KR20090064987A

KR20090064987A - 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주엔테로박터 루드위기 ｋｕ201-3(ｋａｃｃ91341ｐ) 및 이를포함하는 가축 사료 첨가용 미생물제제

Info

Publication number: KR20090064987A
Application number: KR1020070132386A
Authority: KR
Inventors: 곽완섭; 허정원; 오영균; 양시용; 김영일; 정세형
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-17
Filing date: 2007-12-17
Publication date: 2009-06-22
Also published as: KR100950113B1

Abstract

본 발명은 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3)(KACC91341P) 및 이를 포함하는 가축 사료 첨가용 미생물제제에 관한 것으로서, 버섯폐배지에서 분리한 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3)(KACC91341P)에 관한 것이다. 또한 이의 순수배양물 또는 순수배양물의 유효량과 첨가제를 혼합하는 것을 특징으로 하는 가축 사료 첨가용 미생물제제에 관한 것이다.

엔테로박터 루드위기, 가축사료, 미생물제제

Description

섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기 ＫＵ201-3(ＫＡＣＣ91341Ｐ) 및 이를 포함하는 가축 사료 첨가용 미생물제제{A new strain Enterobacter ludwigii KU201-3(KACC91341P) having cellulase and lignolytic activity and animal feed additive microbial agent comprising thereof}

본 발명은 버섯폐배지에서 분리한 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3)(KACC91341P)에 관한 것이다.

본 발명은 신균주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3)(KACC91341P)를 이용한 가축 사료 첨가용 미생물제제에 관한 것이다.

버섯은 수분, 탄수화물, 조단백, 조지방, 조섬유, 회분으로 구성되면서 단백질과 필수아미노산 조성이 좋을 뿐만이 아니라 미량원소도 풍부하여 단백질 공급원으로 중요한 역할을 하고 있으며, 성인병 및 항암효과가 입증되어 식품적 가치가 높은 것이다. 버섯은 맛과 향이 좋고 각종 영양성분이 많이 함유되어 있음은 물론, 다당류들은 항암 및 면역조절 작용을 하는 것으로 알려져 있어서 건강식품으로 사 용되고 있는 것인데, 이러한 버섯을 재배하고 난 배지에는 가축에게 유익한 많은 양의 영양원을 포함하고 있다.

특히 버섯과 버섯배지에 포함되어 있는 베타 글루칸(β-Glucan)과 같은 다당류는 세포조직의 면역기능을 활성화시켜서 암세포의 증식과 전이를 방지하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 버섯 재배에 사용되는 배지는 많은 영양소가 들어 있지만 다량의 섬유질을 포함하고 있어서 가축이 소화하기 어려운 점이 있으나, 버섯이 재배되는 과정에서 버섯이 섬유질을 흡수하여 분해시킴으로서 소화가 용이하게 되어 버섯 부산물에는 소화 양분이 높아져서 비타민 미네랄 등의 영양원을 효과적으로 이용할 수 있다. 이렇게 버섯 폐배지는 섬유소 함량이 높고 난분해성 물질이 많이 포함되어 있기 때문에 버섯 폐배지에서 분리된 미생물은 섬유소 및 난분해성 물질을 분해할 수 있는 능력을 가지고 있을 확률이 크다. 따라서 버섯 폐배지에서 분리된 미생물을 적절하게 사용하면 유익한 미생물이 활동을 촉진해서 가축의 사료 분해 작용을 돕는 가축사료에 유용하게 사용될 수 있는 미생물제제를 제조할 수 있다.

한국특허출원번호 10-2001-0006282호(출원일 2001.02.09)는 사료 첨가용 미생물제 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 가축의 증체, 사료효율 개선 및 축산분뇨에 의한 악취 발생을 감소시키는 가축 사료 첨가용 미생물제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 주로 치즈나 간장과 같은 식품 및 알코올 제조에만 이용되어온 종래의 뮤커 속 미생물과 달리 가축의 증체 및 축산 분뇨에 의한 악취발생억제 효율이 있는 것으로 동정된 신규한 뮤커 속 균주 KFCC-11239에 관하여 개시하고 있다.

한국특허출원번호 10-2001-0047829호(출원일 2001.08.09)는 사료 첨가용 미생물 제제와 그 제조방법에 관한 것이다. 유산균인 락토바실루스 아밀로필루스와 효모인 사카로마이세스 세레비시애와, 고초균인 바실루스 섭틸리스를 각각 배양한 다음, 제올라이트와 탈지강 혼합물에 흡착 고정시키고, 25∼30 ℃의 인큐베이터에서 48∼72시간 동안 숙성시킨 다음, 수분 함량을 10∼12 % 이하로 건조시켜 만든 락토바실루스 아밀로필루스 흡착물, 사카로마이세스 세레비시애 흡착물, 바실루스 섭틸리스 흡착물을 5 : 3 : 2의 비율로 배합한 다음 250 ∼ 300 메쉬 크기로 파쇄한 사료 첨가용 미생물 제제에 관하여 개시하고 있다.

국제특허출원번호 PCT/AU2000/00021호(출원일 2000.01.14)는 제품 내에서 증가된 성장/수확 가능성 또는 증가된 생존율/회수율을 갖는 미생물 제제로서, 난소화성 전분을 기질로 하거나 난소화성 전분을 함유하는 배지에서 성장 또는 배양시킨 미생물을 포함하는 제제; 그 제조 방법 및 미생물 제제를 함유하는 제품을 제공한다.

상기와 같이 여러 가지 사료 첨가용 미생물제제에 관하여 개시되었지만, 본 발명에서 분리되고 사용된 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3) (KACC91341P)에 대한 언급은 어디에도 없다.

따라서 본 발명자들은 버섯 폐배지의 성상에 가장 알맞은 미생물제제 개발에 목표를 두고 버섯 폐배지 전용 발효 미생물제의 개발을 위해 관련 버섯 폐배지에서 미생물을 분리하고 동정하였다.

본 발명은 버섯폐배지에서 분리한 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3)(KACC91341P)을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 신균주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(Enterobacter ludwigii KU201-3)(KACC91341P) 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 가축사료 첨가용 미생물제제 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)를 제공한다.

본 발명은 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 가축 사료 첨가용 미생물제제를 제공한다.

본 발명은 배양배지를 준비하는 단계; 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)를 배양하는 단계; 상기 배양액을 수거하는 단계; 상기 수거된 배양액과 첨가제를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가축 사료 첨가용 미생물제제 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제 1의 양태는 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)를 제공한다.

본 발명에 따른 균주는 최적 성장을 위한 질소원으로는 대두박 1%와 탄소원으로는 sucrose 2% 이었다. 균 성장시 포자는 형성되지 않으며, 콜로니 형성 시 쌀과 같이 명도가 어두운 흰색을 뛴다. 중온(36℃)에서 성장이 왕성하며, pH는 6~7 범위가 최적이다. 또한 본 발명에 따른 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 균주는 2007년 12월 5일 농업생명공학연구원에 기탁번호 KACC91341P로 균주기탁되었다.

본 명세서에 사용된 "섬유소 분해 활성"은 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase; CMCase), 아밀라아제(amylase) 또는 자일라나아제(xylanase) 활성이다. 프로테아제는 단백질 분해 효소이고, 셀룰라아제는 셀룰로오스(cellulose) 분해 효소이고, 아밀라아제는 녹말 분해 효소이고, 자일라나아제는 자일란(xylan) 분해 효소이다.

본 명세서에 사용된 "리그닌 분해 활성"은 락카아제(laccase) 활성이다. 락카아제는 폴리페놀 산화효소(polyphenol oxidase)라고도 하며, 리그닌 중의 페놀 잔기를 퀴논으로 산화함으로써 복잡한 리그닌 분자를 분해한다.

본 발명의 제 2의 양태는 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 가축 사료 첨가용 미생물제제를 제공한다.

본 발명의 제 3의 양태는 배양배지를 준비하는 단계; 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)를 배양하는 단계; 상기 배양액을 수거하는 단계; 상기 수거된 배양액과 제오라이트를 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가축 사료 첨가용 미생물제제 제조방법을 제공한다.

본 발명의 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P) 균주는 균주 자체, 또는 이의 배양체, 이의 추출물 또는 이의 포자 단독으로 담체와 혼합하여 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 가축 사료 첨가용 미생물 제제로서 사용할 수 있으며, 상기 담체로는 물, 화이트 카르본, 카올린, 제오라이트 등을 사용할 수 있다.

제형화된 미생물 제제는 가축사료에 첨가함으로써 가축의 사료 분해 작용을 돕는 가축사료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 버섯 폐배지로부터 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 균주들의 분리

1. 시료준비

미생물 분리를 위한 폐배지 시료는 초여름에 버섯종류에 따라서 폐배지 5점을 수거하였다. 팽이버섯 폐배지는 충주시 가금면에 위치한 충주농원에서 채취하였으며 이때 폐배지의 온도는 41℃였다. 새송이버섯폐배지는 충주시 노은면에 위치한 농장에서 채취하였으며, 채취간 폐배지의 중심부 온도가 높게 올라가서 고온인 부분(57℃)과 중온인 부분(40℃)에서 각각 시료를 채취하였다. 느타리버섯 폐배지는 충주시 가금면에 위치한 농장에서 채취하였으며, 이때의 폐배지의 온도는 38℃이었다.

2. 미생물 분리

수집한 각각의 시료 10g을 190㎖의 멸균수에 넣고 분쇄(Homogenizer, Heidalph diax 900)한 후 연속적인 희석(serial dilution)에 의해 적정 희석하였다. 희석액을 평판 계수 아가(plate count agar; PCA, 카제인 펩톤 5g, 효모 추출물 2.5g, 덱스트로즈 1.0g, 아가 15g), MRS 아가, 뇌-심장 혼합(brain heart infusion; BHI) 아가, 효모 및 맥아 추출물(yeast & malt extract; YM) 아가, 감자 덱스트로즈 아가(potatoes dextrose Agar; PDA) 배지에 각각 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다(표 1).

배양 후 형성된 colony 형태에 따라 세균은 PCA, 효모와 곰팡이(yeast, molds)는 PDA 배지에 순수분리 배양하였다. 분리균주는 총 367개로 세균 290개, 곰팡이 77개 균주가 분리되었다.

< 배양 배지의 조성 >

배지	조성	g/L
PCA	카제인 펩톤(casein peptone)	5.0
	효모 추출물(yeast extract)	2.5
	덱스트로즈(dextrose)	1.0
	아가(agar)	15.0
MRS	프로테오스 펩톤(proteos peptone) No.3	10.0
	육 추출물(beef extract)	10.0
	효모 추출물(yeast extract)	5.0
	덱스트로즈(dextrose)	20.0
	폴리소르베이트 80(polysorbate 80)	1.0
	암모니움 시트레이트(ammonium citrate)	2.0
	소디움 아세테이트(sodium acetate)	5.0
	마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)	0.1
	망가네즈 설페이트(manganese sulfate)	0.05
	디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate)	2.0
	아가(agar)	15.0
BHI	송아지 뇌 혼합물(calf brain infusion, 200g)	7.7
	소 심장 혼합물(beef heart infusion, 250g)	9.8
	프로테오즈 펩톤(proteose peptone)	10.0
	덱스트로즈(dextrose)	2.0
	소디움 클로라이드(sodium chloride)	5.0
	디소디움 포스페이트(disodium phosphate)	2.5
	아가(agar)	15.0
YM	효모 추출물(yeast extract)	3.0
	맥아 추출물(malt extract)	3.0
	펩톤(pepton)	5.0
	덱스트로즈(dextrose)	10.0
	아가(agar)	15.0
PDA	감자(potatoes)	4.0
	덱스트로즈(dextrose)	20.0
	아가(agar)	15.0

3. 미생물 선발

(1) 섬유소 분해효소 생산 균주 선발

폐배지는 섬유소함량이 높고 난분해성 물질이 많이 포함되어 있기 때문에 폐배지에서 분리된 균주들 중 섬유소 분해효소로서 자일라나아제(xylanase) 또는 셀룰라아제(cellulase; CMCase) 활성을 나타내는 균주들을 1차적으로 선발하였다. 분리된 균주들을 셀룰로즈(cellulose)와 자일란(xylan)을 기질로 1% 함유한 스크리닝 배지를 이용하여 30℃ 배양조건에서 배양 후 클리어 존(clear zone)을 나타내는 균주들을 선발하였다. 자일라나아제(xylanase)는 배양 후 형성된 클리어 존(clear zone)을 바로 평가하였고, 셀룰라아제(cellulase)의 경우 배양 후 배지를 콩고 레드(congo red) 염색용액으로 염색한 다음 1M NaCl로 세척하여 나타나는 클리어 존(clear zone)을 평가하였다.

1차 균주선발 결과 25 균주를 선발하였으며, 선발된 균주를 표 1에서 제시 된 배지를 이용하여 셀룰라아제(cellulase), 자일라나아제(xylanase), 아밀라아제(amylase) 및 프로테아제(protease) 효소활성을 측정하였다. 발효시의 고온조건을 고려하여 50℃ 고온조건에서의 효소활성도 및 성장도도 동시에 분석하였다. 클리어 존(Clear zone)은 표 2와 같이 염색하여, 크기에 따라 ‘+++’, ‘++’, ‘+’, ‘-’로 기록 평가하였다(표 3).

< 여러 효소 활성 검출을 위해 사용된 스크리닝 배지 및 염료 >

효소	기질	염료	확인
프로테아제 (Protease)	2% (w/v) 스킴 밀크 (skim milk)		클리어 존
셀룰라아제 (Cellulase; CMCase)	1% (w/v) CMC¹	0.2% (w/v) 콩고 레드 용액	클리어 존
아밀라아제 (Amylase)	1% (w/v) 수용성 전분 (soluble starch)	0.2% (w/v) I₂ + 2%(w/v)KI 용액	클리어 존
자일라나아제 (Xylanase)	1% (w/v) 오트 소비 자일란 (oat spelt xylan)		클리어 존

^*기본 배지: 카제인 펩톤(casein peptone) 5g, 효모 추출물(yeast extract) 2.5g, 덱스트로즈(dextrose) 1g, 아가(agar) 15g/ℓ

¹카르복시메틸 셀룰로즈(Carboxymethyl cellulose) - 배지 점도(medium viscosity)

< 선별된 25 균주의 효소 활성 >¹

균주 번호	효소 활성(Enzyme activity)²
	30℃				50℃
	자일라나아제	셀룰라아제	아밀라아제	프로테아제	자일라나아제	셀룰라아제	아밀라아제	프로테아제
7	++	++	++	++	-	+++	++	+++
11	++	++	++	++	-	+++	+++	++
12	++	+	++	++	-	+++	+++	++
89	++	++	+++	++	-	+++	++	++
95	+	++	++	+++	-	+++	++	++
96	+	++	++	+++	-	+++	++	++
97	++	++	+	+++	-	++	+++	++
101	+	+++	+++	++	-	+++	++	++
104	++	+++	++	++	-	+++	+++	++
127	++	++	+++	++	-	++	+++	+++
135	++	+	+	-	-	-	+	-
148	-	++	+	-	+	+++	+++	++
153	-	++	+	-	+	-	++	-
161	+	+	++	-	+	++	++	+
162	+	+	++	-	+	+++	++	-
169	-	++	+	-	+	+	-	-
196	+	++	+++	+++	-	+++	+++	++
198	+	++	+++	+++	-	-	+++	++
201	+	+	++	+++	-	+	++	++
203	+	+	++	+	-	++	+	+
205	+	+	+++	+++	-	+++	+	+
206	-	++	+++	+++	+	+++	+	+
207	-	++	+	+++	+	+++	++	+
208	-	+	+	-	+	++	++	+
216	+++	+++	+	-	-	+++	+	+

¹성장률은 평판 계수 아가에 24시간 배양한 후에 측정되었다.

²+++ 는 스크리닝 배지에서 우수한 클리어 존 형성을 표시; ++ 좋음; + 중간; - 음성

(2) 리그닌(Lignin) 분해 활성 미생물 선발

섬유소 분해효소 활성을 나타내는 선발된 균주들을 대상으로 변색환 생성여부를 통한 리그닌 분해 활성 및 탄소원을 리그닌으로 한 액체배지(broth)에서의 균주 성장성을 통한 리그닌 분해 이용성을 나타내는 균주를 선발하였다.

변색환을 이용한 리그닌분해효소 활성 균주 선발을 위해 PCA배지에 0.05% 레마졸 브릴런트 블루 R(rhemazol brilliant blue R; RBBR), 0.01% 구아이아콜(guaiacol; GU), 0.1% 갈릭산(galic acid; GA)이 각각 첨가된 아가 플레이트(agar plate)에 6종의 선발된 균주를 접종하여 30℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 리그닌 분해성이 있는 균이 접종된 배지에서는 균 주위에 변색환이 붉게 형성이 되는데 변색환의 크기를 클리어 존(clear zone) 측정방법과 동일하게 측정하여 균주를 선발하였다.

분석 결과 표 4에 나타난 바와 같이 RBBR과 구아이아콜(guaiacol)을 함유한 배지에서는 변색환을 나타내는 균주가 없었으나, 갈릭산(galic acid)를 함유한 배지에서 4개 균주(NO. 196, 201, 206, 208)에서 변색환을 나타내어 리그닌분해활성이 있는 것으로 나타났다. 특히, 206번이 가장 우수한 효소활성을 나타내었다. 196번, 201번, 208번은 동일한 효소활성을 보였으나, 탄소원을 리그노설포닉산(lignosufonic acid)으로 첨가한 배지에서의 성장성 분석결과 및 섬유소 분해효소 활성 등을 종합적으로 검토하여 최종적으로 201과 206번 균주를 선발하였고, 201 균주는 KU201-3으로 명명하였다

< 선별된 6 종의 미생물의 리그닌 분해 활성 >¹

균주번호	30℃에서 리그닌 분해 활성(Lignolytic activity)²
균주번호	레마졸 브릴런트 블루 R (Rhemazol brilliant blue R)	구아이아콜 (Guaiacol)	갈릭산 (Galic acid)
96	-	-	-
162	-	-	-
196	-	-	++
201	-	-	++
206	-	-	+++
208	-	-	++

¹성장률은 평판 계수 아가에 48시간 배양한 후에 측정되었다.

(3) 효소활성 측정을 통한 리그닌(Lignin) 분해성 측정

① 락카아제(Laccase) 활성

선발균주 KU201-3, 206번에 대하여 락카아제(Laccase) 활성 측정결과 KU201-3번에서 배양 8시간에서 0.716 unit/min으로 나타났다(도 1).

락카아제 활성 측정을 위해서 조효소액 1.9ml과 PBS(pH 7.0)을 혼합하여, 5mM의 p-페닐에네디아민(phenylenediamine) 0.3ml을 첨가한 즉시 525ml에서 흡광도를 측정하고, 이후 매분마다 흡광도를 측정하여 활성을 다음 식으로 계산하였다(Morohoshi, N. et al. 1985. Tokyo Univ. of Agri. and Tech. 21:101-105).

효소활성(unit/min) = ΔE/Δt x 15.3846

ΔE = 흡광도

Δt = 반응시간(min)

② 망가나아제 퍼록시다아제(Manganase peroxidase) 활성

선발균주인 KU201-3, 206번에 대하여 망가나아제 퍼록시다아제(Manganase peroxidase)를 배양시간대별 측정을 하였으나, 효소 활성은 없는 것으로 나타났다.

(4) 선발균주의 성장곡선 측정

선발균주인 KU201-3번과 206번은 PCA 배지에서 총균수를 측정하여 성장곡선을 측정한 바, 두 균주가 성장속도가 우수하였으며 KU201-3번 균주가 206번 균주에 비해 다소 유도기가 짧았으며, 12시간에서 대수기가 종료가 되고 정상기에 도달하였다(도 2).

< 실시예 2 > 버섯 폐배지로부터 분리된 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 균주들의 동정

(1) 분리균주 KU201-3의 동정

선발균주의 동정은 계통 세균학의 버게이 메뉴얼(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology)에 준하여 동정하였다. 분리균주의 생리 및 생화학적 특성파악을 위해 API 50 키트(Bio-Merieux, 프랑스)를 이용하여 당 발효/이용성을 조사하였으며, 세포 지방산 프로파일(cellular fatty acid profiles), 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다.

분리균주 KU201-3의 API 50 키트를 이용한 당 발효/이용성은 표 5와 같다. 본 균주는 리보즈(ribose), 글루코즈(glucose), 프록토즈(fructose), N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine), 에스쿨린(esculine), 살리신(salicine), 셀로바이오스(cellobiose), 말토즈(maltose), 사카로즈(sacchorose), 트레할로즈(trehalose), 아미돈(amidon), 글리코젠(glycogene)을 발효/이용하여 산을 생성하는 것으로 나타났다. 세포내 구성 지방산 함량은 표 6과 도 3에 나타난 바와 같이 C15:0 ISO가 가장 높고, C13:0 ISO 등의 함량이 높았다. 16S rDNA의 유전자 분석을 행한 결과는 서열번호 1에 나타내었다. 이를 근거로 대조 균주와 비교하여 % 유사성(similarity)을 구한 결과, 본 균주 KU201-3은 엔테로박터(Enterobacter) 속에 속하는 세균으로 판명되었으며 엔테로박터 루드위기(Enterobacter ludwigii)의 표준균주와 98%의 유사도를 나타내어 가장 가까운 균이라 할 수 있다. 또한, 네이버 조이닝 방법(Neighbor joining method)에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때 계통수의 스케일 바(scale bar)는 사이트 당 0.01 치환(0.01 substitution per site)을 의미한다.

이상과 같이 KU201-3 균주의 특성을 검토한 결과 KU201-3 균주는 엔테로박터 루드위기(Enterobacter ludwigii)의 유연균으로 분류되었으며, 최종적으로 엔테로박터 루드위기(Enterobacter ludwigii) KU201-3으로 동정되었다. 또한 엔테로박터 루드위기(Enterobacter ludwigii) KU201-3은 2007년 12월 5일, 농업생명공학연구원에 기탁번호 KACC91341P로 균주기탁되었다.

< 분리균주 KU201-3의 생화학적 특성(탄수화물) >¹

특성(Characteristics)	KU201-3	특성(Characteristics)	KU201-3
글리세롤(Glycerol)	-	에스쿨린(Esculine)	+
에르티쓰리톨(Ertythritol)	-	살리신(Salicine)	+
D - 아라비노스(Arabinose)	-	셀로바이오스(Cellobiose)	+
L - 아라비노스(Arabinose)	-	말토즈(Maltose)	+
리보스(Ribose)	+	락토즈(Lactose)	+
D - 자일로스(Xylose)	-	멜리바이오스(Melibiose)	-
L - 자일로스(Xylose)	-	사카로즈(Saccharose)	+
아도니톨(Adonitol)	-	트레랄로스(Trehalose)	+
β 메틸-자일로사이드 (β Methyl-xyloside)	-	인눌린(Inuline)	-
Galactose	-	멜레지토스(Melezitose)	-
D - 글루코즈(Glucose)	+	D - 라피노즈(Raffinose)	-
D - 프록토즈(Fructose)	+	아미돈(Amidon)	+
D - 맨노즈(Mannose)	-	글리코겐(Glycogen)	+
L - 소보즈(sorbose)	-	자일리톨(Xylitol)	-
램노즈(Rhamnose)	-	β 젠티오바이오스(Gentiobiose)	-
둘시톨(Dulcitol)	-	D - 투라노스(Turanose)	-
이노시톨(Inositol)	-	D - 리소스(Lyxose)	-
맨니톨(Mannitol)	-	D - 타가토즈(Tagatose)	-
소르비톨(Sorbitol)	-	D - 푸코즈(Fucose)	-
α 메틸-D-맨노사이드 (α Methyl - D - mannoside)	-	L - 푸코즈(Fucose)	-
α 메틸-D-글루코사이드 (α Methyl - D - glucoside)	-	D - 아라비톨(Arabitol)	-
N 아세틸 글루코사민 (N acetyl glucosamine)	+	L - 아라비톨(Arabitol)	-
아미그달린(Amygdaline)	-	글루코네이트(Gluconate)	-
알부틴(Arbutine)	-	2 아세토-글루코네이트 (2 aceto-gluconate)	-
		5 아세토-글루코네이트 (5 aceto-gluconate)	-

¹ '+'= 양성; '-'= 음성

< 분리균주 KU201-3의 세포 지방산 조성 >

지방산	%
C9:0	0.19
C11:0 ISO	0.51
C12:0 ISO	1.30
C12:0	0.77
C13:0 ISO	20.97
C13:0 ANTEISO	1.57
C14:0 ISO	3.82
C14:0	3.54
C15:0 ISO	35.37
C15:0 ANTEISO	2.91
C15:0	-
C16:1 w7c 알콜	0.97
C16:0 ISO	3.12
C16:0	2.28
C15:0 2OH	0.89
ISO C17:1 w10c	1.86
ISO C17:1 w5c	4.06
C17:1 ANTEISO A	-
C17:0 ISO	4.71
C17:0 ANTEISO	-

(2) 분리균주 206의 동정

분리균주 206의 API 50 키트를 이용한 당 발효/이용성은 표 7과 같다. 본 균주는 글리세롤(glycerol), 리보스(ribose), 글루코즈(glucose), 프록토즈(fructose), 맨니톨(mannitol), N 아세틸 글루코사민(acetyl glucosamine), 아미그달린(amygdaline), 아르부틴(arbutine), 에스쿨린(esculine), 살리신(salicine), 셀로바이오스(cellobiose), 말토즈(maltose), 락토즈(lactose), 사카로즈(saccharose), 트레할로즈(trehalose), 아미돈(amidon), 그리코젠(glycogene)을 발효 또는 이용하여 산을 생성하는 것으로 나타났다.

세포내 구성 지방산 함량은 도 5와 표 8에 나타난 바와 같이 15:0 ISO가 가장 높고, C13:0 ISO 등의 함량이 높았다. 16S rDNA의 유전자 분석을 행한 결과는 서열번호 2에 나타내었다. 이를 근거로 대조 균주와 비교하여 % 유사성(similarity)을 구한 결과, 본 균주 206은 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 세균으로 판명되었으며 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 표준균주와 99%의 유사도를 나타내어 가장 가까운 균이라 할 수 있다. 또한, 네이버 조이닝 방법(Neighbor joining method)에 의하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때 계통수의 스케일 바(scale bar)는 사이트당 0.01 치환(0.01 substitution per site)을 의미한다.

이상과 같이 206 균주의 특성을 검토한 결과 206 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 유연균으로 분류되었으며, 최종적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 206으로 동정하였다.

< 분리균주 206의 생화학적 특성(탄수화물) >¹

특성(Characteristics)	206	특성(Characteristics)	206
글리세롤(Glycerol)	+	에스쿨린(Esculine)	+
에르티쓰리톨(Ertythritol)	-	살리신(Salicine)	+
D - 아라비노스(Arabinose)	-	셀로바이오스(Cellobiose)	+
L - 아라비노스(Arabinose)	-	말토즈(Maltose)	+
리보스(Ribose)	+	락토즈(Lactose)	+
D - 자일로스(Xylose)	-	멜리바이오스(Melibiose)	-
L - 자일로스(Xylose)	-	사카로즈(Saccharose)	+
아도니톨(Adonitol)	-	트레랄로스(Trehalose)	+
β 메틸-자일로사이드 (β Methyl-xyloside)	-	인눌린(Inuline)	-
Galactose	-	멜레지토스(Melezitose)	-
D - 글루코즈(Glucose)	+	D - 라피노즈(Raffinose)	-
D - 프록토즈(Fructose)	+	아미돈(Amidon)	+
D - 맨노즈(Mannose)	-	글리코겐(Glycogen)	+
L - 소보즈(sorbose)	-	자일리톨(Xylitol)	-
램노즈(Rhamnose)	-	β 젠티오바이오스(Gentiobiose)	-
둘시톨(Dulcitol)	-	D - 투라노스(Turanose)	-
이노시톨(Inositol)	-	D - 리소스(Lyxose)	-
맨니톨(Mannitol)	+	D - 타가토즈(Tagatose)	-
소르비톨(Sorbitol)	-	D - 푸코즈(Fucose)	-
α 메틸-D-맨노사이드 (α Methyl - D - mannoside)	-	L - 푸코즈(Fucose)	-
α 메틸-D-글루코사이드 (α Methyl - D - glucoside)	-	D - 아라비톨(Arabitol)	-
N 아세틸 글루코사민 (N acetyl glucosamine)	+	L - 아라비톨(Arabitol)	-
아미그달린(Amygdaline)	+	글루코네이트(Gluconate)	-
알부틴(Arbutine)	+	2 아세토-글루코네이트 (2 aceto-gluconate)	-
		5 아세토-글루코네이트 (5 aceto-gluconate)	-

¹ '+'= 양성; '-'= 음성

< 분리균주 206의 세포 지방산 조성 >

지방산	%
C12:0 ISO	2.02
C12:0	1.20
C13:0 ISO	20.07
C13:0 ANTEISO	2.14
C14:0 ISO	5.33
C14:0	4.71
C15:0 ISO	27.27
C15:0 ANTEISO	3.55
C15:0	0.61
C16:1	0.85
C16:0 ISO	4.54
C16:0	5.46
C15:0 2OH	0.59
ISO C17:1 w10c	1.86
ISO C17:1 w5c	3.03
C17:1 ANTEISO A	0.76
C17:0 ISO	4.60
C17:0 ANTEISO	0.73

< 실시예 3 > 엔테로박터 루드위기 ( Enterobacter ludwigii ) KU201 -3 [KACC91341P]을 포함하는 미생물제제 제조

1. 버섯폐배지 전용 발효제 시제품 생산

(1) 종균의 액상 배양

- PCB(Plate count broth)를 이용하여 36℃에서 12시간 배양한 액상 종균을 배양한다.

항목	g/ℓ
카제인 분해물(Pancreatic digest of casein)	5
효모 추출물(Yeast extract)	2.5
덱스트로즈(Dextrose)	1

(2) 농산가공부산물을 이용한 종균의 대량 배양

- 엔테로박터 루드위기(Enterobacter ludwigii) KU201-3의 대량생산을 위해 대두박 및 미강을 이용한 대량 배양을 통하여 균주를 생산한다.

- 대두박과 미강의 혼합비율은 8 : 2로 하며 이때 균주의 성장을 촉진하기 위하여 당밀을 건물의 2%수준에서 첨가한다.

- 액상배양된 종균을 5% 수준에서 농산가공부산물을 이용한 고상배지에 접종한다.

- 36℃ 배양기에서 48시간 배양한다.

(3) 엔테로박터 루드위기(Enterobacter ludwigii) 201-3 배양물의 건조

- 최적의 균수를 보장하기 위하여 통풍식 건조 오븐을 이용하여 40℃에서 48시간 건조한다.

(4) 시제품의 활용

- 제조된 시제품은 25kg 단위로 포장하여 버섯폐배지 발효사료 제조간 발효 촉진제로 활용

본 발명에 따른 신규주 엔테로박터 루드위기 KU201-3(KACC91341P)은 버섯폐배지에서 분리한 섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 균주이다. 버섯폐배지에는 난분해성 물질이 많이 포함되어 있기 때문에, 버섯 폐배지에서 분리된 미생물은 난분해성 물질 분해 활성이 우수하다. 따라서 본 발명에 사용된 엔테로박터 루드위기 KU201-3(KACC91341P)을 적절하게 사용하면 섬유질 함량이 높은 가축의 사료에도 본 균주가 사료 분해 작용을 도와 가축사료에 유용하게 사용될 수 있는 미생물제제를 제조할 수 있다.

도 1은 KU201-3 균주의 락카아제 활성 및 세포 성장을 나타낸다.

도 2는 KU201-3 및 206 균주의 세포 성장을 나타낸다.

도 3은 분리균주 KU201-3의 세포 지방산 가스 크로마토그램을 나타낸다.

도 4는 분리균주 KU201-3의 계통수를 나타낸다.

도 5는 분리균주 206의 세포 지방산 가스 크로마토그램을 나타낸다.

도 6은 분리균주 206의 계통수를 나타낸다.

<110> Konkuk university industrial cooperation agency <120> A new strain Enterobacter ludwigii KU201-3(KACC91341P) having cellulase and lignolytic activity and animal feed additive microbial agent comprising thereof <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1449 <212> DNA <213> Enterobacter ludwigii KU201-3 <400> 1 ggggactgcg gcaggctacc atgcaagtcg aacggtagca cagagagctt gctctcgggt 60 gacgagtggc ggacgggtga gtaatgtctg ggaaactgcc tgatggaggg ggataactac 120 tggaaacggt agctaatacc gcataacgtc gcaagaccaa agagggggac cttcgggcct 180 cttgccatca gatgtgccca gatgggatta gctagtaggt ggggtaacgg ctcacctagg 240 cgacgatccc tagctggtct gagaggatga ccagccacac tggaactgag acacggtcca 300 gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggcgcaagcc tgatgcagcc 360 atgccgcgtg tatgaagaag gccttcgggt tgtaaagtac tttcagcggg gaggaaggtg 420 ttgtggttaa taaccgcagc aattgacgtt acccgcagaa gaagcaccgg ctaactccgt 480 gccagcagcc gcggtaatac ggagggtgca agcgttaatc ggaattactg ggcgtaaagc 540 gcacgcaggc ggtctgtcaa gtcggatgtg aaatccccgg gctcaacctg ggaactgcat 600 tcgaaactgg caggctagag tcttgtagag gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa 660 tgcgtagaga tctggaggaa taccggtggc gaaggcggcc ccctggacaa agactgacgc 720 tcaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780 cgatgtcgac ttggaggttg tgcccttgag gcgtggcttc cggagctaac gcgttaagtc 840 gaccgcctgg ggagtacggc cgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac 900 aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct actcttgaca 960 tccagagaac ttagcagaga tgctttggtg ccttcgggaa ctctgagaca ggtgctgcat 1020 ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080 atcctttgtt gccagcggtc cggccgggaa ctcaaaggag actgccagtg ataaactgga 1140 ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac acacgtgcta 1200 caatggcgca tacaaagaga agcgaactcg cgagagcaag cggacctcat aaagtgcgtc 1260 gtagtccgga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtag 1320 atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg 1380 gagtgggtgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc acttgtgatn 1440 cagaacggg 1449 <210> 2 <211> 1429 <212> DNA <213> Bacillus cereus 206 <400> 2 agcagggggc tatctgcagt cggcgatgga ttagagcttg ctcttatgaa gttagcggcg 60 gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cataagactg ggataactcc gggaaaccgg 120 ggctaatacc ggataacatt ttgaaccgca tggttcgaaa ttgaaaggcg gcttcggctg 180 tcacttatgg atggacccgc gtcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc 240 aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag 300 actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa 360 cgccgcgtga gtgatgaagg ctttcgggtc gtaaaactct gttgttaggg aagaacaagt 420 gctagttgaa taagctggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480 gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc 540 gcgcgcaggt ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat 600 tggaaactgg gagacttgag tgcagaagag gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa 660 tgcgtagaga tatggaggaa caccagtggc gaaggcgact ttctggtctg taactgacac 720 tgaggcgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 780 cgatgagtgc taagtgttag agggtttccg ccctttagtg ctgaagttaa cgcattaagc 840 actccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960 atcctctgaa aaccctagag atagggcttc tccttcggga gcagagtgac aggtggtgca 1020 tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080 tgatcttagt tgccatcatt aagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga 1140 ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200 caatggacgg tacaaagagc tgcaagaccg cgaggtggag ctaatctcat aaaaccgttc 1260 tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320 atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga 1380 gagtttgtaa cacccgaagt cggtggggta accttttgga gccagccgc 1429

Claims

섬유소 분해 및 리그닌 분해 활성을 가진 신균주 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P).
제1항의 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)의 순수배양물을 유효성분으로 함유하는 가축 사료 첨가용 미생물제제.
배양배지를 준비하는 단계;

제1항의 엔테로박터 루드위기(Enterobater ludwigii) KU201-3 (KACC91341P)를 배양하는 단계;

상기 배양액을 수거하는 단계;

상기 수거된 배양액과 첨가제를 혼합하는 단계; 및

상기 혼합물을 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 가축 사료 첨가용 미생물제제 제조방법.