KR101558526B1 - 붉은싸리버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물 - Google Patents

붉은싸리버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물 또는 이의 분획물, 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B는 피부의 진피조직 속에 있으면서 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 인간 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현을 억제하는 효과가 우수하여 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있고, 세포 독성이 없이 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

붉은싸리버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물{The composition comprising the extracts of Ramaria formosa(Fr.) Quel for prevention of anti-aging as an active ingredient}
본 발명은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부 노화는 나이가 들어감에 따라 자연히 발생하는 자연노화(intrinsic aging, 내인성 노화)와 주위 환경, 특히 자외선에 의한 광노화(photoaging)로 나눌 수 있다. 광노화는 오랫동안 햇빛에 노출된 얼굴, 손등, 목 뒤 등의 피부에서 관찰되는 노화현상을 말하는 것으로 내인성 노화 현상과 자외선에 의한 영향이 합쳐진 결과로 발생한다. 자연노화와 광노화 사이에는 주름이 생성되는 기전이 세부적으로 차이는 있으나, 표피 세포의 증식이나 신진대사가 저하되며, 표피-진피 사이의 결합이 약해 조그만 자극에도 손상을 입기 쉽고, 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐 분해 효소인 MMPs(Matrix Metalloproteinases)의 과다한 발현 증가 등의 생리적 변화들이 나타나 피부가 건조해지며 표피, 진피층의 구조적인 차이로 인해 탄력성을 잃어버리고, 점차 주름이 깊어지게 되는 것이다.
주름생성의 주요한 원인으로 나이가 들면서 체세포의 분열능력이 떨어지고 세포 수가 감소하는 노화와 반응성이 높은 활성산소가 세포의 주요 구성물질을 파괴하면서 세포의 기능을 저하시켜 진행되는 노화, 및 장기간 자외선에 노출된 피부에서 피부 속의 교원질(콜라겐)과 탄력섬유(엘라스틴) 등의 기질 단백질이 손상되어 피부 내 교원질의 양이 부족해지고 탄력섬유의 변형을 유발하는 피부 노화가 있다.
피부 노화의 임상적 특징으로는 여러 가지가 있는데, 그 중, 사람의 피부는 나이가 들어감에 따라 점차 탄력을 상실하게 되는데 어릴 때의 탄력섬유(oxytalane fiber)는 수직으로 구성되어 있다가 나이가 들어감에 따라 차츰 분해되고 없어지면서 수평으로 배열된 탄력섬유(elastic fiber)가 증가한다. 이러한 탄력섬유의 구성성분 변화가 노화된 피부에서 탄력성 상실의 큰 요인으로 작용하는 것으로 보고된바 있다(손의동 외, NICE, 25(2), 133~138, 2007).
피부주름 개선에는 콜라겐(collagen)뿐만 아니라 탄력섬유인 엘라스틴(elastin) 등도 기여하는 것으로 보고되고 있다. 더 나아가 자외선에 의하여 사람의 피부에서 광노화 현상이 나타나며 자외선 조사 후 엘라스타제(elastase)의 활성이 증가하기 때문에 엘라스타제의 활성증가는 자외선에 의한 피부 탄성도의 감소 및 주름 생성의 주요원인으로 판단되어 다양한 연구가 진행되고 있다.
콜라겐 생성의 증가가 피부주름 개선에 주된 요소임은 분명하나 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴 등도 주름 개선에 크게 기여하고 있다고 보고되고 있어, 콜라겐의 생성 증가효과나 분해 억제효과만을 기능성 화장품의 유효성 평가방법으로 사용하는 데에는 무리가 있으며, 새로운 평가기준의 개발이 시급한 실정이며, 세계적으로 콜라겐뿐만이 아니라 엘라스틴의 생성과 분해에 대한 관심이 고조되고 있으므로 엘라스틴 및 관련효소를 이용한 주름개선 후보물질의 탐색은 주름개선 기능성 화장품뿐만 아니라 주름치료용 의약품을 개발하는데 기여할 것으로 예상된다.
한편, 싸리버섯은 담자균류의 일종인 민주름버섯목(Aphyllophorales), 싸리버섯과(Ramariaceae) 싸리버섯속(Ramaria)에 속하는 버섯으로 국내에서는 붉은싸리버섯을 포함하여 총 7종이 보고되어 있으며 그 중 붉은싸리버섯은 제일 대형버섯으로 전국에서 자생하고 있어 확보하기가 쉬운 버섯으로 알려져 있다.
붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)은 주로 가을에 활엽수림내 땅위에서 군생 또는 단생하며, 주로 동아시아, 유럽, 북미 그리고 우리나라의 산야에 널리 분포하고 있다. 산호 모양으로 가지가 갈라져 있는 모양이 싸리의 빗자루와 비슷하기 때문에 싸리버섯이라는 이름이 붙여졌다. 또 가지 끝이 쥐의 다리와 아주 흡사하기 때문에 쥐 버섯 및 쥐 다리라고도 불리고 있다. 붉은싸리버섯은 높이가 5~20cm, 너비 10~20cm 정도이고, 싸리버섯보다 크고, 산호형이며, 버섯 전체가 적등색 또는 연한 홍색이고, 분지 끝은 황색이다. 대의 지하부는 백색 또는 연한 갈색을 띤다. 표면색인 붉은색은 성장하면서 다소 퇴색하여 연한 회황색을 띤다. 상처가 생기면 갈색으로 변한다. 포자문은 황갈색이며, 포자모양은 긴 타원형이다.
붉은싸리버섯(Ramaria fomosa)은 한방에서는 성미귀경(性味歸經)하여 맛이 평하고 달다고 알려져 있으며 여러 가지 생물활성이 알려져 있다. 예를 들면, 항종양작용(Yoo et. al., 1983), 면역조절작용(Oh et. al., 2001), 기타 항 돌연변이작용, 간 손상보호작용 효과 등이 개시되어 있다. 그러나, 붉은싸리버섯의 피부 노화 예방의 관련성에 대한 문헌은 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 피부 노화 예방 활성을 가진 물질을 연구하던 중, 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물 또는 이의 분획물, 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B가 인간 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현을 효과적으로 억제하는 효과가 있고, 세포 독성이 없이 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112015029348332-pat00001
.
또한, 본 발명은
1) 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)을 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 수득한 분획물에 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1로 기재되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물 또는 이의 분획물, 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B는 피부의 진피조직 속에 있으면서 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 인간 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현을 억제하는 효과가 우수하여 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있고, 세포 독성이 없이 우수한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 구조를 나타낸 도이다:
1: 라마린 A; 및
2: 라마린 B.
도 2는 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 사람 호중구 엘라스테아제(HNE) 활성 억제 효과를 확인한 도이다:
EGCG: 양성 대조군;
Comp1: 라마린 A; 및
Comp2: 라마린 B.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명에 있어서 "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 붉은싸리버섯은 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 붉은싸리버섯은 자실체 전체를 이용할 수 있고, 붉은싸리버섯 균사체를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 붉은싸리버섯은 생육단계 중 모든 시기가 사용 가능하다.
상기 추출물은 붉은싸리버섯을 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것이 바람직하며, 메탄올 또는 에탄올로 추출하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 추출 용매의 양은 붉은싸리버섯 중량의 2 내지 30배인 것이 바람직하고, 5 내지 20배로 하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 붉은싸리버섯 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 침지 추출, 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당 업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 붉은싸리버섯 추출물의 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출물은 초음파 추출 방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출 시 온도는 10 ℃ 내지 100 ℃인 것이 바람직하며 상온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1시간 내지 24시간인 것이 바람직하고, 3시간 내지 7일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
추출된 붉은싸리버섯 추출물은 감압 농축하는 것이 바람직하며, 이때, 상기 감압 농축은 진공회전증발농축기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조, 상온건조 또는 동결건조를 필요에 따라 적절하게 이용할 수 있다.
구체적으로, 상기 붉은싸리버섯 추출물은 붉은싸리버섯을 건조하고, 세절하여 각각 추출용기에 넣고, 에탄올(EtOH)을 첨가하여 실온에서 3일 동안 추출한 후 추출액을 얻는다. 붉은싸리버섯 추출물의 추출 효율을 높이기 위하여 상기 과정을 수회 반복 수행할 수 있다. 이후, 상기 추출액을 일정 시간 동안 방치한 다음 거름종이 등으로 여과하여 본 발명의 붉은싸리버섯 추출물을 제조할 수 있다.
상기 방법으로 얻은 추출물들은 진공회전증발 농축기(EYELA, Japan.)를 이용하여 감압 농축하는 단계를 추가적으로 수행할 수 있다.
상기 분획물은 붉은싸리버섯 추출물을 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용하여 수득된 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 피부 노화는 피부 위축, 콜라겐 손실, 탄성 섬유 손실, 결합 조직 손실, 셀룰라이트 또는 주름 형성인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 붉은싸리버섯 추출물(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 및 이의 분획물을 제조하고, 이로부터 신규한 화합물인 라마린 A 및 B를 분리 및 정제한 후, 이의 구조를 확인하였고(도 1 참조), 피부의 진피 조직 속에 존재하면서 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 사람 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현 억제능을 확인한 결과, 붉은 싸리버섯 메탄올 추출물을 1, 3, 10 및 30 ㎍/㎖의 낮은 농도로 처리하였을 때, 22, 30, 40 및 42%로 사람 호중구 엘라스테아제(HNE) 활성이 억제되는 것을 확인하였으며, 신규한 화합물인 라마린 A 및 B의 사람 호중구 엘라스테아제(HNE)의 활성 억제능을 확인한 결과, 농도 의존적으로 사람 호중구 엘라스테아제(HNE) 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH 방법을 통해 프리 라디칼 소거 활성을 확인한 결과, 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 프리 라디칼 소거 활성이 뛰어난 것을 확인하였고(표 2 참조), SOD 유사 활성을 확인한 결과, 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 SOD 유사 활성이 뛰어난 것을 확인하였으며(표 3 참조), 이러한 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B이 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(표 4 참조).
따라서, 본 발명의 붉은싸리버섯 추출물 또는 이의 분획물은 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 사람 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현 억제 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있고, 세포 독성이 없이 우수한 항산화 활성을 나타내므로, 피부 노화, 예를 들면, 피부 위축, 콜라겐 손실, 탄성 섬유 손실, 결합 조직 손실, 셀룰라이트, 주름 형성 등의 예방 또는 개선을 목적으로 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패치 또는 분무제 등을 포함하나 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제조함에 있어서, 통상적으로 함유되는 피부 외용제 조성물에 본 발명의 붉은싸리버섯 추출물 또는 이의 분획물을 1 내지 15 중량부, 바람직하게는 2 또는 10 중량부로 첨가할 수 있다. 상기 피부 외용제 조성물에는 본 발명의 붉은싸리버섯 추출물 또는 이의 분획물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부 외용제 조성물에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure 112015029348332-pat00002
상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 독립적으로 -H, -OH, 직쇄 또는 측쇄 C1-20 알킬이고,
R3는 독립적으로 직쇄 또는 측쇄 C1 -20 알킬, 또는 직쇄 또는 측쇄 C1 -20 하이드록시 알킬이다.
상기 화합물은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)으로부터 분리된 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
1) 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)을 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 수득한 분획물에 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 1로 기재되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 상기 제조방법을 단계별로 설명한다.
먼저, 단계 1)은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)을 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 붉은싸리버섯은 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 상기 C1 내지 C2의 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출 용매의 양은 붉은싸리버섯 건조 중량의 1 내지 50 배인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 방법은 열수추출, 침지추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출시 온도는 10℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하며 상온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1일 내지 14일인 것이 바람직하고, 7일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 붉은싸리버섯 추출물을 제조하는 방법은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 수득한 추출액의 농축은 감압농축의 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 단계 2)는 단계 1)에서 수득한 추출물로부터 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 유기용매는 노르말-헥산, 에틸아세테이트 또는 노르말-부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 분획물은 붉은싸리버섯 추출물을 물에 현탁시킨 후, 노르말-헥산, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 분획물은 상기 붉은싸리버섯 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 단계 3)은 단계 2)에서 수득한 분획물에 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피 및 고압액체 크로마토그래피(HPLC:High performance liquid chromatography)를 순차적으로 수행하여 상기 화학식 1의 신규한 화합물을 수득하는 단계이다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 농도구배 실리카겔 컬럼 크로마트그래피 및 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피는 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매를 사용하여 수행되며 고압액체 크로마토그래피(HPLC:High performance liquid chromatography)는 메탄올과 물 혼합용매를 사용하여 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매의 농도 구배는 100:1 ~ 1:1인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 고압액체 크로마토그래피(HPLC:High performance liquid chromatography)를 수행하는 방법은 메탄올과 물의 혼합용매 6:4(V/V) 조건에서 수행하는 것이 바람직하고, 2.5 ㎖/min의 속도로 용출하여 활성분획을 수득하는 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 기재되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화합물은 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)으로부터 분리된 것이 바람직하다.
상기 피부 노화는 피부 위축, 콜라겐 손실, 탄성 섬유 손실, 결합 조직 손실, 셀룰라이트 또는 주름 형성인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 화학식 1로 기재되는 화합물은 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 사람 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현 억제 효과를 나타내어 피부 주름을 예방하거나 개선할 수 있고, 세포 독성이 없이 우수한 항산화 활성을 나타내므로, 피부 노화, 예를 들면, 피부 위축, 콜라겐 손실, 탄성 섬유 손실, 결합 조직 손실, 셀룰라이트, 주름 형성 등의 예방 또는 개선을 목적으로 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 붉은싸리버섯( Ramaria formosa (Fr.) Quel) 추출물의 제조
충북 옥천 및 금산에서 구입한 붉은싸리버섯의 자실체를 구입하고 음건한 후, 분쇄하여 350 g에 8 리터의 메탄올을 가하여 상온에서 7일 동안 3번 추출한 후, 여과하고, 농축하여 붉은 싸리버섯 메탄올 추출물 22 g을 수득하였다.
<실시예 2> 붉은싸리버섯 메탄올 추출물로부터 분획물의 제조
붉은싸리버섯 추출물로부터 분획물을 제조하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제조한 메탄올 추출물 20 g을 물 1 L에 현탁한 후, 노르말-헥산(n-hexane) 1ℓ를 첨가 후 분배하여 3번 노르말-헥산 층을 분리하였고, 남아 있는 물 층에 다시 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc) 1ℓ를 가하여 3번 에틸아세테이트 층을 분리하였으며, 이와 같은 방법으로 노르말-부탄올(n-butanol, n-BuOH) 1ℓ를 가하여 3번 노르말-부탄올 층을 분리하여, 노르말-헥산, 에틸아세테이트 및 노르말-부탄올 분획물을 각각 8.0 g, 1.1 g, 및 5.2 g 수득하였다.
<실시예 3> 붉은싸리버섯 분획물로부터 신규한 화합물의 제조
<3-1> 신규한 화합물 라마린(Ramarin) A 및 B의 분리 및 정제
상기 <실시예 2>에서 제조한 에틸아세테이트 층 1.1 g을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(70-230 메쉬, 50×5.0 cm)에 적재한 후, 농도구배 모드(50:1 → 4:1)에서 CH2Cl2-MeOH로 용출하여 5개의 분획(E1-E5)을 수득하였다. 그런 다음, 150 mg의 E1 분획을 YMC RP-18 컬럼(50×3.5 cm)에 가한 후, MeOH-H2O(3:7 → 5:5)로 용출하여 2개의 분획(E1.1-E1.2)을 수득하였다. 분획을 분취용 RP-HPLC(preparative RP-HPLC)(YMC-pack Pro C18(250×10 ㎜) 컬럼, MeOH-H2O(60:40, v/v), 유속=2.5 ㎖/min, 254 ㎚에서 검출)(Gilson TRILUTION system)을 사용하여 추가적으로 분획하여 E1.2로부터 신규한 화합물 1(라마린(Ramarin) A)(1.0 mg, t R=34.0분)을 수득하였다. 또한, E2 분획을 분취용 RP-HPLC(YMC-pack Pro C18(250×10 ㎜) 컬럼, MeOH-H2O(40:60, v/v), 유속=2.5 ㎖/min, 254 ㎚에서 검출)(Gilson TRILUTION system)을 사용하여 추가적으로 분획하여 신규한 화합물 2(라마린 B)(5.0 mg, t R=31.0분)를 수득하였다.
<3-2> 신규한 화합물 라마린(Ramarin) A 및 B의 구조 분석
상기 실시예 <3-1>에서 분리한 신규한 화합물의 구조 분석을 위하여, 광학 회전, UV 분석, IR 분석, NMR 분석 및 질량 분석을 실시하였다. JASCO P-2000 디지털 선광도 측정계(polarimeter)를 이용하여 광확 회전을 측정하였고, JASCO V-550 UV/vis 및 JASCO 100 IR 분광계로 UV 분석 및 IR 분석을 각각 기록하였으며, 1H-(300 ㎒) 및 13C-(75 ㎒) NMR 분석은 TMS를 내부 표준으로 Bruker DRX-300 분광계를 사용하여 실시하였고, 2D-NMR 실험(COSY, HMBC 및 NOESY)은 Bruker Avance 500 NMR 분광계로 실행하였으며, HREIMS 및 EIMS는 Hewlett-Packard 5989B 질량 분광계를 이용하여 결정하였다.
그 결과, 화합물의 구조는 하기 화학식 1 및 2와 같이 동정하였고, 상기 화학식으로 표시되는 신규 화합물은 각각 라마린(Ramarin) A 및 B로 명명하였다. 구체적으로, 화합물 1은
Figure 112015029348332-pat00003
+180°(c=0.1, MeOH)의 포지티브 특정 회전으로 무색 오일을 수득하였다. 화합물 1의 고해상도 EIMS 분석은 m/z: 250.1567에서 분자 이온 피크를 수득하여, 분자식 C15H22O3와 부합함을 확인하였다. 화합물 1의 EIMS는 m/z: 250에서 어미 피크 및 m/z 232([M-H2O]+) 및 217([M-H2O-CH3]+)에서 특유의 조각 이온을 보였다. 239 ㎚에서 UV 최대 흡수 파장(absorption maxima) 및 1665 ㎝-1에서 IR 흡수 밴드는 13C-NMR 스펙트럼(spectrum)에 있어서, δC 199.2에서 탄소 공진의 존재에 의해 지원되어, 케토(keto) 그룹과 결합된 존재를 제시하였다. 화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼은 δH 6.19(1H, br s)에서 올레핀 양성자(olefinic proton), δH 4.38(1H, dd, J=12.0, 5.2 Hz)에서 하이드록시메틴(hydroxymethine) 양성자, δH 3.42 및 3.32(2H, 각각 d, J=11.6 Hz)에서 하이드록시메틸렌(hydroxymethylene) 양성자의 쌍, δH 1.23 및 1.24(6H, 각 s)에서 두 3차 메틸기, 및 δH 1.10(3H, d, J=6.8 Hz)에서 2차 메틸기의 특유의 신호를 표시하였다(표 1). DEPT 데이터와 결합한 13C-NMR 스펙트럼은 δC 199.2에서 카르복시기 탄소(carboxyl carbon), δC 173.3 및 121.3에서 올레핀 탄소, δC 69.7에서 하이드록시메틴, δC 71.2에서 하이드록시메틸렌, 및 δC 24.0, 16.2 및 12.5에서 세 메틸기를 포함하는 15개 탄소 신호를 밝혔다(표 1). 이상의 분광 데이터를 문헌에 보고된 유사구조와 비교하여 화합물 1을 아리스톨레인형(aristolane-type) 세스퀴테르핀계(sesquiterpene)로 추정하였다. HMBC 상관관계(correlation)의 H-6/C-7, C-8, C-9 및 H-7/C-6, C-8, C-9, C-10으로 확인된 사이클로프로판 부분(cyclopropane moiety)은 C-6 및 C-7에 연결되어있다. C-11에서 하이드록시메틸렌 그룹의 결합은 C-6, C-7, C-11 및 C-13과 함께 H-12의 HMBC 크로스 피크로부터 추론하였다. 화합물 1의 상대 구성은 NOESY 실험(도 1B)을 기초로 하고, 보고된 유사구조와 비교하여 결정하였다. C-14 및 C-15에서 메틸기 그룹의 베타-구성(β-configuration)은 각각 NOE 상관관계 Me-14/H-3ax 및 H-4ax/H-2ax로부터 추론된다. NOE 상관관계 H-6/Me-14 및 H-4/Me-13은 시클로프로판의 알파-구성(α-configuration)을 시사한다. 따라서, 화합물 1의 구조는 하기 화학식 1로 기재되는 ent-1α,12-다이하이드록시-9-아리스톨렌-8-원(ent-1α,12-dihydroxy-9-aristolen-8-one)으로 라마린 A로 명명하였다.
화합물 2는 무색 오일로 수득하였고, 고해상도 EIMS 분석은 m/z: 234.1622[M]+에서 분자 이온 피크를 수득하여, 분자식 C15H22O2와 부합함을 확인하였다. 화합물 2의 UV(λmax=237 nm) 및 IR(νmax=1662 ㎝-1) 분석은 케토 그룹과 결합된 특징을 확인하였다. 화합물 2의 1H-NMR 스펙트럼에서 관측된 δH 1.66 및 1.83에서의 두 개의 특징적인 고자장의 수소(각 1H, d, J=8.0 Hz)와 H 5.74의 올레핀 수소의 존재는 ent-아리스토론과 매우 유사하고, 화합물 2가 사이클로프로판 그룹과 같은 아리스토렌 스케레톤(skeleton)을 가지고 있음을 시사한다. 화합물 1과 비교하여 C-11에서 하이드록시메틸렌 그룹의 존재를 추정할 수 있고, 이는 C-6, C-7, C-11 및 C-13과 H-12의 HMBC 상관관계를 통해 입증된다(도 1A). 화합물 2의 상대 구성은 NOESY 실험(도 1B)을 기초로 하였다. 따라서, 화합물 2의 구조는 하기 화학식 2로 기재되는 ent-12-하이드록시-9-아리스톨렌-8-원(ent-12-hydroxy-9-aristolen-8-one)으로 라마린 B로 명명하였다.
[화학식 1]
라마린(Ramarin) A(화합물 1): 무색 오일;
Figure 112015029348332-pat00004
+180°(c=0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax nm(log ε): 239 (3.95); IR (KBr) ν max cm-1: 3420, 1665, 1650; EIMS m/z (rel. int.): 250 [M]+ (10), 232 (66), 217 (100), 201 (26), 175 (49); HREIMS m/z: 250.1567 [M]+ (Calcd for C15H22O3: 250.1569); 1H- 및 13C-NMR 데이터는 하기 표 1에 나타냄.
[화학식 2]
라마린(Ramarin) B(화합물 2): 무색 오일;
Figure 112015029348332-pat00005
+93°(c=0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax nm(log ε): 237 (3.92); IR (KBr) ν max cm-1: 3410, 1662, 1654; EIMS m/z (rel. int.): 234 [M]+ (30), 219 (35), 203 (55), 164 (100), 149 (60), 121 (70), 91 (65); HREIMS m/z: 234.1622 [M]+ (Calcd for C15H22O2: 234.1620); 1H- 및 13C-NMR 데이터는 하기 표 1에 나타냄.
Figure 112015029348332-pat00006
< 실험예 1> 붉은싸리버섯( Ramaria formosa ( Fr .) Quel ) 추출물의 사람 호중구 엘라스테아제(HNE) 발현 억제효과 측정
본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물(Ramaria formosa(Fr.) Quel)의 피부 진피 조직 속에 존재하면서 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 사람 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트 각각에 10 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5), 1.4 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-니트로아닐라이드, 0.18 U HNE 및 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 제조한 다양한 농도의 붉은싸리버섯 추출물을 첨가한 시약을 100 ㎕ 첨가하고, 암실에서 2시간 동안 37 ℃로 배양하였다. 그 후, 0.2 mg/㎖의 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor) 100 ㎕를 첨가하여 상기 반응을 종결하고, 흡광도는 ELISA 리더기를 이용하여 405 nm에서 즉시 측정하였다.
그 결과, 붉은 싸리버섯 메탄올 추출물을 1, 3, 10 및 30 ㎍/㎖의 낮은 농도로 처리하였을 때, 22, 30, 40 및 42%로 사람 호중구 엘라스테아제(HNE) 활성이 억제되는 것을 확인하였다.
< 실험예 2> 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 사람 호중구 엘라스테아제( HNE ) 활성 억제효과 측정
본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물의 분획물로부터 얻은 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 피부 진피 조직 속에 존재하면서 피부의 탄력성을 유지시키는 엘라스틴을 저해하는 효소인 사람 호중구 엘라스테아제(HNE)의 발현 억제 효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트 각각에 10 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5), 1.4 mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-니트로아닐라이드, 0.18 U HNE(EC 3.4.21.37, 독일) 및 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 정제한 다양한 농도의 라마린 A 및 B(30, 50, 100 μM)를 첨가한 시약을 100 ㎕ 첨가하고, 암실에서 2시간 동안 37 ℃로 배양하였다. 그 후, 0.2 mg/㎖의 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor) 100 ㎕를 첨가하여 상기 반응을 종결하고, 흡광도는 ELISA 리더기를 이용하여 405 nm에서 즉시 측정하였다. 양성 대조군으로 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)를 사용하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 신규한 화합물 라마린 A 및 B는 농도 의존적으로 사람 호중구 엘라스테아제(HNE) 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 2).
< 실험예 3> 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 항산화 활성 확인
<3-1> 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 프리 라디칼 (free radical) 소거 활성 확인
본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물 및 이의 분획물로부터 얻은 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)를 이용하여 라디칼 소거 활성을 확인하였다. DPPH는 그 자체가 매우 안정한 프리 라디칼로써, 517 nm에서 특정적인 광흡수를 나타내는 진한 보라색의 화합물을 측정하여 라디칼 소거 활성이 있는 항산화제에 의해 정량적으로 탈색됨으로 인해 항산화 활성을 쉽게 측정할 수 있다.
구체적으로, 96-웰 플레이트 각각에 상기 <실시예 1>의 붉은싸리버섯 추출물(30 ug/mL) 및 상기 <실시예 3>의 신규한 화합물 라마린 A 및 B(50, 100 μM) 100 ㎕에 0.2 mM DPPH 100 ㎕를 넣고 교반한 후 30분간 실온에 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 메탄올 100 ㎕에 0.2 mM DPPH 100 ㎕을 넣어서 사용하였고, 양성 대조군으로 EGCG를 사용하였다. 프리 라디칼 소거 활성은 측정된 흡광도를 이용하여 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.
Figure 112015029348332-pat00007
A: 본 발명의 시료 대신 메탄올을 처리한 대조군의 흡광도
B: 본 발명의 시료를 처리한 실험군 및 양성 대조군의 흡광도
그 결과 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 프리 라디칼 소거 활성이 뛰어나므로, 우수한 항산화 효과를 갖고있음을 확인하였다(표 2).
시료명 프리 라디칼 소거 활성
붉은싸리버섯 추출물(30 ㎍/㎖) 57.4%
라마린 A(50 μM) 47.2%
라마린 A(100 μM) 59.1%
라마린 B(50 μM) 46.8%
라마린 B(100 μM) 57.1%
EGCG(100 μM) 56.5%
<3-2> 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 SOD 유사 활성(superoxide dismutase-like activity) 확인
본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물 및 이의 분획물로부터 얻은 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 SOD 유사 활성을 확인하였다. SOD 유사 활성 반응에서 피로갈롤(pyrogallol)은 물에 존재하는 슈퍼옥사이드 라디칼에 의해 자동 산화가 일어나 갈색물질을 형성하여 이를 분광 광도계로 분석하고, 슈퍼옥사이드 포착 활성이 있는 물질이 존재시 피로갈롤의 산화속도가 낮아지는 원리를 이용하여 슈퍼옥사이드 포착 활성을 간접적으로 측정할 수 있다.
SOD 유사 활성은 Marklund(Marklund S, Marklund G. Involvement of superoxide anion radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur. J. Biochem. 47: 469-474(1974)) 등의 방법에 따라 측정하였다. 각각의 상기 <실시예 1>의 붉은싸리버섯 추출물(30 ㎍/㎖) 및 상기 <실시예 3>의 신규한 화합물 라마린 A 및 B(50, 100 μM) 2 ㎖에 Tris-HCl의 완충용액(50 mM Tris+10 mM EDTA, pH 8.5) 3 ㎖와 7.2 mM 피로갈롤 200 ㎕를 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 100 ㎕를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 피로갈롤의 양을 420 ㎚에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 양성 대조군으로 EGCG를 사용하였다. SOD 유사 활성은 측정된 흡광도를 이용하여 하기 수학식 2에 의해 계산하였다.
Figure 112015029348332-pat00008
A: 본 발명의 시료를 처리하지않은 대조군의 흡광도
B: 본 발명의 시료를 처리한 실험군 및 양성 대조군의 흡광도
그 결과 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 SOD 유사 활성이 뛰어나므로, 우수한 항산화 효과를 갖고있음을 확인하였다(표 3).
시료명 SOD 유사 활성
붉은싸리버섯 추출물(30 ㎍/㎖) 50.9%
라마린 A(50 μM) 46.6%
라마린 A(100 μM) 54.1%
라마린 B(50 μM) 44.7%
라마린 B(100 μM) 52.3%
EGCG(100 μM) 46.5%
< 실험예 4> 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 세포 독성 확인
본 발명에 따른 붉은싸리버섯 추출물 및 이의 분획물로부터 얻은 신규한 화합물 라마린 A 및 B의 세포 독성을 MTT assay를 통해 확인하였다.
구체적으로, 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 플레이트에 1×104개씩 분주하고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 배양한 세포를 PBS로 1회 세척하고, 10% FBS가 포함된 DMEM 1 ㎖과 함께 상기 <실시예 1>의 붉은싸리버섯 추출물(30 ㎍/㎖) 및 상기 <실시예 3>의 신규한 화합물 라마린 A 및 B(50, 100 μM)을 처리한 후 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고, 10% FBS가 포함된 DMEM 500 ㎕와 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(2.5 ㎎/㎖) 100 ㎕를 넣은 후 1시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 제거하고, 생성된 formazan 크리스탈을 DMSO로 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 측정된 흡광도를 이용하여 하기 수학식 3에 의해 계산하였다.
Figure 112015029348332-pat00009
A: 세포없이 배지만 처리한 군의 흡광도
B: 본 발명의 시료를 처리하지않고 배지만 처리한 군의 흡광도
C: 본 발명의 시료를 처리한 실험군 및 양성 대조군의 흡광도
그 결과 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 붉은싸리버섯 추출물 및 신규한 화합물 라마린 A 및 B이 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(표 4).
시료명 세포 생존율
붉은싸리버섯 추출물(30 ㎍/㎖) 98.0%
라마린 A(50 μM) 99.4%
라마린 A(100 μM) 98.6%
라마린 B(50 μM) 99.7%
라마린 B(100 μM) 98.5%

Claims (6)

  1. 붉은싸리버섯 추출물(Ramaria formosa(Fr.) Quel) 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 분획물은 붉은싸리버섯 추출물을 메탄올, 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 유기용매를 이용하여 수득된 것을 특징으로 하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  3. 하기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이들의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 2]
    Figure 112015059423418-pat00013
    ; 또는
    [화학식 3]
    Figure 112015059423418-pat00014
    .

  4. 제 3항에 있어서, 상기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이들의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 붉은싸리버섯으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 화합물, 이들의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 1) 붉은싸리버섯(Ramaria formosa(Fr.) Quel)을 물, C1-C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 수득한 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)에서 수득한 분획물에 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 화합물을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이들의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 제조방법.
  6. 제 3항의 화합물, 이들의 광학 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
KR1020150041744A 2015-03-25 2015-03-25 붉은싸리버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물 KR101558526B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2909825B2 (ja) * 1988-05-20 1999-06-23 株式会社ナリス化粧品 化粧料
JP2000053523A (ja) * 1998-08-07 2000-02-22 Pola Chem Ind Inc 美白に好適な皮膚外用剤

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