KR20090087208A

KR20090087208A - 신규 크라이토싸이빈 유도체, 이의 제조방법 및 이를유효성분으로 함유하는 노화방지용 조성물

Info

Publication number: KR20090087208A
Application number: KR1020080012510A
Authority: KR
Inventors: 유익동; 류인자; 김영희; 추수진; 이상구
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-02-12
Filing date: 2008-02-12
Publication date: 2009-08-17
Also published as: KR100991375B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 크라이토싸이빈 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체는 뛰어난 라디칼 소거 활성을 나타내고, 이외에도 DNA 손상 감소효과, 자외선에 의한 홍반 감소효과 등을 나타내므로 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐 아니라 노화 방지에도 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 이용하여 노화방지용 약학적 조성물 또는 기능성 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서 R¹ 및 R²는 명세서에서 정의한 바와 같다.)

깔대기버섯, 항산화, 항노화, DNA 손상억제, 홍반감소, 자외선차단, 기능성화장품

Description

신규 크라이토싸이빈 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 조성물{Novel clitocybin derivates, preparation method thereof and composition containing the same for prevention of aging as an active ingredient}

본 발명은 신규 이소인돌론계 크라이토싸이빈 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장품 조성물에 관한 것이다.

각종 산화반응, 화학약품, 식품, 인체질환 및 방사선 등에 의해 슈퍼옥사이드(superoxide, O₂ ^-), 하이드록실라디칼(hydroxyl radical, ·OH), 및 과산화수소 (H₂O₂) 등과 같은 반응성이 큰 강한 활성산소와 유리 라디칼(free radical) 등이 생체 내에 생성되면 이들에 의해서 불포화 지방산이 다량 함유된 세포막의 지질이 산화되어 세포막에 지질 과산화물이 생성되게 된다. 세포막에 지질과산화물이 축적하면 세포막의 유동성과 기능성이 저하됨으로 세포의 전체적인 기능이 억제되고 세 포의 구조도 변화하는 등 조직상에 국소적인 장해가 생기면서 각종 질환이 유발되게 되는 것이다. 또한 활성산소와 유리라디칼은 세포 구성성분인 핵산, 당 등을 변형 또는 파괴함으로써 암을 비롯하여 알콜성 간염 등의 간장 질환, 뇌혈관 장해로 인한 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 질환 등 각종 인체 질환의 원인이 되고 있다[Arthritis. Res. Ther. 6(6): 265-78 (2004), J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65(7): 631-41 (2006), Trends. Mol. Med. 12(11): 521-8 (2006), Int. J. Biochem. Cell. Biol. 39(1); 44-84 (2007)]. 또한 활성산소는 식품에 다량으로 존재하는 불포화 지방산 등과 반응하여 산패의 원인이 되어 식품의 안전성 및 고품질 유지에 결정적인 결함을 초래하기도 하며 각종 산화물에 의한 동식물의 산화적 스트레스, 미생물 발효시 발생하는 활성산소에 의한 수율저하 등 많은 분야에서 활성산소에 의한 문제가 야기되고 있다.

따라서 강력하면서도 독성이 없는 항산화 활성을 갖는 새로운 물질의 발견은 각종 질병의 치료제 개발이나 노화방지용 화장품첨가제 및 식품첨가제 등으로 매우 유용하게 활용될 것이다.

지금까지 지질과산화 저해제로는 BHT(butylated hydroxy toluene) 및 BHA(butylated hydroxy anisol) 등과 같은 합성 항산화제가 사용되어 왔으나, 이들 BHT나 BHA는 지질과산화 저해활성은 우수하나 암 또는 기형을 유발할 수 있는 가능성이 매우 높아 계속적으로 사용할 수 없는 단점이 있었다. 따라서 천연물로부터 새로운 항산화 활성물질을 창출하여 독성이나 부작용이 전혀 없는 항산화제를 개발하는 것이 필요하다.

한편, 미생물 대사산물로부터 탐색된 항산화 물질은 약 20여 종이 알려져 있으며, 지금까지 보고된 미생물로부터 유래된 항산화 활성물질은 대부분 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서 유래된 것이 대부분이며, 카바졸(carbazole)계 화합물이 가장 많이 보고되었다. 대표적인 화합물들은 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스(Streptomyces exfoliatus) 균체 아세톤 추출물로부터 발견된 카르퀴노스타틴(carquinostatin) 외에도 안티오스타틴(antiostatin), 카라조스타틴(carazostatin), 네오카로조스타틴(neocarozostatin), 카바조마이신(cabazomycin) 등이 보고되었다. 또한 페나진(phenazine)계 항산화 물질로는 벤토시아닌(benthocyanin), 벤토포에닌(benthophoenin), 페나조비리딘(phenazoviridin) 등이 밝혀졌으며 기타 티아졸계 화합물로 티아졸스타틴과 나프테르핀 피롤로스타틴 등이 보고되었다.

국내 지질과산화 저해물질의 탐색연구는 대부분 식품소재를 재료로 하여 항산화 활성의 유무 및 활성정도를 측정하고 식품보호제로서의 이용에 국한되어 있어 활성물질의 추출, 정제 및 구조해석 등의 연구는 매우 미흡한 실정이었다.

1990년대 초 한국생명공학 연구원에서 본격적으로 지질과산화 저해활성물질을 탐색하는 연구가 시작되어 토양방선균 배양액 또는 천연물로부터 지질과산화 저해활성물질을 조사하였으며, 국내 자생버섯으로부터 항산화 활성물질을 개발하면서 그동안 애그로사이브 실린드라세(Agrocybe cylindracea) 버섯으로부터 활성산소 제거 활성을 나타내는 새로운 인돌 알칼로이드 화합물(J. of Natural Products, 60 : 721- 723, 1997), 콩버섯 유래의 신규 항산화성 화합물 및 이를 유효성분으로 함유 하는 항산화조성물(대한민국 특허등록 제0466031호, 2005년), 신규 히스피딘계 활성산소 소거물질 및 그 제조방법(대한민국 특허등록 0320787호, 2002년), 까치버섯(Polyozellus multiplex) 균주로부터 테르페닐계 신규 화합물 폴리오젤린(대한민국 특허등록 0362394, 2002년), 좀주름찻잔버섯 균사체 배양액으로부터 항산화 활성 추출물 및 그의 제조방법(대한민국 특허출원 제2006-96391호, 2006년) 등을 개발한 바 있다.

본 발명자들은 국내 자생 버섯류로부터 계속하여 새롭고도 강력한 항산화 활성물질을 탐색하던 중, 깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP)의 균사체 배양액 추출물로부터 아직 밝혀지지 않은 신규하고 강력한 항산화 활성을 나타내는 이소-인돌론계 화합물을 발견하고 크라이토싸이빈 A(Clitocybin A)라고 명명하였으며, 유기합성 중 크라이토싸이빈 B 및 C를 합성한 후, 이들이 강력한 항산화 활성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규 크라이토싸이빈 유도체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 자외선차단제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장품 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 크라이토싸이빈 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 자외선차단제를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체는 뛰어난 라디칼 소거 활성을 나타내고, 그밖에도 DNA 손상 감소효과, 자외선에 의한 홍반 감소효과 등을 나타내므로 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐 아니라 노화 방지에도 유용하게 이용될 수 있으며, 이를 이용한 노화방지용 약학적 조성물 또는 기능성 화장품 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규 크라이토싸이빈 유도체를 제공한다.

(상기 화학식 1에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 또는 선택적으로 OCH₃ 또는 OH이다.)

상기 화학식 1로 표시되는 신규 크라이토싸이빈 유도체를 보다 구체적으로 예시하면 하기 화학식 1a~1c와 같다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1a의 화합물은 연한 갈색 분말의 성상을 나타내고, 분자식은 C₁₄H₁₁O₄N로 표시되며, 크라이토싸이빈 A 화합물로 명명하였다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1b의 화합물은 연한 노란색 분말의 성상을 나타내고, 분자식은 C₁₅H₁₃O₄N로 표시되며, 크라이토싸이빈 B 화합물로 명명하였다.

나아가, 본 발명에 따른 상기 화학식 1c의 화합물은 흰색 분말의 성상을 나타내고, 분자식은 C₁₆H₁₅O₄N로 표시되며, 크라토싸이빈 C 화합물로 명명하였다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 바람직하게는 깔대기버섯 균주로 부터 추출 및 정제하여 얻을 수 있고, 유기합성을 통하여 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이 트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 상기 화학식 1의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물을 모두 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체는 깔대기버섯 균주로부터 추출 및 정제를 통한 방법과 유기합성에 의한 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법의 일실시형태로는

깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP) 균주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 수득한 배양액을 아세톤 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 추출된 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3에서 얻은 활성분획을 메탄올(100%)을 용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 크라이토싸이빈 유도체를 수득하는 단계(단계 4)를 포함한다.

먼저, 단계 1은 깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP) 균주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계이다.

이때, 상기 배양액은 깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP) 균주를 효모-맥아 추출(Yeast extract, YPS) 액체배지에 배양시켜 수득하는 것이 바람직하다.

다음으로, 단계 2는 상기 단계 1에서 수득한 배양액을 아세톤 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계이다.

상기 단계 1에서 수득한 배양액은 아세톤으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 재추출하는 것이 바람직하다. 추출방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 추출방법을 이용할 수 있으며, 재추출 후 에틸아세테이트층이 다음 단계에 이용된다.

다음으로 단계 3은 상기 단계 2에서 추출된 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 단계이다.

이때 사용되는 클로로포름과 메탄올의 혼합용매의 농도구배는 50:1 ~ 1:1인 것이 바람직하며, 10~15 ㎖/분의 속도로 용리시켜 150분 후에 활성분획을 수득할 수 있다.

다음으로 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 활성분획을 메탄올(100%)을 용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 크라이토싸이빈 유도체를 수득하는 단계이다.

상기 단계 3에서 얻은 활성분획은 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 용리액으로서 메탄올(100%)을 사용하여 1~1.6 ㎖/분의 속도로 용리시켜 140분 후에 밝은 갈색의 신규 크라이토싸이빈 유도체(화학식 1a)를 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법의 다른 일실시형태로는 하기 반응식 1로 표시되는 바와 같이,

유기용매 하에서 화학식 2의 화합물에 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1(화학식 1c)의 화합물을 제조하는 단계(단계 a)를 포함한다.

(상기 반응식 1에서 상기 화학식 1c는 본 발명의 화학식 1에 포함된다.)

또한, 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법의 또 다른 일실시형태로는 하기 반응식 2로 표시되는 바와 같이,

유기용매 하에서 화학식 2의 화합물에 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1c의 화합물을 제조하는 단계(단계 a); 및

상기 단계 a에서 제조된 화학식 4의 화합물에 브롬산과 초산을 가한 후 에틸아세테이트로 추출하여 화학식 1(화학식 1a 및 화학식 1b)의 화합물을 제조하는 단계(단계 b)를 포함한다.

(상기 반응식 2에서 상기 화학식 1a 및 화학식 1b는 본 발명의 화학식 1에 포함된다.)

먼저, 단계 a는 유기용매 하에서 화학식 2의 화합물에 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1c의 화합물을 제조하는 단계이다.

이때 사용되는 유기용매는 메탄올인 것이 바람직하며, 상기 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물의 혼합비율은 1:1 당량인 것이 바람직하다.

다음으로 단계 b는 상기 단계 a에서 제조된 화학식 1c의 화합물에 브롬산과 초산을 가한 후 에틸아세테이트로 추출하여 화학식 1(화학식 1a 및 화학식 1b)의 화합물을 제조하는 단계이다.

구체적으로는 상기 단계 a에서 제조된 화학식 1c의 화합물에 브롬산 수용액과 초산을 넣고 15~20시간 동안 가열환류시킨후, 반응용액을 얼음물에 붓고 에틸아세테이트로 추출한다. 유기층을 물로 세척하고 무수 황산마그네슘을 건조하여 감압농축한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)로 정제하여 화학식 1a 및 화학식 1b의 크라이토싸이빈 유도체를 약 80% 이상 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체를 이용하여 수퍼옥사이드(superoxide), DPPH 및 ABTS⁺를 대상으로 한 라디칼 소거 활성을 조사한 결과, 대조군인 트롤록스, BHA, 페룰린산 또는 카테킨보다 뛰어난 라디칼 소거 활성을 보임을 확인하였다(표 3 참조).

또한, 세포내 DNA 손상 감소 효과 실험에서, 과산화수소 처리시 발생하던 tail DNA의 수가 신규 크라이토싸이빈 유도체를 투여함으로써 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 8 및 표 4 참조).

이를 통해 본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체는 항산화제로서 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체를 이용한 자외선 차단 효과 실험에서, 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체는 자외선 조사에 대하여 홍반감소효과가 우수하다고 알려진 대조군과 유사하게 홍반을 감소시키는 결과를 나타냈다(도 9 참조). 이를 통해 본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체는 자외선차단제로서 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP)에서 분리, 정제한 신규 크라이토싸이빈 유도체는 수퍼옥사이드(superoxide), DPPH 및 ABTS⁺를 대상으로 한 라디칼 소거 활성 측정에서 대조군인 트롤록스, BHA, 페룰린산 또는 카테킨보다 뛰어난 라디칼 소거 활성을 보임을 확인하였다(표 3 참조). 또한, 세포내 DNA 손상 감소 효과 실험에서, 과산화수소 처리시 발생하던 tail DNA의 수가 신규 크라이토싸이빈 유도체를 투여함으로써 유의하게 감소되는 것을 확인하였다(도 8 및 표 4 참조). 과산화수소 등과 같은 반응성이 큰 강한 활성산소와 유리 라디 칼(free radical)은 DNA 등을 손상시키며, 상기 DNA 등의 손상은 노화를 촉진시킨다[Free Radic . Biol . Med . 43: 477-503 (2007)]. 그러므로, 상기 라디칼 소거 활성이 우수하고 DNA 손상이 감소되는 것은 간접적으로 활성산소의 생성이 감소되는 것을 나타낸다.

따라서 본 발명의 약학적 조성물은 활성산소의 생성을 억제함으로써 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 알콜성 간염 등의 간장질환, 뇌혈관 장애로 인한 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 및 암 등[Arthritis . Res . Ther . 6(6): 265-78 (2004), J. Neuropathol . Exp . Neurol. 65(7): 631-41 (2006), Trends . Mol . Med . 12(11): 521-8 (2006), Int . J. Biochem . Cell . Biol . 39(1); 44-84 (2007)] 각종 인체 질환의 예방 및 치료뿐만 아니라 노화방지에도 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 신규 크라이토싸이빈 유도체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 젤라틴 등을 섞어 조용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제 인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수성용제, 형탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

투여량은 환자의 체충, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 유도체의 일일 투여량은 약 0.1 ~ 100 ㎎/kg이고, 바람직하게는 5 ~ 50 ㎎/kg이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 크라이토싸이빈 유도체의 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/kg으로 나타나, 안전한 물질로 판단된다.

본 발명의 조성물은 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐만 아니라 노화방지를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 노화방지용 화장품으로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무 제 등이 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 함유하는 노화방지용 화장품을 제조함에 있어서, 통상적으로 함유되는 피부 외용제 조성물에 본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 1 내지 15 중량부, 바람직하게는 2 또는 10 중량부로 첨가할 수 있다. 본 발명의 피부용 외형제에는 본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 크라이토싸이빈 유도체의 제조 1 ( 깔대기버섯 균주로부터 추출, 분리 및 정제)

깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP) 균주를 효모-맥아 추출 (Yeast extract, YPS) 액체배지 100 ㎖가 들어있는 500 ㎖용 삼각 플라스크에 접종하여 섭씨 27도, rpm 140 회전으로 왕복 진탕배양기에서 5일 동안 배양하였다. 이후, 5 리터 용량의 액침배양조(jar fermentor; Korea Fermentor Co. Ltd사)에 3 리터의 효모-맥아 추출(Yeast extract, YPS) 액체배지를 넣고 멸균한 후 상기 진탕배양된 배양액 100 ㎖를 접종하여 동일한 조건으로 배양하였다. 7일 동안 배양한 후, 70% 아세톤으로 추출하고, 에틸아세테이트로 재추출하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분리하였다.

상기에서 얻은 에틸아세테이트 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매 (50:1 ~ 1:1)를 사용하여 농도구배 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시한 후, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(100% 메탄올)로 순차적으로 분리하여 밝은 갈색의 순수한 화합물(6.5 mg)을 얻었다. 이를 35% 메탄올 용매 조건에서 역상(ODS) 컬럼 크로마토그래피로 분석한 결과 100% 순수하게 추출 정제된 화합물임을 확인하였으며, 이와 같이 하여 얻은 화합물을 크라이토싸이빈 A(Clitocybin A)로 명명하였다.

< 실시예 2> 크라이토싸이빈 유도체의 제조 2 (유기 합성)

(1) 크라이토싸이빈 C 화합물의 제조

메틸 2-퍼밀-3,5-디메톡시벤조에이트(2,24 g, 10.0 mmol)를 메탄올(40 ㎖)에 용해시킨 용액에 4-아미노페놀(1.1 g, 10.0 mmol)을 첨가하고 1시간 동안 교반시켰다. 이후, 0 ℃에서 반응용액에 NaBH4(0.75 g, 20.0 mmol)을 첨가하고 온도를 상 온으로 상승시킨 후 18시간 동안 교반시켰다. 반응용액을 감압농축한 후, 물(50 ㎖)과 소량의 초산을 넣었다. 형성된 침전물을 유리필터로 여과시킨 후, 수득한 고체를 물로 세척하고 건조하여 목적화합물인 크라이토싸이빈 C 화합물(화학식 1c; 2.6 g, 91%)을 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.38 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.62 (s, 1H), 6.82-6.76 (m, 4H), 4.73 (s, 2H), 3.87 (s, 3H);

¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 165.9, 161.4, 154.9, 154.2, 134.7, 131.1, 121.5, 115.2, 102.5, 97.8, 55.7, 55.6, 48.3

(2) 크라이토싸이빈 A 화합물의 제조

상기 (1)에서 제조된 크라이토싸이빈 C 화합물(2.0 g, 7.0 mmol)에 48% 브롬산 수용액(10 ㎖)과 초산(20 ㎖)을 넣고 18시간 동안 가열환류시켰다. 반응용액을 얼음물에 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고 무수 황산마그네슘을 건조하여 감압농축한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)로 정제하여 목적화합물인 크라이토싸이빈 A 화합물(1.5 g, 85%)을 수득하였다.

¹H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.98 (s, 1H), 9.61 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 7.61 (dd, J = 6.6, 1.8 Hz, 2H), 6.79 (dd, J = 6.6, 1.8 Hz, 2H), 6.56 (dd, J = 1.8 Hz, 1H), 6.49 (dd, J = 1.8 Hz, 1H), 4.65 (s, 2H);

¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 166.4, 161.4, 158.9, 154.1, 153.0, 134.9, 131.3, 121.5, 117.8, 115.2, 105.9, 100.1, 48.5

(3) 크라이토싸이빈 B 화합물의 제조

상기 (1)에서 제조된 크라이토싸이빈 C 화합물(2.0 g, 7.0 mmol)에 48% 브롬산 수용액(10 ㎖)과 초산(20 ㎖)을 넣고 18시간 동안 가열환류시켰다. 반응용액을 얼음물에 붓고 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고 무수 황산마그네슘을 건조하여 감압농축한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)로 정제하여 크라이토싸이빈 A 화합물과 함께 목적화합물인 크라이토싸이빈 B 화합물(0.76 g, 40%)을 수득하였다.

¹H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ 9.85 (s, 1H), 9.36 (s, 1H), 7.62 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 6.67 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 4.70 (s, 2H), 3.84 (s, 3H);

¹³C NMR (75MHz, DMSO-d6) δ 166.0, 159.3, 154.9, 154.1, 134.7, 131.2, 121.5, 119.0, 115.2, 102.5, 100.5, 55.4, 48.3.

<구조 분석>

상기 실시예 1 및 2에서 얻은 화합물의 물리화학적 특성을 다음과 같이 측정하였다.

선광도는 편광기(JASCO DIP-370 polarimeter)를 사용하여 측정하였다. 자외선 흡수 스펙트럼은 자외선 분광광도계(Shimadzu UV-260 spectrophotometer, Japan)를 통해 측정하였으며, 적외선 흡수 스펙트럼은 자외선 분광광도계(FT-IR Equinox 55 spectrometer, Burker, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한 HR-ESI-MS 스펙트럼은 질량분석기(JEOL JMS HX-110 mass spectrometer,JEOL, 일본)를 이용하여 측정하여 분자 구조를 결정하였다.

측정 결과를 표 1에 나타내었다.

	크라이토싸이빈 A 화합물	크라이토싸이빈 B 화합물	크라이토싸이빈 B 화합물
화학구조식
성상	연한 갈색 분말	연한노란색	흰색
선광도	[α]D²⁰ - 1.40^o(c= 0.3)	[α]D²⁰ - 1.40^o(c= 0.9)	[α]D²⁰ - 1.40^o(c= 1.0)
화학식	C₁₄H₁₁O₄N	C₁₅H₁₃O₄N	C₁₆H₁₅O₄N
분자량	257	271	285
HR-ESI-MS m/z	실험치: 258.07571(M+H⁺) 계산치: 258.07608	실험치: 272.0923(M+H⁺) 계산치: 272.0923	실험치: 286.1079(M+H⁺) 계산치: 286.1079
자외선 흡수 스펙트럼[UV λ_max nm(in 메탄올)]	211 (1.6), 286 (0.4) cm^-1	211 (1.8), 286 (0.8) cm^-1	211 (1.8), 286 (0.8) cm^-1
적외선 흡수 스펙트럼[R (cm^-1) ]	3399, 2925, 1616, 1516, 1453, 1256, 1144, 1097	3399, 2925, 1616, 1516, 1453, 1256, 1144, 1097	3399, 2925, 1616, 1516, 1453, 1256, 1144, 1097
가용성	MeOH, DMSO	EtOAc, DMSO	EtOAc, DMSO
불용성	헥산, 물	헥산, 물	헥산, 물

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 A 화합물은 연한 갈색 분말로 얻어졌으며, 고분해능 ESI-MS 분석결과 (M+H⁺)의 값은 258.07571 m/z로 계산치인 258.07608 m/z로 거의 유사하였으며, 그 결과 분자식은 C₁₄H₁₁O₄N로 결정하였다. UV 스펙트럼을 측정한 결과 211 nm와 286 nm에서 최대흡수파장을 나타내었으며, IR 스펙트럼을 측정한 결과 3399 cm^-1에서 하이드록시기에 기인하는 띠(band)가 관찰되었다. 이에 따라 크라이토싸이빈 A 화합물은 신규 이소-인돌론계 화합물로 동정하였다.

본 발명에 따른 크라이토싸이빈 B 화합물은 연한 노란색 분말로 얻어졌으며, 고분해능 ESI-MS 분석결과 (M+H⁺)의 값은 272.0923 m/z로 계산치인 272.0923 m/z와 일치하였으며, 그 결과 분자식은 C₁₅H₁₃O₄N로 결정하였다. UV 스펙트럼을 측정한 결과 211 nm와 286 nm에서 최대흡수파장을 나타내었으며, IR 스펙트럼을 측정한 결과 3399 cm^-1에서 하이드록시기에 기인하는 띠(band)가 관찰되었다. 이에 따라 크라이토싸이빈 B 화합물은 신규 이소-인돌론계 화합물로 동정하였다.

본 발명에 따른 크라이토싸이빈 C 화합물은 연한 노란색 분말로 얻어졌으며, 고분해능 ESI-MS 분석결과 (M+H⁺)의 값은 286.1079 m/z로 계산치인 286.1079 m/z와 일치하였으며, 그 결과 분자식은 C₁₆H₁₅O₄N로 결정하였다. UV 스펙트럼을 측정한 결과 211 nm와 286 nm에서 최대흡수파장을 나타내었으며, IR 스펙트럼을 측정한 결과 3399 cm^-1에서 하이드록시기에 기인하는 띠(band)가 관찰되었다. 이에 따라 크라이토싸이빈 C 화합물은 신규 이소-인돌론계 화합물로 동정하였다.

또한, 핵자기공명(NMR) 분석(Burker AMX 300, Burker, USA)을 통하여 상기 z크라이토싸이빈 A~C 화합물의 ¹H 및 ¹³C NMR, HMQC((1H-detected heteronuclear Multiplie-Quantum Coherence), HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Cohence) 스펙트럼을 얻었다. 상기 스펙트럼은 도 1~7 및 표 2에 나타내었다.

탄소번호 (position)	크라이토싸이빈 A 화합물		크라이토싸이빈 B 화합물		크라이토싸이빈 C 화합물
탄소번호 (position)	δC (ppm)	δH (ppm)	δC (ppm)	δH (ppm)	δC (ppm)	δH (ppm)
1	155		154.1		154.2
2	108	6.50(d, J=1.8 Hz)	102.5	6.63(d, J=1.8 Hz)	102.5	6.63(d, J=1.8Hz)
3	162		159.3		161.4
4	102	6.71(d, J=1.8 Hz)	102.5	6.67(d, J=1.8 Hz)	97.8	6.99(d, J=1.8Hz)
5	120		119.0		121.1
6	136		134.7		134.7
7	172		166.0		165.9
8	50	4.71(s)	48.3	4.70(s)	48.3	4.68(s)
9	133		131.2		131.1
10,14	124	7.54(d, J=9.0 Hz)	121.5	7.62(d, J=9.3 Hz)	121.5	7.68(d, J=9.0 Hz)
11,13	117	6.84(d, J=9.0 Hz)	119.0	6.78(d, J=9.3 Hz)	115.2	6.89(d, J=9.0 Hz)
12	157		154.9		154.9
15			55.4	3.84(s)	55.6	3.83(s)
16					55.7	3.87(s)
표준물질: TMS ¹H NMR : 600 MHz ¹³C NMR : 150 MHz

도 1은 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 A 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼이고, 도 2는 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 A 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼이며, 도 3은 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 A 화합물의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다.

도 4는 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 B 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼이고, 도 5는 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 B 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 6은 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 C 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼이고, 도 7는 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 C 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 1~7 및 표 2에 나타낸 바와 같이, ¹H-NMR에서는 방향족 고리(aromatic ring)에 결합된 수소 피크(proton peak)가 δ6.50(1H), δ6.71(1H), δ6.84(2H), δ7.54(2H)가 관찰되었고, δ4.71(2H)의 화학적 이동(chemical shift)으로 질소와 결합하고 있는 것을 알 수 있다. 또한 ¹³C-NMR 및 HMQC 분석결과 δ155(C1), δ162(C3) and δ157(C12)의 하이드록시기 탄소(hydroxy carbon)의 존재를 확인할 수 있었고, δ50(C8) 탄소와 δ172(C7)의 카보닐 탄소(carbonyl carbon)를 확인할 수 있었으며, δ120(C5), δ136(C6), δ133(C9)에서 세 개의 sp 사급탄소, δ124(C10, C14), δ117(C11, C13)에서 메틴 탄소(methine carbon)가 관측되었다. HMBC 스펙트럼에서도 아래와 같이 δ4.71, δ6.50, δ6.71, δ6.84와 δ7.54에서 장거리 상관화(long range correlation)가 관찰되었다.

< 실험예 1> 신규 크라이토싸이빈 유도체의 라디칼 소거 활성 측정

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 라디칼 소거 활성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

(1) 2,2- 아지노 - 비스-3 - 에틸벤조씨알로진썰폰산 ( ABTS ⁺ ) 라디칼 소거 활성 측정

7 mM ABTS 수용액을 2.45 mM 포타슘퍼설페이트(potassium persulfate)와 혼합하여 ABTS⁺ 라디칼을 생성시킨 후 이를 734 nm에서 약 0.7의 흡광도를 갖도록 희석하여 ABTS⁺ 라디킬 수용액을 만들었다. 이후, 상기 제조된 ABTS⁺라디칼 수용액 190 ㎕에 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체(크라이토싸이빈 A, B, C 화합물), 비교군으로서 트롤록스(trolox), BHA 등의 시료를 DMSO에 녹인 용액 10 ㎕를 혼합한 후 7분 동안 방치한 다음 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. 다음으로 상기 ABTS⁺라디칼 수용액에 시료를 넣지 않고 DMSO만을 넣은 대조군의 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도를 이용하여 하기 수학식 1에 따라 ABTS⁺ 라디칼 소거 활성을 계산하였다.

(2) 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(DPPH) 라디칼 소거 활성 측정

에탄올에 녹인 150 μM의 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl ; DPPH) 용액 90 ㎕에 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체(크라이토싸이빈 A, B, C 화합물), 비교군으로서 트롤록스(trolox), BHA 등의 시료를 DMSO에 녹인 용액 10 ㎕를 혼합한 후 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 다음으로 상기 DPPH 라디칼 용액에 시료를 넣지 않고 DMSO만을 넣은 대조군의 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도를 이용하여 하기 수학식 2에 따라 DPPH 라디칼 소거 활성을 계산하였다.

(3) 수퍼옥사이드(superoxide) 라디칼 소거 활성 측정

96-웰 플레이트의 각 웰당 50 mM 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate buffer, pH 7.8), 1 mM EDTA, 0.04 mM 니트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium; NBT), 0.18 mM 크산틴(xanthine), 250 mU/㎖ 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 및 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체(크라이토싸이빈 A, B, C 화합물) 등의 시료를 DMSO에 녹인 시료 용액을 첨가하여 총 100 중량%가 되도록 하여 30분 동안 37℃의 암실에서 반응시켰다. 크산틴 산화효소는 크산틴을 요산과 수퍼옥사이드로 산화를 촉진시키고, 수퍼옥사이드는 NBT를 환원시켜 청색 포르마잔(blue formazan)을 형성한다. NBT의 환원으로 형성된 청색 포르마잔을 ELISA를 통해 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 넣지 않고 DMSO만 첨가해 확인하였으며, 비교군으로 페룰린산(ferulic acid) 또는 카테킨(cathechin)을 사용하였다. 소거 활성은 대조군 및 시험 시료의 흡광도 차를 이용하여 하기 수학식 2에 따라 계산되었다. 상기 실험은 3회 수행되었으며, 흡광도 변화는 평균을 내어 결정하였다.

라디칼 소거 활성(%)=(ΔA_대조군/ΔA_시료-1)× 100

라디칼 소거 활성(%)=(1-ΔA_시료/ΔA_대조군)× 100

(수학식 1 또는 2에서,

ΔA_시료 : 시험 화합물을 포함하는 웰의 흡광도 변화.

ΔA_대조군: 시험 화합물을 대신하여 DMSO가 포함된 웰의 흡광도 변화를 나타낸다.)

상기 라디칼 소거 활성 측정 결과를 표 3에 나타내었다. 상기 결과는 라디칼을 50% 소거하는 농도(EC₅₀)로 나타내었다.

시료	라디칼 소거 활성 (EC₅₀ ± SD (μM))
시료	ABTS⁺	DPPH	수퍼옥사이드
신규 크라이토싸이빈 A 화합물	6.45 ± 0.32	＞ 100	10.3 ± 0.43
신규 크라이토싸이빈 B 화합물	9.63 ± 0.22	＞ 100	5.98 ± 0.33
신규 크라이토싸이빈 C 화합물	94.91 ± 5.52	＞ 100	3.61 ± 0.38
트롤록스	14.54 ± 0.08	37.61 ± 1.68
BHA	11.70 ± 0.26	97.09 ± 05.52
페룰린산			150.22 ± 6.55
카테킨			47.61 ± 1.68

표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 크라이토싸이빈 유도체의 라디칼 소거 활성은 ABTS⁺ 라디칼 및 수퍼옥사이드 라디칼에서 신규 크라이토싸이빈 A 화합물인 경우, 각각 6.45±0.32 μM, 10.3±0.43μM, 신규 크라이토싸이빈 B 화합물인 경우 각각 9.63 ± 0.22 μM, 5.98 ± 0.33 μM를 나타냄으로써 라디칼 소거 활성이 뛰어나다고 알려진 비교군(트롤록스, BHA,페룰린산, 카테킨 등) 보다 라디칼 소거 활성이 월등히 우수함을 알 수 있다. 신규 크라이토싸이빈 C 화합물도 수퍼옥사이드 라디칼에서 3.61 ± 0.38 μM를 나타냄으로써 비교군보다 라디칼 소거 활성이 뛰어남을 알 수 있다. DPPH 라디칼에 있어서는 BHA와 동등한 정도를 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따른 신규한 크라이토싸이빈 유도체는 뛰어난 라디칼 소거 활성을 나타내므로 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료뿐 아니라 노화 방지에도 유용하게 이용될 수 있다.

<실험예 2> 신규 크라이토싸이빈 유도체의 세포내 DNA 손상 감소 효과

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 세포내 DNA 손상 감소 효과를 알아보기 위하여 전은재 등에 의해 보고된 혜성분석법(comet assay)(한국영양학회지 37(6) : 440-447, 2004년도)을 이용하였다.

건강한 성인 여자의 혈액으로부터 채취한 인체 임파구 세포에 대조군으로서 아무 처리를 하지 않거나, 100 μM의 신규 크라이토싸이빈 유도체(크라이토싸이빈 A, B, C 화합물), 과산화수소(H₂O₂) 또는 신규 크라이토싸이빈 유도체 + 과산화수소를 가하여 반응시켜 생성된 tail DNA량을 측정하여 DNA 손상 정도를 조사하였으며 동시에 형광현미경(Leica DMLB, Germany)을 이용하여 이미지 분석을 실시하였다.

상기 tail DNA의 생성량이 증가할수록 DNA 손상이 증가함을 나타낸다.

측정 결과를 도 8 및 표 4에 나타내었다.

도 8에서 (a)는 대조군이고, (b)는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 A 화합물 처리군이고, (c)는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 B 화합물 처리군이고, (d)는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 C 화합물 처리군이고, (e)는 과산화수소 처리군이고, (f)는 신규 크라이토싸이빈 A 화합물+과산화수소 처리군이고, (g)는 신규 크라이토싸이빈 B 화합물+과산화수소 처리군이며, (h)는 신규 크라이토싸이빈 C 화합물+과산화수소 처리군이다.

	tail DNA
	평균	표준편차	오차
대조군	5.72	5.10	0.72
신규 크라이토싸이빈 A 화합물	7.01	5.29	0.75
신규 크라이토싸이빈 B 화합물	6.49	5.68	0.80
신규 크라이토싸이빈 C 화합물	5.09	4.18	0.59
과산화수소	61.11	17.26	2.44
신규 크라이토싸이빈 A 화합물 + 과산화수소	35.39	15.92	2.25
신규 크라이토싸이빈 B 화합물 + 과산화수소	38.34	18.00	2.55
신규 크라이토싸이빈 C 화합물 + 과산화수소	32.32	15.59	2.25

표 4에 나타낸 바와 같이, 과산화수소를 처리하면 평균 61.11의 tail DNA가 생성되나 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 유도체를 함께 처리하면 생성되는 tail DNA는 32.32~38.34로 약 40%의 tail DNA의 손상을 억제함을 알 수 있다.

또한, 혜성 분석 이미지 사진을 촬영한 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 과산화수소(H₂O₂)를 처리하면 많은 tail DNA에 의한 꼬리가 형성되는데(e), 크라이토싸이빈 유도체를 처리함으로서 육안으로 관찰이 가능할 정도로 tail DNA의 꼬리가 감소하는 것으로 관찰되었다(f~h).

따라서, 본 발명에 따른 크라이토싸이빈 유도체는 과산화수소와 같은 반응성이 큰 강한 활성산소에 의한 DNA 손상을 약 40% 감소시켜 노화촉진을 감소시키므로 노화방지용 화장품 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

<실험예 3> 신규 크라이토싸이빈 유도체의 자외선 차단 효과

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 광 조사에 의한 자외선 차단 효과를 알아보기 위하여 기니피그 결절홍반 모델(Guinea Pig Erythema model)을 사용하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

즉, 알비노 기니피그를 제모한 후 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체(크라이토싸이빈 A, B, C 화합물)를 자외선 조사 4일전, 2일전, 2시간전, 자외선 조사 직후에 도포한 후, 자외선에 의한 홍반 감소효과를 조사하였다. 자외선 처리량은 2MED - 400 MJ/cm² 조건으로 조사하였다. 대조군으로는 종래 알려진 항산화 활성물질인 PG/EtOH/DIW 혼합용액(PG : EtOH : DIW = 5 : 3 : 2)을 처리하였다.

홍반 측정은 육안관찰, 사진, 크로마미터(chromameter), 조직염색상으로 관찰하였으며, 하기 수학식 3에 따라 홍반감소정도를 산출하였다.

홍반감소정도(AU) = [(A대조군 -A물질처리군)/A대조군]

* A는 크로마미터 값(chromameter value)이다.

측정결과를 도 9에 나타내었다.

도 9는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체(a~c) 및 홍반감소효과가 우수하다고 알려진 대조군(d)의 홍반감소정도를 나타내는 그래프이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체는 자외선 조사에 대하여 홍반감소효과가 우수하다고 알려진 대조군과 유사하게 홍반을 감소시키는 결과를 나타냈다. 또한, H&E 조직염색으로 관찰한 조직학적 변화에서도 별다른 차이를 보이지 않았다(미도시).

따라서 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체는 광 조사에 의한 자외선 차단 효과가 뛰어나므로 기능성 화장품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

<실험예 4> 신규 크라이토싸이빈 유도체의 급성 독성실험

본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체의 급성 독성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 급성독성실험을 수행하였다.

실험동물로 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하였으며, 군당 5마 리씩 나누었다. 상기 실시예에서 제조한 신규 크라이토싸이빈 유도체를 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 1 g/㎏/15 ㎖의 용량으로 단회 경구투여 하였다.

시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

실험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상은 없었고 폐사된 동물도 없었으며, 또한 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 1,000 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

1. 정제의 제조

본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 정제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예의 화합물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 얻었다.

상기 정제의 구성성분은 하기와 같다.

신규 크라이토싸이빈 유도체 5.0 ㎎

락토오스 BP 150.0 ㎎

전분 BP 30.0 ㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎

스테아르산 마그네슘 1.0 ㎎

2. 캡슐제의 제조

본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 캡슐제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

상기 실시예의 화합물을 일정량의 부형제 및 스테아르산마그네슘과 혼합하였다. 얻어진 혼합물을 젤라틴 캡슐 중에 충전하여 캡슐을 수득하였다.

상기 캡슐제의 구성성분은 하기와 같다.

신규 크라이토싸이빈 유도체 5.0 ㎎

전분 1500 100.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎

3. 주사액제의 제조

본 발명의 신규 크라이토싸이빈 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 유 효성분으로 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 상기 신규 크라이토싸이빈 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 이어서 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 이어서 120℃로 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 얻었다.

상기 주사액제의 구성성분은 하기와 같다.

신규 크라이토싸이빈 유도체 100 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

<제제예 2> 피부 외용제의 제조

1. 크림의 제조

세토스테아릴알코올 2.8 중량부

밀난 2.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 2 중량부

피이지-100 스테아레이트 1 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 1.4 중량부

호호바오일 4 중량부

스쿠알란 3.8 중량부

폴리소르베이트 60 1.1 중량부

마카다이아오일 2 중량부

초산토코페롤 0.2 중량부

메칠폴리실록산 0.4 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

Euxyl K-400 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 7 중량부

메칠파라벤 0.05 중량부

글리세린 6 중량부

d-판데놀 0.2 중량부

신규 크라이토싸이빈 유도체 4.6 중량부

트리에탄올아민 0.2 중량부

pt 41891 0.2 중량부

p-H₂O 46.05 중량부

2. 로션의 제조

세토스테아릴알코올 1.6 중량부

스테아린산 1.4 중량부

친유형모노스테아린산글리세린 1.8 중량부

피이지-100 스테아레이트 2.6 중량부

세스퀴올레인산소르비탈 0.6 중량부

스쿠알렌 4.8 중량부

마카다이아오일 2 중량부

호호바오일 2 중량부

초산토코페롤 0.4 중량부

메칠폴리실록산 0.2 중량부

에칠파라벤 0.1 중량부

프로필파라벤 0.1 중량부

1,3-부칠렌글리콜 4 중량부

메칠파라벤 0.1 중량부

산탄검 0.1 중량부

글리세린 4 중량부

d-판데놀 0.15 중량부

알란토인 0.1 중량부

신규 크라이토싸이빈 유도체 3.5 중량부

카르보내(2% aq. Sol) 4 중량부

트리에탄올아민 0.15 중량부

에탄올 3 중량부

pt 41891 0.1 중량부

p-H₂0 48.3 중량부

도 1은 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 A 화합물을 나타내는 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 A 화합물을 나타내는 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 A 화합물을 나타내는 HMBC 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 B 화합물을 나타내는 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 B 화합물을 나타내는 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 C 화합물을 나타내는 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 7은 본 발명에 따른 신규 크라이토싸이빈 C 화합물을 나타내는 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체과 과산화수소 처리시 DNA 손상 정도를 나타내는 혜성 분석 이미지 사진이다((a) 대조군; (b) 신규 크라이토싸이빈 A 화합물 처리군; (c) 신규 크라이토싸이빈 B 화합물 처리군; (d) 신규 크라이토싸이빈 C 화합물 처리군; (e) 과산화수소 처리군; (f) 신규 크라이토싸이빈 A 화합물 + 과산화수소 처리군; (g) 신규 크라이토싸이빈 B 화합물 + 과산화수소 처리군; 및 (h) 신규 크라이토싸이빈 C 화합물 + 과산화수소 처리군).

도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 신규 크라이토싸이빈 유도체 처리시 홍반감소정도를 나타내는 그래프이다((a) 신규 크라이토싸이빈 A 화합물 처리군; (b) 신규 크라이토싸이빈 B 화합물 처리군; (c) 신규 크라이토싸이빈 C 화합물 처리군; 및 (d) 대조군).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 신규 크라이토싸이빈 유도체:

[화학식 1]

.

(상기 화학식 1에서, R¹ 및 R²는 독립적으로 또는 선택적으로 OCH₃ 또는 OH이다.)
제1항에 있어서, 상기 크라이토싸이빈 유도체는 하기 화학식 1a, 화학식 1b 또는 화학식 1c로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 신규 크라이토싸이빈 유도체:

[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

.
깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP) 균주를 배양하여 배양액을 수득하는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 수득한 배양액을 아세톤 및 에틸아세테이트로 추출하는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 추출된 추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획을 수득하는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3에서 얻은 활성분획을 메탄올(100%)을 용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 화합물을 수득하는 단계(단계 4)를 포함하는 제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 1은 깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca KCTC 11143BP) 균주를 효모-맥아 추출(Yeast extract, YPS) 액체배지에 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 단계 3의 클로로포름과 메탄올의 혼합용매의 농도구배는 50:1 ~ 1:1인 것을 특징으로 하는 제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법.
하기 반응식 1로 표시되는 바와 같이,

용매 하에서 화학식 2의 화합물에 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계(단계 a)를 포함하는 제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법:

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서 상기 화학식 1c는 본 발명의 화학식 1에 포함된다.)
하기 반응식 2로 표시되는 바와 같이,

용매 하에서 화학식 2의 화합물에 화학식 3의 화합물을 반응시켜 화학식 1c의 화합물을 제조하는 단계(단계 a); 및

상기 단계 a에서 제조된 화학식 1c의 화합물에 브롬산과 초산을 가한 후 에틸아세테이트로 추출하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계(단계 b)를 포함하는 제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법:

[반응식 2]

.

(상기 반응식 2에서 상기 화학식 1a 및 화학식 1b는 본 발명의 화학식 1에 포함된다.)
제6항 또는 제7항에 있어서, 단계 a의 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체의 제조방법.
제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 항산화제.
제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 자외선차단 제.
제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 활성산소가 과량으로 축적되어 발병되는 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제11항에 있어서, 상기 활성산소가 과량으로 축적되어 발병하는 질환은 간장 질환, 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 또는 암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 약학적 조성물.
제1항의 신규 크라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장품 조성물.