BRPI0714326A2 - partÍcula de proteÍna imunogÊnica, composiÇço, uso de uma proteÍna ou de uma composiÇço, mÉtodo para tratar um paciente suscetÍvel À infecÇço por plasmàdio, sequÊncias de dna de codificaÇço do hospedeiro, processo para a produÇço de uma partÍcula, e, produto - Google Patents

Abstract

PARTÍCULA DE PROTEÍNA IMUNOGÊNICA, COMPOSIÇçO, USO DE UMA PROTEÍNA OU DE UMA COMPOSIÇçO, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE SUSCETÍVEL À INFECÇçO POR PLASMàDIO, SEQUÊNCIAS DE DNA DE CODIFICAÇçO DO HOSPEDEIRO, PROCESSO PARA A PRODUÇçO DE UMA PARTÍCULA, E, PRODUTO. A presente invenção diz respeito a uma nova partícula de lipoproteína, métodos para preparar e purificar a mesma, seu uso na medicina, particularmente na prevenção de infecções malarinas, composições/vacinascontendo a partícula ou anticorpos contra a partícula de proteína tal como, anticorpos monoclonais ou policlonais e uso dos mesmos, particularmente na terapia. Em particular, este diz respeito a uma partícula de proteína imunogênia que compreende os seguintes monômeros: a. uma proteína proteína de fusão que compreende sequências derivadas de uma proteína CS de P. vivax e o antígeno S da Hepatite B (CSV-S) e b.uma proteína de fusão que compreende as sequências derivadas de proteínas CS de P. falciparum e antígeno S de Hepatite B (RTS) e o. opcionalmente, o antígeno S derivado de Hepatite B.

Description

"PARTÍCULA DE PROTEÍNA IMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA PROTEÍNA OU DE UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE SUSCETÍVEL À INFECÇÃO POR PLASMÓDIO, SEQÜÊNCIAS DE DNA DE CODIFICAÇÃO DO HOSPEDEIRO, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PARTÍCULA, E, PRODUTO"

A presente invenção se refere a uma nova partícula de lipoproteína, métodos para o preparo e purificação das mesmas, seu uso em medicina, particularmente na prevenção de infecções malarianas, composições/vacinas contendo a proteína ou anticorpos contra a partícula de proteína, tais como anticorpos monoclonais ou policlonais, e ao uso dos mesmos, particularmente em terapia.

A malária é um dos principais problemas de saúde mundial, com mais de 2 a 4 milhões de pessoas morrendo da doença a cada ano. Uma das formas mais prevalentes da doença é causada pelo parasita protozoário P. vivax, o qual é encontrado em regiões tropicais e subtropicais. De modo interessante, o parasita pode completar seu ciclo no mosquito em temperaturas tão baixas quanto 15 graus Celsius, o que tem permitido que a doença se dissemine em climas temperados.

Uma das formas mais agudas da doença é causada pelo parasita protozoário Plasmodium falciparum (P. falciparum), o qual é responsável pela maioria da mortalidade atribuível à malária.

O ciclo de vida do Plasmodium é complexo, requerendo dois hospedeiros, o homem e o mosquito, para término. A infecção do homem é iniciada através da introdução de esporozóitos na saliva de um mosquito infectado. Os esporozóitos migram para o fígado e ali infectam hepatócitos, onde eles se diferenciam, via o estágio intracelular exoeritrocítico, para o estágio de merozóito, o qual infecta células sangüíneas vermelhas (RBC) para iniciar replicação cíclica no estágio sangüíneo assexuado. O ciclo é terminado através da diferenciação de uma série de merozóitos nas RBCs em gametócitos em estágio sexual, os quais são ingeridos pelo mosquito, onde eles se desenvolvem através de uma série de estágios, no intestino intermediário para produzir esporozóitos os quais migram para a glândula salivar.

Em virtude do fato de que a doença causada por P. vivax raramente é fatal, esforços para prevenir e tratar malária têm estado focalizados sobre a forma mais mortal da doença causada por Plasmodium falciparum (P. falciparum).

Embora a doença causada por P. vivax usualmente não resulte em morte do paciente, em virtude do volume de casos, os quais parecem estar aumentando, do impacto significativo sobre a qualidade de vida do paciente, dos relatos crescentes das graves incidências da doença que resultam em anemia e morte e do impacto econômico, uma vacinação eficaz para a doença ainda é requerida. Além disso, uma única vacina capaz de proporcionar proteção contra ambas as causas da doença seria vantajosa.

Uma característica do P. vivax é que algumas cepas são capazes de causar infecção retardada permanecendo latente no fígado antes de emergir na circulação periférica para manifestar sintomas clínicos. Assim, os indivíduos, por exemplo, quando viajam para uma área infectada, podem ser infectados e ainda assim não exibir sintomas durante vários meses. Isso tem o potencial de causar a disseminação da doença e, por essa razão, não é permitido que pessoas que viajam para áreas infectadas doem sangue para transfusão durante um período de tempo definido após viajar para a região infectada.

A infecção malariana por P. vivax permanece latente dentro do fígado enquanto o parasita está sofrendo esquizogonia pré-eritrocítica. Se o parasita é controlado nesse estágio, antes que ele escape do fígado, nenhum sintoma clínico da doença é observado no paciente. O estágio de esporozóito do Plasmodium foi identificado como um alvo potencial de uma vacina contra malária. Foi mostrado que vacinação com esporozóito desativado (irradiado) induz à proteção contra malária experimental humana (Am. J, Trop. Med. Hyg 24: 297-402,1975). Contudo, não tem sido prática e logisticamente possível fabricar uma vacina contra malária para a população geral baseado nessa metodologia empregando esporozóitos irradiados.

A principal proteína na superfície do esporozóito é conhecida como uma proteína de circunsporozóito (proteína CS). Acredita-se que ela esteja envolvida na motilidade e invasão do esporozóito durante sua passagem do local inicial de inoculação pelo mosquito para a circulação, onde ela migra para o fígado.

A proteína CS de espécies Plasmodia é caracterizada por um domínio central repetitivo (região repetitiva) flanqueado por fragmentos amino (N-término) e carbóxi (C-término) não repetitivos. O domínio central do P. vivax é composto de vários blocos de uma unidade repetitiva, geralmente de nove aminoácidos aleatórios.

Em determinadas cepas Asiáticas, após a região central repetitiva, uma seqüência adicional de aproximadamente 12 aminoácidos está presente (veja SEQ ID NO: 11). A função da última é desconhecida. Contudo, supõe-se que os referidos aminoácidos podem estar ligados ao início retardado de sintomas clínicos da doença, embora isso não tenha sido investigado. Acredita-se que o N-término é caracterizado por uma seqüência de 5 aminoácidos conhecida como região I (veja SEQ ID NO: 1). Também, acredita-se que o C-término é caracterizado por compreender uma seqüência de 18 aminoácidos conhecida como região II. A última contém um motivo de adesão celular, o qual é altamente conservado entre todas as proteínas CS de malária (veja SEQ ID NO: 2).

Vários grupos propuseram vacinas de subunidade baseadas na proteína de circunsporozóito. Duas dessas vacinas sofreram testagem clínica: uma é um peptídeo sintético, a outra é uma proteína recombinante (Bailou e colaboradores, Lancet: 1277 (1987) e Herrington e colaboradores, Nature 328: 257 (1987)). Essas vacinas obtiveram sucesso na estimulação de uma resposta anti-esporozóito. Todavia, a magnitude da resposta foi desapontadora, com algumas vacinas não obtendo uma resposta em geral. Além disso, a ausência de (reforços) "boosting" dos níveis de anticorpo após injeções subseqüentes e os resultados de ensaios de proliferação de linfócitos in vitro sugeriram que células T da maioria desses voluntários não reconhecem a repetição imuno-dominante. Todavia, um voluntário vacinado em cada estudo não desenvolveu parasitemia.

O WO 93/10152 e WO 98/05355 descrevem uma vacina derivada da proteína CS de P. falciparum e parece que tem havido algum progresso com relação à vacinação contra P. falciparum usando a abordagem descritas nos mesmos; veja também Heppner e colaboradores, 2005, Vaccine 23, 2243-50.

A proteína CS em P. falciparum tem uma região central repetitiva que é conservada. Em contraste, pelo menos duas formas (designadas VK210 ou tipo I e VK247 ou tipo II) da proteína CS para P. vivax são conhecidas. Isso torna mais difícil identificar uma estrutura da proteína CS com todas as propriedades desejadas, tal como imunogenicidade, a qual proporciona proteção geral contra P. vivax, a despeito do tipo específico de proteína CS porque anticorpos dirigidos à região central repetitiva do tipo I não reconhecem necessariamente epítopos sobre a região correspondente do tipo II e vice versa.

Uma proteína CS de P. vivax recombinante foi expressa e testada como uma vacina na década de 1980-1990 com sucesso limitado (Collins e colaboradores, 1989. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40, 455-64). Algum trabalho foi feito para desenvolver uma vacina baseada em Múltiplos Peptídeos Antigênicos (MAP) empregando um ou mais epítopos que são cruzadamente ligados (Nardelli e Tarn, 1995, Pharm. Biotechnol. 6, 803-19).

A presente invenção proporciona uma partícula antigênica para uso em vacinas contra malária, a qual acredita-se que produza uma resposta humoral e também uma resposta celular imune. Acredita-se que a partícula antigênica induza à produção de anticorpos contra a proteína CS de P. vivax e P. falciparum, tipo I e tipo II. O antígeno também pode induzir à células T auxiliares, por exemplo, células Thl e/ou Th2.

Conseqüentemente, a presente invenção proporciona uma partícula de proteína imunogênica compreendendo os seguintes monômeros:

a. uma proteína de fusão compreendendo seqüências derivadas de uma proteína CS de P. vivax e o antígeno S de Hepatite B (CSV-S) e

b. uma proteína de fusão compreendendo as seqüências derivadas de proteína CS de P. falciparum e o antígeno S de Hepatite B

(RTS) e opcionalmente

c. antígeno S derivado do vírus da Hepatite B. Listagem de

seqüência

SEQ. ID. No. 1 Região I no N-término SEQ. ID. No. 2 Região II no C-término

SEQ. ID. No. 3-9 Várias unidades repetitivas de proteína CS do tipo I

SEQ. ID. No. 10 Principal unidade repetitiva de proteína CS do tipo II

SEQ. ID. No. 11 Aminoácidos adicionais encontrados em cepas Asiáticas

SEQ. ID. No. 12 Seqüência de nucleotídeo da proteína híbrida de CSV (otimizada

para expressão em E. coli) SEQ. ID. No. 13 Seqüência de aminoácido da proteína híbrida de CSV SEQ. ID. No. 14 Unidade repetitiva mínima de proteína CS do tipo II SEQ. ID. No. 15 Seqüência de nucleotídeo para a proteína híbrida de CSV

(otimizada para expressão em levedo) SEQ. ID. No. 16 Seqüência de nucleotídeo para a proteína de fusão híbrida CSV-S SEQ. ID. No. 17 Seqüência de aminoácido para a proteína de fusão híbrida CSV-S SEQ. ID. No. 18 Seqüência de nucleotídeo para um cassete de expressão RTS e proteína S de RTS prevista

Figuras

Fig. 1 Mapa de plasmídeo para pRITl 5546 é um vetor epissomal de levedo Fig. 2 Mapa de plasmídeo de pGFl-S2, um plasmídeo preparado através de GSK empregado em "fusão" do antígeno desejado com o antígeno S de Hepatite B. Clonagem de seqüências de DNA heterólogas entre sítios SmaI (após excisão do fragmento de DNA SmaI de 12 bp) cria fusão em-rede com o gene S Fig. 3 Mapa de plasmídeo do pRTI15582. Digestão com XhoI libera um fragmento de DNA linear de 8,5 kb trazendo o cassete de expressão CSV-S mais o marcador seletivo LEU2, sendo usado para inserção no cromossoma de levedo

Fig. 4 Mapa de restrição do fragmento XhoI linear usado para integrar o cassete CSV-S

Fig. 5 Western blot de proteínas recombinantes expressas na cepa Yl 835.

Painel A: WB revelado com anticorpo anti-S. Amostras carregadas (100 μg de proteína total/cavidade):

1: Yl 631 (cepa de produção RTS,S como comparação)

2:Y1835

3:Y1835

4: Y1834

Painel B: WB revelado com anticorpo anti-CSV. Amostras carregadas (100 μg de proteína total/cavidade):

1: Yl 631 (cepa de produção RTS5S como comparação) 2: Y1295 3:Y1835 4: Y1834

5: nr (outra estrutura de CSVS) 6: nr (outra estrutura -antígeno S apenas) Fig. 6 Micrografia eletrônica de partículas misturadas de CSV-S3S produzidas na cepa Yl835. As partículas de CSV-S,S foram purificadas a partir de extratos de célula solúveis (baseado no processo de purificação de RTS5S) e submetidas à análise por microscopia eletrônica. As partículas foram visualizadas após coloração negativa com ácido fosfotungstíco. A escala é equivalente a 100 nm Fig. 7 Western blot de proteínas recombinantes expressas na cepa Yl 845. WB revelado com anticorpo anti-S

Quantidade de proteína total carregada está entre parênteses 1: Y1835 (100 μg)

2: Y1631 (100 μg - cepa de produção RTS5S, como comparação) 3: Y1845 (100 μ£) 4: Yl845 (50 μ£) 5: Yl 845 (25 μβ)

Fig. 8 Análise de densidade por CsCl de um extrato isento de células preparado a partir da cepa Y1845

Assim, a proteína de fusão CSV-S empregada na invenção

compreende: uma porção derivada da proteína CS de P. vivax (CSV). Esse

antígeno de CSV pode ser uma proteína nativa, tal como encontrado em

proteínas CS do tipo I de P. vivax e/ou conforme encontrado em proteína do

tipo II de P. vivax. Alternativamente, a proteína CSV pode ser uma proteína

híbrida ou proteína quimérica compreendendo elementos das referidas

proteínas CS dos tipos I e II. Quando a última é fundida ao antígeno S, essa

será referida aqui como uma proteína de fusão híbrida. CSV-S é usado aqui como um termo genérico para abranger proteínas de fusão compreendendo uma seqüência/fragmento da proteína CS de P. vivax e uma seqüência/fragmento do S-antígeno de Hepatite B.

RTS é usado aqui como um termo genérico para abranger proteínas compreendendo uma seqüência/fragmento da proteína CS de P. falciparum e uma seqüência/fragmento do S-antígeno de Hepatite B.

A proteína híbrida/quimérica geralmente compreenderá: pelo menos uma unidade repetitiva derivada da seção central repetitiva de uma proteína de circunsporozóito do tipo I de P. vivax e pelo menos uma unidade repetitiva derivada da seção central repetitiva de uma proteína de circunsporozóito do tipo II de P. vivax.

Geralmente, a proteína híbrida também conterá um fragmento N-terminal de proteína CS de Plasmodium, tal como P. vivax, por exemplo, um fragmento compreendendo a região I, tal como os aminoácidos mostrados em SEQ ID NO: 1.

Usualmente, a proteína híbrida conterá um fragmento C- terminal da proteína CS de Plasmodium, tal como P. vivax, por exemplo, um fragmento compreendendo a região II, tal como o motivo mostrado em SEQ ID NO: 2.

Embora não desejando estar preso à teoria, acredita-se que os fragmentos NeC terminais incluem vários epítopos de células TeB.

Qualquer cepa adequada de P. vivax pode ser empregada na invenção, incluindo: Latina, Americana (isto é, Sal 1, Belém), Coreana, Chinesa, Tailandesa, Indonesiana, Indiana e Vietnamita. A estrutura em SEQ ID NO: 3 é baseada em uma cepa Coreana (mais especificamente, uma cepa da Coréia do Sul).

P. vivax com proteínas CS do tipo I é mais prevalente do que P. vivax com proteínas CS do tipo II. Portanto, em um aspecto, a invenção emprega uma proteína CS do tipo I. Em um aspecto alternativo, a invenção proporciona uma proteína híbrida compreendendo uma unidade repetitiva do tipo I e uma unidade repetitiva do tipo II, por exemplo, em que mais unidades repetitivas do tipo I estão incluídas no híbrido do que unidades repetitivas do tipo II.

Mais especificamente, a proteína híbrida da invenção pode incluir 1 a 15 unidades repetitivas, tal como 9 unidades repetitivas do tipo I.

Exemplos de unidades repetitivas de proteínas CS do tipo I são fornecidos em SEQ ID NOs: 3 a 9.

Em uma modalidade, a invenção proporciona um híbrido com uma mistura de diferentes unidades repetitivas do tipo I, tal como uma daquelas listadas em SEQ ID NOs: 3 a 9.

Uma ou mais unidades repetitivas podem ser duplicadas no híbrido, por exemplo, duas unidades repetitivas de SEQ ID NO: 3 e/ou 4 podem ser incorporadas na estrutura.

a) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de

SEQ ID NO: 3.

b) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID NO: 4, opcionalmente em combinação com unidades conforme descrito no parágrafo a) diretamente acima.

c) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID NO: 5, opcionalmente em combinação com unidades conforme descrito no parágrafo a) ou b) diretamente acima.

d) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID NO: 6, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades conforme descrito nos parágrafos a) a c) diretamente acima.

e) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID NO: 7, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades conforme descrito nos parágrafos a) a d) diretamente acima.

f) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID NO: 8, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades conforme descrito nos parágrafos a) a e) diretamente acima.

g) Em um aspecto, a proteína CS compreende uma unidade de SEQ ID NO: 9, opcionalmente em combinação com uma ou mais unidades conforme descrito nos parágrafos a) a f) diretamente acima.

Exemplos de unidades repetitivas componentes adequadas de proteínas CS do tipo II são fornecidos em SEQ ID NOs: 10 e 14, tal como 10.

Em um aspecto da invenção, é proporcionada uma proteína híbrida com 5 ou menos unidades repetitivas derivadas do tipo II, tal como uma unidade repetitiva, por exemplo, conforme mostrado em SEQ ID NO: 10.

O híbrido também pode incluir a inserção de 12 aminoácidos encontrada na extremidade da região repetitiva encontrada em determinadas cepas Asiáticas de P. vivax, por exemplo, conforme mostrado em SEQ ID NO: 11.

Em uma modalidade, a proteína híbrida compreende cerca de

257 aminoácidos derivados de proteína CS de P. vivax.

O componente antígeno derivado de CSV da invenção é geralmente fundido à extremidade amino terminal da proteína S.

Acredita-se que a presença do antígeno na superfície de Hepatite B reforça a imunogenicidade da porção de proteína CS, auxilia na estabilidade e/ou auxilia na fabricação reproduzível da proteína.

Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende cerca de 494 aminoácidos, por exemplo, cerca de 257 dos quais são derivados de proteína CS de P. vivax. A proteína de fusão híbrida pode também incluir outros

antígenos derivados de P. falciparum e/ou P. vivax, por exemplo, em que o antígeno é selecionado de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSPó, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl e RBP ou fragmentos dos mesmos. Em outro exemplo, antígenos derivados de P. falciparum

incluem PfEMP-1, antígeno Pfs 16, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-I

e TRAP. Outros antígenos de Plasmodium incluem EBA, GLURP, RAP1,

RAP2 de P. falciparum, Sequestrina, PÍ332, STARP, SALSA, PffiXP 1,

Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 e seus análogos em outras Plasmodium spp.

Em uma modalidade, a proteína de fusão híbrida (CSV-S) tem

a seqüência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 17. Na seqüência, os

aminoácidos 6 a 262 são derivados de CSV e 269 a 494 são derivados de S.

Os aminoácidos restantes são introduzidos através de engenharia genética (a

qual, em particular, pode ser variada conforme apropriado). Esses quatro

aminoácidos, Met, Met, Ala, Pro, são derivados especificamente do plasmídeo pGFl-S2 (veja Fig. 4).

As propriedades da proteína de fusão CSV-S de SEQ ID NO: 17 são proporcionadas nas Tabelas abaixo.

Análise Proteína toda Peso molecular 51794,75 m.w. Comprimento 494 1 micrograma = 19,307 pMoles Coeficiente de extinção molar 90780+/-5% 1 A (280) = 0,57 mg/ml Ponto isoelétrico 7,33 Carga em um pH de 7 1,05

Análise de composição de proteína toda

Aminoácido(s)

Carregado (RKHYCDE) Ácido (DE) Básico (KR) Polar (NCQSTY) Hidrofóbico (AILFWV)

AAla

CCys

DAsp

EGlu

FPhe

GGly

HHis

Número % em peso % em contagem freqüência 106 26,35 21,46 38 8,82 7,69 39 10,68 7,89 134 28,15 27,13 167 34,68 33,81 52 7,14 10,53 18 3,58 3,64 24 5,33 4,86 14 3,49 2,83 17 4,83 3,44 64 7,05 12,96 4 1,06 0,81 IIle 17 3,71 3,44 KLys 20 4,95 4,05 L Leu 42 9,18 8,50 MMet 8 2,03 1,62 N Asn 32 7,05 6,48 PPro 40 7,50 8,10 QGln 21 5,20 4,25 RArg 19 5,73 3,85 S Ser 30 5,04 6,07 TThr 26 5,08 5,26 VVal 25 4,78 5,06 WTrp 14 5,03 2,83 YTyr 7 2,21 1,42 BAsx 0 0,00 0,00 ZGlx 0 0,00 0,00 XXxx 0 0,00 0,00 Ter 1 0,00 0,20

A seqüência de nucleotídeo para a proteína de SEQ ID NO: 17 é fornecida em SEQ ID NO: 16.

O componente das partículas de proteína da invenção denominado RTS (isto é, derivado de P. falciparum) pode ser preparado conforme descrito no WO 93/10152, o qual inclui uma descrição de RTS* (da cepa NF54/3D7 de P. falciparum).

Em uma ou mais modalidades da invenção, o antígeno derivado de P. falciparum empregado na proteína de fusão pode ser substancialmente da proteína CS toda do mesmo.

Em uma modalidade da invenção, antígeno-S de comprimento

total é empregado. Em outra modalidade, um fragmento do referido antígeno- S é empregado.

Em uma modalidade, o antígeno derivado de P. falciparum compreende pelo menos 4 unidades repetitivas da região central repetitiva.

Mais especificamente, esse antígeno compreende uma seqüência a qual contém pelo menos 160 aminoácidos, a qual é substancialmente homóloga à porção C-terminal da proteína CS. A proteína CS pode ser desprovida dos últimos 12 a 14 (tal como 12) aminoácidos do C-término.

Em particular, uma proteína de fusão, a qual compreende uma porção da proteína CS de P.falciparum correspondendo substancialmente aos

aminoácidos 207-395 da proteína CS de P. falciparum (cepa NF54[3D7])

7G8 fundida em-rede via um ligante linear ao N-término do antígeno S, é

empregada nas partículas. O ligante pode compreender uma porção de preS2 do antígeno-S.

Mais especificamente, a proteína de fusão derivada de P. falciparum empregada é aquela codificada pela seqüência de nucleotídeo para o cassete de expressão RTS em SEQ ID NO: 18.

Antígenos S adequados podem compreender um preS2. Um exemplo de um sorotipo adequado é adw (Nature 280: 815-819, 1979).

Em um aspecto, as proteínas de fusão híbridas da invenção

compreendem uma porção derivada de uma proteína S mutante, por exemplo,

conforme descrito no pedido US publicado No. 2006/194196 (também

publicado como WO 2004/113369). Esse documento descreve um mutante

rotulado HDB05. Em particular, ele descreve comparações das proteínas

mutante e do tipo silvestre nas Figuras 1 e 6 e genes para o mutante nas

Figuras 4 e 5. As seqüências 12 a 22 no mesmo descrevem polipeptídeos

particulares da proteína S mutante. Cada um dos acima é incorporado aqui por referência.

A proteína de fusão CSV-S pode, por exemplo, ser preparada empregando o plasmídeo pGFl-S2 (veja Fig. 2 e os exemplos para outros detalhes) o qual, quando a seqüência apropriada correspondendo à CSV é inserida no sítio de clonagem SmaI pode, sob condições adequados, produzir a proteína de fusão CSV-S.

As seqüências de DNA que codificam as proteínas da presente invenção são, em uma modalidade, flanqueadas por elementos de controle transcricional, de preferência derivados de genes de levedo e incorporados em um vetor de expressão.

Um cassete de expressão para proteínas híbridas da invenção pode, por exemplo, ser construído compreendendo as seguintes características:

• Uma seqüência promotora derivada, por exemplo, do gene TDHS de S. cerevisiae.

• Uma seqüência de codificação de uma proteína de fusão

apropriada.

• Uma seqüência de término de transcrição contida dentro da seqüência derivada, por exemplo, do gene ARG3 de S. cerevisiae.

Um exemplo de um promotor específico é o promotor do gene TDH3 de S. cerevisiae, Musti e colaboradores.

Um plasmídeo adequado pode, então, ser empregado para inserir a seqüência de codificação para a proteína de fusão híbrida em um hospedeiro adequado para síntese. Um exemplo de um plasmídeo adequado é pRIT15546, um vetor mícron-baseado para trazer um cassete de expressão adequado; veja Fig. 1 e Exemplos para outros detalhes.

O plasmídeo geralmente conterá um marcador de construção para auxiliar na seleção, por exemplo, um gene que codifica resistência a antibiótico ou auxotrofia por LEU2 ou HIS.

Geralmente, o hospedeiro terá um cassete de expressão para cada proteína de fusão na partícula e também terá um ou mais cassetes de expressão para o antígeno S integrado em seu genoma.

A invenção também se refere a uma célula hospedeira transformada com um vetor de acordo com a invenção. Células hospedeiras podem ser procariotas ou eucariotas mas, de preferência, são levedo, de preferência Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, tal como DC5 no banco de dados ATCC (número de acesso 20820), sob o nome RIT DC5 cir(o). Depositante: Smith Kline-RITj e levedos não- Saccharomyces. Esses incluem Schizosaccharomyces (por exemplo, Schizosaccharomyces pombe) Kluyveromyces (por exemplo, Kluyveromyces lactis), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris), Hansenula (por exemplo, Hansenula polymorpha), Yarrowia (por exemplo, Yarrowia lipolytiea) e Schwanniomyees (por exemplo, Schwanniomyees oceidentalis).

Em um aspecto, a invenção se refere a uma cepa de levedo recombinante Yl 834 (e ao uso da mesma) para expressão da proteína de fusão; veja Exemplos para preparo da mesma.

Em outra modalidade, a invenção proporciona uma cepa de levedo recombinante Yl835 ou Yl 845 (e ao uso das mesmas) para expressão da proteína de fusão da invenção; veja Exemplos para outros detalhes.

As seqüências de nucleotídeo ou parte das mesmas (tal como a porção de codificação da proteína híbrida/CS, mas opcionalmente não a porção de codificação da proteína S) empregadas aqui podem ser códon- otimizadas para expressão em um hospedeiro, tal como levedo.

A invenção também se refere a um hospedeiro compreendendo um polinucleotídeo, tal como DNA que codifica dois ou mais componentes da partícula empregada na presente invenção.

Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende um cassete de expressão para uma proteína de fusão derivada de P. vivax e um cassete de expressão para a proteína de fusão derivada de P. faleiparum.

Em determinados hospedeiros, tais como células de levedo, uma vez expressa, a proteína de fusão (compreendendo o antígeno S) é espontaneamente montada em uma estrutura/partícula de proteína composta de numerosos monômeros das referidas proteínas de fusão. Quando o levedo expressa duas proteínas de fusão diferentes, acredita-se que essas são co- montadas em partículas.

Quando a cepa de levedo recipiente escolhida já traz em seu genoma várias cópias integradas de cassetes de expressão S de Hepatite B, então, as partículas montadas também podem incluir monômeros de antígeno S não fundido. Essas partículas podem também ser referidas como Partículas Semelhantes a Vírus (VLP). As partículas também podem ser descritas como partículas de lipoproteína multimérica.

Alternativamente, essas partículas podem ser preparadas através de uma série de formas, por exemplo, através de fusão de cada um dos antígenos derivados de Plasmodium a outro parceiro de fusão (por exemplo, os antígenos do vírus de Hepatite B ou uma proteína estrutural viral) e expressão das mesmas em um hospedeiro adequado, tal como levedo ou bactéria.

Assim, é proporcionado uma partícula de proteína imunogênica compreendendo os seguintes monômeros:

a. uma proteína de fusão compreendendo seqüências derivadas de uma proteína CS de P. vivax e

b. uma proteína de fusão compreendendo seqüências derivadas de uma proteína CS de P. falciparum.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo:

a) uma seqüência derivada de uma proteína CS de P. vivax (tal como uma seqüência da região repetitiva do tipo I e/ou do tipo II)

b) uma seqüência derivada da proteína CS de P. falciparum (tal como uma seqüência da região repetitiva da mesma) e

c) uma seqüência do antígeno-S de Hepatite B.

Assim, a invenção se estende a uma partícula de proteína compreendendo uma proteína de fusão derivada de uma proteína CS de P. vivax e uma proteína de fusão derivada de proteína CS de P. falciparum, em que o antígeno fundido com o antígeno de Plasmodium é escolhido para induzir à formação/montagem das lipopartículas quando as referidas proteínas de fusão são expressas em um hospedeiro adequado.

Assim, a invenção proporciona uma VLP compreendendo unidades de CSV-S e RTS. Em um aspecto, a invenção proporciona uma partícula consistindo essencialmente de unidades de CSV-S e RTS. Em um aspecto alternativo, as partículas produzidas compreendem ou consistem essencialmente de unidades de CSV-S, RTS e S.

Várias abordagens podem ser usadas para manipular levedo para o preparo das referidas partículas, por exemplo, um cassete de expressão para a proteína de fusão pode ser inserido no genoma de um levedo já contendo um cassete de expressão para uma das proteínas de fusão requeridas e/ou o antígeno S. Contudo, aqueles habilitados que trabalham no campo são bem capazes de preparar um hospedeiro adequado para o preparo de partículas de acordo com a invenção.

Assim, em um aspecto, a invenção proporciona um hospedeiro adequado, tal como levedo, compreendendo DNA que codifica CSV-S, RTS e opcionalmente S. Em um aspecto alternativo, um hospedeiro adequado é um ou mais plasmídeos capazes de expressão de CSV-S, RTS e opcionalmente S. O plasmídeo pode, por exemplo, ser usado para expressar a proteína em conjunto, por exemplo, com um levedo.

Embora não se deseje estar preso à teoria, acredita-se que os tensoativos usados para liberar a proteína das células também podem auxiliar na estabilização das partículas de lipoproteína.

Supõe-se que as partículas de lipoproteína da invenção podem contribuir para estimulação adicional in vivo da resposta imune à(s) proteína(s) antigênica(s).

Em um aspecto, a invenção proporciona um vetor viral com replicação deficiente que codifica uma ou mais proteínas CS, por exemplo, as quais correspondem a uma ou mais proteínas CS compreendidas nas partículas de acordo com a invenção.

Vetores virais adequados podem ser derivados de vetores adenovirais, vetores virais adeno-associados (AAVs), sarampo, lentivírus, alfavírus, baculovírus, herpes simplex vírus e poxvírus, tais como cowpox, fowlpox, pigeonpox, canarypox, suipox e sheeppox/goatpox. Metodologia para preparo de vetores adenovirais que codificam um antígeno da malária é, por exemplo, descrita no WO 2004/055187.

A proteína codificada pelo vetor pode, por exemplo, ser modificada para prevenir glicosilação da proteína durante expressão, por exemplo, determinadas serinas podem ser substituídas por resíduos de alanina para reduzir a glicosilação.

Vetores virais empregados na invenção podem ser

recombinantes. Adenovírus

Vetores adenovirais da presente invenção compreendem um ou mais polinucleotídeos heterólogos (DNA) os quais codificam um ou mais polipeptídeos imunogênicos.

Vetores adenovirais de uso na presente invenção podem ser derivados de uma faixa de hospedeiros mamíferos.

Adenovírus (aqui referidos como "Ad" ou "Adv") têm uma morfologia característica com um capsídeo icosaédrico consistindo de três proteínas principais, hexon (II), base penton (III) e uma fibra recoberta de saliências (IV), junto com uma série de outras proteínas diversas, VI, VIII, IX, IIIa e IVa2 (Russell W.C. 2000, Gen Viriol, 81: 2573-2604). O genoma do vírus é um DNA fita dupla linear com uma proteína terminal presa ao 5' término, o qual tem repetições terminais invertidas (ITRs). O DNA viral está intimamente associado com a proteína VII altamente básica e um pequeno peptídeo denominado mu. Outra proteína, V, é engolfada com esse complexo de DNA-proteína e proporciona um elo estrutural ao capsídeo via a proteína VI. O vírus também contém uma protease vírus codificada, a qual é necessária para processamento de algumas das proteínas estruturais para produzir vírus infecciosos maduros. Mais de 100 sorotipos distintos de adenovírus foram isolados, os quais infectam várias espécies de mamífero, 51 dos quais são de origem humana. Assim, um ou mais dos vetores adenovirais podem ser derivados de um adenovírus humano. Exemplos de tais adenovírus derivados de ser humano são Adi, Ad2, Ad4, Ad5, Ad6, Adl 1, Ad24, Ad34, Ad35, Ad50/51, particularmente Ad5, Adll e Ad35. Os sorotipos humanos foram classificados em seis sub-gêneros (A-F) baseado em uma série de critérios biológicos, químicos, imunológicos e estruturais.

Embora vetores baseados em Ad5 tenham sido usados extensivamente em uma série de experimentos de terapia genética, existem limitações quanto ao uso de Ad5 ou outros vetores adenovirais do grupo C em virtude de imunidade pré-existente na população geral devido à infecção natural. Ad5 e outros membros do grupo C tendem a estar entre os sorotipos mais prevalentes. A imunidade aos vetores existentes pode se desenvolver como um resultado de exposição ao vetor durante tratamento. Esses tipos de imunidade pré-existente ou desenvolvida aos vetores soro-prevalentes podem limitar a eficácia de terapia genética ou esforços de vacinação. Sorotipos adenovirais alternativos, assim, constituem alvos muito importantes na busca por sistemas de distribuição de gene capazes de evadir a resposta imune do hospedeiro.

Uma de tais áreas de sorotipos alternativos são aqueles derivados de primatas não humanos, especialmente adenovírus de chimpanzé. Veja Patente U.S. 6.083.716, a qual descreve o genoma de dois adenovírus de chimpanzé.

Foi mostrado que vetores adenovirais de chimpanzé ("Pan" ou "C") induzem à fortes respostas imunes aos produtos do transgene, tão eficientemente quanto vetores adenovirais humanos (Fitzgerald e colaboradores, J. Immunol. 170: 1416).

Adenovírus de primata não-humano podem ser isolados dos nódulos linfáticos mesentéricos de chimpanzés. Adenovírus de chimpanzé são suficientemente similares ao adenovírus humano subtipo C para permitir replicação de vírus El-deletado em células HEK 293. Ainda, adenovírus de chimpanzé são filogeneticamente distintos dos sorotipos humanos mais comuns (Ad2 e Ad5). Pan 6 é menos intimamente relacionado e é sorologicamente distinto de Pans 5, 7 e 9.

Assim, um ou mais dos vetores adenovirais podem ser derivados de um adenovírus de primata não-humano, por exemplo, um adenovírus de chimpanzé, tal como um selecionado dos sorotipos Pan5, Pan6, Pan7 e Pan9.

Vetores adenovirais também podem ser derivados de mais de um sorotipo de adenovírus e cada sorotipo pode ser da mesma ou de uma fonte diferente. Por exemplo, eles podem ser derivados de mais de um sorotipo humano e/ou mais de um sorotipo de primata não-humano. Métodos para a construção de vetores adenovirais quiméricos são divulgados no W02005/001103.

Existem determinadas restrições associadas à inserção de DNA heterólogo em adenovírus. Adenovírus humanos têm a capacidade de engolfar até 105% do comprimento do genoma do tipo silvestre (Bert e colaboradores, 1993, J Virol 67 (10), 5911-21). Foi mostrado que o menor limite de engolfamento para adenovírus humanos é de 75% do comprimento do genoma do tipo silvestre (Parks e colaboradores, 1995, J Virol 71(4), 3293-8).

Um exemplo de adenovírus útil na presente invenção são adenovírus os quais são distintos dos sorotipos prevalentes que ocorrem naturalmente na população humana, tais como Ad2 e Ad5. Isso evita a indução de respostas imunes potentes contra o vetor, o que limita a eficácia de subseqüentes administrações do mesmo sorotipo por meio de bloqueio de captação do vetor através de anticorpo de neutralização e influência a toxicidade. Assim, os adenovírus podem ser um adenovírus o qual não é um sorotipo de vírus humano prevalente que ocorre naturalmente. Adenovírus isolados de animais têm componentes de capsídeo, hexon, penton e fibra imunologicamente distintos, mas são filogeneticamente relacionados intimamente. Especificamente, o vírus pode ser um adenovírus não-humano, tal como um adenovírus de símio e, em particular, um adenovírus de chimpanzé, tal como Pan 5, 6, 7 ou 9. Exemplos de tais cepas são descritos no WO 03/000283 e estão disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209 e outras fontes. Cepas de adenovírus de chimpanzé desejáveis são Pan 5 [ATCC VR-591], Pan 6 [ATCC VR-592], e Pan 7 [ATCC VR-593].

Acredita-se que o uso de adenovírus de chimpanzé é vantajoso com relação ao uso de sorotipos de adenovírus humano em virtude da falta de imunidade pré-existente, em particular a falta de anticorpos de neutralização cruzados, aos adenovírus na população alvo. Reação cruzada dos adenovírus de chimpanzé com respostas de anticorpo de neutralização pré-existentes está presente apenas em 2% da população alvo comparado com 35% no caso de determinados vetores adenovirais humanos candidatos. Os adenovírus de chimpanzé são distintos dos subtipos humanos Ad2 e Ad5 mais comuns, mas não mais intimamente relacionados ao Ad4 humano do subgrupo Ε, o qual não é um subtipo prevalente. Pan 6 é menos intimamente relacionado ao Pan 5, 7 e 9.

O adenovírus da invenção pode ter a replicação defectiva. Isso significa que ele tem uma capacidade reduzida de se replicar em células não complementares, comparado com o vírus do tipo silvestre. Isso pode ser obtido através de mutação do vírus, por exemplo, através de deleção de um gene envolvido em replicação, por exemplo, deleção do gene Ela, Elb, E3 ou E4.

Os vetores adenovírus de acordo com a presente invenção pode ser derivado de adenovírus com replicação defectiva compreendendo uma deleção El funcional. Assim, os vetores adenovirais de acordo com a invenção podem ter a replicação defectiva em virtude da ausência da capacidade de expressar Ela e Elb adenoviral, isto é, são funcionalmente deletados em Ela e Elb. Os adenovírus recombinantes também podem trazer deleções funcionais em outros genes [veja WO 03/000283], por exemplo, deleções em genes E3 ou E4 (ou parte dos mesmos, tal como parte de E3). O gene precoce retardado E3 de adenovírus pode ser eliminado da seqüência adenoviral a qual forma parte do vírus recombinante. A função de E3 não é necessária para a produção da partícula adenoviral recombinante. Assim, é desnecessário substituir a função desse produto genético de forma a engolfar um adenovírus recombinante útil na invenção. Em uma modalidade particular, os adenovírus recombinantes têm genes El e E3 funcionalmente deletados. A construção de tais vetores é descrita em Roy e colaboradores, Human Gene Therapy 15: 519-530, 2004. Em um aspecto, o adenovírus tem El e E4 deletados e parte de E3 deletada.

Adenovírus recombinantes também podem ser construídos tendo uma deleção funcional do gene E4, embora possa ser desejável reter a função ORF6 de E4. Vetores adenovirais de acordo com a invenção também podem conter uma deleção no gene precoce retardado E2a. Deleções também podem ser feitas em qualquer um dos genes tardios Ll a L5 do genoma do adenovírus. Deleções similares nos genes IX e IVa intermediários podem ser úteis.

Outras deleções podem ser feitas em outros genes de adenovírus estruturais ou não estruturais. As deleções acima podem ser usadas individualmente, isto é, uma seqüência de adenovírus para uso na presente invenção pode conter deleções de El apenas. Alternativamente, deleções de genes inteiros ou porções dos mesmos eficazes para destruir sua atividade biológica podem ser usadas em qualquer combinação. Por exemplo, em um vetor exemplificativo, as seqüências de adenovírus podem ter deleções dos genes El e do gene E4 ou dos genes El, E2a e E3 ou dos genes El e E3 (tais como deleções funcionais em Ela e Elb e uma deleção de pelo menos parte de E3) ou dos genes El, E2a e E4, com ou sem deleção de E3 e assim por diante. Tais deleções podem ser deleções parciais ou completas desses genes e podem ser usadas em combinação com outras mutações, tais como mutações sensíveis à temperatura, para obter um resultado desejado.

Os vetores adenovirais podem ser produzidos sobre qualquer linhagem de célula adequada na qual o vírus é capaz de replicação. Em particular, linhagens de célula de complementação as quais fornecem os fatores que faltam ao vetor viral que resultam em suas características de replicação prejudicada (tal como El e/ou E4) podem ser usadas. Sem limitação, tal linhagem de célula pode ser células HeLa [Acesso a ATCC No. CCL 2], A549 [Acesso a ATCC No. CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [por exemplo, Detroit 510, CCL 72] e WI-38 [CCL 75], dentre outras. Essas linhagens de células estão todas disponíveis da American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209. Outras linhagens de células precursoras adequadas podem ser obtidas de outras fontes, tais como células PER.C6®, conforme representado pelas células depositadas sob ECACC no. 96022940 na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) no Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR, Reino Unido) ou células Her 96 (Crucell).

A invenção se estende ao uso de linhagens de células conhecidas para o preparo de um vetor viral que codifica uma proteína da presente invenção.

As seqüências de polinucleotídeo as quais codificam polipeptídeos CS imunogênicos podem ser códon-otimizadas para células de mamífero. Tal otimização de códon é descrita em detalhes no WO 05/025614.

A presente invenção também se refere à vacinas compreendendo uma quantidade imunoprotetora de partícula de proteína de acordo com a invenção em mistura com um diluente ou veículo adequado.

A invenção também se estende a uma composição compreendendo uma partícula de acordo com a invenção e um vetor viral compreendendo um antígeno da malária, particularmente um antígeno da malária em comum com a referida partícula e opcionalmente um adjuvante.

No contexto da presente especificação, excipiente se refere a um componente em uma formulação farmacêutica sem efeito terapêutico em si. Um diluente ou veículo cai dentro da definição de um excipiente.

Imunogênico, no contexto da presente especificação, se destina a se referir à capacidade de estimular uma resposta imune. Essa resposta pode, por exemplo, ser quando a partícula de lipoproteína é administrada em uma formulação apropriada a qual pode incluir/requerer um adjuvante adequado. Um reforço compreendendo uma dose similar ou menos do que a dose original pode ser requerido para obter a resposta imunogênica requerida. A composição/formulações farmacêuticas de acordo com a invenção também podem incluir em mistura um ou mais de outros antígenos, tais como aqueles derivados de P. falciparum e/ou P. vivax, por exemplo, em que o antígeno é selecionado de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSPó, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAl e RBP ou um fragmento dos mesmos.

Em outro exemplo, antígenos derivados de P. falciparum incluem PfEMP-1, antígeno Pfs 16, MSP-1, MSP-3, LSA-1, LSA-3, AMA-I e TRAP. Outros antígenos de Plasmodium incluem EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, Pf332, STARP, SALSA, PfEXP 1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum e seus análogos em outras Plasmodium spp.

As composições/formulações farmacêuticas de acordo com a invenção podem também compreender partículas de RTS, S (conforme descrito no WO 93/10152) em mistura com as partículas de acordo com a invenção.

Em uma modalidade, a estrutura de vetor viral é conforme descrito no WO 2004/055187.

Na vacina da invenção, uma solução aquosa da partícula pode ser usada diretamente. Alternativamente, a proteína, com ou sem liofilização prévia, pode ser misturada ou absorvida com qualquer um dos adjuvantes conhecidos os quais incluem, mas não estão limitados a, alume, dipeptídeo de muramila, saponinas, tal como Quil A.

Adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo consistindo de sais de metal, emulsões óleo em água, agonista do receptor Toll-semelhante (em particular, agonista do receptor 2 Toll-semelhante, agonista do receptor 3 Toll-semelhante, agonista do receptor 4 Toll- semelhante, agonista do receptor 7 Toll-semelhante, agonista do receptor 8 Toll-semelhante e agonista do receptor 9 Toll-semelhante), saponinas ou combinações dos mesmos, contanto que os sais de metal não sejam usados unicamente em combinação com outro adjuvante e não sozinhos, a menos que eles sejam formulados de uma forma tal que não mais do que cerca de 60% do antígeno estejam adsorvidos sobre o sal de metal, mais especificamente não mais do que cerca de 50%, por exemplo, 40% do antígeno estão adsorvidos sobre o sal de metal e, em uma modalidade, não mais do que cerca de 30% do antígeno estão adsorvidos sobre o sal de metal. O nível de anticorpo adsorvido sobre o sal de metal pode ser determinado através de métodos bem conhecidos na técnica. O nível de antígeno livre pode ser aumentado, por exemplo, formulando a composição na presença de íons de fosfato, tal como solução salina tamponada com fosfato, ou aumentando a proporção de antígeno para sal de metal. Em uma modalidade, o adjuvante não inclui um sal de metal como o único adjuvante. Em uma modalidade, o adjuvante não inclui um sal de metal. Em uma modalidade, o adjuvante é um ligante do receptor 4 Toll-semelhante (TLR), de preferência um agonista, tal como um derivado de lipídio A, particularmente monofosforil lipídio A ou, mais particularmente, monofosforil lipídio A 3 deacilado (3D-MPL).

Monofosforibosil lipídio A 3 deacilado é conhecido da Patente U.S. No. 4.912.094 e pedido de patente do Reino Unido No. 2.220.211 (Ribi) e está disponível da Ribi Immunochem, Montana, EUA.

3D-MPL é vendido sob a marca comercial MPL® pela Corixa Corporation e promove primariamente respostas de células T CD4+ com um fenotipo de IFN-g (Thl). Ele pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados no GB 2 220 211 A. Quimicamente, ele é uma mistura de monofosforil lipídio A 3-deacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. De preferência, nas composições da presente invenção, 3D-MPL com pequeno tamanho de partícula é usado. 3D-MPL com pequeno tamanho de partícula tem um tamanho de partícula de modo que ele pode ser filtrado estéril através de um filtro de 0,22 μπι. Tais preparados são descritos no Pedido de Patente Internacional No. WO 94/21292. Derivados sintéticos de lipídio A são conhecidos e acredita-se que sejam agonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitado a:

OMl 74 (2-deóxi-6-0-[2-deóxi-2-[(R)-3-dodecanoilóxi

tetradecanoilamino]-4-o-fosfono-P-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3-hidróxi tetradecanoilamino]-a-D-glicopiranosil di-hidrogen fosfato) (WO 95/14026)

OM294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoilóxi

tetradecanoilamino] -4-oxo-5 -aza-9(R)- [(R)-3 -hidróxi

tetradecanoilamino] decan-1,10-diol, 1,10-bis(di-hidrogen fosfato) (W099 /64301 e WO 00/0462 )

OMl 97 MP-Ac DP 10-(6-aminohexanoato) de (3S-,9R)-3- [(R)-dodecanoilóxi tetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidróxi

tetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1-di-hidrogen fosfato) (WO 01/46127). Tipicamente, quando 3D-MPL é usado, o antígeno e 3D-MPL são distribuídos com alume ou apresentados em uma emulsão óleo em água ou múltiplas emulsões óleo em água. A incorporação de 3D-MPL é vantajosa, uma vez que ele é um estimulante de respostas de células T efetuadoras.

Outros ligantes de TLR4 os quais podem ser usados são alquil glicosaminida fosfatos (AGPs), tais como aqueles divulgados no WO 9850399 ou US 6303347 (processos para o preparo de AGPs são também divulgados) ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs, conforme divulgado no US 6764840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4 e alguns são antagonistas de TLR4. Acredita-se que ambos sejam úteis como adjuvantes.

Outro imunoestimulante para uso na presente invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é um preparado de saponina isolado da arvora da América do Sul Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro descrita como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard e colaboradores em 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, páginas 243-254). Fragmentos purificados de Quil A foram isolados através de HPLC, os quais retêm atividade adjuvante sem a toxicidade associada à Quil A (EP 0 362 278), por exemplo, QS7 e QS21 (também conhecidas como QA7 e QA21). QS-21 é uma saponina natural derivada da casca de Quillaja saponaria Molina a qual induz à células T citotóxicas CD8+ (CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante.

Formulações particulares de QS21 foram descritas, as quais ainda compreendem um esterol (WO 96/33739). A proporção de QS21:esterol será, tipicamente, da ordem de 1:100 a 1:1, peso/peso. Geralmente, um excesso de esterol está presente, a proporção de QS21:esterol sendo de pelo menos 1:2 peso/peso. Tipicamente, para administração a seres humanos, QS21 e esterol estarão presentes em uma vacina na faixa de cerca de 1 pg a cerca de 100 μg, tal como cerca de 10 μg a cerca de 50 μg por dose.

Os lipossomas geralmente contêm um lipídio neutro, por exemplo, fosfatidil colina, o qual é usualmente não cristalino em temperatura ambiente, por exemplo, fosfatidil colina de gema de ovo, dioleoil fosfatidil colina ou dilauril fosfatidil colina. Os lipossomas também podem conter um lipídio carregado o qual aumenta a estabilidade da estrutura lipossoma-QS21 composta de lipídios saturados. Nesses casos, a quantidade de lipídio carregado é, freqüentemente, de 1-20% peso/peso, tal como 5-10%. A proporção de esterol para fosfolipídio é de 1-50% (mol/mol), tal como 20- 25%.

Essas composições podem conter MPL (monofosforil lipídio A 3-deacilado, também conhecido como 3D-MPL). 3D-MPL é conhecido do GB 2 220 211 (Ribi) como uma mistura de 3 tipos de monofosforil lipídio A De-O-acilados com 4, 5 ou 6 cadeias aciladas e é fabricado pela Ribi Immunochem, Montana.

As saponinas podem ser separadas na forma de micelas, micelas misturadas (geralmente, mas não exclusivamente, com sais biliares) ou podem estar na forma de matrizes ISCOM (EP 0 109 942), lipossomas ou estruturas coloidais relacionadas, tais como complexos multiméricos semelhantes a anel ou semelhantes a verme ou estruturas lipídicas/em camadas e lamelas quando formuladas com colesterol e lipídio ou na forma de uma emulsão óleo em água (por exemplo, conforme no WO 95/17210). As saponinas podem, freqüentemente, estar associadas a um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (WO 98/15287).

Usualmente, a saponina é apresentada na forma de um lipossoma, ISCOM ou uma emulsão óleo em água.

Oligonucleotídeos imuno-estimulatórios podem também ser usados. Oligonucleotídeos exemplificativos para uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção incluem oligonucleotídeos contendo CpG, geralmente contendo dois ou mais motivos CpG dinucleotídicos separados por pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos seus ou mais nucleotídeos. Um motivo CpG é um nucleotídeo de citosina, seguido por um nucleotídeo de guanina. Os oligonucleotídeos de CpG são, tipicamente, deóxinucleotídeos. Em uma modalidade, o internucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato ou, mais preferivelmente, uma ligação de fosforotioato, embora fosfodiéster e outras ligações internucleotídeo estejam dentro do escopo da invenção. Também incluídos dentro do escopo da invenção são oligonucleotídeos com ligações internucleotídeo misturadas. Métodos para a produção de oligonucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato são descritos na US 5.666.153, US 5.278.302 e WO 95/26204. Exemplos de oligonucleotídeos são como segue: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456), as seqüências podendo conter ligações internucleotídeo de fosforotioato.

Oligonucleotídeos de CpG alternativos pode compreender uma ou mais seqüências, acima do que eles têm deleções ou adições sem conseqüências nos mesmos.

Os oligonucleotídeos de CpG podem ser sintetizados através de qualquer método conhecido na técnica (por exemplo, veja EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático.

Exemplos de um agonista de TLR2 incluem peptidoglicana ou lipoproteína. Imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod, são agonistas de TLR7 conhecidos. RNA fita simples também é um agonista de TLR conhecido (TLR8 em seres humanos e TLR7 em camundongos), enquanto que RNA fita dupla e poli IC (ácido poli-inosínico/poli-citidílico - um mimético sintético comercial de RNA viral) são exemplos de agonistas de TLR3. 3D-MPL é um exemplo de um agonista de TLR4, enquanto CpG é um exemplo de um agonista de TLR9.

Um imuno-estimulante pode, alternativamente ou além disso, ser incluído. Em uma modalidade, essa imuno-estimulante será monofosforil lipídio A 3 deacilado (3D-MPL).

Em um aspecto, o adjuvante compreende 3D-MPL.

Em um aspecto, o adjuvante compreende QS21.

Em um aspecto, o adjuvante compreende CpG.

Em um aspecto, o adjuvante é formulado como uma emulsão

óleo em água.

Em um aspecto, o adjuvante é formulado como lipossomas.

Combinações de adjuvante incluem 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 BI), emulsões óleo em água compreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414) ou 3D-MPL formulado com outros veículos (EP 0 689 454 BI). Outros sistemas de adjuvante preferidos compreendem uma combinação de 3D-MPL, QS21 e um oligonucleotídeo de CpG, conforme descrito no US 6558670 e US 6544518.

Em uma modalidade, a presente invenção proporciona uma vacina compreendendo uma partícula aqui descrita, em combinação com 3 D- MPL e um veículo. Tipicamente, o veículo será uma emulsão óleo em água ou alume.

As partículas de proteína da presente invenção também podem ser encapsuladas em micropartículas, tais como lipossomas.

O preparo de vacinas é geralmente descrito em New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller e colaboradores, University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A., 1978. Encapsulação dentro de lipossomas é descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente U.S. 4.235.877. A quantidade das partículas de proteína da presente invenção presentes em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade a qual induz a uma resposta imune sem efeitos colaterais adversos significativos em vacinas típicas. Tal quantidade variará dependendo de qual imunogênio específico é empregado e se a vacina tem ou não um adjuvante. Geralmente, espera-se que cada uma compreenda 1-1000 μg de proteína, de preferência 1- 200 μg, mais preferivelmente 10-100 μg. Uma quantidade ótima para uma vacina em particular pode ser determinada através de estudos padrões envolvendo observação de titulações de anticorpo e outras respostas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos receberão, de preferência, um reforço em cerca de 4 semanas, seguido por reforços repetidos a cada seis meses, durante tanto tempo quanto haja um risco de infecção. A resposta imune à proteína da presente invenção é intensificada através do uso de adjuvante ou um imuno-estimulante.

A quantidade de 3D-MPL usada geralmente é pequena mas, dependendo da formulação de vacina, pode estar na faixa de 1-1000 μg por dose, por exemplo, 1-500 μg por dose e tal como entre 1 a 100 μg por dose.

A quantidade de CpG ou oligonucleotídeos imuno- estimulatórios nos adjuvantes ou vacinas da presente invenção geralmente é pequena mas, dependendo da formulação de vacina, pode estar na faixa de 1 - 1000 μg por dose, de preferência 1-500 μg por dose e, mais preferivelmente, entre 1 a 100 μg por dose.

A quantidade de saponina para uso nos adjuvantes da presente invenção pode estar na faixa de 1-1000 μg por dose, de preferência 1-500 μg por dose, mais preferivelmente 1-250 μg por dose e, ainda mais preferivelmente, entre 1 a 100 μg por dose.

As formulações da presente invenção podem ser usadas para fins profiláticos e terapêuticos, terapia inclui tratamento profilático. Conseqüentemente, a invenção proporciona uma composição de vacina conforme descrito aqui para uso em medicina, por exemplo, para o tratamento (incluindo profilaxia) de malária.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar um processo para o preparo de proteína híbrida da invenção, processo o qual compreende expressão da seqüência de DNA que codifica a proteína em um hospedeiro adequado, de preferência um levedo e recuperação do produto.

Um outro aspecto da invenção repousa em um método de tratamento de um paciente suscetível à infecções por Plasmodium através de administração de uma quantidade eficaz de uma vacina conforme aqui antes descrito.

Em um outro aspecto, é proporcionada uma combinação para tratamento compreendendo uma partícula imunogênica de acordo com a invenção e um vetor viral que codifica um antígeno de malária, tal como o referido antígeno híbrido, por exemplo, em que a referida partícula e o referido vetor viral são administrados concomitantemente, por exemplo, elas podem ser misturados para administração simultânea ou, alternativamente, podem ser formulados para administração seqüencial.

Conforme usado aqui, o termo "concomitantemente" significa quando a referida combinação de componentes é administrada dentro de um período de não mais do que 12 horas, por exemplo, dentro de um período de não mais do que 1 hora, tipicamente em uma ocasião, por exemplo, no curso da mesma visita ao profissional de saúde, por exemplo, onde eles são administrados seqüencial ou simultaneamente.

A invenção também inclui regimes de reforço de prime com os vários componentes descritos aqui, por exemplo, priming com vetor viral e reforço com as referidas partículas ou vice versa.

No contexto da presente especificação, compreendendo deve ser interpretado como incluindo.

Aspectos da invenção compreendendo um determinado elemento também se destinam a se estender aos referidos aspectos consistindo ou consistindo essencialmente dos elementos relevantes.

Os exemplos abaixo são mostrados para ilustrar a metodologia a qual pode ser empregada para preparar partículas da invenção. Os exemplos podem ou não formar um aspecto da invenção. EXEMPLOS Exemplo 1

DESCRIÇÃO DA CEPA Y1834

A cepa recombinante de levedo Yl834 pode ser usada para expressar a proteína de fusão. Ela consiste da cepa hospedeira DC5 de Saccharomyces eerevisiae transformada com o vetor de expressão recombinante pRIT 15546.

DC5 é uma cepa de levedo de laboratório (ATCC No: 20820) com o seguinte fenotipo: leu2-3, leu2-112, his3, canl-11. A mutação dupla leu-2 permite seleção para a captação e manutenção do vetor pRIT15546, o qual traz uma cópia funcional do gene LEU-2. Apenas aquelas células trazendo um vetor com um gene LEU-2 podem crescer quando leucina está ausente do meio de crescimento.

O vetor pRIT 15546 é um vetor de expressão epissomal de levedo (vetor 2μ-baseado) trazendo o cassete de expressão. A expressão recombinante é acionada por um promotor derivado do gene TDH3 de levedo (expressão constitutiva). A construção do vetor pRIT15546 é detalhada abaixo.

Construção do vetor pRIT15546

Um gene sintético com um uso de códon apropriado para expressão de levedo é construído e sub-clonado no vetor pUC57. O plasmídeo pUC57/CSV resultante e o vetor de expressão de levedo pGfl-S2 são ambos restritos com a enzima apropriada. O vetor pGfl-S2 foi construído (em GSK) através de um procedimento de clonagem com múltiplas etapas. Esse vetor, o qual já traz um cassete de expressão S, permite a construção de genes de fusão, como uma fusão em-rede N-terminal com o gene S do vírus da Hepatite Β. O vetor de expressão final, após verificação de seqüência, foi denominado pRIT15546 (Fig 3). Transformação da cepa DC5

A cepa DC5 leu- e his-auxotrófica é transformada com o plasmídeo recombinante pRIT15546 usando protocolo padrão para levedo. As células transformadas foram colocadas sobre lâminas seletivas de Agar. Um transformante foi selecionado e recebeu a designação oficial Yl 834. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Yl 834 é crescida a 30 0C em meio mínimo YNB (Base de Nitrogênio de Levedo, disponível da Kracker Scientific Inc.) suplementado com 8 μg/ml de histidina até uma O.D. (620 nm) de 0,5. Então, as células são coletadas e os extratos celulares são preparados. PREPARO DE EXTRATO

As células são suspensas em Tampão de Ruptura e mecanicamente rompidas (glóbulos de vidro). Extrato é centrifugado durante minutos a 5000 rpm. A fração sobrenadante é passada sobre SDS-PAGE a 4-20%.

Tampão de Ruptura: Tampão de fosfato de Na a 50 mM (pH de 7,5), EDTA a 4 mM, Tween-20 a 0,5% + coquetel inibidor de protease (Completo/ROCHE).

Concentração de células: 100 ml de cultura (OD: 0,5) em 5 ml de tampão de ruptura.

Clarificação do extrato bruto: extrato centrifugado 15 minutos/5000 rpm.

DETECÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

Os extratos clarificados são passados sobre SDS-PAGE a 4- 20%, as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose e submetidas à imunocoloração.

Análise de Western blotting:

Reagente = anticorpo monoclonal de camundongo anti-S (preparado pela GSK Biologicals) - (diluição: 1/500)

Anticorpos anti-S os quais estão comercialmente disponíveis podem ser substituídos por aqueles empregados nesse método. Alternativamente, anticorpos anti-CSV podem ser empregados, por exemplo, aqueles conhecidos como MR4 disponíveis da NIH. Exemplo 2

DESCRIÇÃO DA CEPA Y1835

A cepa recombinante de levedo Yl 835 expressa simultaneamente a proteína de fusão CSV-S e o antígeno S. Para obter uma cepa co-expressando CSV-S e proteínas S, a cepa Y1295 de Saccharomyces eerevisiae, a qual já traz cinco cópias integradas de cassetes de expressão S, foi transformada com o vetor de expressão integrativo recombinante pRIT15582.

A cepa Yl 295 foi construída em GSK através de procedimentos de transformação com múltiplas etapas. A construção da cepa Y1295 é descrita no WO 93/10152. A cepa Y1295 tem o seguinte fenotipo: leu2-3, leu2-112, gall. A mutação leu-2 permite seleção para a captação de um fragmento de DNA linear pRIT15582-derivado,o qual traz o casses CSV- Seo gene funcional LEU2.

O vetor pRIT15582 é um vetor de expressão de levedo integrativo (vetor Ty-baseado) trazendo o cassete de expressão C SV-S. A expressão recombinante é acionada por um promotor derivado do gene TDH3 de levedo (expressão constitutiva). A construção do vetor pRIT15582 é detalhada abaixo.

Construção do vetor integrativo pRIT15582

O material de iniciação usado para construir o vetor pRIT15582 foi o plasmídeo de expressão pRIT15546 (Fig 1). A construção desse plasmídeo é descrita no Exemplo 1. Digestão do pRJT15546 com endonuclease HindIII libera um fragmento de DNA de 3706 bp de comprimento correspondendo ao cassete de expressão CSV-S completo (pTDH3 + CSV-S + tARG3). Esse fragmento de DNA HindIII (após enchimento com DNA polimerase T4) foi inserido no vetor integrativo Ty- baseado pRIT13144 no sítio de clonagem único SalI (SalI restrito/T4 tratado). O plasmídeo pRIT15582 resultante contém, além do cassete de expressão, o gene LEU2 de levedo como um marcador seletivo (Fig. 3). Digestão do pRIT15582 com endonuclease XhoI libera um fragmento linear de 8500 bp mostrado na Figura 4, o qual pode ser integrado no genoma do levedo através de recombinação homóloga das extremidades livres com elementos Ty residentes.

Transformação da cepa Y1295

Para obter uma cepa expressando proteínas S e CSV-S, a cepa Yl295 foi transformada com o fragmento XhoI linear de 8500 bp (Fig 4) com seleção por colônias Leu+. Vários integrantes contendo conjuntos de ambos os cassetes de expressão presentes no genoma em várias proporções foram obtidos. Um transformante trazendo quatro cópias de cassetes CSV-S foi selecionado e fornecida a designação oficial Yl835. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Yl 835 é crescida a 30 0C em meio mínimo YNB (Base de Nitrogênio de Levedo, disponível da Kracker Scientific Inc.) suplementado com 8 μg/ml de histidina até uma O.D. (620 nm) de cerca de 0,5 (0,8). Então, as células são coletadas e os extratos celulares são preparados. ANÁLISE DOS PRODUTOS DE EXPRESSÃO ATRAVÉS DE IMUNOBLOTTING PREPARO DE EXTRATO

As células são suspensas em Tampão de Ruptura e mecanicamente rompidas (glóbulos de vidro). Extrato é centrifugado durante 5-10 minutos a 5000 rpm. A fração sobrenadante é passada sobre SDS-PAGE a 12,5%.

Tampão de Ruptura: Tampão de fosfato de Na a 50 mM (pH de 7,5), EDTA a 4 mM, Tween-20 a 0,5% + coquetel inibidor de protease (Completo/ROCHE).

Concentração de células: 100 ml de cultura (OD: 0,5) em 2,5 ml de tampão de ruptura = concentração de 20 unidades OD/ml.

Clarificação do extrato bruto: extrato centrifugado 5-10 minutos/5000 rpm.

DETECÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

Os extratos clarificados são passados sobre SDS-PAGE a 12,5%, as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose e submetidas à imunocoloração. Análise de Western blotting (Fig. 5):

Reagentes =

1. anticorpo monoclonal de camundongo anti-S (preparado pela GSK Biologicals) - (diluição: 1/250)

2. anticorpo policlonal de coelho anti-CSV (gentilmente fornecido pela WRAIR) - diluição de 1/20.000.

Anticorpos anti-S, bem como anticorpos anti-i5. vmax/CSP, os quais estão comercialmente disponíveis,podem ser substituídos por aqueles empregados nesse método. Exemplo 3 DESCRIÇÃO DA CEPA Y1845

A cepa recombinante de levedo Y1845 expressa simultaneamente a proteína de fusão CSV-S, a fusão RTS e o antígeno S. Para obter uma cepa co-expressando CSV-S, RTS e proteínas S, a cepa Yl295 de Saccharomyces eerevisiae, a qual já traz cinco cópias integradas de cassetes de expressão S, foi transformada com uma quantidade equimolar de fragmentos de DNA lineares de RTS e CSV-S derivados dos vetores integrativos pRIT13540 e pRIT15582, respectivamente.

A cepa Yl295 foi construída em GSK através de um procedimento de transformação com múltiplas etapas. A construção da cepa Y1295 é descrita no WO 093/10152. A cepa Y1295 tem o seguinte fenotipo: leu2-3, leu2-l 12, gall. A mutação leu-2 permite seleção para a captação de fragmento de DNA linear pRIT15582-derivado, o qual traz o cassete CSV-S e o gene funcional LEU2.

Os vetores pRIT13540 e pRIT15582 são vetores de expressão de levedo integrativos (vetor Ty-baseado) trazendo os cassetes de expressão RTS e CSV-S, respectivamente. Para ambos os vetores, a expressão recombinante é acionada por um promotor derivado do gene TDH3 de levedo (expressão constitutiva). A construção do vetor pRIT 15582 é detalhada no Exemplo 2. A construção do vetor pRIT13540 é descrita no WO 93/10152. Preparo dos fragmentos de DNA integrativos lineares

Os vetores integrativos pRIT13540 e pRIT 15582 foram ambos restritos com endonuclease XhoI, liberando fragmentos de DNA de 8200 bp e 8500 bp, respectivamente. Esses fragmentos podem ser integrados no genoma do levedo através de recombinação homóloga das extremidades livres com elementos Ty residentes. Transformação da cepa Y1295

Para obter uma cepa expressando as três proteínas RTS, CSV- S e S, a cepa Y1295 foi transformada com uma solução equimolar dos fragmentos XhoI lineares de 8200 bp e 8500 bp, com seleção por colônias Leu+. Vários integrantes contendo conjuntos dos dois cassetes de expressão presentes no genoma em várias proporções foram obtidos. Um transformante trazendo quatro cópias de CSV-S e duas cópias de RTS (além das cinco cópias de cassetes S) foi selecionado e fornecida a designação oficial Y1845. EXPRESSÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Yl 845 é crescida a 30 0C em meio mínimo YNB (Base de Nitrogênio de Levedo, disponível da Kracker Scientific Inc.) suplementado com 8 μg/ml de histidina até uma O.D. (620 nm) de 0,5. Então, as células são coletadas e os extratos celulares são preparados. PREPARO DE EXTRATO

As células são suspensas em Tampão de Ruptura e mecanicamente rompidas (glóbulos de vidro). Extrato é centrifugado durante 5-10 minutos a 5000 rpm. A fração sobrenadante é passada sobre SDS-PAGE a 12,5%.

Tampão de Ruptura: Tampão de fosfato de Na a 50 mM (pH de 7,5), EDTA a 4 mM, Tween-20 a 0,5% + coquetel inibidor de protease (Completo/ROCHE).

Concentração de células: 100 ml de cultura (OD: 0,5) em 5 ml de tampão de ruptura = concentração de 10 unidades OD/ml.

Clarificação do extrato bruto: extrato centrifugado 5-10 minutos/5000 rpm.

DETECÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE

Os extratos clarificados são passados sobre SDS-PAGE a 12,5%, as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose e submetidas à imunocoloração.

Análise de Western blotting (Fig. 5):

Reagente = anticorpo monoclonal de camundongo anti-S (preparado pela GSK Biologicals) - (diluição: 1/500). CENTRIFUGACÂO EM GRADIENTE DE DENSIDADE CsCl

A formação de partículas na cepa Yl845 foi analisada através de centrifugação em gradiente de densidade de CsCl. Extratos brutos (-20 mg de proteína total) foram analisados sobre gradiente de 12 ml de CsCl a 1,5 M (88 horas a 40.000 rpm, +8 0C em um rotor Beckman 70,1 Ti). Frações (-0,6 ml) foram coletadas e analisadas através de imunoblot usando um anticorpo anti-S. Conforme mostrado na Figura 8, picos por Western blot aparecem nas mesmas frações (No. IOe 11) do gradiente, correspondendo a uma densidade flutuante de 1,21 e 1,20 g/cm3. A formação de partícula tripla é sustentada através de análise de gradiente. Referências

(1) Harford N, Cabezon T, Colau B. e colaboradores, "Construction and Characterization of a Saccharomyces Cerevisiae Strain (RIT4376) Expressing Hepatitis B Surface Antigen", Postgrad Med J 63, Sup. 2: 65-70,1987.

(2) Jacobs E, Rutgers T, Voet P. e colaboradores, "Simultaneous Synthesis and Assembly of Various Hepatitis B Surface Proteins in Saccharomyces cerevisiae", Gene 80: 279-291, 1989.

(3) Vieira J e Messing J, "The pUC plasmids, an M13mp7- Derived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers", Gene 19: 259-268,1982.

(4) Hinnen A, Hicks JB. e Fink GR, "Transformation of Yeast", Proe Natl Aead Sei USA 75: 1929-1933, 1980.

(5) Broaeh JR, Strathern JN. e Hicks JB, "Transformation in Yeast Development of a Hybrid Cloning Vector and Isolation of the CAN 1 Gene", Gene 8: 121-133,1979.

(6) Zhang H. e colaboradores, "Double Stranded SDNA Sequencing as a Choice for DNA Sequencing", Nucleic Acids Research 16: 1220, 1988.

(7) Dame JB, Williams JL. Mc Cutchan TF. e colaboradores, " Structure of the Gene Encoding the Immunodominant Surface Antigen on the Sporozoites of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum", Science 225: 593-599, 1984.

(8) Valenzuela P, Gray P, Quiroga M. e colaboradores, "Nucleotide Sequences of the Gene Coding for the Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen", Nature 280: 815-819,1979.

(9) In SS, Kee-Hoyung L, Young RK. e colaboradores, "Comparison of Immunological Responses to Various Types of

Circunsporozoite Proteins of Plasmodium vivax in Malaria Patients of Korea", Microbiol. Immunol. 48(2): 119-123; 2004; Microbiol. Immunol. 2004; 48(2): 119-123.

(10) Rathore D, Sacci JB, de Ia Vega P. e colaboradores, "Binding and Invasion of Liver Cells by Plasmodium falciparum

SporozoitesJ. Biol. Chem. 277(9): 7092-7098, 2002.

(11) Rathore e colaboradores, 2002, J. Biol. Chem. 277, 7092-8. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SSQ ID NO: 1 REGIÃO 1 KLKQP

SEQ ID NOϊ 2 REGIÃO Π PLUS CSVTCG

SEQ ID NO: 3 Repetição VK210 GDRAAGQPA

SEQ ID 170: 4

Repetição VK210 GDRADGQPA

SSQ ID NO: 5 Repetição VK210 GDKftDGQAA

SBQ ID MOt 6 Repetição VK210 GNGAGGQPA

SEQ ID NO: 7 Repetição VK210

GDGAAGQPA

SEQ ID NOt 8 Repetição YK210 GDRAA GQAA

SEQ U> NO: 9 Repetição VK210 GNGAGGQAA

SEQ ID NO: 10 Repetição YK210 principal ANGAGNQFG

SEQ ID NOJ 11 Inserção de 12 aminoácidos

GGNAANKKAEDA Seqüência de nucleotídeo de Pv-CS SEQ ID NO: 12

Acacattgcggacataatgtagatttafcctaaagctataaatttaaatggtgfcaaac tteaataacgtaqacgctaqrttcactcçiqqçretcycg cacgtaggtcagtctgctagcagggggcgcggtctcggggaaaacccagacgacgaa gaaggtgatgctaaaaagaaaaaggacg

gtaaaaaageggaaccaaaaaatccaagggaaaataaattaaaacagcccggggatc gcgcggatggtcaagcggcgggtaatggg

gcggggggtcaaccagcgggggatcgcgcggctggtcagccagcgggggatcgcgcg gctggtcagccagcgggggatggtgc

ggctggccaaccagcgggggatcgcgcggatggtcagccagcgggggatcgcgcgga tggtcaaccagccggtgatcgegcggct

ggccaagcggccggtaatggggcggggggtcaagcggccgcgaacggagcggggaac cagccaggcggcggtaaegctgcga

ataaaaaagcggaagatgcgggtggtaacgcgggcggtaatgcgggcggccaaggtc agaacaacgaaggggc taat gcaccaaa

cgaaaaatctgtcaaagaatatctcgataaagtccgcgctacagtagggacagaatg gacgccatgctctgtaacatgtggtgtcggggt

acgcgtgcgccgccgtgtcaatgcggctaacaaaaaaccagaagatctcacgttaaa tgatctcgaaacggatgtctgcaca

SSQ ID NOi 13

Seqüência de amiitoácidos da proteína Pv- C S

THCGHNVDLS KAINLNGVNFNNVDAS SLGAAHVGQSASRGRGLGEN

PDDB2GDAKKKKDGKKAEPKNPRENKXKQPGDRADGQAAGNGAGG

QPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGDGAAGQPAGDRADGQPAGDRADG

QPAGDRAAGQAAGNGAGGQAAAHGAGNQPGGGNAANKKAEDAGG

NAGGNAGGÇXSQNNEGANAPHEKSVKEYLDKVRATVGTEWTPCSVT

CGVGVRVRRRVNAANKKPEDLTLNDLETDVCT

SEQ XD HO: 14 Repetição mínima do tipo 2

AKGAGDQPG

SEQ ID No IS

GENE HÍBRIDO DE CSV

AOTGArreTGGTC^CAAIOT 6 O

AACAACCTCGATGC^CTTCTTTAG^ 120 AGAGGT T TAGGTGAAAACC C AGACGACGAAGAAGGTGACGC TAAGAAGAAGAAGGACGG T 180

aagaag<xxgaaccaaagaacccaagagaaaacaagttgaaa 240

GACGGA CAAG CAG C TGGTAATGGTGCTGGAGGT CAACCAGCTGGTGACAG AG CTGCCG G 7 3 00

CAaCCTGCTGCSTGATAGAGCTGCTGGACAACCTGCTGGAGACGOlWCQCC® 360

GCTOGrGATAaAGCAGACGGACAACCAGCTGCTGA^ 420

GATAGGGCTGCAGGTCAAGCCGCTGGTAACGGTGCCGGTGGTCAAGCT 480

GCTGGTAACCAACCAGGTGGTGGTAACGCTGCCAACAA 540

AATGCTGGAGGTAATGCAGGTGGTCAGGGTCAAAACAACGAAGGTGCT 600

GaaAAGTCraiTAftGG^ 660

CCATGTTClXrrTACTrOTCXSTCTCGGTGTT^^ 720

AAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTAAACGACTTGGAAACTGACGTTTGTACT 771

SKQ ID NO 16 I Fusao de CSV-S

Seqüência de nucleotídeos

ATGATGGCTCCCGGGACCCATTCTGGTCACAATGTCGATTTGTCTAAGGCCATXAACTTG 6 0

AACGCTGTTAATTTCAACAAraTCGATGCTTCTTCTTTAGGl^^ 120

TCTeCTTCW^ÂGGTAGAOGT^ 180

AAGAAGAAGGACGGTAAGAAGGCOSAACCAAAGAACCCAAGAfi^^ 240

C CAfiGTGACAGAGCCGACGGACAAGCAGCTGGTAATGGTGCTGGAGGTCAACCAGC TGGT 3 OO

GACAGAGCTGCCGGTCAGCCIXXrrcGTGATAGAGCTGCrrGGACAAarrG 360

GCCGCCGGTCAACCTGCTGGTGATAGAfiCAGACGGACAACGAGCTC^ 420

GGACAGCCAGCCGGCGATAGGGCTG<^GTaekAGCCG<TrGGTAACGGTGCCGCTGGTCAA 480

GCTGCTGCTiW^TGCTGGrrA^ 540

GAAfíAOSCrraST^TAaTG^^ 600

GCTAACGCTCCftftACGAAJU^CH^ 660

GGTACTGAATtX^CTCCATGTTCTGTTACTTGTGGTGTC 720

GITAACGCCGCTAACAAGAAGCCAGAAGACTTGACTCTARACGACTTGGA 780

TGTACTCCCGGGCCTGTGACGAACAlt^AGAACATCACATC^GGATTCCTAGGACCCCTG 84 0 CTCSTGTTACT^GC^^GGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTA 900 GACTCX3TGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTC 960

TCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACXAACCTCCIO^ 1020

CGCTGGATGraTCTGCiKCGTTCTAT 1080

TTCTTArTGCTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCC^ 1140

T CAACAAC AACCAATAC GGGACCATGCAAAACCTGC ACXJACTCCTGCTCAAGGCAACT CT 12 00 ATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTOTATTCCCATC 12 6 0 CCATCXSTCCTGGCX^TTTCGCAAAATACCTATGGGAGT^ 1320

CTC^TTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCA^ 13 8 0

T<^GCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCMGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTT 14 4 0 ATACCGCTGTTACCAATT T TCTTTTGTCT CTGGG T ATAC ATTTAA 1485

SEQ ID No 17 Seqüência de aminoácidos

^^§THCGHNVDLSKAINMGVHPK]^^)ASSr^AAHVGQSASRGRGLGENPDDEEGDAK 60

KKXTCKKAEPiaiPRENKtiKQPGDHAIX3QAAGNGAGGOPAGDRAAGQPAGDRAAGQPAGIX3 12 0

AÂÍ^PAGDRAÍX^PAGDRADGQm 180

EDA^NAGGNAGGQGQNNEGAmPNEK3VK^YIX>XVRATVGTEWTPCSWCGVGVm^iRR 24 0

VKAAMKKPEDLTTJitDLKTDVC^PQPVTH^ESI TSGPU3 PLI.VLQAGFFLLTRILTIPQS L 300

DSKWTSI^FLGGSPVCLG^SQS PTSNHS PTSCPPICPGYRI^I^FIIFLFXLLLCIil 3 60

FLLVLLDYQGMIJPVCPLIPGSTTTN^ 4 20

PSSMAFA1CYLWBKASVRPSWLSLLVPFVQWFVGLS PTVWLSAIVíMMWYKGPSLYS XVSPF 480

IPLLPIPPCLWVYI 434 SEO IO NO. IS

Seqüência de nucleotídeo do cassete de expressão RTS e produto traduzido previsto da proteína híbrida RTS-HBs Ag. O produto da tradução, começando a partir do códen ATG de TDH3, é mostrado abaixo da seqüência de DNA.

AAGCTmCCAGTTCTC^CACGGAACAC<^CTAA^ CTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAÍ^CCAAGLAfíAG acrrtgatgcarattcccaaagctaataacatgcragacacgtacggtcaagaagacatat

ttgacctcttaactggttcagaoxxjactccctcatcagtaagac^

tacc^ aaaaaaacgaatatatactax3cgttgaatgttagcgtcaacaacaasaagttta

atgacgcggaggccaaggcaaaaagatrccttgattacgtaagggasttagaatcatttt

GAATAAAAAACACGCTTTTTC^TTCGAGTTTATCATTATt^

ΑΤΑΟβΤΑΑΑΤΑΑΤΓΑΑΤΑΟΤΑβΤ^^

taattctx!tgtaacccgtacatgcccaaaatagggggcgggttacacagaatatataac atcgtaggtgtcrroogtoaacagtttatccckxxlatc

TTTTAAG CTGG CAT CCAGAAAAAAAAAG AATC CCAGCACCAAAA7A3TGTTFTCTTCAC C

aaccatcagttcataggtcc^ttctcttagcgcaactac^

G CAAAAAACGGG CACAAC CTCAATGGAGTGATG CAACCTGCC TGGAGTAAATGATiSACAC AAGGC^TTGACCCACGCATGTATCTATCTCATTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGC

tctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggttgaaacc^gttccctgaaattattcc c ctac ttgactaataagtatataargacggtaggtattg attg taattctctaaatctgtaaatcta?

TTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGTTAGTCrrrrrriTAGTTrTAA

agaacrr^tttcgaataaacac^cataaacaaacaaaatgatggctcccgatcctaatg

MetMetAlaProAspProAgnA

caaatccaaatgcaaacccaaatgouvacccaaacgcaaacccc^

LaAstiPr OAsnAI aAsnProAsriAlaAsnProAsnAlaAsiiProAsnAlaAsnProAsiiA

CAAACCCCAATGCAAATCCTAA1X;CAAATCCTAATGCCAATCCAAATGCAAATCCAAATG LaAsnProAsnAlaAsnPr OAsnAlaAsnPr o AsxiAlaAsnPr oAsxiAlaAsrlProAstiA

C^AACCCAAACGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATGCCAATCCA

LaAsnPr OAs nAlaAsrvProAsaft.laAsnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnProAsna.

CAAACCXIAAATGCAAACCCAAATGCAAACCCCAATGCAAATCCTAATAAAAAC^ LaAsiiProAs nAlaAsnProAsriAlaAsnProAsnAlaAsnPr OAsnLysAsnAsnGlnG

gtaatggacaaggtcacaatatgccaaatgacccaaaccgaaatgtagatgaaaatgcta

LyAsnGlyGlnGlyHisAsnMetProAsnAspProAsnAspProAsnArgAsnValAspGluAsnAla?

atgccaacaatgctgtaaaaaataataataacgaagaaccaagtgataaík:acatagaac snAlaAsnAsnAlaValLysAsnAsnAsnAsnGluGluProSerAspLysHisUeGluG aataittaaagaaaataaaaaattctatttcaactgaatggtccccatgtagtgtaactt

LnTyrteuLysLysX IeLysABnSe rlleSerThrGluTrpSerProCy-sSerValThrC

GTGGAAATGGTATTX^GTTAGAATAAAGCCTGGCTCTGCrAATAAACCTAAAGACGAAT YsGlyAsnGl yTleGl nVal ArgIleLys ProGlySe rAl aAsnLys ProLysAspGluL

TAGATTATGAAAATGATATTGAAAAAAAAATTTCTAAAATGGAAAAGTGCTCGAGTGTGT euAspTyrGluAsnAsplleGluLysLysIleCysLysMetGluLysCysSerSerVal?

I^AATGIXXSTAAATAGTCGACCTGTGACGAACATGGAíGAACATCACATCAGGATTCCTAG HeAsnValValAsoserArgproValThrAsnMetG IuAsnlleThrSerGlyPheLeuG

GACCCCTGCXCGTt3TTACAGGCGGG3TTTTTCTTGTTG?4.CAAGAATCCTCACA^ LyProLeuLeuVa 1 LeuG InAla G IyPhe Phe LeuLeuTiii-Arg I IeLeuThrI IePxoQ

AGAGTCTAGACTCGTGGrGGACTTCTCTCAA.TTTTCTAGGGG<^TCACCCGTGTGTCTIt3 Ln-SerLeuAepSerTrpTrp ThrEerLeuAsnpheLeuGlyGlySer Pro ValCysLeuG

GCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAAT^^ LyGlnAs nSerGlriSerProThrSerAsnHisSerProThrSerCysProProIleCysP

Cn^TTATCGCTGGATGTXnXTTGCQOTTTTTATÍ^TAT^^

RoGlyTyrArg TrpKe tCy s LeuArgArg PheI lei IePheLeuPhe I IeLeuLeuLeuC

GCCTCATCTTCTTArTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAA YsLeuI IePheLeuLeuVal LeuLeuAspTyrGlnGlyMet LeuPmValCys ProLeu I

ttcc^vggatcaacaacaaccaatacgggaccatgcaaaacctgca^^ LeProGlySerThrThrThrAsnThrslyProCysLysThrCysThrThrProAlaGlnG

GCAACTCTATGTTTCCCTCAKn-TGCr^

LyAsnScrMct PheProSerCysCysCysThrLyB ProThrAspGlyAanCysThrCyBl

TTCC CATCCCATCGTCCTGGG CTT TCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTT I^ProIleProSerSerTrpAla PheAlaLysTryLeuTrpG IuTrpAlaSerValArgP

TCTCTTGGCTCAGTITACTAGTGCC^TTrGTC

HeSerT rpLeuSerLeuLeuValProPheValGlnTrpPheValGlyLeUSerProThrV

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Claims (20)

1. Partícula de proteína imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende os seguintes monômeros: a. uma proteína de fusão que compreende as seqüências derivadas de uma proteína CS de P.vivax e o antígeno S de Hepatite B (CS V- S)e b. uma proteína de fusão que compreende seqüências derivadas de proteína CS de P. falciparum e antígeno S de Hepatite B (RTS) e c. opcionalmente o antígeno S derivado de Hepatite B.

2. Partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o antígeno de Hepatite B é derivado de um sorotipo adw.

3. Partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um ou mais antígenos adicionais derivados de P. falciparium e/ou P. vivax.

4. Partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o componente de p. vivax é um polipeptídeo híbrido selecionado de DBP, PvTRAP, PvMSP2, PvMSP4, PvMSP5, PvMSPó, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PvAMAI e RBP.

5. Partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência de proteína de circunsporozóite como mostrado na SEQ ID N0 13.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma partícula como definida em qualquer uma das reivindicações e um adjuvante.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que compreende: • sais metálicos, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, • emulsões óleo em água, • agonista de receptor semelhante a Toll, (tal como agonista de receptor 2 semelhante a Toll, agonista de receptor 3 semelhante a Toll, agonista de receptor 4 semelhante a Toll, agonista de receptor 7 semelhante a Toll, agonista de receptor 8 semelhante a Toll e agonista de receptor 9 semelhante a Toll), • saponinas, por exemplo, Quil A e seus derivados, tais como QS7 e/ou QS21, • Oligonucleotídeos contendo CpG, · 3D-MPL, • (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-ofosfono-P-D-glucopiranosil]-2-[(R)-3- hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glucopiranosildiidrogenofosfato), • DP (3S, 9 R) -3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4- oxo-5 -aza-9(R)- [(R)-3 -hidroxitetradecanoilamino] decan-1,10-diol, 1,10- bis(diidrogenofosfato) e • MP-Ac DP (3S-,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetra- decanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10- diol, 1 -diidrogenofosfato 10-(6-aminoexanoato), ou combinações dos mesmos.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo que compreende: • uma saponina associada com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio • 3D - MPL , QS21 e um oligonucleotídeo CpG, por exemplo, como um óleo na formulação aquosa, • saponina na forma de uma lipossoma, por exemplo, ainda compreende um esterol tal como QS21 e esterol e • ISCOM,

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 8, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um ou mais antígenos adicionais derivados de P. falciparium e/ou P. vivax em mistura.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição é uma vacina para o uso parental.

11. Partícula de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 10, caracterizada pelo fato de ser para o uso no tratamento.

12. Uso de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 6 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento/prevenção de malária.

13. Método para tratar um paciente suscetível à infecção por plasmódio, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de uma proteína como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 6 a 11, particularmente como uma vacina.

14. Seqüências de DNA de codificação do hospedeiro (vetor/plasmídeo), caracterizadas pelo fato de que são os componentes de uma partícula como definidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, e que o dito plasmídeo do vetor é adequado para inserir o DNA em um hospedeiro para a fabricação da partícula relevante ou o dito plasmídeo é capaz de, sob condições apropriadas, fabricação dos componentes, que montam-se na partícula relevante.

15. Processo para a produção de uma partícula como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o processo compreende expressar uma seqüência de nucleotídeo que codifica quanto às ditas proteínas em um hospedeiro adequado e recuperação do produto.

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é uma levedura.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a levedura é selecionada do grupo que compreende de: Saccharomyces, Schizosaccharomycees, Kluveromyees, Piehia (por exemplo, Piehia pastoria), Hansenula, (por exemplo, Hansenula polymorpha), Yarowia, Schwaniomyees, Schizosaceharomyees, Zygoaeeharomyees, tal como Saccharomyees eerevisiae, S. earlsberoensis, K. Laetis, Yl834 e DC5.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 17, caracterizado pelo fato de que o produto é recuperado pela Iise das células hospedeiras pelo tratamento com uma composição adequada que compreende um tensoativo.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é selecionado do grupo que compreende: Tween (tal como Tween 20), briji, polietileno e glicol.

20. Produto, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 14 a 19.