CN101112354B - 苦竹有效成分提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种苦竹有效成分提取物，其制备方法以及其在化妆品和制药中的应用。所述提取物的主要有效成分是Taxiphyllin(2R-β-D-吡喃葡萄糖基-2-对羟基苯乙腈)，其具有良好的抗氧化活性，同时具有明显的酪氨酸酶抑制活性，可应用于肤色增白的化妆品，或者是色素增加性皮肤病药物。

Description

苦竹有效成分提取物的制备方法 
本申请是申请号为200410093600.3、申请日为2004年12月24日、发明名称为“苦竹有效成分提取物、其制备方法和用途”的专利申请的分案申请。 
技术领域
本发明涉及天然药物化学和生物化学等学科，具体涉及从中草药苦竹中提取具有酪氨酸酶活性抑制作用的有效成分的方法。 
背景技术
酪氨酸酶是黑素生物合成途径中的主要限速酶。大多数能使皮肤脱色的物质都通过抑制该酶活性来阻滞皮肤黑素生成，属酪氨酸酶抑制型皮肤脱色剂(Depigmenting agent)。近年来，从微生物和植物药中分离天然的酪氨酸酶抑制剂已得到人们的普遍关注。它不但用于色素增加性皮肤病(黄褐斑、雀斑等)的临床治疗，而且可用于化妆品使肤色增白。 
一般来说，与酪氨酸酶的底物类似的单酚类化合物氢醌能抑制该酶活性，许多具有相似官能团结构的单酚或多酚化合物也能抑制酪氨酸酶活性。但氢醌及其它酚类化合物的外用制剂化学性质不稳定，容易氧化变色，另外还有这类物质引起皮肤永久性白斑的报告，限制了此类化合物的开发和应用。维生素C和熊果苷是当前美白化妆品中比较常用的添加物。但是，维生素C同样也是非常不稳定，无法直接添加到产品中，通常采用维生素C的衍生物(如维生素C的磷酸盐等)。而熊果苷在近年来的研究中也发现其抑制酪氨酸酶活性不是非常稳定。因此，寻找活性高、安全的酪氨酸酶抑制剂仍是目前研究的一个热点。 
竹子这一具有丰富资源的植物在国内外已有多方面的开发利用。在化妆品生产方面，除了作为一些化妆品辅助产品的原料以外，如睫毛刷、眼影刷和腮红刷等的手柄和一些化妆品的包装盒之类产品，竹子还以竹类提 取物的形式被用作天然化妆品和功能性化妆品的有效添加物，具有保湿、美 白、抗衰老、抗炎症、清洁以及护发等多种功能。例如，意大利的Erbasol公司从竹笋中提取得到α-羟基酸具有更新细胞、保持pH平衡的作用，被应用于保湿沐浴露的生产；日本NOEVIA公司从一种开花竹中获得的提取物可以有效抑制B16黑素细胞中酪氨酸酶的T3异构酶的生成，将其应用于新型美白化妆品的开发。国内则由浙江安吉的圣氏生物制品有限公司开发出的竹叶黄酮产品，可作为天然生物抗氧化剂应用于医药、保健和化妆品等多种行业中。 
目前对苦竹(Pleioblastus amarus Keng(Keng)f.(Gramineae))的研究相对较少。苦竹笋在中药记载中具有清热，除湿，明日，治疗目痛，口疮，汤火伤等功能。 
发明内容
本发明的目的在于，提供上述中草药提取物的制备方法。 
本发明提供的从苦竹(Pleioblastus amarus Keng(Keng)f.(Gramineae))，特别是苦竹笋中制备的提取物中，主要有效成分是Taxiphyllin，2R-β-D-吡喃葡萄糖基-2-对羟基苯乙腈，分子式为C14H17NO7 (分子量为311)，可占提取物的98％以上，结构为： 
Figure G071B2730020070706D000021
将本发明所述提取物分离提纯可得到白色针晶(氯仿-甲醇)，溶于水、甲醇。在预制硅胶板上点样展开，用碘显色，斑点颜色由黄色逐渐变成绿色，再变成蓝色，且于空气中放置，颜色并不消失；当展开剂为氯仿-甲醇(2∶1)；乙酸乙酯-甲醇(1∶3)苯-甲醇(2∶1)时，Rf值分别为0.56、0.17、0.42。经过电喷雾电离质谱(ESI-MS)，高分辨电子轰击质谱(HREI-MS)，13C NMR和1H NMR等数据表明该化合物的分子式为C14H17NO7。元素分析显示，该化合物含有一个腈基。1H-NMR(400MHZ，二甲亚砜-d6)显示，该化合物存在一对位取代的苯环结构(δ7.32和δ6.82， J＝8.6Hz，4H)和一个羟基(δ9.84，δ5.23，δ5.05，δ4.98和δ4.55，5H)。 1H-NMR氢谱数据和已发表的Cyanogenic glucoside taxiphyllin数据一致。 
13C-NMR碳谱数据如表1所示。 
表1苦竹提取物的13C-NMR碳谱数据 
Figure G071B2730020070706D000031
本发明的中草药提取物具体制备方法为： 
方法一： 
1.苦竹笋用50～90％倍体积的乙醇回流提取2次，得到浸膏； 
2.苦竹笋浸膏加水溶解(约5～10倍体积)离心、过滤； 
3.滤液用正丁醇或者氯仿、乙酸乙酯等溶剂萃取； 
4.浸膏用硅胶柱，用氯仿-甲醇洗脱； 
5.重结晶。 
方法二： 
1.苦竹笋用10倍体积的50～90％乙醇回流提取2次，得到浸膏； 
2.苦竹笋浸膏加水溶解(约5～10倍体积)； 
3.水溶液加入95％乙醇沉淀，放置过夜； 
4.滤液浓缩过滤，并用氯仿、石油醚或等正丁醇溶剂萃取； 
5.用大孔吸附树脂吸附，用30～60％乙醇洗脱； 
6.硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱； 
7.以甲醇或丙酮、无水乙醇等重结晶。 
方法三： 
1.苦竹笋用10倍体积的50～90％乙醇回流提取2次，得到浸膏； 
2.苦竹笋浸膏加水溶解(约8～12倍体积)离心、过滤； 
3.滤液稍加浓缩后用大孔树脂洗脱，乙醇-水梯度洗脱； 
4.洗脱液用硅胶柱层析进行分离，所用溶剂为氯仿-甲醇(2∶1～5∶1)； 
5.重结晶。 
本发明所述的苦竹有效成分提取物，具有良好的抗氧化活性，同时具有明显的酪氨酸酶抑制活性。 
将本发明的提取物和维生素C以及熊果苷在不同浓度下作酪氨酸酶活性抑制对比，结果见图1，可以看出在反应物浓度较高时，苦竹有效成分提取物(YF4332)和维生素C(Vc)活性水平基本接近，高于熊果苷；在低浓度范围内，维生素C和熊果苷活性迅速下降，而苦竹有效成分提取物(YF4332)下降缓慢。因此，苦竹有效成分提取物(YF4332)的作用范围比维生素C和熊果苷更加宽泛，有利于配方成本的降低。 
从上述内容可知，本发明的苦竹有效成分提取物十分适合用于肤色增白的化妆品，或者是色素增加性皮肤病药物。 
附图说明
本申请中包括的附图是说明书的一个构成部分，附图与说明书和权利要求书一起用于说明本发明的实质内容，用于更好地理解本发明。附图中： 
图1是本发明的苦竹有效成分提取物(YF4332)和维生素C以及熊果苷在不同浓度下的酪氨酸酶活性抑制对比示意图。 
图2是在黑素细胞中熊果苷和本发明的苦竹有效成分提取物(YF4332)酪氨酸酶抑制活性与浓度的关系示意图。 
图3是在黑素细胞中熊果苷和本发明的苦竹有效成分提取物(YF4332)黑素生成抑制与浓度的关系示意图。 
实施方式 
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。 
实施例1 
按照分离方法一进行制备：苦竹笋的乙醇浸膏882g，用5～10倍量水溶解沉淀，过滤后的滤液用2～5倍量的溶剂如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等萃取，萃取液经过硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(10∶1～1∶1)洗脱，重结晶后得1812.7mg苦竹提取物。 
实施例2. 
按照分离方法二进行制备：苦竹笋的乙醇浸膏700g，用5～10倍水溶解，加入2～4倍的95％乙醇放置过夜。过滤，滤液浓缩过滤后用正丁醇、或氯仿、石油醚等溶剂萃取。萃取液经甲醇溶解后过滤，滤液上大孔吸附树脂用30～60％的乙醇洗脱至无色，得馏份26g。经甲醇溶解后上硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，经甲醇或丙酮、无水乙醇等重结晶后得白色固体，即苦竹有效成分提取物0.68g。 
在本方法中，活性成分苦竹有效成分提取物(YF4332)得率为1‰；其纯度可以达到99.8％。 
实施例3 
按照分离方法三进行制各：苦竹笋的乙醇浸膏500g，加入8～12倍体积的水溶解、沉淀，离心过滤后的滤液稍稍浓缩，上大孔吸附树脂用乙醇-水梯度洗脱，得馏份14.8g(此时用高效液相色谱HPLC分析即可在231.8nm检测到苦竹有效成分提取物(YF4332)含量为73.4％)。然后上硅胶柱层析，用氯仿-甲醇(2∶1～5∶1)洗脱，重结晶后析出针状晶体，即苦竹有效成分提取物(YF4332)157.6mg。 
实施例4 
抗氧化活性分析 
采用DPPH自由基清除法测定抗氧化活性。 
测定方法：0.1ml含有不同浓度添加剂样品与3.9ml的DPPH·乙醇溶液充分混匀，室温放置30分钟后测定517纳米吸光度值(OD517nm)。 
表1：抗氧化活性 
实施例5 
体外酪氨酸酶活性抑制 
测定原理：在酪氨酸酶的作用下，左旋多巴(L-DOPA)氧化为棕褐色的多巴色素(DOPAchrome)。 
测定方法：0.5ml含有不同浓度添加剂的样品与0.5ml的10u/ml酪氨酸酶溶液和1.5ml缓冲液充分混匀，置30℃水浴孵育20分钟。然后在每一试管中，加入1.0ml的0.2％L-DOPA，30℃水浴准确反应5分钟，即刻用分光光度计于475nm处测定多巴色素的吸收峰值， 
表2：酪氨酸酶抑制活性 
Figure DEST_PATH_GA20185275200710112730001D00022
实施例6 
黑素细胞内酪氨酸酶活性抑制 
测定方法：B16黑素细胞培养24小时后添加苦竹有效成分提取物(YF4332)，经过48小时培养后用生理盐水将培养基冲洗干净。加入聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)在37℃孵育30min，移取0.2ml用茚三酮定量细胞蛋白质，向余下细胞中加入Dopa，在37℃孵育30min时测定OD475。 
测试了苦竹提取物在黑素细胞中对酪氨酸酶活性的抑制。结果如图2所示。数据表明苦竹有效成分提取物(YF4332)在黑素细胞中的确具有抑制酪氨酸酶活性和黑素的作用。 
实施例7 
黑素细胞黑素生成抑制 
测定方法：向培养24小时后的黑素细胞中添加苦竹有效成分提取物(YF4332)，经过48小时培养后用磷酸盐缓冲液(PBS)将培养基冲洗干净。加入胰酶消化细胞。离心后去上清，同样移取0.2ml用茚三酮定量细胞蛋白质，向余下细胞中加入NaOH煮沸20min，冷却后测定400纳米吸光度值(OD400)。 
测试了苦竹提取物在黑素细胞中对黑素生成的抑制。结果如图3所示。数据表明苦竹有效成分提取物(YF4332)在黑素细胞中的确具有抑制黑素生成的作用。 

Claims (1)

1.一种苦竹有效成分提取物的制备方法，其特征在于该方法由下列步骤组成：
苦竹笋用10倍体积的50～90％乙醇回流提取2次，得到苦竹笋的乙醇浸膏，取700g浸膏，用5～10倍水溶解，加入2～4倍的95％乙醇放置过夜，过滤，滤液浓缩过滤后用正丁醇、或氯仿、石油醚溶剂萃取，萃取液经甲醇溶解后过滤，滤液上大孔吸附树脂用30～60％的乙醇洗脱至无色，得馏分26g，再经甲醇溶解后上硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，经甲醇或丙酮、无水乙醇重结晶后得白色固体，即得苦竹有效成分提取物0.68g，其中活性成分苦竹有效成分提取物得率为1‰；其纯度为99.8％。
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