KR20090039649A

KR20090039649A - 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20090039649A
Application number: KR1020080102060A
Authority: KR
Inventors: 황재관; 심재석; 권송희; 권이영; 오현인; 한영선; 최은정
Original assignee: (주)바이오케어
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2009-04-22
Also published as: JP2011500669A; EP2200574A4; US20120065272A1; EP2200574B1; EP2200574A1; JP2014111660A; WO2009051434A1; US20160271028A1; CN101827576B; KR101088069B1; JP5931944B2; CN101827576A

Abstract

본 발명은 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 조성물에 관한 것이다. 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 세포증식을 유도하고 콜라겐 분해를 저지하며 콜라겐 합성을 촉진하므로 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선, 예방 또는 치료 효과가 탁월하여 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.

판두라틴 유도체, 카엠페리아 판두라타, 추출물, 주름, 항노화

Description

판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 신규한 용도{Novel use of Panduratin derivatives or extract of Kaempferia pandurata comprising the same}

본 출원은 2007년 10월 17일자로 출원된 대한민국 특허출원 제2007-0104788호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 발명의 참고문헌이다.

본 발명은 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다.

노화는 크게 자연노화 혹은 내인성 노화와 외적 노화로 구분되며 자연노화는 유전적 원인에 의한 것이므로 조절이 어려우나 외적 노화는 환경적 원인에 의한 것이므로 인위적인 조절이 용이하다. 따라서 외적 노화를 방지하기 위한 연구가 지속되어 왔으며, 특히 장기간 자외선 노출에 의해 진행되는 외인성 광노화에 따른 주름 형성 방지에 대한 연구가 주목되고 있다(Gilchre st B.A., J. Am. Acad. Dermatol., 1989:21:610-613). 상기 외인성 피부노화인 광노화의 임상적 특징은 피 부가 거칠고 탄력성이 없어지며, 불규칙한 색소 침착이 발생되고, 깊은 주름살이 증가되는 것이다.

상기 노화에 영향을 미치는 외부인자들은 바람, 온도, 습도, 담배연기, 공해, 자외선 등에 의해서 노화가 일어나며, 특히 자외선에 의한 노화를 광노화라고 한다. 특히 미용의 대상으로서 중요한 안면, 두부 등의 주름 형성에는 상기 광노화의 영향이 큰 것으로 밝혀지고 있어 항노화 또는 항주름 화장품 개발의 기초연구로서 인체 피부나 동물 모델을 이용한 광노화와 주름형성에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 광노화와 주름 형성에 관해서는 지금까지 피부의 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)의 합성, 분해 등의 기초적인 생리 대사 변화를 검토한 결과가 다수 보고되고 있다(Lavker R.M., Blackwell science Inc.,1995:123-135).

상기 광노화의 기작을 간단히 살펴보면, 피부가 많은 양의 자외선에 노출되면 피부에는 높은 농도의 활성산소(reactive oxygen species)가 생성되고 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어계를 붕괴시킨다. 이로 인해 피부조직의 주 단백질인 콜라겐(collagen)이 현저히 감소된다. 상기 콜라겐 감소에 중요한 영향을 미치는 것은 콜라겐 분해 효소-1(MMP-1, matrix metalloproteinase-1)이다. 상기 효소는 세포외기질(extracellular matrix)과 기저막(basement membrane)의 분해에 관여하는 효소로써 자외선 조사에 의해 피부내의 콜라겐 분해효소-1 활성이 증가되어 콜라겐을 현저하게 붕괴시킴으로써 주름 형성에 매우 중요한 역할을 하고 있다는 연구 결과들이 보고되어 있다(Sim G.S., Kim J.H et al., Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 2005:20(1):40-45).

현재 개발되고 있는 피부 주름개선 또는 항노화를 위한 유효성분들은 일부 화장품 원료로 사용할 수 없거나 매우 불안정하고, 피부로의 전달이 용이하지 않아 특별한 안정화 시스템과 전달체계가 필요하며, 피부주름의 개선효과가 가시적이지 않는 등의 문제점이 있어서 최근 레티노이드(retinoid)를 함유한 피부보호제로 관심이 점차 집중되고 있다. 상기 레티노이드는 일광으로 축적된 결과인 주름살, 피부의 두꺼워짐, 처짐, 탄력 감소 등의 광노화 현상을 해결하는 수단으로 이용되고 있다. 그러나 레티노이드는 매우 불안정한 화합물로 자외선, 수분, 열, 산소에 민감하여 쉽게 화학적인 변화를 일으키는 문제점이 있어 이를 해결하기 위한 천연물 유래의 유효성분 개발에 연구가 집중되고 있는 실정이다.

한편, 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata)는 보에센베르지아 판두라타(Boesenbergia pandurata)로도 알려져 있는 생강과(zingiberaceae family)식물로서, 근경(rhizome)부위는 감기, 장염, 피부질환 및 요됴통증에 널리 사용되고 있다. 카엠페리아 판두라타에는 피노셈브린 겔콘(pinocembrin chalcone), 카르다모닌(cardamonin), 피노셈(pinocembrin), 피노스트로빈(pinostribin), 4-히드록시판두라틴 에이(4-hydroxypaduratin A), 판두라틴 에이(panduratin A)등이 함유되어 있는데, 이러한 성분들은 항암효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있고(Trakoontivakorn, G.,등, J.Arig. Food chem.., 49, 3046-3050, 2001), 플라보노이드 계통의 하이드로 겔콘(dihydrochalcone) 화합물들은 살충효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Pandji, C., 등, Phytochemistry, 34, 415-419, 1993). 또한 대한민국 등록특허 제492034호에는 아이소판두라틴 에이와 같은 판두라틴 유도체를 함유하는 충치 및 치주염 예방과 치료용 항균제 및 구강 조성물에 대하여 기재되어 있다. 그러나 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 주름 개선 또는 항노화 효과에 대해서는 지금까지 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 주름 개선 또는 항노화 활성이 있는 천연물 유래의 물질을 연구하던 중 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물이 상기와 같은 활성이 있음을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에 서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항주름 및 항노화용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물 을 함유하는 것을 특징으로 하는 항주름 및 항노화용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에서 ‘카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물’은 보에센베르지아 판두라타(Boesenbergia pandurata)로도 불리는 카엠페리아 판두라타에서 유래된 상기 판두라틴 유도체를 함유하는 추출물을 말한다. 상기 판두라틴 유도체를 함유할 수 있다면 상기 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물의 제조방법에는 제한이 없지만, 바람직하게는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata Roxb.) 식물 또는 식물의 일부(줄기, 근경 또는 잎)로부터 물, C1-C6의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출함으로써 제조될 수 있다. 또한 필요한 경우 당업자에게 공지된 방법에 따라 여과 및 농축 단계를 추가적으로 포함하여 제조할 수 있다.

상기 C1-C6의 유기용매는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 C1-C6의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 말한다.

또한 상기에서 '초임계 유체'란 일반적인 조건에서는 기체 상태이지만 임계 온도와 임계 압력 이상에서는 유체인 것을 말하며, 상기에서 아임계 유체는 아임계 액체와 기체를 포함하며 특히 아임계 액체는 온도가 초임계온도와 포화온도보다 낮은 상태의 유체이며, 아임계 기체는 온도가 포화온도보다 높고 압력은 초임계압력보다 낮은 상태의 유체를 말한다. 상기 초임계 유체 및 아임계 유체는 의약품 공업, 식품공업, 화장품·향료 공업, 화학 공업, 에너지 공업 및 기타 다양한 분야에 응용되고 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 초임계 유체 및 아임계 유체는 특별히 제한되는 것은 아니며 예를 들어, 이산화탄소, 질소, 아산화질소, 메탄, 에틸렌, 프로판, 프로필렌, 석유에테르, 에틸에테르 및 시클로헥산 등을 이용할 수 있다. 특히, 이산화탄소는 대량구입이 가능하고, 비교적 저렴하며, 비폭발성이고, 가공용으로 충분히 안전하다는 장점 때문에 특히 바람직하다. 상기 이산화탄소는 임계온도가 31.1℃이고 임계압력은 73.8기압이다.

본 발명의 일실시예에서는 건조한 카엠페리아 판두라타를 분쇄하고 이에 에탄올, 헥산 또는 클로로포름 용매를 이용하여 추출한 다음 여과 및 농축 단계를 거쳐 카엠페리아 판두라타 에탄올, 헥산 또는 클로로포름 추출물을 제조하였다. 또한 초임계 유체로서 이산화탄소(CO₂)를 이용한 초임계 유체추출기에 카엠페리아 판두라타를 투여하여 카엠페리아 판두라타 초임계 추출물을 제조하였다(<실시예 1> 참조).

본 발명에서 ‘판두라틴 유도체’는 하기 화학식 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 말한다. 구체적으로 화학식 1로 표시되는 화합물은 판두라틴 에이(panduratin A)를 말하고, 화학식 2로 표시되는 화합물은 이소판두라틴 에이(isopanduratin A)를 말하며, 화학식 3으로 표시되는 화합물은 4-히드록시판두라틴 에이(4-hydroxypanduratin A)를 말한다.

상기 판두라틴 유도체는 일반적으로 구매 가능한 물질이거나, 공지의 합성 방법을 이용하여 제조될 수 있으며 상기 카엠페리아 판두라타 추출물이나 카엠페리아 판두라타 식물을 압착하여 얻은 오일로부터 분리 정제하여 수득할 수 있다. 상기 카엠페리아 판두라타 추출물로부터 판두라틴 유도체의 분리 및 정제는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고성능액체 크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 판두라틴 유도체의 추출, 분리 및 정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 건조한 카엠페리아 판두라타를 분쇄한 후 에탄올과 혼합하여 용매 추출한 다음, 용매를 제거하고 추출성분을 농축하였다. 농축된 조추출물과 에틸아세테이트를 혼합하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 추출하고 에틸아세테이트를 제거하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 농축한 다음 각 성분의 극성 차이에 따라 각 성분별로 분리하였다. 구체적으로 일차적으로 헥산, 에틸아세테이트를 혼합한 용매를 이용하여 전개시킴으로서 불순물을 제거하고, 이를 다시 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트를 혼합한 용매를 이용하여 분리함으로서, 최종적으로 판두라틴 에이(panduratin A), 이소판두라틴 에이(isopanduratin A) 또는 4-히드록시판두라틴 에이(4-hydroxypanduratin A)를 수득할 수 있었다(도 1 및 <실시예 2> 내지 <실시예 4> 참조).

상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선, 예방 또는 치료 효과가 탁월하다.

구체적으로 먼저 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 우수한 세포증식 활성을 가지고 있다. 본 발명의 일실험예에서는 섬유아세포를 이용한 MTT 실험을 수행한 결과, 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 투여한 경우 세포증식이 현저히 유도됨을 확인하였다(<실험예 1> 참조).

또한 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유 도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 콜라겐 분해효소-1의 발현을 억제하여 콜라겐 분해를 억제하고, 프로콜라겐 합성을 유도함으로써 콜라겐 합성을 촉진하는 활성이 있다. 본 발명의 일실험예에서는 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 처리한 경우, 콜라겐 분해효소-1 의 발현이 억제되는 반면 프로콜라겐 합성은 증가됨을 확인하였다(<실험예 2> 참조).

이에 본 발명자들은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물이 콜라겐 분해를 억제하고 콜라겐 합성을 촉진하는 기작을 추가적으로 확인하였다.

구체적으로 콜라겐 분해가 발생하는 기작은 MAPKs(mitogen-activated protein kinases)에 속하는 ERK(extracellular-regulated protein kinase), JNK(Jun-N-terminal kinase) 및 p38 키나아제가 인산화되어 활성화되면, AP-1(activator protein-1)의 활성이 유도되어(Xu Y, Fisher GJ., J Dermatol Sci Suppl 2005; 1: S1 S8) DNA와 결합하고 이를 통해 MMPs(matrix metalloproteinase) 분비가 일어나 콜라겐이 분해되게 된다. 이때 c-Jun 및 c-Fos는 상기 AP-1과 DNA 결합에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Waskiewicz AJ, Cooper JA., Curr Opin Cell Biol., 1995; 7: 798 805).

본 발명의 일실험예에서는 판두라틴 에이를 투여한 경우 상기 ERK, JNK 및 p38 키나아제의 활성 및 AP-1과 DNA 결합이 억제됨을 확인하고 상기 c-Jun 및 c-Fos의 활성이 억제됨을 추가적으로 확인함으로써 결국 MMPs 분비가 억제됨을 알 수 있었다. 따라서 판두라틴 에이는 콜라겐 분해를 억제하고 콜라겐 합성이 촉진하는 활성이 있음을 알 수 있었다(<실험예 3> 참조).

또한 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 자외선에 노출되어 주름이 발생한 마우스의 피부에 도포하거나 구강에 투여한 결과, 현저하게 주름이 개선됨을 확인하였다(<실험예 4> 참조).

따라서 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선, 예방 또는 치료 효과가 탁월하므로 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.

상기 본 발명의 화장료 조성물은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다.

상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 상기 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 상기 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물 또는 이의 염을 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물의 함량은 이에 한정되지 않지만 전체 조성물 총중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.01 내지 5 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 상기 함량이 0.001중량% 미만에서는 목적하는 항노화 또는 주름개선 효과를 기대할 수 없고, 10중량% 초과에서는 안전성 또는 제형상의 제조에 어려움이 있을 수 있다.

한편 상기 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.

상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 이에 한정되지 않지만 예를 들면, 건강식품으로는 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용할 수 있도록 액상화, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물과 항노화 또는 주름 개선효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물 중 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다. 더 바람직하게는, 본 발명의 식품 조성물은 특히, 항노화 또는 주름 개선에 효과가 있는 것으로 알려진 활성 성분과 함께 혼합하여 건강식품의 형태로 제조될 수 있다.

한편 상기 본 발명의 약학적 조성물은 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여 할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 비경구 투여시는 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여되도록, 그리고 경구 투여시는 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물을 기준으로 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 그러나 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 판두라틴 유도체 또는 카엠페테리아 판두라타 추출물을 항노화 또는 주름 예방 및 치료로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

이상 살펴본 바와 같이, 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 세포증식을 유도하고 콜라겐 분해를 저지하며 콜라겐 합성을 촉진하므로 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선, 예방 또는 치료 효과가 탁월하여 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예 및 시험예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1>

판두라틴을 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 제조

<1-1> 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물의 제조

건조한 카엠페리아 판두라타 근경을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 카엠페리아 판두라타 시료 100 g를 에탄올 1 ℓ에 넣고 48시간 상온에서 냉침하여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (Whatman) 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물을 얻었다.

<1-2> 카엠페리아 판두라타 헥산 추출물의 제조

건조한 카엠페리아 판두라타 근경을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 카엠페리아 판두라타 시료 100 g를 헥산 1 ℓ에 넣고 48시간 상온에서 냉침하여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (Whatman) 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 카엠페리아 판두라타 헥산 추출물을 얻었다.

<1-3> 카엠페리아 판두라타 클로로포름 추출물의 제조

건조한 카엠페리아 판두라타 근경을 믹서로 분쇄한 다음, 분쇄한 카엠페리아 판두라타 시료 100 g를 클로로포름 1 ℓ에 넣고 48시간 상온에서 냉침하여 추출하였다. 추출된 시료는 와트만 (Whatman) 2번 여과지로 여과하고, 여과된 추출액을 진공 회전 농축기로 농축하여 용매성분을 제거한 후 카엠페리아 판두라타 클로로포름 추출물을 얻었다.

<1-4> 카엠페리아 판두라타 초임계 추출물의 제조

초임계 유체로서 이산화탄소(CO₂)를 이용한 초임계 유체추출기로 카엠페리아 판두라타 근경으로부터 초임계 추출물을 수득하였다. 이때 추출온도는 50 ℃, 추출 압력은 200 bar에서 추출한 후 추출물로부터 용매를 제거하여 초임계 추출물을 얻었다.

<실시예 2>

판두라틴 에이의 분리

상기 <실시예 1-1>에서 얻은 농축된 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물과 에틸아세테이트를 혼합하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 추출하고, 에틸아세테이트를 감압 하에서 제거하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 농축한 다음, 실리카겔을 6x15cm로 충진한 컬럼에서 헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 15 : 5 : 1.5 (v/v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취한 순서에 따라서 총 6개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 6개의 분획 중 3번 분획(분획 3)을 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메탄올(methanol)를 각각 18 : 2 : 1 (v/v/v)의 전개 용매로 박층 크로마토그래피(TLC, silica gel 60F254, Merck)하여 분취한 순서에 따라서 총 3개의 분획으로 나누어 농축 건조하였다. 최종적으로 상기 3개의 분획 중 2번 분획(분획 3-2)을 리싸이클링 고성능 액체 크로마토그래피(recycling HPLC, column: W-252, 20.0 mm ID× 500 mm L)를 이용하여 순서에 따라서 총 2개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 최종적으로 상기 2개의 분획 중 2번 분획(분획 3-2-2)을 농축 건조시켜 순수한 단일 주름개선 활성 물질인 하기 화학식 1의 판두라틴 에이를 분리하였다.

<실시예 3>

이소판두라틴 에이의 분리

상기 <실시예 1-1>에서 얻은 농축된 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물과 에틸아세테이트를 혼합하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 추출하고, 에틸아세테이트를 감압 하에서 제거하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 농축한 다음, 실리카겔을 6x15cm로 충진한 컬럼에서 헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 15 : 5 : 1.5 (v/v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취한 순서에 따라서 총6개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 6개의 분획 중 4번 분획(분획 4)을 리버스 페이즈-18(Rp-18, LiChropep, 25-40 m) 충진물을 이용하여 메탄올(methanol), 물(water)을 각각 9 : 1 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템으로 용출시켜 분취한 순서에 따라서 총 2개의 분획을 얻었고, 얻어진 분획 중 2번 분획(분획 4-2)을 농축 건조한 후 클로로포름, 메탄올을 10 : 0.2 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 용출시켜 순서에 따라서 총2개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 최종적으로 상기 2개의 분획 중 2번 분획(분획 4-2-2)을 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 10 : 3 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 용출시켜 순서에 따라서 총2개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 최종적으로 상기 2개의 분획 중 2번 분획(분획 4-2-2-2)을 농축 건조시켜 순수한 단일 주름개선 활성 물질인 하기 화학식 2의 이소판두라틴 에이를 분리하였다.

<실시예 4>

4-히드록시판두라틴 에이의 분리

상기 <실시예 1-1>에서 얻은 농축된 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물과 에틸아세테이트를 혼합하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 추출하고, 에틸아세테이트를 감압 하에서 제거하여 에틸아세테이트 용해성 성분을 농축한 다음, 실리카겔을 6x15cm로 충진한 컬럼에서 헥산(n-hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 15 : 5 : 1.5 (v/v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이 용하여 분취한 순서에 따라서 총 6개의 분획으로 나누어 각각의 분획을 농축 건조하였다. 6개의 분획 중 6번 분획(분획 6)을 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 메탄올(methanol)을 19 : 1 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템으로 용출시켜 분취한 순서에 따라서 총 3개의 분획을 얻었고, 상기 3개의 분획 중 2번 분획(분획 6-2)을 다시 클로로포름(chloroform), 메탄올(methanol)을 20 : 1 (v/v)의 비율로 혼합한 용매시스템을 이용하여 분취한 순서에 따라서 총 2개의 분획을 얻었다. 최종적으로 상기 2개의 분획 중 2번 분획(분획 6-2-2)을 리싸이클링 고성능 액체 크로마토그래피(recycling HPLC, column: W-252, 20.0 mm ID× 500 mm L)를 이용하여 순수한 단일 주름개선 활성 물질인 하기 화학식 3의 4-히드록시판두라틴 에이를 분리하였다.

<실험예 1>

카엠페리아 판두라타 추출물 및 판두라틴 유도체의 세포증식효과

<1-1> 카엠페리아 판두라타 추출물의 세포증식효과

상기 <실시예 1-1>에서 제조된 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물을 이용하여 피부의 주름개선효과를 검정하는 세포증식효과를 보기 위하여 섬유아세포를 이용한 MTT 시험법[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide reduction method]을 수행하였고, 피부 주름개선 효과가 있는 것으로 알려진 녹차추출물(green tea extract)을 비교군으로 설정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

카엠페리아 판두라타 추출물의 세포증식효과

	증식효과(%)	증식효과(%)
농도(㎍/ml)	카엠페리아 판두라타 추출물	녹차 추출물
0	100	100
0.001	102	101
0.01	103	102
0.1	107	105
1	121	119
10	128	121
50	134	128

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 카엠페리아 판두라타 추출물은 비교군보다 세포증식 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<1-2> 판두라틴 유도체의 세포증식효과

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>에서 제조된 판두라틴 유도체를 이용하여 피부의 주름개선효과를 검정하는 세포증식효과를 보기 위하여 섬유아세포를 이용한 MTT 시험법[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide reduction method]을 수행하였으며, 피부 주름개선 효과가 있는 것으로 알려진 EGCG(epigallocatechin-3-O-gallate)를 비교군으로 설정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

판두라틴 유도체의 세포증식효과

	증식효과(%)	증식효과(%)	증식효과(%)	증식효과(%)
농도(μM)	판두라틴 에이	이소판두라틴 에이	4-히드록시판두라틴 에이	EGCG
0	100	100	100	100
0.001	103	102	101	102
0.01	104	102	102	104
0.1	111	110	109	107
1	120	120	119	119
10	126	124	121	120
50	131	130	128	126

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 판두라틴 유도체들은 비교군보다 세포증식 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2>

카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체의 콜라겐 분해효소-1 억제 및 프로콜라겐 합성 효과

<2-1> 카엠페리아 판두라타 추출물의 경우

상기 <실시예 1>에서 제조한 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물의 콜라겐 분해효소-1 억제 활성과 프로콜라겐 합성 효과를 웨스턴 블럿과 RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)의 방법에 따라 측정한 결과를 도 2에 기재하였다.

구체적으로 섬유아세포 배양액에서 단백질을 추출하고 protein assay reagent(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, 미국)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 웨스턴 블럿을 실시하기 위해, 상기 동량의 단백질을 3분 동안 가열하고 식힌 다음, 10% SDS-PAGE에서 전기영동으로 니트로셀룰로오스 막(Amersham International, Little Chalfont, 영국)으로 전이시켰다. 상기 막은 TBST(10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 5 % 탈지분유로 포화되어 있으며, 2시간 동안 1차 항체(1:1000 희석)로 블럿을 수행하고, TBST로 세척한 다음 2시간 동안 2차 항체(1:2000 희석)로 블럿을 수행한 다음, TBST로 3번 세척하였다. 블럿된 항체는 ECL 검출 시스템(Amersham International, Little Chalfont, 영국)으로 분석하였다.

또한 RT-PCR을 수행하기 위하여 수득한 섬유아세포를 TRIZOL(Invitrogen, 미국)를 사용하여 총 RNA를 분리하고, 분리된 총 RNA를 정량하여 콜라겐분해효소-1 및 프로콜라겐 프라이머와 Taq Polymerase를 이용하였다. 구체적으로 콜라겐분해효소-1 프라이머를 이용하여 94℃에서 30초, 50℃ 1분, 72℃에서 1분을 25번 반복하여 RT-PCR을 실시하였고, 프로콜라겐 프라이머를 이용하여 94℃에서 30초, 60℃ 1분, 72℃에서 1분을 28번 반복하여 RT-PCR을 실시하였다. 상기 실시 후, 1% 아가로즈젤(Agarose gel)을 이용하여 전기영동한 후 EtBr(Ethidium bromide) 발광을 통해 콜라겐분해효소-1 및 프로콜라겐의 mRNA 발현양을 분석하였다.

상기 도 2에 기재된 바와 같이, 상기 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물을 처리했을 때 콜라겐 분해효소-1 단백질과 mRNA 발현양이 농도 의존적으로 억제된 반면 프로콜라겐 단백질과 mRNA 발현양은 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였다(도 2 참조).

또한 상기 <실시예 1>에서 제조한 카엠페리아 판두라타 헥산 추출물, 클로로포름 추출물 및 초임계 추출물에 대해서도 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, 카엠페리아 판두라타 헥산 추출물을 처리한 경우 대조군에 비하여 콜라겐 분해효소-1의 발현량은 37% 감소하였으며, 프로콜라겐 합성은 250% 증가하였다(결과 미도시). 또한 카엠페리아 판두라타 클로로포름 추출물을 처리한 경우 대조군에 비하여 콜라겐 분해효소-1의 발현량은 40% 감소하였으며, 프로콜라겐 합성은 290% 증가하였다(결과 미도시). 마지막으로 카엠페리아 판두라타 초임계 추출물을 처리한 경우 대조군에 비하여 콜라겐 분해효소-1의 발현량은 29% 감소하였으며, 프로콜라겐 합성은 220% 증가하였다(결과 미도시).

상기 결과를 통해 카엠페리아 판두라타 추출물이 콜라겐 분해효소의 발현을 억제하며, 프로콜라겐 합성을 증가시킴으로서 항노화 또는 주름개선에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<2-2> 판두라틴 유도체의 경우

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>에서 제조된 판두라틴 유도체의 콜라겐 분해효소-1 억제 활성과 프로콜라겐 합성 효과를 상기 <실험예 2-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿과 RT-PCR을 수행하여 측정하고 그 결과를 도 3 내지 도 5에 기재하였다.

상기 도 3 내지 도 5에 기재된 바와 같이, 상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>에서 제조된 판두라틴 유도체인 판두라틴 에이(도 3 참조), 이소판두라틴 에이(도 4 참조) 또는 4-히드록시판두라틴 에이(도 5 참조)를 각각 처리한 경우 콜라겐 분해효소-1 단백질과 mRNA 레벨이 농도 의존적으로 억제되는 반면 프로콜라겐 단백질과 mRNA 합성 또한 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였다. 특히 동일 농도에서 비교군인 EGCG와 비교하였을 때 EGCG보다 우수한 활성을 나타냈다.

상기 결과를 통해 상기 판두라틴 유도체는 콜라겐 분해효소의 발현을 억제하며, 프로콜라겐 합성을 증가시킴으로서 항노화 또는 주름개선에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실험예 3>

카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체의 콜라겐 분해 억제 기작

<3-1> MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 활성에 미치는 효과

인간의 피부 섬유아세포(CCD-986sk, ATCC, Manassas, VA, 미국)를 DMEM(Gibco, Grand Island, NY, 미국) 배지에 배양하였다. 상기 섬유아세포가 10 cm 배양 디쉬(SPL, 서울, 한국)에 80%까지 배양되도록 하고 24시간 동안 무혈청 배양 배지에서 추가 배양하였다. 상기 세포를 24시간 동안 상기 <실시예 2>의 판두라틴 에이가 함유된 무혈청 DMEM에 계속해서 배양하였다. 상기 배양 후, 배지를 5 ㎖의 PBS(phosphate-buffered salin)로 바꾸고 상기 세포를 자외선(20 mJ/cm²)에 노출시켰다. 이때 음성 대조군으로 동일 조건에서 자외선에 노출되지 않은 세포를, 양성 대조군으로 EGCG(epigallocatechin-3-O-gallate)를 사용하였다.

상기 섬유아세포를 RIPA 버퍼(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, 미국)에 용해시키고 protein assay reagent(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, 미국)를 이용하여 단백질을 정량하였다. 웨스턴 블럿을 실시하기 위해, 상기 동량의 단백질을 3분 동안 가열하고 식힌 다음, 10% SDS-PAGE에서 전기영동으로 니트로셀룰로오스 막(Amersham International, Little Chalfont, 영국)으로 전이시켰다. 상기 막은 TBST(10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 5 % 탈지분유로 포화되어 있으며, 2시간 동안 1차 항체(1:1000 희석)로 블럿을 수행하고, TBST로 세척한 다음 2시간 동안 2차 항체(1:2000 희석)로 블럿을 수행한 다음, TBST로 3번 세척하였다. 블럿된 항체는 ECL 검출 시스템(Amersham International, Little Chalfont, 영국)으로 분석하고 검출 정도는 RFLPscan version 2.1 소프트웨어 프로그램을 이용하여 측정하였다.

상기 실험 과정을 통하여, MAPKs(mitogen-activated protein kinases)에 속하는 ERK(extracellular-regulated protein kinase), JNK(Jun-N-terminal kinase) 및 p38 키나아제의 활성 변화를 측정하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.

상기 도 6에 기재한 바와 같이, 자외선에 의하여 ERK, JNK 및 p38 키나아제가 인산화되어 활성화가 유도되지만, 판두라틴 에이를 투여한 경우 농도 의존적으로 ERK, JNK 및 p38 키나아제의 활성이 억제됨을 알 수 있었다. 상기 ERK, JNK 및 p38 키나아제가 인산화되어 활성화되면 AP-1(activator protein-1)의 활성이 유도되고(Xu Y, Fisher GJ., J Dermatol Sci Suppl 2005; 1: S1 S8) 이를 통하여 MMPs(matrix metalloproteinase)의 분비가 촉진되어 콜라겐이 분해될 수 있음을 고려할 때(Huang C, Schmid PC, Ma WY, Schmid HH, Dong Z., J Biol Chem 1997; 272: 4187 94), 상기 판두라틴 에이는 콜라겐의 분해를 억제함으로써 항노화 또는 주름개선에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<3-2> AP-1(activator protein-1)의 DNA 결합 활성에 미치는 효과

AP-1(activator protein-1)의 DNA 결합 활성을 측정하기 위하여 EMSA(Electrophoretic mobility shift assay)를 수행하였다. 구체적으로 상기 <실험예 3-1>에서 배양하여 판두라틴 에이가 투여되고 자외선에 노출된 섬유아세포를 PBS로 세척하여 수집한 다음, 100 ㎕의 용해 버퍼(10 mM HEPES, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, pH 7.9)에 15분 동안 재 부유시키고 30 ㎕의 5% NP-40을 추가하여 15초 동안 혼합하였다. 시토졸(cytosol) 부분을 원심 분리하여 제거하고 핵 펠렛(nuclear pellets)을 추출버퍼(20 mM HEPES, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 7.9)로 용해 시켰다. 정량된 핵 단백질을 이용하여 제조자의 지시(Gel Shift Kit System ; Panomics, Fremont, CA, 미국)에 따라 gel shift assay를 수행하였다. 상기 수행 후 탐지된 단백질은 ECL 검출 시스템(Amersham International, Little Chalfont, 영국)으로 분석하고 검출 정도는 RFLPscan version 2.1 소프트웨어 프로그램을 이용하여 측정하였다.

상기 실험 과정을 통하여, AP-1(activator protein-1)의 DNA 결합 활성을 측정하고 그 결과를 도 7에 기재하였다.

상기 도 7에 기재된 바와 같이, 판두라틴 에이를 투여한 경우 농도 의존적으로 AP-1(activator protein-1)과 DNA 결합이 억제됨을 알 수 있었다. 따라서 AP-1(activator protein-1)의 활성이 유도되어 MMPs(matrix metalloproteinase) 분비가 촉진됨으로써 콜라겐이 분해될 수 있음을 고려할 때 상기 판두라틴 에이는 콜라겐의 분해를 억제함으로써 항노화 또는 주름개선에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<3-3> c-Jun 및 c-Fos 활성에 미치는 효과

상기 판두라틴 에이가 c-Jun 및 c-Fos 활성에 미치는 효과를 측정하기 위하여 상기 <실험예 3-1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블럿을 수행하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.

상기 도 8에 기재한 바와 같이, 판두라틴 에이를 투여한 경우 농도 의존적으로 c-Jun 및 c-Fos의 활성이 억제됨을 알 수 있었으며 상기 c-Jun 및 c-Fos는 AP-1의 전사 활성에 영향을 미치는 점을 고려할 때(Waskiewicz AJ, Cooper JA., Curr Opin Cell Biol., 1995; 7: 798 805), 상기 판두라틴 에이는 상기 <실험예 3-2>와 같이 AP-1의 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

<실험예 4>

카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체의 주름개선 효과

<4-1> 피부에 도포한 경우

6 주령 된 암컷 무모마우스(Hos:HR-1) 48마리를 1주일간 적응시킨 후 무작위로 각 군당 8 마리씩 6군으로 나누었다. 무모생쥐(Hos:HR-1)는 8주 동안 자외선에 노출시켰다. 이때, 자외선 조사량은 1주일에 3번씩 각각 1 MED(1 MED=50 mJ/cm²)씩 조사하였고 4 MED까지 증가시킨 후 시험 종료까지 유지하였다. 시험군은 자외선 무처리군, 자외선처리군, 자외선처리와 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물(0.1%, 0.5%) 처리군, 자외선처리와 판두라틴 에이(1 mM, 5 mM) 처리군의 총 6군으로 하였다. 각각의 시료는 에탄올:폴리에틸렌 글리콜(7:3 v/v)에 녹여 8주간 매일 50 ㎕씩 등 부위에 도포하였으며, 자외선 무처리군과 자외선 처리군은 에탄올:폴리에틸렌 글리콜(7:3 v/v)을 50 ㎕씩 도포하였다.

주름 생성 예방 효과를 알아보기 위해 실리콘폴리머(SILFLO Impression Material, Flexico, England)를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하였다. 채취한 피부주형은 이미지파일로 저장된 주름 그림자 명암 영상을 컴퓨터 영상 분석 시스템인 Skin Visiometer SV 600 소프트웨어(Courage+Khazaha Elecronic, Kln, 독일)를 이용하여 Rt, Rm, Rz, Ra 값(Rt: 피부 표면 가장 높은 값과 낮은 값 사이의 거리, Rm: 5부위 측정치 중 Rt의 가장 큰 값, Rz: 5부위 측정치 Rt 평균, Ra: 산술 평균 표면 거칠기)을 측정하고 그 결과를 도 9및 도 10에 기재하였다.

상기 도 9에 나타낸 바와 같이, 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물 처리군(0.1 % 및 0.5 %) 및 판두라틴 에이 처리군(1 mM 및 5 mM)은 자외선 처리군에 비하여 주름 생성량이 크게 감소한 것을 알 수 있었다. 또한 도 10에 나타낸 바와 같이, 피부주름 생성정도를 나타내는 Rt, Rm, Rz, Ra 값도 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물 처리군과 판두라틴 에이 처리군에서 모두 유의적으로 감소한 것을 알 수 있다(p<0.05).

상기 결과를 통해 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체를 피부에 도포하는 경우 주름개선 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

<4-2> 구강에 투여한 경우

상기 <실험예 4-1>의 자외선에 노출된 무모 마우스에 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물(200 mg/kg) 또는 판두라틴 에이(50 mg/kg)를 Tween 80이 5 % 포함된 0.5 % 카르복실메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose) 용액에 녹여 8주간 매일 경구 반복투여 하였다. 이때 대조군인 자외선 무처리군과 자외선 처리군은 0.5 % 카르복실메틸셀룰로오스 용액을 투여하였다.

상기 투여 후 주름 생성 예방 효과를 알아보기 위해 실리콘폴리머(SILFLO impression material, Flexico, England)를 이용하여 피부주형(replica)을 채취하고 그 결과를 도 11에 기재하였다.

상기 도 11에 기재한 바와 같이, 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물 또는 판두라틴 에이를 마우스의 구강에 투여한 경우에도 주름 생성량이 크게 감소됨을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체를 구강에 투여하는 경우에도 주름개선 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

<제형예 1 - 화장품>

<1-1 내지 1-2> 영양화장수(밀크로션)

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물을 하기 표 3의 영양화장수 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 영양화장수를 제조하였다.

영양화장수(밀크로션)

배합성분	제형예 1-1 (중량%)	제형예 1-2 (중량%)
판두라틴 유도체	2.0	-
카엠페리아 판두라타 추출물	-	2.0
스쿠알란	5.0	5.0
밀납	4.0	4.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5	1.5
유동파라핀	0.5	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	3.0	3.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1	0.1
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

<1-3 내지 1-4> 유연화장수(스킨로션)

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물을 하기 표 4의 유연화장수 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 유연화장수를 제조하였다.

유연화장수(스킨로션)

배합성분	제형예 1-3 (중량%)	제형예 1-4 (중량%)
판두라틴 유도체	2.0	-
카엠페리아 판두라타 추출물	-	2.0
글리세린	3.0	3.0
부틸렌글리콜	2.0	2.0
프로필렌글리콜	2.0	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1	0.1
PEG 12 노닐페닐에테르	0.2	0.2
폴리솔베이트 80	0.4	0.4
에탄올	10.0	10.0
트리에탄올아민	0.1	0.1
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

<1-5 내지 1-6> 영양크림

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물을 하기 표 5의 영양크림 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 영양크림을 제조하였다.

영양크림

배합성분	제형예 1-5 (중량%)	제형예 1-6 (중량%)
판두라틴 유도체	2.0	-
카엠페리아 판두라타 추출물	-	2.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
PEG60 경화피마자유	2.0	2.0
유동파라핀	10	10
스쿠알란	5.0	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0
글리세린	5.0	5.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제	적량	적량
색소	적량	적량
향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

<1-7 내지 1-8> 마사지크림

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물을 하기 표 6의 마사지크림 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 마사지크림을 제조하였다.

마사지크림

배합성분	제형예 1-7 (중량%)	제형예 1-8 (중량%)
판두라틴 유도체	1.0	-
카엠페리아 판두라타 추출물	-	1.0
밀납	10.0	10.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
PEG 60 경화피마자유	2.0	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8	0.8
유동파라핀	40.0	40.0
스쿠알란	5.0	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	4.0	4.0
글리세린	5.0	5.0
부틸렌글리콜	3.0	3.0
프로필렌글리콜	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

<1-9 내지 1-10> 팩

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물을 하기 표 7의 팩 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 팩을 제조하였다.

팩

배합성분	제형예 1-9 (중량%)	제형예 1-10 (중량%)
판두라틴 유도체	1.0	-
카엠페리아 판두라타 추출물	-	1.0
폴리비닐알콜	13.0	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2	0.2
글리세린	5.0	5.0
알란토인	0.1	0.1
에탄올	6.0	6.0
PEG 12 노닐페닐에테르	0.3	0.3
폴리솔베이트 60	0.3	0.3
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

<1-11 내지 1-12> 젤

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물을 하기 표 8의 젤 제형 비율대로 하여 통상적인 방법에 따라 젤을 제조하였다.

젤

배합성분	제형예 1-11 (중량%)	제형예 1-12 (중량%)
판두라틴 유도체	0.5	-
카엠페리아 판두라타 추출물	-	0.5
에틸렌디아민초산나트륨	0.05	0.05
글리세린	5.0	5.0
카르복시비닐폴리머	0.3	0.3
에탄올	5.0	5.0
PEG 60 경화피마자유	0.5	0.5
트리에탄올아민	0.3	0.3
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	to 100	to 100

<제형예 2 - 식품>

<2-1> 건강식품의 제조

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 1000㎎, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎를 혼합하여 제조할 수 있으며, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<2-2> 건강음료의 제조

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 1000㎎, 구연산 1000㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2g, 타우린 1g에 정제수를 가하여 전체 900 ㎖ 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강음료 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<2-3> 츄잉껌

껌 베이스 20 중량%, 설탕 76.9 중량%, 향료 1 중량% 및 물 2 중량%와 상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 츄잉껌을 제조하였다.

<2-4> 캔디

설탕 60 중량%, 물엿 39.8 중량% 및 향료 0.1 중량%와 상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 0.1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 캔디를 제조하였다.

<2-5> 비스켓

박력 1급 25.59 중량%, 중력 1급 22.22 중량%, 정백당 4.80 중량%, 식염 0.73 중량%, 포도당 0.78 중량%, 팜쇼트닝 11.78 중량%, 암모늄 1.54 중량%, 중조 0.17 중량%, 중아황산나트륨 0.16 중량%, 쌀가루 1.45 중량%, 비타민 B₁0.0001 중량%, 비타민 B₂0.0001 중량%, 밀크향 0.04 중량%, 물 20.6998 중량%, 전지분유 1.16 중량%, 대용분유 0.29 중량%, 제1인산칼슘 0.03 중량%, 살포염 0.29 중량% 및 분무유 7.27 중량%와 상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 1 중량%를 배합하여 통상의 방법으로 비스켓을 제조하였다.

<제형예 3 - 의약품>

<3-1> 산제

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 50 mg, 결정셀룰로오즈 2 g을 혼합한 후 통상의 산제 제조방법에 따라서 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<3-2> 정제

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 50 ㎎, 결정셀룰로오즈 400 ㎎, 스테아린산 마그네슘 5 ㎎을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<3-3> 캡슐제

상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 30 ㎎, 유청단백질 100 ㎎, 결정셀룰로오즈 400 ㎎, 스테아린산 마그네슘 6 ㎎을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<3-4> 주사제

통상의 주사제 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 상기 <실시예 2> 내지 <실시예 4>의 판두라틴 유도체 또는 상기 <실시예 1>의 카엠페리아 판두라타 추출물 100 ㎎, 주사용 증류수, pH 조절제 를 혼합하여 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.

상기 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 세포증식을 유도하고 콜라겐 분해를 저지하며 콜라겐 합성을 촉진하므로 항노화 활성이 우수하며 특히 주름 개선, 예방 또는 치료 효과가 탁월하여 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있다.

도 1은 카엠페리아 판두라타에서 주름개선 활성 물질을 분리하는 과정을 도시한 분리도이다.

도 2는 카엠페리아 판두라타 에탄올 추출물의 콜라겐분해효소-1의 억제 활성 및 프로콜라겐 합성 효과를 나타낸 결과이다(A: 콜라겐 분해효소-1 단백질 발현 억제 활성, B: 콜라겐 분해효소-1 mRNA 발현억제 활성, C: 프로콜라겐 생합성 촉진활성, D: 프로콜라겐 mRNA 발현 촉진활성).

도 3은 판두라틴 에이의 콜라겐분해효소-1의 억제 활성 및 프로콜라겐 합성 효과를 나타낸 결과이다(A: 콜라겐 분해효소-1 단백질 발현 억제 활성, B: 콜라겐 분해효소-1 mRNA 발현억제 활성, C: 프로콜라겐 생합성 촉진활성, D: 프로콜라겐 mRNA 발현 촉진활성)

도 4은 이소판두라틴 에이의 콜라겐분해효소-1의 억제 활성 및 프로콜라겐 합성 효과를 나타낸 결과이다(A: 콜라겐 분해효소-1 단백질 발현 억제 활성, B: 콜라겐 분해효소-1 mRNA 발현억제 활성, C: 프로콜라겐 생합성 촉진활성, D: 프로콜라겐 mRNA 발현 촉진활성)

도 5는 4-히드록시판두라틴의 콜라겐분해효소-1의 억제 활성 및 프로콜라겐 합성 효과를 나타낸 결과이다(A: 콜라겐 분해효소-1 단백질 발현 억제 활성, B: 콜라겐 분해효소-1 mRNA 발현억제 활성, C: 프로콜라겐 생합성 촉진활성, D: 프로콜라겐 mRNA 발현 촉진활성)

도 6은 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체가 MAPKs 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 7은 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체가 AP-1의 DNA 결합 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체가 c-Jun 및 c-Fos 활성에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 마우스의 피부에 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체를 도포한 후 피부주형을 촬영한 사진이다.

도 10은 마우스의 피부에 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체를 도포한 후 Rt, Rm, Rz, Ra 값을 측정한 결과이다(Rt: 피부 표면 가장 높은 값과 낮은 값 사이의 거리, Rm: 5부위 측정치 중 Rt의 가장 큰 값, Rz: 5부위 측정치 Rt 평균, Ra: 산술 평균 표면 거칠기).

도 11은 마우스의 경구에 카엠페리아 판두라타 추출물 또는 판두라틴 유도체를 투여한 후 피부주형을 촬영한 사진이다.

Claims

하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 화장료 조성물.
하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 주름 개선 및 항노화용 식품 조성물.
하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 이루어진 군에서 선택된 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항주름 및 항노화용 약학적 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 이어서, 상기 카엠페리아 판두라타(Kaempferia pandurata) 추출물은 물, C1-C6의 유기용매 및 아임계 또는 초임계 유체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 이어서, 상기 C1-C6의 유기용매는 C1-C6의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether)로 이루어진 군 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.