCTGCTGCTAACGGT
GCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCTGAAGACGCTGGTGGT
AATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGTGCTAACGCTCCAAAC
GAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTCGGTACTGAATGGACT
CCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGAGTTAACGCCGCTAAC
AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTTTGTACT SEQ ID No 16 "csv-s融合體 核苷酸序列 ATGATGGCTCCCGGGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG 60 122372.doc
200819462
AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTCAA
TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCTAAG
AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCCGAACCAAAGAACCCAAGAGAAAACAAGTTGAAACAA
CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT
GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT
GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC
GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAA
GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT
GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGT
GCTAACGCTCCTUUVCGAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC
GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA
GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT
TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG
CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCrTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA
GACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAAT
TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTAT
CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC
TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA
TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCT
ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC
CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG
CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT
TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT
ATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAA SEQ ID No 17 胺基酸岸列
|MMAPG|THCGHNVDLSKAINLNGVNFNNVDASSLGAAHVGQSASRGRGLGENPDDEEGDAK
KKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDG
AAGQPAGDHADGQPAGDRADGQPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKA
EDAGGNAGGNAGGQGQNNEGANAPiiEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVTCGVGVRVRRR
DSVmTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLI
FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPI
PSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPF
IPLLPIFFCLWVYI SBQ ID NO. 18 RTS表現卡匣之核苷酸序列及RTS-HBsAg雜交蛋白之預測轉譯產物 由TDH3 ATG密碼子啟始之轉譯產物展示於DNA序列下方。
AAGCTTACCAGTTCTCACACGGAACACCACTAATGGACACAAATTCGAAATACTTTGACC
CTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAGCCCAAGAGAGCCAAGATTTAAATTTTCCTATG
ACTTGATGCAAATTCCCAAAGCTAATAACATGCAAGACACGTACGGTCAAGAAGACATAT
TTGACCTCTTAACTGGTTCAGACGCGACTGCCTCATCAGTAAGACCCGTTGAAAAGAACT
TACCTGAAAAAAACGAATATATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAACAAGAAGTTTA
ATGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGAGTTAGAATCATTTT
GAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGA
ATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTCAAAAATTAGCCTTT 122372.doc 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1485 60 120 180 240 300 360 420 480 4 94 200819462
TAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGGGTTACACAGAATATATAAC
ATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTATCCCTGGCATCCACTAAATATAATGGAGCTCGC
TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATCCCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACC
AACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCGCAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAG gcaaaaaacgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtatuvtgatgacac
AAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGC
TCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAGGTTGAAACCAGTTCCCTGAT^ATTATTCC
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TTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCA
AGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAAATGATGGCTCCCGATCCTAATG
MetMetAlaProAspProAsnA CAAATCCAAATi LaAsnProAsnA： GCAAAC AlaAsr ^CGCAAAC snAlaAsr nProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnA CAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProA 曰 nAlaAsnProAsnA .CGCAAACCCCAATGCAAA4 TiAlaAsnProAsnAlaAs: CAAACCCAAA 丨 LaAsnProAs ‘TCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG nProAsnAlaAsnProAanAlaAsnProAsna
CAAACCCAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATAAAAACAATCAAG
LaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsnLysAsnAsnGlnG
GTAATGGACAAGGTCACAATATGCCAAATGACCCAAACCGAAATGTAGATGAAAATGCTA
LyAsnGlyGlnGlyHisAsnMetProAsnAspProAsnAspProAsnArgAsnValAspGluAsnAlaA
ATGCCAACAATGCTGTAAAAAATAATAATAACGAAGAACCAAGTGATAAGCACATAGAAC snAlaAsnAsnAlaValLysAsnAsnAsnAsnGluGluProSerAspLiysHisIleGluG AATATTTAAAGAAAATAAAAAATTCTATTTCAACTGAATGGTCCCCATGTAGTGTAACTT LnTyrLeuLysLys 工 leLysAsnSerlleSerThrGluTrpSerProCysSerValThrC
GTGGAAATGGTATTCAAGTTAGAATAAAGCCTGGCTCTGCTAATAAACCTAAAGACGAAT
YsGlyAsnGlylleGlnValArglleLysProGlySerAlaAsnLysProLysAspGluL
TAGATTATGAAAATGATATTGAAAAAAAAATTTGTAAAATGGAAAAGTGCTCGAGTGTGT
euAspTyrGluAsnAspIleGluLysLysIleCysLysMetGluLysCysSerSerValP
TTAATGTCGTAAATAGTCGACCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAG
HeAsnValValAsnSerArgProValThrAsnMetGluAsnlleThrSerGlyPheLeuG
GACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGC
LyProLeuLeuValLeuGlnAlaGlyPhePheLeuLeuThrArglleLeuThrlleProG
AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTG
LnSerLeuAspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheLeuGlyGlySerProValCysLeuG
GCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTC
L»yGlnAsnSerGlnSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProIleCysP -4- 122372.doc 200819462
CTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTAT
RoGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhellellePheLeuPhelleLeuLeuLeuC
GCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAA
YsLeuIlePheLeuLeuValLeuLeuAspTyrGlnGlyMetLeuProValCysProLeuI
TTCCAGGATCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAG
LeProGlySerThrThrThrAsnThrGlyProCysLysThrCysThrThrProAlaGlnG
GCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTA
LyAsnSerMetPheProSerCysCysCysThrLysProThrAspGXyAsnCysThrCysI
TTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTT
LeProIleProSerSerTrpAlaPheAlaLysTryLeuTrpGluTrpAlaSerValArgP
TCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTG
HeSerTrpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheValGlyLeuSerProThrV
TTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGA
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GTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAACGAATTC
ErProPhelleProLeuLeuProIlePhePheCysLeuTrpValTyrlleEnd
CAAGCTGAAACAATTCAAAGGTTTTCAAATCAATCAAGAACTTGTCTCTGTGGCTGATCC
AAACTACAAATTTATGCATTGTCTGCCAAGACATCAAGAAGAAGTTAGTGATGATGTCTT
TTATGGAGAGCATTCCATAGTCTTTGAAGAAGCAGAAAACAGATTATATGCAGCTATGTC
TGCCATTGATATCTTTGTTAATAATAAAGGTAATTTCAAGGACTTGAAATAATCCTTCTT
TCGTGTTCTTAATAACTAATATATAAATACAGATATAGATGCATGAATAATGATATACAT
TGATTATTTTGCAATGTCAATTAAAAAAAAAAAATGTTAGTAAAACTATGTTACATTCCA
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AAAAATTTAAATATACACTGCCAACAAATTCCTTCGAGTTGTCCAATTTCACCACTTTTA
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CGGTCGTTTTACCTGCGTATTTTGGTTATTACCAGAGCCTTGTGCATTTTCTATGCGGT
TGTTATTGTACTCCGTTATCTGGTCAGTGTATCTGTTACAATATGATTCCACAACTTTTT
TGCCTCTTTTTCACGGGACGACATGACATGACCTAATGTTATATGAAGTTCCTTCTGAAC
TTTTCCACTAGCTAGTAAATGCTTGAATTTCTCAGTCAGCTCTGCATCGCTAGCAATACA
CCTCTTGACCAATCAATAATTTCATCGTAGTTTTCTATTTAGCTGAGATATATGTAGGT
TTAATTAACTTAGCGTTTTTTGTTGATTATTGTTGCCTTTACCAACTATTTTTCTCACAG
TAGGTTTGTAATCTAAGCTCCTTCTGAACGCTGTCTCAATTTCATCATCTTTCGGGATCT 122372.doc 200819462
CTGGTACCAAAATTGGATAAGCTT SEQ.ID.No 19:CSV-S融合基因（選殖於PHIL-D2整合型巴斯德畢赤酵母表現載體中） 核苷酸序列 ATGGTTGCTCCCGGGACCCATTGTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATTAACTTG AACGGTGTTAATTTCAACAACGTCGATGCTTCTTCTTTAGGTGCCGCTCATGTTGGTC TCTGCTTCAAGAGGTAGAGGTTTAGGTGAAAACCCAGACGACGAAGAAGGTGACGCT； AAGAAGAAGGi ΓΟΑΑ ΓΑΑΘ
5CCGAACC ：AAGCAGC
CCAGGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGCTGGT GACAGAGCTGCCGGTCAGCCTGCTGGTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGGT OCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAGCAGACGGACAACCAGCTGGTGACCGTGCTGAC GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAA GCTGCTGCTAACGGTGCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAAGAAAGCT GAAGACGCTGGTGGTAATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGT GCTAACGCTCCAAACGAAAAGTCTGTTAAGGAATACTTAGATAAGGTTAGAGCTACTGTC GGTACTGAATGGACTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTCGGTGTTAGAGTTAGAAGAAGA GTTAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTT TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTG CTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA GACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAAT TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTAT CGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATC TTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGA TCAACAACAACCAATACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCT ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATC CCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGG CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT ATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAA 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1485 o
SEQ.ID.NO 20:表現於巴斯德畢赤酵母中之csv-s融合蛋白 胺基酸序列 |mvapg|thcghnvdlskainlngvnfnnvdasslgaahvgqsasrgrglgenpddeegdak KKKDGKKAEPKNPRENKLKQPGDRADGQAAGNGAGGQPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDG AAGQPAGDRADGQPAGDRADGQPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAANGAGNQPGGGNAANKKA EDAGGNAGGNAGGQGQNNEGANAPNEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVTCGVGVRVRRR vnaankkpedltlndletdvct^51>vtn|menitsgflgpllvlqagfflltriltii>qsl DSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLF 工 LLLCLI FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPI ΡββΝΑΡΑΚΥΙΛ^Αβνΐ^ν^Ι^νΡΡνΟνίΡνΟΙ^ΡΤννίΙ^ΑΙΠίΜΜνίΥν^ΡΒΙΛ^ΐνΒΡΡ IPLLPIFFCLWVYI 60 120 180 240 300 360 420 480 494 122372.doc
Claims (1)
- 200819462 申請專利範圍： U 種免疫原性雜交融合蛋白，其包含：至少一個衍生自間日癔原蟲（户“…一之丨型環子孢 子蛋白之重複區域的重複單元； 至少一個衍生自間日瘧原蟲之„型環子孢子蛋白之 重複區域的重複單元；及 衍生自B型肝炎病毒之表面抗原s或其片段。 2·如請求項1之蛋白質，其中該蛋白質進一步包含來自間 曰癔原蟲之CS蛋白的N末端片段。 3. 如請求項2之蛋白質，其中該1^末端片段包含諸如展示於 SEQ ID No 1中稱為區域⑴之片段。 4. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中該蛋白質進—步 包含來自間曰瘧原蟲2CS蛋白的c末端片段。 5. 如請求項4之蛋白f，其中該c末端片段包含稱為區域 (11)之部分，諸如展示於SEQ ID No 2中之基元。 6. 如請求項丨至3中任-項之蛋白質，其中該〗型重複單元係 衍生自下列間日癔原蟲菌株中之-或多者：拉丁菌株:、 美國菌株（亦即Sal l Belem)、朝鮮菌株、中國菌株、泰 國囷株、印度尼西亞菌株、印度菌株及越南菌株。 7. =請求項⑴中任一項之蛋白質，其中該！型重複翠元係 選自—或多種展示於SEQ ID N〇 3至9中之單體。 8. 如請求項6之蛋白質，其包含至少9個I型重複單元。 9. 如凊求項7之蛋白質，其包含至少9個I型重複單元。 月长項1至3中任-項之蛋白質，其中該π型單體係選 1. a. b. c. 122372.doc 200819462 自一或多種展示於SEQ ID No 10或14中之單體。 11 ·如請求項1至3中任一項之蛋白質，其包含1個1];型重複。 12.如請求項1至3中任一項之蛋白質，其進一步包含位於某 - 些間日癔原蟲亞洲菌株中所見之重複區域末端的12個胺 基酸之插入。 13 .如請求項12之蛋白質，其中該等胺基酸為彼等展示於 ’· SEQ ID No 1 1中之胺基酸。 ( I4·如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中該B型肝炎s抗原 係衍生自adw血清型。 15.如請求項1至3中任一項之蛋白質，其進一步包含一或多 種衍生自惡性瘧原蟲（凡加吻^謂）及/或間曰癔原蟲之 其他抗原。 16·如請求項15之蛋白質，其中該抗原係選自DBP、 PvTRAP、PVMSP2、PVMSP4、PvMSP5、PvMSP6、 PvMSP7、PvMSP8、PVMSP9、PvAMAl 及 RBP。 〇 1 7·如明求項1至3中任一項之蛋白質，其包含如SEQ ID No 13中所示之雜交環子孢子蛋白序列。 18. —種組合物，其包含如請求項丨至17中任一項之雜交融 •- 合蛋白及佐劑。 I9·如巧求項18之組合物，其中該佐劑係選自包含以下各物 之群： •金屬鹽，諸如氫氧化鋁或磷酸鋁； •水包油乳液； •釦樣文體促效劑(諸如鐘樣受體2促效劑、鐘樣受體3促 122372.doc 200819462 效劑、鐘樣受體4促效劑、鐘樣受體7促效劑、鐘樣受體 8促效劑及鐘樣受體9促效劑）； •皂苷，例如Quil A及其衍生物，諸如QS7及/或QS21 ; ， •含CpG之寡核苷酸； • 3D-MPL ; . · (2-去氧-6_o-[2-去氧-2-[(R)-3-十二醢氧基四-癸酿基胺 . 基]-4-0-膦酸基- β-D -葡糖σ比嚼糖基]-2-[(R)-3_經基四癸醯 基胺基]-α-D-葡糖吼喃糖基二氫填酸酯）； Γ: •0卩（38,911)-3-[(11)-十二醯氧基四癸醯基胺基]_4_側氧 基-5 -氮雜-9(R)-[(R)-3 -羥基四癸醯基胺基]癸·！，；[〇_二 醇，1，1〇-雙（二氫磷酸酯）；及 - · Mp-Ac DP (3S-，9R)-3_[(R)-十二醯氧基四癸醯基胺基]- 4-側氧基-5-氮雜-9-[(R)-3 -經基四癸酿基胺基]癸- ΐ，ι〇_二 醇，1-二氫磷酸酯10-(6-胺基己酸酯）； 或其組合。 Q 20·如請求項18或19之組合物，其中該佐劑係選自包含以下 各物之群： •與諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之金屬鹽結合之息苦· * ·3〇·ΜΡί、QS21及CpG募核苦酸，例如呈水包油型調 \ 配物形式； •呈脂質體形式之皂*，例如其進—步包含諸如的21及 固醇之固醇；及 • ISCOM。 21·如請求項18或19之組合物，其進一步包含一或多種衍生 122372.doc 200819462 自惡性癔原蟲及/或間日瘧原蟲呈混 原。 勿形式之其他抗 22. 如請求項18或19之組合物，其進一步包 23. 如請求項22之組合物，复 丨面活性劑。 (TWeen)(諸如0土溫20)、布利吉（bHji) 1乙二醇。自/孤 24. 如請求項18或19之組合物，纟中該組合予如 疫苗之疫苗。 有如非I ^ 25. -種多聚體脂蛋白顆粒，其包含如請求们至 項所定義之雜交蛋白。 26. -種組合物，其包含如請求項25所定義之顆粒及至少一 種賦形劑/載劑。 27. 如請求項26之組合物，其進一步包含佐劑。 28. 如請求項27之組合物’其中該佐劑係選自包含以下各物 之群： •金屬鹽，諸如氫氧化鋁或磷酸鋁； Ο •水包油乳液； •釦樣文體促效劑（諸如鐘樣受體2促效劑、鐘樣受體3促 效劑、鐘樣叉體4促效劑、鐘樣受體7促效劑、鐘樣受體 8促效劑及鐘樣受體9促效劑）； •息芽’例如Qml A及其衍生物，諸如QS7及/或的21 ; •含C p G之券核苦酸； • 3D-MPL; • (2-去氧-6-0-0去氧-2·[(ιι)_3-十二醯氧基四_癸醯基胺 基]-4-0-膦酸基葡糖叽喃糖基]羥基四癸醯 122372.doc 200819462 基胺基；ha-D-葡糖吡喃糖基二氫磷酸酯）； •DP (38,911)-3-[(11)-十二酸氧基四癸酸基胺基]-4-側氧 基-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸醯基胺基]癸-1，1〇_二 醇，1，10-雙（二氫磷酸酯）；及 • MP_Ac DP (3S-，9R)-3-[(R)-十二醯氧基四癸醯基胺基]_ 4_側氧基-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸醯基胺基]二 醇’ 1-二氫壤酸酯10-(6-胺基己酸酯）； 或其組合。ϋ 29.如請求項27或28之組合物，其中該佐劑係選自包含以下 各物之群： •與諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之金屬鹽結合的皂苷； • 3D-MPL、QS2UCpG寡核㈣，例如呈水包油型調 配物形式； 包含諸如QS21及 •呈脂質體形式之皂苷，例如其進一步 固醇之固醇；及 • ISCOM。 30.如請求項26至28中任一項之組合物， 共進一步包含一或 夕種衍生自惡性瘧原蟲及/或間日癌 不虫央呈混合物形式之 其他抗原。 、 其進一步包含界面 性劑係選自吐溫（諸 其中該組合物為諸 3 1 ·如請求項2 6至2 8中任一項之組合物 活性劑。 32·如請求項31之組合物，其中該界面活 如吐溫20)、布利吉、聚乙二醇。 3 3.如请求項26至28中任一項之組合物， 122372.doc 200819462 34. 如非經腸疫苗之疫苗。 一種如請求項1至3中任_項 治療。 所疋義之蛋白質 其係用於 35. 36. 種如睛求項1 8或19所定義 一種如請求項26至28中任一 於治療。 之組合物，其係用於 項所定義之組合物， 治療。 其係用 37.一種如請求項1至丨7中任一 項25所定義之顆粒之用途， 瘧疾之藥物。 項所定義之蛋白 其係用於製造用 質或如請求 以治療/預防 3 8 ·如睛求項3 7之用途，盆中兮盛 ^ ^瘧疾係由間日瘧原 --種如請求項㈣中任—項所定義之:二 項18至24或26至33中任-項所定義之組合物之 係用於製造用以治療易受瘧原蟲感染之患者 /、 40. 一種核皆酸㈣，其編碼如請求項m中任:所 義之蛋白質。 負所疋 ϋ 41. 42. 一種宿主，其包含如請求項4〇所定義 一種用於製備如請求項1至1 7中任一 的方法，該方法包含於合適宿主中表 核苦酸序列及回收產物。 之核苦酸序列。 項所定義之蛋白 現編瑪該蛋白質 質 之 43. 如請求項42之方法 44. 如請求項43之方法 之群： ，其中該宿主為酵母。 〃中4酵母係選自包含以下各物種 酵母卿-㈣、裂殖酵母收—__、刻 魯維酵母⑹騰簡声小畢赤酵母㈣叫（例如巴斯德 122372.doc 200819462 畢赤酵母（尸/c/n’a 、漢森酵母(例如 多形漢森酵母（丹“似e關/a po^ymorp/za))、耶氏酵母 (7ar(9>Wa)、許旺酵母、裂殖酵母 (Schizosaccharomyces) ^ ^ (Zygosaccharomyces) 5 諸士口 釀酒酵母（iSaec/zaromyca cerevb/ae)、卡斯伯恩斯酵母 (5\ 似Z))、乳酸刻魯維酵母（尤.Z^dzi)、Y1834 及 DC5。 45. 如請求項43或44中任一項之方法，其中藉由以包含界面 活性劑之合適組合物處理來溶解該等宿主細胞而回收產 物。 46. 如請求項45之方法，其中該界面活性劑係選自包含以下 各物之群：吐溫（諸如吐溫20)、布利吉及聚乙二醇。 G 122372.doc
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