KR101398026B1

KR101398026B1 - 클라이토싸이빈 유도체를 함유하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101398026B1
Application number: KR1020120050642A
Authority: KR
Inventors: 윤여표; 박은석; 유규동; 유익동
Original assignee: 한국생명공학연구원; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-14
Filing date: 2012-05-14
Publication date: 2014-05-27
Also published as: KR20130127052A

Abstract

본 발명은 클라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 조성물 및 이 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 용도의 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 클라이토싸이빈 유도체는 뛰어난 혈관평활근세포 증식 억제 활성을 가지므로, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환, 예를 들어, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관재협착증, 혈관협착증 뿐만 아니라 이로 인해 이차적으로 발생되는 다양한 심혈관계 질환의 예방, 치료, 완화 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

클라이토싸이빈 유도체를 함유하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition Comprising Clitocybin Derivatives for Prevention and Treatment of Vascular Smooth Muscle Cell Hyper-Proliferative Disease}

본 발명은 클라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 조성물 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

심부전, 관상동맥질환, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증, 협심증 등의 심장질환과 뇌졸중, 말초혈관 질환 등의 심혈관계 질환은 다양한 연령층에서 발생하며 적기에 치료하지 않으면 심각한 후유증과 더불어 사망에 이르게 할 수 있다. 특히, 최근에는 서구화된 식생활로 인하여 관상동맥질환의 발병율이 급격히 증가되고 있어, 관상동맥질환을 효과적으로 치료하려는 노력이 계속되고 있다. 현재까지 개발된 관상동맥질환에 대한 치료법으로는, 약물요법, 유전자 치료법, 경피적 관동맥 성형술 및 스텐트 삽입술 (PTCA: percutaneous transluminal coronary angioplasty and stenting), 외과적으로 수술하는 관동맥우회술 (CABG: coronary artery bypass graft)의 재관류요법 (revascularization therapy) 등이 있다. 또한, 최근에는, 경피적 관동맥 성형술 및 스텐트 삽입술 (PTCA)이 많이 사용되고 있으나, 3 내지 6개월이 경과한 후에는 약 40％ 가량의 환자들에 있어서 혈관 재협착(restenosis)이 일어난다는 문제점이 있다 (Ryan et al., J. Am. Coll. Cardiol., 22. 2033-2054, 1993). 이러한 혈관 재협착은 풍선도자에 의해 손상된 혈관내피 세포, 활성화된 혈소판 또는 대식세포로부터 여러 가지의 사이토카인이 생성, 분비되면서 혈관 평활근세포의 유주 (migration) 및 증식이 촉진되고, 이에 따라 세포외간질 (ECM: extracellular matrix)의 생성 및 분비가 촉진되어 혈관내막의 비후를 일으켜, 발생되는 것으로 알려져 있다 (Godfried et al, Am. Heart J., 129, 203-210, 1995).

한편, 정상적인 상태의 혈관 평활근세포는 증식을 하지 않지만, 스텐트시술 등을 통하여 내피세포의 중막이 손상되면서 여러 단계의 신호전달을 거쳐 혈관 평활근세포의 분열, 이동 및 증식이 유발된다. 혈관 평활근세포 증식의 기전으로는 정상적인 내피세포의 손상에 의한 증식억제인자의 제거와 증식유발인자의 활성화, 혈관 평활근세포 표면의 수용체를 통한 증식유발신호의 전달, 혈관 평활근세포의 핵 내로 전달된 증식유발신호에 의한 세포 주기의 변화 등을 들 수 있다. 정상적인 내피세포는 혈관 평활근세포의 증식을 억제하는 물질을 분비하는데, 내피세포가 손상되면 이들의 분비가 억제되고, 활성화된 혈소판에서 분비되는 혈소판 유래 성장인자 (platelet derived growth factor), 혈장 중에 포함되어 있는 여러 사이토카인 (cytokine) 등에 의해 혈관 평활근세포의 증식이 유발된다고 알려져 있다. 현재까지는 항 혈소판제, 항 응고제, 콜레스테롤 생합성 저해제, 항 알레르기제 등을 이용하여 재협착을 예방해 보려고 시도를 하였으며(Lefkovits et al., Progr. Cardiovas. Dis., 40, 141-158, 1997), 최근에는 생선유(fish oil), 비타민C 나 비타민E 등 천연물 유래 성분의 재협착 예방 작용에 대한 연구가 이루어지고 있다. 하지만 이들 약제는 임상에서는 아직 충분한 결과를 얻지 못한 실정이다. 이 밖에 택솔(Herdeg et al., Zeischrift fur Kardiologie, 89, 390-397, 1999), 헤파린, EPA, 에스트로겐 등이 혈관 재협착 억제제로서 연구 개발 중에 있으나, 이 역시 뚜렷한 실효를 거두지 못하는 실정이다.

한편, 대한민국 특허등록 제478671호에는 클로트리마졸을 유효성분으로 포함하는 혈관 재협착 예방 및 치료용 약학 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제 516026호에는 3’-디옥시아데노신(3’-deoxyadenosine)을 유효성분으로 하는 혈관 재협착 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2001-110793호에는 Rho 키나아제 저해활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 하는 혈관협착증의 예방 및 치료제가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2003-46314호에는 항트롬빈을 유효성분으로 하는 이식 혈관병, 재협착증, 인-스텐트 재협착증(in-stent restenosis) 및 폐 고혈압과 같은 혈관 이상 증식성 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허 제2005-23249호에는 레티노이드 및 레티노이드 작용 조절제를 유효성분으로 하는 혈관내 스텐트를 사용한 경피적 관상동맥 혈관형성술 후의 혈관 재협착 및/또는 재폐색 등 혈관성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2005-43183호에는 커쿠민(curcumin)을 포함하는 혈관 재협착 예방 및 치료용 약학조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 혈관 재협착 억제제는 혈관 재협착을 방지하는 것 이외의, 상처재생억제, 혈관손상, 간독성, 신장손상, 혈소판응집억제에 의한 출혈량 증가 등의 다양한 부작용을 나타내었기 때문에, 사람에 대하여 안전성이 입증된 다양한 천연물로부터 유래된 혈관 재협착을 억제할 수 있는 물질을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다. 따라서, 안전하면서도 효과적으로 혈관 재협착을 억제할 수 있는 물질을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

또한, 동맥경화는 동맥벽의 탄력이 손실되고 그 벽이 두꺼워져서 경화되는 질환으로, 침범된 장기에 따라 다양한 증세를 나타내지만, 공통적으로 혈액공급의 부족으로 인한 허혈에 기인한 증세가 가장 많고 탄력성 상실로 인해 파열출혈의 증세가 나타나기도 한다. 특히, 심장관상동맥이 동맥경화를 일으켜서 혈류가 줄어들면, 운동 시에 흉부통을 느끼는 협심증이 생기고, 더욱 줄어들면 휴식 시에도 통증을 느끼는 불안정협심증(unstable angina)이 되며, 아주 막히면 심근이 썩는 심근경색이 되어 생명이 위험하게 되기도 한다. 그 동안 이러한 동맥경화를 치료하기 위한 연구가 진행되었는데, 1970년대에 비로소 심장으로 관을 넣어 혈관촬영을 하고 병소를 발견하였고, 여기에 풍선을 넣어 물리적으로 넓히는 시술법의 아이디어가 도입되었다. 최근에는 약물코팅 스텐트를 이용하여 시술의 성공률을 높이고, 보다 광범위한 상황에서의 시술 성공률이 높아져 심장병의 치료에 전기를 맞고 있다. 동맥경화로 인한 심장병에 대한 시술기법은 이렇듯 많은 발전을 낳았으나, 한편으로는 동맥경화자체를 예방하고 조절하기 위한 학문적인 성과에는 아직 해결해야할 부분이 많으며, 동맥경화의 원인 및 치료에 대한 연구, 혈전 형성을 억제하기 위한 효과적인 항혈전 및 항응고제 의 탐색 및 응용연구가 필요하다.

클라이토싸이빈(clitocybin) 유도체는 깔대기버섯(Clitocybe aurantiaca)의 균사체 배양액 추출물로부터 분리된 이소-인돌론계 화합물로서, 강력한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으나, 현재까지 이 유도체가 혈관 평활근세포의 증식을 억제한다는 활성에 대해서는 보고되어 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 혈관평활근세포의 과도한 증식을 억제할 수 있는 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 클라이토싸이빈 유도체가 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)의 증식 억제 활성이 있음을 실험적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 클라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포의 증식 억제용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 클라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포의 이상 증식성 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)의 증식 억제용 조성물을 제공한다.

단, 상기 화학식 1에서 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 히드록시기(hydroxy group) 또는 탄소수 1 내지 5의 알콕시기(alkoxy group)이다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환(vascular smooth muscle cell hyper-proliferative disorder)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 클라이토싸이빈(clitocybin) 유도체는 혈관평활근세포의 증식 억제 활성을 갖는다.

본 발명의 하기 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 클라이토싸이빈 유도체는 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)로 유도한 대동맥 평활근 세포의 증식과, DNA의 합성을 억제한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 클라이토싸이빈 유도체는 상기 화학식 1 에서 (i) R₁ 및 R₂가 각각 독립적으로 히드록시기인 화합물; (ⅱ) R₁이 탄소수 1 내지 5의 알콕시기이고, R₂가 히드록시기인 화합물; 또는 (ⅲ) R₁ 및 R₂가 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 5의 알콕시기인 화합물이다.

본 발명의 하기 구체적인 일 실시예에 의하면, 하기 화학식 2로 표시되는 클라이토싸이빈 A, 하기 화학식 3으로 표시되는 클라이토싸이빈 B, 및 하기 화학식 4로 표시되는 클라이토싸이빈 C의 혈관평활근세포의 증식을 억제하는 활성이 입증된다.

본 발명의 클라이토싸이빈 유도체는 혈관평활근세포의 증식 억제 활성을 가지므로, 혈관평활근세포의 비정상적으로 과도한 증식이 억제되어야 하는 다양한 분야에 매우 유용하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 관상동맥을 비롯한 혈관 폐쇄성 질환 치료에 사용되는 스텐트 코팅 조성물로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “평활근”은 관 모양의 기관, 방광, 복강, 자궁, 생식도관, 위장관, 호흡기관, 맥관구조, 피부 및 모양체근(ciliary muscle), 눈의 홍채 등의 기관의 벽(wall) 내에서 발견되는 비-줄무늬근(non-striated muscle)이다. 상기 평활근을 구성하는 세포인 “평활근 세포”는 단핵세포로서, 시트 (sheet)나 다발(bundle)의 형태로 배열되어 갭정션(gap junction)에 의해 연결되어 있는 것이 특징이다.

본 명세서에서 용어 “혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)”는 혈관 벽의 평활근을 구성하는 세포를 의미한다.

본 명세서에서 용어 “혈관 평활근 세포 이상 증식성 질환 (VSMC hyper-proliferative disorder)”이란 혈관 평활근 세포의 과도한 증식에 기인하여 발생되는 질환 또는 질병을 통칭하는 의미한다.

본 발명에서의 “혈관평활근세포 이상 증식성 질환”은 혈관평활근세포의 이상 증식에 의해 직접적으로 발생되는 혈관재협착증, 혈관협착증, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증 뿐만 아니라, 이들 질환에 의해 이차적으로 유발되는 심혈관계 질환인 고혈압, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 말초혈관협착증 등을 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료 또는 예방되는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환은 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관재협착증, 혈관협착증 또는 고혈압증이다.

아테롬성 동맥경화증은 동맥의 내층에 지방 물질이 침착되거나 섬유화 (fibrosis)되어 있는 질환이다. 한편, 혈관의 재협착증(restenosis)은 혈관벽이 손상(traumatization)된 후 혈관 통로가 좁혀지는 질환이다. 동맥경화 진행과 스탠트 삽입술 후에 발생하는 혈관 재협착증은 모두 혈관평활근 세포의 증식, 이동 그리고 세포외 기질(extracellular matrix)의 분비 등에 기인한다고 알려지고 있다 (Circulation, 1997, 95, 1998-2002; J. Clin. Invest. 1997, 99, 2814-2816; Cardiovasc. Res. 2002, 54, 499-502). 이에, 동맥경화의 진행과 혈관 재협착의 방지를 위해 혈관평활근 세포의 증식을 억제하는 약물에 대한 연구가 널리 진행되고 있으며, 현재 몇 가지 약물이 환자의 치료에 사용되고 있다(J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 39, 183-193). 따라서, 혈관평활근세포의 증식을 효율적으로 억제하는 본 발명의 클라이토싸이빈 유도체는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 활성성분 클라이토싸이빈 유도체 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 조성물에 포함되는 클라이토싸이빈 유도체의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 바람직하게는 본 발명의 클라이토싸이빈 유도체는 조성물 중에 1 - 50 의 농도로 첨가될 수 있다. 1 미만의 농도로 포함되는 경우 원하는 효과를 기대하기 어렵고, 50 초과의 농도로 포함되면 농도가 증가하는 것에 비례한 증가된 효과를 기대하기 어려우며 또한 본 발명에 의한 제품의 제조비용이 증가하는 단점이 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 의하면 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 완화 또는 개선 용도의 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 클라이토싸이빈 유도체 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명은 화학식 1로 표시되는 클라이토싸이빈 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 증식 억제용 조성물 및 이 유도체를 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방, 치료, 개선 또는 완화 용도의 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 클라이토싸이빈 유도체는 뛰어난 혈관평활근세포 증식 억제 활성을 가지므로, 혈관평활근세포 이상 증식성 질환, 예를 들어, 동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관재협착증, 혈관협착증 뿐만 아니라 이로 인해 이차적으로 발생되는 다양한 심혈관계 질환의 예방, 치료, 완화 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 클라이토싸이빈 A, B, 또는 C를 각각 5μM, 10μM, 20μM, 40μM의 농도로 흰쥐의 대동맥 평활근세포에 처리한 후 이 세포의 증식 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 클라이토싸이빈 A, B, 또는 C를 각각 5μM, 10μM, 20μM, 40μM의 농도로 흰쥐의 대동맥 평활근세포에 처리한 후 이 세포의 DNA 합성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 실험재료

클라이토싸이빈(Clitocybin) A, B 및 C는 Moon EY, et al.(Biol Pharm Bull. 2009;32:16891694)이 보고한 내용에 따라 합성하고 특성을 확인한 후 사용하였다. 합성한 화합물들을 DMSO(dimethylsulfoxide)에 용해시키고 최대의 최종 DMSO 농도가 0.05％가 되도록 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 첨가하였다. 세포 배양에 사용되는 재료는 Gibco-BRL (Rockville, MD, USA)으로부터 구입하였고, 다른 화학시료들은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)으로부터 구입하였다. [³H]-티미딘(thymidine)은 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)으로부터 구입하였고, PDGF-BB는 Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA)으로부터 구입하였다.

2. 세포 배양

흰쥐(rat)의 대동맥혈관평활근세포(VSMC)는 Chamley JH et al. (Cell Tissue Res. 1977;177:503522.)에 의해 보고된 방법을 약간 변형한 효소처리 분산 방법에 의해 분리하였다. 간략히 설명하면, 세포들을 10％ FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스트렙토마이신, 8 mM HEPES 및 2mM L-글루타민이 첨가된 DMEM 배지를 사용하여 37℃에서, 95％ 공기 및 5％ CO₂ 의 습화된 분위기의 인큐베이터 내에서 배양하였다. 흰쥐 VSMC 배양의 순도는 α-평활근 액틴의 웨스턴 블로팅에 의해 확인하였다. VSMC의 5-9 계대(passage)를 실험에 사용하였다.

3. 세포 증식 분석

VSMC 증식은 Park ES et al.(Vascul Pharmacol. 2010;53:6167)에 의해 보고된 방법에 따라 직접적인 세포 계수에 의해 측정하였다. 간략히 설명하면, 세포들을 10％ FBS가 첨가된 DMEM이 채워져 있는 12-웰 배양 플레이트에 4 X 10⁴ 세포/웰의 농도로 분주하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 다양한 농도의 클라이토싸이빈 A, B 또는 C를 첨가하였거나 또는 첨가하지 않은 무혈청 배지로 교체하였다. 세포들을 25 ng/mL PDGF-BB(platelet-derived growth factor, 혈소판유래성장인자)으로 처리하고, 24시간 더 배양한 후에 배양을 종료하였다. 각 배양세포에 트립신(trypsin)을 처리하여 배양된 세포를 분리시키고 현미경하에서 세포계수기(hemocytometer)를 사용하여 계수하였다.

4. [ ³ H]- 티미딘 ( thymidine ) 혼입 분석

DNA의 합성은 세포의 DNA안으로 혼입되는 [³H]-티미딘의 수준을 측정하여 분석하였다(Zhang et al., 2000). VSMC를 24-웰 배양 플레이트에 분주하고 상술한 세포 증식 분석의 세포 배양 조건과 동일한 조건하에서 배양하였다. 이어서, 1μCi/mL의 [³H]-티미딘을 배지에 첨가하여 세포를 4시간 더 배양하였다. 이어서, 배양물을 얼음에 옮겨 두고 배지를 흡입하여 반응을 중지시킨 후, 10％ 트리클로로아세트산(TCA, trichloroacetic acid) 및 에탄올/에테르(1:1, v/v)를 포함하는 PBS으로 세정하였다. 산-불용성 [³H]- 티미딘을 300㎕의 0.5M NaOH를 가하여 용해시키고, 용해물을 3 mL의 섬광계수용 혼합액(scintillation cocktail, Ultimagold; Packard Bioscience, Meriden, CT, USA)와 혼합하고, 액체 섬광계수기(LS3801, Beckman, D, Germany)를 사용하여 방사선량을 측정하였다.

5. 통계 분석

실험결과는 평균±S.E.M으로 표현하였다. 일원변량분석(One way analysis of variance)를 사용하여 다중 비교를 행하였다(GraphPad Prism version 4.00 for Windows, San Diego, CA, USA). 처리군간에 현저한 변화가 있다면, Dunnett 테스트를 적용하였다. 데이터는 P < 0.05인 경우를 유의한 것으로 하였다.

6. 급성 독성 실험

25±5g의 ICR계 마우스와 235±10g의 특정병원부재(SPF) 스프라그-도올리(Sprague Dawley, Biogenomics사) 랫트를 각각 3 마리씩 4개의 군으로 나누어 클라이토싸이빈 A, B, 또는 C를 각각 100 mg/㎏, 10 mg/㎏, 1 mg/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰하였다.

실험 결과

1: 클라이토싸이빈의 대동맥 평활근세포 증식억제 효과

클라이토싸이빈이 흰쥐의 대동맥 평활근세포 성장을 억제하는지 알아보기 위하여, 3.0 X 10⁴개의 대동맥 평활근세포를 12웰 플레이트에서 0.5％(V/V)의 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24시간 동안 배양하여, 각각 5, 10, 20, 40 μM 농도의 클라이토싸이빈 A, B, 또는 C를 처리하고, 다시 24시간 동안 더 배양한 다음, 25 ng/ml의 농도로 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF-BB, Sigma Chem. Co., USA)로 처리하고, 또 다시 24, 48, 72 시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 배양세포에 트립신을 처리하여 배양된 세포를 분산시키고, 세포계수기로 세포의 수를 측정하였다. 실험결과, 도 1에서 나타난 바와 같이, 클라이토싸이빈의 처리농도가 증가할수록, 대동맥 평활근세포의 혈소판 유래 성장인자에 의한 증식정도가 억제됨을 알 수 있었다.

2. 클라이토싸이빈의 대동맥 평활근세포의 DNA 합성억제 효과

상기 실시예 1에서 확인된 클라이토싸이빈의 세포증식 억제효과가 DNA의 합성과 관련된 것인지를 확인하고자 클라이토싸이빈이 세포의 DNA 합성에 미치는 영향을 측정하였다. 먼저, 흰쥐의 대동맥 평활근세포에 혈소판 유래 성장인자(PDGF-BB)를 처리하고 20 시간 동안 배양한 후, 1 ㎕의 [³H]-티미딘을 배양액에 가하고, 다시 4시간 동안 배양하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 대동맥 평활근세포를 배양하였다. 이어, 배양된 세포를 PBS로 세척하고, 500 ㎕의 트리클로로아세트산(TCA)를 가하여 30분 동안 반응시켰다. 이어, TCA를 제거하고, 세척용액(에탄올/에테르, 1:1 (v/v))으로 세척한 다음, 500 ㎕의 NaOH를 가하여 세포를 용해시켰다. 이어서, 세포용해물에 5 ㎖의 섬광계수용 혼합액(scintillation cocktail)을 가하고, 방사선량을 측정하여, 합성된 DNA의 상대적인 양을 비교하였다. 도 2에는 혈소판 유래 성장인자가 처리된 대동맥 평활근세포의 DNA 합성에 대한, 클라이토싸이빈의 처리 농도에 따른 DNA 합성 억제효과가 그래프로 도시되어 있다. 도 2에서 확인되는 바와 같이, 클라이토싸이빈의 처리 농도가 증가할수록 대동맥 평활근세포의 DNA 합성량이 감소하였다. 따라서, 실시예 1에서 확인된 클라이토싸이빈에 의한 대동맥 평활근세포의 증식억제 효과는 클라이토싸이빈이 대동맥 평활근세포의 DNA 합성을 억제하기 때문에 발생함을 알 수 있었다.

3. 급성 독성 실험 결과

독성 실험 수행 결과, 4군 모두에서 사망한 예를 전혀 관찰할 수 없었고, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 발명의 화합물이 안전한 약물임을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

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(a) 하기 화학식 2, 화학식 3, 또는 화학식 4로 표시되는 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관내피세포 손상에 의해 유도되는 혈관평활근세포의 증식에 의한 혈관재협착증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]
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제 3 항에 있어서, 상기 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물은 1 - 50μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
하기 화학식 2, 화학식 3, 또는 화학식 4로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관내피세포 손상에 의해 유도되는 혈관평활근세포의 증식에 의한 혈관재협착증의 완화 또는 개선 용도의 기능성 식품 조성물.
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]
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제 7 항에 있어서, 상기 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물은 1 - 50μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
하기 화학식 2, 화학식 3, 또는 화학식 4로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관내피세포 손상에 의해 유도되는 혈관평활근세포의 증식에 의한 혈관재협착 방지를 위한 스텐트 코팅용 조성물.
[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]